JPH05227996A - 生長する哺乳動物細胞における遺伝子の発現についての生物発光アツセイ - Google Patents
生長する哺乳動物細胞における遺伝子の発現についての生物発光アツセイInfo
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- JPH05227996A JPH05227996A JP3177297A JP17729791A JPH05227996A JP H05227996 A JPH05227996 A JP H05227996A JP 3177297 A JP3177297 A JP 3177297A JP 17729791 A JP17729791 A JP 17729791A JP H05227996 A JPH05227996 A JP H05227996A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＨＩＶの感染の診断方法が提供され、この方
法はテスター細胞の使用に基き、前記細胞は遺伝子工学
により調製され、酵素、例えば、ルシフェラーゼを発現
することができ、前記酵素はＨＩＶ粒子および／または
ＨＩＶ−ＴＡＴの存在下に、光を放射する反応を触媒す
る。この方法に従い、テスター細胞を血液試料またはそ
の分画とインキュベーションし、そして生細胞または抽
出物中のバックグラウンドのレベルより上の、ＨＩＶの
感染を示す光を検出する。 【効果】 本発明によりＨＩＶの感染を診断することが
できる。
法はテスター細胞の使用に基き、前記細胞は遺伝子工学
により調製され、酵素、例えば、ルシフェラーゼを発現
することができ、前記酵素はＨＩＶ粒子および／または
ＨＩＶ−ＴＡＴの存在下に、光を放射する反応を触媒す
る。この方法に従い、テスター細胞を血液試料またはそ
の分画とインキュベーションし、そして生細胞または抽
出物中のバックグラウンドのレベルより上の、ＨＩＶの
感染を示す光を検出する。 【効果】 本発明によりＨＩＶの感染を診断することが
できる。
Description
【０００１】本発明は、ある種の物質の細胞または媒質
の中の存在を検出する生物発光アッセイ方法、キットお
よび系に関する。本発明によれば、このような物質に対
して暴露したとき、光を放射することができる、遺伝子
操作した細胞を利用する。
の中の存在を検出する生物発光アッセイ方法、キットお
よび系に関する。本発明によれば、このような物質に対
して暴露したとき、光を放射することができる、遺伝子
操作した細胞を利用する。
【０００２】以下の説明において、時々種々の先行技術
の文献をこの明細書の終わりに記載される参考文献のリ
ストからのそれらの番号を示すことによって言及する。
の文献をこの明細書の終わりに記載される参考文献のリ
ストからのそれらの番号を示すことによって言及する。
【０００３】遺伝子の発現についての生物発光アッセ
イ、とくに蛍の酵素ルシフェラーゼを利用するアッセイ
は記載された（概観について、参照１）。しかしなが
ら、生きている生長する哺乳動物細胞における遺伝子の
発現を監視するために適用するとき、これらのアッセイ
はたいていの場合において細胞の破壊に導く。さらに、
細胞の生存能力が維持された場合でさえ、このようなア
ッセイは不感受性であることが証明された。
イ、とくに蛍の酵素ルシフェラーゼを利用するアッセイ
は記載された（概観について、参照１）。しかしなが
ら、生きている生長する哺乳動物細胞における遺伝子の
発現を監視するために適用するとき、これらのアッセイ
はたいていの場合において細胞の破壊に導く。さらに、
細胞の生存能力が維持された場合でさえ、このようなア
ッセイは不感受性であることが証明された。
【０００４】したがって、一般に、生物発光は完全な哺
乳動物細胞におけるアッセイ系として使用することがで
きないと信じられた。
乳動物細胞におけるアッセイ系として使用することがで
きないと信じられた。
【０００５】本発明の目的は、先行技術の前述の欠点を
克服する、生きている生長する哺乳動物細胞における遺
伝子の発現についての生物発光アッセイを提供すること
である。
克服する、生きている生長する哺乳動物細胞における遺
伝子の発現についての生物発光アッセイを提供すること
である。
【０００６】よりとくに、本発明の目的は、細胞中の遺
伝子の活性化因子の存在を検出し、ここで前記物質の存
在下に光を発生することができる遺伝子操作された細胞
を使用するアッセイを提供することである。
伝子の活性化因子の存在を検出し、ここで前記物質の存
在下に光を発生することができる遺伝子操作された細胞
を使用するアッセイを提供することである。
【０００７】本発明の他の目的は、ある因子の存在下に
光を発生することができる遺伝子操作された細胞を使用
することによって、媒質中の前記因子の存在を検出する
方法を提供することである。
光を発生することができる遺伝子操作された細胞を使用
することによって、媒質中の前記因子の存在を検出する
方法を提供することである。
【０００８】本発明の特定の実施態様の他の目的は、ウ
イルスの感染を有することが疑われる個体の体液中のウ
イルス感染の発生を決定するための生物発光アッセイを
提供することである。
イルスの感染を有することが疑われる個体の体液中のウ
イルス感染の発生を決定するための生物発光アッセイを
提供することである。
【０００９】本発明の他の特定の実施態様の目的は、外
部の細胞膜上のレセプターに結合するリガンドの生物学
的流体中の存在またはレベルを決定する方法を提供する
ことである。
部の細胞膜上のレセプターに結合するリガンドの生物学
的流体中の存在またはレベルを決定する方法を提供する
ことである。
【００１０】本発明によれば、先行技術の一般的信念と
反対に、生物発光を事実生長する哺乳動物の細胞におい
てアッセイとして使用することができることが、驚くべ
きことには、発見された。
反対に、生物発光を事実生長する哺乳動物の細胞におい
てアッセイとして使用することができることが、驚くべ
きことには、発見された。
【００１１】本発明の方法に従い、哺乳動物の細胞は一
般にＤＮＡ構成体で遺伝子操作され、ここでＤＮＡ構成
体はプロモーター配列およびホタルのルシフェラーゼの
遺伝情報を指定するｌｕｃ遺伝子からなる。本発明に従
い使用する遺伝子操作した細胞は、ルシフェラーゼの基
質であるルシフェリンを取り囲む媒質から吸収するそれ
らの能力について、およびさらに高いレベルの遺伝子の
発現を行う、すなわち、遺伝子発現産生物を高いレベル
で産生するそれらの能力について選択された細胞であ
る。細胞中の前記プロモーターのインデューサー物質の
存在下に、ルシフェラーゼ酵素は発現されそして、取り
囲む媒質中のルシフェリンの存在を包含する、適当な条
件下に、光は発生される。
般にＤＮＡ構成体で遺伝子操作され、ここでＤＮＡ構成
体はプロモーター配列およびホタルのルシフェラーゼの
遺伝情報を指定するｌｕｃ遺伝子からなる。本発明に従
い使用する遺伝子操作した細胞は、ルシフェラーゼの基
質であるルシフェリンを取り囲む媒質から吸収するそれ
らの能力について、およびさらに高いレベルの遺伝子の
発現を行う、すなわち、遺伝子発現産生物を高いレベル
で産生するそれらの能力について選択された細胞であ
る。細胞中の前記プロモーターのインデューサー物質の
存在下に、ルシフェラーゼ酵素は発現されそして、取り
囲む媒質中のルシフェリンの存在を包含する、適当な条
件下に、光は発生される。
【００１２】本発明の方法により検出することができる
インデューサー物質は、外部の媒質中で由来するもの、
例えば、ヒトＴ白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩおよびＩ
ＩのＴＡＸタンパク質またはヒトの免疫不全症のウイル
ス（ＨＩＶ）のＴＡＴであることができる、それは細胞
中で発現される物質、例えば、ウイルスのインデューサ
ー物質、例えば、ウイルスによるその感染後に細胞中で
発現されるＴＡＸまたはＴＡＴであるか、あるいはそれ
は細胞の遺伝子のウイルスの活性化の結果としてまたは
外部の膜表面上のレセプターへのリガンドの結合の結果
として、細胞中で発現された第２メッセンジャー、例え
ば、細胞の遺伝子産生物であることができる。各場合に
おいて、当業者は容易に理解するように、前記プロモー
ターはそれぞれのインデューサー物質により誘発可能な
ものであろう。
インデューサー物質は、外部の媒質中で由来するもの、
例えば、ヒトＴ白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩおよびＩ
ＩのＴＡＸタンパク質またはヒトの免疫不全症のウイル
ス（ＨＩＶ）のＴＡＴであることができる、それは細胞
中で発現される物質、例えば、ウイルスのインデューサ
ー物質、例えば、ウイルスによるその感染後に細胞中で
発現されるＴＡＸまたはＴＡＴであるか、あるいはそれ
は細胞の遺伝子のウイルスの活性化の結果としてまたは
外部の膜表面上のレセプターへのリガンドの結合の結果
として、細胞中で発現された第２メッセンジャー、例え
ば、細胞の遺伝子産生物であることができる。各場合に
おいて、当業者は容易に理解するように、前記プロモー
ターはそれぞれのインデューサー物質により誘発可能な
ものであろう。
【００１３】こうして、本発明によれば、工程： ａ）テスター細胞を準備し、前記テスター細胞はｉ）イ
ンデューサー物質により誘発可能なプロモーターおよび
前記プロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子から
なる発現ベクターを構成し、前記発現ベクターは前記イ
ンデューサー物質の不存在下に低いレベルでそしてその
存在下に高いレベルでｌｕｃ遺伝子を発現することがで
き、そしてｉｉ）取り囲む媒質からルシフェリンを吸収
しそして高いレベルで遺伝子を発現することができる細
胞を選択し、そしてこれらの細胞を前記発現ベクターで
トランスフェクションすることによって調製され、 ｂ）テスター細胞をｌｕｃ遺伝子の発現が光を発生する
条件下に培養し、そして ｃ）適当な手段により光の発生を監視し、あるレベルよ
り上の光の発生は前記細胞中の前記インデューサー物質
の存在を示す、からなる、細胞中のインデューサー物質
の存在を検出する方法が提供される。
ンデューサー物質により誘発可能なプロモーターおよび
前記プロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子から
なる発現ベクターを構成し、前記発現ベクターは前記イ
ンデューサー物質の不存在下に低いレベルでそしてその
存在下に高いレベルでｌｕｃ遺伝子を発現することがで
き、そしてｉｉ）取り囲む媒質からルシフェリンを吸収
しそして高いレベルで遺伝子を発現することができる細
胞を選択し、そしてこれらの細胞を前記発現ベクターで
トランスフェクションすることによって調製され、 ｂ）テスター細胞をｌｕｃ遺伝子の発現が光を発生する
条件下に培養し、そして ｃ）適当な手段により光の発生を監視し、あるレベルよ
り上の光の発生は前記細胞中の前記インデューサー物質
の存在を示す、からなる、細胞中のインデューサー物質
の存在を検出する方法が提供される。
【００１４】本発明は、また、前述の方法において有用
な発現ベクターおよびテスター細胞およびそれらの調製
方法を提供する。
な発現ベクターおよびテスター細胞およびそれらの調製
方法を提供する。
【００１５】本発明に従い満足される、長い間感じられ
た要求が先行技術に従い達成されなかった理由は完全に
は明らかでない。先行技術の研究者らの失敗は細胞およ
び発現ベクターの選択が不適切であったと考えられる。
本発明のテスター細胞の調製に使用すべき細胞は、取り
囲む媒質から細胞の中にルシフェリンを輸送するそれら
の能力、および一般に高いレベルで遺伝子およびリポー
ター遺伝子産生物、とくにルシフェラーゼを発現するそ
れらの能力について選択される。本発明に導いた実験に
おいて利用したこのような細胞の１つの例は、２９３細
胞系から誘導された細胞である。しかしながら、他の型
の細胞を、また、本発明によるテスター細胞の調製に使
用することができ、そして当業者は制限された量の実験
後に他の適当な細胞の発見において困難を要しないこと
に注意すべきである。
た要求が先行技術に従い達成されなかった理由は完全に
は明らかでない。先行技術の研究者らの失敗は細胞およ
び発現ベクターの選択が不適切であったと考えられる。
本発明のテスター細胞の調製に使用すべき細胞は、取り
囲む媒質から細胞の中にルシフェリンを輸送するそれら
の能力、および一般に高いレベルで遺伝子およびリポー
ター遺伝子産生物、とくにルシフェラーゼを発現するそ
れらの能力について選択される。本発明に導いた実験に
おいて利用したこのような細胞の１つの例は、２９３細
胞系から誘導された細胞である。しかしながら、他の型
の細胞を、また、本発明によるテスター細胞の調製に使
用することができ、そして当業者は制限された量の実験
後に他の適当な細胞の発見において困難を要しないこと
に注意すべきである。
【００１６】以下の説明に限定されないが、２９３細胞
系の使用における成功は、これらの細胞がＥＩａおよび
ＥＩｂのアデノウイルスを含有するという事実から生
じ、それらの発現産生物はプレオトロピックインデュー
サー（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃｉｎｄｕｃｅｒ）、すなわ
ち、多数のプロモーターを活性化することができるか、
あるいは特定のプロモーターの誘発活性を増加するイン
デューサーである。したがって、プレオトロピックイン
デューサーをエンコードする遺伝子を含有し、高いレベ
ルで遺伝子を発現することができるようにする他の細
胞、例えば、ＥＩａまたはＥＩｂ遺伝子を含有する細
胞、また、本発明のテスター細胞の調製に非常に適当で
あることができると信じられる。
系の使用における成功は、これらの細胞がＥＩａおよび
ＥＩｂのアデノウイルスを含有するという事実から生
じ、それらの発現産生物はプレオトロピックインデュー
サー（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃｉｎｄｕｃｅｒ）、すなわ
ち、多数のプロモーターを活性化することができるか、
あるいは特定のプロモーターの誘発活性を増加するイン
デューサーである。したがって、プレオトロピックイン
デューサーをエンコードする遺伝子を含有し、高いレベ
ルで遺伝子を発現することができるようにする他の細
胞、例えば、ＥＩａまたはＥＩｂ遺伝子を含有する細
胞、また、本発明のテスター細胞の調製に非常に適当で
あることができると信じられる。
【００１７】本発明の発現ベクターは、ｌｕｃ遺伝子を
前記インデューサー物質の不存在下に低いレベルでそし
てその存在下に高いレベルで発現することができるよう
に構成される。多数のプロモーター、とくにウイルスの
プロモーターは、それらのインデューサーの不存在下に
おいてさえ、それらの関連する遺伝子を多少発現するこ
とに注意すべきである。このようなバックグラウンドの
発現はバックグラウンドのシグナルを増加し、それゆえ
本発明の方法におけるシグナル対ノイズ比を減少するで
あろう。
前記インデューサー物質の不存在下に低いレベルでそし
てその存在下に高いレベルで発現することができるよう
に構成される。多数のプロモーター、とくにウイルスの
プロモーターは、それらのインデューサーの不存在下に
おいてさえ、それらの関連する遺伝子を多少発現するこ
とに注意すべきである。このようなバックグラウンドの
発現はバックグラウンドのシグナルを増加し、それゆえ
本発明の方法におけるシグナル対ノイズ比を減少するで
あろう。
【００１８】シグナル対ノイズ比はプロモーターの閉塞
（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）により、すなわち、閉塞プロモ
ーターに対する下流のｌｕｃ遺伝子に連鎖したプロモー
ター（以後、「試験プロモーター」と呼ぶ）を配置する
ことによってかなり増加することができ、そして閉塞プ
ロモーターは両者のプロモーターのインデューサー物質
の不存在下に試験プロモーターより活性であり、２つの
プロモーターの間の転写停止シグナルは存在しない。こ
うして、試験プロモーターのインデューサー物質の不存
在下において、閉塞プロモーターにより誘発された発現
は試験プロモーターにより誘発される発現を阻害するで
あろう；しかしながら、試験プロモーターのインデュー
サー物質が存在するとき、閉塞プロモーターのそれを越
える（それゆえ閉塞を克服する）活性、結局ｌｕｃ遺伝
子は発現されるであろう。結局、基礎的光の発生は前記
インデューサー物質の存在下に起こるものより非常に低
く、これはシグナル対ノイズ比のかなりの増加を意味す
る。
（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）により、すなわち、閉塞プロモ
ーターに対する下流のｌｕｃ遺伝子に連鎖したプロモー
ター（以後、「試験プロモーター」と呼ぶ）を配置する
