WO1990008323A1

WO1990008323A1 - Reagent for detecting antibody corresponding to acid-fast bacterium antigen and application thereof

Info

Publication number: WO1990008323A1
Application number: PCT/JP1989/001341
Authority: WO
Inventors: Ikuya Yano; Shiro Oka; Yoshiteru Ueno; Yayoi Natsuhara; Junji Yoshinaga; Yoshiko Kato
Original assignee: Sawai Pharmaceutical Co., Ltd.; Medisa Shinyaku Inc.
Priority date: 1989-01-18
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1990-07-26
Also published as: EP0407605B1; DE68924265D1; EP0407605A4; EP0407605A1; DE68924265T2

Description

明細書

抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬およびその用途

「技術分野」

本発明は、結核菌またはその類縁抗酸菌 'に感染したヒトを舍む動物の血清等中の抗原対応抗体を特異的に検出するための抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬および抗酸菌抗原対応抗体の検出法、さらには抗酸菌感染症の迅速診断法に関する。

「背景技術」

抗酸菌に属する細菌は、その菌体表層に極めて疎水性の強い長鎖脂肪酸であるミコール酸を持つことが特徴であり、ミコール酸はァラビノガラクタンに結合して存在する他に、各種の脂質や糖、ペプチド等と結合した形で存在する。

この中でも、特に糖に結合したものとして、トレハロース ' ジミコレート（ T D Mと略す）は結核菌ではコードファクターとも呼ばれ、かって人型結核菌の産生する毒性糖脂質と,して、その病原性との深い関わり合いが注目されていたが、最近ではその他多数のマイコバクテ '') ゥム属 (Mycobacterium ) 菌種はもちろんのこと、その近縁菌であるノカルジァ属（ Mocardia) や口ドコ 'ソカス属（Rhodococcus) 等の非病原性放線菌細胞壁にも広く分布することが明らかにされつつある。

また、抗酸菌細胞壁に分布するミコール酸は T D Mとしてだけではなく、その他にミコール酸含有糖脂質（ M G L と略す）としては、たとえば

グルコース一モノミコレート

グノレコース一ジミコレートフルクト一ス一モノミコレ一ト

ァラビノース一モノミコレート

マンノース一モノミコレート

トレハロース一モノミコレート

トレノヽロース一トリミコレート

トレノヽロース一テトラミコレート

等の存在も明らかになつている。

これらの M G Lは生理活性の面で毒性のみならず、免疫ァジュバント活性、非特異的感染防御能、肉芽腫形成能、マクロファージ活性化能、抗腫瘍性等、多彩な免疫薬理学的生理活性を有する点が注目されている〔Kekkaku.. 63 (3) ,41-54 (1988) および第 11回医用マス研究会講演集、 11, 63-72 (1986)参照〕。

しかして、ミコール酸の種類は菌種に特有であり、抗酸菌種の同定にはきわめて重要な項目となっている。一方、ミコール酸の各菌種に応じたサブクラス組成や分子種組成については、すでに明らかにされている [Journal of Clinical Microbiology, 24 (6) , 106-1070 (1986) Journal of General Microbiology, 134, 2213-2229 (1988)参照〕。

従って、各菌種に由来するミコール酸またはその誘導体に対応する抗体を確認することによつて当該抗酸菌種、即ち感染菌種を同定することができる。

ところが、従来当該菌種の同定は、主として、分離培養後得られる菌体の形態学的および生化学的性状の解析によって行われていたので、迅速性に欠けるだけでなく、菌種によっては、判定結果がまちまちとなり、信頼できる結果が得られない等の問題点があつた。

—方、結核菌およびその類縁抗酸菌感染症は各種免疫反応に基づく類上皮細胞性肉芽腫を中心に進展し、最も特徴的な病変である結核結節や空洞形成を引き起こすことは周知のとおりであるが、現在、これら感染菌の迅速同定法がなく、従ってこれら結核菌またはその類緣抗酸菌感染症に対する迅速診断法が強く望まれているのが実情である。

本発明の一つの目的は抗酸菌種の同定用試薬及び抗酸菌の属

(マイコノ 'クテリゥム、ノカルジァおよび口ドコッカス属を舍む）の同定用試薬を提供することにある。

本発明の他の目的は抗酸菌種および抗酸菌の属（マイコバクテリゥム、ノカルジァおよびロドコッカス属を舍む）の同定法を提供することにある。

さらに、本発明の他の目的はヒトをはじめとする各種動物の抗酸菌感染症の迅速な診断法を提供することにある。

「発明の開示」

本発明者らは以前より、結核菌をはじめとして、抗酸菌の菌体の細胞壁脂質成分であるミコール酸およびその誘導体について鋭意研究を行ってきたところ、これら菌体から得られる M G Lを生体内に投与することにより生成される抗体が、ミコール酸部分（即ち、ミコール酸または当該ミコール酸の誘導体）を抗原として認識し、しかもミコール酸サブクラス間の構造の違いをも認識することを見出した。また、抗酸菌感染症患者の有する抗体が、ミコール酸、ミコール酸塩、ミコール酸エステルおよびミコール酸を除く炭素数が 1 4以上の脂肪酸と単糖類または二糖類とのエステルを抗原として認識することを、特に結核菌またはその類緣抗酸菌感染症患者の体液を検体として用いた場合も、そこに舍まれる抗体が上記化合物を抗原として認識することを見出し、これらに基づいて本発明を完成したものである。

即ち、本発明は下記①、 ②および③を提供するものである。

①抗酸菌種を同定するための抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬およびその検出法。

②抗酸菌の属（マイコバクテリゥム、ノカルジァおよびロドコッカス属を舍む）を同定するための抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬およびその検出法。

③上記①または②の抗酸菌抗原対応抗体検出法により、健常人と被験者との検体における吸光度の差を測定する被験者の抗酸菌感染症診断法。

本発明において、抗酸菌の属とは、主にマイコバクテリゥム属（ Mycobacterium ) 、ノカゾレジァ属（ Hoc rdia) および口ドコッカス属 (Rhodococcus) 等であり、たとえばマイコノクテリゥム属（Mycobacterium) に属する抗酸菌種としては、人型結核菌（liit&erculosis) 、牛型結核菌 (M. bovis) 等が結核菌として、マイコノクテリウム ' カンサシィ（ M. kansasii ) 、癩菌 ( M. leprae)^ マイコノヾクテゥム · ィントラセルラーレ（ intracell lare) と，島型結核菌（M. avium) との複合体、マイコノクテリゥム · スクロフラセゥム (M.

