JPH11506316A - 固相支持体上でのリゾルベース解離によるミスマッチの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ここで開示されているのは、基準核酸に優先的にハイブリッド形成する検体核酸における単数又は複数のミスマッチを検出するための方法である。この方法には、ａ）検体核酸をその１本鎖形態で提供する段階：ｂ）電気泳動ゲル内のスロットに適合した固相支持体上に固定化された、１本鎖形態の基準核酸を提供する段階：ｃ）２本鎖形成を可能にする条件下で、１本鎖の固定化された基準核酸と１本鎖の検体核酸を接触させ、かくして固相支持体上に２本鎖を固定化させる段階：ｄ）リゾルベース(例えばＴ４エンドヌクレアーゼVII)が２本鎖を解離できるような条件の下で、２本鎖内の少なくとも１つの単一塩基対ミスマッチを認識することのできるこのリゾルベースと固定化された２本鎖と接触させる段階：ｅ）固定化された２本鎖の全て又は解離部分をスロット内に放出するのに充分な条件下で、電気泳動ゲルのスロット内に固相支持体を挿入する段階：及びｆ）ゲル電気泳動による放出産物を分析する段階であって、解離産物の存在が検体核酸内のミスマッチを表わしている段階が含まれている。

Description

【発明の詳細な説明】 固相支持体上でのリゾルベース解離によるミスマッチの検出 発明の背景 本発明は、核酸ミスマッチ検出方法に関する。 コーティング及び非コーティングＤＮＡならびにＲＮＡ内の突然変異を検出す る能力は、遺伝性疾患の診断にとって重要である。遺伝子突然変異は、必須タン パク質をコードするＤＮＡ配列中の単一ヌクレオチド変異又は多重ヌクレオチド 変異であることが考えられる。単一ヌクレオチド変異又は多重ヌクレオチド変異 は、結果として、フレームシフト突然変異、終止コドン又は遺伝子内の非保存的 アミノ酸置換を生成する可能性があり、これらの各々は、コードされたタンパク 質を不活性にすることがある。しかしながら、遺伝子突然変異は無害のものであ る可能性もあり、その場合、生成されるタンパク質産物は、機能的には変異を全 く検出することができないことになる（例えば無害の遺伝子多型性）。一方、反 復的ＤＮＡ内の突然変異は、例えばヒトの脆弱Ｘ症候群、棘筋及び延髄筋ジスト ロフィー、及び筋強直性ジストロフィーといった場合に観られるように、疾病を 導く可能性もある。 単一ヌクレオチド変異又は多重ヌクレオチド変異を含む突然変異体核酸は、変 性及びそれに続く対応する野生型及び相補的核酸間のアニーリングの後、単数又 は複数の塩基対のミスマッチを形成することになる。核酸ヘテロ２本鎖の中に見 出すことができると考えられる８つの単一塩基対ミスマッチは、具体的には、Ｇ ：Ａ，Ｃ：Ｔ，Ｃ：Ｃ，Ｇ：Ｇ，Ａ：Ａ，Ｔ：Ｔ，Ｃ：Ａ及びＧ：Ｔで表す事が できる。尚、ここで核酸ストランドがＲＮＡである場合には、ＵがＴと置換され る。一方のストランドが他方に比べて配列の欠失、置換、挿入、転位又は逆転を 含む配列が異なっているヘテロな鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡ分子間より２本の 相補ストランドが誘導されている場合に、核酸ミスマッチが形成し得る。 このような突然変異の検出は、がんの診断及び予後、遺伝的疾患のための周産 期スクリーニング、従来のテストによっては容易に検出できない疾病の示唆的診 断（例えばマルクアン症候群及び脆弱Ｘ症候群）及び遺伝子多型性の分析（例え ば、遺伝子地図作成又は同定を目的とするもの）を含む分野における重要な診断 手段を提供する。 発明の要約 一般に、本発明は、基準核酸に優先的にハイブリッド形成する検体核酸の中の 単数又は複数のミスマッチを検出するための方法において、ａ）検体核酸をその １本鎖形態で提供する段階：ｂ）電気泳動ゲル内のスロットに適合する固相支持 体上に固定化された、１本鎖形態の基準核酸を提供する段階：ｃ）２本鎖形態を 可能にする条件下で、１本鎖の固定化された基準核酸と１本鎖の検体核酸とを接 触させ、かくして固相支持体上に２本鎖を固定化させる段階：ｄ）リゾルベース がヘテロ２本鎖を解離できるような条件の下で、２本鎖内の少なくとも１つの単 一塩基対ミスマッチを認識することのできる条件下でリゾルベースと固定化され た２本鎖と接触させる段階：ｅ）固定化された２本鎖の全て又は解離部分をスロ ット内に放出させるのに充分な条件下で、電気泳動ゲルのスロット内に固相支持 体を挿入する段階：及びｆ）ゲル電気泳動による放出産物を分析する段階であっ て、解離産物の存在が検体核酸内のミスマッチを表わしている段階を含んで成る 方法に関する。 好ましい実施形態においては、固相支持体は、多重歯コームのうちの１本の歯 であり、これはマルチスロット電気泳動ゲルに適合する。又、解離産物は、電気 泳動ゲルのスロット内への挿入に先立って固相支持体に非共有結合した状態に保 持されている。上記リゾルベースはＴ４エンドヌクレアーゼVIIを用いることが できる。基準核酸はＰＣＲ増幅産物を用いることができる。基準核酸は、特異的 結合対の第１のメンバで標識付けされたプライマを用いて増幅される。固相支持 体は、特異的結合対の第２のメンバに対して非共有的に結合させている。かくし て増幅された基準核酸は特異的結合対の第１及び第２のメンバの相互作用を通し て固相支持体上に固定化される。特異的結合対はアビジン及びビオチンである。 固定化された基準核酸は検出可能な形で標識されている。解離部位は、基準核酸 上の検出可能な標識と固相支持体の間に位置づけされている。基準核酸は、変性 （例えば熱又はアルカリ処理による）により１本鎖にされている。固定化された 基準核酸は、１本の核酸鎖の分解（例えば、λエキソヌクレアーゼといった５’ エキソヌクレアーゼを用いたもの）により１本鎖にされる。検体核酸はＰＣＲ増 幅の産物を用いることができる。検体核酸は検出可能な形で標識づけされてる。 検体核酸は、検出可能な形で標識づけされているプライマを用いたＰＣＲ増幅の 産物であり、基準核酸は、特異的結合対の第１のメンバで標識づけされたプライ マを用いてＰＣＲ増幅され、検体核酸プライマは、特異的結合対標識の第１のメ ンバの方向とは反対に位置づけされた検出可能な標識で標識づけされる。解離部 位は、検体核酸上の検出可能な標識と固相支持体の間に位置づけされる。検体核 酸は変性により１本鎖とすることもできる。突然変異に由来するミスマッチを検 出するができる。 関連形態では、本発明は、検体核酸内のミスマッチを検出するためのキットに おいて、ａ）検体核酸に優先的にハイブリッド形成し、かつ電気泳動ゲル内のス ロットに適合する固相支持体上に固定化されている基準核酸、及びｂ）ヘテロ２ 本鎖の中の少なくとも１つのミスマッチを認識し解離することのできるリゾルベ ースを内含するキットに関する。 