Gène reσorabinant défectif et activable par un transactivateur.
L'invention concerne des moyens (produits et procédés) applicables à la détection in vitro de la E 45 présence d'un retrovirus infectieux dans un échantillon biologique, notamment dans un prélèvement provenant d'un patient ou porteur présumé du retrovirus. Une application préférée de l'invention s'adresse à la détection d'un virus du SIDA (HIV) ou de séquences nucléiques de ce retrovirus dans de tels échantillons biologiques.
Dans une autre variante d'application, l'invention a pour but de permettre l'étude de l'influence d'agents extérieurs, notamment de principes actifs de médicaments susceptibles d'inhiber, à tout le moins moduler, le ca¬ ractère infectieux in vivo du retrovirus étudié.
La mise au point d'un système de détection directe et ultrasensible plus particulièrement des virus HIV de¬ vient urgente. Les tests de séro-positivité mettant en oeuvre la détection d'anticorps contre le retrovirus HIV chez les porteurs éventuels peuvent s'avérer insuffisants, compte tenu de l'observation qui a été faite que les anti¬ corps recherchés n'apparaissent souvent chez le sujet in¬ fecté par le virus HIV qu'après une durée d'incubation de 12 à 18 mois. D'autres tests actuellement utilisés, tels que la détection et le dosage de l'activité réverse transcriptase du virus éventuellement présent dans les prélèvements étudiés ne présentent pas toujours le degré de sensibilité voulue pour conclure utilement à l'infec¬ tion ou non du sujet dont provenait le prélèvement.
L'invention a pour but de remédier au moins en grande partie aux inconvénients des tests existant, n-
tamment de fournir des moyens et des procédés extrêmement sensibles de détection d'une infection retrovirale et ce même à un stade très précoce de l'infection.
En particulier, un premier but de l'invention est de permettre la détection, in vitro, de l'existence ou non d'une infection retrovirale chez un hôte (humain ou ani¬ mal) sensible à ladite infection retrovirale, et ce même à un stade très précoce de l'évolution de cette infection.
Un autre but de 1'invention est 1'étude de 1'in¬ fluence d'agents extérieurs sur la capacité d'infection des lignées cellulaires par ce retrovirus provenant de cet hôte (ou apparentées à celles-ci), par exemple de princi¬ pes actifs de médicaments visant à inhiber le caractère infectieux in vivo de ce retrovirus. Mais ces agents exté¬ rieurs peuvent aussi consister en d'autres facteurs, sus¬ ceptibles au contraire d'accélérer l'infection retrovi¬ rale.
D'autres buts encore de 1'invention sont de per¬ mettre la détection de la capacité d'un retrovirus déter¬ miné à infecter une lignée cellulaire donnée, ou l'iden¬ tification de ceux des clones cellulaires qui, au sein d'une culture cellulaire, sont infectables par ce rétro- virus ou encore 1'étude in vitro de la capacité poten¬ tielle d'agents divers, parmi lesquels des principes actifs de médicaments potentiels d'affecter l'infection retrovirale de cellules sensibles exposées au retrovirus étudié.
L'invention met à profit la capacité que possèdent des retrovirus recombinants (ou des gènes recombinants issus de ces retrovirus) contenant un gène exogène dont l'expression est recherchée, à s'incorporer dans le génome de cellules individuelles infectables par le retrovirus sauvage correspondant et à permettre l'expression du gène exogène, le cas échéant dans des conditions d'activation
appropriées, dans les cellules individuelles infectées auxquelles le recombinant rétroviral a été incorporé, ce gène exogène étant trans issible d'une génération cellu¬ laire à l'autre.