、マイコバクテリゥム · フォーチユイタム（Μ,/oriuiiun 等の非定型抗酸菌（ Atypical Mycobacter i a)が類緣抗酸菌として、それぞれ例示される。

本発明に関して、ミコール酸は下式（ Γ) の構造を有するものである。

R ¹ - C H - C H - C O O H

ί Η ²

(式中、 R ¹ および R ² はそれぞれ C ,。— ₆。の直鎮または分技鎖状の脂肪族鎖からなる）

ここで R ' および R ² はシクロプロパン環等のシクロアルキル基、メチル基等の低級アルキル基、メトキシ基等の低級アルコキシ基、エポキシ基、ヒドロキシ基、カルボニル基、カルボキシル基等の極性の異なる基を有していてもよく、また二重結合（好適には 1 〜 7個の二重結合）を有していてもよい。

菌体から得られるミコール酸の構造は、菌種によつて著しく異なり、総炭素数、二重結合数、 R ¹ および R ^z の炭素数等が分類学的に特徴を有するが、総炭素数のみについてもマイコバクテリゥム属（ Mycobacterium ) では C ₈₀以上、ノカルジァ属 ( ^ocardia) では C ₅₀前後が中心で、コリネバクテリゥム属 (Corynebacterium) では C ₃。前後が多いというように、きわめて広範囲にわたるほか、 R ¹ および R ² 中にシクロプロパン環やメチル基、メトキシ基、エポキシ基、ヒドロキシ基、カルボ二ル基または力ルボキシル基等極性の異なる多彩な基を有する。これらの事実は既に公知である〔微生物の化学分類実験法（学会出版センター発行） 131 〜 143 頁（ 1 9 8 5年 2月 1 0 日， 3刷）、 Eur.J. Biochem.139巻， 173 〜180 頁， 1984年〕。

ただし、本発明において菌種まで同定する際に問題となるのば置換基の相異であり、たとえば菌体から得られるものとして下記のようなサブクラスが知られている。

■ ( 7 ) or— ミコ— レ酸 ( C 7 a < , . tubercvilosis)

OH

CH₃ (CH_Z)！, CH-CH(CH₂)！ 4CH-CH(CH₂) ! ₃-CH-CH-COOH

\ / \ / I

CH 2 CH 2 C Z 4 H 49

(ィ）メトキシ一ミコール酸 ( C ₈₅< , . tuberculosis)

OCH₃ OH

CH₃ (CH₂)！ ₇CH-CH(CH₂)！ ₆CH-CH(CH_Z)！ ₇-CH-CH-COOH

I \/ I

CH 3 CH 2 C 2 H 9

(ゥ）ーミコール酸（またはケト一ミコー酸）

( C a 5 < , M. tuberculosis)

0 OH

II I

CH₃(CH₂) 17CH-C- (Ci₇H₃4)CH-CH(CH₂) _{i g}-CHCH-COOH

CH 3 CH 2 C 2 H

(ェ）ジ力ルボキシーミコール酸

( C "く， M.pklei )

OH I

HOOC- (CH_Z) , ₄CHCH=CH(CH₂) ₁₆CH-CH-COOH

t I -

CH 3 C z 2 H 5

その他、 or ' -ミコール酸（一ミコ一ル酸と同様だが、炭素数が異なる）やエポキシ基を有するものが例示される。

本発明において、ミコール酸は上述の如くであるが、炭素数については平均的な数値であり、異なる炭素数の混合物であつてもよい。本発明においてミコール酸塩とは、上記ミコール酸のナトリゥム、カリウム等の金属塩を意味する。

. 本発明において、ミコール酸エステルは、単糖類または二糖類とのエステル化物のみならず、アルキル、アルケニル、シリルまたはァリールエステルをも意味する。これらエステルとしては、抗原抗体反応を阻害しないものであれば特に制限はなく、例えばメチルエステル、ェチルエステル、 i -ブチルエステル、フエ二ノレエステル、卜リメチノレシリルエステル、ベンジルエステル等が例示される。

ミコール酸を除く炭素数が 1 4以上（好ましくは 1 4以上 80 以下、より好ましくは 1 4以上 4 0以下）の脂肪酸とは、置換基として水酸基、低級アルコキシ基、低級アルキル基、ェポキシ基、カルボニル基、カルボキシル基等の基を有していてもよい飽和脂肪族、不飽和脂肪族カルボン酸を表す。置換基を持たない単独の脂肪酸としては、例えばミリスチン酸、ペンタデカン酸、ノ、。ルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、ァラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ヘプタコサン酸、モンタン酸、メリシン酸、バクセン酸等の飽和脂肪酸、ォレイン酸、エライジン酸、セトレイン酸、ェルカ酸、ブラシジン酸、リノール酸、リノレン酸、ァラキドン酸、ステアロール酸等の不飽和脂肪酸が例示される。

本発明において単糖類としては、ペントース、へキソース、ヘプトース、ォクトース、ノノース、デコース等の直鎮、分枝鎖状または環状のものの他に、デォキシ糖、メチル糖、チォ糖、ァミノ糖等の置換体をも意味する。二糖類としては、麦芽糖、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ラクトース、ッラノース、ソホロース、トレハ -ロ一ス、イソトレハロース、ショ糖、イソサッカロースを意味する。

本究明において、アルキル、アルケニル、ァリールとしては特に限定されず、例えば置換されていてもよいアルキル（たとえば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、 s e c -プチル、 i er i— ブチレ、ブチル、へキシノレ、シクロへキシル等の直鎖状、分枝鎖状または環状のアルキル）、アルケニル (例えば、ァリル、ビニル、ベンジル、スチリル等の直鎖状、分枝鎖状または環状のアルケニル）、ァリール（たとえば、フェニル、ナフチル等）が例示される。本究明において特に低級アルキルとは、炭素数が 6以下のメチル、ェチル、プロビル、イソプロピル、イソブチル、 s ec-ブチル、 i ert - ブチル、ブチノレ、れーアミゾレ、イソアミノレ、へキシゾレ、シクロペンチゾレ、シク口へキシル等を意味する。

上記のミコ一ル酸またはミコール酸と糖類以外とのエステルの製造は自体既知の方法（菌体よりの抽出、合成等）によって行われる。

菌体から抽出する方法は次のようにして行われる。

即ち、菌体を直接加水分解し、有機溶媒抽出した後、 T L C (薄層クロマトグラフィー）分離するか、いつたん菌体からクロロホルムーメタノール等で糖脂質を抽出分離し、さらにこれを加水分解後、脂質を有機溶媒抽出して T L C分離することにより、各サブクラスのミコ一ル酸を得ることができる。さらに、これらのミコール酸を常法により低級アルキルエステル等とすることができる。

