PDGF-A, PDGF-AA, PDGF-AB, Herstellungsverfahren und sie
enthaltende Arzneimittel
Einleitung
Platelet Derived Growth Factor (PDGF) ist ein Hauptmitogen im Serum, das das Wachstum von Fibroblasten und glatten Muskelzellen in vitro fördert. In vivo wird PDGF in den α-Granula der Thrombozyten gespeichert und nach Stimulation der Thrombozyten freigesetzt. Hochgereinigtes PDGF ist ein basisches Protein, das eine beträchtliche Heterogenität hinsichtlich seines Molekulargewichtes aufweist (27.000 bis 31.000 d). Die Gründe für diese Heterogenität sind Alterung, Prozessierung und die Existenz verschiedener Isoformen des Typs AA, AB oder BB. Die biologische Aktivität all dieser Formen wird durch Reduktion der Disulfidbrücken zerstört. Human-PDGF aus Thrombozyten besteht hauptsächlich aus AB-Heterodimeren (Heldin & Westermark 1984; Deuel et al. 1985; Ross et al. 1986).
Aminosäuresequenzierungen in Verbindung mit DNA-Sequenzierungen der Gene zeigten, daß A und B homolog sind (Betsholtz et al. 1986). PDGF-B ist nahezu identisch mit dem transformierten Genprodukt P28v-sis des Simian-Sarcoma-Virus (SSV). In SSV-transformierten Zellen wurden entsprechende Homodimere des Typs BB nachgewiesen, die ähnliche Eigenschaften wie thrombozytäres PDGF zeigten. Allerdings wurden diese BB-Dimeren nur zum geringen Teil aus den infizierten Zellen sekretiert. PDGF-AA-Formen werden hingegen effizient von produzierenden Zellen sekretiert (Heldin et al . 1986). Es gibt eine zunehmende Zahl an Hinwei
sen, daß die drei Isoformen AA, AB und BB unterschiedliche Funktionen wahrnehmen. Für eingehende Untersuchungen war daher die Entwicklung eines Verfahrens nötig, größere Mengen an PDGF-A, PDGF-B, PDGF-AA und PDGF-AB zu erzeugen.
Zur Anwendung von PDGF bei der Wundbehandlung vergleiche man EP-A-0 288 307.
Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung PDGF-A
(Monomeres) oder biologisch aktives (wachstumstimulierendes) PDGF-AA (Dimeres), die dadurch herstellbar sind, daß man
I) mit Hilfe von E. coli, umfassend einen Hybridvektor, der aus pEX und Fremd-DNA gebildet ist, die folgendes Fusionsprotein kodiert:
(a) ein Fusionsprotein aus ß-Galaktosidase und PDGF-A der
folgenden Aminosäuresequenz (i)
SIEEAVPAVCKTRTVTYEIPRSQVDPTSANFLIWPPCVEVKRCTGCCNT
SSVKCQPSRVHHRSVΕVAICTEYVRKKPKLKEVQVRLEEHLECACATTSL
NPDYREEDTDVR
(i) oder
(b) ein Fusionsprotein gemäß (a), dem eine beliebige Aminosäure fehlt, bei dem eine beliebige Aminosäure durch eine
beliebige andere Aminosäure ersetzt ist oder bei dem an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen ist, oder
(c) gemäß (a) oder (b) ein Fusionsprotein, bei dem der C-Terminus oder der N-Terminus um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt ist;
ein Fusiorisprotein als Dimeres der Monomeren gemäß (a), (b) und/oder (c) exprimiert,
II) das gebildete Fusionsprotein (gegebenenfalls nach
Reduktion) chemisch spaltet und ein Monomeres der Aminosäuresequenz gemäß (I) (a) oder ein entsprechendes Monomeres freisetzt, bei dem eine beliebige Aminosäure fehlen kann, eine beliebige Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt sein kann, an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen sein kann und/oder der C-Terminus oder der N-Terminus um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt sein kann,
III) die Thiolgruppen durch Sulfonieren schützt,
IV) das geschützte Monomere chromatographisch reinigt,
V) die Sulfogruppen des gereinigten und geschützten Monomeren reduziert und gegebenenfalls ferner
VI) das entschützte Monomere durch Ausbildung von Disulfidbrücken dimerisiert und danach