好ましい実施形態においては、キットはさらに、検体核酸に優先的にハイブリ ッド形成する基準核酸を含んでおり：基準核酸は、固相支持体上に固定化されて おり：基準核酸は特異的結合対の第１の部材で標識付けされ、固相支持体は、特 異的結合対の第２のメンバに非共有結合させられ、かくして基準核酸は特異的結 合対の第１及び第２のメンバの相互作用を通して固相支持体の上に固定化されて おり：特異的結合対はアビジン及びビオチンであり：固相支持体は、多重歯コー ムの１本の歯であって、マルチスロット電気泳動ゲルに適合し：リゾルパーゼは Ｔ４エンドヌクレアーゼVIIであり：キットにはさらに５'エキソヌクレアーゼ（ 例えばλエキソヌクレアーゼ）が含まれ、かくして、固定化された基準核酸を１ 本鎖にするのにエキソヌクレアーゼが使用され：検出されたミスマッチは突然変 異である。 「２本鎖（二重鎖）」という語は、２本がアニールにより生成された相補的核 酸ストランド（例えば検体及び基準核酸のアニールされたストランド）の間に形 成される構造を意味する。「ヘテロ２本鎖（ヘテロデュプレックス）」というの は、２本のアニールされた相補的核酸ストランド（例えば検体及び基準核酸のア ニールされたストランド）の間に形成され、第１のストランドの中の単数又は複 数のヌクレオチドが、単数又は複数のミスマッチを原因として第２の相対する相 補ストランドの中のヌクレオチドと適切に塩基対合できないような構造のことを 意味する。異なるタイプのヘテロ２本鎖の例としては、各々 Bhattacharya 及び Lilley，Nucl．Acids，Res.１７：６８２１（１９８９）の中で開示されている ような、単数又は複数のヌクレオチドの交換及び挿入及び欠失突然変異を示すも のがある。本願で使用する「相補的」という語は、ＤＮＡ又はＲＮＡといったよ うな２つの核酸間で２本鎖領域を生成するべく、塩基対合を形成することのでき る一連の連続的ヌクレオチドを含んでいることを意味している。かくして、ＤＮ Ａ又はＲＮＡの１本のストランドの中のアデニンは、相対する相補的ＤＮＡスト ランドの中のチミン又は相対する相補的ＲＮＡストランドの中のウラシルと対合 する。或いは又、ＤＮＡ又はＲＮＡの１本のストランドの中のグアニンは、相対 する相補ストランドの中のシトシンと対合する。対合領域は、２本鎖と呼ばれる 。２本鎖は、ホモ２本鎖又はヘテロ２本鎖のいずれをも含む。 「ミスマッチ」という語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの１本のストランドの中のヌク レオチドが、ワトソン−クリック塩基対合及びπ−積重ね相互作用を通して対合 しない又はできないことを意味する。かくして、ＤＮＡ又はＲＮＡの１本のスト ランドの中のアデニンは、相対する相補的ＤＮＡ又はＤＮＡストランドの中のア デニンとミスマッチを形成することになる。ミスマッチは又、第１のヌクレオチ ドが、第２のヌクレオチドの不在のために相対する相補的ＤＮＡ又はＲＮＡスト ランドの中の第２のヌクレオチドと対合できない場合にも発生する。 本願で用いる「基準核酸」というのは、長さが少なくとも２０ヌクレオチド、 好ましくは１００〜４００００ヌクレオチド、より好ましくは１５０〜５０００ ヌクレオチドである、ＤＮＡ及びＲＮＡのあらゆる配列のことを言う。往々にし て、基準核酸は対応する野生型個体群が得られたＤＮＡとは区別できない配列を もつことになる。 「検体核酸」というのは、長さが少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１ ００〜４００００ヌクレオチド、より好ましくは１５０〜５０００ヌクレオチド であるＤＮＡ又はＲＮＡのあらゆる配列のことである。特に大きい検体核酸フラ グメントが分析される場合（すなわち、２ｋｂ以上）、変性ポリアクリルアミド ゲル電気泳動に適したサイズ（＜２ｋｂ）のフラグメントを得るように、第２の 制限酵素で核酸を解離することができる。第２の制限酵素の選択は、ＤＮＡフラ グメントの制限酵素地図を作成することによって誘導される。 望まれる場合、検体又は基準核酸を、検出検定の実施に先立って分離すること か可能である。「分離された核酸」というのは、核酸が誘導されたもとの生体の 自然発生ゲノムの中でそれがすぐに隣接している核酸の両方とすぐに隣接してい ない（すなわちこれに共有結合していない）核酸セグメント又はフラグメントの ことを意味する。従って、この語には例えば、自律的複製が可能なプラスミドベ クター又は、ウイルス、バクテリオファージなどのベクターの中に取り込まれる 核酸が含まれる。「分離された核酸」という語には同様に、化学的手段、選択的 増幅又は制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生された核酸フラグメントなど の核酸から実質的に精製される核酸も含まれる可能性がある。本発明の検出検定 は、複数のＤＮＡ配列を同時に分析するのに使用され得ることから、分離及び精 製は不要であるが、望ましい場合にはこれを行なうことも可能である。 本願で使用する「優先的にハイブリッド形成する」という句は、第２の相補的 核酸ストランドに対しアニールし通常のハブリダイゼーション条件下でこれとホ モ２本鎖又はヘテロ２本鎖のいずれかの安定した２本鎖を形成し、しかも同じ通 常のハイブリダイゼーション条件下で無関係の核酸分子とは安定した２本鎖を形 成しないような核酸ストランドのことを指す。２本鎖の形成は、ハイブリダイゼ ーション反応の中で２本の相補的核酸ストランドをアニールすることによって達 成される。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応が起こ るハイブリダイゼーション条件（往々にしてハイブリダイゼーション緊縮性（ス トリンジェンシー）と呼ばれる）を調整して、きわめて特異的なものにすること ができる。すなわち、２本の核酸ストランドが実質的に又は完全に相補的である 特異的な配列間で一定数のヌクレオチドを有してない場合には、安定した２本鎖 、例えば通常の緊縮性条件下で２本鎖を形成する領域を保持する２本鎖を形成さ せないハイブリダイゼーション条件に調整される。 「通常のハイブリダイゼーション又は通常の緊縮性条件」は、何らかの与えられ たハイブリダイゼーション反応について、容易に決定される。（例えば、Ausube l et al，「分子生物学における現行プロトコル、John Wiley & Sons，Inc.，Ne w York，又は Sambrook et al.，分子クローニング：実験室マニュアル，Cold S pring Harbor Laboratory Press を参照のこと）。 