これらミコール酸またはミコール酸と糖類以外とのエステル (たとえばミコール酸低級アルキルエステル）は、常法により下記の如く合成によつても得ることができる。

〔 A法〕〔 B法〕〔 C法〕

R³ = R²の場合 R³≠I?^Zの場合 R³≠R²の場合

〔式中、 R ³- C H ₂ は前記式（ I ) の R ¹ に相当し、 R ² は前記と同意義〕

A法によると、 or—アルキル一 ^ 一ヒドロキシ脂肪酸（ I ) 〔即ち、前記式（ I ) で表わされるミコール酸〕のような分枝した脂肪酸を製造する場合、文献〔ビュルタン * ド · ラ ' ソシェテ ' シミク · ド ' フランス（ B u l l . S oc . C him . F r. ) 504 〜 510 (1954年）〕の記載にしたがって、 R ³ と！？ ² が同一のァルキル基の場合にば脂肪酸エステルをクライゼン縮合させ、次いで N a B H ₄ 還元することにより目的物のミコール酸低級ァルキルエステル（ H ) を得ることができる。

また、 B法によると、 R ³ と R ² が異なるアルキル基の場合、レホルマトスキ一反応を利用して、脂肪族アルデヒドと α:—ブ口モカルボン酸ェステルを縮合させ、ミコール酸低級アルキルエステル（ E ) を得ることができる。 A法または B法いずれかにより得られた化合物（ H ) を加水分解すると、目的物である化合物（ M ) 〔即ち、ミコール酸（ I ) 〕を得る。 . .

さらに、 C法によると、 R ³ と R ² が異なるアルキル基の場合、好ましくは 2モル以上の L D A (リチウムジイソプロピルアミド）のような強塩基の存在下に脂肪族アルデヒドとカルボン酸を縮合させ、直接化合物（ H ) 〔即ち、ミコール酸（ I ) 〕を得ることができる。

合成によつて得たミコール酸であれば、種々の所望の炭素数のものが得られ、組成が均一なものが得られることは言うまでもない。

尚、ミコール酸塩は、たとえばミコール酸を塩基と反応させることにより容易に調製される。ミコール酸を除く炭素数が 1 4以上の脂肪酸に関しても、自体既知の方法により調製される。

以上の如くして得られたミコール酸（菌体から得たものまたは合成により得たもの）、ミコ一ル酸塩または炭素数が 1 4以上の脂肪酸を前述の単糖類または二糖類により、既知の方法によりエステル化することにより、糖類とのエステル化物を製造することができる。

本発明において、二糖類としては特にトレハロースが望ましく、つまり、エステルとしてミコール酸とトレノヽロースとのェステルまたはミコール酸を除く炭素数が 1 4以上の脂肪酸とトレハロースとのエステル（ T F E と略す）が望ましい。

T F E としては、たとえばトレハロース · ノ\。ルミテート、トレノ、ロース ' ミリステート、トレノヽロース ' ステアレート、トレハロース ' ォクタデカジエネート、トレノヽロース ' コリノミコレート、トレハロース . ミコレート等が例示され、具体的には、 6 , 6 ' — ジ - 0 _ パルミトイノレ一，一トレハロース、 6,6' ージ -0— ミコロイノレ一 a , or— トレノヽロース、 2,6'— ジ- 0—ォレオイル一， α— トレハロース等が例示される。

T F Εは公知化合物を包舍するものであり、トレハロースと前記ミコール酸（菌体から得たものまたは合成により得たもの）、ミコール酸塩または炭素数が 1 4以上の脂肪酸とを自体既知のエステル化反応に付すことによって製造される。たとえば、トレハロースの 6 , 6 ' 位の 2置換体を調製するには、特開昭 58 一 185599号公報、ケミストリー ' アンド ' フィジックス ' ォブ - リピッズ (Chemistry and Physics of Lipids) 127 卷、 345 〜352 頁、 1980年に記載の方法ないしばこれに準ずる方法によつて、トレハロースの 6 , 6 ' 位の 2置換体を調製することが -できる。

また、非対称型（例えば 2 , 6 ' 位）の 2置換体を調製するには、トレハロースの 4 , 6位および 4 ' , 6 ' 位をそれぞれベンジリデン等の保護基により保護した後に常法により異性化を行い、再び 6位を保護し、所望の脂肪酸により 2 , 6 ' 位にジァシル化を行い、 2 , 6 ' 位以外の保護基を脱保護することにより、トレハロースの 2 , 6 ' 位の 2置換体を調製することができる。

T F Eはトレハロースの任意の位置に、好ましくは、 2 > 2 ' , 3 , 3 ' , 6 , 6 ' の任意の位置に、好適にば 1 〜 4個の脂肪酸 (ミコール酸を含む）が結合したエステルであり、特に 6 , 6 ' 位に 2個の脂肪酸（ミコール酸を含む）が結合したエステルが好適である。

本発明において、各サブクラスのミコール酸のエステルを抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬として採用した場合には、感染抗酸菌種まで同定することができ、従って T F Eの中でも、特にトレハロースのミコール酸エステル（ TMEと略す）が望ましい。

TM Eとしては、トレハロース . モノミコレート、トレハロース ' ジミコレート、トレノヽロース ' トリミコレート、トレノ、、ロース · テトラミコレート等が挙げられるが、特にトレハロース 6, 6'-ジミコレートが望ましい。

T-M Eとして具体的に例示すれば、 -0-コリノミコロイル -2-0 ；ンタデカノィルー o , 一トレノヽロース、 2-0 -ィコサノィル - 6 0- ( 3-ヒドロキシ - 2_η—ォクタデカニルーテトラコサノィル）一 or , or— トレハロース、 2-0- (9—ォクタデセノィル） - 6' -0- (3-ヒドロキシ- 2—テトラデカニル一 11ーィコセノィノレ） - な， - トレノヽロース、 2-0 -ペンタデカノィノレ- 3-0—ォクタデカノィル- 6 ' - 0- (3— ヒドロキシ - 2 - n—テトラデカニル一ドコサノィノレ）- or , - トレノヽロース、 2, 3-ジ -0—エイコサノィル -6' - 0- (3- ヒドロキシ -2-n—ォクタデカニルーテトラコサノィル） - α , - トレハロース、 2,3-ジ -0- (9-ォクタデセノィル） - 6' -0- (3- ヒドロキシ- 2—テトラデカニル一 11ーィコセノィル） - a , 一トレハロース等が挙げられる。

T Eは公知化合物を包舍するものであり、前述のミコール酸の菌体よりの抽出法と同様に、マイコバクテリゥム属 ( yco- bacterium. ) 、ノカノレジァ属 f f^ocardia ) 、ロドコッカス ¾

( Rkodococcus)、コリネノヾクテウム属 ( Coryneb cteriu ) 0 ような抗酸菌から公知の方法で抽出、単離することもできる。この場合には、各菌種由来のトレハロース -6- モノミコレート、トレハロース - 6, 6' -ジミコレート（コードファクタ一）、トレハロース - 2, 3, 6'- 卜リミコレート、トレハロース - 2, 6, 6'- トリミコレート等を得ることができる。

