JP2874504B2 - ヘリコバクター ピロリの検出方法 - Google Patents
ヘリコバクター ピロリの検出方法Info
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- JP2874504B2 JP2874504B2 JP3666193A JP3666193A JP2874504B2 JP 2874504 B2 JP2874504 B2 JP 2874504B2 JP 3666193 A JP3666193 A JP 3666193A JP 3666193 A JP3666193 A JP 3666193A JP 2874504 B2 JP2874504 B2 JP 2874504B2
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- helicobacter pylori
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物の検出方法に関
し、更に詳しくはヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；以下、Ｈｐと称するこ
とがある。）の検出方法に関する。
し、更に詳しくはヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；以下、Ｈｐと称するこ
とがある。）の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｈｐは、ヒト活動性慢性胃炎の粘膜から
高率に検出され、猿胃内に接種されると定着してヒト類
似の活動性胃炎を発生することなどから、胃病変に密接
に関連することが知られている。近年は、この細菌が胃
癌発生に関する幾つかの因子の一つにも挙げられている
［Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，第８４
巻，第７７５〜７８１（１９８９年），Ｃａｎｃｅｒ，
第６６巻，第２５６９〜２５７４（１９９０年）な
ど］。
高率に検出され、猿胃内に接種されると定着してヒト類
似の活動性胃炎を発生することなどから、胃病変に密接
に関連することが知られている。近年は、この細菌が胃
癌発生に関する幾つかの因子の一つにも挙げられている
［Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，第８４
巻，第７７５〜７８１（１９８９年），Ｃａｎｃｅｒ，
第６６巻，第２５６９〜２５７４（１９９０年）な
ど］。
【０００３】従来、Ｈｐの同定は、胃粘膜より採取した
組織を培養し、これをＷａｒｔｈｉｕｍ Ｓｔａｒｒｙ
の銀染料、ギムザ、ヘマトキシリン、エオシンあるいは
アクリジンオレンジのいずれかにて染色ののち、顕微鏡
検査によって確認される。また、Ｈｐは大量のウレアー
ゼを産生するため、ウレアーゼの存在を探知することに
よってＨｐを検出する方法が検討されている。さらに、
胃炎、胃・十二指腸潰瘍、胃癌などの胃疾患、就中胃癌
患者で疫学的にＨｐの感染を明らかにするには、血清学
的に抗体の存在を証明する方法が採用されている。
組織を培養し、これをＷａｒｔｈｉｕｍ Ｓｔａｒｒｙ
の銀染料、ギムザ、ヘマトキシリン、エオシンあるいは
アクリジンオレンジのいずれかにて染色ののち、顕微鏡
検査によって確認される。また、Ｈｐは大量のウレアー
ゼを産生するため、ウレアーゼの存在を探知することに
よってＨｐを検出する方法が検討されている。さらに、
胃炎、胃・十二指腸潰瘍、胃癌などの胃疾患、就中胃癌
患者で疫学的にＨｐの感染を明らかにするには、血清学
的に抗体の存在を証明する方法が採用されている。
【０００４】しかしながら、直接染色法、ウレアーゼ活
性法はいずれも長時間を要し、かつ満足できる感度及び
特異性はいまだ示されていない。抗体の存在を証明する
方法においても、Ｈｐの抗原性は極めて多用で、現在既
に開発されている欧米のキットを用いても充分な特異性
が得られず、数％の偽陰性と３０％近くの偽陽性が発現
する。
性法はいずれも長時間を要し、かつ満足できる感度及び
特異性はいまだ示されていない。抗体の存在を証明する
方法においても、Ｈｐの抗原性は極めて多用で、現在既
