JP2001502909A

JP2001502909A - 一本鎖ｄｎａアレイの調製方法

Info

Publication number: JP2001502909A
Application number: JP10520193A
Authority: JP
Inventors: チャールズ，アンドリュー・デイヴィッド
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 2001-03-06
Also published as: GB2318791B; GB9622665D0; GB9722594D0; GB2318791A; WO1998018961A1; EP0935671A1

Abstract

(57)【要約】固体支持体上に固定化された一本鎖ＤＮＡアレイの調製方法であって、（ｉ）固体支持体に取り付けるためのセンス又はアンチセンス鎖上で化学的に修飾された二本鎖ＤＮＡのサンプルを用意する工程と；（ii）固体支持体にＤＮＡを結合させる工程とを含み、工程（ii）の前若しくは後に、非修飾鎖を除去して、固体支持体上に一本鎖ＤＮＡアレイが形成されるようにする上記方法。

Description

【発明の詳細な説明】一本鎖ＤＮＡアレイの調製方法本発明は、遺伝子研究における用途及び診断用途を有する、例えばハイブリダイゼーションアッセイのような、生物学的スクリーニング方法に用いるための核酸アレイの調製方法に関する。固定化核酸のアレイ、特にＤＮＡアレイは、遺伝子研究及び診断目的のために、ますます増大して用いられている。これらのアレイは適当な固体支持体上に固定された二次元マトリックスとして組織化された、複数個のＤＮＡから成る。マトリックス中の各点はＤＮＡ要素を含む。各ＤＮＡ要素は、核酸の複雑な混合物中の相補的配列を検出するためのプローブとして用いることができる。このことは１つの実験において多くのＤＮＡ種の同定と数度(量：abundance)との同時測定を可能にする。このようなアレイは、多様な方法を用いて、例えばニトロセルロースのような多孔質膜上に形成することができる。ドット−ブロット又はスロット−ブロット方法では、複数種類のＤＮＡサンプルを膜の頂部に施用された、予め形成したウエルのアレイから成るマニホルド中に入れて、真空を用いて膜に通してＤＮＡを吸引することによって膜に移される。この方法の他の態様では、ピンのアレイを用いて、例えばマイクロタイター・プレートのウエルに含有されるＤＮＡサンプルからＤＮＡを膜表面上に移すことによって、ＤＮＡが直接膜に施用される［Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｈ．等，“ゲノム・マッピングと配列決定におけるハイブリダイゼーション・フィンガープリンティング”，“ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ ”，１巻，Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｅ．とＴｉｌｇｈｍａｎＳ．Ｍ．（編集），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｔｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９０，３８〜８２頁；Ｎｉｚｅｔｉｃ，Ｄ．等，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ），１９９１，８８，３２３３〜３２３７］。或いは、in situ合成又は直接施用のいずれかによって、ＤＮＡアレイを例えばガラスのような非多孔質表面上に形成することができる。例えば、マスクによって保護された、化学的に感作されたガラス表面から出発して、選択された暴露表面を適当に修飾されたヌクレオチドと反応させることによって、オリゴデオキシヌクレオチドのアレイをアセンブルすることができる。マスクとヌクレオチド試薬との適当な選択によって、明確に定められた(defined)配列の合成オリゴデオキシヌクレオチドのアレイをガラス表面上に作製することができる［例えば、Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｗ．とＦｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１２，１９〜２６；Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．等，国際特許出願第ＷＯ９２／１０５８８号，１９９２年６月２５日発行；Ｃｈｅｅ，Ｍ．等，国際特許出願第ＷＯ９５／１１９９５号，１９９５年５月４日発行を参照のこと］。他のアプローチはＳｏｕｔｈｅｒｎによって述べられている［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，ヨーロッパ特許第０３７３２０３Ｂ１号，１９９４年８月３１日発行］。これらのアレイにアセンブルされたオリゴヌクレオチドの最大長さは、実際には通常２０〜２５ヌクレオチド以下の長さであるオリゴヌクレオチドをアセンブルするために用いられる化学によって制限される。他のアプローチでは、例えばガラス顕微鏡スライドのような非多孔質表面上の規則的な所定の位置に、自動装置のマイクロピペッティング(robotic micropipe tting)によって、例えば９６ウエルプレートのような容器から少量の、典型的にはナノリットル以下の少量のＤＮＡを移すことによって、さらに長いＤＮＡ種のアレイを構成することができる。各ＤＮＡサンプルを顕微鏡スライド上の既知位置に結合させて、アレイの１つのＤＮＡ要素を構成する。このような装置を用いて、数千の個々のＤＮＡ要素のアレイを支持する、多数のレプリカ・スライドを構成することができる［Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，４６７〜４７０；Ｓｈａｌｏｎ，Ｔ．Ｄ．とＢｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，国際特許出願第ＷＯ９５／３５５０５号，１９９５年１２月２８日発行］。