上記のように、 T M Eを直接菌体から得る場合には、トレハロースにつくミコール酸の数による分離しかできず、ミコール酸の置換基等が異なる種類（サブクラス）を分離することはできないため、菌体由来の所望のミユール酸をトレハロースの任意の位置に結合させる場合には、抗酸菌から公知の方法でミコール酸のみを抽出、分離、単離して、これらとトレハロースとを前述の自体既知のエステル化反応に付すことによって、 T M -Eを製造することができる。

本発明においては、ミコール酸（菌体から得たものまたは合成により得たもの）、ミコール酸塩または炭素数が 1 4以上の脂肪酸と、単糖類とのエステルについても、二糖類の場合と同様の方法により製造することができる。

本発明の試薬による抗酸菌抗原対応抗体検出ひいては抗酸菌種の同定、抗酸菌（マイコバクテリゥム、ノカルジァおよび口ドコッカス属を舍む）の属の同定ないしは抗酸菌感染症の診断に際しては、ミコール酸、ミコール酸塩、ミコール酸エステル

( M S と略す）またはミコール酸を除く炭素数が 1 4以上の脂肪酸と単糖類または二糖類とのエステル（ S F Eと略す）をプレートに固定して用いるのが好ましく、これに抗体を舍む検体

(結核菌感染患者の体液、特に血液、血清、血漿、胸水、腹水、尿等）を接触させ、自体公知の方法である E L I S A ( Enzyme- l i nked i mmunosorben t assay) feにて分析 i ることか好ましい。即ち、当該検出にはワンステツプ法とッ一ステツブ法があり、ワンステップアツセィでは各種 M Sまたは S F Εをゥエル等に固定化した面相と検体および酵素標識抗体とを同時に反応させ、一定時間後反応しなかった標識抗体を洗浄により除去し、面相の酵素活性を測定することによつて当該検体中に含まれる抗体を、 M Sまたは S F Eに応じて同定することによって行われる。

また、ツーステップ法は、まず抗原固定化物と検体とを反応させ、一定時間後に未反応の検体中の抗体を洗浄により除去し、次に酵素標識抗抗体を反応させ、一定時間後に洗浄により未反応の標識抗体を除去し、固相の酵素活性を測定することによつて当該検体中に舍まれる抗体を、 M Sまたは S F Eに応じて同定することによって行われる。より詳細な同定、即ち、抗酸菌種の同定を行なうに際しては、各サブクラス毎に分離した M S をゥエルに固定する。

固定方法は本発明の目的を達成しうる限り特に制限されるものではない。たとえば、へキサン、イソプロノ^ノール、ェタノ —ル等の有機溶媒に M Sまたは S F Eを溶解し、これをマイク口プレート等のゥエル中に加注して固定させる。およそ 2〜 4 8時間で固定される。固定後適当な溶媒でゥ · ルを洗浄し、さらにブロッキングしておくことが好ましい。

ゥヱル中の M Sまたは S F Εと検体中の抗体との反応は該反応が容易に進行する状態（たとえば温度 2 0〜 4 0 て、湿度 70 〜100 %の湿潤箱内）で反応が完結するまで約 3 0分〜 2時間反応させる。反応終了後、ゥュル中の未反応物を除去するか、除ますることなく抗抗体を加え、反応が容易に進行する状態 (たとえば、温度 2 0〜 4 0 て、湿度 70〜 1 0 0 %の湿潤箱内）で反応が完結するまで約 1 0分〜 2時間反応させる。反応残查を除去し、さらにへキサン、イソプロパノール等の有機溶媒、リン酸緩衝液等でゥエルを洗浄する。

抗抗体は、前記 1次抗体に対する抗抗体であり、動物（動物の種類は特に限定されず、たとえば、ャギ、ゥマ、ヒッジ、ゥシなどの動物が例示される）で作成した抗抗体である。尚、各サブクラスのミコール酸、ミコ一ル酸塩またはミコ一ル酸ェステルを用いて菌種の同定を行なう場合は、主に I g M ( I g G を舍んでいてもよい）に対する抗抗体を、ミコール酸以外の炭素数が 1 4以上の脂肪酸と糖類（単糖類または二糖類）とのェステルを用いて菌の属の同定を行なう場合は、 I g M + I g G に対する抗抗体を用いるのが好ましい。本発明では標識を結合させた抗抗体が使用される。ここで、標識としては免疫学的測定において通常使用されている物質を使用すればよく、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物質等が例示される。たとえば、酵素としてはパーォキシダーゼ、 β — Ό 一力' ラクトシダ一ゼ、アルカリホスファターゼが、放射性物質としてヨウ素、重水素が、発光物質としてはァクリジゥム塩等が、蛍光物質としてはフルォレセィンイソチオシァネートが挙げられる。

標識を結合させた抗抗体の製造に際しては、自体既知の方法を採用すれば十分である。

次いで反応に関与した抗抗体を測定する。測定方法としては抗抗体に結合させた標識として、たとえばパーォキシダーゼを結合させた場合、 0-フユ二レンジアミンと過酸化水素とを作用させて発色させ、主波長 4 9 2 n m、副波長 6 9 0 n mの波長にて吸光度（ 0 D ) を測定することができる。

尚、測定結果は、コントロールである健常人の平均 0 Dと検体の 0 Dとの吸光度の差（ O D D ) として算出することが望ましく、 0 D Dが 0. 1 0 0以上である場合には、抗酸菌より産出された抗体が検体中に有意に存在することを示し、従って、検体が採取された被験者（ヒト以外の動物をも包含する）が、抗酸菌（結核菌またはその類縁抗酸菌）に感染していると判断することができる。

検体としては、ヒトを舍む動物の体液であり、ヒト以外の動物では、たとえばゥマ、ブタ、ニヮトリ等の哺乳類および鳥類等が挙げられる。体液としては、たとえば、血清、血漿、髄液、唾液、胸水、腹水、尿等が使用される。本発明において、検体は常法に準じて調製すればよく、たとえば、血清中の抗体を測定するに際しては、血清を 4 0 〜 6 4 0倍、特に 1 6 0倍に希釈して使用することが好ましい。

本発明の抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬、当該試薬を使用する抗酸菌抗原対応抗体検出法、当該検出法による抗酸菌感染症の診断法は従来の試薬および方法に比較してその操作が簡単で、その特異性が極めて高い。

特に、本発明の試薬によれば、抗酸菌感染症患者の体液を直接検体として使用して、 E L I S A法により測定を行なうので、極めて迅速に抗体検出、菌の同定および感染症の診断を行うことができる。

