FR2820146A1 - Procede d'obtention de cellules d'encapsidation fortement productrices de retrovirus par elimination, au sein de la culture, des cellules permissives a l'infection par le retro virus produit - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention de cellules d'encapsidation de rétrovirus non permissives à l'infection par ledit rétrovirus ou un rétrovirus de même type. L'invention concerne également l'utilisation de vecteur rétroviral pour la mise en oeuvre dudit procédé d'obtention ainsi qu'un procédé de préparation de rétrovirus recombinant non réplicatif par transfection de cellules d'encapsidation obtenues par ledit procédé d'obtention.

Description

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La présente invention concerne le domaine de la biologie, et plus particulièrement le domaine de la virologie. L'invention se rapporte à un procédé d'obtention de cellules d'encapsidation de rétrovirus qui sont transcomplémentantes et non permissives à l'infection par ledit rétrovirus. L'invention concerne également l'utilisation de vecteur rétroviral pour la mise en oeuvre dudit procédé d'obtention ainsi qu'un procédé de préparation de rétrovirus recombinant non réplicatif par transfection de cellules d'encapsidation obtenues par ledit procédé d'obtention.

L'utilisation de vecteurs rétroviraux nonréplicatifs s'élargit de plus en plus tant en recherche fondamentale qu'en clinique. La production de vecteurs non-réplicatifs nécessite l'utilisation de lignées cellulaires appelées transcomplémentantes . Ces lignées ont été mises au point pour produire l'ensemble des protéines de structure nécessaires pour assembler un rétrovirus mais ne produisent pas elles-mêmes de virus de manière spontanée. La mise au point de ces lignées est généralement longue et fastidieuse et fait appel à de nombreuses étapes de biologie moléculaire et de culture cellulaire. Lorsque l'on introduit, par transfection dans ces lignées, un génome viral dont les gènes de structure ont été remplacés par des gènes d'intérêt, on obtient la production de particules virales qui portent les gènes en question. Ces vecteurs rétroviraux peuvent effectuer un cycle d'infection rétrovirale mais ne sont pas capables de ressortir de la cellule infectée sous forme de particule virale car les gènes de structure virale sont absents.

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L'un des problèmes les plus fréquemment rencontrés dans l'utilisation de ces lignées est la perte progressive de la capacité à produire le virus et la difficulté à obtenir des clones cellulaires produisant de grandes quantités de virus. Cette dérive se produit dans les lignées transcomplémentantes naïves comme dans les cellules productrices. Ce phénomène, bien connu des utilisateurs, nécessite de sous-cloner plus ou moins régulièrement les cellules et de les tester pour isoler des clones possédant des caractéristiques plus favorables. Ces contraintes rencontrées dans tous les types d'utilisation prennent du temps et sont un frein à l'utilisation des vecteurs.

Pour éviter cela, il est généralement recommandé d'utiliser des stocks viraux provenant de passages précoces. Mais il est parfois difficile pour les laboratoires d'avoir accès à de telles lignées cellulaires ayant un faible nombre de passages en culture.

Certains auteurs ont imaginé produire ces vecteurs de manière transitoire. Cette technique, surtout utilisée en thérapie génique, consiste à cotransfecter à la fois un plasmide portant les gènes de structure et un autre plasmide contenant le vecteur que l'on souhaite produire. Les vecteurs sont récoltés sur une période de 48 à 72 heures après quoi la culture est éliminée. On réalise alors des stocks viraux qui sont congelés avant utilisation. Néanmoins, ce type de production ne peut être mis en oeuvre que pour certaines espèces virales qui supportent bien la congélation et pour lesquelles ont été isolées des lignées cellulaires

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hautement transfectables qui ne peuvent pas encapsider tous les types de vecteurs.

Pour pallier les inconvénients de l'utilisation des espèces rétrovirales en culture, les inventeurs ont développé un procédé basé sur le phénomène d' interférence rétrovirale pour éliminer rapidement et sûrement de la culture cellulaire les cellules parasites dont la présence contribue à diminuer fortement l'efficacité de la production virale.