に開発されている欧米のキットを用いても充分な特異性
が得られず、数％の偽陰性と３０％近くの偽陽性が発現
する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特異
的かつ簡便にＨｐを検出する方法を提供することにあ
る。
的かつ簡便にＨｐを検出する方法を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的に
鑑みＨｐの産生物質について鋭意検討した結果、Ｈｐよ
り１１−メトキシ脂肪酸が産生されることを初めて見出
した。これまでメトキシ脂肪酸はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍのある種の細菌にのみ発見されていたが、Ｈｐの
場合のメトキシ基の位置はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
のそれとは異なるものであった。従って１１−メトキシ
脂肪酸の存在はＨｐ分類学上の特性を示している。
鑑みＨｐの産生物質について鋭意検討した結果、Ｈｐよ
り１１−メトキシ脂肪酸が産生されることを初めて見出
した。これまでメトキシ脂肪酸はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍのある種の細菌にのみ発見されていたが、Ｈｐの
場合のメトキシ基の位置はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
のそれとは異なるものであった。従って１１−メトキシ
脂肪酸の存在はＨｐ分類学上の特性を示している。
【０００７】本発明はかかる知見に基づいて完成された
ものであり、以下本発明を説明する。本発明は、ヘリコ
バクター ピロリを含有する試料を酸メタノリシスし、
式
ものであり、以下本発明を説明する。本発明は、ヘリコ
バクター ピロリを含有する試料を酸メタノリシスし、
式
【０００８】
【０００９】（式中、ｎは５または７である。）で表さ
れる１１−メトキシ脂肪酸メチルエステルを同定するこ
とからなるヘリコバクター ピロリの検出方法である。
以下、順を追って本発明を詳細に説明する。本発明にお
いて、ＨＰを含有する試料とは、高等動物の胃粘膜、胃
液などであり、これらは場合により培養される。培養
は、Ｈｐを増殖するものであればいずれの方法でもよ
い。たとえば、深見の方法［検査と技術，第１７巻，第
１３８９〜１３９４頁（１９８９年）］、ｂｒｕｃｅｌ
ｌａ寒天培地を用いる方法などがある。次いで、培養物
から、常法により、培養した細菌を集め、洗浄、遠心分
離して菌体を得ることができる。
れる１１−メトキシ脂肪酸メチルエステルを同定するこ
とからなるヘリコバクター ピロリの検出方法である。
以下、順を追って本発明を詳細に説明する。本発明にお
いて、ＨＰを含有する試料とは、高等動物の胃粘膜、胃
液などであり、これらは場合により培養される。培養
は、Ｈｐを増殖するものであればいずれの方法でもよ
い。たとえば、深見の方法［検査と技術，第１７巻，第
１３８９〜１３９４頁（１９８９年）］、ｂｒｕｃｅｌ
ｌａ寒天培地を用いる方法などがある。次いで、培養物
から、常法により、培養した細菌を集め、洗浄、遠心分
離して菌体を得ることができる。
【００１０】本発明において、酸メタノリシスする試料
は、その脂質成分を抽出したものを用いるのが好まし
い。脂質を抽出するためには、たとえば、胃液を適宜な
溶媒によって抽出する方法、前述の菌体をクロロホルム
−メタノールの混合溶媒を用いて室温に一晩放置するな
ど方法などによって行うことができるが、本発明はこれ
に限定されるものではない。抽出溶媒としては、上記以
外に塩化メチレン、酢酸エチル、エチルエーテル、テト
ラヒドロフラン、エタノールなどの脂質と反応しない溶
媒を単独または混合して用いることができる。抽出条件
は溶媒によっては加温することもあり、数分間〜数時間
行うこともある。
は、その脂質成分を抽出したものを用いるのが好まし
い。脂質を抽出するためには、たとえば、胃液を適宜な
溶媒によって抽出する方法、前述の菌体をクロロホルム
−メタノールの混合溶媒を用いて室温に一晩放置するな
ど方法などによって行うことができるが、本発明はこれ
に限定されるものではない。抽出溶媒としては、上記以