ことによってかなり増加することができ、そして閉塞プ
ロモーターは両者のプロモーターのインデューサー物質
の不存在下に試験プロモーターより活性であり、２つの
プロモーターの間の転写停止シグナルは存在しない。こ
うして、試験プロモーターのインデューサー物質の不存
在下において、閉塞プロモーターにより誘発された発現
は試験プロモーターにより誘発される発現を阻害するで
あろう；しかしながら、試験プロモーターのインデュー
サー物質が存在するとき、閉塞プロモーターのそれを越
える（それゆえ閉塞を克服する）活性、結局ｌｕｃ遺伝
子は発現されるであろう。結局、基礎的光の発生は前記
インデューサー物質の存在下に起こるものより非常に低
く、これはシグナル対ノイズ比のかなりの増加を意味す
る。
【００１９】その実施態様の１つにより、本発明は試験
した試料中の生存能力のあるウイルス粒子の存在を検出
する方法を提供する。このような方法において使用する
ために、テスター細胞はウイルスにより感染させること
ができ、そして発現ベクター中の前記プロモーターはウ
イルスのゲノムによりエンコードされる物質により誘発
することができるべきである。原理的には、ゲノムが認
識されたインデューサー物質をエンコードする任意のウ
イルスを本発明の方法によりアッセイすることができ、
そしていくつかの例は次の通りである：ＨＩＶ、プロモ
ーターはＨＩＶＴＡＴにより誘発可能である；ＨＴＬＶ
ＩおよびＩＩ、プロモーターは、それぞれ、ＨＴＬＶ
ＩおよびＩＩのＴＡＸにより誘発可能である；Ｂ型肝
炎ウイルス（ＨＢＶ）、プロモーターはＨＢＶ Ｘタン
パク質により誘発可能である；単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）、プロモーターはＨＳＶ ＩＣＰ４により誘
発可能である；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロ
モーターはＣＭＶトランスアクチベーター（ｔｒａｎｓ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ）により誘発可能である；など。
した試料中の生存能力のあるウイルス粒子の存在を検出
する方法を提供する。このような方法において使用する
ために、テスター細胞はウイルスにより感染させること
ができ、そして発現ベクター中の前記プロモーターはウ
イルスのゲノムによりエンコードされる物質により誘発
することができるべきである。原理的には、ゲノムが認
識されたインデューサー物質をエンコードする任意のウ
イルスを本発明の方法によりアッセイすることができ、
そしていくつかの例は次の通りである：ＨＩＶ、プロモ
ーターはＨＩＶＴＡＴにより誘発可能である；ＨＴＬＶ
ＩおよびＩＩ、プロモーターは、それぞれ、ＨＴＬＶ
ＩおよびＩＩのＴＡＸにより誘発可能である；Ｂ型肝
炎ウイルス（ＨＢＶ）、プロモーターはＨＢＶ Ｘタン
パク質により誘発可能である；単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）、プロモーターはＨＳＶ ＩＣＰ４により誘
発可能である；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、プロ
モーターはＣＭＶトランスアクチベーター（ｔｒａｎｓ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ）により誘発可能である；など。
【００２０】その実施態様の他のものにより、本発明
は、テスター細胞により吸収されることができ、そして
そのままで、あるいは細胞の中に存在する酵素により修
飾された後、前記プロモーターのインデューサーとして
直接にあるいは間接に働く、ある媒質中の因子の存在を
検出する方法を提供する。細胞膜を横切って完全な状態
で輸送することができ、そしてそのままで適当なプロモ
ーターを活性化する、因子の例はＨＩＶ ＴＡＴであ
る。
は、テスター細胞により吸収されることができ、そして
そのままで、あるいは細胞の中に存在する酵素により修
飾された後、前記プロモーターのインデューサーとして
直接にあるいは間接に働く、ある媒質中の因子の存在を
検出する方法を提供する。細胞膜を横切って完全な状態
で輸送することができ、そしてそのままで適当なプロモ
ーターを活性化する、因子の例はＨＩＶ ＴＡＴであ
る。
【００２１】その実施態様のなお他のものにより、本発
明は、テスター細胞の外部の膜表面上に存在するレセプ
ターのリガーゼである物質をある媒質中で検出する方法
を提供し、そのレセプターへの結合は細胞中の「第２メ
ッセンジャー」、例えば、転写因子、例えば、ＮＨκＢ
またはＳＰＩの産生を誘発し、発現ベクター中の前記プ
ロモーターは第２メッセンジャーにより誘発可能であ
る。この実施態様に従い使用するために、テスター細胞
はそれらの外表面上にそのリガンドのためのレセプター
を表しそして前記レセプターへの前記リガンドの結合の
結果として、活性される機構を発生する第２メッセンジ
ャーを有するべきである。レセプターおよび前記機構は
本発明に従いテスター細胞を調製するために使用した親
細胞の中に先天的に存在するか、あるいはそれ自体既知
の遺伝子操作方法により細胞の中に導入されるべきであ
る。
明は、テスター細胞の外部の膜表面上に存在するレセプ
ターのリガーゼである物質をある媒質中で検出する方法
を提供し、そのレセプターへの結合は細胞中の「第２メ
ッセンジャー」、例えば、転写因子、例えば、ＮＨκＢ
またはＳＰＩの産生を誘発し、発現ベクター中の前記プ
ロモーターは第２メッセンジャーにより誘発可能であ
る。この実施態様に従い使用するために、テスター細胞
はそれらの外表面上にそのリガンドのためのレセプター
を表しそして前記レセプターへの前記リガンドの結合の
結果として、活性される機構を発生する第２メッセンジ
ャーを有するべきである。レセプターおよび前記機構は
本発明に従いテスター細胞を調製するために使用した親
細胞の中に先天的に存在するか、あるいはそれ自体既知
の遺伝子操作方法により細胞の中に導入されるべきであ
る。
【００２２】本発明は、さらに、本発明の方法を実施す
るためのキットおよびシステムを提供する。キットは、
テスター細胞を包含する、本発明の方法の実施に必要な
成分および、必要に応じて、また、細胞のための適当な
インキュベーション媒質、ルシフェリン、光反応の実施
のための緩衝液、などからなる。このようなキットは、
また、種々の標準、例えば、既知の濃度の試験すべき物
質を含有する溶液からなることができる。
るためのキットおよびシステムを提供する。キットは、
テスター細胞を包含する、本発明の方法の実施に必要な
成分および、必要に応じて、また、細胞のための適当な
インキュベーション媒質、ルシフェリン、光反応の実施
のための緩衝液、などからなる。このようなキットは、
また、種々の標準、例えば、既知の濃度の試験すべき物
質を含有する溶液からなることができる。
【００２３】本発明による方法を実施するシステムは、
上のキットにおけるのと同一の成分、および光監視装置
からなるであろう。
上のキットにおけるのと同一の成分、および光監視装置
からなるであろう。
【００２４】以下において、本発明を、時には、ＨＩＶ
（エイズ）の感染の検出に本発明に従うテスター細胞の
使用を参照して例示する。しかしながら、本発明はそれ
に限定されず、そして当業者は以下に記載するもの以外
のプロモーターからなる発現ベクターでトランスフェク
ションしたテスター細胞を疑いなく認識するであろう。
これらの他のプロモーターは種々の他のインデューサー
物質に対するそれらの特異性について選択され、それら
の例は前述のウイルスのインデューサー物質により誘発
可能なすべてのプロモーターである。
（エイズ）の感染の検出に本発明に従うテスター細胞の
使用を参照して例示する。しかしながら、本発明はそれ
に限定されず、そして当業者は以下に記載するもの以外
のプロモーターからなる発現ベクターでトランスフェク
ションしたテスター細胞を疑いなく認識するであろう。
これらの他のプロモーターは種々の他のインデューサー
物質に対するそれらの特異性について選択され、それら
の例は前述のウイルスのインデューサー物質により誘発
可能なすべてのプロモーターである。
【００２５】ＨＩＶの感染の検出において有用なテスタ
ー細胞中の発現ベクターは、ｌｕｃ遺伝子およびＨＩＶ
ＴＡＴ誘発可能なプロモーターからなり、前記プロモ
ーターはＴＡＴタンパク質の認識部位であるｔａｒ部位
を包含するＨＩＶ−ＬＴＲまたはその一部分、またはＨ
ＩＶ ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発
することができる類似の配列から成る群より選択され、
ｌｕｃ遺伝子はプロモーターの発現制御下にある。
ー細胞中の発現ベクターは、ｌｕｃ遺伝子およびＨＩＶ
ＴＡＴ誘発可能なプロモーターからなり、前記プロモ
ーターはＴＡＴタンパク質の認識部位であるｔａｒ部位
を包含するＨＩＶ−ＬＴＲまたはその一部分、またはＨ
ＩＶ ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発
することができる類似の配列から成る群より選択され、
ｌｕｃ遺伝子はプロモーターの発現制御下にある。
【００２６】遺伝子のｍＲＮＡの発生のために、発現ベ
クターは活性プロモーターおよび遺伝子の３’末端にポ
リアデニル化（ポリＡ）部位およびシグナルを有するこ
とが必要である。ｌｕｃ遺伝子のポリＡ部位は非効率的
であることを理解すると、本発明の発現ベクターの中
に、異なるポリＡシグナルおよび部位、例えば、ＳＶ４
０のそれを含めることは好ましい。発現ベクターは、好
ましくは、また、それによりトランスフェクションした
細胞の選択を促進するマーカー遺伝子、例えば、抗生物
質抵抗性を付与するもの、からなる。
クターは活性プロモーターおよび遺伝子の３’末端にポ
リアデニル化（ポリＡ）部位およびシグナルを有するこ
とが必要である。ｌｕｃ遺伝子のポリＡ部位は非効率的
であることを理解すると、本発明の発現ベクターの中
に、異なるポリＡシグナルおよび部位、例えば、ＳＶ４
０のそれを含めることは好ましい。発現ベクターは、好
ましくは、また、それによりトランスフェクションした
細胞の選択を促進するマーカー遺伝子、例えば、抗生物
質抵抗性を付与するもの、からなる。
【００２７】前述のように、ＨＩＶ−ＬＴＲを包含す
る、ウイルス由来の多数のプロモーターはそれらのイン
デューサーの不存在下においてさえある程度まで活性で
ある。また前述したように、この事実はバックグラウン
ドのシグナルを増加し、これによりシグナル対ノイズ比
を減少し、それゆえアッセイの感度を減少することがあ
る。このバックグラウンドのシグナルは、プロモーター
の閉塞により、すなわち、閉塞プロモーターより下流に
試験プロモーターを配置することによって小さいレベル
に減少することができ、ここで閉塞プロモーターは両者
のプロモーターのインデューサー物質の不存在下に試験
プロモーターより活性である。ＨＩＶ−ＬＴＲの閉塞に
使用することができる閉塞プロモーターの１つの例はＭ
ＬＶ−ＬＴＲである。ＨＩＶ−ＬＴＲ指令の転写はＭＬ
Ｖ−ＬＴＲ指令の転写に関してセンスの向きであるか、
あるいは好ましくはそれに関してアンチセンスの向きで
ある。アンチセンスの向きの優越性は、このような場合
において、試験プロモーターのバックグラウンドの活性
（すなわち、そのプロモーターの不存在下にその誘発さ
れたペプチド）はなをさらに減少されるという事実を見
たものである。ＴＡＴタンパク質が存在しないとき、細
胞の中にインデューサー物質が存在しないＭＬＶ−ＬＴ
Ｒは、前者より活性であり、それゆえＨＩＶ−ＬＴＲに
より誘発される転写はほとんど完全に排除される。この
排除は、両者のプロモーターにより誘発された転写の方
向が互いに関してアンチセンスの向きであるとき、いっ
そう強い。ＴＡＴが存在するとき、ＨＩＶ−ＬＴＲプロ
モーターはＭＬＶ−ＬＴＲより活性となり（閉塞を克服
し）結局ｌｕｃ遺伝子は発現される。
る、ウイルス由来の多数のプロモーターはそれらのイン
デューサーの不存在下においてさえある程度まで活性で
ある。また前述したように、この事実はバックグラウン
ドのシグナルを増加し、これによりシグナル対ノイズ比
を減少し、それゆえアッセイの感度を減少することがあ
る。このバックグラウンドのシグナルは、プロモーター
の閉塞により、すなわち、閉塞プロモーターより下流に
試験プロモーターを配置することによって小さいレベル
に減少することができ、ここで閉塞プロモーターは両者
のプロモーターのインデューサー物質の不存在下に試験
プロモーターより活性である。ＨＩＶ−ＬＴＲの閉塞に
使用することができる閉塞プロモーターの１つの例はＭ
ＬＶ−ＬＴＲである。ＨＩＶ−ＬＴＲ指令の転写はＭＬ
Ｖ−ＬＴＲ指令の転写に関してセンスの向きであるか、
あるいは好ましくはそれに関してアンチセンスの向きで
ある。アンチセンスの向きの優越性は、このような場合
において、試験プロモーターのバックグラウンドの活性
（すなわち、そのプロモーターの不存在下にその誘発さ
れたペプチド）はなをさらに減少されるという事実を見
たものである。ＴＡＴタンパク質が存在しないとき、細
胞の中にインデューサー物質が存在しないＭＬＶ−ＬＴ
Ｒは、前者より活性であり、それゆえＨＩＶ−ＬＴＲに
より誘発される転写はほとんど完全に排除される。この
排除は、両者のプロモーターにより誘発された転写の方
向が互いに関してアンチセンスの向きであるとき、いっ
そう強い。ＴＡＴが存在するとき、ＨＩＶ−ＬＴＲプロ
モーターはＭＬＶ−ＬＴＲより活性となり（閉塞を克服
し）結局ｌｕｃ遺伝子は発現される。
【００２８】ＨＩＶの感染の検出のための本発明による
テスター細胞は、細胞を上の発現ベクターでトランスフ
ェクションすることによって調製される。このようなテ
スター細胞は、試験した試料中のＴＡＴタンパク質およ
び／または生存能力のあるＨＩＶ粒子の存在を検出すべ
きである。このようなテスター細胞がＴＡＴタンパク質
の存在の信頼性ある感受性の検出因子であるためには、
それらはそれらの取り囲む媒質からこのタンパク質を吸
収することができるべきである。このような吸収を行う
ことができる細胞の例は、２９３細胞系から誘導される
細胞である。
テスター細胞は、細胞を上の発現ベクターでトランスフ
ェクションすることによって調製される。このようなテ
スター細胞は、試験した試料中のＴＡＴタンパク質およ
び／または生存能力のあるＨＩＶ粒子の存在を検出すべ
きである。このようなテスター細胞がＴＡＴタンパク質
の存在の信頼性ある感受性の検出因子であるためには、
それらはそれらの取り囲む媒質からこのタンパク質を吸
収することができるべきである。このような吸収を行う
ことができる細胞の例は、２９３細胞系から誘導される
細胞である。
【００２９】血液中のＨＩＶの感染をアッセイするため
に、ＴＡＴタンパク質を吸収する能力を有するテスター
細胞を第１トランスアクチベーション（ｔｒａｎｓａｃ
ｔｉｖａｔｉｏｎ）段階にかけ、ここでそれらを試験血
液または他の体液の試料または試験した試料の中に存在
するときＴＡＴタンパク質を含有するその分画と接触さ
せる。血液の中に、ＴＡＴタンパク質は主としてＴ4ヘ
ルパー細胞の核の中に存在し、したがって試験を実施す
る前にＴ4ヘルパー細胞を溶解することが好ましい。こ
のような溶菌後、これらの細胞はそのＴＡＴタンパク質
の内容物を媒質の中に解放し、次いでリゼイトはそのま
まであるいはそのタンパク質を含有する分画をテスター
細胞と接触させる。試験した試料がＨＩＶで感染した個
体からのもである場合、ＴＡＴは存在し、そしてテスタ
ー細胞の中へのその吸収はルシフェラーゼを発現させる
であろう。
に、ＴＡＴタンパク質を吸収する能力を有するテスター
細胞を第１トランスアクチベーション（ｔｒａｎｓａｃ
ｔｉｖａｔｉｏｎ）段階にかけ、ここでそれらを試験血
液または他の体液の試料または試験した試料の中に存在
するときＴＡＴタンパク質を含有するその分画と接触さ
せる。血液の中に、ＴＡＴタンパク質は主としてＴ4ヘ
ルパー細胞の核の中に存在し、したがって試験を実施す
る前にＴ4ヘルパー細胞を溶解することが好ましい。こ
のような溶菌後、これらの細胞はそのＴＡＴタンパク質
の内容物を媒質の中に解放し、次いでリゼイトはそのま
まであるいはそのタンパク質を含有する分画をテスター
細胞と接触させる。試験した試料がＨＩＶで感染した個
体からのもである場合、ＴＡＴは存在し、そしてテスタ
ー細胞の中へのその吸収はルシフェラーゼを発現させる
であろう。
【００３０】とくに試験したウイルスが拡散可能なトラ
ンスアクチベーション産生物の産生を誘発しない場合、
体液中の生存能力のあるウイルス粒子の存在について直
接アッセイすることは、時には、好ましい。その目的
で、細胞は試験したウイルスにより感染させることがで
きるべきであり、これは、通常、細胞の外部の膜表面上
にウイルスの適当なレセプターの存在を必要とする。こ
のようなウイルスのレセプターはテスター細胞の調製に