「電気泳動ゲル内のスロットに適合する」というのは、あらゆるタイプの電気 泳動ゲル（例えば、あらゆるタイプのアガロース又はアクリルアミドゲル）の単 数又は複数のウェルの中にフィットするように構成されている又は構成され得る あらゆる固相支持体のことを意味する。電気泳動ゲル系の例は、Ausubel et al. ,（前出）及び Sambrook et al.,(前出)の中で提供されており、当該技術分野に おいて周知のものである。 本願で使用される「リゾルベース」というのは、ヘテロ２本鎖鋳型内のミスマ ッチを認識しこれを解離することのできるあらゆるタンパク質のことである。リ ゾルベースの例としては、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII，Saccharomyces cerevis iae Endo X1，Endo X2，又は Endo X3(Jensch et al.，ＥＭＢＯ Ｊ．８：４３ ２５，１９８９），Ｔ７ エンドヌクレアーゼＩ、Ｅ．coli MutＹ（Wu et al., Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ８９：８７７９−８７８３，１９９２），哺乳 動物チミングリコシラーゼ（Wiebauer et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ８７：５８４２−５８４５，１９９０），ヒトの胸腺からのトポイソメラーゼＩ （Yeh et al.，J．Biol．Chem.２６６：６４８０−６４８４，９９１：Yeh et a l.，J．Biol．chem.２６９：１５４９８−１５５０４，１９９４）及びデオキシ イノシン３’エンドヌクレアーゼ（Yao 及び Kow，J．Biol．Chem.２６９：３１ ３９０−３１３９６，１９９４）が含まれるが、これらに限定されることはない 。一定の与えられたミスマッチ検出検定において、単数又は複数のリゾルベース を利用することが可能である。 「特異的結合対（ペア）」というのは、互いに特異的非共有結合親和力をもつ 第１及び第２のメンバを含めあらゆる分子対を意味する。特異的結合対の例とし ては、抗原／抗体対、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ結合部位対、酵素／基質対 、レクチン／炭水化物対及び核酸２本鎖又は連結ＤＮＡストランドがある。 本願で使用する「変異」という語は、核酸配列内のヌクレオチド配列の変異（ すなわちヌクレオチドの置換、欠失又は挿入）に関する。突然変異を有する核酸 は、対応する野生型個体群のものとは配列の異なる核酸配列をもつ。本発明の方 法は、１以上５０以下のヌクレオチド配列変異を含む検体核酸内の突然変異を検 出する上で特に有用である。好ましくは、検体又は基準核酸内の突然変異は１以 上１０以下のヌクレオチド配列変異、より好ましくは１以上７以下のヌクレオチ ド配列変異を内含することになる。 本願で開示している通り、本発明は、核酸標本中でＤＮＡミスマッチを検出す るための単純かつ廉価な手段を提供する。このアプローチは、哺乳動物の疾病（ 例えばガン及びさまざまな遺伝的疾患）に付随するＤＮＡ突然変異を検出するた めに特に有用である。特定の例においては、反復ＤＮＡ内の単数又は複数の突然 変異が、ヒト脆弱Ｘ症候群、棘筋及び延髄筋ジストロフィ及び筋強直性ジストロ フィに関連づけられている（Caskey，前出）。これらの遺伝子の各々からの反復 ＤＮＡは、本願に記述する方法における検体核酸として役立てることができる。 代替的には、本発明の方法は、標準的テストが利用できないか又は確定的でない ような疾病（例えばマルファン症候群）に対応する突然変異を検出するために使 用することができる。この方法は自動式であるため、数多くの標本の大規模スク リーニング又は一定数の基準核酸に対する特定の標本のスクリーニングにとって 実用的なものとなっている。 当業者であれば、本発明がその他の目的にも有用であることが認められるであ ろう。例えば、請求されている方法は、実験的操作（例えば形質転換、突然変異 誘発、ＰＣＲ増幅又は長期間にわたる保存又は凍結／解凍サイクルの後）の間に 導入される突然変異といったような、クローニングされたＤＮＡ内の単一塩基対 のミスマッチの検出を容易にする。従って、この方法は、治療用タンパク質を発 現するか又は遺伝子療法を目的として患者の体内に導入される遺伝的構成体をテ ストするために有用である。 この方法は同様に、細菌及びウイルス株の迅速な型別のためにも使用できる。 「型別する」というのは、特定の株を同じ又は関連する細菌又はウイルスのその 他の株と区別する単数又は複数の核酸突然変異を検出することにより同遺伝子型 の細菌又はウイルス株を特徴づけることを意味する。一例としては、ヒト免疫不 全ウイルスの遺伝的変動は、各々特徴的遺伝子突然変異を有する全く異なるＨＩ Ｖ型の分離を導いてきた(Lopez-Galindez et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．Ｕ ＳＡ８８：４２８０(１９９１))。型別のために特に有利な検体ＤＮＡのその他 の例としては、例えばヒト−Ｔリンパ球ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス（特 にＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−II，ＨＩＶ−１，又はＨＩＶ−２のうちのいずれか １つ）といった Retroviridae 系統群のウイルス、Adenoviridae，Papovavirida e 又は Herpetoviridae 系統群のＤＮＡウイルス、細菌又はその他の微生物、例 えば Spirochaetales目、Treponema 又は Borrelia属、Kinetoplastida目、Tryp anosoma cruzi種、Actinomycetales目、Mycobacteriaceae系統群、Mycobacteriu m tukerculosis種又は Streptococcus属の微生物から分離された検体ＤＮＡが含 まれる。 相反する定義づけのないかぎり、本願で使用する全ての専門用語及び学術用語 は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解するものと同じ意味を もつ。本願で言及する全ての出版物は、参考として内含される。 本発明のその他の特長及び利点は、詳細な説明なる以下の記述及びクレームか ら明白となることだろう。 詳細な説明 まず最初に以下で図面について簡単に説明する。 図面 図１は、ミトコンドリア核酸配列を用いたミスマッチ検出検定の結果を示すク ロマトグラムである。 図２は、ｐ５３由来の核酸配列を用いたミスマッチ検出検定の結果を示すクロ マトグラムである。 