VII) das gebildete Dimere chromatographisch reinigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung biologisch aktives (wachstumstimulierendes) PDGF-AB, das dadurch herstellbar ist, daß man in die vorstehend angeführte Stufe (III) PDGF-A gemäß der vorstehend angeführten Stufe (II) und PDGF-B der folgenden Aminosäuresequenz (ii) oder (iii)
20 30 40 50 60
IAECKTRTEVFEISRRLIDRTNANFLWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQC (ii)
70 80 90 100 110
RPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHIACKCETVAAARPVTRSPLN
1 10 20 30 40 50 60
SLGSLTIAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDRTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQC
70 80 90 100 110
(iii) RPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHIACKCΞTVAAARPVT
oder einer Aminosäuresequenz gemäß (i) oder (ii), bei der eine beliebige Aminosäure fehlt, bei der eine beliebige Aminosäure
durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt ist, bei der an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen ist und/oder bei der der C-Terminus oder der N-Terminus um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt ist,
einsetzt und gemäß den vorstehend angeführten Stufen (III) bis (VII) verfährt und PDGF-AB gewinnt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von PDGF-A (Monomeres) und gegebenen- falls biologisch aktivem (wachsturnstimulirendem) PDGF-AA
(Dimeres), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
I) mit Hilfe von E. coli, umfassend einen Hybridvektor, der aus pEX und Fremd-DNA gebildet ist, die folgendes Fusionsprotein kodiert:
(a) ein Fusionsprotein aus ß-Galaktosidase und PDGF-A der
folgenden Aminosäuresequenz
SIEEAVPAVCKTRTVIYEIPRSQVDPTSANFLIWPPCVEVKRCTGCCNT SSVKCQPSRVHHRSVKVAKVEYVRKKPKLKEVQVRIEEHLECACATTSL NPDYREEDTDVR oder
(b) ein Fusionsprotein gemäß (a), dem eine beliebige Aminosäur fehlt, bei dem eine beliebige Aminosäure durch eine
beliebige andere Aminosäure ersetzt ist oder bei dem an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen ist, oder
(c) ein Fusionsprotein gemäß (a) oder (b), bei dem der C-Terminus oder der N-Terminus um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt ist,
ein Fusionsprotein als Dimeres der Monomeren gemäß (a), (b und/oder (c) exprimiert,
II) das gebildete Fusionsprotein (gegebenenfalls nach
Reduktion) chemisch spaltet und ein Monomeres der Aminosäurese quenz gemäß (I) (a) oder ein entsprechendes Monomeres frei
setzt, bei dem eine beliebige Aminosäure fehlen kann, eine beliebige Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt sein kann, an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen sein kann und/oder der C-Terminus oder der N-Terminus um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt sein kann,
III) die Thiolgruppen durch Sulfonieren schützt,
IV) das geschützte Monomere chromatographisch reinigt,
V) die Sulfogruppen des gereinigten und geschützten Monomeren reduziert und gegebenenfalls ferner
VI ) das entschützte Monomere durch Ausbildung von
Disulfidbrücken dimerisiert und danach
VII) das gebildete Dimere chromatographisch reinigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann man in Stufe (III) zwei Monomere (PDGF-A) einsetzen, die verschieden sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann man in die Stufe (III) PDGF-A, das bei Stufe (II) anfiel, und PDGF-B einsetzen, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Wie in Abb. 3 gezeigt, fördert der modifizierte pEX-2-Vektor eine Hochexpression des cro-ß-gal-PDGF-A-Fusionsproteins. Durch die Deletion von ca. 80 % des lacZ-Gens wird ein kleines Fusionsprotein von 40 000 d gebildet, das mehr als 50 % PDGF-A- Anteil enthält. Trotz dieser günstigen Voraussetzungen sind die Ausbeuten von rPDGF-AA mit 0,2 mg/l Kultur vergleichsweise niedrig. Drei Gründe sind dafür verantwortlich.