使用した親細胞の中に先天的に存在するか、あるいはそ
れ自体既知の遺伝子操作方法に従い導入すべきである。
例えば、ＨＩＶの場合において、ウイルスによる直接感
染はＣＤ４レセプターの外部の細胞膜上の存在を必要と
し、そしてテスター細胞の調製のために選択した細胞は
Ｔ4ヘルパー細胞系であるか、あるいはＣＤ４レセプタ
ーを表す他の細胞系であるか、あるいはＣＤ４の遺伝情
報を指定する遺伝子でトランスフェクションした２９３
のような細胞であることができる。
ンスアクチベーション産生物の産生を誘発しない場合、
体液中の生存能力のあるウイルス粒子の存在について直
接アッセイすることは、時には、好ましい。その目的
で、細胞は試験したウイルスにより感染させることがで
きるべきであり、これは、通常、細胞の外部の膜表面上
にウイルスの適当なレセプターの存在を必要とする。こ
のようなウイルスのレセプターはテスター細胞の調製に
使用した親細胞の中に先天的に存在するか、あるいはそ
れ自体既知の遺伝子操作方法に従い導入すべきである。
例えば、ＨＩＶの場合において、ウイルスによる直接感
染はＣＤ４レセプターの外部の細胞膜上の存在を必要と
し、そしてテスター細胞の調製のために選択した細胞は
Ｔ4ヘルパー細胞系であるか、あるいはＣＤ４レセプタ
ーを表す他の細胞系であるか、あるいはＣＤ４の遺伝情
報を指定する遺伝子でトランスフェクションした２９３
のような細胞であることができる。
【００３１】ルシフェラーゼの発現は適当な条件下に光
の放射を監視することによってアッセイする。このよう
な監視のために、テスター細胞を組織の培地（例えば、
１０％の子ウシ血清を含有する）中でルシフェリン（例
えば、０．３ミリモルの最終濃度）の存在下に適当な条
件（例えば、ＣＯ2（７％）のインキュベーター、３７
℃）下にインキュベーションする。本発明に従い開発し
た、光の放射を監視する適当な装置はカメラの装置であ
り、これは比較的小さい、光を通さないが、気体透過性
のボックスから成り、上部に写真フィルムのカセット、
例えば、ポラロイド（ＰＯＬＡＲＯＩＤ）（商標）フィ
ルムのカセットを装備し、スライドシャッターを有し、
そしてキャリヤー、例えば、皿、スライド、プレートな
どをフィルムと接触させて保持するための保持手段を有
する。光の放射を監視するために、テスター細胞を含有
するキャリヤーをフィルムへ、フィルムの感度、インキ
ュベーション条件、および試験したウイルスの感染性ま
たは力価に依存して、十分な時間露出する。当業者は各
場合において適当なインキュベーション時間を容易に決
定することができるであろう。あるいは、光の放射は、
また、任意の数の入手可能なフォトメーター、例えば、
光増強電荷カップルド装置（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｔｅｎｓ
ｉｆｅｄ ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃ
ｅ）（ＣＣＤ）で検出することができる。しかしなが
ら、非常に安価なかつ簡単な設計のカメラ装置に加え
て、また光の検出はインキュベーター内で実施すること
ができることに注意すべきであり、これにより延長した
期間にわたって連続的な露出を実施することができ、な
らびに異なる時間に同一の細胞を連続的に監視すること
ができる。
の放射を監視することによってアッセイする。このよう
な監視のために、テスター細胞を組織の培地（例えば、
１０％の子ウシ血清を含有する）中でルシフェリン（例
えば、０．３ミリモルの最終濃度）の存在下に適当な条
件（例えば、ＣＯ2（７％）のインキュベーター、３７
℃）下にインキュベーションする。本発明に従い開発し
た、光の放射を監視する適当な装置はカメラの装置であ
り、これは比較的小さい、光を通さないが、気体透過性
のボックスから成り、上部に写真フィルムのカセット、
例えば、ポラロイド（ＰＯＬＡＲＯＩＤ）（商標）フィ
ルムのカセットを装備し、スライドシャッターを有し、
そしてキャリヤー、例えば、皿、スライド、プレートな
どをフィルムと接触させて保持するための保持手段を有
する。光の放射を監視するために、テスター細胞を含有
するキャリヤーをフィルムへ、フィルムの感度、インキ
ュベーション条件、および試験したウイルスの感染性ま
たは力価に依存して、十分な時間露出する。当業者は各
場合において適当なインキュベーション時間を容易に決
定することができるであろう。あるいは、光の放射は、
また、任意の数の入手可能なフォトメーター、例えば、
光増強電荷カップルド装置（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｔｅｎｓ
ｉｆｅｄ ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃ
ｅ）（ＣＣＤ）で検出することができる。しかしなが
ら、非常に安価なかつ簡単な設計のカメラ装置に加え
て、また光の検出はインキュベーター内で実施すること
ができることに注意すべきであり、これにより延長した
期間にわたって連続的な露出を実施することができ、な
らびに異なる時間に同一の細胞を連続的に監視すること
ができる。
【００３２】本発明の方法は、十分に感受性であって、
単一の細胞からの光を検出することができるが証明され
た。しかしながら、これは光の監視に通常延長したイン
キュベーション期間、例えば、数時間を必要とする。放
射した光の検出要求される時間を減少するために、細胞
は、例えば、遠心により濃縮し、次いで光の放射をこの
濃縮物の中で測定することができる。このような濃縮に
より、すべての光を発生する細胞は密に詰められ、単一
の細胞を監視することができないが、露出時間はかなり
減少し、例えば、数分となる。
単一の細胞からの光を検出することができるが証明され
た。しかしながら、これは光の監視に通常延長したイン
キュベーション期間、例えば、数時間を必要とする。放
射した光の検出要求される時間を減少するために、細胞
は、例えば、遠心により濃縮し、次いで光の放射をこの
濃縮物の中で測定することができる。このような濃縮に
より、すべての光を発生する細胞は密に詰められ、単一
の細胞を監視することができないが、露出時間はかなり
減少し、例えば、数分となる。
【００３３】本発明に従い、結果を、陰性の対照試料を
使用して同様な条件下にインキュベーションしたテスタ
ー細胞から得られた対照の結果と、比較することが好ま
しい。対照レベルより上の光の生成の増加は、試料の中
の試験した物質の存在を示すであろう。さらに、放射し
た光の量は種々の陽性の対照の標準を使用して得られた
光の物質と比較することができる。
使用して同様な条件下にインキュベーションしたテスタ
ー細胞から得られた対照の結果と、比較することが好ま
しい。対照レベルより上の光の生成の増加は、試料の中
の試験した物質の存在を示すであろう。さらに、放射し
た光の量は種々の陽性の対照の標準を使用して得られた
光の物質と比較することができる。
【００３４】本発明を実施例を参照して説明する。実施
例において、本発明によるテスター細胞を使用して、Ｈ
ＩＶトランスアクチベータータンパク質ＴＡＴの存在を
検出する。これらの実施例は本発明の一般の範囲の例示
であり、そして本発明を限定しない。
例において、本発明によるテスター細胞を使用して、Ｈ
ＩＶトランスアクチベータータンパク質ＴＡＴの存在を
検出する。これらの実施例は本発明の一般の範囲の例示
であり、そして本発明を限定しない。
【００３５】以下において、本発明によるプラスミドの
調製を説明する。プラスミドの構成に関係するＤＮＡ断
片のＤＮＡの切断および結合は、それ自体既知の方法に
従い実施した。
調製を説明する。プラスミドの構成に関係するＤＮＡ断
片のＤＮＡの切断および結合は、それ自体既知の方法に
従い実施した。
【００３６】各段階において、構成されたプラスミドを
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＲ１００細胞の中にクローニングし、
そしてトランスフェクションした細胞を調製したすべて
のプラスミドが有するＡｍｐR遺伝子により付与された
アンピシリン抵抗性について選択した。特定したように
選択した後、プラスミドをほぼ５０の選択したコロニー
の各々から精製し、そしてこれらのプラスミドの制限分
析を実施した。このような分析後、１つのクローンを選
択し、生長させ、そしてそのプラスミドを精製し、次い
でこれらを、必要に応じて、引き続くプラスミドの構成
の段階にまたはテスター細胞のトランスフェクションの
ために保存した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＲ１００細胞の中にクローニングし、
そしてトランスフェクションした細胞を調製したすべて
のプラスミドが有するＡｍｐR遺伝子により付与された
アンピシリン抵抗性について選択した。特定したように
選択した後、プラスミドをほぼ５０の選択したコロニー
の各々から精製し、そしてこれらのプラスミドの制限分
析を実施した。このような分析後、１つのクローンを選
択し、生長させ、そしてそのプラスミドを精製し、次い
でこれらを、必要に応じて、引き続くプラスミドの構成
の段階にまたはテスター細胞のトランスフェクションの
ために保存した。
【００３７】ａ、ｐＡＬＵＣＡＴの調製 プラスミドｐＡＬＵＣＡＴの構成は図１に概略的に示さ
れている。ｌｕｃ遺伝子（酵素ルシフェラーゼをエンコ
ードする）源は、Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｌｉｎｓ）、
ＦＲＧ、から入手したプラスミドｐＳＶＬＵＣ−Ｇであ
った。ｐＳＶＬＵＣ−ＧをＳｍａＩおよびＸｈｏＩ制限
酵素で切断後、ｌｕｃ遺伝子を分離し、そして精製し
た。アンピシリン抵抗性のための遺伝子を有するプラス
ミドｐＢＲ３２２（２）お、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶ
制限酵素により切断し、小さい４６６ｂｐの断片を廃棄
し、そしてｐＳＶＬＵＣ−Ｇから精製したｌｕｃ断片を
その場所に結合して、プラスミドｐＢＲＬＵＣを産生し
た。
れている。ｌｕｃ遺伝子（酵素ルシフェラーゼをエンコ
ードする）源は、Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｌｉｎｓ）、
ＦＲＧ、から入手したプラスミドｐＳＶＬＵＣ−Ｇであ
った。ｐＳＶＬＵＣ−ＧをＳｍａＩおよびＸｈｏＩ制限
酵素で切断後、ｌｕｃ遺伝子を分離し、そして精製し
た。アンピシリン抵抗性のための遺伝子を有するプラス
ミドｐＢＲ３２２（２）お、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶ
制限酵素により切断し、小さい４６６ｂｐの断片を廃棄
し、そしてｐＳＶＬＵＣ−Ｇから精製したｌｕｃ断片を
その場所に結合して、プラスミドｐＢＲＬＵＣを産生し
た。
【００３８】図１に示すように、ｐＳＶＬＵＣ−Ｇから
得られたｌｕｃ遺伝子断片はＸｈｏＩ制限部位に近接し
て単一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する。プラスミド
ｐＢＲ３２２は、また、ＥｃｏＲＶ部位に近接して大き
いＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片上に単一のＨｉｎｄＩＩＩ
制限部位を含有する。こうして、ｐＢＲＬＵＣ中のｌｕ
ｃ遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりフランキング
される。こうして、ｐＢＲＬＵＣはＨｉｎｄＩＩＩで切
断され、そしてそのようにして得られたｌｕｃ遺伝子断
片をｐＡＣＡＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合した［Ａ．
パネット（Ｐａｎｅｔ）ら、バイオテクノロジー・ジェ
ネラル−ＢＴＧ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ−ＢＴＧ）、イスラエル国ネスジオナ］。この
プラスミドはｃａｔ遺伝子にかつその上流に融合された
ＨＩＶ−ＬＴＲを収容する。
得られたｌｕｃ遺伝子断片はＸｈｏＩ制限部位に近接し
て単一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する。プラスミド
ｐＢＲ３２２は、また、ＥｃｏＲＶ部位に近接して大き
いＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片上に単一のＨｉｎｄＩＩＩ
制限部位を含有する。こうして、ｐＢＲＬＵＣ中のｌｕ
ｃ遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりフランキング
される。こうして、ｐＢＲＬＵＣはＨｉｎｄＩＩＩで切
断され、そしてそのようにして得られたｌｕｃ遺伝子断
片をｐＡＣＡＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合した［Ａ．
パネット（Ｐａｎｅｔ）ら、バイオテクノロジー・ジェ
ネラル−ＢＴＧ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ−ＢＴＧ）、イスラエル国ネスジオナ］。この
プラスミドはｃａｔ遺伝子にかつその上流に融合された
ＨＩＶ−ＬＴＲを収容する。
【００３９】こうして、生ずるｐＡＬＵＣＡＴプラスミ
ドは、ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にｌｕｃ遺伝子を含
む。このプラスミドは、また、アンピシリン抵抗性を付
与するｐＡＣＡＴのＡｍｐ遺伝子を含む。
ドは、ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にｌｕｃ遺伝子を含
む。このプラスミドは、また、アンピシリン抵抗性を付
与するｐＡＣＡＴのＡｍｐ遺伝子を含む。
【００４０】そのように構成されたｐＡＬＵＣＡＴプラ
スミドは、本発明によりテスター細胞として使用する細
胞のトランスフェクションにおける使用に適する。
スミドは、本発明によりテスター細胞として使用する細
胞のトランスフェクションにおける使用に適する。
【００４１】テスター細胞を有するｐＡＬＵＣＡＴにお
ける光の放射の程度は、ＨＩＶ−ＬＴＲの活性化の程度
に依存する。適切なカリブレーションを得るために、ｐ
ＡＬＵＣＡＴを含有する細胞と同一の細胞系に属する細
胞をプラスミドｐＡＣＡＴによりトランスフェクション
した。こうして、ｐＡＬＵＣＡＴでトランスフェクショ
ンした細胞の光の放射の程度をｐＡＣＡＴでトランスフ
ェクションした細胞中のＣＡＴの産生の程度と比較する
ことによって得られる。
ける光の放射の程度は、ＨＩＶ−ＬＴＲの活性化の程度
に依存する。適切なカリブレーションを得るために、ｐ
ＡＬＵＣＡＴを含有する細胞と同一の細胞系に属する細
胞をプラスミドｐＡＣＡＴによりトランスフェクション
した。こうして、ｐＡＬＵＣＡＴでトランスフェクショ
ンした細胞の光の放射の程度をｐＡＣＡＴでトランスフ
ェクションした細胞中のＣＡＴの産生の程度と比較する
ことによって得られる。
【００４２】ｈｖｐはＴＡＴタンパク質の不存在下でさ
え多少のバックグラウンドのレベルの活性を発現ことに
注意すべきである。こうして、ｌｕｃ遺伝子のある程度
の発現はＴＡＴタンパク質の不存在下でさえ連続的に起
こり、したがって、本発明による方法において使用する
とき、このプラスミドを含有する細胞はある程度のバッ
クグラウンドの生物発光を示す。
え多少のバックグラウンドのレベルの活性を発現ことに
注意すべきである。こうして、ｌｕｃ遺伝子のある程度
の発現はＴＡＴタンパク質の不存在下でさえ連続的に起
こり、したがって、本発明による方法において使用する
とき、このプラスミドを含有する細胞はある程度のバッ
クグラウンドの生物発光を示す。
【００４３】ｂ、ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣの構成 ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣプラスミドの構成は、図２に概略
的に示されている。
的に示されている。
【００４４】ｐＡＬＵＣＡＴプラスミドは、完全なＨＩ
Ｖ−ＬＴＲ配列およびｌｕｃ遺伝子をフランキングする
２つのＡｓｐ７１８制限部位を有する（図１に示すよう
に）。ｐＡＬＵＣＡＴをＡｓｐ７１８で切断した後、Ｈ
ＩＶ−ＬＴＲおよびｌｕｃ遺伝子を含有するＤＮＡ断片
を分離しそして精製し、そしてその粘着末端を充填し
た。プラスミドｐＳＶ2ＣＡＴ（３）をＰｖｕＩＩおよ
びＨｐａＩ制限酵素で切断し、そしてｃａｔ遺伝子を含
有する断片を廃棄した。ｐＳＶ2ＣＡＴの残りの部分の
粘着末端を上のようにして充填し、次いでこの断片をｐ
ＡＬＵＣＡＴからの前記ＤＮＡ断片に結合した。このよ
うな結合はそれに取り付けられたＰｖｕＩＩ制限部位お
