JP2001349889A - 核酸の分析方法 - Google Patents
核酸の分析方法Info
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- JP2001349889A JP2001349889A JP2000171572A JP2000171572A JP2001349889A JP 2001349889 A JP2001349889 A JP 2001349889A JP 2000171572 A JP2000171572 A JP 2000171572A JP 2000171572 A JP2000171572 A JP 2000171572A JP 2001349889 A JP2001349889 A JP 2001349889A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 十分な感度を達成することができ、クロスト
ーク（混色）を防止することができる、マイクロアレイ
法を利用した２種類の試料に由来する２種類の核酸混合
物における標的核酸を分析する方法を提供すること。 【解決手段】 下記の工程を含む核酸の分析方法。 （ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１の核
酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して検出
できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２の核
酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核
酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質
的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標
的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）アレイ
の標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の
核酸を検出する工程。
ーク（混色）を防止することができる、マイクロアレイ
法を利用した２種類の試料に由来する２種類の核酸混合
物における標的核酸を分析する方法を提供すること。 【解決手段】 下記の工程を含む核酸の分析方法。 （ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１の核
酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して検出
できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２の核
酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核
酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質
的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標
的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）アレイ
の標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の
核酸を検出する工程。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の分析方法、
より詳細には、各々２種類の異なる酵素で標識した２種
類の核酸混合物を、標的核酸を含む核酸アレイと接触さ
せることにより、上記２種類の核酸混合物中における標
的核酸を検出又は分析する方法に関する。
より詳細には、各々２種類の異なる酵素で標識した２種
類の核酸混合物を、標的核酸を含む核酸アレイと接触さ
せることにより、上記２種類の核酸混合物中における標
的核酸を検出又は分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子の異常に基づく疾患の研究及び検
出を目的として、ある特定の細胞集団間における遺伝子
のコピー数またはその発現量の相違を同定および検出す
ることは有意義である。例えば、多くの悪性腫瘍は、癌
遺伝子の活性化及び／または腫瘍抑制遺伝子の不活化を
伴うことが知られている。このような疾患に関与する遺
伝子のコピー数や発現量の変化を同定することは、該疾
患の早期検出、治療の有効性の予測等において有用であ
る。
出を目的として、ある特定の細胞集団間における遺伝子
のコピー数またはその発現量の相違を同定および検出す
ることは有意義である。例えば、多くの悪性腫瘍は、癌
遺伝子の活性化及び／または腫瘍抑制遺伝子の不活化を
伴うことが知られている。このような疾患に関与する遺
伝子のコピー数や発現量の変化を同定することは、該疾
患の早期検出、治療の有効性の予測等において有用であ
る。
【０００３】増幅または欠失した染色体領域を検出する
ための方法の一つとして、細胞遺伝学的分析がある。し
かし、細胞遺伝学的分析の分解能は約１０Ｍｂ（ギムザ
染色された染色体中のバンドのおそよの幅）以上の非常
に大きい領域に制限され、多数のトランスロケーション
及びその他の遺伝子変化を有する複雑な核型を細胞遺伝
学的分析で分析することは困難である。
ための方法の一つとして、細胞遺伝学的分析がある。し
かし、細胞遺伝学的分析の分解能は約１０Ｍｂ（ギムザ
染色された染色体中のバンドのおそよの幅）以上の非常
に大きい領域に制限され、多数のトランスロケーション
及びその他の遺伝子変化を有する複雑な核型を細胞遺伝
学的分析で分析することは困難である。
【０００４】細胞内における全ての遺伝子の発現量を一
度にモニターするシステムを構築することができれば、
遺伝子異常に基づく疾患の解明のみならず、生命現象全
般の解明にも役立つことが期待される。これまで、細胞
内における遺伝子発現の解析は、細胞から抽出したＲＮ
Ａをフィルター上に固定し、遺伝子特異的プローブを用
いて検出するノーザンブロット法や、各遺伝子に特異的
なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などにより行われ
てきた。しかし、これらの方法では、微生物において少
なくとも数千個、ヒトでは約１０万個存在すると推測さ
れている遺伝子の全てを一度にモニターすることは不可
能である。最近、より簡便に直接的に遺伝子発現を解析
する方法として、ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析法
が開発された（DeRiesil,JL他、Science(1997) 278:680
-686；及びLashkari DA他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
(1997)94: 13057-13062）。
度にモニターするシステムを構築することができれば、
遺伝子異常に基づく疾患の解明のみならず、生命現象全
般の解明にも役立つことが期待される。これまで、細胞
内における遺伝子発現の解析は、細胞から抽出したＲＮ
Ａをフィルター上に固定し、遺伝子特異的プローブを用
いて検出するノーザンブロット法や、各遺伝子に特異的
なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などにより行われ
てきた。しかし、これらの方法では、微生物において少
なくとも数千個、ヒトでは約１０万個存在すると推測さ
れている遺伝子の全てを一度にモニターすることは不可
能である。最近、より簡便に直接的に遺伝子発現を解析
する方法として、ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析法
が開発された（DeRiesil,JL他、Science(1997) 278:680
-686；及びLashkari DA他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
(1997)94: 13057-13062）。
【０００５】ＤＮＡマイクロアレイ法は、スライドガラ
ス上に数千から数万個のＤＮＡスポットを作製し、解析
するＲＮＡから調製した標的ＤＮＡをハイブリダイゼー
ションさせ、ハイブリダイゼーションの強度を指標にし
て、各遺伝子の転写量を測定する方法である。現在、マ
イクロアレイを作製する装置（スポッターもしくはアレ
イヤー）や検出装置（スキャナー）が市販品として入手
可能である。マイクロアレイ法を利用して、２種類の試
料に由来する２種類の核酸混合物における標的核酸の存
在量を分析する方法としては、標識として蛍光標識を使
用した方法が報告されている（米国特許第5,800,992
号；細胞工学、Vol.18, No.6, p.877-885, 1999；及び
細胞工学、Vol.18, No.7, 1050-1056, 1999）。しかし
ながら、蛍光標識で検出する場合には、必ずしも十分な
感度が達成できないという問題やクロストーク（混色）
が生じるという問題があった。
ス上に数千から数万個のＤＮＡスポットを作製し、解析
するＲＮＡから調製した標的ＤＮＡをハイブリダイゼー
ションさせ、ハイブリダイゼーションの強度を指標にし
て、各遺伝子の転写量を測定する方法である。現在、マ
イクロアレイを作製する装置（スポッターもしくはアレ
イヤー）や検出装置（スキャナー）が市販品として入手
可能である。マイクロアレイ法を利用して、２種類の試
料に由来する２種類の核酸混合物における標的核酸の存
在量を分析する方法としては、標識として蛍光標識を使
用した方法が報告されている（米国特許第5,800,992
号；細胞工学、Vol.18, No.6, p.877-885, 1999；及び
細胞工学、Vol.18, No.7, 1050-1056, 1999）。しかし
ながら、蛍光標識で検出する場合には、必ずしも十分な
感度が達成できないという問題やクロストーク（混色）
が生じるという問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、マイクロア
レイ法を利用して２種類の異なる試料に由来する２種類
の核酸混合物における標的核酸を分析する方法であっ
て、蛍光標識を使用しない方法を提供することを解決す
べき課題とした。即ち、本発明は、十分な感度を達成す
ることができ、クロストーク（混色）を防止することが
できる、マイクロアレイ法を利用した２種類の試料に由
来する２種類の核酸混合物における標的核酸を分析する
方法を提供することを解決すべき課題とした。
レイ法を利用して２種類の異なる試料に由来する２種類
の核酸混合物における標的核酸を分析する方法であっ
て、蛍光標識を使用しない方法を提供することを解決す
べき課題とした。即ち、本発明は、十分な感度を達成す
ることができ、クロストーク（混色）を防止することが
できる、マイクロアレイ法を利用した２種類の試料に由
来する２種類の核酸混合物における標的核酸を分析する
方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、２種類の異なる試料
に由来する２種類の核酸を標識するための標識として酵
素を使用することにより、上記課題を解決できることを
見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によ
れば、下記の工程を含む核酸の分析方法が提供される。 （ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１の核
酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して検出
できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２の核
酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核
酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質
的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標
的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）アレイ
の標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の
核酸を検出する工程。
解決するために鋭意検討した結果、２種類の異なる試料
に由来する２種類の核酸を標識するための標識として酵
素を使用することにより、上記課題を解決できることを
見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によ
れば、下記の工程を含む核酸の分析方法が提供される。 （ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１の核
酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して検出
できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２の核
酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核
酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質
的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標
的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）アレイ
の標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の
核酸を検出する工程。
【０００８】好ましくは、核酸の検出は、核酸アレイの
標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸を第１の酵素
を用いて検出した後、核酸アレイを洗浄して第１の酵素
の検出に使用した物質を除去し、次いで、標的核酸とハ
イブリダイズした第２の核酸を第２の酵素を用いて検出
することにより、核酸アレイの標的核酸とハイブリダイ
ズした第１の核酸及び第２の核酸を検出するか；あるい
は核酸アレイの標的核酸とハイブリダイズした第２の核
酸を第２の酵素を用いて検出した後、核酸アレイを洗浄
して第２の酵素の検出に使用した物質を除去し、次い
で、標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸を第１の
酵素を用いて検出することにより、核酸アレイの標的核
酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の核酸を検
出することにより行われる。
標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸を第１の酵素
を用いて検出した後、核酸アレイを洗浄して第１の酵素
の検出に使用した物質を除去し、次いで、標的核酸とハ
イブリダイズした第２の核酸を第２の酵素を用いて検出
することにより、核酸アレイの標的核酸とハイブリダイ
ズした第１の核酸及び第２の核酸を検出するか；あるい
は核酸アレイの標的核酸とハイブリダイズした第２の核
酸を第２の酵素を用いて検出した後、核酸アレイを洗浄
して第２の酵素の検出に使用した物質を除去し、次い
で、標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸を第１の
酵素を用いて検出することにより、核酸アレイの標的核
酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の核酸を検
出することにより行われる。
【０００９】好ましくは、核酸アレイの標的核酸はｃＤ
ＮＡである。好ましくは、核酸アレイの標的核酸は哺乳
動物由来のｃＤＮＡである。好ましくは、標識された第
１及び第２の核酸は哺乳動物由来のＤＮＡである。好ま
しくは、第１の酵素はホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）、であり、第２の酵素がアルカリホスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）である。
ＮＡである。好ましくは、核酸アレイの標的核酸は哺乳
動物由来のｃＤＮＡである。好ましくは、標識された第
１及び第２の核酸は哺乳動物由来のＤＮＡである。好ま
しくは、第１の酵素はホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）、であり、第２の酵素がアルカリホスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）である。
【００１０】好ましくは、第１の試料由来の第１の核酸
は、試験細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり、第
２の試料由来の第２の核酸は、基準（対照）細胞からの
ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。好ましくは、第１の試
料由来の第１の核酸は、試験ゲノム由来の核酸であり、
第２の試料由来の第２の核酸は、基準（対照）ゲノム由
来の核酸である。好ましくは、本発明の方法は、第１の
試料及び第２の試料中における標的核酸の存在量を比較
するために使用する。
は、試験細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり、第
２の試料由来の第２の核酸は、基準（対照）細胞からの
ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。好ましくは、第１の試
料由来の第１の核酸は、試験ゲノム由来の核酸であり、
第２の試料由来の第２の核酸は、基準（対照）ゲノム由
来の核酸である。好ましくは、本発明の方法は、第１の
試料及び第２の試料中における標的核酸の存在量を比較
するために使用する。
【００１１】本発明の別の側面によれば、（ａ）固相支
持体に結合した標的核酸のアレイ、（ｂ）第１の酵素標
識、及び（ｃ）第１の酵素標識とは区別して検出できる
第２の酵素標識、を含む、核酸分析キットが提供され
る。
持体に結合した標的核酸のアレイ、（ｂ）第１の酵素標
識、及び（ｃ）第１の酵素標識とは区別して検出できる
第２の酵素標識、を含む、核酸分析キットが提供され
る。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法及び実施
態様について詳細に説明する。本発明の核酸の分析方法
は、（ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１
の核酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して
検出できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２
の核酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含
む核酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と
実質的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を
該標的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）ア
レイの標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第
２の核酸を検出する工程：を含む。
態様について詳細に説明する。本発明の核酸の分析方法
は、（ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１
の核酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して
検出できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２
の核酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含
む核酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と
実質的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を
該標的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）ア
レイの標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第
２の核酸を検出する工程：を含む。
【００１３】１．核酸の分析方法 本明細書で言う「核酸の分析方法」とは最も広い意味で
解釈され、試料中に存在する核酸を検出又は定量するこ
とを含む全ての分析を含む。本発明では、第１の試料由
来の核酸混合物と第２の試料由来の核酸混合物とを標的
核酸とハイブリダイズさせることにより、上記２種類の
試料における標的核酸の存在の有無を検出したり、標的
核酸の存在量を測定および比較することができる。本発
明の分析方法は、このように２種類の異なる試料におけ
る標的核酸の存在の有無の検出、並びに存在量を測定お
よび比較することが包含される。本発明の方法を利用す
ることにより、例えば、ある特定の細胞又は組織に由来
する染色体ＤＮＡにおける核酸コピー数を分析および比
較したり、疾患と関連する染色体異常を調べることや、
あるいは、２種類の細胞又は組織における特定遺伝子の
発現パターンや発現量を調べることが可能である。
解釈され、試料中に存在する核酸を検出又は定量するこ
とを含む全ての分析を含む。本発明では、第１の試料由
来の核酸混合物と第２の試料由来の核酸混合物とを標的
核酸とハイブリダイズさせることにより、上記２種類の
試料における標的核酸の存在の有無を検出したり、標的
核酸の存在量を測定および比較することができる。本発
明の分析方法は、このように２種類の異なる試料におけ
る標的核酸の存在の有無の検出、並びに存在量を測定お
よび比較することが包含される。本発明の方法を利用す
ることにより、例えば、ある特定の細胞又は組織に由来
する染色体ＤＮＡにおける核酸コピー数を分析および比
較したり、疾患と関連する染色体異常を調べることや、
あるいは、２種類の細胞又は組織における特定遺伝子の
発現パターンや発現量を調べることが可能である。
【００１４】２．標識される核酸の混合物 本発明では、第１の試料及び第２の試料に由来する２種
類の異なる核酸混合物を使用する。第１の試料と第２の
試料に由来する２種類の核酸としては、任意の核酸を使
用することができ、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃ
ＤＮＡであってもよい。核酸は任意の生物由来のもので
よく、例えば、哺乳動物（ヒトを含む）由来の核酸など
を使用することができる。