この後者のアプローチでは、固体支持体に移されるＤＮＡサンプルは典型的に、５０ｂｐより長い長さの二本鎖ポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントである。これらのＤＮＡは例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーのような、多くのソース(source)から得ることができ、既知又は未知のいずれの配列組成であることもできる。ＤＮＡは多くの方法によって固体支持体にカップリングさせることができる。例えば、ポリ−Ｌ−リシンのようなポリカチオンポリマーのコーティングフィルムとの非共有的静電相互作用によって、ＤＮＡはガラスに結合することができる［例えば、Ｓｈａｌｏｎ，Ｔ．Ｄ．とＢｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，国際特許出願第ＷＯ９５／３５５０５号，１９９５年１２月２８日発行を参照のこと］。或いは、ＤＮＡは固体支持体に共有結合することもできる。ＤＮＡを固体支持体に共有結合させるために、支持体の性質に依存して、利用可能な多くの方法が存在する。固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドＤＮＡプローブのアレイを用いて、ハイブリダイゼーション方法によるＤＮＡの複雑な混合物の組成を調べることができる。典型的な用途では、標識ｃＤＮＡの複雑な混合物をＤＮＡアレイに、適当なストリンジェンシー(stringency)の条件下でハイブリダイズさせ、非結合物質を洗い流す。次に、例えば走査蛍光顕微鏡のような、残留する結合した標識ｃＤＮＡを感知することができる検出方法を用いて、アレイを走査する。アレイ中の任意の特定要素における検出シグナルの強度は、オリジナルの複雑な混合物中の対応する相補的ｃＤＮＡの濃度の尺度である［Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，４６７〜４７０；Ｓｈａｌｏｎ，Ｔ．Ｄ．とＢｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，国際特許出願第ＷＯ９５／３５５０５号，１９９５年１２月２８日発行；Ｐｉｎｋｅｌ，Ｄ．等，国際特許出願第ＷＯ９６／１７９５８号，１９９６年６月１３日発行］。アレイ中の種々な位置に選択されたセンス、アンチセンス、ミスセンス又はノンセンス配列を含有する要素を用いる、固定化オリゴヌクレオチドのアレイは既に述べられている。このようなアレイは多くの用途に、例えばＤＮＡ配列を知るために用いられている［例えば、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１２，２７〜３２と、この中の参考文献；Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．等，国際特許出願第ＷＯ９２／１０５８８号，１９９２年６月２５日発行；Ｃｈｅｅ，Ｍ他、国際特許出願ＷＯ９５／１１９９５，１９９５年５月４日発行］。他の用途では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのアレイが、遺伝的多型を検出し、遺伝子型を決定するために、用いられている［例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，ヨーロッパ特許第０３７３２０３Ｂ１号，１９９４年８月３１日発行；Ｇｕｏ，Ｚ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，５４５６〜５４６を参照のこと］。しかし、任意の特定のオリゴヌクレオチドは特定のストリンジエンシーで２つ以上のターゲットＤＮＡの配列にハイブリダイズすることができるので、このようなアレイは例えばｃＤＮＡのような標識ポリヌクレオチドＤＮＡターゲットの複雑な混合物をプローブするために用いる場合に限定を有する。ターゲットＤＮＡの配列が既知である場合に、各遺伝子に対して特有のハイブリダイゼーション・シグナルを与える幾つかのセットのオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなセットをアレイ中の１つ以上の要素に結合させて、任意の既知ターゲットに特徴的なハイブリダイゼーション・シグナルを与えることができる［Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．等，国際特許出願第ＷＯ９２／１０５８８号，１９９２年６月２５日発行；Ｃｈｅｅ，Ｍ．等，国際特許出願第ＷＯ９５／１１９９５号，１９９５年５月４日発行］。しかし、ターゲットＤＮＡの配列が未知又は不完全である場合に、このようなアプローチを正確に適用することができない。オリゴヌクレオチド・アレイをin situ合成法によって構築する場合には、追加のターゲット遺伝子の添加は、かなりの費用をかけてアレイ全体を再合成することを必要とする。対照的に、より長い非オリゴヌクレオチド・プローブＤＮＡのアレイはターゲットＤＮＡへのハイブリダイゼーションに関して非常に高度な特異性を与える。しかし、現在までのこのようなアレイの全ては、アレイ中の各ＤＮＡ要素内に特定ＤＮＡフラグメントのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の混合物を組み入れていた。特定ＤＮＡ要素にハイブリダイズする対応ターゲットＤＮＡの両方の鎖を検出することが望ましい場合には、このことは問題ではない。しかし、ターゲット核酸の複雑な混合物中の任意の特定のターゲットＤＮＡの１つの鎖のみを検出することが有利であると考えられる用途が存在する。例えば、標識ｍＤＮＡターゲットの直接検出は、各要素におけるアンチセンス鎖ＤＮＡプローブのみを必要とする。或いは、ｍＤＮＡ鋳型から逆転写酵素によって合成された第１鎖標識ｃＤＮＡターゲットの直接検出はセンス鎖ＤＮＡプローブのみを必要とする。このような場合に、各ＤＮＡ要素内のプローブの好ましくないセンス又はアンチセンス鎖の存在は、ターゲット・ハイブリダイゼーションに利用可能なプローブ部位の数を減ずることによってシグナル感度を低下させる。