さらに、本発明で使用される試薬（ M Sおよび S F E ) は合成によっても製造することができるので、工業的に多量の試薬を容易に供給することが出来る。

また、本発明の試薬および方法はその感度が高く、血清中に微量に存在する抗体をも測定することが可能である。

従って、本発明の試薬および方法によって、簡便に、且つ速やかに抗酸菌抗原対応抗体を検出し、ひいては抗酸菌の属（マィコバクテリゥム、ノカルジァおよび口ドコッカス属を舍む）の同定が行なえる。特に、各サブクラスのミコール酸、ミコール酸塩またはミコール酸ヱステル（M S ) を抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬として用いれば、抗酸菌種の同定が行えるから、 -いかなる抗酸菌に感染しているかの診断が可能であり、当該疾病に対する治療薬剤の選択が速やかに行い得るという効果を有する。

「図面の簡単な説明」

第 1図はノカルジァ · ルブラ ' ocdY ia ru&r 由来（ N r —）のトレハロ一スージミコレート（ T D M ) 、グルコース一モノミコレート（ GM) 、マンノース一モノミコレート（MM) に対する抗体の E L I S A法による検出を示すグラフ、第 2図は N r — T D Mに対する抗体の E L I S A法による検出を示すグラフ、第 3図はマウス免疫方法による N r — T D Mに対する抗体価の違いを示すグラフ、第 4図は N r の菌体および菌体からミコ一ル酸を除去したものを抗原として用いた場合の反応を示すグラフ、第 5図はミコール酸メチルエステルの抗原性を示すグラフ、第 6図は種々の T D Mおよびミコール酸メチルエステルを抗原として用いた場合の反応性を示すグラフ、第 7図はトレハロース一 6 , 6， -ジパルミテート（ T D P ) を抗原とした場合の抗体の E L I S A法による検出を示すグラフである。

「発明を実施するための最良の形態」 .

次に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

、実施例 1〜 1 0 に関しては、下記の E L I S A法により測定を行ない、実施例 1〜 6に関しては、血清の希釈倍率を 5、 1 0、 2 0、 4 0、 8 0倍とし、その結果を各図に示した。 P TJP89/01341

1 9

( E L I S Aによる方法）

9 6穴マイクロプレ一トに抗原のエタノールまたはィソプロパノール溶液 5 0 // /wel lを分注し、一晩放置して蒸発乾固し、抗原を吸着させる。

ここに 0. 5 %Tween20 添加リン酸緩衝生理食塩水（pH 7. 4 ) 〔 P B S — Tと略す〕 1 0 0 £ /wel lを入れ、室温で 10分間放置するか、もしくは 5 %牛血清アルブミン加 P B S — T 100 H ZweHを入れ、室温で 2時間放置する。

P B S — Tまたは 5 %牛血清アルブミン加 P B S — Tを吸引除去した後、抗体（血清の段階希釈液）、 5 0 μ /wel lを分注し、室温で 1時間放置する。

P B S — Tで 3回洗浄後、パーォキシダーゼ標識抗マウス I g ( G + M ) 5 0 ^ g /wel lを添加し、室温で 1時間放置する _c

P B S — Tで 3回洗浄し、 0 -フエ二レンジアミンおよび過酸化水素水加クェン酸緩衝液（PH4. 9 ) 50 A' £ /wel lを分注後、 6 - H C £ 5 0 £ /wellを分注し、 4 9 2 n mの吸光度をマイク口プレートリーダーで測定する。

実施例 1

N r — T D M、 G M、 M Mに対する抗体の E L I S A法による抗原一ノカゾレジァ · レフ"ラ (Noccrrdia rubr 由来（ N r — と赂す）のトレハロース一ジミコレート（ T D Mと略す）、グルコース一モノミコレート（ G Mと略す）、マンノース一モノミコレート（ M Mと略す）を、それぞれ 2 0 0 μ g / /^のエタノール溶液に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 0 / g /50 U £ Zwellずつ分注し、ー晚放置して蒸発乾固させ吸着させた。尚、本検出結果を示す第 1図において、それぞれ T D M、 GM、 - MMと表示する。

抗体一 I C R系マウスに N r由来（N r —） T D M、 GM、 M Mを 3.2 %フロインド不完全アジュバントを舍有する水中油中水型ェマルジヨン（ w 0 / wェマルジヨンと略す）の形態で 3 (^ ノマゥスずっ隔日に丄 0回尾静脈内（ i . v . と略す）投与した後、最終投与日の 2 日後に採血して得た血清を P B S— Tで 5倍希釈した後、 5 6 °C 3 0分間処理し、血清中の補体を不活化した（非働化と略す）ものを原液として用いる。これを P B S— Tで段階希釈して用いた。尚、本検出結果を示す第 1図においてそれぞれの血清を T D M、 GM、 MMと表示する。

(結果）

第 1図に示す通りである。即ち、 . ·

I . M G L (ミコ一ル酸舍有糖脂質） 3 0 g X l O回 i . v . 投与マウス血清中に、 M G Lを抗原として認識する抗体が検出された。

2 , T D M投与マウス血清が T D M、 GM、 MMのいずれに対しても高い抗体価を示した。

実施例 2

(目的）

1. 抗原としてプレートに吸着させた N r — T D Mによるマウス血清中グロプリンの非特異的な吸着の有無を検討するために、 wZ o Zwコントロール群（後述）の血清を抗体として用いた。 2. 抗原糖脂質とマウス血清中免疫グロブリンとの反応が、非特異的な脂質に対するものであるか否かを検討するために、抗原として卵黄フォスファチジルコリン（ P C ) を用いた。

3. 抗原を吸着させたプレートに対する 5 %牛血清アルブミン ( B S A ) によるブロック操作の効果を検討した。

抗原 N r — T D Mまたは P Cを 2 0 Q /j g /idのェタノ一ル溶液に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 0 / g / 5 0 u ずつ分注し、一晩放置して蒸発乾固させ吸着させた。本検出結果を示す第 2図においてそれぞれ T D M、 P Cと表示する。

抗体 ① I C R系マウスに N r — T D M 3 0 / g X l 0回投与後の血清の 5倍希釈液（実施例 1 と同じ）

② I C R系マウスに、糖脂質を舍まない w/o/wェマルジョンを

0. 2 マウスずつ 1 0画隔日に投与した後、採血して得た血清を P B S - Tで 5倍希釈し、非働化したもの。本検出結果を示す第 2図においてそれぞれ T D M、 w/ o Zwコントロールと表示する。

(結果）

第 2図に示す通りである。即ち、

1 . 抗原（ T D Mおよび P C ) と w/ o /wコントロール群の血清とは殆ど反応せず、非特異的吸着でないことが確認された。

2. 抗原 P Cと T D M群の抗体は反応せず、非特異的脂質との反応でないことが確認された。 '

3. 5 % B S Aによるブロック操作は、特に効果がなかつた。実施例 3 マゥス免疫方法による N r — T D Mに対する抗体価の違いの検抗原 N r — T D Mをェタノールで 2 0 0 g

