PT755517E - Metodo para detectar a presenca de uma especie de mycobacterium e estojo e anticorpos para utilizacao no mesmo - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Método para detectar a presença de uma espécie de Mycobacterium e estojo e anticorpos para utilização no mesmo"

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 presente invento refere-se a um método, baseado numa abordagem imunológica, para detectar a presença de uma espécie de Mycobacterium e a um estojo e anticorpos para utilização no mesmo.

As diversas espécies de Mycobacterium conhecidas causam diversas doenças infecciosas em humanos e animais. Uma destas espécies de Mycobacterium, a Mycobacterium tuberculosis, causa tuberculose em humanos. A tuberculose é considerada a principal doença transmissível na maior parte do mundo. Apesar dos grandes avanços na ciência médica e da existência de uma gama de drogas eficazes, o que durante algum tempo criou a ideia de que a doença estava controlada, e apesar dos esforços internacionais organizados, a tuberculose continua a ser um problema de saúde mundial de proporções alarmantes. Só no ano de 1990, foram descritos mais de 8 milhões de casos novos em todo o mundo e mais de 3 milhões de mortes (Snider, 1994) . As previsões realizadas pela Organização Mundial de Saúde indicam que no ano 2 000, os números anuais irão crescer para 10,2 milhões de casos novos e 3,5 milhões de mortes, sendo a Ásia e a África Sub-Sahara os continentes mais afectados (Dolin, Raviglione and Koch, 1994). A distribuição global do número de casos de tuberculose estimados para a década actual e o número de mortes estimado para o mesmo período é apresentado nas figuras 1 e 2, respectivamente (Dolin, Raviglione and Koch, 1994) 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 2

Fig.l Distribuição no globo do número cumulativo de casos de tuberculose, estimado em 1990-1999. (Segue Fig. 2) 3 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ

Fig. 2 Distribuição no globo do número cumulativo de mortes causadas por tuberculose, estimado em 1990-1999 A forte associação documentada entre a tuberculose e a SIDA, bem como a presença frequentemente concomitante de ambas as doenças, agravam a situação (Torres et al. , 1990; De Cock, 1994; Cantwell and Binkin, 1994; Murray, 1994). O aparecimento de resistência a múltiplas drogas entre as estirpes de Mucobacterium tuberculosis e outras micobactérias atípicas tem agravado a dimensão deste problema gigantesco (Blumberg, Miller e Koornhof, 1994; Morse, 1994). A detecção precisa e atempada da tuberculose e outras doenças por micobactérias relacionadas, é um dos requisitos essenciais ao desenvolvimento de uma estratégia global de maior sucesso, para o combate a estas doenças.

Os métodos de detecção laboratoriais tradicionais têm as grandes desvantagens, de ou não serem capazes de distinguir entre os bacilos vivos e mortos (a coloração rápida e simples

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 4 de Ziehl-Neelsen) ou, se estes métodos confirmam a presença de bacilos vivos (cultura directa), são necessárias várias semanas até os testes laboratoriais estarem completos. Isto, por sua vez, atrasa o início do tratamento e poderá conduzir a uma nova disseminação da doença.

As abordagens mais recentes baseiam-se na detecção da resposta dos pacientes à infecção, por métodos como testes' serológicos, respostas de proliferação de linfócitos a antigénios micobacterianos, ou na determinação dos níveis de adenosina-desaminase, ou na detecção de antigénios e constituintes micobacterianos, utilizando imunoensaios, como ELISA, cromatografia gasosa e líquida ou espectrometria de massa. As abordagens moleculares, mais modernas, incluem a reacção em cadeia com polimerase (PCR), sondas de ADN ou sequenciação de ADN (Musial et al., 1988; Godfrey-Fausset, 1994) .

Mason et al. , 1993 (Tubercle and Lung Disease) descrevem um método para identificar e caracterizar espécies micobacterianas utilizando anticorpos monoclonais inter alia, dirigidos para lipoarabinomana micobacteriano e glicolípidos não específicos.

Wiker et al. , 1991 (Journal of General Microbiology) descrevem um método para a caracterização e identificação de espécies micobacterianas crescidas em cultura, através da detecção de antigénios proteicos característicos das micobactérias.

Hamid et al., 1993 (Journal of General Biology) descrevem um teste para distinguir as micobactérias de outras bactérias, através da precipitação de ácidos micolíticos e realização de uma análise de TLC.

Young, 1980 (Journal of General Biology) descreve um método para a extracção e análise de ácidos micolíticos de micobactérias por TLC e mostra uma diferença no perfil de ácido micolítico entre Mycobacterium leprae e outras bactérias 5 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ em biópsias de lepra. O pedido de Patente Europeia No. 0407605 descreve um método para a detecção de anticorpos no soro do paciente, para bactérias da espécie Nocardia, através da detecção de anticorpos criados contra ácidos micolíticos nocardiais.

No entanto, nenhum destes métodos acima enumerados preenche todos os requisitos para um teste rápido, simples e de confiança, capaz de distinguir entre células de micobactérias vivas e mortas.

SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o invento, proporciona-se um teste de diagnóstico para a detecção e identificação de uma espécie de Mycobacterium numa amostra biológica de um animal, que compreende os passos seguintes: estabelecer o contacto de uma amostra biológica com um anticorpo específico para pelo menos um antigénio micobacteriano intracelular da espécie de micobactéria, que compreende um ácido micólico ou uma mistura de ácidos micólicos; e detectar a formação de um complexo anticorpo-antigénio na amostra 0 termo "antigénio micobacteriano intracelular" significa um antigénio que não de superfície, ou um produto metabólico da espécie Mycobacterium. O teste compreende de preferência o passo de lise de pelo menos algumas células micobacterianas presentes na amostra, a fim de libertar pelo menos algum do antigénio presente nas suas paredes celulares, antes do contacto da amostra com o anticorpo. 0 teste compreende também, preferencialmente, os passos 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 6

de tratar a amostra biológica para libertar as células micobacterianas de quaisquer resíduos orgânicos em que possam estar embebidas e descontaminar a amostra biológica para eliminar microorganismos indesejáveis, presentes na amostra antes da lise das células micobacterianas. 0 antigénio micobacteriano intracelular é de preferência uma mistura de ácidos micólicos presentes na parede celular da espécie Mycobacterium, tendo cada um a seguinte estrutura geral α β

CH3-(CH2)x- ch.oh - CH - COOH

CH A amostra biológica é de preferência, esputo, sangue, fluido cerebro-espinal, fezes, urina, lavagem gástrica, saliva, tecido, esfregaço da laringe ou um exsudado de uma lesão da pele. O teste compreende também, de preferência, o passo de concentrar os ácidos micólicos na amostra através de um processo de afinidade para anticorpos imobilizados, antes do contacto destes com um anticorpo marcado. O passo de concentração é realizado, de preferência, utilizando uma coluna de imunoafinidade.

Um método para a separação de grupos e subsequente purificação de ácidos micoliticos micobacterianos com a estrutura geral acima estabelecida, a partir de uma mistura de ácidos micoliticos micobacterianos extractados e contaminantes compreende os passos de: dissolver a mistura de ácidos micoliticos e contaminantes

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 7 num solvente bifásico; e submeter a mistura a uma separação de fases líquido-líquido .

De preferência, os ácidos micolíticos purificados não são subsequentemente derivatizados quimicamente O sistema de solventes bifásico compreende clorofórmio, metanol e água.

De preferência, o sistema de solventes bifásico compreende uma fase superior e uma fase inferior. O método compreende também, preferencialmente, os passos de mistura e equilíbrio das fases superior e inferior.

De preferência, a composição da fase superior é de 12-18% de clorofórmio, 45-55% de metanol e 20-40% de água. Mais preferencialmente, a composição da fase superior é de 15% de clorofórmio, 52% de metanol e 33% de água.

De preferência, a composição da fase inferior é de 50-80% de clorofórmio, 15-40% de metanol e 2-8% de água. Mais preferencialmente, a composição da fase inferior é de 68% de clorofórmio, 27% de metanol e 5% de água A purificação é de preferência realizada utilizando um aparelho em contracorrente ou qualquer outro extractor líquido-líquido.

De acordo com outro aspecto do invento, proporciona-se um anticorpo criado contra um ácido micólico micobacteriano purificado, ou mistura de ácidos micólicos de uma parede celular de uma espécie de Mycobacterium, em que cada ácido micólico tem a seguinte estrutura geral: 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 8

α β

CH3-(CH2)x- CH.OH - CH - COOH (CHa)y

I

CH Ο anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal e é de preferência de origem animal. 0 anticorpo é preferencialmente um anticorpo policlonal isolado, criado contra um ácido micólico purificado pelo método acima.

De acordo com outro aspecto do invento, proporciona-se um conjugado de veículo proteico/antigénio intracelular micobacteriano. 0 antigénio intracelular é de preferência um ácido micólico e está, de preferência, conjugado com um veículo. O veículo pode ser uma proteína, como a albumina de soro bovino, gelatina ou hemocianina de lapa do género Fissurella.

De acordo com ainda outro aspecto do presente invento, proporciona-se um estojo para a detecção da presença de uma espécie de Mycobacterium numa amostra biológica, tal como apresentado na reivindicação 14 do presente fascículo. 0 estojo poderá também compreender um anticorpo imobilizado, tal como apresentado em qualquer das reivindicações 7 a 9.

DESCRICÃQ PORMENORIZADA DO INVENTO 0 objectivo do presente invento é desenvolver um teste de

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 9 diagnóstico para confirmar a presença de Mycobacteria em espécimens biológicos, de origem humana ou animal, como esputo, fluido cerebro-espinal, sangue, urina, amostras de fezes ou de tecido, lavagem gástrica, saliva, esfregaços de laringe ou um exsudado de uma lesão da pele. O teste baseia-se na detecção imunológica de um ou mais antigénios celulares/ácidos micólicos, originários de Mycobacteria. 0 teste poder-se-á basear na utilização de anticorpos marcados com uma enzima, corante fluorescente, partículas de látex ou qualquer marcador adequado.

Os ácidos micólicos são ácidos gordos α-hidroxi de peso molecular elevado, que possuem cadeias alifáticas moderadamente longas na posição-a.

