JPH05137593A - 生物発光によるｈｉｖの感染の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＨＩＶの感染の診断方法が提供され、この方
法はテスター細胞の使用に基き、前記細胞は遺伝子工学
により調製され、酵素、例えば、ルシフェラーゼを発現
することができ、前記酵素はＨＩＶ粒子および／または
ＨＩＶ−ＴＡＴの存在下に、光を放射する反応を触媒す
る。この方法に従い、テスター細胞を血液試料またはそ
の分画とインキュベーションし、そして生細胞または抽
出物中のバックグラウンドのレベルより上の、ＨＩＶの
感染を示す光を検出する。 【効果】 本発明によりＨＩＶの感染を診断することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、疑われる被検体においてＨＩＶ
の感染を検出する方法、キットおよびシステムに関す
る。本発明の方法に従い、ＨＩＶの感染の被検体の血液
試料の中に存在する因子に暴露したとき、光を放射する
ことができる遺伝子操作した細胞を利用する。

【０００２】本発明は、また、細胞をトランスフェクシ
ョンして前述の光の放射の能力を有するようにさせるた
めに適当な組み換えＤＮＡ分子、およびさらにこのよう
なトランスフェクションされた細胞を提供する。

【０００３】１９８０年代初頭における後天性免疫不全
症候群（エイズ）の最初の診断および引き続くこの病気
およびその病原性因子、ＨＩＶの特性決定以来、エイズ
の研究の主な目標の１つはＨＩＶの感染の早期の診断の
ための信頼性あるアッセイを開発することであった。こ
のようなアッセイはこの病気の表皮の広がりの防止のた
めにとくに重要である。

【０００４】エイズの診断のための種々のアッセイは従
来利用可能である。これらのアッセイの１つに従い、エ
イズの陽性の診断は抗ＨＩＶ抗体の免疫学的手段により
血液試料中のＨＩＶ抗原の決定に基づく。しかしなが
ら、ＨＩＶ抗原は通常血液試料の中に少量でのみ存在す
るので、それらの検出は非常に困難である。さらに、種
々のＨＩＶ菌株が同定され、これらはしばしば抗原的に
互いに有意に異なり、こうして免疫学的方法によるそれ
らの同定を非常に困難とする。この免疫学的アッセイは
他の欠点を有し、あるレベルの交差反応性は抗ＨＩＶ抗
体に関してＨＩＶ関係抗原および非ＨＩＶ関係抗原の間
に存在し、誤った陽性の生ずることがある。

【０００５】他の広く使用されるアッセイは、疑われる
被検体の血液中のＨＩＶに対して向けられた抗体の検出
に基づく。しかしながら、前述の理由で、このような方
法の主要な欠点は、種々のＨＩＶ菌株の存在のために、
異なる型の抗体を異なる感染した個体により産生するこ
とがあるという事実である。さらに、ＨＩＶ関係抗原お
よび非ＨＩＶ関係抗原の間の反応性のために、アッセイ
においてＨＩＶ抗原を認識する血液試料中の抗体は疑わ
れる個体における非ＨＩＶ抗原に対して引き出され、こ
うして誤った陽性の結果を生ずることがある。

【０００６】さらに、前述のアッセイはそれらが間接的
であるために追加の重大な欠点を有する。１つについ
て、多数のＨＩＶ感染した個体は抗ＨＩＶ抗体を開発せ
ず、そしてこれはとくに６才までの年令の乳児の場合で
あり、その結果多数の誤った陰性の結果がこれらのアッ
セイから得られることがある。さらに、感染した個体に
おける抗ＨＩＶ抗体の出現は通常数週を要しそして、あ
る場合において、数カ月から数年を要することさえあ
る。最後に、前述の欠点のために、エイズの明確な診断
は通常かなりの時間を必要とし、そして３カ月までを要
することがあり、この解釈は感染した個体が無意識のう
ちに他の人を感染し続けるということである。

【０００７】こうして、上の抗原および抗原の両者の検
出のアッセイは比較的大きい比率の誤った陽性および誤
った陰性の結果を生ずることがあることが明らかであ
る。

【０００８】このバックグラウンドに対して、多数の試
みは疑われる被検体の血液中のＨＩＶの存在を検出する
直接の方法の展開に集中されてきている。従来提案され
た１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であ
る。この方法により、臨床的試料の中に存在するＤＮＡ
は精製され、そしてむしろ複雑な手順により、１つのＨ
ＩＶＤＮＡ配列の存在または不存在は決定される。しか
しながら、その技術的複雑さに加えて、標準の臨床的実
験室において通常使用されない熟練した実験室の要員を
必要とし、この方法は信頼性がないことが発見され、時
々誤った陽性の結果を生ずる。さらに、この方法は感染
性および非感染性のウイルスを区別することができな
い。

【０００９】ＨＩＶの感染性粒子の直接の検出の方法
は、また、国際特許出願第ＷＯ８９／０３８７８号にお
いて提案された。しかしながら、この特許出願により開
示された方法は単に理論的である。なぜなら、実験結果
が記載されておらず、そして本発明の開発の間に得られ
た経験および知識により、この方法が有効でないと信じ
られたからである。

【００１０】本発明の目的は、先行技術の前述の欠点を
克服するＨＩＶの感染を診断する方法を提供することで
ある。よりとくに、本発明の目的は、血液試料をＨＩＶ
の感染性粒子、ＨＩＶ感染したＴ₄ヘルパー細胞、また
はＨＩＶ誘発性タンパク質−ＴＡＴの存在についてアッ
セイすることによって、ＨＩＶの感染を直接に決定する
方法を提供することである。

【００１１】本発明の他の目的は、前記方法において有
用な組み換えＤＮＡ分子およびそれでトランスフェクシ
ョンされた細胞を提供することである。

【００１２】本発明のそれ以上の目的は、上の方法を実
施するためのキットおよびシステムを提供することであ
る。

【００１３】以下の説明において、時々種々の先行技術
の文献をこの明細書の終わりに記載される参考文献のリ
ストからのそれらの番号を示すことによって言及する。

【００１４】ＨＩＶレトロウイルスのゲノムの複製は、
ＬＴＲ（長い末端の反復）配列の中に存在するプロモー
ターによりコントロールされ（１、３、４）そしてレト
ロウイルスの遺伝子ｔａｔによりエンコードされる調節
タンパク質ＴＡＴにより誘発される（２、３、４）。Ｔ
ＡＴタンパク質ならびにｔａｒ部位は異なるＨＩＶ株の
中に高度に保存される。ＨＩＶの感染のとき、ＴＡＴは
感染した細胞中で直ちに産生され、こうして、試料の中
にそれが見いだされる場合、それは試料中のＨＩＶの存
在の明瞭な指示である。しかしながら、ＴＡＴは通常少
量で存在するので、その直接の検出、例えば、免疫学的
手段により検出は非常に困難である。

【００１５】本発明によれば、ＨＩＶの感染は組み換え
ＤＮＡ分子でトランスフェクションされた細胞の使用に
より診断され、前記組み換えＤＮＡ分子は光を放射する
反応を触媒することができる酵素をエンコードする異種
ＤＮＡ配列からなり、前記配列の発現はＴＡＴ誘発性Ｈ
ＩＶプロモーターの発現の制御下にある。適当なＤＮＡ
配列は、基質のルシフェラーゼの分解の間に光を放射す
るＡＴＰ依存性反応を触媒する、酵素ルシフェラーゼ
（ホタル由来の）をエンコードするものである。トラン
スフェクションされた細胞（以後テスター細胞と呼ぶ）
内のＴＡＴタンパク質の存在において、酵素は、ｔａｒ
部位の発現制御下にあり、発現される。これらの細胞ま
たはその抽出物を適当な条件に暴露することによって、
光は放射され、ＨＩＶｔａｔ産生物の存在を示す。

【００１６】こうして、本発明は、工程： ａ）組み換えＤＮＡ分子によりトランスフェクションし
たテスター細胞を準備し、前記テスター細胞は、ｉ）Ｈ
ＩＶ−ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発
することができるｔａｒ部位または類似の配列を包含す
る、ＨＩＶ−ＬＴＲまたは一部分から成る群より選択さ
れるＨＩＶ−ＴＡＴ誘発性プロモーター、ｉｉ）光を放
射する反応を触媒することができる酵素をエンコードす
る異種ＤＮＡ配列、前記配列は前記プロモーターの発現
制御下にある、を有し、そして前記テスター細胞は取り
囲む媒質からＴＡＴタンパク質を吸収しおよび／または
ＨＩＶの感染を受け易く、 ｂ）前記テスター細胞を疑われる個体からの血液試料
と、またはその適当な分画と接触させ、そしてテスター
細胞またはその抽出物を前記異種ＤＮＡ配列の発現が光
の放射を生ずる条件に暴露し、そして ｃ）前記テスター細胞またはその抽出物による光の放射
を監視し、バックグラウンドより上の光の放射の検出は
ＨＩＶの感染を示す、からなる、疑われる個体において
ＨＩＶの感染を診断する方法を提供する。

【００１７】本発明の方法の２つの実施態様が提供され
る。１つの実施態様（以後、感染の実施態様と呼ぶ）に
より、試験はＨＩＶの感染に対して感受性である。ＨＩ
Ｖの感染に対して感受性は、細胞の表面上に少なくとも
ＣＤ４レセプター抗原の存在を必要とし、こうしてこの
実施態様に従い使用すべき細胞はそれらの表面上にＣＤ
４レセプター抗原を表す。このような細胞は、例えば、
前記ＤＮＡ分子でトランスフェクションしたＴ₄ヘルパ
ー細胞系であるか、あるいは前記ＤＮＡ分子およびＣＤ
４レセプターをエンコードする遺伝子で同時トランスフ
ェクションしてＨＩＶの感染に対して感受性であるよう
にした他の細胞であることができる。ＣＤ４を表す細胞
はＨＩＶで遊離のＨＩＶ粒子によるか、あるいはウイル
スで既に感染した細胞との融合により感染することがで
きる。こうして、感染の実施態様によるテスター細胞
は、試料のＴ₄ヘルパー細胞（これらはＨＩＶで主とし
て感染した血液中の細胞である）、血液の中に現在する
場合、遊離のＨＩＶ粒子，または両者を含有する、血液
試料、またはその適当な分画とともにインキュベーショ
ンする。血液試料が遊離のＨＩＶ粒子またはＨＩＶ感染
したＴ₄ヘルパー細胞を含有する場合、テスター細胞の
あるものは感染され、その結果、ＴＡＴは細胞中で産生
され、そして光の放射反応を触媒する酵素は発現される
であろう。