L'invention met en outre à profit le fait que l'activité genique de plusieurs retrovirus, notamment de retrovirus humains et de mammifères supérieurs (HTLV, BLV) , dépend en général d'une trans-activation (ou trans¬ stabilisation) par une protéine virale codée par un gène endogène faisant partie du gène rétroviral. Par exemple dans le cas des retrovirus HIV, l'activité genique du virus dépend d'une trans-activation (ou trans¬ stabilisation) par le gène HIV-tat (également connu sous la dénomination "gène Q"), l'une au moins des cibles de la protéine codée par le gène tat étant constituée par une séquence contenue dans la région R, elle-même normalement dans la région LTR du génome rétroviral. La trans- activation (ou trans-stabilisation) du retrovirus sous le contrôle du gène tat est une condition essentielle à une réplication efficace du retrovirus, en particulier au niveau de la transcription des gènes codant pour les protéines σaσ. env et pol. L'absence de trans-activation n'est pas un obstacle total à la capacité de réplication virale. Néanmoins il peut être estimé que l'efficacité de réplication sous l'effet de cette trans-activation est de 500 à 1 000 fois supérieure à celle d'un retrovirus dé- fectif au niveau de la région tat.
Le procédé de détection de l'invention d'une in¬ fection retrovirale repose sur l'idée d'assurer dans des cellules contenant déjà une séquence genique ou un pro¬ virus défectif au niveau de la région tat (ou de la région analogue s'agissant d'un autre retrovirus), la susdite trans-activation ou trans-stabilisation par un apport ex¬ térieur (en "trans") d'un trans-activateur codé par la ré¬ gion tat du génome rétroviral du retrovirus éventuellement
présent dans 1'échantillon ou prélèvement biologique à étudier. Pour parvenir à cette fin, l'invention fournit également des moyens permettant la mise en oeuvre de ce procédé et la révélation de la trans-activation ainsi in¬ duite dans les cellules susdites, dès lors qu'elles ont été mises au contact de 1'échantillon à étudier et in¬ fectées par le retrovirus éventuellement présent dans cet échantillon.
L'invention concerne plus particulièrement un gène recombinant incorporable à des lignées cellulaires infec¬ tables par le retrovirus dont la présence est recherchée, ce gène recombinant étant lui-même activable par un trans- activateur rétroviral du virus recherché, et plus particu¬ lièrement caractérisée : en ce qu'il comporte une séquence recombinante résultant de la fusion d'une séquence activable par ce trans-activâteur, cette séquence étant dérivée du génome du retrovirus homologue et fusionnée à un marqueur hété¬ rologue, ladite séquence recombinante étant elle-même placée sous le contrôle d'un promoteur présent dans le gène recombinant et permettant 1'expression du marqueur dans un hôte cellulaire sensible, infectable par le re¬ trovirus sauvage correspondant ; en ce que ce gène recombinant est dépourvu de l'essentiel de la séquence codant pour le susdit trans- activateur rétroviral.
L'invention concerne donc aussi les cellules aux¬ quelles le susdit gène recombinant activable a été incor¬ poré, que ce soit par transfection ou infection de ces cellules avec un vecteur contenant le susdit gène recom¬ binant activable dans des conditions permettant 1'expres¬ sion d'un marqueur hétérologue au sein de cette cellule ou de ces cellules.
Avantageusement dans une forme de réalisation
préférée de ces cellules, le gène recombinant est incor¬ poré à leur propre patrimoine génétique.
Dans une forme préférée du gène recombinant selon l'invention, le gène recombinant contient un ADN corres¬ pondant essentiellement à la totalité du génome d'un re¬ trovirus comportant un gène activable par un trans- activateur rétroviral placé sous le contrôle d'un promo¬ teur, cet ADN étant cependant, d'une part, dépourvu de la séquence codant pour le trans-activateur rétroviral et, d'autre part, pourvu d'un marqueur hétérologue placé sous
5• le contrôle du promoteur, en 1'occurence le LTR , norma¬ lement associé aux séquences codant pour les protéines gag, pol et env.
