JPH04316487A

JPH04316487A - 核酸サブトラクション法

Info

Publication number: JPH04316487A
Application number: JP10818791A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Kishimoto; 利彦岸本; Shinichiro Niwa; 真一郎丹羽
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1991-04-15
Filing date: 1991-04-15
Publication date: 1992-11-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸サブトラクション
法に関し、さらに詳しくは、各種の核酸を含む溶液から
特定の核酸のみを取り去る核酸サブトラクション法に関
する。本発明の核酸サブトラクション法は、遺伝子操作
、特に、遺伝子クローニング等に好適である。

【０００２】

【従来の技術】従来、核酸を含む溶液から特定の核酸の
みを取り去るというサブトラクション技術は知られてい
ない。これまでに試みられていた方法としては、メンブ
ラン上にｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　　Ｄ
ＮＡ）を非特異的吸着により固定し、このｃＤＮＡと核
酸溶液中のｍＲＮＡ（ｍｅｓｅｎｇｅｒ　　ＲＮＡ）を
ハイブリダイゼーションさせ、溶液中に残存する核酸を
回収する方法がある。しかしながら、この方法は、ｃＤ
ＮＡをｃＤＮＡライブラリーから回収する手間が非常に
大きいこと、ｃＤＮＡの固定化が非特異的な吸着による
ためｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションが完全でない
こと、さらに、ｃＤＮＡの固定化密度が非常に低いため
、操作に手間がかかり、かつ、完全にｍＲＮＡを除くこ
とが困難であること、等の問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、核酸
溶液から特定の核酸のみを効率よく抽出できる核酸サブ
トラクション法を提供することにある。

【０００４】本発明者らは、鋭意研究した結果、一本鎖
ＤＮＡをその分子末端で支持体に固定したもの（以下、
固定化ＤＮＡと略記）を用いると、非常に精度の高いハ
イブリッド形成（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ
−ＲＮＡハイブリッド）が可能となるため、この固定化
ＤＮＡを用いて、核酸溶液を処理し、該一本鎖ＤＮＡと
相補的な塩基配列を有する核酸とハイブリダイゼーショ
ンさせることにより、特定の核酸のみを効率よく、かつ
、完全に抽出できることを見出した。

【０００５】この方法により、例えば、正常な細胞の核
酸を支持体上に固定化したものを用い、癌などの病気の
細胞から得られた核酸溶液を処理して、相補的な塩基配
列を有する核酸を取り去ると、病気に特異的な核酸（遺
伝子）を回収することができる。また、内容不明の２つ
の核酸溶液の間で相互に存在しない特異的核酸を回収す
ることが可能となる。本発明は、これらの知見に基づい
て完成するに至ったものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、一本鎖核酸をその末端で不溶性の支持体上に固定化
したものを用いて核酸溶液を処理し、該一本鎖核酸とそ
れに相補的な塩基配列を有する核酸とをハイブリダイゼ
ーションさせ、次いで、核酸溶液中に残存する核酸を回
収することを特徴とする核酸サブトラクション法が提供
される。以下、本発明について詳述する。

【０００７】（不溶性の支持体）本発明で用いる不溶性
の支持体としては、例えば、ナイロンメンブラン、ニト
ロセルロースメンブラン、ポリテトラフルオロエチレン
メンブラン、ポリエチレンメンブラン等、天然または合
成有機高分子メンブラン（膜状体）を挙げることができ
る。ニトロセルロースのように有機高分子（例；セルロ
ース）を化学的に処理し、改質して得たメンブランも含
む。

【０００８】また、支持体としては、グラファイト、多
孔質ガラス、シリカ等の無機高分子メンブラン；アルミ
ニウム、アパタイト等の金属メンブラン；アルミナ、窒
化珪素等のセラミックスメンブラン；食塩等の結晶を挙
げることが出来る。さらに、これらの表面を化学的、物
理的に表面処理することで改質されれたものも使用でき
る。