1) Die Zellen müssen bei einer geringen Dichte induziert werden und erreichen dadurch nur eine endgültige Dichte von 1,5 OD55 0 . Andere Induktions- bzw . Wachstumsbedingungen verschlechterten signifikant die Expression des Fusionsproteins.
2) Die CNBr-Spaltung an der Stelle MSIEE... verläuft nicht vollständig.
3) Durch die Dimerisierung tritt ein Ausbeuteverlust ein.
Die biologische Aktivität des rPDGF-AB ist vergleichbar mit de des menschlichen Thrombozyten PDGF und rPDGF-BB aus E. coli. Die Aktivität des rPDGF-AA ist etwa 10-fach geringer (vgl. Ab 5).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ei Arzneimittel zur Wundbehandlung, das durch PDGF-A, PDGF-AA und/oder PDGF-AB gemäß der vorstehenden Beschreibung als Wirkstoff gegebenenfalls in Kombination mit üblichen Trägern, Verdünnungsmitteln und/oder ein oder mehreren anderen Wachstumsfaktoren oder die Wundheilung fördernden Substanzen gekennzeichnet ist. Insuline like Growth Faktor (IGF) ist ein Beispiel für einen anderen Wachstumsfaktor.
Nachstehend wird die Erfindung mit Beispielen und Abbildungen näher erläutert. Weitere Einzelheiten zur Herstellung lassen sich Hoppe et al. in Biochem., 28 (1989) 2956-2960 und Eur. J. Biochem., 778 (1989) entnehmen. Im übrigen lassen sich die Sequenzen (i) bis (iii) auch synthetisch, herstellen, beispiel weise mit Oligopeptidsynthesemaschinen.
Abb. 1 : Strategie für die Konstruktion des Plasmids pAx-HA.
Weiße Kästchen: cro-lacZ-Gen
Graue Kästchen: Genbereich für das mature PDGF-A
Schwarze Kästchen: Genbereiche für Pre-Prosequenzen
Schlangenlinie: m13mp19-Sequenzen
PR : Bakteriophagen-lambda-Promoter; cro-lacZ: Cro-ß-Galaktosi dase-Fusionsprotein; tf d : Phagen-Transkriptions-Terminator.
Abb . 2 : Aminosäuresequenz des exprimierten PDGF-A.
A = Alanin, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenyl alanin, G = Glycin, H = Histidin, I = Isoleucin, K = Lysin, L Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutami R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, W = Tryptophan, Y = Tyrosin.
Abb. 3: SDS-Gelelektrophorese-Analyse des Expression von PDGF-A in E. coli und der Reinigungsschritte.
A) Lysat aus E. -coli-Zellen
B) Einschlußkörper
C) CNBr-Fragmente
D) Monomeres rPDGF-A nach HPLC-Reinigung
E) Dimeres rPDGF-AA nach Endreinigung
F) Dimeres rPDGF-AB nach Endreinigung
Abb. 4: Bevorzugte Bildung von Heterodimeren aus monomerem rPDGF-A bzw. -B.
Monomeres rPDGF-A und -B wurden in den angegebenen Verhältnissen gemischt und den Renaturierungsbedingungen unterworfen.
Nach einem Tag wurden 8 μg durch SDS-Gelelektrophorese analysiert.
Abb. 5: SDS-Gelelektrophorese von gereinigtem rPDGF-AB nach Reduktion mit 2-Merkaptoethanol. Die Banden, die rPDGF-A bzw. rPDGF-B entsprechen, sind angegeben.
Abb. 6: Biologische Aktivitäten von rekombinanten PDGF-Isoformen. (A) Stimulation von [3H]-Thymidin-Einbau in AKR-2B-MausFibroblasten durch rPDGF-AA (schwarze Kästchen), rPDGF-AB
(schwarze Kreise) und rPDGF-BB (schwarze Dreiecke). Ein Hintergrund von 2800 cpm wurde abgezogen. (B) Bindung von 125I-rPDGFAA (schwarze Kästchen), 125I-rPDGF-AB (schwarze Punkte) und 125I-rPDGF-BB (schwarze Dreiecke) an AKR-2B-Maus-Fibroblasten. rPDGF-BB wurde mit Bolton-Hunter-Reagens markiert. B/F = gebundener/freier Faktor.