Uma vez que se sabe que cada espécie do género Mycobacterium se caracteriza por um tipo único de ácidos micólicos (Butler, Jost e Kilburn, 1991; Butler e Kilburn, 1988), deveria ser possível distinguir entre vários membros do género, utilizando anticorpos específicos fornecidos pelo teste. EXEMPLO 1 A investigação que constitui a base do invento, no qual se proporciona um método para a detecção e identificação de uma espécie de Mycobacterium, num espécime biológico, compreendeu as seguintes fases:

Fase 1: Pesquisa das estirpes de Mycobacterium. As culturas foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC);

Fase 2: Isolamento de ácidos micólicos de culturas de Mycobacterium, identificação de ácidos micólicos por análise de HPLC e sua purificação;

Fase 3: Preparação de conjugados de ácidos micólicos utilizando BSA, KLH e gelatina como moléculas veículo; 10 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ

Fase 4: Imunização de animais experimentais e produção de anticorpos específicos para ácidos micólicos. Caracterização de anticorpos;

Fase 5: Desenvolvimento proposto de um teste/ensaio de diagnóstico (tornando as reacções antigénio-anticorpo detectáveis);

Fase 6: A ser seguida pela avaliação do teste/ensaio de diagnóstico: confirmação da especificidade e sensibilidade do teste, testes de campo, comparação com testes/ensaios existentes;

Os materiais (incluindo os animais experimentais) , métodos e resultados utilizados durante as investigações são descritos a seguir.

MATERIAIS

Cultura

Utilizou-se nas experiências a Mycobacterium tuberculosis H37R ATCC 27294 - uma estirpe virulenta, originalmente isolada a partir de um pulmão humano infectado. A cultura foi adquirida na forma liofilizada da American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA.

Meios

Utilizaram-se os seguintes meios para a cultura de M. tuberculosis: meio líquido: caldo Dubos meio sólido: Meio de Lúwenstein-Jensen (LJ) meio Middlebrook 7.H-10

No Laboratory Manual of Tuberculosis Methods,

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Tuberculosis Research Institute of the SA Medicai Research Council (1980, Capítulo 6, pp. 83-105; Segunda edição, revista por EE Nel, HH Kleeberg e EMS Gatner) está descrita uma composição pormenorizada dos ingredientes necessários para a preparação destes meios, bem como as condições recomendadas para a sua esterilização.

Os meios são preparados pelo Departamento de Microbiologia Médica no Institute for Pathology of the University of Pretória.

Reagentes

Utilizaram-se os reagentes seguintes para a saponificação, extracção, derivatização e análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), dos ácidos micólicos:

Reagente A: hidróxido de potássio a 25% (grau analítico) dissolvido em metanol-água (1:1); dissolveram-se 62,5 g de hidróxido de potássio em 125 ml de água e adicionaram-se 12 5 ml de metanol (BDH, grau para HPLC)

Reagente B: ácido clorídrico concentrado (BDH, grau analítico) diluído 1:1 com água.

Reagente C: bicarbonato de potássio a 2% (BDH, grau analítico) dissolvido em metanol:água (1:1): dissolveram-se 10 g de bicarbonato de potássio em 250 ml de água e adicionaram-se 250 ml de metanol.

Reagente D: Distribuíram-se porções de 500 μΐ de para-bromo-fenacilbrometo em éter coroa (Pierce Chemical Co., No. Cat. 48891) em frascos com tampa de rosca, pequenos, de cor âmbar, com septos revestidos com Teflon (marca registada). Colocaram-se e enroscaram-se as tampas e envolveram-se os frascos com Parafilm (marca registada). O reagente D foi

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armazenado a 4°C

Reagente E: Preparou-se o reagente E por mistura do reagente B 1:1 com metanol

Padrão de HPLC

Padrão interno de elevado peso molecular (C-100) da Ribi ImmunoChem Research Company, No Cat R-50. Suspendeu-se o padrão, 1 mg, em 2,0 ml de cloreto de metileno (BDH, grau para HPLC) e distribuiram-se alíquotas de 35 0 μΐ em frascos pequenos, com tampa de rosca, com septos revestidos com Teflon (marca registada). Envolveram-se os frascos com Parafilm (marca registada) e armazenaram-se a 4°C. A fim de limitar a evaporação do cloreto de metileno, mantiveram-se as aliquotas de padrão de HPLC em gelo, durante o manuseamento.

Clorofórmio (Associated Chemical Enterprises, grau de pureza química)

Cloreto de metileno (BDH, grau para HPLC)

Os reagentes A, B, C e E foram preparados de fresco, antes das experiências, tomando todas as precauções de segurança necessárias.

Utilizou-se água desionizada, bi-destilada para a preparação dos reagentes.