類の異なる核酸混合物を使用する。第１の試料と第２の
試料に由来する２種類の核酸としては、任意の核酸を使
用することができ、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃ
ＤＮＡであってもよい。核酸は任意の生物由来のもので
よく、例えば、哺乳動物（ヒトを含む）由来の核酸など
を使用することができる。
【００１５】本明細書で言う「核酸」とは、一本鎖形態
または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチドポリマーを表し、特に限定しない限り、
天然ヌクレオチドと同様に機能しすることができる天然
ヌクレオチドの類縁体も含まれる。例えば、ある種の生
物個体、組織または細胞に由来する完全ゲノムに相当す
るゲノムＤＮＡの断片を使用してもよい。あるいは、一
種以上の特定の遺伝子の発現レベルを２種類の試料間で
比較するためには、比較する２種類の生物、組織または
細胞から調製されたｍＲＮＡまたはそれに由来するｃＤ
ＮＡを使用することができる。
または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチドポリマーを表し、特に限定しない限り、
天然ヌクレオチドと同様に機能しすることができる天然
ヌクレオチドの類縁体も含まれる。例えば、ある種の生
物個体、組織または細胞に由来する完全ゲノムに相当す
るゲノムＤＮＡの断片を使用してもよい。あるいは、一
種以上の特定の遺伝子の発現レベルを２種類の試料間で
比較するためには、比較する２種類の生物、組織または
細胞から調製されたｍＲＮＡまたはそれに由来するｃＤ
ＮＡを使用することができる。
【００１６】例えば、第１の種類の細胞に由来する第１
の標識化ｃＤＮＡを、第２の種類の細胞に由来する第２
の標識化ｃＤＮＡとともに、ある細胞由来のｃＤＮＡラ
イブラリーからのｃＤＮＡクローンを固相支持体に固定
したｃＤＮＡアレイにハイブリダイゼーションさせるこ
とができる。ハイブリダイゼーション後に、アレイにハ
イブリダイズした第１の標識化ＤＮＡと第２の標識化Ｄ
ＮＡとをそれぞれ検出し、両者を比較することで第１の
種類の細胞における遺伝子の発現パターンと第２の種類
の細胞における遺伝子の発現パターンとを比較すること
ができる。あるいは、２種類の細胞に由来のゲノムＤＮ
Ａ断片を標識して第１の標識化ＤＮＡと第２の標識化Ｄ
ＮＡを作製し、これらをｃＤＮＡアレイにハイブリダイ
ゼーションすることにより、ゲノム中の変異ＤＮＡのコ
ピー数などを検出することができる。
の標識化ｃＤＮＡを、第２の種類の細胞に由来する第２
の標識化ｃＤＮＡとともに、ある細胞由来のｃＤＮＡラ
イブラリーからのｃＤＮＡクローンを固相支持体に固定
したｃＤＮＡアレイにハイブリダイゼーションさせるこ
とができる。ハイブリダイゼーション後に、アレイにハ
イブリダイズした第１の標識化ＤＮＡと第２の標識化Ｄ
ＮＡとをそれぞれ検出し、両者を比較することで第１の
種類の細胞における遺伝子の発現パターンと第２の種類
の細胞における遺伝子の発現パターンとを比較すること
ができる。あるいは、２種類の細胞に由来のゲノムＤＮ
Ａ断片を標識して第１の標識化ＤＮＡと第２の標識化Ｄ
ＮＡを作製し、これらをｃＤＮＡアレイにハイブリダイ
ゼーションすることにより、ゲノム中の変異ＤＮＡのコ
ピー数などを検出することができる。
【００１７】さらに具体的には、第１の試料として、研
究（試験）対象の細胞、細胞集団または組織を選択し、
第２の試料として、基準（対照）用の細胞、細胞集団ま
たは組織を選択することができる。研究（試験）対象の
細胞として疾患由来の細胞を選択し、基準（対照）用の
細胞として正常な非疾患細胞を選択することができる。
基準（対照）用の細胞としては、該疾患の他の段階にお
ける標準として利用できる疾患組織の細胞を選択しても
よい。
究（試験）対象の細胞、細胞集団または組織を選択し、
第２の試料として、基準（対照）用の細胞、細胞集団ま
たは組織を選択することができる。研究（試験）対象の
細胞として疾患由来の細胞を選択し、基準（対照）用の
細胞として正常な非疾患細胞を選択することができる。
基準（対照）用の細胞としては、該疾患の他の段階にお
ける標準として利用できる疾患組織の細胞を選択しても
よい。
【００１８】本発明の方法は、２種類以上の細胞集団に
おける特定の配列のコピー数を比較するのに適してい
る。具体的には、２種類以上の生物種に由来するゲノム
またはｃＤＮＡ同士を比較することができる。あるい
は、同一生物の２種類以上の組織または細胞における一
定の遺伝子の存在量またはその発現量のレベルを比較す
ることができる。このような２種類の遺伝子の存在量ま
たは発現量の比較は、遺伝子の異常に関連する疾患の診
断に特に有用である。
おける特定の配列のコピー数を比較するのに適してい
る。具体的には、２種類以上の生物種に由来するゲノム
またはｃＤＮＡ同士を比較することができる。あるい
は、同一生物の２種類以上の組織または細胞における一
定の遺伝子の存在量またはその発現量のレベルを比較す
ることができる。このような２種類の遺伝子の存在量ま
たは発現量の比較は、遺伝子の異常に関連する疾患の診
断に特に有用である。
【００１９】組織又は細胞から核酸（ＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡ）を単離する方法は当業者に公知である（例えば、
Sambrook他，Molecular Cloning，A Laboratory Manua
l，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harb
or，N.Y．(1985)などに記載）。また、ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡの合成も当業者に公知である。
ＮＡ）を単離する方法は当業者に公知である（例えば、
Sambrook他，Molecular Cloning，A Laboratory Manua
l，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harb
or，N.Y．(1985)などに記載）。また、ｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡの合成も当業者に公知である。
【００２０】標識核酸を調製するための核酸を単離する
細胞または組織の種類は、その目的又は用途に依存す
る。例えば、癌に関連する遺伝子の異常の検出が目的で
あるならば、腫瘍細胞から単離したゲノムＤＮＡの断片
又はｍＲＮＡを使用することができる。あるいは、ある
疾患の出生前診断が目的である場合には、胎児組織から
単離したゲノムＤＮＡ断片又はｍＲＮＡを使用すること
ができる。核酸を単離するための試料が少量しか得られ
ない場合には、縮重プライマーを使用するＰＣＲ法など
の増幅技術を使用して標識用の核酸混合物を調製しても
よい。また、ＰＣＲ法を利用して、ゲノム中に高コピー
数存在する反復配列の間に存在する配列を選択的に増幅
することもできる。例えば、反復配列の１種であるAlu
配列に相補的なプライマーを使用して、Alu ファミリー
に属する二つの配列の間に存在する配列を選択的に増幅
することも可能である。
細胞または組織の種類は、その目的又は用途に依存す
る。例えば、癌に関連する遺伝子の異常の検出が目的で
あるならば、腫瘍細胞から単離したゲノムＤＮＡの断片
又はｍＲＮＡを使用することができる。あるいは、ある
疾患の出生前診断が目的である場合には、胎児組織から
単離したゲノムＤＮＡ断片又はｍＲＮＡを使用すること
ができる。核酸を単離するための試料が少量しか得られ
ない場合には、縮重プライマーを使用するＰＣＲ法など
の増幅技術を使用して標識用の核酸混合物を調製しても
よい。また、ＰＣＲ法を利用して、ゲノム中に高コピー
数存在する反復配列の間に存在する配列を選択的に増幅
することもできる。例えば、反復配列の１種であるAlu
配列に相補的なプライマーを使用して、Alu ファミリー
に属する二つの配列の間に存在する配列を選択的に増幅
することも可能である。
【００２１】３．核酸混合物中の核酸の標識 本発明では、上記した第１の試料及び第２の試料に由来
する２種類の核酸はそれぞれ第１の酵素及び第２の酵素
で標識される。第１の酵素及び第２の酵素は、ハイブリ
ダイゼーション後にそれぞれ区別して検出できる別個の
異なる酵素である。標識として使用する酵素の種類は、
それが固相支持体上の標的配列への標識核酸のハイブリ
ダイゼーションを有意に阻害しない限り、特に限定され
ない。標識として使用できる酵素の具体例としては、EL
ISA に通常使用される酵素が挙げられ、具体的には、ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカ
リホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６
ＰＤＨ）、ルシフェラーゼ、インベルターゼ、アミラー
ゼなどが挙げられる。
する２種類の核酸はそれぞれ第１の酵素及び第２の酵素
で標識される。第１の酵素及び第２の酵素は、ハイブリ
ダイゼーション後にそれぞれ区別して検出できる別個の
異なる酵素である。標識として使用する酵素の種類は、
それが固相支持体上の標的配列への標識核酸のハイブリ
ダイゼーションを有意に阻害しない限り、特に限定され
ない。標識として使用できる酵素の具体例としては、EL
ISA に通常使用される酵素が挙げられ、具体的には、ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカ
リホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６
ＰＤＨ）、ルシフェラーゼ、インベルターゼ、アミラー
ゼなどが挙げられる。
【００２２】あるいは、核酸は、検出可能な酵素で標識
された抗リガンドが利用できるリガンドを使用して間接
的に酵素で標識してもよい。例えば、ビオチン化核酸を
使用して核酸を標識した後、上記したような酵素で標識
されたアビジンまたはストレプトアビジンを使用してビ
オチン化核酸を検出してもよい。一般的には、標的核酸
のコピー数が少量でも検出可能であり、それによりアッ
セイの感度が向上し、しかもバックグラウンドシグナル
を越えて検出可能である標識が好ましい。標識は当業者
に公知の方法で核酸に結合することができる。好ましい
態様においては、核酸は、ニックトランスレーション法
またはランダムプライム法などを使用して標識すること
ができる。
された抗リガンドが利用できるリガンドを使用して間接
的に酵素で標識してもよい。例えば、ビオチン化核酸を
使用して核酸を標識した後、上記したような酵素で標識
されたアビジンまたはストレプトアビジンを使用してビ
オチン化核酸を検出してもよい。一般的には、標的核酸
のコピー数が少量でも検出可能であり、それによりアッ
セイの感度が向上し、しかもバックグラウンドシグナル
を越えて検出可能である標識が好ましい。標識は当業者
に公知の方法で核酸に結合することができる。好ましい
態様においては、核酸は、ニックトランスレーション法
またはランダムプライム法などを使用して標識すること
ができる。
【００２３】４．標的核酸 本発明の方法では、２種類の試料に由来する第１の酵素
で標識した核酸混合物及び第２の酵素で標識した核酸混
合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核酸アレ
イと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質的に同
一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標的核酸