よびＡｓｐ７１８制限部位を再構成するが、ＰｖｕＩＩ
および他方のＡｓｐ７１８制限部位が失わる。
Ｖ−ＬＴＲ配列およびｌｕｃ遺伝子をフランキングする
２つのＡｓｐ７１８制限部位を有する（図１に示すよう
に）。ｐＡＬＵＣＡＴをＡｓｐ７１８で切断した後、Ｈ
ＩＶ−ＬＴＲおよびｌｕｃ遺伝子を含有するＤＮＡ断片
を分離しそして精製し、そしてその粘着末端を充填し
た。プラスミドｐＳＶ2ＣＡＴ（３）をＰｖｕＩＩおよ
びＨｐａＩ制限酵素で切断し、そしてｃａｔ遺伝子を含
有する断片を廃棄した。ｐＳＶ2ＣＡＴの残りの部分の
粘着末端を上のようにして充填し、次いでこの断片をｐ
ＡＬＵＣＡＴからの前記ＤＮＡ断片に結合した。このよ
うな結合はそれに取り付けられたＰｖｕＩＩ制限部位お
よびＡｓｐ７１８制限部位を再構成するが、ＰｖｕＩＩ
および他方のＡｓｐ７１８制限部位が失わる。
【００４５】生ずるｐＳＶＨＩＶＬＵＣプラスミドは、
ＨＩＶ−ＬＴＲ、ｌｕｃ遺伝子およびＡｓｐ７１８とＢ
ａｍＨＩ制限部位との間のＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナル（図２においてＰ．Ａ．）を有する。
ＨＩＶ−ＬＴＲ、ｌｕｃ遺伝子およびＡｓｐ７１８とＢ
ａｍＨＩ制限部位との間のＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナル（図２においてＰ．Ａ．）を有する。
【００４６】プラスミドｐＺｉｐ（４）は、アンピシリ
ン抵抗性を付与する原核生物のｂｌａ遺伝子、およびｐ
ＢＲ３２７の複製の由来を収容する。ネオマイシン抵抗
性を付与する遺伝子（ｎｅｏR）およびＭＬＶパッキン
グシグナルは、ＭＬＶ−ＬＴＲのＤＮＡ配列によりフラ
ンキングされている。このプラスミドは、５’ＬＴＲに
近接してドナーおよびアクセプタースプライス部位の間
に独特ＢａｍＨＩ制限部位を有して、ＢａｍＨＩ部位に
おけるクローンされた遺伝子の発現、ならびにｎｅｏR
遺伝子の発現を可能とする。
ン抵抗性を付与する原核生物のｂｌａ遺伝子、およびｐ
ＢＲ３２７の複製の由来を収容する。ネオマイシン抵抗
性を付与する遺伝子（ｎｅｏR）およびＭＬＶパッキン
グシグナルは、ＭＬＶ−ＬＴＲのＤＮＡ配列によりフラ
ンキングされている。このプラスミドは、５’ＬＴＲに
近接してドナーおよびアクセプタースプライス部位の間
に独特ＢａｍＨＩ制限部位を有して、ＢａｍＨＩ部位に
おけるクローンされた遺伝子の発現、ならびにｎｅｏR
遺伝子の発現を可能とする。
【００４７】ＨＩＶ−ＬＴＲおよびｌｕｃ遺伝子ならび
にポリＡシグナルおよび部位を包含する、プラスミドｐ
ＳＶＨＩＶＬＵＣ中のＡｓｐ７１８およびＢａｍＨＩ切
断部位の間に位置するＤＮＡ断片が分離された。この断
片をｐＺｉｐのＢａｍＨＩ切断部位に結合し、不適合性
粘着末端を充填しそして再結合した。
にポリＡシグナルおよび部位を包含する、プラスミドｐ
ＳＶＨＩＶＬＵＣ中のＡｓｐ７１８およびＢａｍＨＩ切
断部位の間に位置するＤＮＡ断片が分離された。この断
片をｐＺｉｐのＢａｍＨＩ切断部位に結合し、不適合性
粘着末端を充填しそして再結合した。
【００４８】２つの型のプラスミドがこの方法において
産生され、ここでＨＩＶ−ＬＴＲは上流のＭＬＶ−ＬＴ
Ｒにより閉塞されている： １）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ／
ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片はＭＬＶ−ＬＴＲ指令の転写
に関してアンチセンスの向きに、すなわち、ＭＬＶ−Ｌ
ＴＲ指令の転写およびＨＩＶ指令の転写が反対向である
向きに、挿入されている。
産生され、ここでＨＩＶ−ＬＴＲは上流のＭＬＶ−ＬＴ
Ｒにより閉塞されている： １）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ／
ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片はＭＬＶ−ＬＴＲ指令の転写
に関してアンチセンスの向きに、すなわち、ＭＬＶ−Ｌ
ＴＲ指令の転写およびＨＩＶ指令の転写が反対向である
向きに、挿入されている。
【００４９】２）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ２、ここでＨＩ
Ｖ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片はＭＬＶ−ＬＴ
Ｒ指令の転写に関してセンスの向きに挿入されている。
Ｖ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片はＭＬＶ−ＬＴ
Ｒ指令の転写に関してセンスの向きに挿入されている。
【００５０】ｐＳＶＨＩＶＬＵＣからのＨＩＶ−ＬＴＲ
ｌｕｃ ＤＮＡ断片をｐＺｉｐのＢａｍＨＩとＢｇｌ
ＩＩとの制限部位の間に挿入することによって、異なる
組のプラスミドを調製した。こうして、２つの構成体が
得られた： （１）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ
／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片の向きはｐＺｉｐＨＩＶＬ
ＵＣ１のそれと同一である。
ｌｕｃ ＤＮＡ断片をｐＺｉｐのＢａｍＨＩとＢｇｌ
ＩＩとの制限部位の間に挿入することによって、異なる
組のプラスミドを調製した。こうして、２つの構成体が
得られた： （１）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ
／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片の向きはｐＺｉｐＨＩＶＬ
ＵＣ１のそれと同一である。
【００５１】（２）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３ａ、ここで
ＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片の向きはｐ
ＺｉｐＨＩＶＬＵＣ２のそれと同一である。
ＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片の向きはｐ
ＺｉｐＨＩＶＬＵＣ２のそれと同一である。
【００５２】ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３および３ａにおい
て、３’スプライス部位は欠失されて、転写体から誘導
された、すべてのＨＩＶ−ＬＴＲの発現を促進する。な
ぜなら、配列のスプライシングは存在しないからであ
る。これらの２つのプラスミドは、また、ｎｅｏR遺伝
子を発現せず、こうしてこれらのプラスミドによりトラ
ンスフェクションされたテスター細胞の選択はｐＳＶ２
ＮＥＯで同時トランスフェクションすることによって便
利に実施される。
て、３’スプライス部位は欠失されて、転写体から誘導
された、すべてのＨＩＶ−ＬＴＲの発現を促進する。な
ぜなら、配列のスプライシングは存在しないからであ
る。これらの２つのプラスミドは、また、ｎｅｏR遺伝
子を発現せず、こうしてこれらのプラスミドによりトラ
ンスフェクションされたテスター細胞の選択はｐＳＶ２
ＮＥＯで同時トランスフェクションすることによって便
利に実施される。
【００５３】ｃ、ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣの調製 ＨＩＶの発現は陽性および陰性の両者の調節タンパク質
により調節される。陰性に調節性のタンパク質はＡｖａ
Ｉ切断部位から上流のＬＴＲ−ＤＮＡ配列の５’におい
て相互作用することが発見された（５）。したがって、
ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ系列に対して同様な構成である
が、ＡｖａＩ部位から上流のＨＩＶ−ＬＴＲ配列が欠失
されているものが調製された。図３に概略的に示す欠失
およびクローニングを次のようにして実施した。：プラ
スミドｐＳＶＨＩＶＬＵＣをＡｖａＩで切断した。この
ＡｖａＩはＨＩＶ−ＬＴＲにおいて１回そしてｌｕｃ遺
伝子中で１回切断する。さらに、このプラスミドを、ま
た、ＡＳＰ７１８で切断し、これは再構成されたＡＳＰ
７１８部位において１回切断し、ｐＶＵＩＩおよびＡＳ
Ｐ７１８の間の融合からｐＳＶＬＵＣ１２を生ずる。Ａ
ＳＰ７１８およびＡｖａＩ切断部位の間に位置するＤＮ
Ａ断片が除去された。２つの残りのＤＮＡ断片を一緒に
結合し、不適合のＡＳＰ７１８およびＡｖａＩ粘着末端
をＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を使用してフィルイ
ンし、そして再び結合した。制限酵素の分析によるスク
リーニング後、正しい向きに挿入されたＡＶａＩ断片を
もつプラスミドを収容するクローンを選択した。そのよ
うに産生されたプラスミド、ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣを使
用して、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４、５、６および６ａ
を調製した。プラスミドの調製の方法は、ｐＺｉｐＨＩ
ＶＬＵＣプラスミドのそれに類似した。簡単に述べる
と、この調製は次のようにして実施した：ｐＳＶＨＩＶ
ＬＵＣ中のフィルドインＡＶａＩをＡｓｐ７１８制限部
位のフィルドインへの結合はＡｓｐ７１８切断部位を再
構成する。こうして、プラスミドはＡｓｐ７１８および
ＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、そして１６０ｐｂ欠失の
ＨＩＶ−ＬＴＲ、ｌｕｃ遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシ
グナルおよび部位を含有するＡＳＰ７１８−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片が分離された。この断片をｐＺｉｐのＢａ
ｍＨＩ切断部位の中にｍｖｌ指令転写に関してセンスお
よびアンチセンスの両者の方向に結合し、こうして、そ
れぞれ、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４およびｐＺｉｐ△Ｈ
ＩＶＬＵＣ５が得られるか、あるいはＢａｍＨＩおよび
ＢｇｌＩＩの切断部位の間にＭＬＶに関してアンチセン
スまたはセンスの向きに結合し、こうして、それぞれ、
ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ６およびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵ
Ｃ６ａが得られた。
により調節される。陰性に調節性のタンパク質はＡｖａ
Ｉ切断部位から上流のＬＴＲ−ＤＮＡ配列の５’におい
て相互作用することが発見された（５）。したがって、
ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ系列に対して同様な構成である
が、ＡｖａＩ部位から上流のＨＩＶ−ＬＴＲ配列が欠失
されているものが調製された。図３に概略的に示す欠失
およびクローニングを次のようにして実施した。：プラ
スミドｐＳＶＨＩＶＬＵＣをＡｖａＩで切断した。この
ＡｖａＩはＨＩＶ−ＬＴＲにおいて１回そしてｌｕｃ遺
伝子中で１回切断する。さらに、このプラスミドを、ま
た、ＡＳＰ７１８で切断し、これは再構成されたＡＳＰ
７１８部位において１回切断し、ｐＶＵＩＩおよびＡＳ
Ｐ７１８の間の融合からｐＳＶＬＵＣ１２を生ずる。Ａ
ＳＰ７１８およびＡｖａＩ切断部位の間に位置するＤＮ
Ａ断片が除去された。２つの残りのＤＮＡ断片を一緒に
結合し、不適合のＡＳＰ７１８およびＡｖａＩ粘着末端
をＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を使用してフィルイ
ンし、そして再び結合した。制限酵素の分析によるスク
リーニング後、正しい向きに挿入されたＡＶａＩ断片を
もつプラスミドを収容するクローンを選択した。そのよ
うに産生されたプラスミド、ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣを使
用して、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４、５、６および６ａ
を調製した。プラスミドの調製の方法は、ｐＺｉｐＨＩ
ＶＬＵＣプラスミドのそれに類似した。簡単に述べる
と、この調製は次のようにして実施した：ｐＳＶＨＩＶ
ＬＵＣ中のフィルドインＡＶａＩをＡｓｐ７１８制限部
位のフィルドインへの結合はＡｓｐ７１８切断部位を再
構成する。こうして、プラスミドはＡｓｐ７１８および
ＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、そして１６０ｐｂ欠失の
ＨＩＶ−ＬＴＲ、ｌｕｃ遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシ
グナルおよび部位を含有するＡＳＰ７１８−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片が分離された。この断片をｐＺｉｐのＢａ
ｍＨＩ切断部位の中にｍｖｌ指令転写に関してセンスお
よびアンチセンスの両者の方向に結合し、こうして、そ
れぞれ、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４およびｐＺｉｐ△Ｈ
ＩＶＬＵＣ５が得られるか、あるいはＢａｍＨＩおよび
ＢｇｌＩＩの切断部位の間にＭＬＶに関してアンチセン
スまたはセンスの向きに結合し、こうして、それぞれ、
ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ６およびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵ
Ｃ６ａが得られた。
【００５４】知られているように（６）、クローニング
したホタルのルシフェラーゼのポリＡシグナルは非効率
的であった。ｐＳＶＬＵＣ１２からのＨＩＶ−ＬＴＲ／
ｌｕｃ／ＤＮＡ断片を分離することによって、ポリＡシ
グナルおよびポリＡ部位をｌｕｃ遺伝子の３’末端に添
加しそしてこれらの３’プロセシングシグナルは高度に
効率的であるので、それはｍＲＮＡの効率よい発生を促
進する。
したホタルのルシフェラーゼのポリＡシグナルは非効率
的であった。ｐＳＶＬＵＣ１２からのＨＩＶ−ＬＴＲ／
ｌｕｃ／ＤＮＡ断片を分離することによって、ポリＡシ
グナルおよびポリＡ部位をｌｕｃ遺伝子の３’末端に添
加しそしてこれらの３’プロセシングシグナルは高度に
効率的であるので、それはｍＲＮＡの効率よい発生を促
進する。
【００５５】ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１、１、３および３
ａおよびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４、５、６および６ａ
において、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターの閉塞は５’−
ＭＬＶ−ＬＴＲにより保証され、こうしてルシフェラー
ゼのバックグラウンドの発現はプラスミドｐＡＬＵＣＡ
Ｔにおけるより非常に低い。しかしながら、これらの８
つのプラスミドのうちで、ＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポ
リＡがアンチセンスの向きに挿入されているもの、すな
わち、プラスミドｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１および３、お
よびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４および６、は、他のもの
より有利である。後者のプラスミドにおいて、ＭＬＶ指
令の転写は、ＭＬＶのゲノムのＲＮＡを産生ことがあ
り、ＨＩＶ−ＬＴＲプロセシングシグナルにおいてプロ
セシングすることによって切頭される。
ａおよびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４、５、６および６ａ
において、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターの閉塞は５’−
ＭＬＶ−ＬＴＲにより保証され、こうしてルシフェラー
ゼのバックグラウンドの発現はプラスミドｐＡＬＵＣＡ
Ｔにおけるより非常に低い。しかしながら、これらの８
つのプラスミドのうちで、ＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポ
リＡがアンチセンスの向きに挿入されているもの、すな