Utilizaram-se os reagentes seguintes na purificação dos ácidos micólicos extraídos:

Clorofórmio (Saarchem, grau analítico)

Metanol (Merck, quimicamente puro)

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Utilizaram-se os reagentes seguintes para a imunização de animais experimentais:

Albumina de soro bovino (BSA) - Sigma Lote 11H1040

Conjugados de ácidos micólicos-BSA

Hemocianina de lapa do género Fissurella. - KLH Sigma Immuno Chemicals

Conjugados de ácidos micólicos-KLH

Adjuvante de Freund incompleto (FIA)

Modulador Imunológico AdjuPrime (marca registada) (Pierce Chemical Company, No Cat. 77138)

Solução salina estéril - solução de cloreto de sódio 0,85% p/v em água bi-destilada

Utilizaram-se os seguintes reagentes para o desenvolvimento de ELISA para a detecção de anticorpos específicos para ácidos micólicos:

Albumina de soro bovino (BSA) - Sigma Lote 11H1040

Gelatina (Serva, Lote 22151, Reinst-grau para Investigação)

Conjugado gelatina-MA PBS - solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) que compreende:

Cloreto de sódio (Unilab, grau de pureza química, Lote 28159)

Hidrogenofosfato de sódio dodeca-hidratado (Merck, grau de pureza química, Lote 7468715)

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Cloreto de potássio (Merck, Grau de pureza química, Lote 6420150)

Di-hidrogenofosfato de potássio (Merck, grau de pureza química, Lote 6332422)

Tampão citrato (pH 4,5) que compreende: Ácido cítrico 0,1 M (Merck, Lote 775A)

Citrato tri-sódico 0,1 M (Merck, Lote 8533833)

Caseína (Merck, Lote 0100 336 V279342) O-fenilenodiamina (dicloridrato) (Sigma, Lote 59F-5021)

Metanol (Saarchem, grau analítico, Lote 31260)

Anticorpo monoclonal de cabra anti-ratinho, conjugado com peroxidase (Cappel, Lote 37081)

Substracto: 8 mg de ureia hidrogeno-peroxidase

10 mg de o-fenilenodiamina em 10 ml de tampão citrato 0,1 M

Utilizaram-se nesta experiência amostras de soro provenientes de cinco ratinhos imunizados e três ratinhos de controlo.

Animais experimentais

Utilizaram-se ratinhos Balb-C fêmea, de seis semanas de idade nas experiências de imunização. Os ratinhos foram criados no Centro Animal do South African Institute for Medicai Research, em Joanesburgo.

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Placas de ELISA

Utilizaram-se imunoplacas Nunc (Maxisorp) para os testes ELISA.

Aparelho para separação em contracorrente

Utilizou-se no decorrer das investigações, um aparelho de contracorrente produzido pela H O POST, Instrument Company, Inc., Middle Village, Nova Iorque.

MÉTODOS

Utilizaram-se os métodos seguintes no trabalho experimental:

Cultura da estirpe bacteriana

Fez-se a cultura de bactérias a 37°C utilizando:

Caldo Dubos

Meio Lôwenstein-Jensen (rampas), e Meio de agar Middlebrook 7H-10 (rampas)

Preparação de ácidos micólicos a partir de amostras bacterianas A preparação de amostras bacterianas compreendeu três passos: recolha de células de Mycobacteria; saponificação e extracção de ácidos micólicos. A saponificação, extracção e derivatização de ácidos micólicos foram realizadas como descrito por Butler, Jost e Kilburn (1991), com modificações menores e estão descritas sob o título correspondente. O material de vidro utilizado para a extracção, a derivatização e as análises de HPLC dos ácidos micólicos foi lavado em 2% (v/v) Contrad (Merck) , lavado com água, seguida

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 16 de lavagem com clorofórmio, água, etanol de grau técnico, água e finalmente lavado com água desionizada, bi-destilada. O material de vidro lavado foi seco num forno de ar quente. A recolha foi feita por raspagem do material bacteriano que cresceu na superfície do meio em rampas (utilizando hansas de plástico estéreis). As suspensões bacterianas homogéneas foram preparadas em reagente A, através de agitação ou aplicando vórtex às células recolhidas, com contas de vidro estéreis. A saponificação das Mycobacteria em reagente A foi realizada numa autoclave a 121°C, durante uma hora. A extracção de ácidos micólicos compreendia o seguinte:

Deixaram-se arrefecer as amostras e introduziram-se 1,5 ml de reagente B em cada amostra. Após agitação com vórtex, verificou-se o pH de cada amostra e, se necessário, ajustou-se para pH 1 com reagente B. A seguir, adicionaram-se 2,0 ml de clorofórmio a cada amostra e agitou-se com vórtex durante 30 segundos. Deixaram-se separar as camadas. Removeram-se as camadas inferiores com pipetas de Pasteur, transferiram-se para frascos WISP e evaporaram-se até à secura a 85°C, num evaporador de blocos de calor, sob corrente de azoto. A fim de neutralizar vestígios de ácido arrastado, adicionaram-se 100 μΐ de reagente C a cada amostra e evaporou-se o fluido até à secura a 85°C, num evaporador de blocos de calor, sob corrente de azoto.

Derivatização de ácidos micólicos para análise por HPLC

Os ácidos micólicos extraídos foram derivatizados como se segue:

Introduziu-se em cada amostra arrefecida 1,0 ml de clorofórmio e em seguida adicionaram-se 50 μΐ de reagente D. As amostras rolhadas foram agitadas com vórtex durante 30

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 17 segundos e aquecidas durante 20 minutos a 85°C num evaporador de blocos de calor. Em seguida, as amostras foram arrefecidas e adicionou-se 1,0 ml de reagente E. As amostras foram agitadas com vórtex durante 30 segundos e deixaram-se separar as camadas. Removeram-se as camadas inferiores com pipetas de Pasteur e transferiram-se para frascos WISP. Colocaram-se os frascos num evaporador de blocos de calor e evaporou-se o seu conteúdo até à secura a 85°C, utilizando uma corrente de azoto.