Abkürzungen
HBS : Mit Hepes gepufferte Saline
PBS : : Mit Phosphat gepufferte Saline
PDGF : Platelet derived growth factor
(= Wachstumsfaktor aus Thrombozyten) rPDGF-AA, -AB, -BB : rekombinantes PDGF der Isoformen AA,
AB und BB
P28v- sis : Transformierendes Protein des Simian- Sarcoma-Virus
cro-ß-gal : Fusionsprotein aus cro-Repressor und ß-Galaktosidase
FCS Fötales Kälberserum
RF : Replikations-Form
Materialien
pMVW vgl. FEBS Letters, 198 (1986) 344, 345 pEX1 (Plasmid) Genofit Heidelberg; vgl. auch EMBO J.,
3 (1984) 1429-1434
pEX2 (Plasmid) Genofit, Heidelberg
E. coli NF1 vgl. EMBO J., 3 (1984) 1429-1434
E. coli JC 236 BioRad
E. coli JM 103 Pharmacia
ml3mpl8 Pharmacia
ml3mpl9 Pharmacia
Mutagenesekit einschließlich E. coli CJ 236
BioRad
pPGF-2 FEBS Letters, 229 (1987) 243, 244
Guanidinhydrochlorid und Tris waren von Sigma, Ameisensäure, 2- Propanol, Acetonitril, Trifluoressigsäure von Merck.
Sephacryl S-200 war von Pharmacia, die Chromatographiesäule Si- 300-polyolbutyl und Ampicillin von Serva, Medium und Supplemente von Gibco und Radiochemikalien von Amersham.
Biologische Systeme
Wachstumstimulierende Aktivität wurde nach Shipley et al.
(1984) bestimmt.
Analytische Methoden
Gelelektrophoresen wurden wie beschrieben durchgeführt (13,5-proz. Gele) (Hoppe et al. 1986). Aminosäureanalysen wurden mit einem Analysator (LC2000 von Biotronic) bestimmt. Aminoterminale Sequenzanalysen wurden mit einem Gasphasen-Analysator (470A von Applied Biosystems) bestimmt. Der Proteingehalt wurde nach den Methoden von Bradford (1976) oder Redinbaugh (1986) ermittelt.
Beispiel 1: PDGF-A und PDGF-AA
Konstruktion eines Expressionsvektors für PDGF-A-Sequenzen
Ein 2 kb langes Bgll-Fragment aus Klon pPGF-2 (Hoppe et al.
1987), das den für PDGF-A kodierenden Bereich enthält, wurde mit SstI und Rsal gespalten (Abb. 1 Zeile a) . Das so erhaltene 460 b lange Fragment wurde in den Phagen ml3mpl9 integriert, der zuvor mit SstI und HincII gespalten worden war (Abb. 2 Zeile b). Nach Transformation in den Wirtsstamm JM103 wurden die erhaltenen Kolonien auf korrekte Integration in die PhagenDNA untersucht. Der Stamm CJ236 (20 ml) wurde dann mit 3 × 106 der so erhaltenen Phagen infiziert. Danach wurden Uracil enthaltende Phagen wie beschrieben isoliert (BioRad Manual für gezielte Mutagenese). Einzelsträngige Phagen-DNA wurde daraufhin mit dem Primer CGG AGG AAG ATG AGC ATC GAG GAΑ G hybridisiert,
um das Arginin an Position 76 (AGA) in ein Methionin (ATG) zu mutieren (Abb. 1 Zeile c). Nach Zweitstrangsynthese mittels T4-DNA-Polymerase und Transformation in den Wirtsstamm JM103 wurde der für PDGF-A kodierende Bereich in vier Phagen durch DNA-Sequenzierung analysiert.