わち、プラスミドｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１および３、お
よびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４および６、は、他のもの
より有利である。後者のプラスミドにおいて、ＭＬＶ指
令の転写は、ＭＬＶのゲノムのＲＮＡを産生ことがあ
り、ＨＩＶ−ＬＴＲプロセシングシグナルにおいてプロ
セシングすることによって切頭される。
【００５６】本発明により調製されるか、あるいはこれ
らのプラスミドの調製において使用されるプラスミド
を、下表１に列挙する：
らのプラスミドの調製において使用されるプラスミド
を、下表１に列挙する：
【００５７】
【表１】表１ ｐＳＶＬＵＣ−Ｇ［Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、
トイツ国］：ｌｕｃ遺伝子に融合されたプロモーター； ｐＲＳＶＴＡＴ［Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、ト
イツ国］：ＲＳＶ−ＬＴＲに融合されたＨＩＶ ｔａｔ
遺伝子； ｐＡＣＡＴ［ＢＴＧ、Ａ．パネット（Ｐａｎｅｔ）］：
ＨＩＶ−ＬＴＲに融合されたｃａｔ遺伝子； ｐＢＲ３２２［ボリヴァー（Ｂｏｌｉｖａｒ）、Ｆ．
ら、１９７７（２）］：ＡｍｐR遺伝子； ｐＢＲＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＡＬＵＣＡＴ［この研究］：テキストを参照； ｐＳＶ2ＣＡＴ［ゴールマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９
８２（３）］； ｐＳＶ2ＮＥＯ［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、１９
８２（７）］； ｐＳＶＨＩＶＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＺＩＰ［セプコ（Ｃｅｐｋｏ）、Ｃ．Ｌ．］ら、１９
８４（４）］； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−１［この研究］：ＭＬＶ転写に
対して反対方向のＢａｍＨＩ部位におけるＨＩＶ−ＬＴ
ＲＬＵＣインサート； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−２［この研究］：ｐＺｉｐＨＩ
ＶＬＵＣ−１と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲＬＵＣイ
ンサートはＭＬＶ転写と同一の向きに挿入されている； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−３［この研究］：ＨＩＶ−ＬＴ
ＲＬＵＣはＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩの間にＭＬＶ転写に
対して反対方向に挿入されている； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−３ａ［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−３と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲＬＵＣ
インサートはＭＬＶ転写と同一の向きに挿入されてい
る； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−４［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−１と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−５［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−２と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−６［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−３と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−６ａ［この研究］：ｐＺｉｐ
ＨＩＶＬＵＣ−３ａと同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは
５’末端において１６０ｂｐ欠失されている。
トイツ国］：ｌｕｃ遺伝子に融合されたプロモーター； ｐＲＳＶＴＡＴ［Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、ト
イツ国］：ＲＳＶ−ＬＴＲに融合されたＨＩＶ ｔａｔ
遺伝子； ｐＡＣＡＴ［ＢＴＧ、Ａ．パネット（Ｐａｎｅｔ）］：
ＨＩＶ−ＬＴＲに融合されたｃａｔ遺伝子； ｐＢＲ３２２［ボリヴァー（Ｂｏｌｉｖａｒ）、Ｆ．
ら、１９７７（２）］：ＡｍｐR遺伝子； ｐＢＲＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＡＬＵＣＡＴ［この研究］：テキストを参照； ｐＳＶ2ＣＡＴ［ゴールマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９
８２（３）］； ｐＳＶ2ＮＥＯ［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、１９
８２（７）］； ｐＳＶＨＩＶＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＺＩＰ［セプコ（Ｃｅｐｋｏ）、Ｃ．Ｌ．］ら、１９
８４（４）］； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−１［この研究］：ＭＬＶ転写に
対して反対方向のＢａｍＨＩ部位におけるＨＩＶ−ＬＴ
ＲＬＵＣインサート； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−２［この研究］：ｐＺｉｐＨＩ
ＶＬＵＣ−１と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲＬＵＣイ
ンサートはＭＬＶ転写と同一の向きに挿入されている； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−３［この研究］：ＨＩＶ−ＬＴ
ＲＬＵＣはＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩの間にＭＬＶ転写に
対して反対方向に挿入されている； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−３ａ［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−３と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲＬＵＣ
インサートはＭＬＶ転写と同一の向きに挿入されてい
る； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−４［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−１と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−５［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−２と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−６［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−３と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−６ａ［この研究］：ｐＺｉｐ
ＨＩＶＬＵＣ−３ａと同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは
５’末端において１６０ｂｐ欠失されている。
【００５８】次の実験において使用するプラスミドのあ
るものはＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域は図４示されてい
る。
るものはＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域は図４示されてい
る。
【００５９】細胞系 ヒト２９３細胞系をｐＡＬＵＣＡＴで安定にトランスフ
ェクションし、そして遺伝子のコピー数をメタトロキセ
ート選択により増幅した（参照、実験の詳細につい
て）。次いで、これらのトランスフェクションした細胞
を、Ｔ4−ｐＭＶ７を使用するトランスフェクション
（９、６）後ＰＡ３１７細胞系中でつくった両栄養性レ
トロウイルスのベクターを有するＣＤ４により感染さ
せ、そして二重のクローンをｎｅｏR表現型により選択
した。ＣＤ４レセプターの存在は、抗ＣＤ４抗体により
評価した。ｌｕｃ遺伝子の産生物は光の測定により評価
した。
ェクションし、そして遺伝子のコピー数をメタトロキセ
ート選択により増幅した（参照、実験の詳細につい
て）。次いで、これらのトランスフェクションした細胞
を、Ｔ4−ｐＭＶ７を使用するトランスフェクション
（９、６）後ＰＡ３１７細胞系中でつくった両栄養性レ
トロウイルスのベクターを有するＣＤ４により感染さ
せ、そして二重のクローンをｎｅｏR表現型により選択
した。ＣＤ４レセプターの存在は、抗ＣＤ４抗体により
評価した。ｌｕｃ遺伝子の産生物は光の測定により評価
した。
【００６０】同様な方法において、また、２９３細胞を
ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１〜３ａおよびｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４〜６ａプラスミドでトランスフェクションし
た。
ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１〜３ａおよびｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４〜６ａプラスミドでトランスフェクションし
た。
【００６１】光の生成によりルシフェラーゼの発現の監
視 以下において、いくつかの実験を記載し、ここで細胞中
のルシフェラーゼの発現は光の生成を監視することによ
って決定した。光の生成を監視する手順は、次の通りで
あった：手順 ：テスター細胞のリゼイト中の光の生成の検出 種々の実験手順に従いテスター細胞をインキュベーショ
ンした後、細胞を収穫し、ＰＢＳですすぎ、そしてその
抽出物を１％のトリトンＸ−１００、１％のＢＳＡ、１
５％のグリセロール、１ミリモルのＤＴＴ、８ミリモル
のＭｇＣｌ2、１ミリモルのＥＤＴＡおよび２５ミリモ
ルのトリスアセテートｐＨ７．８から成る溶菌緩衝液
（１００μｌ／１０6細胞）の添加によりつくた。次い
で、１０μｌの抽出物を２５０μｌの溶菌緩衝液、４μ
ｌの４０ミリモルのＡＴＰと混合し、次いで化学発光の
測定のために調節したパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）液
体シンチレーションカウンター内のシンチレーションバ
イアルに入れた。次いで、８０μｌの２ミリモルのルシ
フェリン溶液［ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
を添加し、そしてカウンターにおける光の生成の程度／
分（Ｃ．Ｐ．Ｍ．）を測定した。
視 以下において、いくつかの実験を記載し、ここで細胞中
のルシフェラーゼの発現は光の生成を監視することによ
って決定した。光の生成を監視する手順は、次の通りで
あった：手順 ：テスター細胞のリゼイト中の光の生成の検出 種々の実験手順に従いテスター細胞をインキュベーショ
ンした後、細胞を収穫し、ＰＢＳですすぎ、そしてその
抽出物を１％のトリトンＸ−１００、１％のＢＳＡ、１
５％のグリセロール、１ミリモルのＤＴＴ、８ミリモル
のＭｇＣｌ2、１ミリモルのＥＤＴＡおよび２５ミリモ
ルのトリスアセテートｐＨ７．８から成る溶菌緩衝液
（１００μｌ／１０6細胞）の添加によりつくた。次い
で、１０μｌの抽出物を２５０μｌの溶菌緩衝液、４μ
ｌの４０ミリモルのＡＴＰと混合し、次いで化学発光の
測定のために調節したパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）液
体シンチレーションカウンター内のシンチレーションバ
イアルに入れた。次いで、８０μｌの２ミリモルのルシ
フェリン溶液［ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
を添加し、そしてカウンターにおける光の生成の程度／
分（Ｃ．Ｐ．Ｍ．）を測定した。
【００６２】本発明手順：全生長するテスター細胞にお
ける光の生成の検出 全テスター細胞からの光の放射を光検出カメラ（ＬＤ
Ｃ）装置により測定した。ＬＤＣ装置はポラロイドフィ
ルムのカッセットから成り、スライドシャッターを装備
しそして空気が自由に流れるが、光が入らないカバーを
有する軽量ブラックボックスを装備した。
ける光の生成の検出 全テスター細胞からの光の放射を光検出カメラ（ＬＤ
Ｃ）装置により測定した。ＬＤＣ装置はポラロイドフィ
ルムのカッセットから成り、スライドシャッターを装備
しそして空気が自由に流れるが、光が入らないカバーを
有する軽量ブラックボックスを装備した。
【００６３】皿、分裂中期またはチャンバーのスライド
の中のテスター細胞の培養物をホルダーに取り付け、こ
れらのホルダーは皿、プレートおよびスライドの底をポ
ラロイドフィルムに直接接触して保持した。次いで、
０．３ミリモルの最終濃度でルシフェリンを生長培地に
添加し、そしてＬＤＣをＣＯ2インキュベーター内に配
置し、そしてシャッターを所望の間隔で開いた。
の中のテスター細胞の培養物をホルダーに取り付け、こ
れらのホルダーは皿、プレートおよびスライドの底をポ
ラロイドフィルムに直接接触して保持した。次いで、
０．３ミリモルの最終濃度でルシフェリンを生長培地に
添加し、そしてＬＤＣをＣＯ2インキュベーター内に配
置し、そしてシャッターを所望の間隔で開いた。
【００６４】実験の結果
【００６５】
【実施例】実施例１ ： ２９３細胞をプラスミドｐＳＶ△ＨＩＶＬ
ＵＣまたはｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ（５μｇのＤＮＡ／
皿）でトランスフェクションするか、あるいはｐＲＳＶ
ＴＡＴと一緒にこれらの２つのプラスミドの１つで一時
的に同時トランスフェクションした。光の放射は細胞抽
出物について手順Ａの方法により監視するか、あるいは
全細胞について手順Ｂの方法により監視した。
ＵＣまたはｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ（５μｇのＤＮＡ／
皿）でトランスフェクションするか、あるいはｐＲＳＶ
ＴＡＴと一緒にこれらの２つのプラスミドの１つで一時
的に同時トランスフェクションした。光の放射は細胞抽
出物について手順Ａの方法により監視するか、あるいは
全細胞について手順Ｂの方法により監視した。
【００６６】細胞抽出物における光の放射を測定するこ
とによって得られた結果を、下表６に示す：
とによって得られた結果を、下表６に示す：
【００６７】
【表２】 表 ２ プラスミド プラスミド単独 ｐＲＳＶＴＡＴ 同時トランス で同時トランス フェクション フェクション 後の増加（倍） pSV△HIVLUC 2‐7 × 104* 5 × 106 × 100 pZip△HIVLUC4 3‐3.5 × 103* 1 × 107 × 3,000 ＊種々の実験における差の範囲 本発明による手順に従い全生長する細胞について培地さ
れた２つのトランスフェクションした細胞における基本
的光の生成は、図５に示す。理解できるように、本発明
の手順に従い測定した光の生成の結果は参考手順により
得られたものと非常によく相関関係をもつ。
れた２つのトランスフェクションした細胞における基本
的光の生成は、図５に示す。理解できるように、本発明
の手順に従い測定した光の生成の結果は参考手順により
得られたものと非常によく相関関係をもつ。
【００６８】さらに理解できるように、ｐＺｉｐ△ＨＩ
ＶＬＵＣ４でトランスフェクションしたした細胞におけ
る基礎的光の生成はｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣでトランスフ
ェクションした細胞のそれより低く、さらに、同時トラ
ンスフェクション後の光の生成の増加は前者において非
常にいっそう顕著である。こうして、これらの結果が明