【００１８】本発明の他の実施態様［以後、トランスア
クチベーション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）実
施態様と呼ぶ］により、テスター細胞はＴＡＴタンパク
質をそれらの取り囲む媒質から吸収する能力を有する。
今日まで試験した多数の細胞はこの能力を有することが
発見され（５および本発明に従い実施した試験）こうし
て本発明のこの実施態様に従うトランスフェクションに
よるテスター細胞の調製に使用することができる。細胞
は、この実施態様に従い、こうして、試料の中に存在す
る場合ＴＡＴタンパク質を含有する血液試料またはその
分画とともにインキュベーションする。ＴＡＴは核タン
パク質、すなわち、主に細胞の核の中に存在する、であ
るので、この実施態様に従い、試料の細胞を溶解し、こ
うしてＨＩＶで感染した細胞中のＴＡＴ内容物を媒質へ
解放することが好ましい。次いで、リゼイトをテスター
細胞とインキュベーションし、そしてＴＡＴが存在する
場合、それはテスター細胞により吸収され、光の放射反
応を触媒する酵素の発現を誘発するであろう。

【００１９】前記酵素の発現を監視するために、両者の
上の実施態様に従い、テスター細胞またはそれらの抽出
物を光が放射される条件に暴露する。例えば、酵素がル
シフェラーゼである場合、前記条件はルシフェラーゼの
準備および適当な温度であり、ここで光の放射はテスタ
ー細胞の抽出物またＡＴＰについて試験する。次いで、
光の放射を監視し、そしてバックグラウンドより上のそ
のレベルは試験した試料中のＨＩＶの存在を示すであろ
う。

【００２０】本発明は、また、ＨＩＶ−ＴＡＴの存在下
に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発することができるｔａ
ｒ部位または類似の配列を包含する、ＨＩＶ−ＬＴＲま
たは一部分であるＨＩＶプロモーター、および光を放射
する反応を触媒する酵素をエンコードする異種ＤＮＡ配
列、前記ＤＮＡ配列は前記プロモーターの発現制御下に
ある、からなる、上の方法において使用するための組み
換えＤＮＡ分子を提供する。本発明に従い、前記異種Ｄ
ＮＡ配列が酵素ルシフェラーゼをエンコードする、組み
換えＤＮＡ分子はとくに好ましい。

【００２１】本発明は、また、前記方法において有用な
前記組み換えＤＮＡ分子によりトランスフェクションさ
れた細胞を提供する。

【００２２】本発明は、また、工程： ｉ）それらの取り囲む媒質からＴＡＴタンパク質を吸収
することができる細胞を、前記組み換えＤＮＡ分子でト
ランスフェクションし、 ｉｉ）ＨＩＶの感染に対して感受性の細胞を前記組み換
えＤＮＡ分子でトランスフェクションするか、あるいは ｉｉｉ）細胞を前記組み換えＤＮＡ分子でトランスフェ
クションしそして同時にまたは引き続いて前記細胞をＣ
Ｄ４レセプターでトランスフェクションして、前記細胞
をＨＩＶにより感染可能にする、 からなる、前記テスター細胞を調製する方法を提供す
る。

【００２３】最後に、本発明は、また、本発明の方法を
実施するキットおよびシステムを提供する。

【００２４】本発明は、疑われる被検体におけるＨＩＶ
の感染を検出する新規なアプローチを提供する。ＴＡＴ
タンパク質の検出のためのアッセイにおいてマーカー遺
伝子、例えば、ｃａｔ（ＨＩＶエンベロープタンパク質
をエンコードする）を使用することは、この分野におい
て知られている（６、７）。このような既知のアッセイ
により、マーカー遺伝子の活性化の決定は、種々の放射
性物質を使用して細胞抽出物中で生体外で実施された。
放射性物質の望ましくない使用に加えて、このようなア
ッセイは非常に感受性ではない。マーカー遺伝子のこの
ような従来の使用と対照的に、本発明による光の測定は
非常に感受性である。なぜなら、ほとんどの実験室の手
のとどく範囲内にある、適当な比較的安価な計器を使用
して、わずかの人数で測定することができるからであ
る。光の検出は任意の入手可能なフォトメーター、例え
ば、光増強電荷カップルド装置（ｐｈｏｔｏ ｉｎｔｅ
ｎｓｉｆｉｅｄ ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅ
ｖｉｃｅ）（ＣＣＤ）において実施することができ、こ
の装置は単一の細胞からの光を測定することができ、そ
してバックグラウンドの「ノイズ」を最小に減少する
（電子の減じる手段による）ことができる。あるいは、
光の検出はテスター細胞の調製物またはその抽出物を写
真フィルムに直接露出することによって実施することが
できる。（光の検出方法については、下を参照）。

【００２５】本発明による方法の高い感度は、試験試料
中のわずかの生存能力のあるウイルスの粒子の検出さえ
も可能とし、こうして誤った陰性の結果は最小の比率に
減少する。

【００２６】テスター細胞の調製のために、細胞を組み
換えＤＮＡ分子でトランスフェクションし、この組み換
えＤＮＡ分子はｔａｒ部位、および光を放射する反応を
触媒することができる酵素、例えば、ルシフェラーゼを
エンコードする異種ＤＮＡ配列からなり、前記配列はｔ
ａｒ部位の発現制御下にある。トランスフェクションす
べき細胞は好ましくはヒトの細胞系である、そしてとく
に好ましくはヒト腎臓細胞系−２９３である（８）。

【００２７】本発明の感染の実施態様において使用する
テスター細胞は、ＨＩＶの感染に対して感受性でなくて
はならなず、こうしてそれらの外部の表面上に少なくと
もＣＤ４抗原を表す。このようなテスター細胞は、例え
ば、Ｔ₄ヘルパー細胞またはＣＤ４抗原を表しかつこの
ような感染に対して感受性である他の細胞系から調製す
ることができる。さらに、通常ＣＤ４抗原を表すばかり
でなく、かつまたＣＤ４遺伝子でトランスフェクション
後ＨＩＶの感染に対して感受性である細胞系は、また、
この実施態様に従い使用することができ、このようなＣ
Ｄ４のトランスフェクションは酵素をエンコードする組
み換えＤＮＡ分子によるトランスフェクションの前に、
それと同時にまたはその後に実施する。例えば、その外
部表面上にＣＤ４抗原を表さない、２９３細胞系を使用
する場合、細胞は、また、ＣＤ４遺伝子からなる他の組
み換えＤＮＡ分子でトランスフェクションしなくてはな
らない。

【００２８】本発明のトランスアクチベーション実施態
様において使用するテスター細胞は、存在する場合取り
囲む媒質からＴＡＴタンパク質を吸収することができな
くてはならない。今日まで試験したいくつかの細胞系
は、この能力を有することが発見され、こうしてこの実
施態様に従うテスター細胞の調製に使用することができ
る。２９３細胞系は取り囲む媒質からＴＡＴタンパク質
を吸収することができ、こうして前記酵素をエンコード
する組み換えＤＮＡ分子でトランスフェクションして、
この実施態様に従い有用なテスター細胞を得ることがで
きる。

【００２９】感染の実施態様に従いＨＩＶの感染をアッ
セイするために、テスター細胞を感染段階にかけ、ここ
でテスター細胞を血液試料またはその適当な分画と一緒
にインキュベーションし、前記血液試料またはその分画
はＴ₄リンパ球、存在する場合、遊離のＨＩＶ粒子、ま
たは両者を含有する。試験した試料をＨＩＶで感染した
被検体から得た場合、それは遊離のＨＩＶ粒子またはＴ
₄感染したリンパ球、または両者を含有し、そしてこの
ような試料またはその分画を接触することによって、テ
スター細胞のあるものはウイルスで感染されるであろ
う。このような感染は、ある量のＴＡＴタンパク質の感
染した細胞中のウイルスの遺伝子物質の導入ならびにウ
イルス遺伝子物質を包含する。ウイルスのゲノムはなか
でもＴＡＴタンパク質をまたエンコードするので、この
タンパク質はここで感染された細胞中で発現されるであ
ろう。結局、そのように産生されたＴＡＴタンパク質は
前記ＤＮＡ分子中でＨＩＶプロモーターをトランスアク
チベーションし、結局光産生反応を触媒する酵素は発現
されるであろう。結局、適当な条件下に、光は発生す
る。光の放射を監視する方法を下にさらに説明する。

【００３０】トランスアクチベーション実施態様に従
い、テスター細胞をトランスアクチベーション段階か
け、ここでテスター細胞を、試験した試料の中に存在す
る場合ＴＡＴタンパク質を含有する血液試料またはその
分画と接触させる。ＴＡＴタンパク質は感染した被検体
の血液の中に少量で存在するが、それは核タンパク質で
あるので、この実施態様に従い、ＨＩＶにより感染され
た血液中の細胞であるＴ₄ヘルパー細胞を溶解するする
ことが好ましい。溶解後、これらの細胞はＴＡＴタンパ
ク質のそれらの内容物を媒質の中に解放するであろう。
こうして、好ましくは、リゼイトまたはタンパク質を含
有するその分画をテスター細胞と接触させる。試験した
試料がＨＩＶで感染した個体からのものである場合、Ｔ
ＡＴは存在し、そしてテスター細胞中へそれが吸収され
ると、前記酵素は発現される。同様に、感染の実施態様
に従い、酵素の活性は光の放射の監視によりアッセイさ
れる。本発明による方法の２つの実施態様は、両者とも
ＨＩＶにより感染されかつ取り囲む媒質からＴＡＴタン
パク質を吸収することができるテスター細胞を使用する
ことによって、組み合わせることができる。このような
テスター細胞は、例えば、２９３細胞系から誘導されそ
して、また、ＣＤ４遺伝子でトランスフェクションされ
たテスター細胞であることができる。