に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 O ^ gノ 5 O ^ ^ Zweliずつ分注し、吸着させた。

抗体 ① I C R系マウスに N r — T D M 3 0 ;t g X l 0回投与後の血清の 5倍希釈液（実施例 1 と同じ) 。

② I C R系マウスに N r — T D M 3 0 0 / g X 1回投与後、 1、 4、 7および 1 4 日目に経時的に採血して得た血清の 5倍希釈液。

③ I C R系マウスに糖脂質を舍まない w/ o /wェマルジョンを 0.2 i . v . 投与後 1 日目の血清の 5倍希釈液。

(結果)

第 3図に示す通りである。即ち、

1. N r— T D M 3 0 0 〃 g X 1画投与では、 1〜 14日目まで、 4 9 2 n mの吸光度は w_ o /wコントロール群と同じで、抗体は検出されなかった。

2. マウス血清を加えなかつたゥエルでの蛍光の発色はほとんど見られず、 N r — T D Mによる 2次抗体〔パーォキシダーゼ標識抗マウス I g ( G + M) 〕の非特異的吸着はないと確かめられた。

実施例 4

rの菌体およびこの菌体からミコール酸を除去したものを抗原として用いた場合の反応の検討：

抗原 —— ① N r菌体 ② N r の菌体にクロ口ホルム . メタノール 2対 1 ( v / v ) 混液を加えて超音波処理をして、非結合性脂質（ extractable lipid)を除去した後、酸加水分解（注 1 ) して、結合性脂質（ bound lipid. BL)をも除いたもの。

①、 ②共に、 5 2 5 n mの吸光度が 0.4 3になるようにホウ酸緩衝液に懸濁させたものを原液とし、その 1ノ 1、 1 / . 1 / 2 5希釈液を 5 0 /wellずつ分注し、一晩放置してプレ一トに吸着させた後、上清を吸引除ました。

抗体 ① N r — T D M 3 0 g X l 0回投与 I C Rマウス血清（実施例 1 と同じ）

② wZ o /wコントロール 0. 2 X 1 0回投与 I C Rマウス血清（実施例 2 と同じ）

(結果）

第 4図に示す通りである。即ち、

1. N r菌体は抗体と反応した。

2. N r菌体より、脂質（ミコール酸）を除去することにより、抗体との反応性は減少した。

(注 1 ) ：酸加水分解：菌液の約 1 / 3量の 6 N— H C を加え、 9 0 てで一晩加熱後、 n-へキサンで脂質を抽出した後の水層を抗原として用いた。

実施例 5

ミコール酸低級アルキルエステルの抗原性の検討：

抗原 ① N r — T D M

② N r — T D Mを加水分解し、メチル化して得たミコ一ル酸メチルエステル ①、 ②共 2 0 0 g エタノール溶液とし、 1 0 g Z 50 u ί /we 11ずつ 9 6穴プレートに分注し、吸着させた。

-抗体 ① N r — T D M 3 0 μ g 1 0回投与マウス血清

(実施例 1 と同じ）。

② wZ o wコントロール 0. 2 X 1 0画投与マウス血清（実施例 2 と同じ）。

(結果）

第 5図に示す通りである。即ち、

ミコール酸低級アルキルエステルも T D Mと同様の抗原性をレ 7こ。

実施例 6

抗原 ① N r — T D M

②マイコノ Xクテリウム ' ィントラセルラーレ

( . intY cellul re ) 〔 M. int.と略す〕 - T D M

③マイコノクテリゥム ' カンサシィ（ M. kdnsns ii ) Γ M.kan. と略す〕一 T D M

④ N r由来ミコール酸のメチルエステル

⑤ M. int.由来 or— ミコール酸（ M のメチルエステル

⑥ M. int.由来ケト一ミコール酸（ M _z)のメチルエステル

⑦ M. int.由来ジカルボキシーミコール酸（ M ₃)のメチルェステゾレ

いずれも 2 0 0 ；£/ g のエタノール溶液に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 0 fi g / 5 0 £ /wellずつ分注し、一晩放置して蒸発乾固させ吸着させた。

筒、本検出結果を示す第 6図において、それぞれの抗原を〜⑦で表示する。

抗体 N r — T D M 3 0 u g X 1 0画投与マウス血清（実施例 1 と同じ）。

(参考）

1 . N r由来のミコール酸はすべて o — ミコール酸であり、その総炭素鎖長は C ₃₆— ₄₈ (平均 4 4 ) であり、 o位に C ,。― , ₄ の比較的短い側鎖を有する。

2. M . i n t .は 3種類のミコール酸をもち、それぞれの炭素鎖長の平均は以下の通りである。

M 1 — ミコール酸 8 0

M z ケトーミコール酸 C 8 5

M 3 ジカルボキシ一ミコール酸 6 9

3 . M. kan.は 3種類のミコール酸をもつが、その大部分が α ーミコール酸である。平均炭素鎖長は以下の通りである。

o — ミコール酸 C so メトキシーミコール酸 C 7 8 ケトーミコ一ル酸 C 8 3

(結果）

第 6図に示す通りである。即ち、

1. N r — T D Mに対する抗体は、 N r — T D M N r由来ミコール酸（ o — ミコール酸）のメチルエステル、 M. kan. - T D M ( ミコール酸の大部分が or— ミコール酸）および M . int. 由来 or— ミコール酸（ M ,)メチルエステルとは反応する力く、 M i n t .由来ケト一ミコール酸（ M ₂)メチルエステルおよびジカルボキシ一ミコ一ル酸（ M ₃)メチルエステルとは反応しない。 2. M. kan.と M. i n t .由来のミコ一ル酸メチルエステルは、炭素鎮長はほぼ同じだが、そのサブクラスの割合が異なる。3. 以上のことより、 N r — T D Mにより免疫されたマウスの抗血清は、 N r由来一ミコ一ル酸エステルに特異性が高いと考えられる。

実施例 7

実施例 4および 5 の方法に準じて、 N r — T D Mを酸加水分解し、ビニルエステルとフヱニルエステルをそれぞれ調製し、これらを抗原とした。

抗原 ① N r由来ミコール酸のビュルエステル

② N r由来ミコ一ル酸のフユニルエステル

③ α—ミコール酸（合成品）

④ ーミコ一ル酸メチルエステル（合成品）

いずれも 2 0 0 g / のェタノール溶液に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 0 f g Z S Q u i /wellずつ分注し、一晩放置して蒸発乾固させ吸着させた。

抗体 N r — T D M 3 0 β g I 0回投与マウス血清（実施例 1 と同じ）。

(結果）

1. N r - T D Mに対する抗体は、 N r由来のミコール酸（ α 一ミコール酸）ビュルエステルおよびフエニルエステルと反応し、有機合成により調製された or—ミコール酸およびそのメチルエステルとも反応する。

2. 以上のことより、 N r — T D Mにより免疫されたマウスの抗血清は、 N r由来のみならず合成品のーミコール酸およびそのエステルにも特異性が高いと考えられる。