以下では、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII及び個体支持体を利用した核酸ミスマ ッチ検出方法の一例を示す。この例は、本発明を例示するものであって制限的意 味をもつものではない。 固相支持体に対する基準ＰＣＲ産物の増幅及び結合 本検出方法の第１段階として、基準核酸に対応するＰＣＲ産物が生成され、固 相支持体に結合される。以下の好ましいアプローチでは、ＰＣＲ基準産物はビオ チニル化され、ゲル電気泳動装置に適合したストレプトアビジンコーティングの 施されたコームタイプの固相支持体に結合させられる。 特に、基準核酸標本が選択され、５'−ビオチニル化ＰＣＲプライマを用いて 標準的技法に従ってＰＣＲ反応が行なわれる（例えば、Lagerkvist et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ９１：２２４５（１９９４）を参照のこと）。ＰＣ Ｒ反応中のビオチニル化プライマの濃度は、好ましくは、コームに対する最終Ｐ ＣＲ産物の効率のよい結合を可能にするべく０.１μＭという最大濃度に維持さ れ、約５０ｆmole（例えば数μｌ）のＰＣＲ産物が結合のために使用される。こ の量は、解離産物が自動式レーザー螢光ＤＮＡシークエンサ（すなわちスエーデ ン Pharmacia Biotech AB，Uppsala から入手可能なＡＬＦシークエンサ）上で 分析される場合、分解能を最適化する。結合反応は、好ましくは、Lagerkvist e t al.，前出の中で記述されている通りに実施される。 ＰＣＲ産物を固相支持体に結合させるため、ＰＣＲ反応混合物を反応ウエルの 中に分配し、固相支持体と接触させる。コーム型固相支持体の例においては、反 応は、コームの歯の数に対応する反応ウエルの中に分布させられる。各反応混合 物の体積を、１ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５で約８ ０μｌに調整し、コーム混合物の中に浸漬させ４２℃で一晩インキュベートさせ る。望まれる場合、結合効率の低下を補償するため付加的なＰＣＲ産物を用いて 結合時間を著しく短縮することができる（分単位まで）（例えば Lagerkvist et al.，前出を参照のこと）。 その後、室温で５分間０.１５ＭのＮａＯＨでコームを洗浄し、ひきつづき１ 分間室温で５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５の中で 洗浄することによって、ＰＣＲ産物を１本鎖にする。 結合緩衝液（すなわち、１ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ ７.５に調整された Lagerkvist et al.，前出の「ＰＣＲ緩衝液」）中に浸漬さ れた状態で、少なくとも２週間４℃で、固相支持体に結合されたＰＣＲ産物（変 性されたか否かに関わらず）を保存することが可能である。 分析用ＰＣＲ産物の調製 分析用の標本ＰＣＲ産物を調製するため（例えば、標本核酸がヒト疾患の突然 変異診断を内含するか否かを決定する目的で）、ＰＣＲ反応における鋳型として 、標本核酸を使用する。この標本核酸は、血液試料、組織生検材料又はその他の 体液又は組織標本を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）あらゆる供 給源から得ることができる。これらの反応は、フルオロセイン標識付けされたプ ライマ（すなわち基準ＤＮＡの増幅で使用されるビオチニル化されたプライマの 方向とは反対側に位置づけされたプライマ）及び５’−リン酸化プライマ（Lage rkvist et al.,前出）を用いて行なわれる。固相支持体に結合されたＤＮＡスト ランドの標識付けを容易にするため、配列ＴＴＴはフルオレセインプライマの５ ’末端の中に取込まれる。こうして、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ媒介反応を介して のフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰの取込みによる標本ＰＣＲ産物に対するハイ ブリダイゼーションに続く基準ストランドの３’標識付けが可能となる。 固定化された基準ＤＮＡに対する効率の良いハイブリダイゼーションを可能に するため、Higuchi，Nucl．Acids，Res．１７：５８６５（１９８９）又はNikif orov，ＰＣＲ Meth．& Applic．３：２８５（１９９４）の方法に基づいてλ− エキソヌクレアーゼで標識付けされていないストランドを分解することによって 、標本ＰＣＲ産物を１本鎖にする。この段階において、標本ＰＣＲ産物の５'− リン酸塩は、５'−フルオロセインが完全に防御性をもつのに対し、分解を促進 する。この反応を実施するため、水中で２μｌのＰＣＲ反応を５倍に希釈し、こ の溶液に対し１/１０体積の１０×λ−エキソヌクレアーゼ緩衝液（０.６７Ｍ グリシン−ＫＯＨ，ｐＨ９.３，２５ｍＭのＭｇＣｌ₂）及び１Ｕのλ−エキソヌ クレアーゼ(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)を添加する。３７℃で反 応を３０分間インキュベートする。 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応の準備段階として、λ−エキソヌクレアーゼで処 理された一定体積（好ましくは約０.１p mol ）のＰＣＲ産物を２０μｌで５０ ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.５の最終溶液濃度に調整 する。その後、標本を反応ウエルに移して固相支持体と接触させる。コームタイ プの固相支持体が利用されている場合、反応ウエルは個々のコームの歯に対応す るように設計されている。固相支持体（例えばコーム）を溶液中に浸漬させ、標 準的な技術によってハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーショ ンは３７℃と７０℃の間で実施することができるが、好ましいハイブリダイゼー ション温度は７０℃である。この温度は、問題のシグナルを不明確にする可能性 のある短縮された増幅分子及びいわゆるプライマ２量体の効果を最小限におさえ る。７０℃で、好ましいハイブリダイゼーション反応時間は１５分である。ハイ ブリダイゼーションの後、固相支持体を、室温で２分間、５０ｍＭのＮａＣｌ、 １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.５の中で直ちに洗浄する。