とハイブリダイズさせる。２種類の核酸混合物は、混合
物として同時にアレイと接触させてもよいし、あるいは
別々に連続的にアレイと接触させてもよい。
で標識した核酸混合物及び第２の酵素で標識した核酸混
合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核酸アレ
イと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質的に同
一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標的核酸
とハイブリダイズさせる。２種類の核酸混合物は、混合
物として同時にアレイと接触させてもよいし、あるいは
別々に連続的にアレイと接触させてもよい。
【００２４】標的核酸の種類は任意であり、例えば、Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。核酸は
任意の生物由来のものでよく、例えば、哺乳動物（ヒト
を含む）由来の核酸などを使用することができる。通
常、固相支持体に固定化される標的核酸と、上記した標
識される核酸は同一の生物に由来するものである。本発
明では、標的核酸の起源は特に限定されず、典型的に
は、標的核酸は、特定の染色体、特定の染色体領域、特
定の完全ゲノム、ｃＤＮＡライブラリー等に由来する核
酸である。
ＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。核酸は
任意の生物由来のものでよく、例えば、哺乳動物（ヒト
を含む）由来の核酸などを使用することができる。通
常、固相支持体に固定化される標的核酸と、上記した標
識される核酸は同一の生物に由来するものである。本発
明では、標的核酸の起源は特に限定されず、典型的に
は、標的核酸は、特定の染色体、特定の染色体領域、特
定の完全ゲノム、ｃＤＮＡライブラリー等に由来する核
酸である。
【００２５】これらの標的核酸は、例えば、ゲノムクロ
ーンのinter-Alu PCR 産物、ゲノムクローン、ｃＤＮＡ
等の制限消化産物から得られる比較的長い（典型的に
は、数千の塩基）ＤＮＡ断片でもよい。また、標的核酸
は染色体上の特定の領域をスパンするＤＮＡクローンの
ライブラリーでもよい。ゲノム中の全ＤＮＡ配列をアレ
イ中に含めてよい。例えば、ある一定の生物種の完全染
色体をスパンするライブラリーは市販品として入手可能
であり、また、例えば、ヒトゲノム及びその他のゲノム
からの染色体特異的ゲノムライブラリーはClonetech(So
uth San Fran-cisco，CA)またはATCCから入手すること
ができる。
ーンのinter-Alu PCR 産物、ゲノムクローン、ｃＤＮＡ
等の制限消化産物から得られる比較的長い（典型的に
は、数千の塩基）ＤＮＡ断片でもよい。また、標的核酸
は染色体上の特定の領域をスパンするＤＮＡクローンの
ライブラリーでもよい。ゲノム中の全ＤＮＡ配列をアレ
イ中に含めてよい。例えば、ある一定の生物種の完全染
色体をスパンするライブラリーは市販品として入手可能
であり、また、例えば、ヒトゲノム及びその他のゲノム
からの染色体特異的ゲノムライブラリーはClonetech(So
uth San Fran-cisco，CA)またはATCCから入手すること
ができる。
【００２６】標的核酸の塩基配列は、その遺伝子の存在
量または発現量に関する情報を入手することが所望され
る塩基配列である。例えば、標的核酸は、疾患と関連す
ることが知られている染色体上の特定の位置に由来する
核酸でもよく、疾患との関連を調べようとする染色体領
域の代表領域であってもよく、または転写量（発現量）
を分析しようとする標的遺伝子に対応する核酸でもよ
い。
量または発現量に関する情報を入手することが所望され
る塩基配列である。例えば、標的核酸は、疾患と関連す
ることが知られている染色体上の特定の位置に由来する
核酸でもよく、疾患との関連を調べようとする染色体領
域の代表領域であってもよく、または転写量（発現量）
を分析しようとする標的遺伝子に対応する核酸でもよ
い。
【００２７】また、標的核酸は、例えば、特定の遺伝子
を含んでいてもよく、または研究対象の特定の細胞、例
えば、腫瘍の研究の場合には、腫瘍細胞中において増加
または減少したコピー数で存在すると推測される染色体
領域に存在するＤＮＡ断片でもよい。また、標的核酸は
異常なレベルで転写が生じていることが推測されるｍＲ
ＮＡまたは当該ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡでもよい。
また、標的核酸は染色体上の位置が未知であるＤＮＡ断
片であってもよい。
を含んでいてもよく、または研究対象の特定の細胞、例
えば、腫瘍の研究の場合には、腫瘍細胞中において増加
または減少したコピー数で存在すると推測される染色体
領域に存在するＤＮＡ断片でもよい。また、標的核酸は
異常なレベルで転写が生じていることが推測されるｍＲ
ＮＡまたは当該ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡでもよい。
また、標的核酸は染色体上の位置が未知であるＤＮＡ断
片であってもよい。
【００２８】５．固相支持体上における標的核酸のアレ
イ 本明細書で言う「標的核酸のアレイ」とは、複数の標的
核酸を意味し、アレイの中には標識された核酸がハイブ
リダイゼーションすることができる配列を有する核酸が
少なくとも１種類以上含まれている。標的核酸のアレイ
における個々のスポットのサイズは特に限定されない
が、通常は小さいサイズが好ましく、スポットは直径が
一般的には約１ｃｍ 未満であり、好ましくは１μｍ か
ら３ｍｍ、より好ましくは約５μｍ〜約１ｍｍである。
イ 本明細書で言う「標的核酸のアレイ」とは、複数の標的
核酸を意味し、アレイの中には標識された核酸がハイブ
リダイゼーションすることができる配列を有する核酸が
少なくとも１種類以上含まれている。標的核酸のアレイ
における個々のスポットのサイズは特に限定されない
が、通常は小さいサイズが好ましく、スポットは直径が
一般的には約１ｃｍ 未満であり、好ましくは１μｍ か
ら３ｍｍ、より好ましくは約５μｍ〜約１ｍｍである。
【００２９】アレイ上の標的核酸の密度は、標識の性
質、固相支持体の種類などに応じて適宜選択することが
できる。また、アレイ上の標的核酸の一スポットには、
１種類の単一の標的核酸が含まれている場合のみなら
ず、異なる配列を有する２種類以上の標的酸の混合物が
含まれていてもよい。標的核酸の配列の長さは特に限定
されないが、典型的には、約１ｋｂから約１Ｍｂ程度で
ある。
質、固相支持体の種類などに応じて適宜選択することが
できる。また、アレイ上の標的核酸の一スポットには、
１種類の単一の標的核酸が含まれている場合のみなら
ず、異なる配列を有する２種類以上の標的酸の混合物が
含まれていてもよい。標的核酸の配列の長さは特に限定
されないが、典型的には、約１ｋｂから約１Ｍｂ程度で
ある。
【００３０】核酸を種々の固相支持体の表面に固定する
多くの方法が当業界で公知である。例えば、固相支持体
の種類は、核酸が非特異的結合により共有結合または非
共有結合により付着することができれば特に限定されな
い。固相支持体の表面の物質としては、天然又は合成の
多種の有機又は無機ポリマー、並びにその他の物質を使
用することができる。具体的には、例えば、ニトロセル
ロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化膜（紙またはナイ
ロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロー
ス、及びセルロースアセテートなどが挙げられる。ま
た、プラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリスチレン等を使用することもできる。さら
に、紙、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、
サーメット等を使用することもできる。その他に、ゲル
を生成する物質、例えば、タンパク質（例えば、ゼラチ
ン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース及びポリアクリ
ルアミドを使用することもできる。
多くの方法が当業界で公知である。例えば、固相支持体
の種類は、核酸が非特異的結合により共有結合または非
共有結合により付着することができれば特に限定されな
い。固相支持体の表面の物質としては、天然又は合成の
多種の有機又は無機ポリマー、並びにその他の物質を使
用することができる。具体的には、例えば、ニトロセル
ロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化膜（紙またはナイ
ロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロー
ス、及びセルロースアセテートなどが挙げられる。ま
た、プラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリスチレン等を使用することもできる。さら
に、紙、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、
サーメット等を使用することもできる。その他に、ゲル
を生成する物質、例えば、タンパク質（例えば、ゼラチ
ン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース及びポリアクリ
ルアミドを使用することもできる。
【００３１】固相表面が多孔質である場合、細孔のサイ
ズは系の性質に応じて適宜調節することができる。固相
支持体の表面を調製する際には、所望の性質を得るため
に、複数の異なる材料を特にラミネートとして使用する
ことができる。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清
アルブミン）または巨大分子の混合物（例えば、デンハ
ルト溶液）が非特異的結合を回避し、シグナル検出を増
進することを目的として使用することができる。
ズは系の性質に応じて適宜調節することができる。固相
支持体の表面を調製する際には、所望の性質を得るため
に、複数の異なる材料を特にラミネートとして使用する
ことができる。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清
アルブミン）または巨大分子の混合物（例えば、デンハ
ルト溶液）が非特異的結合を回避し、シグナル検出を増
進することを目的として使用することができる。
【００３２】標的核酸と支持体表面とを共有結合により
結合させる場合には、支持体表面は多官能化することが
できる。支持体の表面に存在し、標的核酸との結合に使
用することができる官能基としては、カルボン酸、アル
デヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキ
シル基、メルカプト基等が挙げられる。例えば、分子へ
の種々の官能基の導入による核酸の固定方法が知られて
いる。修飾ヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーを使用
して、または修飾ヌクレオチドによる酵素末端標識によ
り、修飾ヌクレオチドを標的核酸に導入することができ
る。
結合させる場合には、支持体表面は多官能化することが
できる。支持体の表面に存在し、標的核酸との結合に使
用することができる官能基としては、カルボン酸、アル
デヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキ
シル基、メルカプト基等が挙げられる。例えば、分子へ