Les séquences codant pour les protéines gag, env, pol peuvent être délétées au moins en partie. En d'autres termes, et plus particulièrement dans le cas où le rétro- virus concerné est un virus HIV, le gène recombinant cor¬ respondant contient la région R d'un retrovirus HIV et est dépourvu de la région tat d'un retrovirus HIV.
L'invention concerne plus particulièrement un retrovirus recombinant défectif dérivé d'un retrovirus sauvage ou natif, contenant les éléments agissant en "cis" pour activer la transcription des séquences codant pour les protéines virales sous l'effet d'un transactivateur codant une autre région du génome rétroviral, ainsi que les parties agissant en "cis" du virus sauvage et assurant normalement l'empaquetage du retrovirus, sa réverse- transcription en une molécule ADN et son intégration dans le génome de la cellule hôte, ainsi que le site de polyadénylation de cet ARN, ce retrovirus recombinant étant plus particulièrement caractérisé en ce qu'il com¬ porte : une délétion d'au moins une partie sinon de la totalité de la susdite région codant pour le susdit transactivateur du virus sauvage ou natif, la partie
délétée étant suffisamment importante pour que soit in terdite la production endogène, dans la cellule-hôte, d'un polypeptide ayant la propriété d'activer les susdits élé¬ ments activateurs et une séquence codant pour un marqueur de cellules-hôtes infectées par le retrovirus recombinant défectif ainsi constitué, soit à l'état incorporé à la région retrovirale comportant normalement les gènes gag, pol et env, soit en remplacement de tout ou partie de cette région.
La mise en contact d'une cellule hôte ainsi in¬ fectée avec une préparation de virus sauvage ou natif induit alors l'expression des éléments activateurs, grâce à l'apport extérieur du trans-activateur. Lorsque le marqueur code pour une enzyme agissant sur un substrat colorable, les cellules marquées peuvent être identifiées grâce à leur coloration sélective.
Le promoteur sous le contrôle duquel est placée la séquence activable par le trans-activateur est un promo¬ teur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire infectable. La séquence genique peut être limitée pour 1'essentiel à la séquence codant pour le marqueur, placée sous le contrôle direct de la région U3 du LTR 5' du retrovirus. En variante encore, 1'une ou l'autre des régions LTR, ou les deux à la fois, sont dé¬ pourvues de promoteu (s) , la séquence genique codant pour le marqueur étant alors sous le contrôle d'un promoteur distinct remplaçant la région U3 de façon à ce que la transcription se fasse toujours à partir de la région R transactivatrice.
Par exemple un retrovirus recombinant défectif conforme à l'invention, dérivé de HIV, comprend successi¬ vement : la région R du LTR 5' du retrovirus sauvage correspon- dant, précédée de la région U3 du LTR ou d'un promoteur
distinct substitué au précédent, cette région R étant, le cas échéant, suivie de la région d'empaquetage ; le site d'initiation de l'ARN correspondant aux pro¬ téines virales normalement codées par les gènes gag, pol et env ; la séquence codant pour le marqueur incorporée à la région retrovirale comportant les gènes gag, pol et env, ou substituée à tout ou partie de cette région rétro- virale,
- une délétion ou une mutation dans la région tat, et la région LTR 3 ' , qui coïncide avec le site de polyadé- nylation de l'ARN.
Les séquences géniques recombinantes ou rétro- vecteurs défectifs recombinants selon 1'invention peuvent être fabriqués par des techniques classiques en matière de génie génétique, notamment par recombinaison in vitro des éléments constitutifs caractéristiques entrant dans la sé¬ quence genique recombinante ou le retrovirus défectif re¬ combinant tels qu'ils ont été définis ci-dessus. A cet égard, l'invention concerne également les vecteurs re¬ combinants contenant l'ADN du virus recombinant défectif sus-défini, incorporé à tout vecteur permettant l'amplifi¬ cation de l'ensemble dans un hôte cellulaire compétent, par exemple un plasmide bactérien.