【００３１】本発明の感染の実施態様に従う方法の効果
は、感染の段階の間に融合または輸送促進因子、例え
ば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリブレン、
ＤＥＡＥデキストランおよびそれ自体既知の多数の他の
ものの添加により増加することができる。

【００３２】光の放射反応を触媒する酵素の発現は、適
当な条件下に光の放射を監視することによってアッセイ
する。このような監視のために、全テスター細胞または
それらの抽出物を、前記酵素により触媒された反応の間
の光の放射のために適当な基質とともに適当なインキュ
ベーション条件下にインキュベーションする。例えば、
酵素がルシフェラーゼである場合、このような条件はル
シフェリンの添加を必要とし、そして光の放射をテスタ
ー細胞の抽出物について監視する場合、また、ＡＴＰを
添加する。

【００３３】結果を対照試料を使用して同様な条件下に
インキュベーションしたテスター細胞から得られた結果
と比較することは好ましい。対照レベルより上の光の生
成の増加は、試験した試料中のＨＩＶの存在を示すであ
ろう。さらに、放射された光の量は、種々の標準を使用
して得られた光の量と比較することができる。

【００３４】本発明の組み換えＤＮＡ分子は、光の放射
反応を触媒する酵素を発現することができ、その発現は
ＨＩＶ誘発性タンパク質ＴＡＴにより誘発される。この
分子は、前記酵素をエンコードするＤＮＡ配列および、
ＴＡＴタンパク質を認識する部位であるｔａｒ部位を包
含する前記ＨＩＶ−ＬＴＲまたはその一部分。またはＨ
ＩＶ ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発
することができる類似の配列から成る群より選択される
ＨＩＶ−ＴＡＴ誘発性プロモーターからなり、酵素をエ
ンコードする配列は前記プロモーターの発現制御下にあ
る。ホタルのルシフェラーゼをエンコードする酵素は、
とくに好ましい。このルシフェラーゼは、基質のルシフ
ェリンの分解の間に光を放射するＡＴＰ依存性反応を触
媒する。ポリアデニル化（ポリＡ）部位およびその３末
端におけるシグナル配列は、ｍＲＮＡの発生に要求され
る。ルシフェラーゼ遺伝子のポリＡ部位およびシグナル
が非効率的であることを理解すると、本発明のルシフェ
ラーゼをエンコードする配列からなる組み換えＤＮＡ分
子の中に、異なるポリＡシグナルおよび部位、例えば、
ＳＶ４０を含めることは好ましい。本発明による組み換
えＤＮＡ分子は、好ましくは、また、それによりトラン
スフェクションされた細胞の同定を促進するマーカー遺
伝子、例えば、抗生物質抵抗性を与えるものを含む。

【００３５】ＨＩＶ−ＬＴＲは、ＴＡＴの不存在下にお
いてさえ前記異種ＤＮＡ配列の多少の発現を促進する。
こうして、これは上の方法においてバックグラウンドの
シグナルを増加し、こうしてその感度を減少するであろ
う。本発明の開発の過程の間に、このバックグラウンド
の発現はプロモーターの閉塞、すなわち、ＴＡＴの不存
在下にＨＩＶプロモーターより活性化である他のプロモ
ーターに対して下流にＨＩＶ ＴＡＴを配置することに
よって、最小のレベルに減少できることが認められた。
ＴＡＴが存在するとき、ＨＩＶプロモーターの活性は数
倍増加し、こうしてこの閉塞を克服される。

【００３６】したがって、ある好ましい実施態様によ
り、ＤＮＡ分子中のＨＩＶＬＴＲは、ＴＡＴの不存在下
にＨＩＶプロモーターより活性である他のプロモーター
に対して下流に存在する。

【００３７】なおいっそう好ましい本発明の実施態様に
従い、ＨＩＶが指令する転写は前記他のプロモーターに
関してアンチセンス方向である。このようなＤＮＡ分子
において、シグナル対ノイズ比はないっそう増加するで
あろう。

【００３８】本発明によるキットは、本発明の方法の実
施に必要な成分からなる。これらの成分は、感染の実施
態様またはトランスアクチベーション実施態様において
使用するための、トランスフェクションされた細胞を包
含する。さらに、このようなキットは、また、細胞のた
めに適当なインキュベーション媒質、酵素のための基
質、例えば、酵素がルシフェラーゼである場合、ルシフ
ェリン、光反応を実施するための緩衝剤などを包含す
る。必要に応じて、キットは、また、種々の標準、例え
ば、既知の濃度のＴＡＴタンパク質を含有する試料から
なることができる。本発明による方法を実施するための
システムは、上のキットと同一の成分と、光監視装置か
らなるであろう。

【００３９】次の説明は、組み換えＤＮＡ分子、トラン
スフェクションされた細胞および本発明により実施され
た試験を例示する。これらの実施例は、本発明を例示
し、そして３本発明を限定しない。

【００４０】以下において、本発明によるプラスミドの
調製を説明する。プラスミドの構成に関係するＤＮＡ断
片のＤＮＡの切断および結合は、それ自体既知の方法に
従い実施した。

【００４１】各段階において、構成されたプラスミドを
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＲ１００細胞の中にクローニングし、
そしてトランスフェクションした細胞を調製したすべて
のプラスミドが有するＡｍｐ^R遺伝子により付与された
アンピシリン抵抗性について選択した。特定したように
選択した後、プラスミドをほぼ５０の選択したコロニー
の各々から精製し、そしてこれらのプラスミドの制限分
析を実施した。このような分析後、１つのクローンを選
択し、生長させ、そしてそのプラスミドを精製し、次い
でこれらを、必要に応じて、引き続くプラスミドの構成
の段階にまたはテスター細胞のトランスフェクションの
ために保存した。

【００４２】ａ、ｐＡＬＵＣＡＴの調製 プラスミドｐＡＬＵＣＡＴの構成は図１に概略的に示さ
れている。ｌｕｃ遺伝子（酵素ルシフェラーゼをエンコ
ードする）源は、Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｌｉｎｓ）、
ＦＲＧ、から入手したプラスミドｐＳＶＬＵＣ−Ｇであ
った。ｐＳＶＬＵＣ−ＧをＳｍａＩおよびＸｈｏＩ制限
酵素で切断後、ｌｕｃ遺伝子を分離し、そして精製し
た。アンピシリン抵抗性のための遺伝子を有するプラス
ミドｐＢＲ３２２（９）お、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶ
制限酵素により切断し、小さい４６６ｂｐの断片を廃棄
し、そしてｐＳＶＬＵＣ−Ｇから精製したｌｕｃ断片を
その場所に結合して、プラスミドｐＢＲＬＵＣを産生し
た。

【００４３】図１に示すように、ｐＳＶＬＵＣ−Ｇから
得られたｌｕｃ遺伝子断片はＸｈｏＩ制限部位に近接し
て単一のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する。プラスミド
ｐＢＲ３２２は、また、ＥｃｏＲＶ部位に近接して大き
いＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片上に単一のＨｉｎｄＩＩＩ
制限部位を含有する。こうして、ｐＢＲＬＵＣ中のｌｕ
ｃ遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりフランキング
される。こうして、ｐＢＲＬＵＣはＨｉｎｄＩＩＩで切
断され、そしてそのようにして得られたｌｕｃ遺伝子断
片をｐＡＣＡＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合した［Ａ．
パネット（Ｐａｎｅｔ）ら、バイオテクノロジー・ジェ
ネラル−ＢＴＧ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ−ＢＴＧ）、イスラエル国ネスジオナ］。この
プラスミドはｃａｔ遺伝子にかつその上流に融合された
ＨＩＶ−ＬＴＲを収容する。

【００４４】こうして、生ずるｐＡＬＵＣＡＴプラスミ
ドは、ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にｌｕｃ遺伝子を含
む。このプラスミドは、また、アンピシリン抵抗性を付
与するｐＡＣＡＴのＡｍｐ遺伝子を含む。

【００４５】そのように構成されたｐＡＬＵＣＡＴプラ
スミドは、本発明によりテスター細胞として使用する細
胞のトランスフェクションにおける使用に適する。

【００４６】テスター細胞を有するｐＡＬＵＣＡＴにお
ける光の放射の程度は、ＨＩＶ−ＬＴＲの活性化の程度
に依存する。適切なカリブレーションを得るために、ｐ
ＡＬＵＣＡＴを含有する細胞と同一の細胞系に属する細
胞をプラスミドｐＡＣＡＴによりトランスフェクション
した。こうして、ｐＡＬＵＣＡＴでトランスフェクショ
ンした細胞の光の放射の程度をｐＡＣＡＴでトランスフ
ェクションした細胞中のＣＡＴの産生の程度と比較する
ことによって得られる。

【００４７】ｈｖｐはＴＡＴタンパク質の不存在下でさ
え多少のバックグラウンドのレベルの活性を発現ことに
注意すべきである。こうして、ｌｕｃ遺伝子のある程度
の発現はＴＡＴタンパク質の不存在下でさえ連続的に起
こり、したがって、本発明による方法において使用する
とき、このプラスミドを含有する細胞はある程度のバッ
クグラウンドの生物発光を示す。

【００４８】ｂ、ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣの構成 ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣプラスミドの構成は、図２に概略
的に示されている。