上述のハイブリ ダイゼーション反応条件は全て、プライマのハイブリダイゼーション又はプライ マ２量体の形成を防ぐよう充分な緊縮性をもつように標準的技術によって設計さ れている。 固定化されたストランドの標識付け 固定化されたストランドを標識付けするため、固相支持体（又はコームの各々 の歯）を１０分間、４２℃で、８０μｌの１ｍＭフルオレセイン−１５−ｄＡＴ Ｐ（Boeringer Mannheim Biochemical）４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.５ ，１１ｍＭのＤＴＴ，２９ｍＭのイソクエン酸及び４ｕのＴ７ポリメラーゼの中 でインキュベートする。インキュベーションの後、室温で２分間、５０ｍＭのＮ ａＣｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.５の中で固相支持体（例えばコー ム）を洗浄する。 Ｔ４ エンドヌクレアーゼVII解離 解離は、好ましくは以下のように行なわれる。１.５μｌの１０ＸエンドVII反 応緩衝液（０.５Ｍのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８.０，１００ｍＭのＭｇＣｌ₂（オ ートクレーブ処理された水を伴う１Ｍの原液から作られたもの））、５０ｍＭの ＤＴＴ（オートクレーブ処理された原液に対し最終濃度５０ｍＭとなるまで保存 ＤＴＴを添加する）、１ｍｇ/ｍｌのヌクレアーゼ無しのＢＳＡ（−２０℃で保 存された状態で１ｍｇ/ｍｌの最終濃度まで、ヌクレアーゼ無しの保存ＢＳＡ液 を添加する）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼVII（１００〜３０００単位、 好ましくは１００〜１０００単位の範囲内、最も好ましくは少なくとも５００単 位）、及び１２.５μｌの精製水を組合わせ、固相支持体（又はコームの歯）が 中に浸漬されているウエルの中へ分配する。次に反応を１時間３７℃でインキュ ベートする。好ましくは、並行して酵素を含まない対照実験が実施される。この 反応のためには、１μｌの酵素希釈緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８ .０，５０％のグリセロール（オートクレーブ処理水と共に原液から作られたも の）、０.１ｍＭのグルタチオン（オートクレーブ処理された原液に対して最終 濃度０.１ｍＭになるまで保存グルタチオンを添加する）、及び１００μｇ/ｍｌ のＢＳＡ（ヌクレアーゼ無し、オートクレーブ処理された保存希釈液に添加）） をエンドVIIに置換させ、反応は上述のとおりに実施する。 代替的には、Youil et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.ＵＳＡ ９２：８７−９ １（１９９５）又は Mashal et al.，Nature Genetics ９：１７７（１９９５） の中で記述されている通りに、解離反応を実施することもできる。 Ｔ４エンドヌクレアーゼVIIは好ましくは Kosak & Kemper，Eur．J．Biochem ．１９４：７７９−７８４（１９９０）の方法によって精製され、−２０℃で保 存される。 産物の検出 解離反応の産物は、適当なあらゆる方法で分析できるが、好ましくは、ＡＬＦ シークエンサ及びメーカーの指示事項を用いて読取られる。このようなシークエ ンサを用いて反応を実施するためには、ゲルを５０℃まで加熱し、ウエルをホル ムアミドで予め充てんし、固相支持体（例えばコーム）を挿入し好ましくは１５ 分間インキュベートし、その後取り出す（Lagerkvist et al.，前出を参照のこ と）。この反応の間に、固相支持体に結合した産物がゲルのウエル内に放出され る。電気泳動の間、ゲルの温度を、好ましくは４５℃まで低下させる。固相支持 体から完全に解離されたＤＮＡ分子もこの要領でシークエンサ上に投入できるが 、 これは、解離されたＤＮＡ分子のかなり大きい割合が、ゲルのウエル内へ浸漬さ れるまで固相支持体に非特異的に結合された状態にとどまることになるからであ る。 固相支持体に結合したＤＮＡストランドの自由端のフルオレセインによる標識 により、ヘテロ２本鎖のストランド又はその解離産物のいずれか又は両方を同時 に検出することが可能である。消化反応を受けたＰＣＲ産物のサイズ（ひいては 解離部位の位置）を決定するため、ＤＮＡサイズ標準液と並行にゲル中を泳動さ せる（例えば Biomarker^TM EXT plus，ex １７４ Hae III，Biomarker^TM高又は Biomarker^TM低サイズ標準）。 上述の反応は、長さ約５００塩基対のＰＣＲ産物のために最適化されてきたが 、任意のさまざまな長さのＰＣＲ産物に対処するべく標準的技術によって修正す ることも可能である。同様に、望まれる場合には、解離反応の効率を増大させる ため任意の反応混合物に対し、さらに高い濃度のＴ４エンドヌクレアーゼVIIを 添加することができる。 ミトコンドリア及びｐ５３配列内のミスマッチの検出 上述の技術を用いて、ヒトミトコンドリア配列の中でミスマッチを検出した。 特に、ヒトミトコンドリア配列のＤ−ループからのセグメントをＰＣＲ（本願中 に記述されている通り）によって増幅させ、ストランドの１つをビオチンリンケ ージ（同様に本願中に記述されている通り）を用いてコーム様の支持体上に固定 化させた。ミトコンドリア配列の変異をもつ疑いのある個体からのＤＮＡを次に 、（５'−ビオチニル化プライマではなく）５'−リン酸化プライマを用いて（本 願に記述されている通りに）増幅させた。このＰＣＲ反応における反対のプライ マを、５'−フルオレセイン基で標識づけした。その後、増幅させた患者のＤＮ Ａをλエキソヌクレアーゼで処理してリン酸化されたストランドを分解し、残り のフルオレセイン標識づけされたストランドを固相支持体に結合された基準スト ランドに対して（本願に記述されている通りに）アニールさせた。洗浄後、ヘテ ロ２本鎖をＴ４エンドヌクレアーゼVIIで処理し、その後、（同じく本願に記述 される通り）反応産物を投入するべくポリアクリルアミドゲル内のスロットへと 支 持体を移送した。フルオレセインで標識づけされたフラグメントの移動を記録し 、標識づけされたサイズ標準の移動と比較した。結果は、可変的な量のＴ４エン ドヌクレアーゼVIIを含む反応混合物を反映するさまざまなクロマトグラムと共 に図１に示されている。 同じアプローチを用いて、ｐ５３由来の遺伝子セグメント内のミスマッチの検 出が達成された。これらの結果は、図２に示されている。下の２つのクロマトグ ラムは負の対照を示し、一方上の２つのクロマトグラムはＴ４エンドヌクレアー ゼVII反応を例示する。 その他の実施形態 その他の実施形態は、以下の請求の範囲を参照されたい。