これはまた、非特異的ターゲットＤＮＡにハイブリダイズすることによって、バックグラウンド・シグナルを高める可能性もある。本出願人等は、センス又はアンチセンス・ポリヌクレオチドＤＮＡプローブのいずれかを含む要素を含有する一本鎖アレイの調製方法を今回提案している。これらは、標識ＲＮＡ又は標識一本鎖ｃＤＮＡのいずれかと共にハイブリダイゼーション・アッセイにプローブとして用いられる場合のアレイの感度を高めるために用いられる。本発明の第１態様では、固体支持体上に固定化した一本鎖ＤＮＡのアレイの調製方法であって、（ｉ）固体支持体に取り付けるためのセンス又はアンチセンス鎖上で化学的に修飾された二本鎖ＤＮＡサンプルを用意する工程と、（ii）ＤＮＡを固体支持体に結合させる工程とを含み，工程（ii）の前又は後に、非修飾鎖を除去して、一本鎖ＤＮＡのアレイを固体支持体上に形成するようにする方法を提供する。本発明の他の態様では、固体支持体に結合されない鎖に第２の化学的修飾を施す。この第２の化学的修飾の目的は、２つの鎖の分離又は好ましくない鎖の選択的分解を容易にすることである。一本鎖ＤＮＡは好ましくは７５ヌクレオチドより多く、例えば１００ヌクレオチドより多く、又は２００ヌクレオチドより多くを含有するＤＮＡ分子を含む。ヌクレオチドの好ましい範囲は１００〜１０，０００、２００〜１０，０００及び３００〜１０，０００を包含する。センス及び／又はアンチセンス鎖上で化学的に修飾された二本鎖ＤＮＡのサンプルは、化学的に修飾されたプライマー（単数又は複数）の伸長によって便利に形成される。このようなプライマー（単数又は複数）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして好ましく用いられ、それによって所望の化学的修飾（単数又は複数）が二本鎖ＤＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖中に選択的に組み込まれる。プライマー（単数又は複数）は任意の都合の良い位置（単数又は複数）において修飾することができる。修飾（単数又は複数）はプライマーの５’ヌクレオチドに、５’ホスフェート、５’デオキシリボース基又は５’塩基（アデニン、グアニン、チミジン又はシトシン）のいずれかにおいて加えることが好ましい。一般に、修飾は固体表面に結合するための化学的官能性(chemical functionality) を、ターゲット核酸へのプローブＤＮＡの接近可能性を改良するための適当な長さの任意のスペーサー基と共に添加することを含む。共有結合と非共有結合の両方を用いることができる。１つの実施態様では、化学的官能性は、例えば固体表面のストレプトアビジン・コーティングと相互作用するビオチン部分のように、固体表面へ非共有結合を導くことができる。他の実施態様では、化学的官能性は選択されたＤＮＡ鎖を固体表面に共有的に結合させることができる。ＤＮＡの化学的修飾は１つ以上の工程で行うことができる。固体支持体上へのアレイ形成の前又は後に、各ＤＮＡプローブのセンスとアンチセンス鎖とを分離することができることは理解されるであろう。分離は例えば熱若しくはアルカリを用いるプローブの物理的変性、又は例えば適当なエキソヌクレアーゼを用いる、好ましくない鎖の酵素分解、又は両方の方法の組合せを含むことができる。本発明のさらなる態様では、各プローブが少なくとも７５ヌクレオチドを含み、固体支持体上に固定化されている一本鎖プローブＤＮＡのアレイを提供する。より好都合には、各プローブは少なくとも１００若しくは２００ヌクレオチド、例えば少なくとも５００又は１，０００ヌクレオチドを含む。特定の範囲は３００〜１０，０００ヌクレオチドである。このようなアレイの特別の利点は、プローブＤＮＡの配列が未知であってもよいことである。各プローブＤＮＡはある一定の遺伝子配列のセンス又はアンチセンス鎖でありうる。本発明の他の特定の態様では、アレイ中の全てのプローブＤＮＡはアンチセンス鎖ＤＮＡであるか、又はアレイ中の全てのプローブＤＮＡはセンス鎖ＤＮＡである。アレイは好都合には少なくとも１０個のＤＮＡ要素、例えば少なくとも１００個の要素を含む。他の好都合なアレイは少なくとも１，０００、１０，０００又は１００，０００個のＤＮＡ要素を含む。本発明はまた、このような選択された一本鎖アレイを単一細胞種類又は細胞種類の混合集団を含む生物学的サンプルに由来するような、複雑な混合物内の個々のｍＤＮＡ又はそれらの対応第１鎖ｃＤＮＡの数度の定量的推定値を得るために用いることができる方法をも提供する。数度は、アレイ中の各要素の一本鎖プローブＤＮＡと、ｍＤＮＡ又はｃＤＮＡの複雑な混合物内の相補的鎖との間のハイブリダイゼーションの程度を測定することによって決定される。このようなハイブリダイゼーションを検出するために、複雑な混合物中のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子中に例えば蛍光ヌクレオチドのようなラベルを組み入れる。本発明のこの態様の実施では、ｍＲＮＡを細胞から単離し、ｉｎｖｉｔｒｏで直接標識するか、又は好ましい実施態様では、第１鎖ｃＤＮＡに転化させ、この場合にはラベルを修飾ヌクレオチドに導入し、この修飾ヌクレオチドを逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡ中に組み入れる。この態様では、逆転写酵素によって生成された一本鎖ＤＮＡの集団内の任意の特定のｃＤＮＡ種の数度を用いて、生物学的サンプル内の対応ｍＤＮＡの数度を表す。各ポリヌクレオチドプローブのセンス又はアンチセンス鎖のいずれかが各要素に固定化されている要素対を含有する特定の一本鎖アレイに、標識ｃＤＮＡをハイブリダイズさせる。アレイ中の各要素に存在する固定化ＤＮＡの量は、アレイに適用されるサンプル内の対応ターゲットｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの量よりもかなり大きいように制御される。