【００４９】ｐＡＬＵＣＡＴプラスミドは、完全なＨＩ
Ｖ−ＬＴＲ配列およびｌｕｃ遺伝子をフランキングする
２つのＡｓｐ７１８制限部位を有する（図１に示すよう
に）。ｐＡＬＵＣＡＴをＡｓｐ７１８で切断した後、Ｈ
ＩＶ−ＬＴＲおよびｌｕｃ遺伝子を含有するＤＮＡ断片
を分離しそして精製し、そしてその粘着末端を充填し
た。プラスミドｐＳＶ₂ＣＡＴ（１０）をＰｖｕＩＩお
よびＨｐａＩ制限酵素で切断し、そしてｃａｔ遺伝子を
含有する断片を廃棄した。ｐＳＶ₂ＣＡＴの残りの部分
の粘着末端を上のようにして充填し、次いでこの断片を
ｐＡＬＵＣＡＴからの前記ＤＮＡ断片に結合した。この
ような結合はそれに取り付けられたＰｖｕＩＩ制限部位
およびＡｓｐ７１８制限部位を再構成するが、ＰｖｕＩ
Ｉおよび他方のＡｓｐ７１８制限部位が失わる。

【００５０】生ずるｐＳＶＨＩＶＬＵＣプラスミドは、
ＨＩＶ−ＬＴＲ、ｌｕｃ遺伝子およびＡｓｐ７１８とＢ
ａｍＨＩ制限部位との間のＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナル（図２においてＰ．Ａ．）を有する。

【００５１】プラスミドｐＺｉｐ（１１）は、アンピシ
リン抵抗性を付与する原核生物のｂｌａ遺伝子、および
ｐＢＲ３２７の複製の由来を収容する。ネオマイシン抵
抗性を付与する遺伝子（ｎｅｏ^R）およびＭＬＶパッキ
ングシグナルは、ＭＬＶ−ＬＴＲのＤＮＡ配列によりフ
ランキングされている。このプラスミドは、５’ＬＴＲ
に近接してドナーおよびアクセプタースプライス部位の
間に独特ＢａｍＨＩ制限部位を有して、ＢａｍＨＩ部位
におけるクローンされた遺伝子の発現、ならびにｎｅｏ
^R遺伝子の発現を可能とする。

【００５２】ＨＩＶ−ＬＴＲおよびｌｕｃ遺伝子ならび
にポリＡシグナルおよび部位を包含する、プラスミドｐ
ＳＶＨＩＶＬＵＣ中のＡｓｐ７１８およびＢａｍＨＩ切
断部位の間に位置するＤＮＡ断片が分離された。この断
片をｐＺｉｐのＢａｍＨＩ切断部位に結合し、不適合性
粘着末端を充填しそして再結合した。

【００５３】２つの型のプラスミドがこの方法において
産生され、ここでＨＩＶ−ＬＴＲは上流のＭＬＶ−ＬＴ
Ｒにより閉塞されている： １）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ／
ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片はＭＬＶ−ＬＴＲ指令の転写
に関してアンチセンスの向きに、すなわち、ＭＬＶ−Ｌ
ＴＲ指令の転写およびＨＩＶ指令の転写が反対向である
向きに、挿入されている。

【００５４】２）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ２、ここでＨＩ
Ｖ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片はＭＬＶ−ＬＴ
Ｒ指令の転写に関してセンスの向きに挿入されている。

【００５５】ｐＳＶＨＩＶＬＵＣからのＨＩＶ−ＬＴＲ
ｌｕｃ ＤＮＡ断片をｐＺｉｐのＢａｍＨＩとＢｇｌ
ＩＩとの制限部位の間に挿入することによって、異なる
組のプラスミドを調製した。こうして、２つの構成体が
得られた： （１）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ
／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片の向きはｐＺｉｐＨＩＶＬ
ＵＣ１のそれと同一である。

【００５６】（２）ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３ａ、ここで
ＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポリＡＤＮＡ断片の向きはｐ
ＺｉｐＨＩＶＬＵＣ２のそれと同一である。

【００５７】ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ３および３ａにおい
て、３’スプライス部位は欠失されて、転写体から誘導
された、すべてのＨＩＶ−ＬＴＲの発現を促進する。な
ぜなら、配列のスプライシングは存在しないからであ
る。これらの２つのプラスミドは、また、ｎｅｏ^R遺伝
子を発現せず、こうしてこれらのプラスミドによりトラ
ンスフェクションされたテスター細胞の選択はｐＳＶ２
ＮＥＯで同時トランスフェクションすることによって便
利に実施される。

【００５８】ｃ、ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣの調製 ＨＩＶの発現は陽性および陰性の両者の調節タンパク質
により調節される。陰性に調節性のタンパク質はＡｖａ
Ｉ切断部位から上流のＬＴＲ−ＤＮＡ配列の５’におい
て相互作用することが発見された（１２）。したがっ
て、ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ系列に対して同様な構成であ
るが、ＡｖａＩ部位から上流のＨＩＶ−ＬＴＲ配列が欠
失されているものが調製された。図３に概略的に示す欠
失およびクローニングを次のようにして実施した。：プ
ラスミドｐＳＶＨＩＶＬＵＣをＡｖａＩで切断した。こ
のＡｖａＩはＨＩＶ−ＬＴＲにおいて１回そしてｌｕｃ
遺伝子中で１回切断する。さらに、このプラスミドを、
また、ＡＳＰ７１８で切断し、これは再構成されたＡＳ
Ｐ７１８部位において１回切断し、ｐＶＵＩＩおよびＡ
ＳＰ７１８の間の融合からｐＳＶＬＵＣ１２を生ずる。
ＡＳＰ７１８およびＡｖａＩ切断部位の間に位置するＤ
ＮＡ断片が除去された。２つの残りのＤＮＡ断片を一緒
に結合し、不適合のＡＳＰ７１８およびＡｖａＩ粘着末
端をＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を使用してフィル
インし、そして再び結合した。制限酵素の分析によるス
クリーニング後、正しい向きに挿入されたＡＶａＩ断片
をもつプラスミドを収容するクローンを選択した。その
ように産生されたプラスミド、ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣを
使用して、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４、５、６および６
ａを調製した。プラスミドの調製の方法は、ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣプラスミドのそれに類似した。簡単に述べる
と、この調製は次のようにして実施した：ｐＳＶＨＩＶ
ＬＵＣ中のフィルドインＡＶａＩをＡｓｐ７１８制限部
位のフィルドインへの結合はＡｓｐ７１８切断部位を再
構成する。こうして、プラスミドはＡｓｐ７１８および
ＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、そして１６０ｐｂ欠失の
ＨＩＶ−ＬＴＲ、ｌｕｃ遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシ
グナルおよび部位を含有するＡＳＰ７１８−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片が分離された。この断片をｐＺｉｐのＢａ
ｍＨＩ切断部位の中にｍｖｌ指令転写に関してセンスお
よびアンチセンスの両者の方向に結合し、こうして、そ
れぞれ、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４およびｐＺｉｐ△Ｈ
ＩＶＬＵＣ５が得られるか、あるいはＢａｍＨＩおよび
ＢｇｌＩＩの切断部位の間にＭＬＶに関してアンチセン
スまたはセンスの向きに結合し、こうして、それぞれ、
ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ６およびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵ
Ｃ６ａが得られた。

【００５９】知られているように（１３）、クローニン
グしたホタルのルシフェラーゼのポリＡシグナルは非効
率的であった。ｐＳＶＬＵＣ１２からのＨＩＶ−ＬＴＲ
／ｌｕｃ／ＤＮＡ断片を分離することによって、ポリＡ
シグナルおよびポリＡ部位をｌｕｃ遺伝子の３’末端に
添加しそしてこれらの３’プロセシングシグナルは高度
に効率的であるので、それはｍＲＮＡの効率よい発生を
促進する。

【００６０】ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１、１、３および３
ａおよびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４、５、６および６ａ
において、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターの閉塞は５’−
ＭＬＶ−ＬＴＲにより保証され、こうしてルシフェラー
ゼのバックグラウンドの発現はプラスミドｐＡＬＵＣＡ
Ｔにおけるより非常に低い。しかしながら、これらの８
つのプラスミドのうちで、ＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ／ポ
リＡがアンチセンスの向きに挿入されているもの、すな
わち、プラスミドｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１および３、お
よびｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４および６、は、他のもの
より有利である。後者のプラスミドにおいて、ＭＬＶ指
令の転写は、ＭＬＶのゲノムのＲＮＡを産生ことがあ
り、ＨＩＶ−ＬＴＲプロセシングシグナルにおいてプロ
セシングすることによって切頭される。

【００６１】本発明により調製されるか、あるいはこれ
らのプラスミドの調製において使用されるプラスミド
を、下表１に列挙する：

【００６２】

【表１】表１ ｐＳＶＬＵＣ−Ｇ［Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、
トイツ国］：ｌｕｃ遺伝子に融合されたプロモーター； ｐＲＳＶＴＡＴ［Ｊ．コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、ト
イツ国］：ＲＳＶ−ＬＴＲに融合されたＨＩＶ ｔａｔ
遺伝子； ｐＡＣＡＴ［ＢＴＧ、Ａ．パネット（Ｐａｎｅｔ）］：
ＨＩＶ−ＬＴＲに融合されたｃａｔ遺伝子； ｐＢＲ３２２［ボリヴァー（Ｂｏｌｉｖａｒ）、Ｆ．
ら、１９７７（９）］：Ａｍｐ^R遺伝子； ｐＢＲＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＡＬＵＣＡＴ［この研究］：テキストを参照； ｐＳＶ₂ＣＡＴ［ゴールマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９
８２（１０）］； ｐＳＶ₂ＮＥＯ［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、１９
８２（１４）］； ｐＳＶＨＩＶＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣ［この研究］：テキストを参照； ｐＺＩＰ［セプコ（Ｃｅｐｋｏ）、Ｃ．Ｌ．］ら、１９
８４（１１）］； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−１［この研究］：ＭＬＶ転写に
対して反対方向のＢａｍＨＩ部位におけるＨＩＶ−ＬＴ
ＲＬＵＣインサート； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−２［この研究］：ｐＺｉｐＨＩ
ＶＬＵＣ−１と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲＬＵＣイ
ンサートはＭＬＶ転写と同一の向きに挿入されている； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−３［この研究］：ＨＩＶ−ＬＴ
ＲＬＵＣはＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩの間にＭＬＶ転写に
対して反対方向に挿入されている； ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ−３ａ［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−３と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲＬＵＣ
インサートはＭＬＶ転写と同一の向きに挿入されてい
る； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−４［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−１と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−５［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−２と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−６［この研究］：ｐＺｉｐＨ
ＩＶＬＵＣ−３と同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは５’
末端において１６０ｂｐ欠失されている； ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ−６ａ［この研究］：ｐＺｉｐ
ＨＩＶＬＵＣ−３ａと同一であるが、ＨＩＶ−ＬＴＲは
５’末端において１６０ｂｐ欠失されている。