Par phénomène d'interférence virale, on entend désigner la résistance des lignées d'encapsidation à l'infection par les vecteurs qu'elles produisent, car les protéines d'enveloppe rétrovirale produites par les cellules bloquent le récepteur cellulaire nécessaire à l'entrée du virus dans la cellule. Les inventeurs ont posé l'hypothèse que les cellules qui dérivaient perdaient l'expression des gènes de structure virale.

Les inventeurs ont mis au point un système basé sur l'interférence rétrovirale dans lequel les cellules qui expriment peu ou pas de gènes de structure virale peuvent être éliminés de la culture. Le principe de base est d'utiliser un vecteur rétroviral pour infecter les cellules de la lignée d'encapsidation. Les cellules qui auront été infectées seront celles qui auront perdu l'expression des gènes de structure virale. On peut donc les éliminer de la culture par différents moyens qui seront énumérés ci-après.

La présente invention se propose donc de fournir un procédé d'obtention de cellules d'encapsidation de rétrovirus, trans-complémentantes non-permissives à l'infection par ledit rétrovirus, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de :

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(i) culture d'une population des dites cellules d'encapsidation ; (ii) introduction par infection rétrovirale dans les dites cellules cultivées en (i) d'un vecteur rétroviral comprenant au moins un gène marqueur compris dans le génome rétroviral encapsidable ; (iii) sélection des dites cellules n'exprimant pas ledit gène marqueur .

Au sens de la présente invention, on entend désigner par rétrovirus les virus oncogènes et non oncogènes présents naturellement dans la nature qui affectent les animaux et l'homme, les variants de ses rétrovirus issus de l'instabilité et de la variété génétique intrinsèque ou de réarrangement entre rétrovirus, ainsi que des rétrovirus recombinants obtenus par génie génétique.

Les caractères fondamentaux des rétrovirus sont d'avoir une information génétique stockée sous forme d'ARN et de posséder aux extrémités 3'et 5'deux séquences non traduites orientées de la même manière (LTR, pour Long Terminal Repeat t ), ainsi que d'utiliser la reverse-transcriptase au cours de leur multiplication. L'ARN génomique d'un rétrovirus contient des séquences de gènes agissant en trans codant pour des protéines virales : (i) une protéine structurale GAG qui s'associe avec l'ARN dans le corps de la particule virale ; (ii) la reverse-transcriptase POL qui catalyse la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) ; et (iii) une glycoprotéine d'enveloppe ENV qui se situe dans la bicouche des particules et qui lie le virus à la surface des cellules hôte lors de l'infection. La réplication du rétrovirus est régulée

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par des éléments agissant en cis, tel que le promoteur pour la transcription de l'ADN proviral, et d'autres séquences nucléotidiques nécessaires à la réplication virale. Les éléments agissant en cis sont présents dans ou à côté des LTR. Les rétrovirus se répliquent en copiant leur génome ARN par reverse-transcription en un ADN intermédiaire double-brin en utilisant la reversetranscriptase. L'ADN intermédiaire est intégré dans l'ADN chromosomique de la cellule hôte. L'ADN rétroviral intégré est appelé provirus . Le provirus sert de matrice pour la synthèse des chaînes ARN pour la formation des particules virales infectieuses.

Les rétrovirus selon l'invention sont utilisés comme vecteurs rétroviraux en remplaçant dans la forme provirale du rétrovirus un ou plusieurs gènes endogènes agissant en trans par une séquence ou un gène recombinant d'intérêt. Les gènes agissant en trans incluent les gènes GAG, POL et ENV nécessaires a la production de virions intacts. Les rétrovirus recombinants, déficients en gènes trans-activateurs GAG, POL et ENV, ne peuvent donc pas synthétiser les protéines essentielles pour leur réplication et sont de ce fait défectifs pour la réplication. Par virus défectif, on entend désigner un virus ayant perdu l'une quelconque des fonctions qui lui sont nécessaires pour assurer sa perpétuation, soit sous sa forme provirale, soit sous forme végétative. De tels rétrovirus recombinants défectifs pour la réplication sont propagés en utilisant des lignées cellulaires d'encapsidation ou en réalisant une cotransfection avec des virus helper .