L'invention concerne également les cellules ou lignées cellulaires infectables par le retrovirus sauvage ou natif correspondant au retrovirus dont certaines par¬ ties interviennent dans la séquence des susdits retrovirus défectifs et séquences géniques, ces cellules étant elles- mêmes modifiées par incorporation dans leur propre patri¬ moine génétique desdites séquences géniques ou de provirus défectifs recombinants correspondant auxdits retrovirus défectifs.
Ces cellules indicatrices peuvent être produites
par tout procédé classique, notamment par infection de cellules sensibles à l'infection par un retrovirus défec¬ tif recombinant produit in vitro ou par transformation de ces mêmes cellules par un vecteur contenant la séquence genique recombinante ou la totalité du génome du rétro- virus défectif recombinant.
Les observations suivantes peuvent être faites quant aux divers éléments constitutifs de la séquence ge¬ nique recombinante ou du retrovirus défectif recσmbinant selon l'invention.
Le marqueur lui-même est avantageusement constitué par une enzyme produite dans les cellules transformées par le gène ou virus recombinant défectif, pour lui conférer une coloration particulière ou la capacité d'agir sur un substrat pénétrant dans les cellules transformées ou infectées, notamment de subir une modification de colora¬ tion ou plus généralement de son spectre d'absorption des radiations lumineuses, sous 1'action de cette enzyme. A titre d'exemples d'enzymes codées par la séquence codante, contenue dans la séquence genique mise en oeuvre dans l'invention, on mentionnera la β-galactosidase, la β-glucuronidase ou la luciférase. Il va de soi que l'on peut avoir recours à toute autre séquence codante, dès lors qu'elle code pour une protéine susceptible de jouer le rôle de marqueur permettant de repérer aisément les cellules transformées.
L'utilisation de tels types de marqueurs dans le cadre de l'invention est particulièrement avantageux, en tant qu'elle permet une observation individualisée des cellules auxquelles les virus ou provirus défectifs recombinants sus-définis ont été incorporés, notamment à l'occasion de la révélation de l'expression du marqueur, par exemple dans les conditions décrites plus loin.
Il est avantageux, pour obtenir un marquage sen¬ sible, d'utiliser le marqueur qui sera localisé dans un
compartiment cellulaire aisément identifiable des cellules étudiées, l'ensemble formant la séquence genique sus- définie, elle-même placée sous le contrôle de la région LTR du retrovirus concerné. Une séquence genique avan¬ tageuse comprend la séquence "nls-Lac Z" décrite par Kalderon, D. et al (1984), Cell 39; 499-509, et contenant une région signal de localisation de l'antigène T (nls) du virus de singe SV40 fusionnée au gène Lac Z, cette séquen¬ ce nls-LacZ étant, par exemple, placée sous le contrôle du LTR 5 ' du HIV. La protéine de fusion correspondante nls-β-Gal est enzymatiquement active et reste associée avec le noyau des cellules auxquelles une telle séquence genique est incorporée, plus particulièrement avec les membranes des noyaux cellulaires desdites cellules, plutôt que de s'accumuler dans le nucléoplas e. On obtient ainsi une sensibilité maximale. Quand la lignée indicatrice est infectée par le virus sauvage, l'expression du gène LacZ peut être facilement détectée histochimiquement au niveau de la cellule. A chaque cellule de la lignée indicatrice
LacZ infectée correspond alors une cellule βgal décelable par marquage histochimique in situ.
Avantageusement, le promoteur sous le contrôle duquel est placée la séquence codant pour le marqueur est un promoteur faible ou affaibli. En particulier, un pro-
5 ' moteur affaibli dérivé de la séquence du LTR de virus
HIV est constitué par ce LTR lui-même, partiellement dé- lété. En particulier, ce promoteur peut être délété d'une partie de la région U3, sans pour autant supprimer la to¬ talité de l'activité promotrice de la région U3.