【００６３】次の実験において使用するプラスミドのあ
るものはＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域は図４示されてい
る。

【００６４】細胞系 ヒト２９３細胞系をｐＡＬＵＣＡＴで安定にトランスフ
ェクションし、そして遺伝子のコピー数をメタトロキセ
ート選択により増幅した（参照１５、実験の詳細につい
て）。次いで、これらのトランスフェクションした細胞
を、Ｔ₄−ｐＭＶ７を使用するトランスフェクション
（１６、６）後ＰＡ３１７細胞系中でつくった両栄養性
レトロウイルスのベクターを有するＣＤ４により感染さ
せ、そして二重のクローンをｎｅｏ^R表現型により選択
した。ＣＤ４レセプターの存在は、抗ＣＤ４抗体により
評価した。ｌｕｃ遺伝子の産生物は光の測定により評価
した。

【００６５】同様な方法において、また、２９３細胞を
ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１〜３ａおよびｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４〜６ａプラスミドでトランスフェクションし
た。

【００６６】光の生成によりルシフェラーゼの発現の監
視 以下において、いくつかの実験を記載し、ここで細胞中
のルシフェラーゼの発現は光の生成を監視することによ
って決定した。光の生成を監視する手順は、次の通りで
あった：手順Ａ ：テスター細胞のリゼイト中の光の生成の検出 種々の実験手順に従いテスター細胞をインキュベーショ
ンした後、細胞を収穫し、ＰＢＳですすぎ、そしてその
抽出物を１％のトリトンＸ−１００、１％のＢＳＡ、１
５％のグリセロール、１ミリモルのＤＴＴ、８ミリモル
のＭｇＣｌ₂、１ミリモルのＥＤＴＡおよび２５ミリモ
ルのトリスアセテートｐＨ７．８から成る溶菌緩衝液
（１００μｌ／１０⁶細胞）の添加によりつくた。次い
で、１０μｌの抽出物を２５０μｌの溶菌緩衝液、４μ
ｌの４０ミリモルのＡＴＰと混合し、次いで化学発光の
測定のために調節したパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）液
体シンチレーションカウンター内のシンチレーションバ
イアルに入れた。次いで、８０μｌの２ミリモルのルシ
フェリン溶液［ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
を添加し、そしてカウンターにおける光の生成の程度／
分（Ｃ．Ｐ．Ｍ．）を測定した。

【００６７】手順Ｂ：全テスター細胞における光の生成
の検出 全テスター細胞からの光の放射を光検出カメラ（ＬＤ
Ｃ）装置により測定した。ＬＤＣ装置はポラロイドフィ
ルムのカッセットから成り、スライドシャッターを装備
しそして空気が自由に流れるが、光が入らないカバーを
有する軽量ブラックボックスを装備した。

【００６８】皿、分裂中期またはチャンバーのスライド
の中のテスター細胞の培養物をホルダーに取り付け、こ
れらのホルダーは皿、プレートおよびスライドの底をポ
ラロイドフィルムに直接接触して保持した。次いで、
０．３ミリモルの最終濃度でルシフェリンを生長培地に
添加し、そしてＬＤＣをＣＯ₂インキュベーター内に配
置し、そしてシャッターを所望の間隔で開いた。

【００６９】実験の結果

【００７０】

【実施例】実施例１ ：一時的にトランスフェクションした細胞によ
る光の生成 種々の源の１×１０⁶細胞を１０μｇのプラスミドとと
もにリン酸カルシウムの存在下にインキュベーションす
ることによって、トランスフェクションした（１０）。
次いで、細胞を２４時間インキュベーションし、その後
細胞を収穫し、その抽出物を調製し、そして光の生成を
手順Ａに従い監視した。トランスフェクションした細胞
における基礎的な光の活性を、下表２に示す：

【００７１】

【表２】 表２ プラスミド トランスフェクションした細胞 Ｃ.Ｐ.Ｍ ──────────────────────────────── pSVLUC-G COS 7 1.4×10⁵ pSVLUC-G RAT 1 1.2×10³ pSVLUC-G 293 1×10⁶ ──────────────────────────────── 上の表における結果は本発明に従い実施した実験におい
て得られた結果ではないが、２９３が非常に高い光のカ
ウントにより明らかなように２つの他の細胞よりかなり
よくルシフェラーゼを発現することを実証する。この理
由で、２９３細胞を本発明に従い実施したそれ以上の実
験のために選択した。

【００７２】実施例２：ｐＡＬＵＣＡＴおよびｐＲＳＶ
ＴＡＴの同時トランスフェクション後のＴＡＴを使用す
るトランスアクチベーションにより光の発生の増強 １０μｇのｐＡＬＵＣＡＴおよびｐＲＳＶＴＡＴを２９
３細胞の中に一時的にトランスフェクションした。抽出
物をトランスフェクション後２４時間につくり、そして
上の手順Ａに従い光を測定した。

【００７３】追加の系列の実験において、それぞれ、ｐ
ＡＬＵＣＡＴおよびｐＳＶ２ＮＥＯで１：８の比におい
て２９３細胞をトランスフェクションした。細胞をトラ
ンスフェクション後Ｇ４１８に２週間暴露した。Ｇ４１
８抵抗性コロニーを懸濁し、そして抵抗性のプールをｐ
ＲＳＶＴＡＴにより一時的トランスフェクションに使用
した。上と同様にして、抽出物をトランスフェクション
後２４時間につくり、そして上の手順Ａに従い光を測定
した。

【００７４】２つの系列の実験の結果を下表３に示す：

【００７５】

【表３】 これらの結果が示すように、ｐＲＳＶＴＡＴ中のｔａｔ
遺伝子の発現から来るＴＡＴの存在下に、光の生成は増
強される。

【００７６】実施例３：ｐＲＳＶＴＡＴで一時的にトラ
ンスフェクションした２９３細胞から作られた細胞抽出
物によりｐＡＬＵＣＡＴのＨＩＶ−ＬＴＲのトランスア
クチベーション １×１０⁶細胞を５〜１０μｇのｐＡＬＵＣＡＴでトラ
ンスフェクションした。２９３細胞の他の群をｐＲＳＶ
ＴＡＴでトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョン後２４時間に、ｐＲＳＶＴＡＴトランスフェクショ
ンした細胞を溶解し、そして細胞抽出物をｐＡＬＵＣＡ
Ｔトランスフェクションした細胞の培養物に２４時間添
加した。光の放射を細胞抽出物について手順Ａの方法に
より測定し、そして２つの異なる実験から得られた結果
を下表４に示す：

【００７７】

【表４】 表４ ｐＲＳＶＴＡＴ トランスフェクション した細胞の抽出物 クロロキン＊ 実験１ 実験２ ──────────────────────────────── - - - 2.4×10⁴ - + 8 ×10⁴ 4.7×10⁴ + - 9.2×10⁴ 4.1×10⁴ + + 2.8×10⁵ 7.3×10⁴ ──────────────────────────────── （＊）クロロキンはＴＡＴタンパク質の吸収を増強することが報告されている（ ５）。

【００７８】結果が示すように、ｐＡＬＵＣＡＴトラン
スフェクションした細胞は、この実験においてｐＲＳＶ
ＴＡＴトランスフェクションした細胞から生じた、媒質
中のＴＡＴの存在下にそれらの生物発光を増加する。

【００７９】実施例４：ＨＩＶで感染した細胞抽出物に
よるｌｕｃ遺伝子のトランスアクチベーション 健康ヒトのドナーの３０ｍｌの血液から分離したＴ細胞
をＨＩＶ粒子で感染させた。３週後、細胞を凍結および
融解により、次いでダウンズ（Ｄｏｗｎ）ホモジナイザ
ーにより溶菌した。同様な手順により、抽出物をまた非
感染ヒトＴ細胞から調製した。

【００８０】次いで、そのように調製した細胞抽出物を
ｐＡＬＵＣＡＴで一時的にトランスフェクションした２
９３細胞に添加した。抽出物の添加後２４時間に、２９
３細胞を収穫し、溶菌し、そして光の放射を上の手順Ａ
に記載するように測定した。光の生成の結果を下表５に
示す：

【００８１】

【表５】 表５ 細胞抽出物 C.P.M ─────────────────────── Ｔ細胞 5×10⁴ ＨＩＶで感染したＴ細胞 5×10⁵ 抽出物なし 1×10⁵ ─────────────────────── 上の結果から理解することができるように、ＨＩＶで感
染したＴ細胞の抽出物にトランスフェクションした細胞
を暴露すると、光の生成はかなり増加した。

【００８２】実施例５：２つの異なる構成体によりトラ
ンスフェクションした細胞からの光の放射 ２９３細胞をプラスミドｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣまたはｐ
Ｚｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ（５μｇのＤＮＡ／皿）でトラン
スフェクションするか、あるいはｐＲＳＶＴＡＴと一緒
にこれらの２つのプラスミドの１つで一時的に同時トラ
ンスフェクションした。光の放射は細胞抽出物について
手順Ａの方法により監視するか、あるいは全細胞につい
て手順Ｂの方法により監視した。