このような条件下で、用いるハイブリダイゼーション条件下で各要素に結合した状態で留まる標識ターゲット核酸（ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の量はオリジナルサンプル中の各ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの濃度を表す。結合ターゲット核酸はターゲット核酸に運ばれるラベルを測定することができる適当な検出系、例えば走査蛍光顕微鏡を用いて測定することができる［例えば、ＳｃｈｅｎａＭ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，４６７〜４７０参照］。特定のｃＤＮＡ（そして従って、その親ｍＲＮＡ）の数度は、特定のセンス要素における、例えば蛍光強度のような、特異的ハイブリダイゼーション・シグナルの強度を、その対応アンチセンス要素において得られるシグナルによって測定される非特異的ハイブリダイゼーションに比較することによって定量することができる。この方法では、多重ｃＤＮＡの絶対数度の正確な定量を単回実験で得ることができる。このような一本鎖アレイは、多様な細胞種類又は集団中の例えばｍＲＮＡ又はそれらの対応第１鎖ｃＤＮＡのような、一本鎖核酸種の数度の定量に容易に用いることができる。このようにして得られた数度情報を用いて、特定の細胞の種類又は細胞集団内の多数の遺伝子の発現を表す定量的転写体プロフィルを描くことができる。この情報を用いて、例えば罹患組織対正常組織、又は治療された組織対治療されない組織においてどの遺伝子が示差的に発現されるかを調べ、診断及び疾患過程のモニターに、並びに健康な状態を回復するための新しい治療法を同定するための研究に貴重な情報を与えることができる。本発明を次に、以下の詳細な説明と実施例を参照して説明するが、これらによって限定されない。 i）定義本明細書で用いる限り、“動物”なる用語はその最も広い意味で用いられ、動物界のあらゆるメンバーを包含する。本明細書で用いる限り、“生物学的サンプル”なる用語は、ターゲット核酸の供給源を提供するように選択されうる任意の生物からの如何なる状態の如何なる細胞又は組織をも包括する。本明細書で用いる限り、“疾患”又は“疾患状態”なる用語は、同じ種の生物において生物の遺伝子の示差的発現(differential expression)に関して正常又は標準的な健康状態から逸脱する如何なる状態をも意味する。疾患状態とは、（ｉ）健康な生物において正常ではサイレントであるが罹患状態では疾患の原因として若しくは疾患に対する反応として活性化される、又は（ii）健康な生物において正常では幾らかの標準的範囲内で発現されるが罹患状態では疾患の原因として若しくは疾患に対する反応として過度若しくは過少に発現される遺伝子の発現を特徴とするか又はこのような発現によって表されうる、遺伝的起源又は環境的起源の如何なる疾患又は障害をも意味する。本明細書で用いる限り、“要素”又は“ＤＮＡ要素”なる用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかでありうる、多くの固定化ＤＮＡ分子を意味し、これらは複数個のこのような要素から構成される二次元マトリックス内の１点を定義する特定の物理的位置において固体支持体に結合されている。本明細書で用いる限り、“ＥＳＴ”又は“発現された配列タグ”なる用語は、選択された細胞、細胞種類、組織若しくは組織種類、器官又は生物から調製されるゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから得られる、典型的に５０〜５００連続ヌクレオチドから成る部分的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を意味し、このより長い配列はこのライブラリー中に存在する遺伝子のｍＲＮＡに相当する[Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２，１６５１〜１６５６と、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０５２２２号，１９９３年１月７日発行とを参照のこと ]。ＥＳＴは一般にＤＮＡである。本明細書で用いる限り、“遺伝子”なる用語は、ｃＤＮＡ配列が由来するゲノムヌクレオチド配列を意味する。本明細書で用いる限り、“固定化”なる用語は、プローブＤＮＡの固体支持体への取り付けを意味する。この取り付けは共有結合又は非共有結合のいずれの性質であることもでき、用いられる固体支持体の性質に依存する。本明細書で用いる限り、“インサート”なる用語は、当業者に利用可能な分子生物学の方法を用いてベクター内に組み入れられる任意のＤＮＡ配列を意味する。本明細書で用いる限り、“オリゴヌクレオチド”なる用語は、５０ヌクレオチドまで、より典型的には２０ヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡを含有する分子を意味する。本明細書で用いる限り、“生物”なる用語は、非限定的に、微生物、植物及び動物を包含する。本明細書で用いる限り、“プローブ”なる用語は、固体支持体に固定化されたＤＮＡ要素内のＤＮＡ種を意味する。本明細書で用いる限り、“固体支持体”なる用語は、固定化オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドＤＮＡ配列の、サンプル中の他のポリヌクレオチド配列への検出可能なハイブリダイゼーションを可能にするために利用可能な方法によって、プローブＤＮＡを固定化するために有用である、任意の既知基体を意味する。このような有用な固体支持体は、非限定的に、紙、ニトロセルロース、ミエリン、ガラス、シリカ、ナイロン、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリスチレン）、又は他の固体物質を包含する。さらに、“ 固体支持体”なる用語は、アガロース、ポリアクリルアミド、多糖又はタンパク質のような物質から構成されるゲルを意味することもでき、これらのゲルはそれら自体で例えばガラス又は金属のような他の固体表面を覆って、機械的強度、導電性又は他の望ましい物理的性質を得ることができる。固体支持体が多孔質である場合には、“固体支持体”なる用語は、孔度の範囲に関係なく、系の性質に依存して呼ばれる。