の種々の官能基の導入による核酸の固定方法が知られて
いる。修飾ヌクレオチドを含むＰＣＲプライマーを使用
して、または修飾ヌクレオチドによる酵素末端標識によ
り、修飾ヌクレオチドを標的核酸に導入することができ
る。
【００３３】核酸アレイ用の膜支持体（例えば、ニトロ
セルロース、ナイロン、ポリプロピレン）を使用して手
動法及びロボット方法を使用して標的核酸を膜支持体上
に固定化することは、標的核酸を比較的高いスポット密
度（例えば、３０〜４０スポット/ｃｍ2）で配置するこ
とができるので本発明の好ましい態様である。このよう
な膜は一般に市販品として入手可能であり、膜へのハイ
ブリダイゼーションに関するプロトコル及び装置も公知
である。
セルロース、ナイロン、ポリプロピレン）を使用して手
動法及びロボット方法を使用して標的核酸を膜支持体上
に固定化することは、標的核酸を比較的高いスポット密
度（例えば、３０〜４０スポット/ｃｍ2）で配置するこ
とができるので本発明の好ましい態様である。このよう
な膜は一般に市販品として入手可能であり、膜へのハイ
ブリダイゼーションに関するプロトコル及び装置も公知
である。
【００３４】あるいは、膜よりも極めて低い蛍光を有す
る支持体（例えば、ガラス、石英、または小さいビー
ズ）上に作製したＤＮＡアレイの使用も、良好な感度を
達成するための手段として好ましい。このような支持体
を使用した場合には、少量の濃縮された標的核酸を含む
小さなサイズのスポットの核酸アレイを有する膜を作製
することができる。このような濃縮された核酸を含む小
さなスポットを使用することにより、標識核酸の合計量
を少なくすることができ、これにより高度に局在化さ
れ、かつ鮮明なシグナルを得ることができるため、上記
のような膜以外の支持体を使用することが本発明の好ま
しい態様の一つである。
る支持体（例えば、ガラス、石英、または小さいビー
ズ）上に作製したＤＮＡアレイの使用も、良好な感度を
達成するための手段として好ましい。このような支持体
を使用した場合には、少量の濃縮された標的核酸を含む
小さなサイズのスポットの核酸アレイを有する膜を作製
することができる。このような濃縮された核酸を含む小
さなスポットを使用することにより、標識核酸の合計量
を少なくすることができ、これにより高度に局在化さ
れ、かつ鮮明なシグナルを得ることができるため、上記
のような膜以外の支持体を使用することが本発明の好ま
しい態様の一つである。
【００３５】このような小さいスポットを有するアレイ
は典型的には１０4スポット／ｃｍ2より大きい密度を有
する。ガラスまたは合成石英ガラスへの標的核酸の共有
結合による結合は、公知の技術によって達成することが
できる。核酸をガラスに結合するための方法としては多
くの方法が知られている。例えば、幾つかの官能基を有
するシラン処理されたガラスの調製用の材料が市販され
ており、または通常の技術を使用して調製することもで
きる。また、ガラスよりも少なくとも自己蛍光が１０倍
低い石英カバースリップをシラン処理して使用すること
もできる。各種用途のための高密度アレイを作製する技
術は、例えば、Fodor ら，Science 767-773(1991)及び
米国特許第5,143,854 号明細書などに記載されており、
本発明でもこれらの技術を利用することが可能である。
は典型的には１０4スポット／ｃｍ2より大きい密度を有
する。ガラスまたは合成石英ガラスへの標的核酸の共有
結合による結合は、公知の技術によって達成することが
できる。核酸をガラスに結合するための方法としては多
くの方法が知られている。例えば、幾つかの官能基を有
するシラン処理されたガラスの調製用の材料が市販され
ており、または通常の技術を使用して調製することもで
きる。また、ガラスよりも少なくとも自己蛍光が１０倍
低い石英カバースリップをシラン処理して使用すること
もできる。各種用途のための高密度アレイを作製する技
術は、例えば、Fodor ら，Science 767-773(1991)及び
米国特許第5,143,854 号明細書などに記載されており、
本発明でもこれらの技術を利用することが可能である。
【００３６】６．標識した核酸混合物と標的核酸とのハ
イブリダイゼーション 本発明の方法は、第１の酵素で標識した第１の試料由来
の第１の核酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区
別して検出できる第２の酵素で標識した第２の試料由来
の第２の核酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核
酸を含む核酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的
核酸と実質的に同一な配列を有する上記第１及び第２の
核酸をハイブリダイズさせる工程を含む。
イブリダイゼーション 本発明の方法は、第１の酵素で標識した第１の試料由来
の第１の核酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区
別して検出できる第２の酵素で標識した第２の試料由来
の第２の核酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核
酸を含む核酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的
核酸と実質的に同一な配列を有する上記第１及び第２の
核酸をハイブリダイズさせる工程を含む。
【００３７】本明細書で言うハイブリダイズとは、第１
の酵素又は第２の酵素で標識した一本鎖核酸と固定支持
体に結合した一本鎖標的核酸とが、互いに相補性をもつ
塩基対間の水素結合により二本鎖核酸を形成することを
言う。ハイブリダイゼーションは、アレイ中の標的核酸
と実質的に同一な配列を有する標識された核酸のみが特
異的に標的核酸とハイブリダイゼーションするような条
件下で行う。検出すべき核酸の塩基配列と標的核酸の塩
基配列の相同性に応じて、ハイブリダイゼーションのス
トリンジェンシーの程度を調節することができる。
の酵素又は第２の酵素で標識した一本鎖核酸と固定支持
体に結合した一本鎖標的核酸とが、互いに相補性をもつ
塩基対間の水素結合により二本鎖核酸を形成することを
言う。ハイブリダイゼーションは、アレイ中の標的核酸
と実質的に同一な配列を有する標識された核酸のみが特
異的に標的核酸とハイブリダイゼーションするような条
件下で行う。検出すべき核酸の塩基配列と標的核酸の塩
基配列の相同性に応じて、ハイブリダイゼーションのス
トリンジェンシーの程度を調節することができる。
【００３８】本発明の方法では、アレイ中の標的核酸の
塩基配列と完全に同一な配列を有する核酸を検出するの
みならず、それと実質的に同一な配列を有する核酸を検
出してもよい。本明細書で言う「実質的に同一な配列」
とは、標識された核酸の塩基配列が標的核酸の塩基配列
に対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０
％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有す
る配列を意味する。
塩基配列と完全に同一な配列を有する核酸を検出するの
みならず、それと実質的に同一な配列を有する核酸を検
出してもよい。本明細書で言う「実質的に同一な配列」
とは、標識された核酸の塩基配列が標的核酸の塩基配列
に対して少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０
％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有す
る配列を意味する。
【００３９】２種類の核酸の塩基配列が実質的に同一で
あることを示す一つの指標は、これら２種類の核酸がス
トリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする
かどうかである。ハイブリダイゼーション条件は検出す
べき配列の長さや塩基組成（ＧＣ含有率など）に依存し
て変化する。一般に、ストリンジェントな条件は特定の
イオン強度及びｐＨにおいて、検出すべき標的配列の熱
融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選ばれる。Ｔ
ｍは、標的配列の５０％が完全に同一な配列を有するプ
ローブとハイブリダイゼーションする温度（特定のイオ
ン強度及びｐＨにおける）である。
あることを示す一つの指標は、これら２種類の核酸がス
トリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする
かどうかである。ハイブリダイゼーション条件は検出す
べき配列の長さや塩基組成（ＧＣ含有率など）に依存し
て変化する。一般に、ストリンジェントな条件は特定の
イオン強度及びｐＨにおいて、検出すべき標的配列の熱
融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選ばれる。Ｔ
ｍは、標的配列の５０％が完全に同一な配列を有するプ
ローブとハイブリダイゼーションする温度（特定のイオ
ン強度及びｐＨにおける）である。
【００４０】本発明の方法では、２種類の標識された核
酸混合物を１種以上の標的核酸を含む核酸アレイにハイ
ブリダイゼーションさせることにより、上記２種類の核
酸混合物中に存在する、標的核酸と実質的に同一の配列
を有する核酸のコピー数を比較することができる。即
ち、アレイ上の標的核酸の各々に対してハイブリダイズ
した標識核酸により生じるハイブリダイゼーションシグ
ナル強さ、及び強さの比を測定することにより、２種類
の核酸混合物中における標的核酸と実質的に同一の配列
を有する核酸のコピー数を比較することができる。通常
は、個々の標的核酸に関するシグナル強さの比率が大き
い程、その標的核酸に結合する２種の標識核酸混合物中
の配列のコピー数の比は大きいことが言える。
酸混合物を１種以上の標的核酸を含む核酸アレイにハイ
ブリダイゼーションさせることにより、上記２種類の核
酸混合物中に存在する、標的核酸と実質的に同一の配列
を有する核酸のコピー数を比較することができる。即
ち、アレイ上の標的核酸の各々に対してハイブリダイズ
した標識核酸により生じるハイブリダイゼーションシグ
ナル強さ、及び強さの比を測定することにより、２種類
の核酸混合物中における標的核酸と実質的に同一の配列
を有する核酸のコピー数を比較することができる。通常
は、個々の標的核酸に関するシグナル強さの比率が大き
い程、その標的核酸に結合する２種の標識核酸混合物中
の配列のコピー数の比は大きいことが言える。
【００４１】一般に、核酸ハイブリダイゼーションには
以下に述べる工程が含まれる。 （１）標的核酸の固定； （２）標識核酸（プローブ）の接近可能性を増大し、か
つ非特異的結合を減少するためのプレハイブリダイゼー
ション処理； （３）固相表面上の標的核酸に対する標識核酸混合物の
ハイブリダイゼーション； （４）ハイブリダイゼーション中に標的核酸に結合しな
かった標識核酸を除去するための洗浄；及び （５）ハイブリダイゼーションした標識核酸の検出。
以下に述べる工程が含まれる。 （１）標的核酸の固定； （２）標識核酸（プローブ）の接近可能性を増大し、か
つ非特異的結合を減少するためのプレハイブリダイゼー
ション処理； （３）固相表面上の標的核酸に対する標識核酸混合物の
ハイブリダイゼーション； （４）ハイブリダイゼーション中に標的核酸に結合しな
かった標識核酸を除去するための洗浄；及び （５）ハイブリダイゼーションした標識核酸の検出。
【００４２】これらの各工程で使用する試薬及び使用条
件は個々の条件に応じて変化する。例えば、標識核酸
（プローブ）として哺乳動物由来のゲノムＤＮＡを使用
する場合には、ゲノムＤＮＡ中に存在する反復配列のハ