例えば、ゲル電気泳 動装置に適合するあらゆる固定支持体が本発明において利用可能である。コーム 型の固相支持体が好ましいが、電気泳動ウエル内に導入できるあらゆる固相支持 体も利用可能である（例えば常磁性ビーズ）。さらに、ＤＮＡ分子を基板につな ぎとめるためのあらゆる手段を通して、固相支持体に基準増幅産物を結合させる ことが可能である。このような固定手段は当該技術分野において周知のものであ り、検定で利用される条件下で変性しない核酸又はタンパク質成分が関与するあ らゆる結合対が含まれる：かかる対としては、抗原／抗体対、ＤＮＡ結合タンパ ク質／ＤＮＡ結合部位対（例えばＧＣＮ４タンパク質及びそのＤＮＡ結合部位） 、酵素／基質対、レクチン／炭水化物対、及び塩基対合又は連結された核酸が含 まれる。 その上、所望の場合には、上述の段階の多くを修正するか又は手順から除外す ることができる。例えば、標本ＰＣＲ産物のフルオレセイン標識付け段階を完全 に省略することもできるし、又解離産物を、標準的ＤＮＡ検出技術のみにより検 出することもできる（例えばＤＮＡと相互作用する着色剤又は染料を用いて）。 代替的には、フルオレセイン標識に代わって、あらゆる検出可能な標識、例えば 直接的又は間接的に視覚化できるあらゆる放射性、螢光、化学発光又は色素産生 標識を用いることができる：同様に有用な標識として含まれるのは、それ自体検 出可能な形で標識づけされた抗体によって認識されるジゴキシゲニンといったハ プテンである。 λエキソヌクレアーゼによる標本ＰＣＲ産物の消化段階も同様に修正可能であ る。例えば、λ酵素の代わりに、あらゆる５'エキソヌクレアーゼを置換するこ とができる。代替的には、支持体に結合したＰＣＲ産物の変性によりフルオレセ イン標識づけされたストランドを放出させることができる。従って、望まれる場 合には、手順からエキソヌクレアーゼ段階を完全に削除することもできる。消化 段階はハイブリダイゼーション効率を改良するものの、これは検出方法の実施の ために絶対に必要とされるわけではない。この段階におけるその他の修正として は、５'−フルオレセイン半分と任意の５'保護基の置換がある：有用な遮断分子 の例としては、ビオチン又はこれほど好ましいものではないが５−ヒドロキシル 基が含まれる。 本発明は、望ましい任意のリゾルベースを用いて実行できる。Ｔ４エンドヌク レアーゼVIIが好まれるものの、本発明で有用なその他のリゾルベースとしては （制限的な意味なく）、バクテリオファージＴ７エンドヌクレアーゼＩ及び Sac charomyces cerevisiae Endo X1，Endo X2 又は Endo X3（Jensch et al.，EMBO J.８：４３２５，１９８９）、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、E．Coli MutＹ（Wu et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.ＵＳＡ ８９：８７７９−８７８３，１９９２ ），哺乳動物チミングリコシラーゼ（Wiebauer et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．ＵＳＡ ８７：５８４２−５８４５，１９９０），ヒトの胸腺からのトポイソ メラーゼＩ（Yeh et al.，J．Biol．Chem.２６６：６４８０−６４８４，１９９ １：Yeh et al.，J．Biol．Chem.２６９：１５４９８−１５５０４，１９９４） 及びデオキシイノシン３'エンドヌクレアーゼ（Yao 及び Kow，J．Biol．Chem. ２６９：３１３９０−３１３９６，１９９４）が含まれる。１つのリゾルベース 又は異なるリゾルベースの組合せを用いてミスマッチ検出検定を実施することが できる。必要とあらば、本発明の方法及びキット（例えばコーム技術）により、 異なる緩衝液条件を用いた適切な逐次的リゾルベース反応が可能である。 検体核酸及び／又は基準核酸は、あらゆる真核細胞、ユウバクテリウム細胞、 バクテリオファージ、ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスから誘導することがで きる。好ましいＲＮＡウイルスとしては、（制限的な意味なく）、ヒトＴ細胞白 血病ウイルス及びヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−II ,ＨＩＶ−１，及びＨＩＶ−２）が含まれる。好ましいＤＮＡウイルスとしては 、（制限的な意味なく）、Adenoviridae，Papovaviridae 又は Herpetoviridae 系統群のいずれかが含まれる。好ましいユウバクテリウム細胞としては、（制限 的な意味なく）、Spirochaetales，Kinetoplastida，又は Actinomycetales目、 Treponemataceae，Trypoanosomatidae 又は Mycobacteriaceae 系統群、及び My cobacterium tuberculosis，Treponema pallidum，Treponema pertenue，Borrel ia burgdorferi,又は Trypanosoma cvuzi種が含まれる。 基準核酸は同様に、真核（例えば哺乳動物）細胞の腫瘍抑制遺伝子又はがん遺 伝子も含まれる可能性がある：好ましい哺乳動物がん遺伝子には、（制限的な意 味なく）abl，akt，crk，erb-A，erb-B，ets，fes/fps，fgr，fms，fos，jun，k it，mil/raf，mos，myb，myc，H-ras，K-ras，rel，ros，sea，sis，ski，src， 及び yes が含まれる：好ましい腫瘍抑制遺伝子としては、ｐ５３，網膜芽細胞 （好ましくはＲＢ１），腺腫様ポリープ症coli，ＮＦ−１，ＮＦ−２，ＭＬＨ− １，ＭＴＳ−１，ＭＳＨ−２ 及びヒト非ポリープ症遺伝子が含まれる。 代替的には、基準核酸は、β−グロブリン、フェニルアラニンヒドロキシラー ゼ、α₁−抗トリプシン、２１−ヒドロキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナー ゼＥ１α−サブユニット、ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ロードプシン、β −アミロイド、神経成長因子、スーパーオキサイドジスムターゼ、ハンチントン 病、膵のう胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ、β−地中海貧血、オルニチン トランスカルバミラーゼ、コラーゲン、ｂｃｌ−２，β−ヘキソサミニダーゼ 、トポイソメラーゼII、ヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ、 フェニルアラニン ４−モノオキシゲナーゼ、VIII因子、IX因子、ヌクレオシド ホスホリラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルト ランスフェラーゼ、デュシェーヌ筋ジストロフィー、フォンヒペルリンドー又は マウスモデルメンケス遺伝子のうちのいずれか１つから分離可能である。