外に塩化メチレン、酢酸エチル、エチルエーテル、テト
ラヒドロフラン、エタノールなどの脂質と反応しない溶
媒を単独または混合して用いることができる。抽出条件
は溶媒によっては加温することもあり、数分間〜数時間
行うこともある。
【００１１】酸メタノリシスは、好ましくは５％無水メ
タノール−塩酸混合物を用い、６０〜１００℃で、１〜
４時間加熱または還流することによって行われる。酸メ
タノリシス後、通常の化学的手段と同様に、たとえばヘ
キサンなどの溶媒で抽出することによって脂肪酸メチル
エステルを含む粗生成物を得る。
タノール−塩酸混合物を用い、６０〜１００℃で、１〜
４時間加熱または還流することによって行われる。酸メ
タノリシス後、通常の化学的手段と同様に、たとえばヘ
キサンなどの溶媒で抽出することによって脂肪酸メチル
エステルを含む粗生成物を得る。
【００１２】なお、他のアルコールで酸アルコリシスす
ることが可能である。１１−メトキシ脂肪酸メチルエス
テルの同定には、たとえばガス液体クロマトグラフィー
（ＧＬＣ）、ガス・クロマトグラフィー質量分析（ＧＣ
−ＭＳ）、赤外線スペクトル、ＮＭＲなどの科学機器に
よる分析のほか、酵素法、化学反応分析法などが用いら
れるが、本発明はこれらの手段に限定されない。
ることが可能である。１１−メトキシ脂肪酸メチルエス
テルの同定には、たとえばガス液体クロマトグラフィー
（ＧＬＣ）、ガス・クロマトグラフィー質量分析（ＧＣ
−ＭＳ）、赤外線スペクトル、ＮＭＲなどの科学機器に
よる分析のほか、酵素法、化学反応分析法などが用いら
れるが、本発明はこれらの手段に限定されない。
【００１３】
【発明の効果】本発明により、従来法に比べ極めて特異
的かつ簡便にＨｐを検出する方法が提供された。
的かつ簡便にＨｐを検出する方法が提供された。
【００１４】
【実施例】以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００１５】実施例 Ｈｐの標準株（ＡＴＣＣ４３５０４）を１０％ＣＯ2，
１０％Ｏ2，８０％Ｎ2条件下、抗生物質を含まない１０
％馬血清添加ｂｒｕｃｅｌｌａ寒天培地中３７℃で５日
間培養した。培養した細菌を集め、生理食塩水で洗浄
し、１５分間遠心分離（９×１０3ｇ）して１．６ｇの
菌体を得た。
１０％Ｏ2，８０％Ｎ2条件下、抗生物質を含まない１０
％馬血清添加ｂｒｕｃｅｌｌａ寒天培地中３７℃で５日
間培養した。培養した細菌を集め、生理食塩水で洗浄
し、１５分間遠心分離（９×１０3ｇ）して１．６ｇの
菌体を得た。
【００１６】混合比（体積／体積）２：１，１：１，
１：２のクロロホルム−メタノール混合物各５０ｍｌを
用いて、前記菌体を室温にて一晩放置して脂質の抽出を
行った。各抽出液を合わせて、回転エバポレーター中で
蒸発乾固し、次いでこれを蒸留水１０ｍｌ中に懸濁し、
蒸留水に対して透析を行い、最終的に蒸発乾固物（粗脂
質）４０ｍｇを得た。このうち１ｍｇについて、５％無
水メタノール−塩酸混合物１ｍｌを用いて、１００℃で
３時間かけてメタノリシスを行った。反応液をヘキサン
１．５ｍｌを用いて抽出を３回行い、ヘキサン層を合わ
せ、窒素気流中で蒸発乾固した（検体１）。
１：２のクロロホルム−メタノール混合物各５０ｍｌを
用いて、前記菌体を室温にて一晩放置して脂質の抽出を
行った。各抽出液を合わせて、回転エバポレーター中で
蒸発乾固し、次いでこれを蒸留水１０ｍｌ中に懸濁し、
蒸留水に対して透析を行い、最終的に蒸発乾固物（粗脂
質）４０ｍｇを得た。このうち１ｍｇについて、５％無
水メタノール−塩酸混合物１ｍｌを用いて、１００℃で
３時間かけてメタノリシスを行った。反応液をヘキサン
１．５ｍｌを用いて抽出を３回行い、ヘキサン層を合わ
せ、窒素気流中で蒸発乾固した（検体１）。
【００１７】また、そのうち一部は、５：２：１（体積
比）のピリジン／ヘキサメチルジシラザン／トリメチル
クロロシランの混合物とともに６０℃で２０分間攪拌し
て、トリメチルシリル化を行った（検体２）。
比）のピリジン／ヘキサメチルジシラザン／トリメチル
クロロシランの混合物とともに６０℃で２０分間攪拌し
て、トリメチルシリル化を行った（検体２）。
【００１８】ＧＬＣおよびＧＣ−ＭＳによる同定；検体
１および検体２をヘキサンの０．１ｍｌに溶解し、ＤＢ