本明細書で用いる限り、“表面”なる用語は、所望のプローブＤＮＡが取り付けられる又は固定化される固体支持体上の任意の一般に二次元の構造を意味する。本明細書で用いる限り、“ターゲット”なる用語は、例えば当業者によるその検出を可能にするように標識されることができる核酸又はその任意の個々の成分の任意の複雑な混合物を意味する。本明細書で用いる限り、“ベクター”なる用語は、宿主生物内で維持及び複製されることができるＤＮＡ配列を意味する。“ベクター”なる用語は、非限定的に、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）のようなプラスミド、又は例えばＬａｍｂｄａＵｎｉＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなバクテリオファージを包含する。（ii）プローブ調製次のアレイ化のためのプローブ生成に用いられるＤＮＡは、非常に多くの供給源から得ることができる。例えば、ＤＮＡフラグメントは問題の生物から調製されたＤＮＡライブラリーからのクローンの無作為選択から得ることができる。例えばヒト又は齧歯類のような動物の場合には、これらのクローンを１種類以上のｃＤＮＡライブラリーから得ることが好ましい。また、例えばインサートＤＮＡの部分的配列分析によって、又は特定の染色体遺伝子座にインサートＤＮＡをマッピングすることによって、ある程度特徴付けられたクローンのコレクションからフラグメントを選択することもできる。このようなクローンは、非限定的に、ヒト又は齧歯類のｃＤＮＡライブラリーから単離され、各クローンに対する１つ以上のＥＳＴの形成によって特徴付けられたクローンのＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．ＥＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍコレクションを包含することができる［Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．等，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９６，３３，１５１〜１５２］。細菌遺伝子に由来するプローブの場合には、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いることもできる。各クローンは、適当なベクター内の既知部位に挿入されたポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントから成る。ベクターは例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなプラスミド・ベクター、又は例えばＬａｍｂｄａＵｎｉＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなバクテリオファージ・ベクターであることができる。選択されたＤＮＡライブラリーからの個々の細菌クローンを標準方法を用いて適当な液体培地中で培養する。各培養物の小サンプルを鋳型ＤＮＡの供給源として用いて，次にインサートＤＮＡ配列に直接隣接するベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅させる。この方法では、本発明を実施するために、インサートを含むポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントの配列を知る必要はない。選択された一本鎖プローブを製造するために、選択された鎖のＤＮＡポリメラーゼ依存性合成を導くために用いられるプライマーは、この鎖を固体支持体にカップリングさせる(couple)ために用いられる第１の化学的修飾を含有する。核酸を多様な固体表面に固定化することができる多くの方法が、当該技術分野で知られている。その好ましい実施態様において、化学的修飾は、オリゴヌクレオチドの合成中に、プライマーの５’ヌクレオチドに、５’ホスフェート、５’デオキシリボース基又は５’塩基（アデニン、グアニン、チミジン又はシトシン）のいずれかにおいて組み入れられる。しかし、５’プライマー配列内の他の位置においても修飾を行うことができる。修飾は固体表面に結合するための化学的官能性を、ターゲット核酸へのプローブの接近可能性を改良するための適当な長さの任意のスペーサー基と共に含む［リンカー設計に影響するファクターの考察に関して、例えば、Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ．とＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，２０，１６７９〜１６８４を参照のこと］。１実施態様では、化学的官能性は例えば固体表面のストレプトアビジン・コーティングと相互作用するビオチン部分のように、固体表面への非共有結合を導くことができる。他の実施態様では、化学的官能性は選択されたＤＮＡ鎖を固体表面に共有的にカップリングさせることができる。種々な化学的官能基の導入によってＤＮＡを固体表面に共有的に取り付けるためには多くの方法がある［例えば、Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．Ｓ．とＭｕｓｓｏ，Ｇ．Ｆ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５，５３５３〜５３７２；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｒ．等，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，１６４，３３６〜３４４；Ｇｕｏ，Ｚ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，５４５６〜５４６５を参照のこと］。用いるべき化学的官能性の適切な選択は、ＤＮＡが固定化されることになる固体表面の性質に依存する。スペーサー基は例えば一般式−（ＣＸ₂）ｎ−（式中、ＸはＨ又はＦであることができ、ｎは一般に６〜２０である）で表される長鎖炭化水素であることができる。