【００８３】細胞抽出物における光の放射を測定するこ
とによって得られた結果を、下表６に示す：

【００８４】

【表６】 表６ ｐＲＳＶＴＡＴで同時 同時トランスフェク プラスミド プラスミド単独 トランスフェクション ション後の増加（倍） ──────────────────────────────────── pSV△HIVLUC 2-7 ×10⁴* 5×10⁶ × 100 pZip△HIVLUC4 3-3.5×10³* 1×10⁷ ×3,000 ──────────────────────────────────── ＊種々の実験における差の範囲 理解できるように、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトラン
スフェクションしたした細胞における基礎的光の生成は
ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣでトランスフェクションした細胞
のそれより低く、さらに、同時トランスフェクション後
の光の生成の増加は前者において非常にいっそう顕著で
ある。こうして、これらの結果が明瞭に実証するよう
に、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターが５’ＭＬＶ−ＬＴＲ
により閉塞されているプラスミド、例えば、ｐＺｉｐ△
ＨＩＶＬＵＣ４を使用すると、このような閉塞が起こら
ないプラスミド、例えば、ｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣの使用
を越えた利点が得られる。

【００８５】ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４プラスミドの利
点は、さらに、図５において実証され、ここで図５は全
細胞からの光の放射を示す。図５ａにおいて見ることが
できるように、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４で一時的にト
ランスフェクションした細胞の基礎的光の生成はｐＳＶ
△ＨＩＶＬＵＣでトランスフェクションした細胞からの
光の生成（図５ｂ）より非常に低い。

【００８６】さらに、図５における結果が実証するよう
に、生体内の光の生成の監視は、細胞抽出物中で直接測
定したとき、ルシフェラーゼ活性を信頼性をもって反映
する。

【００８７】実施例６：テスター細胞中のｔａｔの発現
および光の生成の間の相関関係 ２９３細胞をｐＲＳＶＴＡＴおよびｐＳＶ２ＮＥＯで１
０：１のモル比において同時トランスフェクションし
た。ネオマイシン抵抗性のクローンをネオマイシン類似
体、Ｇ４１８［シグマ・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｏ．）、米国］の使用により選択した。ｔａｔを発現す
るクローンを同定するために、全体のＲＮＡをテスター
細胞のＧ４１８抵抗性クローンの各から得、グアニジウ
ムイソチオシアネート−塩化リチウム方法（１７）によ
り精製した。次いで、等しい量のＲＮＡをニトロセルロ
ースのフィルター上にスポッティングし、そしてｐＲＳ
ＶＴＡＴプラスミドに対してハイブリダイゼーションし
た（１８）。任意に２３９／ｔａｔ１、２３９／ｔａｔ
５および２３９／ｔａｔ１４と表示する、３つのクロー
ンからの結果を図６に示し、ここで上の列はクローン２
３９／ｔａｔ１、２３９／ｔａｔ５および２３９／ｔａ
ｔ１４のドット−ハイブリダイゼーションからの結果を
示し、下の中央のドット（Ｃ）はスポッティングしたｐ
ＲＳＶＴＡＴと陽性の対照−ハイブリダイゼーションを
示し、そして下の右のコーナー（Ｍ）は偽トランスフェ
クションの２９３細胞から分離したＲＮＡの陰性の対照
のドットを含有した。

【００８８】次いで、２つのクローンｔａｔ１およびｔ
ａｔ１４からの１０⁵細胞を１μｇのｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４のＤＮＡでトランスフェクションした。トラン
スフェクション後２４時間に、ルシフェリンを添加し、
そして光の放射を生細胞において手順Ｂの方法に従い監
視した。結果を図７に示し、ここでａおよびｃおよびｂ
およびｄは、それぞれ、クローン２９３／ｔａｔ１４お
よび２９３／ｔａｔ１である、ａおよびｂ−５時間の暴
露、ｃおよびｄ−１７時間の暴露。

【００８９】明瞭に理解することができるように、光の
放射の結果はドット−ハイブリダイゼーションにより検
出される特異的ｔａｔ−ＲＮＡＲＮＡの量と顕著に相関
関係をもつ。ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェ
クションしなかった２９３／ｔａｔ１細胞において光の
放射は検出されなかった（結果は示されていない）。培
養のプレートの顕微鏡検査において、光のスポットは２
〜１０の細胞の凝集物に相当することが示された。これ
が示すように、手順Ｂに従う光の検出の方法は１または
数個の細胞のみのｌｕｃ活性を明らかにすることができ
る。

【００９０】実施例７：ｔａｔ産生細胞の抽出物により
トランスアクチベーション ２９３細胞をｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４で一時的にトラ
ンスフェクションし、そして４つのチャンバースライド
中で生長させた、５×１０⁴細胞／チャンバー。クロー
ン２９３／ｔａｔ１、２９３／ｔａｔ５および２９３／
ｔａｔ１４（参照、実施例６）および対照のクローン、
２９３／ｐＲＳＶ、ｐＲＳＶプラスミド（ｐＲＳＶＴＡ
Ｔに類似するが、ｔａｔ遺伝子を含有しない）でトラン
スフェクションした、の各々の１０⁵細胞の抽出物の等
しいアリコートの各々を１つのチャンバーに添加し、そ
して光の放射を手順Ｂに従い監視した。クローン２９３
／ＰＲＳＶ、２９３／ｔａｔ５、２９３／ｔａｔ１４お
よび２９３／ｔａｔ１からの抽出物への暴露後の光の放
射を、それぞれ、図８ａ、ｂ、ｃおよびｄに示す。結果
を図６のそれらと比較するとき、理解できるように、ト
ランスフェクション後の光の放射は抽出した細胞におけ
るｔａｔ遺伝子の発現の程度と顕著に相関関係をもつ。

【００９１】実施例８：ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４で安
定にトランスフェクションされた細胞中のｌｕｃ遺伝子
のトランスアクチベーション ２９３細胞はｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４およびｐＳＶ２
ＮＥＯで同時トランスフェクションした。ｐＺｉｐ△Ｈ
ＩＶＬＵＣ４プラスミドを収容する独立のＧ４１８抵抗
性クローンを、ルシフェリンの存在下にマルチ−ベイル
（ｍｕｌｔｉ−ｖａｌｅ）の滴定プレート中で生長させ
るときの光の放射により、手順Ｂの方法に従い同定し
た。２９３／ｌｕｃ３４と表示するクローンは、ＴＡＴ
の不存在下に低い光の放射を示し、それ以上の実験のた
めに選択した。

【００９２】２９３／ｌｕｃ３４細胞を、各チャンバー
の中に等しい数の細胞を含有する二重チャンバーのスラ
イド中でインキュベーションした。ｐＲＳＶＴＡＴプラ
スミドでトランスフェクションした２９３細胞からの抽
出物を１つのチャンバーに添加し、そして正常の非トラ
ンスフェクションの２９３細胞を他方に添加した。２時
間後、ルシフェリンを添加し、そして光の放射を手順Ｂ
の方法に従い決定した。結果を図９に示し、ここで２９
３／ｌｕｃ３４テスター細胞をｐＲＳＶＴＡＴトランス
フェクションした２９３細胞からの細胞抽出物の存在下
にインキュベーションしたとき、光の放射はかなり増加
することが実証される。

【００９３】ルシフェリン添加後の暴露時間はテスター
細胞の密度に大きい程度にに依存し、こうしてそれらの
濃度によりかなり減少させることができることに注意す
べきである。細胞を透明な試験管中の遠心により沈澱さ
せるとき、手順Ｂの方法により光の放射を記録するため
に必要な暴露時間はちょうど数分に減少することができ
る。２分の暴露後の、この方法において濃縮した２９３
／ｌｕｃ３４細胞の調製物からの光の放射の結果を図１
０に示す。

【００９４】こうして、手順Ｂの方法に従う、全生テス
ター細胞による光の生成の監視は、媒質中のＴＡＴの存
在を同定する容易なかつ迅速な方法を提供する。

【００９５】実施例９：ＴＡＴを含有する媒質への暴露
による種々の媒質中のｌｕｃ遺伝子のトランスアクチベ
ーション 前述の方法に類似する方法において、２９３細胞をｌｕ
ｃ遺伝子を含有する種々のプラスミドでトランスフェク
ションした。光の生成を手順Ａの方法に従いテスター細
胞抽出物について監視した。これらの細胞における基礎
的光の生成を決定し、次いで細胞をＴＡＴタンパク質を
含有する媒質へ暴露し、そしてこのような暴露後の光の
生成の増加を測定した。結果を下表７に示す：

【００９６】

【表７】 表７ プラスミド 基礎的光の生成 TATへの暴露後の光の生成 TATへの暴露後の （Ｃ.Ｐ.Ｍ.） （Ｃ.Ｐ.Ｍ.） 増加（倍） ──────────────────────────────────── pZipHIVLUC2 3,900 524,000 × 134 PZipHIVLUC1 3,500 >1,270,000(*) ＞× 363 pSVHIVLUC 20,000 236,000 × 12 PSV△HIVLUC 1,850 30,000 × 16 ──────────────────────────────────── （＊）光の生成は計器により測定できるレベルを越えた。

【００９７】これらの結果が明瞭に示すように、本発明
によるテスター細胞は試験した試料中のＴＡＴタンパク
質の存在に対して感受性であり、こうしてエイズの診断
のために使用することができる。結果がさらに示すよう
に、ＨＩＶプロモーターの閉塞が５’−ｍｖｌの存在に
より保証されるプラスミドを含有するテスター細胞は、
プロモーターが閉塞されていないプラスミド（ｐＳＶＨ
ＩＶＬＵＣおよびｐＳＶ△ＨＩＶＬＵＣ）を含有するテ
スター細胞に比較して、試験の光とバックグラウンドの
光との間の非常に高い差を示す。

【００９８】実施例１０：ｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１およ
びｐＲＳＶＴＡＴを使用する細胞の同時トランスフェク
ション ２９３細胞の３つの培養物を各々対照および試験の培養
物に分割した。５μｇのｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１のＤＮ
Ａを各対照または試験の培養物の中に添加し、そして種
々の量のｐＲＳＶＴＡＴを試験培養物の各々の中に添加
した。３０〜４０時間のインキュベーション後、光の生
成は前述の手順Ａの方法に従いテスター細胞の抽出物に
ついて監視し、そして結果（光の単位で表す）を下表８
に示す：