イブリダイゼーション能をブロックすることが必要であ
る。反復配列のハイブリダイゼーション能を除去するた
めの方法は、幾つか知られている。例えば、ヒトゲノム
を含む多くの哺乳動物ゲノム中で共有される反復配列と
して、Aluなどの幾つかのファミリーに分類される反復
配列が知られている。このような一般に高い比率で存在
する反復配列は、それを含むＤＮＡ溶液を変性及びハイ
ブリダイゼーション条件下でインキュベーションした場
合、その他の配列よりも迅速に二本鎖になることが知ら
れている。そこで、ＤＮＡ溶液を変性及びハイブリダイ
ゼーション条件下でインキュベーションした後、二本鎖
核酸を除去し、残りの一本鎖ＤＮＡを標的核酸とのハイ
ブリダイゼーションに使用することにより、反復配列を
効率的に除去することができる。二本鎖配列からの一本
鎖配列の分離は、ヒドロキシアパタイトまたは固相支持
体に固定化した相補的な核酸を使用することにより達成
することができる。
件は個々の条件に応じて変化する。例えば、標識核酸
（プローブ）として哺乳動物由来のゲノムＤＮＡを使用
する場合には、ゲノムＤＮＡ中に存在する反復配列のハ
イブリダイゼーション能をブロックすることが必要であ
る。反復配列のハイブリダイゼーション能を除去するた
めの方法は、幾つか知られている。例えば、ヒトゲノム
を含む多くの哺乳動物ゲノム中で共有される反復配列と
して、Aluなどの幾つかのファミリーに分類される反復
配列が知られている。このような一般に高い比率で存在
する反復配列は、それを含むＤＮＡ溶液を変性及びハイ
ブリダイゼーション条件下でインキュベーションした場
合、その他の配列よりも迅速に二本鎖になることが知ら
れている。そこで、ＤＮＡ溶液を変性及びハイブリダイ
ゼーション条件下でインキュベーションした後、二本鎖
核酸を除去し、残りの一本鎖ＤＮＡを標的核酸とのハイ
ブリダイゼーションに使用することにより、反復配列を
効率的に除去することができる。二本鎖配列からの一本
鎖配列の分離は、ヒドロキシアパタイトまたは固相支持
体に固定化した相補的な核酸を使用することにより達成
することができる。
【００４３】あるいは、ハイブリダイゼーション能を抑
制するべき反復配列に相補的である未標識配列をハイブ
リダイゼーション混合物に添加してもよい。この方法を
使用することにより、反復配列だけでなく、その他の配
列のハイブリダイゼーションを抑制することもできる。
例えば、Ｃｏｔ−１ＤＮＡを使用して、サンプル中の反
復配列のハイブリダイゼーションを選択的に抑制するこ
とができる。なお、Ｃｏｔ−１ＤＮＡは市販品(BRL社)
として入手可能である。
制するべき反復配列に相補的である未標識配列をハイブ
リダイゼーション混合物に添加してもよい。この方法を
使用することにより、反復配列だけでなく、その他の配
列のハイブリダイゼーションを抑制することもできる。
例えば、Ｃｏｔ−１ＤＮＡを使用して、サンプル中の反
復配列のハイブリダイゼーションを選択的に抑制するこ
とができる。なお、Ｃｏｔ−１ＤＮＡは市販品(BRL社)
として入手可能である。
【００４４】７．ハイブリダイゼーションからの検出可
能なシグナルの分析 標識プローブにより生じたシグナルの検出及び分析のた
めには、酵素標識を用いた通常の核酸分析法と同様の方
法を使用することができる。具体的には、酵素の基質と
なる物質を添加して酵素反応を行い、該反応の結果とし
て生じる発光などのシグナルを検出する。
能なシグナルの分析 標識プローブにより生じたシグナルの検出及び分析のた
めには、酵素標識を用いた通常の核酸分析法と同様の方
法を使用することができる。具体的には、酵素の基質と
なる物質を添加して酵素反応を行い、該反応の結果とし
て生じる発光などのシグナルを検出する。
【００４５】本発明は、上記した本発明の核酸分析方法
を行うための核酸分析キットにも関する。本発明の核酸
分析キットは、少なくとも（ａ）固相支持体に結合した
標的核酸のアレイ、（ｂ）第１の酵素標識、及び（ｃ）
第１の酵素標識とは区別して検出できる第２の酵素標識
を含む。さらにキットには、基準（対照）ゲノムに相当
する核酸又は基準（対照）細胞からのｃＤＮＡや、第１
の酵素標識および第２の酵素標識を核酸に導入する反応
に必要な試薬又は緩衝液などが含まれていてもよい。以
下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、以
下の実施例は本発明の一実施態様を例示するためのもの
であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明
の範囲内で実施例を適宜変更又は修正して実施できるこ
とは当業者には自明である。
を行うための核酸分析キットにも関する。本発明の核酸
分析キットは、少なくとも（ａ）固相支持体に結合した
標的核酸のアレイ、（ｂ）第１の酵素標識、及び（ｃ）
第１の酵素標識とは区別して検出できる第２の酵素標識
を含む。さらにキットには、基準（対照）ゲノムに相当
する核酸又は基準（対照）細胞からのｃＤＮＡや、第１
の酵素標識および第２の酵素標識を核酸に導入する反応
に必要な試薬又は緩衝液などが含まれていてもよい。以
下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、以
下の実施例は本発明の一実施態様を例示するためのもの
であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明
の範囲内で実施例を適宜変更又は修正して実施できるこ
とは当業者には自明である。
【００４６】
【実施例】実施例１：酵素標識ｃＤＮＡの作成 （Ａ）一本鎖ｃＤＮＡの作成 ヒト肝臓またはヒト小腸由来全ＲＮＡ（３μｇ）とオリ
ゴｄＴプライマーまたは遺伝子特異的プライマー（下記
の通り）混合物（５００ｎｇ）を混合し、ＲＮＡｓｅを
含まない滅菌水で１２μｌにメスアップした。これを７
０℃で１０分間加熱した後、氷浴にて急冷した。遠心機
で内容物をチューブ底に集めた後、５×ファーストスト
ランド合成バッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2）4μｌ、0.1ＭのＤＴＴを２μｌ、１０ｍＭのｄ
ＮＴＰ混合液 １μｌを添加、混合し、４２℃で２分間
インキュベートした。次に逆転写酵素SuperScriptII
（Gibco BRL社）２００unitを添加、混合し、４２℃で
３０分間インキュベートした後、７０℃で１５分間加熱
した。最後に大腸菌由来のRNAse H ２ unitを添加、混
合し、３７℃で２０分間インキュベートした。
ゴｄＴプライマーまたは遺伝子特異的プライマー（下記
の通り）混合物（５００ｎｇ）を混合し、ＲＮＡｓｅを
含まない滅菌水で１２μｌにメスアップした。これを７
０℃で１０分間加熱した後、氷浴にて急冷した。遠心機
で内容物をチューブ底に集めた後、５×ファーストスト
ランド合成バッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2）4μｌ、0.1ＭのＤＴＴを２μｌ、１０ｍＭのｄ
ＮＴＰ混合液 １μｌを添加、混合し、４２℃で２分間
インキュベートした。次に逆転写酵素SuperScriptII
（Gibco BRL社）２００unitを添加、混合し、４２℃で
３０分間インキュベートした後、７０℃で１５分間加熱
した。最後に大腸菌由来のRNAse H ２ unitを添加、混
合し、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００４７】使用したプライマー（３１種；配列表の配
列番号１〜３１に記載） HSA1L: AAAGGAGTTC CGGGGCATAA AAG HSA2L: TGGCAGCATT CCTTGTGG HSA3L: TCTCAGCAGC AGCACGAC HSA4L: AACATTTGCT GCCCACTTTT CCTA HSA5L: CTCGGCAAAG CAGGTCT HSA6L: TTAATTAGCC CACAGAAACT
列番号１〜３１に記載） HSA1L: AAAGGAGTTC CGGGGCATAA AAG HSA2L: TGGCAGCATT CCTTGTGG HSA3L: TCTCAGCAGC AGCACGAC HSA4L: AACATTTGCT GCCCACTTTT CCTA HSA5L: CTCGGCAAAG CAGGTCT HSA6L: TTAATTAGCC CACAGAAACT
【００４８】AA2L: GCAAAGAGTG GGTAGGGACA GGAG
【００４９】GP1L: CAGGGGGCAG TCTTGGCACA CC GP2L: GAAGGTGTGG CGCAGGTCGT AGTG GP3L: TCAGGCACTT TCATTAACAG GCACA T
【００５０】REP1L: CCTCCATCGG ACATGTCACA ATAAAC REP2L: AAGTAACAAA GGCAAGTGAG AAGAATG REP3L: ACCCATGCCA GGTGTACCAG ACAATC REP4L: TTGGGGAATA TTCAACTCGT AGAAAT
【００５１】ECD1L: GTGCTGGGTG AACCTTCTGA TGCTAA ECD2L: CCAGCCTGGC CGATAGAATG AGA ECD3L: ACTTGAGCCC AGGAGTTTGA GACCA ECD4L: GGGGGCCAAG GCAGAAGGAT T ECD5L: TGGATAGCTG CCCATTGCAA GTTACA ECD6L: GGGCCACATT TTCTTCTTGC TCCTA ECD7L: TCCACCCCCA AAGAAAATAC
【００５２】NET1L: TCTTTCTTGA TGGCAGGCAC TACC NET2L: CAGTTCCCAT GTGGCAGCAG TAGTG NET3L: CAGAGGCTCT GCTGATTTCA CTTATG
【００５３】EF1L: CACCAACACC AGCAGCAACA ATC EF2L: AGGGCTTGTC AGTTGGACGA GTT EF3L: GGCGATCAAT CTTTTCCTTC AGC EF4L: TGAGACCGTT CTTCCACCAC TGATTA
【００５４】ACT1L: CGCGGTTGGC CTTGGGGTTC AG ACT2L: GCCTAGAAGC ATTTGCGGTG GACGAT ACT3L: GGCTGCCTCC ACCCACTCC
【００５５】（Ｂ）ＨＲＰ標識ｃＤＮＡの作成 滅菌水で希釈した一本鎖ｃＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１
０μｌにＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング試
薬キット(アマシャムファルマシアバイオテク製)添付の
ラベリング試薬１０μｌ、次にグルタルアルデヒド１０
μｌを添加、混合した後、３７℃で１０分間インキュベ
ートし、ＨＲＰ標識ｃＤＮＡを作成した。
０μｌにＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング試
薬キット(アマシャムファルマシアバイオテク製)添付の
ラベリング試薬１０μｌ、次にグルタルアルデヒド１０
μｌを添加、混合した後、３７℃で１０分間インキュベ
ートし、ＨＲＰ標識ｃＤＮＡを作成した。
【００５６】（Ｃ）ＡＬＰ標識ｃＤＮＡの作成 滅菌水で希釈した一本鎖ｃＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１
０μｌにAlkPhosダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング
試薬キット(アマシャムファルマシアバイオテク製)添付