センス鎖プローブの場合には、センス鎖のＤＮＡポリメラーゼ依存性合成を導くために用いられるプライマーは、この鎖を固体支持体にカップリングさせるために用いられる第１の化学的修飾を含有する。この場合には、対応するアンチセンス鎖プライマーは非修飾形であるか又は、センスプライマーに用いられた化学的修飾とは異なる、第２の化学的修飾を含有する。この実施態様では、アンチセンス鎖に行われる修飾は、以下で述べるような、その後の鎖分離を容易にするように設計される。例えば、センス鎖プライマーが５’６−アミノヘキシルーホスホジエステル基を含有する場合には、アンチセンス鎖プライマーは５’ホスフェート又は５’ビオチニル化ヌクレオチド誘導体を含有することができる。アンチセンス鎖プローブの場合には、アンチセンス鎖のＤＮＡポリメラーゼ依存性合成を導くために用いられるプライマーは、この鎖を固体支持体にカップリングさせるために用いられる第１の化学的修飾を含有する。この場合には、対応するセンス鎖プライマーは非修飾形であるか又は、アンチセンスプライマーに用いられた化学的修飾とは異なる、第２の化学的修飾を含有する。この実施態様では、センス鎖に行われる修飾は、以下で述べるような、その後の鎖分離を容易にするように設計される。例えば、アンチセンス鎖プライマーが５’６−アミノヘキシル−ホスホジエステル基を含有する場合には、センス鎖プライマーは５’ホスフェート又は５’ビオチニル化ヌクレオチド誘導体を含有することができる。個々のクローンから得られたＤＮＡにＰＣＲ反応を実施して、選択された鎖アレイにプローブとして用いられることになる所望の数の５’修飾ポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントを得る。これらの反応は９６ウエル又は３８４ウエルプレート中のサンプルと、このようなプレートを扱うように特に設計されたサーモサイクラーとを用いて、多数回、効率的に実施することができる。各鋳型に必要なＰＣＲ条件は適切な適用に依存し、当業者によって容易に最適化されることができる。例えば、ＰＣＲミックスから低分子量成分を除去するＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００のような、適当な精製媒体を用いて、生成物を部分的に精製して、塩、過剰なプライマー及び過剰なヌクレオチドを除去することができる。（iii）一本鎖アレイの調製修飾されたセンス又はアンチセンスプライマーを用いて調製されるＰＣＲ生成物は２つの方法でセンス鎖とアンチセンス鎖とに分離することができる。第１実施態様では、固体支持体上にアレイ化する前に２つの鎖を分離する。これを行うために望ましい１方法は、好ましくない鎖が５’末端に１つ以上のビオチニル化ヌクレオチドを含有するＰＣＲ生成物を生成することである［Ｇｕｏ，Ｚ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，５４５６〜５４６５］。このＰＣＲ生成物を、洗浄して例えば塩、プライマー及び遊離ヌクレオチドのような他の試薬を除去することができるストレプトアビジン被覆アガロース・ビーズに結合させ、次に、０．１ＮＮａＯＨによる１０分間の処理によって２つの鎖を分離する。結合した好ましくない鎖を含むビーズを遠心分離によって除去して、所望の非ビオチニル化鎖を含有する上澄み液をデカントして、ＨＣｌによってｐＨ７．０に中和する。次に、この鎖をアレイ化して、それがその５’末端に含有する官能性（例えば、１，４−フェニレンジーイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）によって活性化されたガラスにカップリングする５’アミノヘキシル−ホスホジエステル基）によって固体支持体に結合させる。第２実施態様では、二本鎖ＰＣＲ生成物を最初にアレイ化して、選択された鎖を固体支持体に、適当なＰＣＲプライマーに組み入れた所望の化学を用いてカップリングさせる。例えば、５’アミノヘキシル−ホスホジエステル基を含有する鎖をＤＩＴＣ活性化ガラスにカップリングさせることができる。この実施態様では、好ましくない鎖は５’アミノ基を有さないＰＣＲプライマーを用いて生成されているので、この好ましくない鎖は固体支持体にカップリングすることができない。次に、アレイ化二本鎖プローブを例えば０．１ＮＮａＯＨ含有浴を用いて変性させて、好ましくない鎖を洗い流す。次に、固体支持体をｐＨ７．０の中和浴に入れて、選択された鎖アレイを生成する。他の実施態様では、二本鎖ＰＣＲ生成物を最初にアレイ化して、選択された鎖を固体支持体に、この鎖のための適当なＰＣＲプライマーに組み入れた所望の化学を用いて結合させる。この実施態様では、この好ましくない鎖は非修飾５’ホスフェート基を有するＰＣＲプライマーを用いて合成される。次に、この鎖を５ ’−３’エキソヌクレアーゼ（例えば、５’末端が５’末端ホスフェート基を含有しないかぎり５’末端に作用することができないλエキソヌクレアーゼ）を用いて酵素分解する［“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”），Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．Ｍ．等（編集），Ｇｒｅｅｎ／Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９５，１５．２．５頁］。本発明の他の実施態様では、酵素分解と、その後のアルカリ変性、洗浄及び中和との組合せによって、好ましくない鎖を除去することができる。この組合せは、１０ｋｂに近い長さのポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントに由来するプローブに特に有効である。プローブＤＮＡを各要素位置で固体支持体に５’化学リンカーによって共有カップリングすることは幾つかの利点を有する。これは、必然的にシグナル損失を伴う、貯蔵とその後の処理中の化学的分解に耐性である、固体表面へのＤＮＡの強固な結合を保証する。重要なことは、これはまたターゲットＤＮＡ配列に自由にハイブリダイズする一本鎖プローブＤＮＡの最大量をも提供する。