実施例 8

• 実施例 4の方法に準じて、 M. int.— T D Mを酸加水分解し、 M_z および M ₃ をそれぞれ単離精製した。 M ₂ のグルコースェステルと M₃ のァラビノースエステルをそれぞれ調製し、これらを抗原とした。

抗原 ① M . i n t .由来ケト ― ミコール酸（ M ₂)のダルコ一スエステル

② M . in t.由来ジカルボキシーミコール酸（ M ₃)のァラビノースエステル

③ N r - T D M

④ M. kan. -T D M

いずれも 2 0 0 μ gZMのエタノール溶液に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 0 u g / 5 0 u /weUずつ分注し、一晚放置して蒸発乾固させ吸着させた。

抗体 M. int. - T D M 3 0 μ g X 1 0回投与マウス血清

(実施例 1 と同様にして調製した）。

(結果）

1. M. int.— T D Mに対する抗体は、 M_z のグルコースエステルおよび M ₃ のァラビノースエステルとは反応する力く、 N r — T DMおよび M, kan.— T DMとの反応性は低い。

2. 以上のことより、 M. int.— T D Mにより免疫されたマウスの抗血清は、ケト ― ミコール酸エステルおよびジカルボキシ一ミコール酸エステルに特異性が高く、反応応答性は糖類ではなく脂肪酸（ケトー、ジカルボキシーミコール酸）に依存すると考えられる。

実施例 9

抗原 —— ① トレハロースー 6 ,6' -ジパルミテート（ T D Pと略す）

②へキサン（Control )

③ステアリン酸メチル（比較）

それぞれの抗原を 2 0 0 u のエタノール溶液に調製し、 9 6穴マイクロプレートに 1 0 g / 5 0 μ H /wellずつ分注し、一晩放置して蒸発乾固させ吸着させた。尚、本検岀結果を示す第 7図において、それぞれ T D P、 Control 、 Stearateと表示する。

抗体一排菌陽性の結核菌感染症患者より採血して得た血清を P B S—丁で 5倍希釈した後、非徽化（ 5 6て 3 0分間加熱処理）したものを原液として用いる。これを P B S— Tで段階希釈して用いた。

(結果）

第 7図に示す通りである。即ち、

1. 結核菌感染症患者の血清は T F Eを抗原として特異的に認識した。

2. 結核菌感染症患者の血清は T F Eに対しても高い抗体価を示した。

尚、健常人から採血して得た血清を用いて、上記と同様にして E L I S A法による測定を行ったところ、発色はみられなかつた。

実施例 1 0 実施例 9 において、 T D Pを下記の化合物に変更した以外は実施例 9 と同様に実施した。

. ① わ erci^osis由来の G M、 M M ( ミコール酸は or—、メトキシー、ケト ― ミコール酸）

② M. int.由来 α— ミコール酸（ Μ ,)またはケト — ミコール酸（ Μ ₂ )のメチル、ビニルまたはフエニルエステル

③ M. kan.由来の T D M、 G M、 MM ( ミコール酸は o — ミコール酸、メトキシーミコール酸またはケトーミコール酸）

④ 6- 0-パルミトイルーグルコース（モノエステルの合成品）

⑤ 6-0-パルミトイルーマンノース（モノエステルの合成品）

⑥ 6,6'— ジ -0—コリノミココイル一 or , 一トレノヽロース〔 T F E ( ジエステル）の合成品〕

⑦ 6,6'ージ -0— ノヽ。ルミトイノレ一 ff , or - トレノヽロース〔 T F E ( ジエステル）の合成品〕

⑧ 6,6'— ジ -0— ミコロイノレ一 or , 一トレハース〔,T F E ( ジエステル）の合成

⑨ 2,6'— ジ- 0— ォレオイル一 , a— ドレハロース〔 T F E (ジエステル）の合成品〕

⑩ 6 0— コリノミコロイノレ- 2- 0 ^ ンタデカノィルーな，一トレハロース〔 T F E (ジエステル）の合成品〕

⑪ 2-0-ィコサノィル- 6' -0 - (3- ヒドロキシ- 2-n—ォクタデカ二ルーテトラコサノィノレ）一，一トレノヽロース〔 T F E ( ジエステル）の合成品〕

⑬ 2-0-ペンタデカノィル -3-0—ォクタデカノィル -6'-0- (3— ヒドロキシ -2— η—テトラデカニルードコサノィル） - a , - トレハロース [； T F E ( トリエステル）の合成品〕

⑭ 2, 3-ジ -0—エイコサノィル -6' -0- (3- ヒドロキシ- 2 - n—ォクタデカニルーテトラコサノィル） - or, α— トレハロ一ス〔Τ F E ( トリエステル）の合成品〕

(結果）

結核菌感染症患者の血清は T F Εのみならず、ミコール酸以外の脂肪酸類と単糖類または二糖類とのエステルおよびミコール酸類のエステルについても抗原として特異的に認識した。実施例 1 1

抗酸菌感染症患者と健常人とを検体としたマイコバクテリウム属の面定法および抗酸菌感染診新法

(菌体からの糖脂質の調製）

人型結核菌（M. iui?erciilosis)H37Rv. の菌株がコードファクター抗原の原料として使用された。

(コードファクター抗原の単離と精製）

菌株をクロ πホルム一メタノール混液（ 2 ： 1 , V / V ) 中に懸濁させ、超音波処理によって粉砕した。クロ口ホルム層の抽出物は蒸発乾固させ、少量のクロロホルムーメタノ一ル混液 ( 2 ： 1 , V / V ) に溶解させる。これらの抽出物は、クロ口ホルム一メタノール一アセトン一酢酸（ 9 0 ： 1 0 ： 6 ： 1 , V / V ) を溶媒としてシリ力ゲルの T L Cで数本のバンドにわ .かれるので、トレハロース- 6, 6' -ジミコレート（ T D M ) を確認し、クロ口ホルム一メタノール混液（ 2 ： 1 , V / V ) で薄層クロマトグラフィー（ T L C ) から回収した。

(検体）

抗酸菌に感染した 5 0人の患者と 5 5人の健常人の血清が検体とされた。 - 健常人： 1人はッベルクリン皮膚反応陰性で、その他はすべて陽性であった。

患者：すべての患者は採血時に塗布標本と培養の両方の方法により、細菌学的に抗酸菌排菌陽性であることが確かめられた。 5 0人の患者はナイァシンテストにより 4 5名が人型結核菌 (肺結核）感染症患者、残りの 5人は非定型抗酸菌（ Atypical Mycobacteria) 感染症患者と診断された。すべての患者は肺の病気を持っている。その 1人は胸膜炎を伴った複雑なもの、 7 人は糖尿病を伴っている。患者の年令幅は 2 0〜 8 0才である。血液は 4 6例は特別な化学療法後、 4例は処置前に集められた。