En effet, comme cela a été indiqué plus haut, la délétion de la région tat ne forme pas un obstacle total à la réplication du virus, cas dans lequel la protéine mar¬ queur peut quelquefois être légèrement exprimée dans une lignée de cellules infectées par le retrovirus défectif. L'affaiblissement du promoteur a pour but de rendre encore
plus faible l'expression du marqueur en l'absence de con¬ tact entre ces lignées cellulaires et un milieu extérieur contenant le retrovirus sauvage. Il ne s'agit là que d'un perfectionnement non nécessaire, car même avec un promo¬ teur non délété le degré d'expression du marqueur est à ce point plus élevé lorsque ces cellules sont mises au con¬ tact d'un apport en retrovirus sauvage extérieur, que dans le cas où elle s'en trouve protégée que la confusion entre les degrés de marquage observables dans les deux cas est pratiquement impossible.
Le procédé selon l'invention pour la détection d'une infection retrovirale dans un échantillon contenant des cellules éventuellement infectées (tel qu'un prélève¬ ment de sérum humain contenant des lymphocytes T4, s'agis¬ sant d'apprécier s'il est infecté par un virus HIV) ou le milieu, tel qu'un surnageant de culture, avec lequel ces cellules avaient auparavant été en contact, est caracté¬ risé par les étapes que constituent : la mise en contact de cet échantillon avec les cellules contenant la séquence genique selon l'invention, notamment un provirus défectif susceptible d'être lui-même transac¬ tivé par l'apport extérieur en retrovirus éventuellement contenu dans l'échantillon, et ce dans des conditions (notamment de température et de durée d'incubation appro¬ priées) permettant l'infection desdites cellules par le retrovirus éventuellement présent dans l'échantillon, et - la détection de l'infection éventuelle desdites cellules par révélation de l'expression du marqueur résultant de la transactivation de la séquence genique ou du provirus dé¬ fectif présent dans ces dernières cellules, à l'aide d'un révélateur approprié.
On tel procédé permet la détection très sensible, dans des délais très rapides, de la présence d'une infec¬ tion retrovirale dans l'échantillon cellulaire initial qui était à tester, et même le dosage du degré de l'infection
retrovirale dans l'échantillon testé, au moment où le test a été réalisé.
On appréciera que ce test permet aussi d'étudier l'évolution de l'infection chez un patient atteint de la maladie induite par le retrovirus sauvage, s'il est répété dans le temps, sur des prélèvements de sérums, de tout autre fluide ou tissu biologique infecté provenant de ce patient.
Ce procédé peut aussi être mis en oeuvre pour l'étude de l'efficacité éventuelle d'un principe actif de médicament vis-à-vis de l'interaction entre le retrovirus considéré et des cellules sensibles, notamment lorsque la susdite mise en contact sus-indiquée est opérée en pré¬ sence de ce principe actif. On apprécie que le test ainsi modifié permet à la fois de sélectionner le principe actif de médicament qui pourrait se révéler le plus actif, de déterminer les doses qui pourraient être efficaces pour traiter le patient ayant fourni le prélèvement, ces doses efficaces découlant notamment de celles qui, dans la mise en oeuvre du test sus-indiqué, n'autorisent pas l'infec¬ tion des cellules contenant le retrovirus ou provirus recombinant défectif au contact de prélèvements provenant du malade à traiter ou le surnageant du milieu dans lequel cet échantillon cellulaire avait été maintenu.
Plus généralement, l'invention permet l'étude in vitro de l'influence de facteurs susceptibles d'interférer avec l'infection virale, le procédé sus-défini comprenant alors la mise en contact des cellules contenant la séquen¬ ce genique ou le provirus recombinant selon l'invention, en présence de ce facteur, avec des quantités déterminées de retrovirus extérieur et la détection des doses de fac¬ teurs, notamment de principe actif de médicament, qui pré¬ viennent l'infection retrovirale, détectable par 1 'activa¬ tion du marqueur, desdites cellules.