【０００９】さらに、支持体としては、ナイロン、ニト
ロセルロース、セルロース、ポリテトラフルオロエチレ
ン、ポリエチレン等の有機高分子粒子；グラファイト、
多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子粒子；アルミニウ
ム、アパタイト等の金属粒子；アルミナ等のセラミック
粒子；等を挙げることができ、また、これら有機高分子
は、例えば酸化、還元、加水分解などの化学的処理、例
えばプラズマ照射などの物理的処理で改質したもの、無
機高分子粒子、金属粒子、セラミック粒子は、例えばイ
オンプレーティングなどの物理的、化学的に表面処理を
行なうことで改質されたものも使用できる。

【００１０】（支持体上への核酸の固定化法）本発明に
おいては、不溶性の支持体上に一本鎖核酸（以下、一本
鎖ＤＮＡと略記）を末端で固定化したものを使用する。一本鎖ＤＮＡとしては、その末端に１若しくはそれ以上
の余分のヌクレチオド分子を含んでいるか、あるいは一
本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチド分子が化学的修飾
を受けているもの、または官能基を有する化学物質（Ａ
ＢＩ社アミノリンク２等）を末端に導入したものを用い
れば、該余分のヌクレオチドまたは化学的修飾を受けた
ヌクレオチド、または官能基を有する化学物質を介して
支持体上への結合を行なうことができる。以下、支持体
上への核酸の固定化法の具体例について、順を追って詳
細に説明する。

【００１１】一本鎖ＤＮＡの末端を化学的に修飾する場
合１）まず、末端に固定化に適した官能基（例えば−ＮＨ
２　　、−ＣＯＯＨ）を導入した一本鎖ＤＮＡを調製す
る。ＤＮＡを合成する場合、その合成自体は、市販のＤ
ＮＡ合成装置〔例えばＡｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ　　Ｉｎｃ．（以下、ＡＢＩ社と略記）製３９
１型ＰＣＲ−ＭＡＴＥなど〕を使用し、常法によって行
なうことができる。官能基の導入は、例えば次のような
方法で行うことができる。

【００１２】■　　アミノリンク２（ＡＢＩ社製）の導
入以下の反応式にしたがい、ＤＮＡ合成装置を使って、
ヘキシルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することができる
（ＡＢＩ社のＵｓｅｒ　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｎｏ．４
９，Ａｕｇｕｓｔ　　１９８８、参照）。

【００１３】

【化１】

【００１４】■　　化２

【００１５】

【化２】で示されるリンカーを、ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社製、
Ａ−３９１ＥＰ　　ＰＣＲ−ＭＡＴＥなど）を用いてＤ
ＮＡ末端に導入し、これを処理することにより、このリ
ンカー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカルボキ
シ基に導き、さらにアルデヒド基の場合は、ビオチンの
ヒドラシド化合物と反応させることにより、アビジンと
特異的に結合して複合体を形成し得るビオチンを導入す
ることができる（Ｊｏｎａｔｈａｎ　　Ｎ．Ｋｒｅｍｓ
ｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　１９８７，Ｖｏｌ．１５，ｐ
．２８９１〜参照）。

【００１６】■　　ＤＮＡ合成装置を用い、アミノ基を
もつ塩基のヌクレオチド１〜数１０個を相補部分のＤＮ
Ａ末端に付加する。

【００１７】■　　ターミナルトランスフェラーゼによ
り、支持体との結合に適した塩基、またはその反応性誘
導体をＤＮＡ末端に導入する（Ｄｅｕｇ　　Ｇ．ａｎｄ
　　ＷｕＲ．，　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，　　Ｖｏｌ．１００，ｐ．９６−１１
６，１９８３、参照）。