Zwei Phagen enthielten den gewünschten Austausch. Einer dieser Phagen wurde verwandt, um RF-DNA zu präparieren. Diese Plasmid-DNA wurde mit SstI verdaut. Überstehende Enden wurden durch T4-DNA-Polymerase-Behandlung entfernt (Abb. 1 Zeile d), wobei ein 460 b langes Fragment durch Pstl-Spaltung freigesetzt wurde (Abb. 1 Zeile e). Dieses Fragment wurde in die Hpal/Pstl-Stellen des Expressionsvektors pEX-2 integriert (Abb. 1 Zeile f). Dieser Hpal/Pstl-Verdau des pEX-2-Plasmides (Abb. 1 Zeile g) führte zu einer Deletion von ca. 2600 b des lacZ-Gens und reduzierte die Größe des cro-ß-gal-Proteins auf 18 000 d. Die nach der Transfektion in dem Wirtsstamm NF1 erhaltenen Stämme wurde im LB-Medium bei 30 °C bis zu einer optischen Dichte von 0,2 OD (550 im) kultiviert. Die Produktion des cro-ß-gal-PDGF-A-Fusionsproteins wurde durch Erhöhung der Temperatur auf 42 °C induziert. Nach 2 Stunden wurden die Zellen geerntet und Proteine durch SDS-Gelelektrophörese analysiert. Es wurde ein Stamm isoliert, der PDGF-A-Sequenzen hoch exprimiert. Das Plas- mid wurde pAX-HA benannt.
Anzucht von Zellen und Präparation von Einschlußkörpern
E. -coli-Zellen wurden in LB-Medium mit 50 bis 100 μg Ampicillin/ml in 1-1-Kulturen bei 30 °C bis zu einer optischen Dichte von 0,2 OD (440 nm) angezogen und dann bei 42 °C weitere 3 Stunden geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10 min bei 5000 × g) geerntet und in 20 ml Tris-HCl (20 mM) und EDTA (0,5 mM) vom pH 7,8 suspendiert. Für eine typische Präpa ration wurden 20 bis 30 1 Kultur angezogen. Die Zellen wurden durch zwei Passagen durch eine Presse (Ribi von Sorvall) bei 20 000 psi oder durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Einschlußkörper wurden nach Zugabe von 2 % Triton X100 (Endkonzen- tration) durch Zentrifugation (10 min bei 6000 × g) erhalten.
Reduktion und CNBr-Spaltung
Einschlußkörper aus 20 bis 30 1 Kultur wurden in 100 ml 50 mM Tris-HCl (50 mM) vom pH 7,8 mit 2 % SDS und 2 % 2-Mercaptoethanol gelöst (ca. 1 h bei 37 °C). Geringe Mengen unlöslichen Materials wurden durch Zentrifugation in 30 min bei 20 000 × g entfernt. Zum Überstand wurden 2 Volumina Aceton bei 0 °C gegeben. Nach 15 min bei 0 °C wurde ein voluminöses Präzipitat abzentrifugiert (10 min bei 6000 × g), das in 80 ml Ameisensäure (100 %) gelöst wurde. Danach wurden 20 ml H2O hinzugefügt. Unlösliches Material wurde in 1 h bei 50 000 × g entfernt. 1 g CNBr und 200 μl 2-Mercaptoethanol wurden zum Überstand hinzugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Lösung wurde am Rotationsverdamper eingetrocknet. Der Rückstand wurde in 80 ml Guanidinhydrochlorid (6 M) aufgenommen, der pH durch Zugabe von 30 % NaOH auf 7,5 eingestellt. Alternativ kann die Spaltung auch in Gegenwart von 6 M
Guanidinhydrochlorid durchgeführt werden. Nach Spaltung wird gegen 10 1 H2O dialysiert. Das Dialysat wird mit Guanidinhydrochlorid auf die Endkonzentration von 6 M eingestellt.
S-Sulfonierung
Zu der erhaltenen Lösung wurden 1 g Na2 SO3 und 0,25 g Na2 S2 O6 hinzugefügt. Die Mischung wurde 5 h lang bei Raumtemperatur belassen. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt (1 h bei 50 000 × g).