L'invention concerne donc également des néces¬ saires ou kits permettant la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être décrit, ces kits comportant :
- des cellules sensibles modifiées contenant le retrovirus ou provirus recombinant défectif sus-défini, des moyens de révélation de l'expression du marqueur, notamment lorsque le marqueur est une enzyme, un substrat spécifique de l'enzyme,
- éventuellement les tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la mise en contact, avec l'échantillon biologique, des cellules contenant la séquence genique ou le retrovirus recombinant défectif à étudier et 1'incuba¬ tion du mélange de réaction dans des conditions permettant l'infection éventuelle de ces cellules au contact de l'é¬ chantillon étudié,
- le cas échéant des milieux de conservation ou de culture desdites cellules saines et modifiées.
Avantageusement les cellules indicatrices utili¬ sées dans ces kits sont constituées par des lignées cel¬ lulaires "immortalisées" infectables par le retrovirus recombinant correspondant. Par exemple, dans le cas d'un kit destiné à la détection d'un virus HIV, lesdites cel¬ lules sensibles modifiées et les cellules saines appar¬ tiendraient toutes deux à des lignées cellulaires du type CEM, HUT, etc.
Dans les exemples indiqués plus loin, les possibi¬ lités de l'invention sont illustrées en rapport avec la production d'un virus recombinant défectif dérivé d'un virus HIV-1.
Il est donc tout à fait clair que 1'invention s'adresse à la détection de tout type de retrovirus éven¬ tuellement infectieux vis-à-vis de cultures cellulaires déterminées et présentant les caractéristiques essen¬ tielles de structure dont il a été question plus haut. En
particulier, elle s'applique à la fabrication de rétro- virus recombinants défectifs permettant, dans les condi¬ tions qui ont été indiquées, la détection du pouvoir infectieux (ou la modulation du pouvoir infectieux) des retrovirus connus sous les dénominations HTLV I, HTLV II, HIV I (ou encore LAV ou HTLV III), HIV II (ou LAV II), HTLV IV. Il en est encore de même pour de nombreux rétro- virus infectieux à l'égard de l'animal. A titre d'exemple, on mentionnera les retrovirus leucémiques des bovins (Bovine Leukemia Viruses) et des félins (FeLV).
Des caractéristiques supplémentaires de 1'inven¬ tion apparaîtront encore au cours de la description d'exemples de réalisation, appliquée à la production de retrovirus recombinants défectifs conformes à l'invention, dérivé de HIV-1.
D'autres buts de l'invention et les moyens qui permettent de les atteindre résulteront encore de la des¬ cription de certains des modes de réalisation présentés, soit à titre préféré, soit à titre d'illustration des possibilités offertes par l'invention pour l'étude de tous les aspects des diverses interactions possibles entre des retrovirus sauvages déterminés et des cellules indicatri¬ ces infectables par ces retrovirus et de la modulation de ces interactions.
Il sera dans ce qui suit fait référence aux fi¬ gures dans lesquelles : les figures 1a et 1b font apparaître de façon schématique les caractéristiques de séquences géniques recombinantes conformes à 1'invention ; les figures 2a, 2b et 2c sont des représenta¬ tions schématiques d'exemples de retrovirus défectifs recombinants conformes à l'invention.
Les figures 1a et 1b sont illustratives de deux gènes recombinants conformes à l'invention, tous deux dépourvus de la région tat. Le gène recombinant de la
figure 1b se distingue de celui de la figure 1a par une délétion partielle du LTR 5' . Ces gènes, incorpores dans le génome de cellules sensibles à l'infection par HIV, sont fonctionnels lorsque les cellules en cause sont placées au contact de source de virus HIV sauvage.