基準核 酸は同様に、任意の細胞サイクル制御遺伝子好ましくはｐ２１，ｐ２７又はｐ１ ６からも誘導可能である。 基準核酸は、（制限的な意味なく）、制限酵素フラグメント、ＰＣＲ，ＮＡＳ ＢＡ，ＳＤＡ又はその他のあらゆる予備的増幅方法を介して増幅により生成され る配列（例えば Landegren，遺伝学潮流、９：１９９−２０４，１９９３参照を 参照）又はあらゆる真核細胞、バクテリオファージ、ユウバクテリア細胞、昆虫 ウイルス（例えばバキュロウイルス誘導ベクター）又は動物ウイルス（例えばＳ Ｖ−４０又はアデノウイルス誘導ベクター）を含む任意の核酸分子であってよい 。 少なくとも１つのＤＮＡミスマッチを宿している疑いがあり、少なくとも部分 的ＤＮＡ配列がわかっている任意の検体ＤＮＡ鋳型をＰＣＲ増幅された検体ＤＮ Ａの供給源として使用することができる。この目的のためのＤＮＡ鋳型には、少 なくとも１つのＤＮＡミスマッチを形成している疑いのある領域が含まれていな くてはならず、同様にＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマ−ハイブリダイゼーシ ョン及びＰＣＲ増幅のための鋳型として役立つよう、疑われているミスマッチの 側鎖の充分なＤＮＡも含まれていなくてはならない。以上で概略的に示されてい る通り、ＰＣＲ増幅は、まず第１に、ミスマッチを形成している鋳型に２つのオ リゴヌクレオチドプライマをハイブリッド形成させ、次にＰＣＲ増幅を多数回完 了させることによって行なわれ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡは、上述のとおりヘテ ロ２本鎖形成のための検体ＤＮＡとして使用される。２つのオリゴヌクレオチド プライマの設計は、疑わしいミスマッチ部位の側鎖のＤＮＡ配列並びにＤＮＡオ リゴヌクレオチドプライマのサイズ及び鋳型にハイブリッド形成されたＤＮＡオ リゴヌクレオチドプライマの３'末端の間の介在領域のサイズという２つの重要 なパラメータによって導かれる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマの長 さは少なくとも１２ヌクレオチド、より好ましくは１５以上５０以下のヌクレオ チド、最も好ましくは１５以上２５以下のヌクレオチドとなる。鋳型にハイブリ ッド形成された２つのオリゴヌクレオチドの３'末端の間の介在領域のサイズは 、ＰＣＲにより増幅された鋳型の周知のサイズ制限条件及びリゾルベース解離部 位を検出するのに使用される特定のゲルの解像力によって支配されることになる 。一般に、鋳型にハイブリッド形成された２つのオリゴヌクレオチドの３'末端 の間の介在領域は、その長さが５０塩基対以上となる。ＰＣＲ技術における最近 の進歩は、最高４０ｋｂのＤＮＡ増幅を可能にした。好ましくは、介在領域の長 さは１００以上４００００以下の塩基対、より好ましくは１５０以上５０００以 下 の塩基対となる。当業者であればわかることであるが、フランキングＤＮＡ配列 が部分的にしか知られていない場合、ＰＣＲ増幅により検体ＤＮＡを調製するた めに、縮重したＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマを使用することができる。 もう１つの例では、少なくとも１つのＤＮＡミスマッチを宿している疑いのあ る鋳型ＤＮＡを、適切なクローニングベクター内にサブクローニングさせ、クロ ーニングベクターにハイブリッド形成しＤＮＡ鋳型の挿入部位に隣接している既 知のＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマを用いて増幅させることが可能である。 この例では、ＰＣＲ増幅のために使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチドが、挿入 された鋳型ＤＮＡではなく既知のＤＮＡ配列のベクターにハイブリッド形成する ことから、いかなる鋳型ＤＮＡ配列情報も必要とされない。例えば、メーカーの 指示事項に従って受容体部位内にＤＮＡ鋳型をサブクローニングするために Blu escript^TM ベクターを用いることができる（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA，Product Catalogue，（１９９２））。BluescriptベクターのＴ７及 びＴ３ ＤＮＡプライマは、挿入されたＤＮＡ鋳型をＰＣＲ増幅させるため（又 は同時に、挿入されたＤＮＡ鋳型を配列決定するため）に使用することができる 。その他の市販のサブクローニングベクターも同様に使用可能である。これには 、（制限的意味なく）、ファージラムダベースの挿入ベクター及びその他の原核 及び真核生物ベクター（例えば Stratagene,前出及び Sambrook et al.,前出、 により記述されているバクテリオファージ、昆虫ウイルス又は動物ウイルスベー スのベクター）が含まれる。代替的には、本願に参考として内含されているスェ ーデン特許出願第９４０３８０５−６号（１９９４年）に記述されている方法を 用いて、その配列を特定的に知ることなく分子クローンを増幅することが可能で ある。このアプローチは特に、クローニング又は増幅の段階の間に導入される分 子クローン内のエラーを検出するために有用である。 代替的な１つの方法では、少なくとも１つのＤＮＡミスマッチを支持するＤＮ Ａインサートを含むベクターを、まず最初に、ＰＣＲ増幅に先立つ細菌、ファー ジ、昆虫又は動物細胞内の伝播により増幅させる（Sambrook et al.，前出参照 ）。充分なＤＮＡが利用可能である場合（すなわち少なくとも１ナノグラム）、 ＰＣＲ増幅段階を削除することができる。 さらにもう１つの例では、少なくとも１つの突然変異をもつ疑いのあるＲＮＡ を、当該技術分野において周知の技術によって細胞又は組織から精製することが できる。例えば、ｍＲＮＡを調製するべく、オリゴ−ｄＴクロマトグラフィによ りＲＮＡを任意に精製することができる（例えば Sambrook et al.，前出及び A usubet et al.，前出を参照のこと）。リボソームＲＮＡが分析の対象であるか 又は特定のｍＲＮＡが豊富である場合、オリゴ−ｄＴクロマトグラフィは必要で なくなる。