Reinigung von S-sulfoniertem monomeren rPDGF-A
Die oben erhaltene Lösung wurde auf eine mit Sephacryl S200 gefüllte Säule (Dimension 5 cm ∅ × 100 cm) aufgetragen. Als Elutionsmittel diente Guanidinhydrochlorid (4 M) und Tris-HCl (50 mM) vom pH 7,4. Die Flußrate war 160 ml/h. Es wurden Fraktionen von 15 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert. Solche Fraktionen, die Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 17 kd aufwiesen, wurden vereinigt und über Nacht gegen 5 1 H2O dialysiert. Während der Dialyse bildete sich ein Präzipitat, das durch Zugabe von
Ameisensäure zu einer Endkonzentration von 10 % weitgehend' gelöst werden konnte. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt (20 min bei 20 0000 × g). Der Überstand (ca. 150 ml) wurde auf eine HPLC-Säule (2 cm ∅ × 25 cm; Umkehrphase Si-300-polyolbutyl 5 μm) (von Serva) bei einer Flußrate von 2, ml/min aufgetragen. Nach Auftrag der Probe wurde mit ca. 2 Säu lenvolumina gewaschen. rPDGF-A-Monomer wurde durch einen linearen Gradienten von 10 % Ameisensäure/H2O gegen 10 % Ameisen säure/60 % 2-Propanol/30 % H2O während 180 min bei einer
Flußrate von 2,5 ml/min eluiert. rPDGF-A eluierte früh nach 40 bis 50 min. Entsprechende Fraktionen wurden vereinigt und gege 5 1 H2O dialysiert.
Dimerisierung zu rPDGF-AA und Reinigung
S-sulfoniertes monomeres rPDGF-A wurde auf eine Konzentration von 0,4 mg/ml eingestellt. Danach wurde Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 2 M hinzugefügt, danach Glutathion (5 mM) und oxidiertes Glutathion (0,5 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Tris-HCl (gegebenenfalls Tris-Base) auf 7,8 eingestellt (Endkonzentration ca. 50 mM). Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur belassen.
Dimeres rPDGF-AA wurde durch. Ionenaustauscher-Chromatographie gereinigt. Dazu wurde der Dimerisierungsansatz gegen 1 1 Na-Azetat (20 mM; pH 5,1), dialysiert und auf eine Säule, die mit Fractogel TSK SP 650 gefüllt war, aufgetragen. Die Säule war in Na-Azetat (20 mM; pH 5,1) äquilibriert, wobei ein Verhältnis von 5 mg Protein/ml Säulenmaterial gewählt wurde. Nach einem Waschvorgang beim pH 5,1 mit Na-Azetat (20 mM) und NaCl (100 mM) wurde beim pH 5,1 mit einem linearen Gradienten von NaCl (100 mM auf 400 mM ) in Na-Azetat (20 mM) eluiert. Das Gradientenvolumen betrug das zehnfache Säulenvolumen.
Dimere Formen eluierten später als monomere Spezies.
Beispiel 2: PDGF-AB rPDGF-B wurde gemäß P 38 34 079.8 = PCT/US 89/..... oder nach folgender Modifikation gewonnen. Das BamHl-DNA-Fragment (2 kb) aus dem Klon pMVW-2 (Weich et al. 1986), das c-sis enthielt, wurde mit umgekehrter Orientierung im Vektor M13mp18 subkloniert. Der 3' -kodierende Bereich der PDGF-B-Kette wurde mit Smal eliminiert. Zum Eliminieren des 5'-kodierenden Bereichs des c-sis-Gens wurde das Plasmid mit PstI und Sall verdaut, um klebrige 5'- und 3'-Enden für einen Verdau mit Exonukleäse II in bekannter Weise zu bilden (Henikoff). Der zweite Strang wurde durch einen S1-Verdau eliminiert; die einzusetzende DNA wurde mit stumpfen Enden versehen, indem man mit DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment auffüllte. Nach der Ligation und Transformation wurden Kolonien, die zu PDGF-B homologe Sequenzen umfaßten, selektiert und sequenziert, um das Ausmaß des Verdaus durch Exonukleäse III zu bestimmen. Es wurde ein Plasmid isoliert, das das ATG-Startkodon der SpHI-Stelle der
M13mp18-Mehrfachklonierstelle im Leserahmen mit der PDGF-B-Sequenz enthielt. Arg110 in der Sequenz von maturem PDGF wurde mit Hilfe einer gezielten Mutagenese (site directed mutagenesis) in ein Stopkodon gemäß dem BioRad-Protokoll mutiert.