EXEMPLES : test de détection d'un retrovirus sauvage de type HIV par trans-activation d'une copie défective inté¬ grée dans une cellule infectable
L'ADN recombinant dont l'expression doit être am¬ plifiée par la présence du produit du gène tat externe possède les éléments suivants :
1* un promoteur (pro dans la figure 2a) permettant la transcription d'une séquence susceptible d'être ex¬ primée, placée sous son contrôle ;
2* la région R de HIV-1 jusqu'au site Hind III (nucléotide n* 83 selon WRIGHT et al., Science 234. p. 988 ou nucléotide n* 77 dans CSH, RNA tumor virus, tome 2, p. 1 104, 1985) comme démontré dans l'article de WRIGHT et al., Science 234, p. 988. Ce fragment contient en effet les éléments qui confèrent en cis la trans-activation par les produits du gène tat ,-
3* un gène marqueur tel que par exemple le fragment de 3.3 kb du gène nls LacZ tel que décrit dans l'article de KALDERON et SMITH ;
4e un signal de polyadénylation de 1'ARN. Cette structure est schématisée en figure 2a. On autre exemple particulier est donné en figure 2b dans laquelle la séquence recombinante comprend le LTR complet d'un retrovirus HIV-1 comportant donc le promoteur (U3), la région cis (R) nécessaire à la trans-activation, fusionnée par recombinaison génétique avec un fragment nls LacZ extrait à l'aide d'enzymes de restriction du vecteur L7RHβgal décrit dans l'article de KALDERON et SMITH avant d'être placé par ligation in vitro sous la dépendance de la région R du LTR et relié, également par ligation, au
signal de polyadénylation du virus HBV.
On autre exemple particulier est donné dans la fi¬ gure 2c où 1'ADN du provirus infectieux décrit dans l'ar¬ ticle de M. MARTIN et al. (Journal of Virol. , vol. 59, p. 284-291) a été fragmenté par les enzymes de restriction Sph1 (nucléotide n* 989 de la séquence publiée dans RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor 1985) et BamHI (nucléo¬ tide 8 032, même référence) comme indiqué à la figure 2c et où le gène nls LacZ (fragment Sali BamHI du plasmide pMMuLVnls LacZ) a été mis à la place de gag, pol et env.
Ces fragments sont coupés, isolés et lignés comme indiqué dans MANIATIS.
Les plasmides décrits dans les figures 1a, 1b ou 2a, 2b, 2c peuvent être introduits, de préférence par co- transfection, en utilisant les méthodes habituelles dé¬ crites par exemple dans GRAHAM et VANDER Eb 19873, Virology £2, 456 et NICOLAS et BERG, CHS, Cell prolifé¬ ration, LQ, 469, dans des cellules infectables par le retrovirus HIV sauvage, telles que les lignées de cellules Leu 30KT4 auxquelles se réfère l'article de MALCOLM MARTIN ou CEM (CNCM 1-416 et CNCM 1-417) ou SupTI.
Quel que soit le gène recombinant introduit, il ne conduira qu'à une expression minimale du gène LacZ dans les cellules dans lesquelles il a été introduit. One telle cellule (formant la cellule indicatrice) comporte une ou plusieurs copies de la construction LacZ. Ces cellules indicatrices peuvent alors être mises en oeuvre dans un test de détection dans un échantillon biologique d'un virus sauvage. L'infection d'une cellule indicatrice entraînera 1'activation (en trans) du gène LacZ et, par conséquent, son expression.
Cette activation peut être mise en évidence par l'essai histochimique basé par exemple sur l'utilisation de X-gal selon la technique décrite par SANES et al. Embo J. 1986) qui permet une détection in situ de l'activité
β-galactosidase. A chaque événement d'infection par un virus sauvage correspondra une cellule βgal détectable au plus 48 heures plus tard.
Les virus présents dans les humeurs ou cellules de malade ou même dans les embryons humains peuvent ainsi être détectés de façon très rapide, et ce à un stade très précoce de l'infection retrovirale.