Ressuspenderam-se os resíduos em 0,212 g (que correspondem a 160 μΐ) de cloreto de metileno, rolhou-se e agitou-se com vórtex. Cada amostra reconstituída, na qual se introduziram 5 μΐ de padrão interno de HPLC, foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,4 5 μτη num frasco WISP de cor âmbar. Os frascos novamente rolhados foram armazenados a 4°C até utilização na análise por HPLC.

Análise por HPLC e quantificação de ácidos micólicos

Para a análise de HPLC, analisaram-se 25 μΐ de cada amostra (mantida em gelo durante o manuseamento). Fez-se a operação com amostras controlo, i.e. 25 μΐ de cloreto de metileno filtrado, antes de cada conjunto de amostras analisado. Quando se analisava um grande número de amostras, operavam amostras de controlo após cada três ou quatro amostras teste, a fim de validar a confiança do aparelho de HPLC.

As análise de HPLC de fase inversa foram realizadas utilizando um aparelho . de Cromatografia líquida de alta eficiência Beckman System Gold, que consistia de:

Bombas (Módulo de fornecimento de solvente Beckman 110 B)

Detector (módulo detector programável 166 ou 168)

Coluna (Nova-Pack C18 4μιη 3,9 x 150 mm) e um conjunto

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 18 conector final para colunas de cartucho de aço.

As condições da operação eram:

Fase móvel:

Solvente A: Metanol de grau para HPLC Solvente B: cloreto de metileno de grau para HPLC Caudal: 2,5 ml/min Temperatura da coluna: 30°C O detector foi ajustado para 260 nm. O gradiente de HPLC compreendia inicialmente 98% (v/v) de metanol (Solvente A) e 2% (v/v) de cloreto de metileno (Solvente B). O gradiente foi aumentado linearmente até 80% de A e 20% de B, ao 1 minuto, 35% de A e 65% de B aos dez minutos, mantido durante 30 segundos e em seguida diminuído durante 30 segundos de novo para 98% de A e 2% de B. Esta razão foi mantida durante 4 minutos a fim de permitir a estabilização do sistema, antes da injecção da amostra seguinte. A quantificação matemática dos ácidos micólicos foi realizada por comparação das áreas de pico combinadas das amostras testadas, com a área de pico da quantidade de padrão interno de HPLC de elevado peso molecular, introduzida.

Purificação de ácidos micólicos e separação de grupos de outros ácidos gordos

Utilizou-se na experiência um carril de distribuição em contracorrente compreendendo 25 tubos, numerados de 0-24. Introduziram-se aproximadamente 900 ml da fase superior num reservatório de tampão.

No tubo número 0, introduziu-se uma amostra do extracto celular em bruto de M. tuberculosis, obtido a partir de uma experiência de extracção em grande escala (30-150 mg), dissolvido em 10 ml da fase inferior e 10 ml da fase superior. Nos 24 tubos restantes, colocaram-se alíquotas de 10 ml da 19 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ fase inferior. A fase superior foi distribuída de forma automática no tubo número 0, em volumes de 10 ml por ciclo, repetidamente durante 25 ciclos, o que resultou num tempo de operação de aproximadamente 16 horas. Assim, realizaram-se 25 ciclos de contra-corrente, consistindo cada ciclo em 20 misturas e 40 minutos de tempo de separação de fases.

Em cada transferência, qualquer soluto resultante da amostra e presente na fase superior é transferido para o tubo seguinte. No final das vinte e cinco transferências, as fracções de soluto separadas deverão estar distribuídas ao longo do carril de 25 tubos A fim de estabelecer a distribuição de ácidos gordos nos vinte cinco tubos, observaram-se os padrões de emulsificação nas fases superior e inferior no carril de tubos e determinaram-se as fracções em acordo com o observado. 0 material separado em contracorrente foi em seguida removido dos tubos, utilizando uma seringa de vidro de 50 ml, com uma tubagem de Teflon (marca registada) acoplada. Reuniu-se o material em sete fracções, secou-se individualmente sob vácuo num evaporador Buchi a 70°C, redissolveu-se o material seco em clorofórmio, metanol ou água (em aproximadamente 5 ml) , transferiu-se para frascos WISP âmbar e armazenou-se a 4°C até necessário.

Rendimento dos ácidos micólicos purificados por separação em contracorrente A fim de calcular o rendimento aproximado de purificação/separação, comparou-se a quantidade pesada de ácidos micólicos presente nas amostras obtidas após a separação/purificação em contracorrente, com a quantidade destes compostos presente no extracto celular em bruto, introduzido num aparelho de contracorrente, calculado a partir das áreas relativas dos picos do conjunto de picos de ácidos micólicos e a partir da área do pico do padrão, no cromatograma de HPLC do extracto celular em bruto.

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Purificação de ácidos micólicos em contracorrente

Verificou-se que o material extraído de M. tuberculosis, de acordo com o método proposto por Butler, Jost e Kilburn (1991) para o isolamento de ácidos micólicos contém menos de 10% de ácidos micólicos (Tabela 1) . De modo a garantir que os ácidos micólicos tenham uma imunogenecidade particularmente elevada, é preferível ligar o material purificado a moléculas veículo, como a albumina de soro bovino.