Der Stamm CJ236 (20 ml) wurde mit 3 × 106 Phagen von M13mp18 infiziert, und U-haltige Phagen wurden in bekannter Weise isoliert. Die Einzelstrangphagen-DNA wurde mit dem Primer CGG CCT GTG ACC TGA AGC CCG G hybridisiert, um Arg110 in ein Stopkodon zu mutieren. Der zweite Strang wurde nach Zugabe von 14-Polymerase synthetisiert. Nach dem Sequenzieren wurden mehrere Stämme erhalten, die ein Stopkodon an der Position 110 enthielten. Von einem dieser Stämme wurde RF-DNA hergestellt und teilweise mit SpHI verdaut. Vorstehende 3'-Enden der SpHI-Stelle wurden in stumpfe Enden durch eine T4-Polymerase-Behandlung überführt. Ein Fragment mit 350 Basenpaaren, das die PDGF-B-Sequenz enthielt, wurde durch EcoRI-Verdau erhalten; dieses Fragment wurde in die EcoRI/EcoRV-Stelle von pEX-2 ligiert. Die Her
Stellung von monomerem rPDGF-B erfolgte analog zur Herstellung von rPDGF-A.
Für die Herstellung von rPDGF-AB wurden die monomeren Formen rPDGF-A und rPDGF-B in aquimolaren Mengen gemischt (Endkonzentration 0,4 mg/ml Protein). Für die Dimerisierungsbedingungen und die Aufreinigung vergleiche man Beispiel 1.
Die Renaturierungsausbeute ist deutlich höher als bei rPDGF-AA (vgl. Abb . 4 ) .
Die biologische Aktivität des rPDGF-AB ist vergleichbar mit de des menschlichen Thrombozyten-PDGF und rPDGF-BB aus E. coli (vgl. Abb . 6).
Tabelle 1: Aminosäureanalyse von rPDGF-Isoformen
Die Werte in Klammern bezeichnen die Anzahl von Amino säureresten, die aus bekannten Sequenzen hergeleitet wurden. Die Hydrolyse wurde 24 h lang durchgeführt; Cystein wurde als Cysteinsäure bestimmt. Es wurde keine Korrektur für Abbau oder unvollständige Hydrolyse vorgenommen. Die Werte sind Mittelwerte aus vier Bestimmungen.
AminoMenge in
säure rPDGF-AA rPDGF-BB rPDGF-AB
mol/mol
Asp 14 (14) 16 (16) 15.0 (15)
Un14.3 (16) 14.7 (16) 14.9 (16)
ser 14.3 (16) 6.1 (6) 10.9 (11)
Glu 27.3 (28) 24.6 (24) 26 (26)
Pro 16.7 (16) 12.3 (14) 15.4 (14)
Gly 3.1 (2) 3.5 (2) 4.1 (2)
Ala 12.1 (12) 14.6 (14) 13.1 (13)
Cys 15.5 (16) 16.3 (16) 13.1 (16)
Val 27.3 (30) 19.6 (24) 25.0 (27)
IIe 8.2 (8) 10.4 (12) 9.3 (10)
Leu 10.6 (10) 11.9 (12) 10.9 (11)
Tyr 4.4 (6) 03 (0) 2.1 (3)
Phe 1.9 (2) 5.4 (6) 3.3 (4)
Lys 17.2 (18) 12.7 (14) 15.0 (16)
His 5.4 (6) 1.9 (2) 3.7 (4)
Arg 16.8 (18) 20.7 (24) 19.1 (21)
Tabelle 2: NH2 -Terminus-Sequenzänalysen von rPDGF-AB
Es wurden 20 μg rPDGF-AB für eine Gas/Flüssig-Sequenzierung verwendet.
Zyklus ermit telte Sequenz am NH2-Terminns
Aminosäure Å-Ket te B-Kette
(pmol)
1 S I S I
2 I A I A
3 E E E E
4 E - E C
5 A K A K
6 V(165) T(195) V T
7 P(193) R (98) P R
8 A (220) T (210) A T
9 V (88) E(150) V E
10 - V C V
Literatur
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