【００１８】２）次に、１）で得た一本鎖ＤＮＡの相補
鎖を１）と同様の合成装置を用いて調製し、両者をアニ
ーリングさせて、二本鎖ＤＮＡとする。

【００１９】３）上で得た二本鎖ＤＮＡを含む溶液、ま
たは一本鎖ＤＮＡの末端に固定化に適した官能基を有す
るＤＮＡ溶液に固定化用支持体を加え、両者を結合させ
る。ＤＮＡと支持体との結合法は、ＤＮＡおよび支持体
の両者の化学的修飾の種類によって異なり、例えば、次
のような各種の方法を用いることができる。

【００２０】■　　ＤＮＡまたは支持体上の水酸基（主
としてジオール基）をトリフロオロエタンスルフォニル
クロライド（以下、トレシルクロライドと略記）（Ｋ．
Ｎｉｌｌｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ，　
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．，１０２，４４９，１９８１）、ＣＮＢｒ（Ｒ．
Ａｘｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｎａｔｕｒｅ，２１
４，１３０２，１９６７）、トリクロロトリアジン（Ｔ
．Ｈ．Ｆｉｎｌａｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８７，７７，１９７８）、エピク
ロロヒドリン（Ｉ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　　ｅｔ　　ａ
ｌ．，　　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８５，１０９１，１
９７９）、ビスオキシラン（Ｌ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ　　
ａｎｄ　　Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ．，９０，８７，１９７４）、ジビニルスルホン酸（
Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ，　　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
３４，２７，１９７４）、ベンゾキノン（Ｊ．Ｂｒａｎ
ｄｔ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３８６，１９６，１９７５）、
カルボニルジイミダゾール（Ｇ．Ｓ．Ｂｅｔｈｅｌｌ　
　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
５４，２５７２，１９７９）などで活性化し、支持体上
、またはＤＮＡの主としてアミノ基と結合させる。

【００２１】■　　ＤＮＡまたは支持体上の主としてカ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を水溶性カルボジイミド
等のカルボジイミド（Ａ．Ｔｅｎｇｂｌａｄ，　　Ｂｉ
ｏｈｅｍ．Ｊ．，１９９，２９７，１９８１；Ｍ．Ｆｕ
ｎａｂａｓｈｉ　　ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，１２６，４１４，１９８２）または２−エ
トキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキ
ノリン（ＥＥＤＱ）（Ｇ．Ｓａｃｃｏｍａｎｉ　　ｅｔ
　　ａｌ．，　　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５６，１２
４０５，１９８１；Ｂ．Ｂｅｌｌｅｕａｕ　　ａｎｄ　
　Ｇ．　　Ｍａｌｅｋ，　　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，９０，１６５１，１９６８）で活性化し、支持上
またはＤＮＡの主としてアミノ基（−ＮＨ２　　）と縮
合結合させる。

【００２２】■　　従来の非特異的または末端とは限ら
ない状態で支持体に結合したＤＮＡに、所望のＤＮＡを
ＤＮＡリガーゼ（連結酵素）を用いて結合させる。

【００２３】■　　支持上およびＤＮＡのヒドラジド基
とアルデヒド基、またはヒドラジド基とカルボキシル基
を用いて結合させる。ヒドラジド基とアルデヒド基の場
合は、混合するとヒドラゾン結合を形成する。これを還
元操作を行うと共有結合化する（Ｊｏｎａｔｈａｎ　　
Ｎ．Ｋｒｅｍｓｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，上掲文献参照
）。ヒドラジドとカルボキシル基の場合は、■のように
カルボジイミド等を用いる。

【００２４】■　　ＤＮＡおよび支持体上に互いに親和
力のある物質を導入し（例えば、ビオチンとアビジン）
、その親和力に基づいて固定化を行う（Ｊｏｎａｔｈａ
ｎ　　Ｎ．Ｋｒｅｍｓｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，上掲文
献参照）。

【００２５】■　　ＤＮＡと支持体上のチオール基どう
しを活性化、固定化する（Ｋ．Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓ
ｔ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｂｉｏｃｈｍ．Ｊ．，１３
３，５７３，１９７３）。