の反応バッファー１０μｌを添加・混合し、次にラベリ
ング試薬２μｌ、さらにクロスリンカーワーキング液を
添加・混合した後、３７℃で３０分間インキュベート
し、ＡＬＰ標識ｃＤＮＡを作成した。
０μｌにAlkPhosダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング
試薬キット(アマシャムファルマシアバイオテク製)添付
の反応バッファー１０μｌを添加・混合し、次にラベリ
ング試薬２μｌ、さらにクロスリンカーワーキング液を
添加・混合した後、３７℃で３０分間インキュベート
し、ＡＬＰ標識ｃＤＮＡを作成した。
【００５７】実施例２：ハイブリダイゼーション 血清アルブミン、α-2-HS糖タンパク質、HFREP-1、E-カ
ドヘリン、テトラスパンNET-1、βアクチン、EF1-α遺
伝子の断片(約５００ｂｐ)をＰＣＲ操作により調製、精
製し、これを９５℃に加熱後急冷し、ナイロンメンブレ
ンHyBond N+に１μｌ（ＤＮＡ量として２ｎｇ）ずつス
ポット、風乾し、ＵＶ照射した。ＤＮＡスポット済メン
ブレンを、ハイブリダイゼーション用バッファー(０．
５Ｍのチャーチリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳ)に浸して、６０℃で３０
分間振盪した後、実施例１で作成したＨＲＰ及びＡＬＰ
標識プローブを終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加し
て、さらに６０℃で１６時間振盪した。
ドヘリン、テトラスパンNET-1、βアクチン、EF1-α遺
伝子の断片(約５００ｂｐ)をＰＣＲ操作により調製、精
製し、これを９５℃に加熱後急冷し、ナイロンメンブレ
ンHyBond N+に１μｌ（ＤＮＡ量として２ｎｇ）ずつス
ポット、風乾し、ＵＶ照射した。ＤＮＡスポット済メン
ブレンを、ハイブリダイゼーション用バッファー(０．
５Ｍのチャーチリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳ)に浸して、６０℃で３０
分間振盪した後、実施例１で作成したＨＲＰ及びＡＬＰ
標識プローブを終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加し
て、さらに６０℃で１６時間振盪した。
【００５８】実施例３：検出 （Ａ）ＨＲＰ標識ｃＤＮＡの検出 上記のメンブレンを洗浄液(１％のＳＳＣ、０．１％の
ＳＤＳ)に浸して６０℃で１０分間振盪を３回繰り返
し、バッファーＡ(１００ｍＭのTris-HCl（ｐＨ７．
５）、６００ｍＭのＮａＣｌ)で1回リンスし、リキッド
ブロック（Amersham製）を上記バッファーＡで２０倍希
釈した液に３０分浸した。その後、ＨＲＰ標識抗フルオ
ロセイン抗体を0.5％のＢＳＡ入りバッファーＡで１０
００倍希釈した液に３０分、０．１％のTween20に１０
分×３回浸した。このメンブレンをラップフィルムに乗
せ、キット添付のＥＣＬ検出試薬を十分量滴下し、３分
後にラップでくるみ、ＬＡＳ１０００で発光を検出・記
録した。
ＳＤＳ)に浸して６０℃で１０分間振盪を３回繰り返
し、バッファーＡ(１００ｍＭのTris-HCl（ｐＨ７．
５）、６００ｍＭのＮａＣｌ)で1回リンスし、リキッド
ブロック（Amersham製）を上記バッファーＡで２０倍希
釈した液に３０分浸した。その後、ＨＲＰ標識抗フルオ
ロセイン抗体を0.5％のＢＳＡ入りバッファーＡで１０
００倍希釈した液に３０分、０．１％のTween20に１０
分×３回浸した。このメンブレンをラップフィルムに乗
せ、キット添付のＥＣＬ検出試薬を十分量滴下し、３分
後にラップでくるみ、ＬＡＳ１０００で発光を検出・記
録した。
【００５９】（Ｂ）ＡＬＰ標識ｃＤＮＡの検出 上記測定終了後、上記メンブレンを０．０１％のＮａＮ
3に10分間浸し、その後バッファーＢ(100 ｍＭのTris-H
Cl（ｐＨ９．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ)でリンス
し、リキッドブロックをバッファーＢで１０倍希釈した
液に３０分浸した。その後、ＡＬＰ標識抗フルオロセイ
ン抗体を０．５％のＢＳＡ入りバッファーＡで５０００
倍希釈した液に３０分、０．３％のTween20に１０分×
３回浸した。このメンブレンをラップフィルムに乗せ、
キット添付のCDP-Star検出試薬を十分量滴下し、３分後
にラップでくるみ、ＬＡＳ１０００で発光を検出・記録
した。
3に10分間浸し、その後バッファーＢ(100 ｍＭのTris-H
Cl（ｐＨ９．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ)でリンス
し、リキッドブロックをバッファーＢで１０倍希釈した
液に３０分浸した。その後、ＡＬＰ標識抗フルオロセイ
ン抗体を０．５％のＢＳＡ入りバッファーＡで５０００
倍希釈した液に３０分、０．３％のTween20に１０分×
３回浸した。このメンブレンをラップフィルムに乗せ、
キット添付のCDP-Star検出試薬を十分量滴下し、３分後
にラップでくるみ、ＬＡＳ１０００で発光を検出・記録
した。
【００６０】（Ｃ）結果 測定結果を以下の表１にまとめる。表１の結果から明ら
かなように、本発明の方法により２種類のｍＲＮＡ混合
物の発現の相違を検出することができることが分かる。
かなように、本発明の方法により２種類のｍＲＮＡ混合
物の発現の相違を検出することができることが分かる。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【発明の効果】本発明により、第１の試料及び第２の試
料中の標的核酸の存在量を比較するのに有用な新規方法
が提供される。本発明の方法は感度が高く、またクロス
トーク（混色）を防止することができる。
料中の標的核酸の存在量を比較するのに有用な新規方法
が提供される。本発明の方法は感度が高く、またクロス
トーク（混色）を防止することができる。
【００６３】
SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd. <120> A process for the analysis of nucleic acid <130> A01171MA <160> 31
【００６４】 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 1 aaaggagttc cggggcataa aag 23
icially synthesized primer sequence <400> 1 aaaggagttc cggggcataa aag 23
【００６５】 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 2 tggcagcatt ccttgtgg 18
icially synthesized primer sequence <400> 2 tggcagcatt ccttgtgg 18
【００６６】 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 3 tctcagcagc agcacgac 18
icially synthesized primer sequence <400> 3 tctcagcagc agcacgac 18
【００６７】 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 4 aacatttgct gcccactttt ccta 24
icially synthesized primer sequence <400> 4 aacatttgct gcccactttt ccta 24
【００６８】 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 5 ctcggcaaag caggtct 17
icially synthesized primer sequence <400> 5 ctcggcaaag caggtct 17
【００６９】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 6 ttaattagcc cacagaaact 20
icially synthesized primer sequence <400> 6 ttaattagcc cacagaaact 20
【００７０】 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 7 gcaaagagtg ggtagggaca ggag 24
icially synthesized primer sequence <400> 7 gcaaagagtg ggtagggaca ggag 24
【００７１】 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 8 cagggggcag tcttggcaca cc 22
icially synthesized primer sequence <400> 8 cagggggcag tcttggcaca cc 22
【００７２】 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 9 gaaggtgtgg cgcaggtcgt agtg 24
icially synthesized primer sequence <400> 9 gaaggtgtgg cgcaggtcgt agtg 24
【００７３】 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 10 tcaggcactt tcattaacag gcacat 26
icially synthesized primer sequence <400> 10 tcaggcactt tcattaacag gcacat 26
【００７４】 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 11 cctccatcgg acatgtcaca ataaac 26
icially synthesized primer sequence <400> 11 cctccatcgg acatgtcaca ataaac 26
【００７５】 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 12 aagtaacaaa ggcaagtgag aagaatg 27
icially synthesized primer sequence <400> 12 aagtaacaaa ggcaagtgag aagaatg 27
【００７６】 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 13 acccatgcca ggtgtaccag acaatc 26
icially synthesized primer sequence <400> 13 acccatgcca ggtgtaccag acaatc 26
【００７７】 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 14 ttggggaata ttcaactcgt agaaat 26
icially synthesized primer sequence <400> 14 ttggggaata ttcaactcgt agaaat 26
【００７８】 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 15 gtgctgggtg aaccttctga tgctaa 26