−１溶融シリカカラム（０．２５ｍｍ×２５ｍ，Ｊ＆Ｗ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．
Ｓ．Ａ．）にて１８０℃から２５０℃まで５℃／ｍｉｎ
で昇温させてＧＬＣ分析した。
１および検体２をヘキサンの０．１ｍｌに溶解し、ＤＢ
−１溶融シリカカラム（０．２５ｍｍ×２５ｍ，Ｊ＆Ｗ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．
Ｓ．Ａ．）にて１８０℃から２５０℃まで５℃／ｍｉｎ
で昇温させてＧＬＣ分析した。
【００１９】検体１の分析結果を図１に示した。図１に
よれば、構造不明のピークＡおよびＢが見いだされた。
本ピークはトリメチルシリル化した検体２においては、
変化が見られなかった。
よれば、構造不明のピークＡおよびＢが見いだされた。
本ピークはトリメチルシリル化した検体２においては、
変化が見られなかった。
【００２０】ピークはＡおよびＢについて、Ｓｈｉｍａ
ｚｕ ＱＰ−１０００（京都）質量分析計（Ｃａｒｒｉ
ｅｒ ｇａｓ：Ｎ2）によりＧＣ−ＭＳ分析を行った。
それぞれの結果を図２および図３に示した。ＡおよびＢ
のＧＣ−ＭＳ分析結果は、これらが典型的な１１−メト
キシ脂肪酸メチルエステルであることを示している。
ｚｕ ＱＰ−１０００（京都）質量分析計（Ｃａｒｒｉ
ｅｒ ｇａｓ：Ｎ2）によりＧＣ−ＭＳ分析を行った。
それぞれの結果を図２および図３に示した。ＡおよびＢ
のＧＣ−ＭＳ分析結果は、これらが典型的な１１−メト
キシ脂肪酸メチルエステルであることを示している。
【００２１】
【図１】検体１のＧＬＣ分析結果を示す。
【図２】ピークＡのＧＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図３】ピークＢのＧＣ−ＭＳ分析結果を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 ヘリコバクター ピロリを含有する試料
を酸メタノリシスし、式 （式中、ｎは５または７である。）で表される１１−メ
トキシ脂肪酸メチルエステルを同定することからなるヘ
リコバクター ピロリの検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3666193A JP2874504B2 (ja) | 1993-02-25 | 1993-02-25 | ヘリコバクター ピロリの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3666193A JP2874504B2 (ja) | 1993-02-25 | 1993-02-25 | ヘリコバクター ピロリの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245793A JPH06245793A (ja) | 1994-09-06 |
| JP2874504B2 true JP2874504B2 (ja) | 1999-03-24 |
Family
ID=12476048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3666193A Expired - Lifetime JP2874504B2 (ja) | 1993-02-25 | 1993-02-25 | ヘリコバクター ピロリの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2874504B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3042890B2 (ja) * | 1994-11-21 | 2000-05-22 | ファイザー製薬株式会社 | フタリド化合物及びその製法 |
-
1993
- 1993-02-25 JP JP3666193A patent/JP2874504B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06245793A (ja) | 1994-09-06 |
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