【００９９】

【表８】 表８ 培養物 pRSVTAT 光の単位 ──────────────────────── 1 5μｇ 1×10⁷ - 3,000 2 1μｇ 1×10⁷ - 2,800 3 0.1μｇ 2×10⁶ - 3,100 ──────────────────────── 培養物３の試験培養物は培養物１の試験培養物より５０
倍少ないｐＲＳＶＴＡＴで感染し、こうしてこの培養物
におけるＴＡＴの産生はかなり少なかった。それにもか
かわらず、ルシフェラーゼの発現は、光の測定により明
らかなように、ほんのわずかに減少しただけであった。
これが明瞭に示すように、本発明による試験は少量のＴ
ＡＴの検出においてさえ有効である。

【０１００】実施例１１：ＨＩＶで慢性的に感染したＴ
細胞の抽出物によるテスター細胞のトランスアクチベー
ション １０⁴の２９３／ｌｕｃ３４細胞を７ウェルの各々の中
に接種し、次いで１０⁶のＨＵＴ７８細胞の２０ｍｌの
抽出物（１９）をウェルの１つに添加し、そして等しい
体積の１０倍の希釈物を他の６つのウェルの５つの各々
に添加した（１０^-5までの希釈）。１つのウェルにおい
て、非感染細胞抽出物を対照として添加した。光の放射
を手順Ｂの方法により検出し、そして結果を図１１に示
す。

【０１０１】理解できるように、光はすべての試験ウェ
ルから放射したが、光の放射は対照のウェル（左のウェ
ル）において見られた。これらの結果が、また、実証す
るように、非常に少量のＴＡＴタンパク質を検出するこ
とができる。

【０１０２】実施例１２：患者の血液中のＨＩＶ ｔａ
ｔの検出 ＨＩＶ血清が陽性およびランダムの血液のドナーの血液
試料からのリンパ球を、標準の密度勾配の遠心により分
離した。約１０⁴〜１０６の細胞を凍結および融解によ
り溶菌し、次いでリゼイトを１０倍に希釈し、そして２
０μｌを１０⁴の２９３／ｌｕｃ３４細胞を含有するウ
ェルに添加した。光の放射を手順Ｂの方法により試験し
た。

【０１０３】正常の血液試料を試験したとき、光の放射
は検出されなかったが、ＨＩＶ血清陽性の血液からのす
べての抽出物は２９３／ｌｕｃ３４細胞から光を放射さ
せた。

【０１０４】参考文献 １、ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら（１９８７）、エイズ
の研究およびヒトのレトロウイルス（ＡＩＤＳ Ｒｅｓ
ｅａｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ）、３、５７−６９。

【０１０５】２、ソドルスキ（Ｓｄｏｒｓｋｉ）ら（１
９８５）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２９、７
４−７７。

【０１０６】３、ハウバー（Ｈａｕｂｅｒ）ら（１９８
８）、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６２、
６７３−６７９。

【０１０７】４、ジャコボビツス（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔ
ｓ）ら（１９８８）、モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、
８、２５５５−２５６１。

【０１０８】５、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）ら（１
９８８）、細胞（Ｃｅｌｌ）、５５、１１８９−１１９
３。

【０１０９】６、フェバー（Ｆｅｂｅｒ）ら（１９８
８）、２３９、１８４−１８７。

【０１１０】７、ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）ら（１９８
７）、ＥＭＢＯ、６、３７６５１−３７７０。

【０１１１】８、コンネリイ（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ）ら
（１９８９）、細胞（Ｃｅｌｌ）、５７、５６１−５７
１。

【０１１２】９、ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら（１９
７７）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２、９５−１３。

【０１１３】１０、ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら（１９
８２）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、２、１０４４−
１０５１。

【０１１４】１１、セプコ（Ｃｅｐｋｏ）ら（１９８
４）、細胞（Ｃｅｌｌ）、３７、１０５３−１０６２。

【０１１５】１２、ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）ら（１９
８７）、ＥＭＢＯ、６、３７６１。 １３、デ・ウェット（Ｄｅ Ｗｅｔ）ら（１９８７）、
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、７、７２５−７３７。

【０１１６】１４、サザン（Ｓｏｔｈｅｒｎ）ら（１９
８２）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ア
プライド・ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．）、１、３７７−３４１。

【０１１７】１５、シメンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）ら
（１９８３）、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８０、２４９５−２
４９９。

【０１１８】１６、マッドン（Ｍａｄｄｏｎ）ら（１９
８６）、細胞（Ｃｅｌｌ）、４７、３３３−３４８。

【０１１９】１７、チルグイン（Ｃｈｉｒｇｕｉｎ）ら
（１９７９）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、１８、５２９４−５２９９。

【０１２０】１８、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
（１９８２）、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コール
ド・ハーバー、ニューヨーク、米国。

【０１２１】１９、ガズダー（Ｇａｚｄａｒ）ら（１９
８０）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、５８、４０９−４１７。

【０１２２】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【０１２３】１、工程： ａ）組み換えＤＮＡ分子によりトランスフェクションし
たテスター細胞を準備し、前記テスター細胞は、ｉ）Ｈ
ＩＶ−ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発
することができるｔａｒ部位または類似の配列を包含す
る、ＨＩＶ−ＬＴＲまたは一部分から成る群より選択さ
れるＨＩＶ−ＴＡＴ誘発性プロモーター、ｉｉ）光を放
射する反応を触媒することができる酵素をエンコードす
る異種ＤＮＡ配列、前記配列は前記プロモーターの発現
制御下にある、を有し、そして前記テスター細胞は取り
囲む媒質からＴＡＴタンパク質を吸収しおよび／または
ＨＩＶの感染を受け易く、 ｂ）前記テスター細胞を疑われる個体からの血液試料
と、またはその適当な分画と接触させ、そしてテスター
細胞またはその抽出物を前記異種ＤＮＡ配列の発現が光
の放射を生ずる条件に暴露し、そして ｃ）前記テスター細胞またはその抽出物による光の放射
を監視し、バックグラウンドより上の光の放射の検出は
ＨＩＶの感染を示す、からなる、疑われる個体において
ＨＩＶの感染を診断する方法。

【０１２４】２、前記テスター細胞はＨＩＶの感染に対
する感受性であり、そして血液の中に存在する場合遊離
のＨＩＶ粒子、Ｔ₄ヘルパー細胞、または両者を含有す
る血液試料またはその分画と接触させる、上記第１項記
載の方法。

【０１２５】３、前記テスター細胞を血液試料またはそ
の分画と融合または輸送を増強する因子の存在下に接触
させる、上記第２項記載の方法。

【０１２６】４、前記テスター細胞はそれを取り囲む媒
質からＴ₄タンパク質を吸収することができ、そして血
液の中に存在場合ＴＡＴタンパク質を含有する血液試料
またはその分画と接触する、上記第１項記載の方法。

【０１２７】５、血液の前記分画はＴ₄ヘルパー細胞の
リゼイトからなる、上記第４項記載の方法。

【０１２８】６、前記テスター細胞はＨＩＶの感染およ
び取り囲む媒質からのＴＡＴタンパク質の吸収に対して
感受性である、上記第１〜５項のいずれかに記載の方
法。

【０１２９】７、前記テスター細胞は２９３細胞系から
誘導される、上記第１〜６項のいずれかに記載の方法。

【０１３０】８、光の放射の監視は全テスター細胞の調
製物について実施する、上記第１〜７項のいずれかに記
載の方法。

【０１３１】９、光の放射の監視はテスター細胞の抽出
物について実施する、上記第１〜７項のいずれかに記載
の方法。

【０１３２】１０、ＨＩＶ−ＴＡＴの存在下に下流のＤ
ＮＡ配列の発現を誘発することができるｔａｒ部位また
は類似の配列を包含する、ＨＩＶ−ＬＴＲまたは一部分
であるＨＩＶプロモーター、および光を放射する反応を
触媒する酵素をエンコードする異種ＤＮＡ配列、前記Ｄ
ＮＡ配列は前記プロモーターの発現制御下にある、から
なる組み換えＤＮＡ分子。

【０１３３】１１、前記異種ＤＮＡ配列は酵素ルシフェ
ラーゼをエンコードする、上記第９項記載の組み換えＤ
ＮＡ分子。

【０１３４】１２、その３’末端に、また、前記異種Ｄ
ＮＡ配列のそれと異なるポリＡ部位および配列を含む、
上記第１１項記載の組み換えＤＮＡ分子。

【０１３５】１３、プラスミドｐＡＬＵＣＡＴまたはｐ
ＳＨＩＶＬＵＣである、上記第１２項記載の組み換えＤ
ＮＡ分子。

【０１３６】１４、前記ＨＩＶプロモーターは他のプロ
モーターに対して下流であり、前記他のプロモーターは
ＴＡＴの不存在下にＨＩＶプラスミドより活性である、
上記第１０〜１２項のいずれかに記載の組み換えＤＮＡ
分子。

【０１３７】１５、前記プロモーターは前記他のプロモ
ーターにより誘発される転写の方向に関してアンチセン
スの向きである、上記第１４項記載の組み換えＤＮＡ分
子。 １６、プラスミドはｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ１またはｐＺ
ｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４である、上記第１５項記載の組み
換えＤＮＡ分子。

【０１３８】１７、前記プロモーターは前記他のプロモ
ーターにより誘発される転写の方向に関してセンスの向
きである、上記第１４項記載の組み換えＤＮＡ分子。

【０１３９】１８、プラスミドｐＺｉｐＨＩＶＬＵＣ２
またはｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ５である、上記第１７項
記載の組み換えＤＮＡ分子。

【０１４０】１９、前記組み換えＤＮＡ分子は上記第１
０〜１８項のいずれかに記載の分子である、上記第１〜
９項のいずれかに記載の方法。

【０１４１】２０、上記第１０〜１８項のいずれかに記
載のＤＮＡ分子によりトランスフェクションされた細
胞。

【０１４２】２１、細胞を上記第１０〜１８項のいずれ
かに記載のＤＮＡ分子でトランスフェクションすること
からなり、トランスフェクションすべき細胞は、ｉ）そ
の取り囲む媒質からＴＡＴタンパク質を先天的に吸収す
ることができる細胞、ｉｉ）ＨＩＶの感染に対して先天
的に感受性である細胞、そしてｉｉｉ）ＣＤ４レセプタ
ーをエンコードする遺伝子と同時トランスフェクション
する細胞から成る群より選択される、上記第１項記載の
方法において有用な細胞を調製する方法。