【００２６】■　　ＤＮＡと支持体上のアミノ基どうし
をブリモアセタミド法にて結合させる（Ｐ．Ｃｕａｔｒ
ｅｃａｓａｓ，　　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５
，３０５９，１９７０）４）上で得た固定化二本鎖ＤＮＡの場合、蒸留水や２．
４Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド水溶液、適宜
希釈した１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ　　ＮａＣｌおよび０
．１５Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）、０．１〜
２Ｍ　　ＮＡＣｌ水溶液等の塩溶液中、熱（約４０℃以
上）またはアルカリを加えることにより変性させ、遠心
して固相と液相を分離することにより、固定化一本鎖Ｄ
ＮＡを得る。

【００２７】二本鎖ＤＮＡをそのまま、あるいは末端を
化学的に修飾して用いる場合二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１若しくはそれ以上のヌクレ
チオド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡは、そのままあ
るいは化学的な修飾を施した後支持体に末端で結合させ
ることができるので、上記の工程３）以降の操作を施せ
ば、上と同様の目的を達成することができる。このよう
な二本鎖ＤＮＡは、次のようにして調製することができ
る。

【００２８】■　　ターミナルトランスフェラーゼを使
用して、片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ支持体との結合に
適した塩基またはその反応性誘導体を導入する。

【００２９】■　　末端に一本鎖部分ができるように制
限酵素で切断する。

【００３０】■　　官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖
ＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより結合させる。例えば、二
本鎖ＤＮＡの両端の切断端が異なる配列を持つように２
種の制限酵素で処理する。そこで、一方の切断端に特異
的に結合できる配列を有する官能基を有するＤＮＡを加
え、そこにＤＮＡリガーゼを作用させることにより目的
ＤＮＡ断片の末端に官能基を導入できる。この場合、除
去したい方の鎖の５′末端を脱リン酸化しておいてもよ
い。即ち、目的とする二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長
い二本鎖ＤＮＡを調製し、この状態で脱リン酸化酵素に
より５′末端を脱リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切
断して目的断片をつくると一方の５′末端は脱リン酸化
されたものができる。

【００３１】■　　二本鎖ＤＮＡの３′末端−ＯＨ基に
トリクロロトリアジン基を導入することでＯＨ基を活性
化する。５′末端−ＯＨ基には、■で述べた脱リン酸化
を行い−ＯＨ基を露出させトリクロロトリアジンを反応
させて活性化する。３′末端の−ＯＨ基と５′末端の−
ＯＨ基では、反応性が５′末端の方が良いため、５′末
端−ＯＨ基を特異的に活性化できる。

【００３２】ｍＲＮＡから固定化ｃＤＮＡを合成する方
法先ず支持体上にオリゴマー（１〜１０００塩基）のデオ
キシチミン〔以下、オリゴ（ｄＴ）と略記〕を固定する
。この固定化法としては、前記一本鎖ＤＮＡの末端を化
学的に修飾してから支持体上に固定化する方法が採用で
きる。次いで、このオリゴ（ｄＴ）にｍＲＮＡをハイブ
リダイゼーションさせ、次いで逆転写酵素を用いて、ｍ
ＲＮＡを鋳型とし、かつ、オリゴ（ｄＴ）をプライマー
としてｃＤＮＡを合成し、しかる後ｍＲＮＡを除去する
ことにより、末端がオリゴ（ｄＴ）を介して支持体上に
固定化されたｃＤＮＡを得る。

【００３３】（核酸溶液）核酸溶液は、次のような核酸
を含有する溶液である。■　　細胞から抽出された（天
然の）２本鎖ＤＮＡ、およびこのＤＮＡを制限酵素や物
理的剪断力等で切断したもの、■　　天然の１本鎖ＤＮ
Ａ（上記■のＤＮＡを熱またはアルカリ等で変性させた
ものも含む）、■　　ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン（ＰＣＲ法）等でｉｎ　　ｖｉｔｒｏで増幅された１
本鎖または２本鎖ＤＮＡ、および該２本鎖ＤＮＡを熱ま
たはアルカリ等で変性させたもの、■　　合成ＤＮＡ、
■　　天然のＲＮＡ、■　　合成ＲＮＡ、■　　■〜■
の任意のＤＮＡ，ＲＮＡの混合物。