Um requisito importante neste processo é a capacidade de estabelecer razões de solubilidade do ácido micólico num solvente adequado. A purificação em contracorrente do extracto bruto de ácidos micólicos de M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 utilizando o sistema de fases acima descrito, foi realizada ao longo de 25 ciclos.

Por mistura das fases finais no carril de tubos e deixando repousar durante alguns minutos, pode-se observar um padrão de emulsificação que indica de forma bastante precisa, o modo como o material se distribui ao longo do carril de tubos.

Analisaram-se as fracções 1, 2, 3, 4, e 5 por HPLC, o que revelou a natureza dos ácidos micólicos dos picos 1 e 2 e a natureza do ácido gordo de cadeia curta dos picos 4 e 5 (gráfico 1).

Os perfis de HPLC do extracto celular em bruto, fracção 1 e fracção 4 são apresentados no gráfico 1. (Segue Gráfico 1)

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Absorváncia Absorvância

1a: extracto bruto 1b: fracçâo 1 1 c: fracçâo 4

Gráfico 1.

Perfis de HPLC do extracto celular bruto (1a) e das fracções 1 (1b) e 4 (1c) purificadas em contracorrente 83 808 ΕΡ Ο 755 517/ΡΤ 22

Não foi possível analisar as fracções Sei por HPLC, devido ao facto de não serem solúveis em clorofórmio. O padrão de distribuição de massa (Tabela 1) indica que foi conseguida a separação da linha de base dos ácidos micólicos dos seus contaminantes mais polares, enquanto que o rendimento de 8% se correlaciona com o rendimento teórico de ácidos micólicos a partir do extracto bruto, dentro dos limites do erro experimental.

Como se torna evidente pelo gráfico 1, a fracção 1 contém, de facto, os ácidos micólicos purificados. (Segue Tabela 1) 23 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 4-1.6

Tabela 1 Perfil de HPLC da primeira fracção resultante do material purificado em contracorrente

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Preparação do conjugado ácido micólico-BSA

Preparou-se uma solução de BSA contendo 5 mg em 500 μΐ de NaHC03 0,1 N (pH 8,3) . Dissolveu-se uma amostra de ácido micólico purificado em contra-corrente (4,5 mg) em 450 μΐ de clorofórmio. Adicionou-se lentamente a solução de BSA a uma alíquota de 200 μΐ da solução de ácidos micólicos durante um período de 1 min e 20 s, à temperatura ambiente. Durante este processo, a mistura foi agitada com vórtex. Após agitação com vórtex durante mais 30 s, colocou-se a amostra em gelo durante 15 minutos. Introduziu-se então acetona arrefecida em gelo (2 ml) durante um período de dois minutos, ao mesmo tempo que se mantinha a amostra em gelo. Deixou-se a mistura em repouso durante meia hora.

Após recolha de um quarto da solução para outro frasco para análise por HPLC (0,5 mg) centrifugou-se a amostra com três pulsos de centrifugação curtos de 10 s e lavou-se a pelete duas vezes com acetona. Transferiu-se então a pelete de novo para o frasco WISP, deixou-se secar ao ar e manteve-se a 4°C durante a noite, sob folha metálica. A amostra recolhida para análise por HPLC foi seca no bloco de calor. A adição de adjuvante foi realizada como se segue:

Moeu-se uma amostra de imunomodulador AdjuPrime (marca registada) (10 mg) com uma vareta de vidro e adicionou-se uma amostra de conjugado de ácidos micólicos-BSA (1 mg) , seca no bloco de calor. Moeram-se os pós conjuntamente, a fim de se obter um pó homogéneo, do qual se pesou 1 mg que se dissolveu em 1 ml de água estéril. A mistura remanescente de BSA-ácidos micólicos/AdjuPrime (marca regisada) foi selada sob vácuo, coberta com folha metálica e armazenada a 4°C.

Aplicaram-se ultra-sons à solução salina utilizando um aparelho Branson - disruptor de células B-30,. durante ciclos de pulsos de 10 segundos com intervalos de 10 s, seguidos de um ciclo de pulsos 30 s, o que resultou na dispersão uniforme

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 25 das partículas. Durante a aplicação de ultra-sons, a amostra foi mantida em gelo. De acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante, deixou-se a solução salina a 4°C durante quatro horas antes de utilização para imunização.

Após remoção do imunogénio necessário para imunização, adicionou-se um grande excesso de acetona arrefecida em gelo à solução salina remanescente, para remover as proteínas por precipitação. Lavou-se o precipitado duas vezes com acetona fria e armazenou-se em folha metálica, sob acetona a 4°C.

Preparação de conjugados de ácidos micólicos-gelatina

Preparou-se uma solução de gelatina compreendendo 5 mg de gelatina em 2 ml de NaHC03 0,1 N (pH 8,3) . Adicionou-se uma alíquota de 500 μΐ desta solução a 600 μΐ de metanol e misturou-se. A mistura foi em seguida gradualmente adicionada sobre 2 mg de ácidos micólicos, dissolvidos em 50 μΐ de clorofórmio, durante um período de 1 min e 20 s, com agitação com vórtex. A amostra foi em seguida agitada com vórtex durante mais 30 s e colocada em gelo durante 15 minutos.