瞭に実証するように、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターが
５’ＭＬＶ−ＬＴＲにより閉塞されているプラスミド、
例えば、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４を使用すると、この
ような閉塞が起こらないプラスミド、例えば、ｐＳＶ△
ＨＩＶＬＵＣの使用を越えた利点が得られる。
ＶＬＵＣ４でトランスフェクションしたした細胞におけ
る基礎的光の生成はｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣでトランスフ
ェクションした細胞のそれより低く、さらに、同時トラ
ンスフェクション後の光の生成の増加は前者において非
常にいっそう顕著である。こうして、これらの結果が明
瞭に実証するように、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターが
５’ＭＬＶ−ＬＴＲにより閉塞されているプラスミド、
例えば、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４を使用すると、この
ような閉塞が起こらないプラスミド、例えば、ｐＳＶ△
ＨＩＶＬＵＣの使用を越えた利点が得られる。
【００６９】実施例２：２９３細胞をｐＲＳＶＴＡＴお
よびｐＳＶ２ＮＥＯで１０：１のモル比において同時ト
ランスフェクションした。ネオマイシン抵抗性のクロー
ンをネオマイシン類似体、Ｇ４１８［シグマ・カンパニ
ー（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）、米国］の使用により選択し
た。ｔａｔを発現するクローンを同定するために、全体
のＲＮＡをテスター細胞のＧ４１８抵抗性クローンの各
から得、グアニジウムイソチオシアネート−塩化リチウ
ム方法（１０）により精製した。次いで、等しい量のＲ
ＮＡをニトロセルロースのフィルター上にスポッティン
グし、そしてｐＲＳＶＴＡＴプラスミドに対してハイブ
リダイゼーションした（１１）。任意に２３９／ｔａｔ
１、２３９／ｔａｔ５および２３９／ｔａｔ１４と表示
する、３つのクローンからの結果を図６に示し、ここで
上の列はクローン２３９／ｔａｔ１、２３９／ｔａｔ５
および２３９／ｔａｔ１４のドット−ハイブリダイゼー
ションからの結果を示し、下の中央のドット（Ｃ）はス
ポッティングしたｐＲＳＶＴＡＴと陽性の対照−ハイブ
リダイゼーションを示し、そして下の右のコーナー
（Ｍ）は偽トランスフェクションの２９３細胞から分離
したＲＮＡの陰性の対照のドットを含有した。
よびｐＳＶ２ＮＥＯで１０：１のモル比において同時ト
ランスフェクションした。ネオマイシン抵抗性のクロー
ンをネオマイシン類似体、Ｇ４１８［シグマ・カンパニ
ー（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）、米国］の使用により選択し
た。ｔａｔを発現するクローンを同定するために、全体
のＲＮＡをテスター細胞のＧ４１８抵抗性クローンの各
から得、グアニジウムイソチオシアネート−塩化リチウ
ム方法（１０）により精製した。次いで、等しい量のＲ
ＮＡをニトロセルロースのフィルター上にスポッティン
グし、そしてｐＲＳＶＴＡＴプラスミドに対してハイブ
リダイゼーションした（１１）。任意に２３９／ｔａｔ
１、２３９／ｔａｔ５および２３９／ｔａｔ１４と表示
する、３つのクローンからの結果を図６に示し、ここで
上の列はクローン２３９／ｔａｔ１、２３９／ｔａｔ５
および２３９／ｔａｔ１４のドット−ハイブリダイゼー
ションからの結果を示し、下の中央のドット（Ｃ）はス
ポッティングしたｐＲＳＶＴＡＴと陽性の対照−ハイブ
リダイゼーションを示し、そして下の右のコーナー
（Ｍ）は偽トランスフェクションの２９３細胞から分離
したＲＮＡの陰性の対照のドットを含有した。
【００７０】次いで、２つのクローンｔａｔ１およびｔ
ａｔ１４からの１０5細胞を１μｇのｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４のＤＮＡでトランスフェクションした。トラン
スフェクション後２４時間に、ルシフェリンを添加し、
そして光の放射を生細胞において手順Ｂの方法に従い監
視した。結果を図７に示し、ここでａおよびｃおよびｂ
およびｄは、それぞれ、クローン２９３／ｔａｔ１４お
よび２９３／ｔａｔ１である、ａおよびｂ−５時間の暴
露、ｃおよびｄ−１７時間の暴露。
ａｔ１４からの１０5細胞を１μｇのｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４のＤＮＡでトランスフェクションした。トラン
スフェクション後２４時間に、ルシフェリンを添加し、
そして光の放射を生細胞において手順Ｂの方法に従い監
視した。結果を図７に示し、ここでａおよびｃおよびｂ
およびｄは、それぞれ、クローン２９３／ｔａｔ１４お
よび２９３／ｔａｔ１である、ａおよびｂ−５時間の暴
露、ｃおよびｄ−１７時間の暴露。
【００７１】明瞭に理解することができるように、光の
放射の結果はドット−ハイブリダイゼーションにより検
出される特異的ｔａｔ−ＲＮＡＲＮＡの量と顕著に相関
関係をもつ。ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェ
クションしなかった２９３／ｔａｔ１細胞において光の
放射は検出されなかった（結果は示されていない）。培
養のプレートの顕微鏡検査において、光のスポットは２
〜１０の細胞の凝集物に相当することが示された。これ
が示すように、手順Ｂに従う光の検出の方法は１または
数個の細胞のみのｌｕｃ活性を明らかにすることができ
る。
放射の結果はドット−ハイブリダイゼーションにより検
出される特異的ｔａｔ−ＲＮＡＲＮＡの量と顕著に相関
関係をもつ。ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェ
クションしなかった２９３／ｔａｔ１細胞において光の
放射は検出されなかった（結果は示されていない）。培
養のプレートの顕微鏡検査において、光のスポットは２
〜１０の細胞の凝集物に相当することが示された。これ
が示すように、手順Ｂに従う光の検出の方法は１または
数個の細胞のみのｌｕｃ活性を明らかにすることができ
る。
【００７２】実施例３：２９３細胞をｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４で一時的にトランスフェクションし、そして４
つのチャンバースライド中で生長させた、５×１０4細
胞／チャンバー。クローン２９３／ｔａｔ１、２９３／
ｔａｔ５および２９３／ｔａｔ１４（参照、実施例２）
および対照のクローン、２９３／ｐＲＳＶ、ｐＲＳＶプ
ラスミド（ｐＲＳＶＴＡＴに類似するが、ｔａｔ遺伝子
を含有しない）でトランスフェクションした、の各々の
１０5細胞の抽出物の等しいアリコートの各々を１つの
チャンバーに添加し、そして光の放射を本発明の手順に
従い監視した。クローン２９３／ＰＲＳＶ、２９３／ｔ
ａｔ５、２９３／ｔａｔ１４および２９３／ｔａｔ１か
らの抽出物への暴露後の光の放射を、それぞれ、図８
ａ、ｂ、ｃおよびｄに示す。結果を図６のそれらと比較
するとき、理解できるように、トランスフェクション後
の光の放射は抽出した細胞におけるｔａｔ遺伝子の発現
の程度と顕著に相関関係をもつ。
ＬＵＣ４で一時的にトランスフェクションし、そして４
つのチャンバースライド中で生長させた、５×１０4細
胞／チャンバー。クローン２９３／ｔａｔ１、２９３／
ｔａｔ５および２９３／ｔａｔ１４（参照、実施例２）
および対照のクローン、２９３／ｐＲＳＶ、ｐＲＳＶプ
ラスミド（ｐＲＳＶＴＡＴに類似するが、ｔａｔ遺伝子
を含有しない）でトランスフェクションした、の各々の
１０5細胞の抽出物の等しいアリコートの各々を１つの
チャンバーに添加し、そして光の放射を本発明の手順に
従い監視した。クローン２９３／ＰＲＳＶ、２９３／ｔ
ａｔ５、２９３／ｔａｔ１４および２９３／ｔａｔ１か
らの抽出物への暴露後の光の放射を、それぞれ、図８
ａ、ｂ、ｃおよびｄに示す。結果を図６のそれらと比較
するとき、理解できるように、トランスフェクション後
の光の放射は抽出した細胞におけるｔａｔ遺伝子の発現
の程度と顕著に相関関係をもつ。
【００７３】実施例４：２９３細胞はｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４およびｐＳＶ２ＮＥＯで同時トランスフェクシ
ョンした。ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４プラスミドを収容
する独立のＧ４１８抵抗性クローンを、ルシフェリンの
存在下にマルチ−ベイル（ｍｕｌｔｉ−ｖａｌｅ）の滴
定プレート中で生長させるときの光の放射により、手順
Ｂの方法に従い同定した。２９３／ｌｕｃ３４と表示す
るクローンは、ＴＡＴの不存在下に低い光の放射を示
し、それ以上の実験のために選択した。
ＬＵＣ４およびｐＳＶ２ＮＥＯで同時トランスフェクシ
ョンした。ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４プラスミドを収容
する独立のＧ４１８抵抗性クローンを、ルシフェリンの
存在下にマルチ−ベイル（ｍｕｌｔｉ−ｖａｌｅ）の滴
定プレート中で生長させるときの光の放射により、手順
Ｂの方法に従い同定した。２９３／ｌｕｃ３４と表示す
るクローンは、ＴＡＴの不存在下に低い光の放射を示
し、それ以上の実験のために選択した。
【００７４】２９３／ｌｕｃ３４細胞を、各チャンバー
の中に等しい数の細胞を含有する二重チャンバーのスラ
イド中でインキュベーションした。ｐＲＳＶＴＡＴプラ
スミドでトランスフェクションした２９３細胞からの抽
出物を１つのチャンバーに添加し、そして正常の非トラ
ンスフェクションの２９３細胞を他方に添加した。２時
間後、ルシフェリンを添加し、そして光の放射を手順Ｂ
の方法に従い決定した。結果を図９に示し、ここで２９
３／ｌｕｃ３４テスター細胞をｐＲＳＶＴＡＴトランス
フェクションした２９３細胞からの細胞抽出物の存在下
にインキュベーションしたとき、光の放射はかなり増加
することが実証される。
の中に等しい数の細胞を含有する二重チャンバーのスラ
イド中でインキュベーションした。ｐＲＳＶＴＡＴプラ
スミドでトランスフェクションした２９３細胞からの抽
出物を１つのチャンバーに添加し、そして正常の非トラ
ンスフェクションの２９３細胞を他方に添加した。２時
間後、ルシフェリンを添加し、そして光の放射を手順Ｂ
の方法に従い決定した。結果を図９に示し、ここで２９
３／ｌｕｃ３４テスター細胞をｐＲＳＶＴＡＴトランス
フェクションした２９３細胞からの細胞抽出物の存在下
にインキュベーションしたとき、光の放射はかなり増加
することが実証される。
【００７５】ルシフェリン添加後の暴露時間はテスター
細胞の密度に大きい程度にに依存し、こうしてそれらの
濃度によりかなり減少させることができることに注意す
べきである。細胞を透明な試験管中の遠心により沈澱さ
せるとき、手順Ｂの方法により光の放射を記録するため
に必要な暴露時間はちょうど数分に減少することができ
る。２分の暴露後の、この方法において濃縮した２９３
／ｌｕｃ３４細胞の調製物からの光の放射の結果を図１
０に示す。
細胞の密度に大きい程度にに依存し、こうしてそれらの
濃度によりかなり減少させることができることに注意す
べきである。細胞を透明な試験管中の遠心により沈澱さ
せるとき、手順Ｂの方法により光の放射を記録するため
に必要な暴露時間はちょうど数分に減少することができ
る。２分の暴露後の、この方法において濃縮した２９３
／ｌｕｃ３４細胞の調製物からの光の放射の結果を図１
０に示す。
【００７６】こうして、本発明の手順の方法に従う、全
生テスター細胞による光の生成の監視は、媒質中のＴＡ
Ｔの存在を同定する容易なかつ迅速な方法を提供する。
生テスター細胞による光の生成の監視は、媒質中のＴＡ
Ｔの存在を同定する容易なかつ迅速な方法を提供する。
【００７７】実施例５：１０4の２９３／ｌｕｃ３４細
胞を７ウェルの各々の中に接種し、次いで１０6のＨＵ
Ｔ７８細胞の２０ｍｌの抽出物（１２）をウェルの１つ
に添加し、そして等しい体積の１０倍の希釈物を他の６
つのウェルの５つの各々に添加した（１０-5までの希
釈）。１つのウェルにおいて、非感染細胞抽出物を対照
として添加した。光の放射を手順Ｂの方法により検出
し、そして結果を図１１に示す。
胞を７ウェルの各々の中に接種し、次いで１０6のＨＵ
Ｔ７８細胞の２０ｍｌの抽出物（１２）をウェルの１つ
に添加し、そして等しい体積の１０倍の希釈物を他の６
つのウェルの５つの各々に添加した（１０-5までの希
釈）。１つのウェルにおいて、非感染細胞抽出物を対照
として添加した。光の放射を手順Ｂの方法により検出
し、そして結果を図１１に示す。
【００７８】理解できるように、光はすべての試験ウェ
ルから放射したが、光の放射は対照のウェル（左のウェ
ル）において見られた。これらの結果が、また、実証す
るように、非常に少量のＴＡＴタンパク質を検出するこ
とができる。
ルから放射したが、光の放射は対照のウェル（左のウェ
ル）において見られた。これらの結果が、また、実証す
るように、非常に少量のＴＡＴタンパク質を検出するこ
とができる。
【００７９】実施例６：ＨＩＶ血清が陽性およびランダ
ムの血液のドナーの血液試料からのリンパ球を、標準の
密度勾配の遠心により分離した。約１０4〜１０６の細
胞を凍結および融解により溶菌し、次いでリゼイトを１
０倍に希釈し、そして２０μｌを１０4の２９３／ｌｕ
ｃ３４細胞を含有するウェルに添加した。光の放射を手
順Ｂの方法により試験した。
ムの血液のドナーの血液試料からのリンパ球を、標準の
密度勾配の遠心により分離した。約１０4〜１０６の細
胞を凍結および融解により溶菌し、次いでリゼイトを１
０倍に希釈し、そして２０μｌを１０4の２９３／ｌｕ
ｃ３４細胞を含有するウェルに添加した。光の放射を手
順Ｂの方法により試験した。
【００８０】正常の血液試料を試験したとき、光の放射
は検出されなかったが、ＨＩＶ血清陽性の血液からのす
べての抽出物は２９３／ｌｕｃ３４細胞から光を放射さ
せた。
は検出されなかったが、ＨＩＶ血清陽性の血液からのす
べての抽出物は２９３／ｌｕｃ３４細胞から光を放射さ
せた。
【００８１】参考文献 １、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら（１９８８）、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）、１７５、５−７３。
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）、１７５、５−７３。
【００８２】２、ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら（１９
７７）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２、９５−１３。
７７）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２、９５−１３。
【００８３】３、ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら（１９８
２）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、２、１０４４−１
０５１。
２）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、２、１０４４−１
０５１。
【００８４】４、セプコ（Ｃｅｐｋｏ）ら（１９８
４）、細胞（Ｃｅｌｌ）、３７、１０５３−１０６２。
４）、細胞（Ｃｅｌｌ）、３７、１０５３−１０６２。
【００８５】５、ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）ら（１９８
７）、ＥＭＢＯ、６、３７６１。 ６、デ・ウェット（Ｄｅ Ｗｅｔ）ら（１９８７）、モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、７、７２５−７３７。
７）、ＥＭＢＯ、６、３７６１。 ６、デ・ウェット（Ｄｅ Ｗｅｔ）ら（１９８７）、モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、７、７２５−７３７。
【００８６】７、サザン（Ｓｏｔｈｅｒｎ）ら（１９８
２）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプ
ライド・ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）、１、３７７−３４１。
２）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプ
ライド・ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）、１、３７７−３４１。
【００８７】８、シメンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）ら
（１９８３）、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８０、２４９５−２
４９９。
（１９８３）、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８０、２４９５−２
４９９。
【００８８】９、マッドン（Ｍａｄｄｏｎ）ら（１９８
６）、細胞（Ｃｅｌｌ）、４７、３３３−３４８。
６）、細胞（Ｃｅｌｌ）、４７、３３３−３４８。
【００８９】１０、チルグイン（Ｃｈｉｒｇｕｉｎ）ら
（１９７９）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、１８、５２９４−５２９９。
（１９７９）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、１８、５２９４−５２９９。
【００９０】１１、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
（１９８２）、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コール
ド・ハーバー、ニューヨーク、米国。
（１９８２）、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コール
ド・ハーバー、ニューヨーク、米国。
【００９１】１３、ガズダー（Ｇａｚｄａｒ）ら（１９
８０）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、５８、４０９−４１７。
８０）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、５８、４０９−４１７。
【００９２】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
である。
【００９３】１、工程： ａ）テスター細胞を準備し、前記テスター細胞はｉ）イ
ンデューサー物質により誘発可能なプロモーターおよび
前記プロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子から
なる発現ベクターを構成し、前記発現ベクターは前記イ
ンデューサー物質の不存在下に低いレベルでそしてその
存在下に高いレベルでｌｕｃ遺伝子を発現することがで
き、そしてｉｉ）取り囲む媒質からルシフェリンを吸収
しそして高いレベルで遺伝子を発現することができる細
胞を選択し、そしてこれらの細胞を前記発現ベクターで
トランスフェクションすることによって調製され、 ｂ）テスター細胞をｌｕｃ遺伝子の発現が光を発生する
条件下に培養し、そして ｃ）適当な手段により光の発生を監視し、あるレベルよ
り上の光の発生は前記細胞中の前記インデューサー物質
の存在を示す、からなる、細胞中のインデューサー物質
の存在を検出する方法。
ンデューサー物質により誘発可能なプロモーターおよび
前記プロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子から
なる発現ベクターを構成し、前記発現ベクターは前記イ
ンデューサー物質の不存在下に低いレベルでそしてその
存在下に高いレベルでｌｕｃ遺伝子を発現することがで
き、そしてｉｉ）取り囲む媒質からルシフェリンを吸収
しそして高いレベルで遺伝子を発現することができる細
胞を選択し、そしてこれらの細胞を前記発現ベクターで
トランスフェクションすることによって調製され、 ｂ）テスター細胞をｌｕｃ遺伝子の発現が光を発生する
条件下に培養し、そして ｃ）適当な手段により光の発生を監視し、あるレベルよ
り上の光の発生は前記細胞中の前記インデューサー物質
の存在を示す、からなる、細胞中のインデューサー物質
の存在を検出する方法。
【００９４】２、細胞は１または２以上のプレオトロピ
ック（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃ）インデューサーをエンコ
ードする遺伝子を含有する、上記第１項記載の方法。
ック（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃ）インデューサーをエンコ
ードする遺伝子を含有する、上記第１項記載の方法。
【００９５】３、細胞は２９３細胞系から誘導される、
上記第１または２項記載の方法。
上記第１または２項記載の方法。
【００９６】４、前記細胞はウイルスで感染させること
ができ、そして前記インデューサー物質はウイルスのゲ
ノムによりエンコードされる物質である、試験した試料
中の生存能力のあるウイルス粒子の存在を検出する、上
記第１〜３項のいずれかに記載の方法。
ができ、そして前記インデューサー物質はウイルスのゲ
ノムによりエンコードされる物質である、試験した試料
中の生存能力のあるウイルス粒子の存在を検出する、上
記第１〜３項のいずれかに記載の方法。
【００９７】５、前記細胞は取り囲む媒質からある因子
を吸収することができ、そして前記インデューサー物質
は前記因子であるか、あるいはその酵素的修飾後に得ら
れた物質である、媒質中の前記因子の存在を検出する、
上記第１〜３項のいずれかに記載の方法。
を吸収することができ、そして前記インデューサー物質
は前記因子であるか、あるいはその酵素的修飾後に得ら
れた物質である、媒質中の前記因子の存在を検出する、
上記第１〜３項のいずれかに記載の方法。
【００９８】６、前記細胞はその外表面上のリガンドお
よび第２メッセンジャーを産生する関連する機構からな
り、前記インデューサー物質は前記第２メッセンジャー
である、媒質中でリガンドを検出する、上記第１〜３項
のいずれかに記載の方法。
よび第２メッセンジャーを産生する関連する機構からな
り、前記インデューサー物質は前記第２メッセンジャー
である、媒質中でリガンドを検出する、上記第１〜３項
のいずれかに記載の方法。
【００９９】７、その中のインデューサー物質の存在下
にシグナルを発生することができ、取り囲む媒質からル
シフェラーゼを吸収しそして高いレベルで遺伝子を発現
することができる細胞であり、前記細胞は前記インデュ
ーサー物質により誘発可能なプロモーターおよび前記プ
ロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子からなる発
現ベクターによりトランスフェクションされている、テ
スター細胞。
にシグナルを発生することができ、取り囲む媒質からル
シフェラーゼを吸収しそして高いレベルで遺伝子を発現
することができる細胞であり、前記細胞は前記インデュ
ーサー物質により誘発可能なプロモーターおよび前記プ
ロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子からなる発
現ベクターによりトランスフェクションされている、テ
スター細胞。
【０１００】８、プレオトロピックインデューサーをエ
ンコードする１または２以上の遺伝子からなる、上記第
７項記載の細胞。
ンコードする１または２以上の遺伝子からなる、上記第
７項記載の細胞。
【０１０１】９、２９３細胞系から誘導された、上記第
８項記載の細胞。
８項記載の細胞。
【０１０２】１０、取り囲む媒質から他の前記インデュ
ーサー物質または細胞中の酵素により前記インデューサ
ー物質に修飾される因子を吸収することができる、上記
第７〜９項のいずれかに記載の細胞。
ーサー物質または細胞中の酵素により前記インデューサ
ー物質に修飾される因子を吸収することができる、上記
第７〜９項のいずれかに記載の細胞。
【０１０３】１１、リガンドをその外側膜上に結合する
ことができるレセプターからなり、リガンドの前記レセ
プターへの結合は第２メッセンジャーを細胞中で産生さ
せ、そして前記インデューサー物質は前記第２メッセン
ジャーである、上記第７〜９項のいずれかに記載の細
胞。
ことができるレセプターからなり、リガンドの前記レセ
プターへの結合は第２メッセンジャーを細胞中で産生さ
せ、そして前記インデューサー物質は前記第２メッセン
ジャーである、上記第７〜９項のいずれかに記載の細
胞。
【０１０４】１２、ウイルスで感染させることができ、
そして前記インデューサー物質は前記ウイルスのゲノム
によりエンコードされる物質である、上記第７〜９項の
いずれかに記載の細胞。
そして前記インデューサー物質は前記ウイルスのゲノム
によりエンコードされる物質である、上記第７〜９項の
いずれかに記載の細胞。
【０１０５】１３、取り囲む媒質からルシフェリンを吸
収しそして遺伝子を高いレベルで発現することができる
細胞を選択し、前記細胞をインデューサー物質により誘
発可能なプロモーターおよび前記プロモーターの発現制
御下にあるｌｕｃ遺伝子からなる発現ベクターによりト
ランスフェクションすることからなり、前記発現ベクタ
ーはｌｕｃ遺伝子を前記インデューサー物質の不存在下
に低いレベルでそしてその存在下に高いレベルで発現す
ることができる、インデューサー物質のその中の存在下
にシグナルを発生することができる、上記第７〜１２項
のいずれかに記載の細胞を調製する方法。
収しそして遺伝子を高いレベルで発現することができる
細胞を選択し、前記細胞をインデューサー物質により誘
発可能なプロモーターおよび前記プロモーターの発現制
御下にあるｌｕｃ遺伝子からなる発現ベクターによりト
ランスフェクションすることからなり、前記発現ベクタ
ーはｌｕｃ遺伝子を前記インデューサー物質の不存在下
に低いレベルでそしてその存在下に高いレベルで発現す
ることができる、インデューサー物質のその中の存在下
にシグナルを発生することができる、上記第７〜１２項
のいずれかに記載の細胞を調製する方法。
【０１０６】１４、インデューサー物質により誘発可能
なプロモーターおよび前記プロモーターの発現制御下に
あるｌｕｃ遺伝子からなる発現ベクターによりトランス
フェクションすることからなり発現ベクターであって、
前記発現ベクターはｌｕｃ遺伝子を前記インデューサー
物質の不存在下に低いレベルでそしてその存在下に高い
レベルで発現することができ、インデューサー物質のそ
の中の存在下にシグナルを発生することができるテスタ
ー細胞を調製するために細胞をトランスフェクションす
るとき有用な発現ベクター。
なプロモーターおよび前記プロモーターの発現制御下に
あるｌｕｃ遺伝子からなる発現ベクターによりトランス
フェクションすることからなり発現ベクターであって、
前記発現ベクターはｌｕｃ遺伝子を前記インデューサー
物質の不存在下に低いレベルでそしてその存在下に高い
レベルで発現することができ、インデューサー物質のそ
の中の存在下にシグナルを発生することができるテスタ
ー細胞を調製するために細胞をトランスフェクションす
るとき有用な発現ベクター。
【０１０７】１５、また、異種ポリアデニル化部位およ
びシグナルからなる、上記第１４項記載の発現ベクタ
ー。
びシグナルからなる、上記第１４項記載の発現ベクタ
ー。
【０１０８】１６、前記ポリアデニル化部位およびシグ
ナルはＳＶ４０のそれである、上記第１５項記載の発現
ベクター。
ナルはＳＶ４０のそれである、上記第１５項記載の発現
ベクター。
【０１０９】１７、前記インデューサー物質により誘発
可能な試験プロモーターおよび他のインデューサー物質
により誘発可能な閉塞プロモーターからなり、前記閉塞
プロモーターは両者のプロモーターのためのインデュー
サー物質の不存在下に試験プロモーターより活性であ
り、試験プロモーターは前記閉塞プロモーターより下流
に存在し、２つのプロモーターの間に転写停止シグナル
は存在しない、上記第１４〜１６項のいずれかに記載の
発現ベクター。
可能な試験プロモーターおよび他のインデューサー物質
により誘発可能な閉塞プロモーターからなり、前記閉塞
プロモーターは両者のプロモーターのためのインデュー
サー物質の不存在下に試験プロモーターより活性であ
り、試験プロモーターは前記閉塞プロモーターより下流
に存在し、２つのプロモーターの間に転写停止シグナル
は存在しない、上記第１４〜１６項のいずれかに記載の
発現ベクター。
【０１１０】１８、試験プロモーターにより誘発された
転写の方向は閉塞プロモーターにより誘発されたそれに
対してアンチセンスの向きである、上記第１７項記載の
発現ベクター。
転写の方向は閉塞プロモーターにより誘発されたそれに
対してアンチセンスの向きである、上記第１７項記載の
発現ベクター。
【０１１１】１９、上記第１〜７項のいずれかに記載の
方法を実施するためのキット。
方法を実施するためのキット。
【０１１２】２０、上記第１〜７項のいずれかに記載の
方法を実施するためのシステム。
方法を実施するためのシステム。
【０１１３】２１、写真フィルムのカセットに取り付け
られた光りが入らない気体透過性ボックス、および前記
カセット中の前記フィルムと接触した細胞を含有するキ
ャリヤーを保持するホルダー手段からなる、上記第２０
項記載のシステム。
られた光りが入らない気体透過性ボックス、および前記
カセット中の前記フィルムと接触した細胞を含有するキ
ャリヤーを保持するホルダー手段からなる、上記第２０
項記載のシステム。
【図１】ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にあるｌｕｃをエ
ンコードするＤＮＡ配列を有するｐＡＬＵＣＡＴを調製
する方法の概略的表示である。
ンコードするＤＮＡ配列を有するｐＡＬＵＣＡＴを調製
する方法の概略的表示である。
【図２】ｍｖｌに対して下流にあるＨＩＶ−ＬＴＲの発
現制御下にあるｌｕｃ遺伝子を有するｐＺｉｐＨＩＶＬ
ＵＣプラスミドを調製する方法の概略的表示である。
現制御下にあるｌｕｃ遺伝子を有するｐＺｉｐＨＩＶＬ
ＵＣプラスミドを調製する方法の概略的表示である。
【図３】図２に従い調製されたプラスミドに類似する
が、ＨＩＶ−ＬＴＲが１６０塩基対を欠くことにおいて
異なる、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣを調製する方法の概略
的表示である。
が、ＨＩＶ−ＬＴＲが１６０塩基対を欠くことにおいて
異なる、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣを調製する方法の概略
的表示である。
【図４】下の実験において使用するいくつかのプラスミ
ドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示し、ここで
両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲは閉塞され
ていず（ａ）そしてそれらにおいてＨＩＶ ＬＴＲは他
のプロモーターにより閉塞されている（ｂ）。
ドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示し、ここで
両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲは閉塞され
ていず（ａ）そしてそれらにおいてＨＩＶ ＬＴＲは他
のプロモーターにより閉塞されている（ｂ）。
【図５】プラスミドｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４（ａ）ま
たはｐＡＬＵＣＡＴ（ｂ）で一時的にトランスフェクシ
ョンした２９３細胞により光の生成を示す。
たはｐＡＬＵＣＡＴ（ｂ）で一時的にトランスフェクシ
ョンした２９３細胞により光の生成を示す。
【図６】ｐＲＳＶＴＡＴでトランスフェクション２９３
細胞（３つの上のスポット）、ｐＲＳＶＴＡＴでトラン
スフェクションした対照（下の中央のスポット）および
偽トランスフェクションの２９３細胞から得られたＲＮ
Ａでトランスフェクションした陰性の対照（下の右のコ
ーナー）の３つのクローンから得られたＲＮＡに対する
ｔａｔ特異的のＤＮＡプローブのドット−ハイブリダイ
ゼーションの結果を示す。
細胞（３つの上のスポット）、ｐＲＳＶＴＡＴでトラン
スフェクションした対照（下の中央のスポット）および
偽トランスフェクションの２９３細胞から得られたＲＮ
Ａでトランスフェクションした陰性の対照（下の右のコ
ーナー）の３つのクローンから得られたＲＮＡに対する
ｔａｔ特異的のＤＮＡプローブのドット−ハイブリダイ
ゼーションの結果を示す。
【図７】プラスミドｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトラン
スフェクションした図６におけるクローンの２つ生長す
る細胞からの光の生成：ａおよびｃ−感光性フィルムへ
の５時間の露出；ｂおよびｄ−感光性フィルムへの１７
時間の露出。
スフェクションした図６におけるクローンの２つ生長す
る細胞からの光の生成：ａおよびｃ−感光性フィルムへ