【００３４】（サブトラクション法）本発明のサブトラ
クション法においては、一本鎖核酸をその末端で不溶性
の支持体上に固定化したものを用いて核酸溶液を処理し
、該一本鎖核酸とそれに相補的な塩基配列を有する核酸
とをハイブリダイゼーションさせ、次いで、核酸溶液中
に残存する核酸を回収する。

【００３５】ハイブリダイゼーションは、公知の各種の
方法を用いることができる。本発明で用いる固定化ＤＮ
Ａは、その末端で支持体上に固定化されているため、固
定化によるＤＮＡ塩基の破壊がなく、液相中でのＤＮＡ
とほぼ同じ挙動が期待され、相補的な塩基配列を有する
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）と効率よく、かつ、完全にハイ
ブリダイゼーションさせることが可能である。したがっ
て、核酸溶液から相補性のある塩基性配列を有する特定
の核酸のみを取り去ることができる。

【００３６】さらに、特定のｍＲＮＡを鋳型として、支
持体上に固定化されたｃＤＮＡを合成すれば、核酸溶液
から相補性のあるｍＲＮＡのみを抽出できる。そこで、
例えば、内容未知のｍＲＮＡを含む２つの核酸溶液の一
方のｍＲＮＡを鋳型として、固定化ｃＤＮＡを作成し、
これを用いて他方の核酸溶液を処理して、ハイブリダイ
ゼーションを行なえば、核酸溶液中に残存して回収され
るｍＲＮＡは、一方の核酸溶液に存在しないものである
ことが分かる。逆の操作も可能である。したがって、こ
のような方法により、内容不明の２つの核酸溶液の間で
相互に存在しない特異的核酸を回収することができる。そして、本発明の核酸サブトラクション法は、遺伝子操
作、特に、遺伝子クローニング等に好適である。

【００３７】

【実施例】

［実施例１］（１）　　トレシル活性化シリカゲルの調製以下の操作
は、ドライボックスもしくは乾燥窒素を満たした無菌パ
ックなどを適宜利用し、水分の混入を防ぎながら行なっ
た。なお、シリカゲルを単にゲルと略称することがある
。

【００３８】１）アセトン、ピリジンを予めモレキュラ
ーシーブで脱水しておく。２）１ｍｌの脱水アセトン、１００μｌのピリジン、お
よび小さなスターラーチップを１０ｍｌのメスフラスコ
に入れておく。３）１ｇのゲルをガラスフィルター（＃５メッシュ）上
でアスピレーターで吸収しながら、アセトン、脱水アセ
トンで素早く洗浄し、直ちに２）で用意したメスフラス
コに入れる。４）乾燥窒素で外気が混入しないようにしながら、スタ
ーラーでゲルを激しく撹拌しつつ、１００〜２００μｌ
のトレシルクロライド（Ｆｌｕｋａ社製）を１分ほどか
けて滴下する。この際、氷を詰めたビニール袋などでメ
スフラスコを０℃付近に保っておく。５）メスフラスコに蓋をし、ゲルを破砕させないように
スターラーの速度を落し２０分間反応させる。メスフラ
スコは０℃付近に保っておく。

【００３９】６）反応後、ガラスフィルター上に移し、
アセトン、アセトン＋５ｍＭ　　ＨＣｌ（１：１）およ
び５ｍＭ　　ＨＣｌで洗浄する。７）さらにアセトンで洗浄し、フィルター上で十分アセ
トンを揮散させる。８）ナスフラスコに移し、減圧下にアセトンを揮散させ
る。トレシルは高温では不安定なので、５）で用いた氷
入りビニールなどで低温に保ちつつ乾燥させると、トレ
シル化シリカゲルが得られる。