また、別に抗酸菌に感染していない片肺がガン（腺ガン）の患者の血清もテス卜された。

( E L I S A法による測定）

E L I S Aテストはポリスチレン · マイクロタイター ' プレート（ファルコン 3915 ,べクトン ' ディクソン社製）上で行なわれた。精製されたコードファクター（ T D M ) 抗原は、 0. 1 mg/ の濃度で n -へキサンに溶解させ、このサンプルの 50 £ は、それぞれのゥェルに使用された（ T D M 5 g /wel 1 ) 。プレートを室温で乾燥させた後に、 P B S— Tを舍む免疫阻止溶液 150 £をそれぞれのゥュルに加え、 1時間室温の定温器で放置した後、吸引除去した。 1 : 160 で希釈された血清の 50 g /wellが加えられ 1時間放置された。パーォキシダ一ゼ —標識ャギ抗ヒト I _g G ( P B S— T中 1 : 500 に希釈したもの）は、第 2 の抗体（抗抗体）として使われた。定温器でもう 1時間放置した後、 0. I M—クェン酸、 0.2 M— N a zH P Oa ： 1 2 H₂0、 0.0 4 %過酸化水素水を舍む溶液中に 0-フユ二レンジアミン 1 mgZ を舍むように希釈した基質溶液を加えた。反応ば 6 N— H C £を加えて停止させ、 4 9 2 — 6 3 0 n m の吸光度をマイク口プレ一トリーダ一で測定した。それぞれの定温器は室温に維持され、それぞれの反応の進行の段階でプレートは、 P B S— Tで 3面洗浄された。

実験結果ば 0 D Dにより評価した。

(結果）

健常人：平均◦ Dは 0.0 9 9であり、この平均 0 Dに基づいて 0 D Dを箕出した。健常人の 0 Dの幅は 0, 0 9 6〜 0. 1 0 2 であり、陽性と判断された者はいなかった。

患者： 50人の抗酸菌感染症患者のうち陽性（◦ D Dが 0.100 以上）と判断されたのは、 4 8人（ 4 5名の結核菌感染症患者のうち 4 3名と 5名の非定型抗酸菌感染症患者の全て）であつた（感度 9 6 %) 。 '

尚、肺結核患者の平均 O D Dは 1.2 7 3、ナイァシンテスト陰性の非定型抗酸菌感染症患者の平均 0 D Dは 1.356 であつた。抗酸菌に感染していない片肺がガンの患者は、 0 D Dが 0.009 であり、陰性と判断された。

. 5 5名の健常人の中で陽性（ひ D Dが 0. 1 0 0以上）と判断された者はいなかつた。

以上より、人型結核菌由来のコードファクター（ T D M ) と反応する抗体は抗酸菌排菌陽性患者の血清において生じ、健常人からは検出されなかつたことを示す（特異性 1 0 0 %) 。実施例 1 2

実施例 1 1 において使用したコードファクター（ T D M ) を M.kan. M. int.. N r由来のコードファクターまたはトレハロース - 6,6' -ジコリノミコレート（合成品）と変更し、実施例 1 1 において陽性と判断された肺結核患者 2 9名の血清を用いて、実施例 1 1 と同様の操作を行なつたところ、 4種全ての抗原について全て陽性と判断された。

実施例 1 3

実施例 1 2 に記載の菌体から得られるトレハロース一 6 —モノミコレートを用いて、実施例 1 2 と同様の操作を行なったところ、全て陽性と判断された。

実施例 1 4

実施例 1 1 において陽性と判断された肺結核患者 2 9名の血情の希釈率を 1280倍に変更して、実施例 1 2 と.同様の操作を行なったところ、全て陽性と判断された。

本発明を上述の明細書およびそれに舍まれる実施例により適切かつ十分に説明したが、それらは本発明の精神および範囲を逸脱することなく、変更または修飾することができる。

Claims

請求の範囲

1. ミコール酸、ミコール酸塩、ミコール酸エステルおよびミコール酸を除く炭素数が 1 4以上の脂肪酸と単糖類または二糖類とのエステルから選ばれる少なくとも一種の化合物よりなる抗酸菌抗原対応抗体検出用試薬。

2. エステルが低級アルキルエステルである請求の範囲第 1 項記載の試薬。

3. エステル力トレハロースまたはグルコースとのエステルである請求項の範囲第 1項記載の試薬。

4. エステルが、トレハロースの 2, 2，， 3, 3' , 6，6'位のうちから選ばれる位置の 1 〜 4置換体である請求の範囲第 1項記載の

5. エステルが、 6 , 6 ^: —ジ- 0—ノヽレミトイルー or , 一トレノヽロース、 6, 6'ージ- 0— ミコロイルー or, — トレノヽロース、 2,6'—ジ -0—ォレオイル一 or, a - トレハロース、 6，- 0—コリノミコ口イスレ- 2- 0 ？ンタデカノィノレ一 or, - トレノヽ口一ス .

2-0-ィコサノィル -6'-0- (3- ヒドロキシ -2- —ォクタデカニル —テトラコサノィル）一，一トレノヽロース、 2-0- (9ーォクタデセノィル） -6' -0- (3-ヒドロキシ- 2—テトラデカニル一 11— ィコセノィル） - ， — トレノ、ロース、 2-0-ぺンタデカノィ）レ -3-0—ォクタデカノィル- -0- (3-ヒドロキシ- 2— η—テトラデ力ニル一ドコサノィノレ）- α , - トレノヽロース、 2 , 3-ジ- 0ーェィコサノィル— -0- (3- ヒドロキシ -2- n—ォクタデカニルーテトラコサノィル） - or, a - トレハロース、 2, 3-ジ -0- (9-ォクタデセノィル）- -0- (3-ヒドロキシ -2—テトラデカニルー 11ーィコセノィル）一び， α — トレハロースカ、らなる群より選ばれる少なくとも一種のェステルである請求の範囲第 1 項記載の試薬。

6 . 請求の範囲第 1 〜 5項記載の試薬を用いて、 E L I S A 法により検体中の抗酸菌抗原対応抗体を測定することを特徴とする抗酸菌抗原対応抗体検出法。

7 . 検体中の抗酸菌抗原対応抗体が結核またはその類縁抗酸菌感染症患者の体液に含まれる抗体であることを特徴とする請求の範囲第 6項記載の抗酸菌抗原対応抗体検出法。

8 . 請求の範囲第 6 または 7 項記載の抗酸菌抗原対応抗体検出法により、健常人と被験者との検体における吸光度の差を測定することを特徴とする被験者の抗酸菌感染症診断法。