Transferiu-se a amostra para um frasco Schott de 100 ml e adicionaram-se 80 ml de acetona arrefecida em gelo. O frasco Schott com o seu conteúdo, foi deixado em gelo durante 3 0 minutos. Lavou-se duas vezes o precipitado que compreende os ácidos micólicos adsorvidos em gelatina, com acetona e armazenou-se a amostra em acetona, a 4°C.

Imunização dos ratinhos A imunização dos ratinhos foi realizada de acordo com o seguinte protocolo:

Duração Dia 1 Dia 14 Dia 21

Tipo de manipulação primeira imunização segunda imunização primeira sangria

Local da manipulação almofada da pata subcutânea veia da cauda Τ 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 26

Dia 28 Dia 35 Dia 49 Dia 59 subcutânea veia da cauda subcutânea veia da cauda terceira imunização segundo sangria terceira imunização terceira sangria

Cada um dos processos de imunização foi acompanha de uma experiência de controlo, em que se injectou um grupo de dois ratinhos com uma molécula veículo e apenas um adjuvante correspondente, utilizando o mesmo modo de injecção.

Durante a primeira imunização, injectaram-se cinco ratinhos Balb-C fêmeas, nas almofadas das patas traseiras com alíquotas de conjugados de ácidos micólicos e mistura de adjuvante. Injectaram-se aproximadamente 50 μΐ da mistura por pata. Durante as imunizações subsequentes, introduziu-se subcutaneamente o mesmo volume de mistura de conjugados de ácidos micólicos e um adjuvante.

Para a primeira e subsequentes sangrias, recolheram-se algumas gotas de sangue da veia da cauda de cada ratinho, incluindo os ratinhos de controlo.

Monitorização da produção de anticorpos

Preparação de soros

Para a monitorização da produção de anticorpos, recolheram-se algumas gotas de sangue da veia da cauda de cada ratinho. Durante a primeira sangria, reuniu-se o sangue de cinco ratinhos imunizados e de três ratinhos de controlo e introduziu-se em dois tubos Eppendorf separados, misturou-se e deixou-se coagular. Separou-se o soro dos eritrócitos por centrifugação numa centrífuga de bancada para Eppendorf, durante 10 min. Armazenaram-se os sobrenadantes de soro recolhidos a 4°C. Para as sangrias subsequentes, recolheram-se amostras de sangue que foram tituladas individualmente.

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 27

Preparação de placas de ELISA

Revestiram-se placas de ELISA com soluções de revestimento que contêm ou BSA, ou conjugado de ácidos micólicos-gelatina, a uma concentração de 10 μg/ml em tampão PBS (pH 7,4).

Introduziram-se alíquotas de 50 μΐ de BSA ou soluções de revestimento de ácido micólico-gelatina em poços individuais e incubaram-se as placas de ELISA durante 16 horas à temperatura ambiente.

Bloquearam-se então as placas de ELISA com 200 μΐ de caseína a 0,5% p/v em tampão PBS (pH, 7,4), por poço, durante uma hora à temperatura ambiente. Removeu-se a solução bloqueadora sacudindo-a e secaram-se as placas.

Titulação dos soros

Diluíram-se os soros obtidos de ratinhos imunizados em caseína a 0,5% p/v em tampão PBS (pH 7,4) e colocaram-se em placas de ELISA, em triplicado. Os soros de ratinhos de controlo, i.e. ratinhos imunizados com BSA AdjuPrime (marca registada), e de ratinhos não imunizados, foram igualmente diluídos em caseína a 0,5% p/v em tampão PBS (pH 7,4) e colocados em placas de ELISA, em triplicado, a 50 μΐ por poço. A titulação directa dos soros obtidos de ratinhos imunizados com conjugado BSA-ácido micólico foi acompanhada por um teste de inibição, a fim de confirmar a especificidade dos anticorpos. Para as experiências de inibição, adicionou-se aos antisoros um conjugado de BSA-ácidos micólicos, como antigénio competidor a 0,32 mg/ml, durante a incubação das placas de ELISA. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante uma, hora num agitador de placas. Após este período, removeram-se os soros e lavou-se a placa três vezes com caseína a 0,5% p/v

83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ em tampão PBS (pH 7,4), utilizando um aparelho de auto-lavagem Anthos.

Colocaram-se anticorpos monoclonais de cabra anti-ratinho, conjugados com peroxidase, diluídos de 1:4000 em placas de ELISA (50 μΐ por poço) e deixaram-se as placas durante 60 minutos à temperatura ambiente, num agitador de placas. A solução do conjugado de peroxidase foi sacudida e lavaram-se as placas três vezes com caseína a 0,5% p/v em tampão PBS (pH 7,4), para remoção de qualquer excesso de conjugado. Misturou-se o substracto e pipetou-se para os poços, a 50 μΐ por poço.

Seguiu-se a absorvância dos poços individuais durante 1,5 horas, utilizando um leitor de ELISA SLT 340 ATC.