【００４０】（２）　　オリゴ（ｄＴ）の合成と支持体
への固定ＡＢＩ社製ＤＮＡ合成装置にて、１μＭスケールで、下
記配列■の一本鎖ＤＮＡを合成した。配列■のＤＮＡは
、精製後、１．５ｍｇが回収された。 ■５′Ｘ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　
　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴＴＴＴ　　３
′Ｘ：アミノリンク２（ＡＢＩ社製）得られたＤＮＡ（２７−ｍｅｒのｄＴ）を常法により高
速液体クロマトグラフィーを用いて精製した。このＤＮ
Ａを５００μｇ分とって減圧下で乾固した。この乾固し
たＤＮＡ１００μｇを１Ｍ　　ＮａＣｌ（１００μｌ）
に溶かし、次いで０．４Ｍ　　ＮａＨＣＯ３　　（ｐＨ
７．５）を１００μｌ加えた。この溶液に、トレシル活
性化シリカゲルを加え、室温で２４時間反応させた。反
応終了後、シリカゲルを１Ｍ　　ＮａＣｌで３回洗浄し
、最後に、１Ｍ　　ＮａＣｌ　　１ｍｌに懸濁した。こ
れを９５℃で５分間加温した後、直ちに遠心し（１２０
００ｒｐｍ）、上清を除去して、残渣としてシリカゲル
に固定化した２７−ｍｅｒのオリゴ（ｄＴ）を得た。

【００４１】（３）　　ｍＲＮＡの調製１）ＢＡＬＢ／
ｃマウス３週齢の肝臓２ｇと脾臓２ｇをとり出し、以下
の操作によってｍＲＮＡを調製した。以下の操作は、肝
臓および脾臓について、それぞれ行なった。２）７０ｍｌ　　５．５Ｍチオシアニン酸グアニジン溶
液（以下、５．５Ｍ　　ＧＴＣ液と略記）を加え、ポリ
テトラフルオロエチレン−ガラスホモジナイザーですり
潰す。＜５．５Ｍ　　ＧＴＣ溶液＞ＧＴＣ（和光純薬）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５．５Ｍクエン酸ナトリウム（和光純薬社製）
　　　　２５ｍＭＳａｒｋｏｓｙｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．５％以上の混合液をＮ
ａＯＨでｐＨ７．０に調整し、フィルターを通す。使用
直前に０．２Ｍとなるように２−メルカプトエタノール
を加える。

【００４２】３）テルモ社製１０ｍｌディスポーザブル
シリンジに＃１８注射針をつけ、これを使って２）のホ
モジネートを出し入れし、ＤＮＡを機械的に切断する。４）オートクレーブ滅菌したポリアロマー社製遠心チュ
ーブに、ＣｓＴＦＡ−０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ液を半分入
れ、その上へ３）のサンプルを重層し、２３０００ｒｐ
ｍ、１５℃で２４時間遠心する。＜ＣｓＴＦＡ−０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ液＞ＣｓＴＦＡ　
　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
　　　　　　　　　　０．２５Ｍこれを蒸留水でρ＝１
．５１とする。

【００４３】５）ピペットを用いて、上からタンパク質
、ＤＮＡ層を取り除き、液を除去して、残渣を回収する
。この残渣を４Ｍ　　ＧＴＣ溶液（５．５Ｍ　　ＧＴＣ
溶液を蒸留水で希釈したもの）４ｍｌに溶かす。６）１００００ｒｐｍ、１０分間遠心して、不溶物を除
く。７）上清に、１Ｍ酢酸１００μｌとエタノール３ｍｌを
加え、−２０℃で５時間静置する。