完全な１本鎖性を確保するため精製されたＲＮＡ又はｍＲＮＡが熱変 性され、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２本鎖を形成するべく対照ＤＮＡ（すなわち基準 ｃＤＮＡ）とハイブリッド形成させられる。ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖を形成するた めの方法は、当該技術分野において周知のものであり、詳細に記述されてきた（ Sambrook et al.，前出，ｐ７６２−７６５参照）。ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２本 鎖の形成の後、上述の方法を用いて、ｃＤＮＡとＲＮＡの間の誤対合により生成 されたミスマッチを検出することができる。 当業者であれは、本発明の組成物を、ミスマッチ検出用キットという形として まとめることができるということを容易に認識することだろう。標準的には、か かるキットは、その上でリゾルベース解離反応を行なうべき固相支持体及びミス マッチを検出できる少なくとも１つのリゾルベースを内含する。好ましくは、キ ットには、適切な緩衝液内のバクテリオファージＴ４エンドヌクレアーゼVIIが 内含され、任意には基準ＤＮＡが含まれることになり、又、反応条件を規格化す るのに用いる予め形成されたヘテロ２本鎖が含まれていてよい。 固相支持体及び上述の方法を用いたミスマッチ検出は、例えば、本願に参考と して内含されている Cotton et al.，U.S.S.N ０８／２３２,５３０内に記述さ れたリゾルベース解離技術といったような任意のリゾルベース解離技術と組合せ て使用可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、基準核酸に好適にハイブリッド形成する検体核酸上の１つ以上のミスマッチ を検出する方法であって、 ａ）検体核酸を一本鎖とし、 ｂ）前記基準核酸を電気泳動ゲルのスロットに適合した固相支持体に一本鎖と して固定化し、 ｃ）前記一本鎖の検体核酸を前記固定化された一本鎖の基準核酸に二重鎖形成 可能な条件で接触させ、前記固相支持体に二重鎖を固定化し、 ｄ）前記固定化された二重鎖に該二重鎖上の少なくとも１塩基対のミスマッチ を認識可能な条件でリゾルベースを接触させ、該リゾルベースによりヘテロデュ プレックスを解離させ、 ｅ）電気泳動ゲルのスロット内に前記固相支持体を挿入し、該スロット中に固 定化されたヘテロデュプレックスの全てまたは解離された一部を十分な条件で放 出させ、 ｆ）ゲル電気泳動により放出産物を解析し、解離産物の存在により検体核酸上 におけるミスマッチを検出することを、含む方法。 ２、前記固相支持体が、複数歯のコームの一本の歯であり、複数のスロットを有 する電気泳動ゲルと適合する請求の範囲１に記載の方法。 ３、前記解離産物が、前記電気泳動ゲルのスロット内への挿入前に前記固相支持 体に非共有的に結合されて保持されている請求の範囲１に記載の方法。 ４、前記リゾルベースがＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである請求の範囲1に記 載の方法。 ５、前記基準核酸がＰＣＲ増幅産物である請求の範囲１に記載の方法。 ６、前記基準核酸が特異的な結合ペアの第一のメンバで標識されたプライマーを 用いて増幅され、 前記固相支持体が特異的な結合ペアの第二のメンバと非共有的に結合され、 これら特異的な結合ペアの第一のメンバおよび第二のメンバの相互作用により 、前記増幅基準核酸が前記固相支持体に固定化される請求の範囲５に記載の方法 。 ７、前記特異的な結合ペアがアビジン及びビオチンである請求の範囲６に記載の 方法。 ８、前記固定化された基準核酸が検出可能に標識されている請求の範囲１に記載 の方法。 ９、前記解離部位が前記固相支持体と前記検出可能な標識との間に位置する請求 の範囲８に記載の方法。 １０、前記基準核酸が、変性または一方の核酸ストランドの分解によって一本鎖 とされる請求の範囲１に記載の方法。 １１、前記基準核酸のストランドが５’エキソヌクレアーゼにより分解される請 求の範囲１０に記載の方法。 １２、前記５’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼである請求の範囲１ １に記載の方法。 １３、検体核酸がＰＣＲ増幅産物である請求の範囲１に記載の方法。 １４、前記検体核酸が検出可能に標識されている請求の範囲１に記載の方法。 １５、前記検体核酸が検出可能に標識されたプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物 である請求の範囲１４に記載の方法。 １６、前記基準核酸が、特異的な結合ペアの第一のメンバで標識されたプライマ ーを用いて増幅され、 前記検体核酸プライマーは、前記特異的な結合ペア標識の第一のメンバとは逆 方向に配置された検出可能な標識により標識されている請求の範囲６に記載の方 法。 １７、前記解離部位が前記固相支持体と前記検出可能な標識との間に位置する請 求の範囲１４に記載の方法。 １８、前記検体核酸は変性により一本鎖にされる請求の範囲１に記載の方法。 １９、前記ミスマッチが変異である請求の範囲１に記載の方法。 ２０、検体核酸上のミスマッチを検出するキットであって、 ａ）電気泳動ゲルのスロットにて適合する固相支持体に固定化され、検体核酸 と好適にハイブリッド形成する基準核酸と、 ｂ）ヘテロデュプレックスにおける少なくとも一つのミスマッチを認識し、解 離させることができるリゾルベースと、を含むキット。 ２１、前記基準核酸が特異的な結合ペアの第一メンバで標識され、 前記固相支持体には、前記特異的な結合ペアの第二メンバが非共有的に結合さ れ、 これら特異的な結合ペアの第一及び第二メンバの間の相互作用により、前記基 準核酸が前記固相支持体に固定化される請求の範囲２０に記載のキット。 ２２、前記特異的結合ペアがアビジンとビオチンである請求の範囲２１に記載の キット。 ２３、前記固相支持体が、複数歯のコームの一本の歯であり、複数のスロットを 有する電気泳動ゲルと適合する請求の範囲２０に記載のキット。 ２４、前記リゾルベースが、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである請求の範囲２ ０に記載のキット。 ２５、さらに５’エキソヌクレアーゼを含み、 前記エキソヌクレアーゼが前記固定化された基準核酸を一本鎖にするために使 用される請求の範囲２０に記載のキット。 ２６、前記５’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼである請求の範囲２ ５に記載のキット。 ２７、前記ミスマッチが変異である請求の範囲２０に記載のキット。