このことは、非特異的な静電相互作用、例えばポリ−Ｌ−リシン被覆スライドへのプローブＤＮＡの結合（この場合には、ＤＮＡプローブの一部がポリ−Ｌ−リシンと錯体形成するため、ターゲットＤＮＡへのハイブリダイゼーションのために有効ではない）に基づく方法を凌駕する重要な利点である。アレイ中の各要素においてアレイ化して、ターゲット核酸に自由にハイブリダイズすることができる一本鎖ＤＮＡ量は、固体表面の性質と、固体表面にプローブを結合させるために用いられる化学とに応じて変化する。しかし、これは分析すべきサンプル中のその対応標識ターゲット核酸の濃度に比べて常に過剰であることを保証するほど充分な量で存在する。この方法では、得られるハイブリダイゼーション・シグナルの強度は生物学的サンプル中に存在するターゲット核酸の量に比例する。本発明の他の態様では、単一固体表面に固定化されたセンス鎖を含む複数個のＤＮＡ要素を含み、各要素中の鎖が異なるポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントに由来し、上記方法によって調製されるものであるセンス鎖アレイを提供する。同じ方法で、単一固体表面に固定化されたアンチセンス鎖を含む複数個のＤＮＡ要素を含み、各要素中の鎖が異なるポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントに由来し、上記方法によって調製されるものであるアンチセンス鎖アレイを提供する。本発明の好ましい実施態様では、特定ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかを含む要素対を含有する混合アレイを構築することができる。要素対はアレイ内で必ずしも並列にアレイ化される必要はない。２種類の要素を同じアレイ又は異なるアレイのいずれに適切に配置するかは、これらが予定される適切な用途に依存する。（iv）ハイブリダイゼーション上述したように生成された、選択された一本鎖アレイは、複数個の一本鎖ターゲット核酸、選択された生物学的サンプルから単離され、例えば放射性標識、蛍光標識又は化学発光標識のような、当業者に公知の方法によって標識されているｍＲＮＡ又は、好ましくは、第１鎖ｃＤＮＡを含むサンプルにハイブリダイズすることができる［例えば、ＳｃｈｅｎａＭ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，４６７〜４７０を参照のこと］。標識ｍＲＮＡの場合には、特異的ハイブリダイゼーションはアンチセンス一本鎖プローブを含む要素のアレイを用いて測定され、非特異的ハイブリダイゼーションは対応するセンス一本鎖プローブのアレイを用いて測定される。これらの２種類のプローブセットは、上述したように、同じ又は別々の固体表面に固定されることができる。標識ｃＤＮＡの場合には、特異的ハイブリダイゼーションがセンス一本鎖プローブを含む要素のアレイを用いて測定され、非特異的ハイブリダイゼーションは対応するアンチセンス一本鎖プローブのアレイを用いて測定される。これらの２種類のプローブ・セットは、上述したように、同じ表面に固定化されることも、別々の固体表面に固定化されることもできる。固体支持体におけるハイブリダイゼーション条件は支持体とアレイ化ＤＮＡの性質に依存するが、当業者に利用可能な多くの方法を用いて定義され、最適化されることができる［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｔｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照のこと］。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェント条件下で、即ち、９５％を越える核酸同一性を明らかにするような条件下で行われる。しかし、必要な場合には、他の比較的ストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件を選択することもできる。特定の核酸種のハイブリダイゼーションは、用途のために選択された特定のストリンジェンシーでアレイを洗浄した後にアレイ中にそのコグネイト要素を結合して留める標識ターゲット核酸からのシグナルの強度を測定することによって検出される。複数の核酸中の特定の一本鎖核酸種（ｍＲＮＡ又は第１鎖ｃＤＮＡ）の絶対数度は、その特定核酸種に対する特異的ハイブリダイゼーション・シグナルを与えるアレイ中の要素におけるシグナルから、非特異的ハイブリダイゼーションに相当するアレイ中の要素におけるシグナルを控除することによって算出することができる。特定のｍＤＮＡの発現が何らかの状態で、例えば罹患状態では正常状態に比べて変化するかどうかを知るために、罹患生物学的サンプルと正常生物学的サンプルとから単離したターゲット核酸の標識サンプルに同じアレイをハイブリダイズさせる。測定された数度の差を用いて、いずれの遺伝子が選択された疾患状態の原因、維持又は進行に関与しうるのかを示すことができる。同じアプローチを薬物治療の効果、又は生物学的サンプル内の遺伝子の発現レベルに関する細胞セット若しくは生物の他の研究又は操作をフォローするために用いることができる。実施例１ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に、ポリＡテールを包含する、インサートＤＮＡの３’ 末端がＸｈｏＩ部位に直接隣接して配置されるように、一方向にクローン化されたｃＤＮＡインサートを含有するヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンセットから、アレイ要素を選択した。このライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ菌株ＳＯＬＲ^TM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に維持した。平均インサートサイズは１．５ｋｂであった。無作為に選択したクローンを９６深ウエルマイクロタイタープレートに移し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬ−ブロス中で増殖させた。