【００４４】８）１００００ｒｐｍ、２０分間遠心する
。９）残渣を３ｍｌのＴＥに溶かし、１００００ｒｐｍ、
１０分間遠心した後、上清を回収する。＜ＴＥ＞Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）　　　　１０ｍＭＥＤ
ＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１ｍＭ１０）０．３ｍｌの２Ｍ　　ＮａＣｌ
と６ｍｌのエタノール加え、−２０℃で３時間静置して
沈殿させる。１１）１００００ｒｐｍ、１０分間遠心した後、沈殿を
回収する。

【００４５】１２）沈殿をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）１０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ　　１ｍＭ
、ＳＤＳ　　０．１％からなる（緩衝液Ａ）に溶かし、
０．５ｍｇ／ｍｌにする。１３）１Ｍ　　ＮａＣｌを１２）の溶液の等量加える。１４）６５℃で５分間処理した後、急冷する。１５）１２０００ｒｐｍ、５分間遠心して、不溶物を除
去する。１６）Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製Ｔｙｐｅ７オリゴ（ｄＴ
）セルロース０．５ｇを蒸留水で膨潤し、詰めたカラム
を０．１Ｍ　　ＮａＯＨ５ｍｌで洗い、その後、緩衝液
Ａで平衡化する。次いで、０．５Ｍ　　ＮａＣｌ　　１
０ｍｌで平衡化する。１７）１６）のカラムに１５）の上清を通す。１８）溶出液をもう１度同じカラムに通す。

【００４６】１９）緩衝液Ａ　　１０ｍｌで溶出する。これは５００μｌづつ分画し、各分画のＡ２６０　　を
測定し、ピークを回収する（分画４〜７）。

【００４７】２０）２５０ｍｌ　　３Ｍ酢酸ナトリウム
（和光純薬社製）ｐＨ５．１、６ｍｌエタノールを加え
、よく撹拌し、−２０℃で沈殿させる。以上の操作によ
り、ＢＡＬＢ／ｃマウス３週齢の肝臓および脾臓から、
それぞれｍＤＮＡを調製した。

【００４８】（４）　　固定化ｃＤＮＡの合成とそれを
用いた核酸サブトラクション以下の操作により、先ずＢＡＬＢ／ｃマウス３週齢の肝
臓から抽出したｍＲＮＡを鋳型として、支持体上に固定
化したｃＤＮＡを合成し、次いで、この固定化ｃＤＮＡ
を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス３週齢の脾臓から抽出し
たｍＲＮＡを含む核酸溶液を処理し、ハイブリダイゼー
ションを行なった。そして、該核酸溶液に残存する核酸
（ｍＲＮＡ）の分析を行なった。

【００４９】１）ＢＡＬＢ／ｃマウス３週齢の肝臓から
抽出したｍＲＮＡ　　５μｇを１０μｌのＨ２Ｏに溶か
す。２）１μｌの１００ｍＭ　　ＣＨ３ＨｇＯＨを加え、１
０分間放置する。３）７００ｍＭ　　２−メルカプトエタノール（原液を
２０倍に希釈したもの）を２μｌ加え、よく撹拌して、
ＣＨ３ＨｇＯＨを不活性化する。４）直ちに、ＲＮａｓｅインヒビター（ＴＡＫＡＲＡ酒
造社製）６０ユニット（６μｌ）を加え、撹拌後、５分
間放置する。５）■で作製した２７−ｍｅｒのオリゴ（ｄＴ）を固定
化したゲル１０ｍｇを加える。

【００５０】６）以下の溶液で反応させる。５）の混合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２μｌの液成分ファーストストランド合成液　　　　　　　　　　１０
μｌ８０ｍＭ　　Ｎａ−ピロリン酸　　　　　　　　２
．５μｌｄＮＴＰｓ混合液　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５μｌＨ２Ｏ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１４．５μｌ逆転写
酵素（生化学工業製）　　　　　　１０００ユニット４
２℃で２時間反応させる。＜ファーストストランド合成液＞Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）　　　　２５０ｍＭＭ
ｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５０ｍＭＫＣｌ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０ｍＭ