RESULTADOS E DISCUSSÃO DAS EXPERIÊNCIAS DE IMUNIZAÇÃO COM ELISA O diagrama apresentado na fig. 3 mostra a resposta de anticorpos obtida por imunização de ratinhos com o conjugado de ácidos micólicos-BSA. As barras contínuas representam as leituras de absorvância registadas (multiplicadas por um factor de 103) , com a indicação do desvio padrão para cada conjunto de diluições em triplicado. Obtiveram-se respostas fortes ao veículo BSA (coluna da direita) e respostas mais fracas aos ácidos micólicos (colunas da esquerda).

Após 59 dias do programa de imunização, dois de um total, de cinco ratinhos imunizados produziram anti-soros que exibiam actividade de anticorpos com especificidade contra ácidos micólicos, tal como indicado pela inibição de 24% do sinal de ELISA a diluições de 1:50 de antisoro, misturadas com conjugado de BSA-ácido micólico, solúvel, a 0,32 mg/ml. A inibição é realizada através do bloqueamento de locais de ligação de anticorpos específicos para ácidos micólicos, com ácidos micólicos ligados a BSA em solução, originando deste modo um decréscimo do número de anticorpos específicos para ácidos micólicos que se ligam à placa de ELISA. •r 29 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ

Quando se utilizou BSA como agente de revestimento, obtiveram-se sinais de ELISA fortes, indicando um elevado grau de imunização para todos os cinco ratinhos. Não se observou nenhuma inibição do sinal da diluição de 1:50 do antisoro obtido a partir de ratinhos que apresentam actividade contra ácidos micólicos, quando se fez a incubação dos antisoros com conjugado de BSA-ácidos micólicos, solúvel, a 0,32 mg/ml. Isto deve-se provavelmente à concentração elevada de anticorpos anti-BSA presentes, fazendo com que a inibição dos anticorpos anti-veículo de BSA esteja fora do limite de sensibilidade. A resposta imunitária anti-ácidos micólicos requer um período de imunização maior, a fim de se atingir uma maturação adequada da resposta, que irá conduzir a um aumento na concentração de anticorpos e/ou a um aumento da afinidade para os anticorpos. Alternativamente, os ratinhos podem ser utilizados para a produção de anticorpos monoclonais, que serão monoespecíficos para os ácidos micólicos. (Segue Tabela) 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 30

L

Fig. 3 Respostas imunitárias de ratinhos contra ácidos micólicos-BSA após 59 dias no programa de imunização, medidas por ELISA. 31 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ

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Lisboa, um m

Por ADCOCK INGRAM LIMITED O AGENTE OFICIAL

EHG.e ANTÓNIO JOÂÔ

Claims (11)

1. 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ REIVINDICAÇÕES 1. Teste de diagnóstico para a detecção e identificação de uma espécie de Mycobacterium numa amostra biológica de um animal que compreende os passos seguintes: estabelecer o contacto entre a amostra biológica e um anticorpo específico para pelo menos um antigénio micobacteriano intracelular da espécie micobacteriana, que compreende um ácido micólico ou uma mistura de ácidos micólicos; e detectar a formação de um complexo anticorpo-antigénio na amostra.
2. 2. Teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, que compreende o passo de realizar a lise de pelo menos algumas células micobacterianas presentes na amostra, antes de estabelecer o contacto da amostra com o anticorpo.
3. 3. Teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 2 que compreende também os passos de tratamento da amostra biológica para libertar as células micobacterianas de quaisquer restos orgânicos em que possam estar embebidas e descontaminação da amostra biológica, a fim de eliminar microorganismos indesejáveis, nela presentes, antes da lise das células micobacterianas.
4. 4. Teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que também compreende o passo de concentrar o antigénio micobacteriano intracelular na amostra, utilizando um processo de afinidade para um anticorpo imobilizado, antes do seu contacto com um anticorpo marcado.
5. 5. Teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o antigénio micobacteriano intracelular é uma mistura de ácidos micólicos presente na parede celular da espécie de Mycobacterium, tendo cada um a

   83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 3/4
6. 9. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, que é monoclonal ou policlonal.
7. 10. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 9, que é um anticorpo policlonal de origem animal.
8. 11. Conjugado antigénio micobacteriano intracelular/ veículo proteico em que o antigénio intracelular é um ácido micólico micobacteriano ou mistura de ácidos micólicos purificados conjugados com o veículo, tendo cada ácido micólico a estrutura geral seguinte: β α CH3-(CH2)X- ch.oh - CH - COOH I ( CH2 ) y I ch3
9. 12. Conjugado antigénio micobacteriano intracelular/ veículo de acordo com a reivindicação 11, em que a proteína é gelatina, ou albumina de soro bovino.
10. 13. Conjugado antigénio micobacteriano intracelular/ veículo de acordo com a reivindicação 11, em que o veículo é hemocianina de lapa do género Fissurella..
11. 14. Estojo para a detecção da presença de uma espécie de Mycobacterium numa amostra biológica num teste de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, ou um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13 . 15. Estojo de acordo com a reivindicação 14 que 83 808 ΕΡ 0 755 517/ΡΤ 4/4 compreende também um anticorpo imobilizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9. Lisboa, Por ADCOCK INGRAM LIMITED 0 AGENTE OFICIAL -

    I ENG.· ANTÓNIO JOÀOl DA CUNHA FERREIRA Ag. Ot- Pr. Ind· Kua das Flores, 74 - 4/ 1 e □ o L- isbo a