の５時間の露出；ｂおよびｄ−感光性フィルムへの１７
時間の露出。
【図８】図６の３つのｐＲＳＶＴＡＴでトランスフェク
ションしたクローンおよび偽トランスフェクションのク
ローンからの抽出物に対して暴露したｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４でトランスフェクションした２９３生長細胞に
よる光の生成を示す。
ションしたクローンおよび偽トランスフェクションのク
ローンからの抽出物に対して暴露したｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４でトランスフェクションした２９３生長細胞に
よる光の生成を示す。
【図９】一夜の暴露後の、正常２９３細胞（ａ）または
ＴＡＴトランスフェクションした２９３細胞（ｂ）の抽
出物に対して暴露したｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４プラス
ミドで安定にトランスフェクションした２９３生長細胞
による光の生成を示す。
ＴＡＴトランスフェクションした２９３細胞（ｂ）の抽
出物に対して暴露したｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４プラス
ミドで安定にトランスフェクションした２９３生長細胞
による光の生成を示す。
【図１０】ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェク
ションしそしてＴＡＴトランスフェクションした細胞の
抽出物へ暴露した沈澱した２９３細胞により光の放射
（露出時間−２分）。
ションしそしてＴＡＴトランスフェクションした細胞の
抽出物へ暴露した沈澱した２９３細胞により光の放射
（露出時間−２分）。
【図１１】プラスミドｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４で安定
にトランスフェクションし、ＨＩＶ感染した細胞の抽出
物の種々の希釈物に暴露した、生長する２９３細胞によ
る光の生成を示す。
にトランスフェクションし、ＨＩＶ感染した細胞の抽出
物の種々の希釈物に暴露した、生長する２９３細胞によ
る光の生成を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にあるｌ
ｕｃをエンコードするＤＮＡ配列を有するｐＡＬＵＣＡ
Ｔを調製する方法の概略的表示である。
ｕｃをエンコードするＤＮＡ配列を有するｐＡＬＵＣＡ
Ｔを調製する方法の概略的表示である。
【図２】図２は、ｍｖｌに対して下流にあるＨＩＶ−Ｌ
ＴＲの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子を有するｐＺｉｐ
ＨＩＶＬＵＣプラスミドを調製する方法の概略的表示で
ある。
ＴＲの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子を有するｐＺｉｐ
ＨＩＶＬＵＣプラスミドを調製する方法の概略的表示で
ある。
【図３】図３は、図２に従い調製されたプラスミドに類
似するが、ＨＩＶ−ＬＴＲが１６０塩基対を欠くことに
おいて異なる、ｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣを調製する方法
の概略的表示である。
似するが、ＨＩＶ−ＬＴＲが１６０塩基対を欠くことに
おいて異なる、ｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣを調製する方法
の概略的表示である。
【図４】図４は、下の実験において使用するいくつかの
プラスミドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示
し、ここで両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲ
は閉塞されていない。
プラスミドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示
し、ここで両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲ
は閉塞されていない。
【図５】図５は、下の実験において使用するいくつかの
プラスミドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示
し、ここで両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲ
は他のプロモーターにより閉塞されている。
プラスミドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示
し、ここで両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲ
は他のプロモーターにより閉塞されている。
【図６】図６は、プラスミドｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣ４
（ａ）またはｐＡＬＵＣＡＴ（ｂ）で一時的にトランス
フェクションした２９３細胞により光の生成を示す。
（ａ）またはｐＡＬＵＣＡＴ（ｂ）で一時的にトランス
フェクションした２９３細胞により光の生成を示す。
【図７】図７は、ｐＲＳＶＴＡＴでトランスフェクショ
ン２９３細胞（３つの上のスポット）、ｐＲＳＶＴＡＴ
でトランスフェクションした対照（下の中央のスポッ
ト）および偽トランスフェクションの２９３細胞から得
られたＲＮＡでトランスフェクションした陰性の対照
（下の右のコーナー）の３つのクローンから得られたＲ
ＮＡに対するｔａｔ特異的のＤＮＡプローブのドット−
ハイブリダイゼーションの結果を示す。
ン２９３細胞（３つの上のスポット）、ｐＲＳＶＴＡＴ
でトランスフェクションした対照（下の中央のスポッ
ト）および偽トランスフェクションの２９３細胞から得
られたＲＮＡでトランスフェクションした陰性の対照
（下の右のコーナー）の３つのクローンから得られたＲ
ＮＡに対するｔａｔ特異的のＤＮＡプローブのドット−
ハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図８】図８は、プラスミドｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣ４
でトランスフェクションした図７におけるクローンの２
つ生長する細胞からの光の生成：ａおよびｃ−感光性フ
ィルムへの５時間の露出；ｂおよびｄ−感光性フィルム
への１７時間の露出。
でトランスフェクションした図７におけるクローンの２
つ生長する細胞からの光の生成：ａおよびｃ−感光性フ
ィルムへの５時間の露出；ｂおよびｄ−感光性フィルム
への１７時間の露出。
【図９】図９は、図７の３つのｐＲＳＶＴＡＴでトラン
スフェクションしたクローンおよび偽トランスフェクシ
ョンのクローンからの抽出物に対して暴露したｐＺｉｐ
ΔＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェクションした２９３生
長細胞による光の生成を示す。
スフェクションしたクローンおよび偽トランスフェクシ
ョンのクローンからの抽出物に対して暴露したｐＺｉｐ
ΔＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェクションした２９３生
長細胞による光の生成を示す。
【図１０】図１０は、一夜の暴露後の、正常２９３細胞
（ａ）またはＴＡＴトランスフェクションした２９３細
胞（ｂ）の抽出物に対して暴露したｐＺｉｐΔＨＩＶＬ
ＵＣ４プラスミドで安定にトランスフェクションした２
９３生長細胞による光の生成を示す。
（ａ）またはＴＡＴトランスフェクションした２９３細
胞（ｂ）の抽出物に対して暴露したｐＺｉｐΔＨＩＶＬ
ＵＣ４プラスミドで安定にトランスフェクションした２
９３生長細胞による光の生成を示す。
【図１１】図１１は、ｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣ４でトラ
ンスフェクションしそしてＴＡＴトランスフェクション
した細胞の抽出物へ暴露した沈澱した２９３細胞により
光の放射（露出時間−２分）。
ンスフェクションしそしてＴＡＴトランスフェクション
した細胞の抽出物へ暴露した沈澱した２９３細胞により
光の放射（露出時間−２分）。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵ
Ｃ４で安定にトランスフェクションし、ＨＩＶ感染した
細胞の抽出物の種々の希釈物に暴露した、生長する２９
３細胞による光の生成を示す。
Ｃ４で安定にトランスフェクションし、ＨＩＶ感染した
細胞の抽出物の種々の希釈物に暴露した、生長する２９
３細胞による光の生成を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 8114−4Ｂ (72)発明者 シヨシヤナ・イスラエル イスラエル・エルサレム92465ケレンカイ エメトストリート８
Claims (6)
- 【請求項１】 工程： ａ）テスター細胞を準備し、前記テスター細胞はｉ）イ
ンデューサー物質により誘発可能なプロモーターおよび
前記プロモーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子から
なる発現ベクターを構成し、前記発現ベクターは前記イ
ンデューサー物質の不存在下に低いレベルでそしてその
存在下に高いレベルでｌｕｃ遺伝子を発現することがで
き、そしてｉｉ）取り囲む媒質からルシフェリンを吸収
しそして高いレベルで遺伝子を発現することができる細
胞を選択し、そしてこれらの細胞を前記発現ベクターで
トランスフェクションすることによって調製され、 ｂ）テスター細胞をｌｕｃ遺伝子の発現が光を発生する
条件下に培養し、そして ｃ）適当な手段により光の発生を監視し、あるレベルよ
り上の光の発生は前記細胞中の前記インデューサー物質
の存在を示す、からなる、細胞中のインデューサー物質
の存在を検出する方法。 - 【請求項２】 その中のインデューサー物質の存在下に
シグナルを発生することができ、取り囲む媒質からルシ
フェラーゼを吸収しそして高いレベルで遺伝子を発現す
ることができる細胞であり、前記細胞は前記インデュー
サー物質により誘発可能なプロモーターおよび前記プロ
モーターの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子からなる発現
ベクターによりトランスフェクションされている、テス
ター細胞。 - 【請求項３】 取り囲む媒質からルシフェリンを吸収し
そして遺伝子を高いレベルで発現することができる細胞
を選択し、前記細胞をインデューサー物質により誘発可
能なプロモーターおよび前記プロモーターの発現制御下
にあるｌｕｃ遺伝子からなる発現ベクターによりトラン
スフェクションすることからなり、前記発現ベクターは
ｌｕｃ遺伝子を前記インデューサー物質の不存在下に低
いレベルでそしてその存在下に高いレベルで発現するこ
とができる、インデューサー物質のその中の存在下にシ
グナルを発生することができる、請求項２の細胞を調製
する方法。 - 【請求項４】 インデューサー物質により誘発可能なプ
ロモーターおよび前記プロモーターの発現制御下にある
ｌｕｃ遺伝子からなる発現ベクターによりトランスフェ
クションすることからなり発現ベクターであって、前記
発現ベクターはｌｕｃ遺伝子を前記インデューサー物質
の不存在下に低いレベルでそしてその存在下に高いレベ
ルで発現することができ、インデューサー物質のその中
の存在下にシグナルを発生することができるテスター細
胞を調製するために細胞をトランスフェクションすると
き有用な発現ベクター。 - 【請求項５】 請求項１の方法を実施するためのキッ
ト。 - 【請求項６】 請求項１の方法を実施するためのシステ
ム。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL97048A IL97048A0 (en) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | Bioluminescence assay for gene expression in growing mammalian cells |
| IL97048 | 1991-01-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227996A true JPH05227996A (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=11062046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3177297A Pending JPH05227996A (ja) | 1991-01-25 | 1991-06-21 | 生長する哺乳動物細胞における遺伝子の発現についての生物発光アツセイ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0496027A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05227996A (ja) |
| CA (1) | CA2044680A1 (ja) |
| IL (1) | IL97048A0 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0516443A1 (en) * | 1991-05-31 | 1992-12-02 | Eli Lilly And Company | Vectors and methods for assaying the regulation of apolipoprotein ai synthesis |
| AU2422792A (en) * | 1991-07-30 | 1993-03-02 | Bio-Technical Resources | Device for detecting aqueous contaminants |
| GB9226065D0 (en) * | 1992-12-14 | 1993-02-10 | Ici Plc | Peptides |
| FI95484C (fi) * | 1994-01-17 | 1996-02-12 | Marko Virta | Menetelmä näytteessä olevan metallin määrittämiseksi |
| EP0850318A1 (en) * | 1995-09-13 | 1998-07-01 | Chiron Corporation | Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation |
| CN1294279C (zh) * | 2004-04-05 | 2007-01-10 | 周国华 | 采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法 |
| CN100460520C (zh) * | 2004-04-05 | 2009-02-11 | 周国华 | 采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988001646A1 (en) * | 1986-08-26 | 1988-03-10 | Allelix Inc. | Universal system for transposon mutagenesis |
| GB8905394D0 (en) * | 1989-03-09 | 1989-04-19 | Delta Biotechnology Ltd | Detection of certain molecules |
-
1991
- 1991-01-25 IL IL97048A patent/IL97048A0/xx unknown
- 1991-06-14 CA CA002044680A patent/CA2044680A1/en not_active Abandoned
- 1991-06-20 EP EP91110171A patent/EP0496027A1/en not_active Withdrawn
- 1991-06-21 JP JP3177297A patent/JPH05227996A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL97048A0 (en) | 1992-03-29 |
| CA2044680A1 (en) | 1992-07-26 |
| EP0496027A1 (en) | 1992-07-29 |
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