【００
５１】７）６）の反応液に、ＲＮａｓｅＨ（ベーリンガ
ーマンハイム山之内社製）を２ユニット加え、１２℃で
６０分間、２２℃で６０分間反応させる。８）７０℃、１０分間で酵素を失活させる。９）１２０００ｒｐｍ、１分間遠心し、上清を除去する
。１０）５００μｌのＴＥで洗浄した後、１２０００ｒｐ
ｍ、１分間遠心し、上清を除去する。１１）５００μｌ　　ＴＥに懸濁する。１２）２ｍｇ／ｍｌの（ｄＡ）３０（アデニンの３０−
ｍｅｒ）を１００μｌ加える。１３）５Ｍ　　ＮａＣｌ　　１００μｌを加え、撹拌後
、そのまま３７℃で１５分間放置する。１４）１２０００ｒｐｍ、１分間遠心した後、上清を除
去する。

【００５２】１５）沈殿に、脾臓のｍＲＮＡ　　５μｇ
を緩衝液Ａ１００μｌに溶かし、７０℃に加熱した後、
冷却したものを加える。１６）１０μｌ　　５Ｍ　　ＮａＣｌ加える。１７）Ｈ２Ｏを加え５００μｌにする。１８）５５℃で１０分間撹拌し反応させる。１９）１２０００ｒｐｍで１０分間遠心する。２０）上清を回収する。２１）エタノール１．５ｍｌを加え、−２０℃で５時間
保持する。２２）１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、４℃に冷却
した後、上清を除去する。

【００５３】２３）５μｌ　　ＴＥに溶かす。２４）１μｌを取り、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイ
ド２０μｌと混合し、紫外線を照射すると、オレンジ色
に発色した。このことは、ＲＮＡがこの溶液中に存在することを示し
ており、肝臓にはないｍＲＮＡが脾臓にあることが示さ
れた。以上により、サブトラクションが行なわれたこと
が分かる。

【００５４】

【発明の効果】本発明のサブトラクション法によれば、
前記実施例で示したように、内容不明の２つの核酸混合
物の間で相互に存在しない特異的核酸が回収できる。そ
こで、例えば、正常の細胞の核酸を固定化し、病気の細
胞（例えば、癌など）の核酸との間で、本発明の方法を
実施すれば、回収される核酸は、病気に特異的な遺伝子
であることが分かる。

【００５５】このように、本発明のサブトラクション法
は、病気の遺伝子の解明の有用な方法ともなり、また、
２種の核酸混合物をいろいろ組み合わせることにより、
老化の遺伝子、臓器特異的遺伝子等が効率的に回収でき
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　一本鎖核酸をその末端で不溶性の支持
体上に固定化したものを用いて核酸溶液を処理し、該一
本鎖核酸とそれに相補的な塩基配列を有する核酸とをハ
イブリダイゼーションさせ、次いで、核酸溶液中に残存
する核酸を回収することを特徴とする核酸サブトラクシ
ョン法。
【請求項２】　　支持体上に固定化した一本鎖核酸が、
合成ＤＮＡである請求項１記載の核酸サブトラクション
法。
【請求項３】　　支持体上に固定化した一本鎖核酸が、
先ず支持体上にオリゴマーのデオキシチミンを固定し、
これにｍＲＮＡをハイブリダイゼーションさせ、次いで
逆転写酵素を用いて、ｍＲＮＡを鋳型とし、かつ、オリ
ゴマーのデオキシチミンをプライマーとしてｃＤＮＡを
合成し、しかる後ｍＲＮＡを除去して形成された末端が
オリゴマーデオキシチミンを介して支持体上に固定化さ
れたｃＤＮＡである請求項１記載の核酸サブトラクショ
ン法。
【請求項４】　　核酸溶液が、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ
からなる群から選ばれる少なくとも１種の核酸を含有す
る溶液である請求項１記載の核酸サブトラクション法。