【０１４３】２２、上記第２１項記載の方法により調製
されたテスター細胞。

【０１４４】２３、上記第２０または２２項記載のトラ
ンスフェクションされた細胞からなる、上記第１〜９項
のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。

【０１４５】２４、上記第２０または２２項記載のトラ
ンスフェクションされた細胞および光監視装置からな
る、上記第１〜９項のいずれかに記載の方法を実施する
ためのシステム。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にあるｌｕｃをエ
ンコードするＤＮＡ配列を有するｐＡＬＵＣＡＴを調製
する方法の概略的表示である。

【図２】ｍｖｌに対して下流にあるＨＩＶ−ＬＴＲの発
現制御下にあるｌｕｃ遺伝子を有するｐＺｉｐＨＩＶＬ
ＵＣプラスミドを調製する方法の概略的表示である。

【図３】図２に従い調製されたプラスミドに類似する
が、ＨＩＶ−ＬＴＲが１６０塩基対を欠くことにおいて
異なる、ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣを調製する方法の概略
的表示である。

【図４】下の実験において使用するいくつかのプラスミ
ドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示し、ここで
両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲは閉塞され
ていず（ａ）そしてそれらにおいてＨＩＶ ＬＴＲは他
のプロモーターにより閉塞されている（ｂ）。

【図５】プラスミドｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４（ａ）ま
たはｐＡＬＵＣＡＴ（ｂ）で一時的にトランスフェクシ
ョンした２９３細胞により光の生成を示す。

【図６】ｐＲＳＶＴＡＴでトランスフェクション２９３
細胞（３つの上のスポット）、ｐＲＳＶＴＡＴでトラン
スフェクションした対照（下の中央のスポット）および
偽トランスフェクションの２９３細胞から得られたＲＮ
Ａでトランスフェクションした陰性の対照（下の右のコ
ーナー）の３つのクローンから得られたＲＮＡに対する
ｔａｔ特異的のＤＮＡプローブのドット−ハイブリダイ
ゼーションの結果を示す。

【図７】プラスミドｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトラン
スフェクションした図６におけるクローンの２つ生長す
る細胞からの光の生成：ａおよびｃ−感光性フィルムへ
の５時間の露出；ｂおよびｄ−感光性フィルムへの１７
時間の露出。

【図８】図６の３つのｐＲＳＶＴＡＴでトランスフェク
ションしたクローンおよび偽トランスフェクションのク
ローンからの抽出物に対して暴露したｐＺｉｐ△ＨＩＶ
ＬＵＣ４でトランスフェクションした２９３生長細胞に
よる光の生成を示す。

【図９】一夜の暴露後の、正常２９３細胞（ａ）または
ＴＡＴトランスフェクションした２９３細胞（ｂ）の抽
出物に対して暴露したｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４プラス
ミドで安定にトランスフェクションした２９３生長細胞
による光の生成を示す。

【図１０】ｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェク
ションしそしてＴＡＴトランスフェクションした細胞の
抽出物へ暴露した沈澱した２９３細胞により光の放射
（露出時間−２分）。

【図１１】プラスミドｐＺｉｐ△ＨＩＶＬＵＣ４で安定
にトランスフェクションし、ＨＩＶ感染した細胞の抽出
物の種々の希釈物に暴露した、生長する２９３細胞によ
る光の生成を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１０月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＩＶ−ＬＴＲの発現制御下にあるｌ
ｕｃをエンコードするＤＮＡ配列を有するｐＡＬＵＣＡ
Ｔを調製する方法の概略的表示である。

【図２】図２は、ｍｖ ｌに対して下流にあるＨＩＶ−
ＬＴＲの発現制御下にあるｌｕｃ遺伝子を有するｐＺｉ
ｐＨＩＶＬＵＣプラスミドを調製する方法の概略的表示
である。

【図３】図３は、図２に従い調製されたプラスミドに類
似するが、ＨＩＶ−ＬＴＲが１６０塩基対を欠くことに
おいて異なる、ｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣを調製する方法
の概略的表示である。

【図４】図４は、下の実験において使用するいくつかの
プラスミドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示
し、ここで両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲ
は閉塞されていない。

【図５】図５は、下の実験において使用するいくつかの
プラスミドのＨＩＶ−ＬＴＲ／ｌｕｃ領域を詳細に示
し、ここで両者のプラスミドにおいて、ＨＩＶ ＬＴＲ
は他のプロモーターにより閉塞されている。

【図６】図６は、プラスミドｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣ４
（ａ）またはｐＡＬＵＣＡＴ（ｂ）で一時的にトランス
フェクションした２９３細胞により光の生成を示す。

【図７】図７は、ｐＲＳＶＴＡＴでトランスフェクショ
ン２９３細胞（３つの上のスポット）、ｐＲＳＶＴＡＴ
でトランスフェクションした対照（下の中央のスポッ
ト）および偽トランスフェクションの２９３細胞から得
られたＲＮＡでトランスフェクションした陰性の対照
（下の右のコーナー）の３つのクローンから得られたＲ
ＮＡに対するｔａｔ特異的のＤＮＡプローブのドット−
ハイブリダイゼーションの結果を示す。

【図８】図８は、プラスミドｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣ４
でトランスフェクションした図７におけるクローンの２
つ生長する細胞からの光の生成：ａおよびｃ−感光性フ
ィルムへの５時間の露出；ｂおよびｄ−感光性フィルム
への１７時間の露出。

【図９】図９は、図７の３つのｐＲＳＶＴＡＴでトラン
スフェクションしたクローンおよび偽トランスフェクシ
ョンのクローンからの抽出物に対して暴露したｐＺｉｐ
ΔＨＩＶＬＵＣ４でトランスフェクションした２９３生
長細胞による光の生成を示す。

【図１０】図１０は、一夜の暴露後の、正常２９３細胞
（ａ）またはＴＡＴトランスフェクションした２９３細
胞（ｂ）の抽出物に対して暴露したｐＺｉｐΔＨＩＶＬ
ＵＣ４プラスミドで安定にトランスフェクションした２
９３生長細胞による光の生成を示す。

【図１１】図１１は、ｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵＣ４でトラ
ンスフェクションしそしてＴＡＴトランスフェクション
した細胞の抽出物へ暴露した沈澱した２９３細胞により
光の放射（露出時間−２分）。

【図１２】図１２は、プラスミドｐＺｉｐΔＨＩＶＬＵ
Ｃ４で安定にトランスフェクションし、ＨＩＶ感染した
細胞の抽出物の種々の希釈物に暴露した、生長する２９
３細胞による光の生成を示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

【図７】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１】

【図８】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シヨシヤナ・イスラエル イスラエル・エルサレム92465ケレンカイ エメトストリート88 (72)発明者 シモン・ウリツアー イスラエル・ハイフア34986・ビラムスト リート３ (72)発明者 ジヨナサン・シー・クン イスラエル・ハイフア34987・シーリトハ プレタ44 (72)発明者 モーデチヤイ・スイサ イスラエル・エルサレム96268・ギバトベ トハケレム４／23 (72)発明者 ズビ・ベントウイツチ イスラエル・レホボト76310・ハグラスト リート６

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 工程： ａ）組み換えＤＮＡ分子によりトランスフェクションし
   たテスター細胞を準備し、前記テスター細胞は、ｉ）Ｈ
   ＩＶ−ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ配列の発現を誘発
   することができるｔａｒ部位または類似の配列を包含す
   る、ＨＩＶ−ＬＴＲまたは一部分から成る群より選択さ
   れるＨＩＶ−ＴＡＴ誘発性プロモーター、ｉｉ）光を放
   射する反応を触媒することができる酵素をエンコードす
   る異種ＤＮＡ配列、前記配列は前記プロモーターの発現
   制御下にある、を有し、そして前記テスター細胞は取り
   囲む媒質からＴＡＴタンパク質を吸収しおよび／または
   ＨＩＶの感染を受け易く、 ｂ）前記テスター細胞を疑われる個体からの血液試料
   と、またはその適当な分画と接触させ、そしてテスター
   細胞またはその抽出物を前記異種ＤＮＡ配列の発現が光
   の放射を生ずる条件に暴露し、そして ｃ）前記テスター細胞またはその抽出物による光の放射
   を監視し、バックグラウンドより上の光の放射の検出は
   ＨＩＶの感染を示す、からなる、疑われる個体において
   ＨＩＶの感染を診断する方法。
2. 【請求項２】 ＨＩＶ−ＴＡＴの存在下に下流のＤＮＡ
   配列の発現を誘発することができるｔａｒ部位または類
   似の配列を包含する、ＨＩＶ−ＬＴＲまたは一部分であ
   るＨＩＶプロモーター、および光を放射する反応を触媒
   する酵素をエンコードする異種ＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ
   配列は前記プロモーターの発現制御下にある、からなる
   組み換えＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 請求項２のＤＮＡ分子によりトランスフ
   ェクションされた細胞。
4. 【請求項４】 細胞を請求項１のＤＮＡ分子でトランス
   フェクションすることからなり、トランスフェクション
   すべき細胞は、ｉ）その取り囲む媒質からＴＡＴタンパ
   ク質を先天的に吸収することができる細胞、ｉｉ）ＨＩ
   Ｖの感染に対して先天的に感受性である細胞、そしてｉ
   ｉｉ）ＣＤ４レセプターをエンコードする遺伝子と同時
   トランスフェクションする細胞から成る群より選択され
   る、上記第１項記載の方法において有用な細胞を調製す
   る方法。
5. 【請求項５】 請求項４の方法により調製されたテスタ
   ー細胞。
6. 【請求項６】 請求項３または４のトランスフェクショ
   ンされた細胞からなる、請求項１の方法を実施するため
   のキット。
7. 【請求項７】 請求項３または４のトランスフェクショ
   ンされた細胞および光監視装置からなる、請求項１の方
   法を実施するためのシステム。