icially synthesized primer sequence <400> 15 gtgctgggtg aaccttctga tgctaa 26
【００７９】 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 16 ccagcctggc cgatagaatg aga 23
icially synthesized primer sequence <400> 16 ccagcctggc cgatagaatg aga 23
【００８０】 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 17 acttgagccc aggagtttga gacca 25
icially synthesized primer sequence <400> 17 acttgagccc aggagtttga gacca 25
【００８１】 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 18 gggggccaag gcagaaggat t 21
icially synthesized primer sequence <400> 18 gggggccaag gcagaaggat t 21
【００８２】 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 19 tggatagctg cccattgcaa gttaca 26
icially synthesized primer sequence <400> 19 tggatagctg cccattgcaa gttaca 26
【００８３】 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 20 gggccacatt ttcttcttgc tccta 25
icially synthesized primer sequence <400> 20 gggccacatt ttcttcttgc tccta 25
【００８４】 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 21 tccaccccca aagaaaatac 20
icially synthesized primer sequence <400> 21 tccaccccca aagaaaatac 20
【００８５】 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 22 tctttcttga tggcaggcac tacc 24
icially synthesized primer sequence <400> 22 tctttcttga tggcaggcac tacc 24
【００８６】 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 23 cagttcccat gtggcagcag tagtg 25
icially synthesized primer sequence <400> 23 cagttcccat gtggcagcag tagtg 25
【００８７】 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 24 cagaggctct gctgatttca cttatg 26
icially synthesized primer sequence <400> 24 cagaggctct gctgatttca cttatg 26
【００８８】 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 25 caccaacacc agcagcaaca atc 23
icially synthesized primer sequence <400> 25 caccaacacc agcagcaaca atc 23
【００８９】 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 26 agggcttgtc agttggacga gtt 23
icially synthesized primer sequence <400> 26 agggcttgtc agttggacga gtt 23
【００９０】 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 27 ggcgatcaat cttttccttc agc 23
icially synthesized primer sequence <400> 27 ggcgatcaat cttttccttc agc 23
【００９１】 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 28 tgagaccgtt cttccaccac tgatta 26
icially synthesized primer sequence <400> 28 tgagaccgtt cttccaccac tgatta 26
【００９２】 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 29 cgcggttggc cttggggttc ag 22
icially synthesized primer sequence <400> 29 cgcggttggc cttggggttc ag 22
【００９３】<210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 30 gcctagaagc atttgcggtg gacgat 26
icially synthesized primer sequence <400> 30 gcctagaagc atttgcggtg gacgat 26
【００９４】 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artif
icially synthesized primer sequence <400> 31 ggctgcctcc acccactcc 19
icially synthesized primer sequence <400> 31 ggctgcctcc acccactcc 19
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 4B024 AA11 AA20 CA09 HA14 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QQ02 QQ42 QQ52 QR02 QR13 QR55 QR82 QS02 QS34 QX01
Claims (10)
- 【請求項１】 下記の工程を含む核酸の分析方法。 （ａ）第１の酵素で標識した第１の試料由来の第１の核
酸の混合物及び第１の酵素による標識とは区別して検出
できる第２の酵素で標識した第２の試料由来の第２の核
酸の混合物を、固相支持体に結合した標的核酸を含む核
酸アレイと接触させて、上記アレイ中の標的核酸と実質
的に同一な配列を有する上記第１及び第２の核酸を該標
的核酸とハイブリダイズさせる工程；及び（ｂ）アレイ
の標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２の
核酸を検出する工程。 - 【請求項２】 核酸アレイの標的核酸とハイブリダイズ
した第１の核酸を第１の酵素を用いて検出した後、核酸
アレイを洗浄して第１の酵素の検出に使用した物質を除
去し、次いで、標的核酸とハイブリダイズした第２の核
酸を第２の酵素を用いて検出することにより、核酸アレ
イの標的核酸とハイブリダイズした第１の核酸及び第２
の核酸を検出するか；あるいは核酸アレイの標的核酸と
ハイブリダイズした第２の核酸を第２の酵素を用いて検
出した後、核酸アレイを洗浄して第２の酵素の検出に使
用した物質を除去し、次いで、標的核酸とハイブリダイ
ズした第１の核酸を第１の酵素を用いて検出することに
より、核酸アレイの標的核酸とハイブリダイズした第１
の核酸及び第２の核酸を検出する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 標的核酸がｃＤＮＡである請求項１又は
２に記載の方法。 - 【請求項４】 標的核酸が哺乳動物由来のｃＤＮＡであ
る、請求項１から３の何れかに記載の方法。 - 【請求項５】 標識された第１及び第２の核酸が哺乳動
物由来のＤＮＡである、請求項１から４の何れかに記載
の方法。 - 【請求項６】 第１の酵素がホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）、であり、第２の酵素がアルカリ
ホスファターゼ（ＡＬＰ）である、請求項１から５の何
れかに記載の方法。 - 【請求項７】 第１の試料由来の第１の核酸が、試験細
胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり、第２の試料由
来の第２の核酸が、基準（対照）細胞からのｍＲＮＡま
たはｃＤＮＡである、請求項１から６の何れかに記載の
方法。 - 【請求項８】 第１の試料由来の第１の核酸が、試験ゲ
ノム由来の核酸であり、第２の試料由来の第２の核酸
が、基準（対照）ゲノム由来の核酸である、請求項１か
ら７の何れかに記載の方法。 - 【請求項９】 第１の試料及び第２の試料中における標
的核酸の存在量を比較するために使用する、請求項１か
ら８の何れかに記載の方法。 - 【請求項１０】 （ａ）固相支持体に結合した標的核酸
のアレイ、（ｂ）第１の酵素標識、及び（ｃ）第１の酵
素標識とは区別して検出できる第２の酵素標識、を含
む、請求項１から９の何れかに記載の方法を行うための
核酸分析キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000171572A JP2001349889A (ja) | 2000-06-08 | 2000-06-08 | 核酸の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000171572A JP2001349889A (ja) | 2000-06-08 | 2000-06-08 | 核酸の分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001349889A true JP2001349889A (ja) | 2001-12-21 |
Family
ID=18674104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000171572A Pending JP2001349889A (ja) | 2000-06-08 | 2000-06-08 | 核酸の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001349889A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2017056251A1 (ja) * | 2015-09-30 | 2018-05-10 | 株式会社日立製作所 | 分析方法および分析用デバイス |
-
2000
- 2000-06-08 JP JP2000171572A patent/JP2001349889A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2017056251A1 (ja) * | 2015-09-30 | 2018-05-10 | 株式会社日立製作所 | 分析方法および分析用デバイス |
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