センスプローブを作製するために、ＤＮＡインサートを２つの制限部位に直接隣接するベクター配列に相当する２４ｎｔプライマー対を用いて増幅させた。ＥｃｏＲＩ部位に対して５’側のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列に相補的なセンスプライマーをその５’末端に６−アミノヘキシルーホスホジエステルを有するように合成した。ＸｈｏＩ部位に対して３’側のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列に相補的なアンチセンスプライマーをその５’末端において標準方法によってビオチニル化した［Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８６，１４，６２２７〜６２４５］。修飾プライマーによるＰＣＲ反応を、最終反応量７０μｌで、９６穴サーモサイクラーにおける細菌培養物の少量（典型的には＜１μｌの一晩培養物）上で直接行った。各ＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ^TMＰＣＲ精製キット（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製した。鎖分離と、アンチセンス鎖の除去とは既述したように行った［Ｇｕｏ，Ｚ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，５４５６〜５４６５］。残留するセンス鎖５’アミノ修飾プローブを真空中で乾燥させ、２０μｌの１００ｍＭ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝剤（ｐＨ９．０）中に再溶解した。アンチセンス鎖プローブを作製するために、５’６−アミノヘキシル−ホスホジエステル基を有するアンチセンスプライマーと、ビオチニル化センスプライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を上述したように実施した。得られた生成物を上述したように精製し、鎖分離した。予め清浄したガラス顕微鏡スライドを１％３−アミノトリメトキシシラン溶液（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）によって処理し、洗浄し、乾燥させ、Ｇｕｏ等が述べているように、１，４−フェニレンジ −イソチオシアネートによって活性化する［Ｇｕｏ，Ｚ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，５４５６〜５４６５］。センス鎖ＤＮＡ又はアンチセンス鎖ＤＮＡのいずれかの２μｌサンプル（典型的に、０．２５〜０．５μｇのＤＮＡ）を手動で顕微鏡スライド上にスポットする。このスライドを含湿雰囲気(humdified atmosphere)中で３７℃において２時間インキュベートし、１％ＮＨ₄ＯＨと水とによって洗浄し、室温において風乾させる。センス及びアンチセンスプローブを含む要素対(paired elements)のアレイを含有するガラススライドを、ＨｅｐＧ２細胞から単離され、本質的にＳｃｈｅｎａ等が述べているように［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，４６７〜４７０］、蛍光ヌクレオチド類似体ｄＣＴＰ−Ｃｙ５（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）によって標識されたポリＡｍＲＮＡの逆転写によって調製された第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。標識ｃＤＮＡ（７．５μｌ中５μｇ）は９５℃において変性する。２．５μｌの濃縮ハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）を加え、混合物をガラス顕微鏡スライドの、カバースリップ下のアレイ上に移す。ハイブリダイゼーションを含湿雰囲気中で６５℃において１２時間行い、スライドを６０℃の０．１ｘＳＳＣによって２回洗浄する。Ｇｕｏ等が述べているように［Ｇｕｏ，Ｚ．等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，５４５６〜５４６５］、蛍光検出と画像再構成とを行う。

Claims

【特許請求の範囲】１．固体支持体上に固定化された一本鎖ＤＮＡアレイの調製方法であって、（ｉ）固体支持体に取り付けるためのセンス又はアンチセンス鎖上で化学的に修飾された二本鎖ＤＮＡのサンプルを用意する工程と；（ii）固体支持体にＤＮＡを結合させる工程とを含み、工程（ii）の前又は後に、非修飾鎖を除去して、固体支持体上に一本鎖ＤＮＡのアレイを形成するようにする上記方法。２．一本鎖ＤＮＡが７５ヌクレオチドより多くを含有するＤＮＡ分子を含む、請求項１記載の方法。３．固体支持体に結合されない鎖を化学的に修飾して、鎖分離又はその選択的分解を容易にする、請求項１又は請求項２に記載の方法。４．二本鎖ＤＮＡが化学的に修飾されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの増幅生成物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．各プローブが少なくとも７５ヌクレオチドを含み、固体支持体上に化学的に固定化される、一本鎖プローブＤＮＡのアレイ。６．各プローブが少なくとも２００ヌクレオチドを含む、請求項５記載のアレイ。７．プローブＤＮＡが未知配列である、請求項５又は請求項６に記載のアレイ。８．プローブＤＮＡがアンチセンス鎖ＤＮＡである、請求項５〜７のいずれか１項に記載のアレイ。９．プローブＤＮＡがセンス鎖ＤＮＡである、請求項５〜７のいずれかに記載のアレイ。１０．単一細胞種類又は細胞種類の混合集団を含む生物学的サンプルに由来するような複雑な混合物内の個々のｍＲＮＡ又はそれらの対応第１鎖ｃＤＮＡの数度の定量的推定値を得るための、請求項５〜９のいずれか１項に記載のアレイの使用。