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Par vecteur rétroviral ou séquence d'ADN proviral recombinant au sens de la présente invention, on entend désigner une séquence nucléotidique rétrovirale ayant conservé les séquences CIS indispensables, c'est-à-dire les LTR pour le contrôle de la transcription et de l'intégration, la ou les séquences nécessaires pour l'encapsidation, la séquence PBS ( Primer binding site ) nécessaire pour la réplication virale, et qui est délétée d'au moins un gène viral GAG, POL, ENV,

facultativement remplacé par au moins une séquence d'ADN d'intérêt.

Une taxonomie des rétrovirus a été décrite par Coffin J. M., Hughes S. H., Warmus H. E. (EDS.), Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997), appendix 2, pages 757-775. Une liste non exhaustive de rétrovirus selon l'invention est donnée ci-après : Avian Leukosis Virus (ALV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Rous-Associated Virus (RAV), Fujinami Sarcoma Virus (FuSV), Avian Myelocytoma Virus (MH2), Avian Erythroblastosis Virus (AEV), S13 Avian Erythroblastosis Virus (AEV), Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Avian Retrovirus RPL12, CT10 Avian Sarcoma Virus (CT10), Avian Myeloblastosis-Erythoblastosis Virus E26 (E26), Avian Myelocytoma MC29 (MC29), Avian Retrovirus RPL30, Rous-Associated Virus-0 (RAV-0), Avian Sarcoma Virus (UR2), Avian Retrovirus (SKV), Y73 Avian Sarcoma Virus (Y73), Avian Sarcoma Virus 17, Avian Retrovirus AS42 (ASV42), Avian Retrovirus (ASV31), Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV), Gross Murine Leukemia Virus (Gross MLV), Graffi Murine Leukemia Virus (GraffiMLV), Friend Murine Leukemia Virus (FR-

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MLV), Radiation Leukemia Virus (RadLV), Spleen Necrosis Virus (SNV), Moloney Murine Leukemia Virus (Mo-MLV), Harvey Murine Sarcoma Virus (Ha-MSV), Feline Leukemia Virus (Fe-LV), Spleen Focus-Forming Virus (SFFV),

Fine-Bisis-Jinins Munne 5'arcom < 3 Virus (FB-MSV), Moloney Mu ri ne sarcoma Virus (Mo-MSV), Avian Reticuloendotheliosis Virus (REV), Kirsten Murine Sarcoma Virus (Ki-MSV), Baboon Endogenous Virus (BaEV), Abelson Murine Leukemia Virus (Ab-MLV), Gibbon Ape Leukemia Virus (GALV), Gardner-Arnstein Féline Sarcoma Virus (GA-FeSV), McDonough Feline Sarcoma Virus (SMFeSV), Simian Sarcoma Virus (SSV), Snyder-Theilen Feline Sarcoma Virus (ST-FeSV), Murine Sarcoma virus 3611 (MSV3611), Hardy-Zuckerman Feline Sarcoma Virus (HZ4FeSV), Mouse Myeloproliferative Leukemia Virus, Mason-Pfizer Monkey-Type Virus (MPMV), Jaagsiekte virus, Bovine Leukemia Virus (BLV), Human T-Cell Leukemia Virus-1 (HTLV-1), Human T-Cell Leukemia Virus- 2 (HTLV-2), Equine Infectious Anemia Virus (EIAV), Visnavirus Caprine Arthrisis-Encephali tis Virus (CAEV), Bovine Immunodeficiency Virus (BIV), Human

T. nununodericiency Virus-- ! (HIV-1), 5'imian Immunodeficiency Virus (SIV), Human Immunodeficiency Virus-2 (HIV-2), Feline Immunodeficiency Virus (FIV), Human Foamy Virus (HFV), Simian Foamy Virus (SFV), Walleye Dermal Sarcoma virus (WDSV).

Selon un mode préféré de réalisation, le rétrovirus selon l'invention est le virus de la nécrose de la rate (SNV). L'ADN proviral et le vecteur rétroviral selon l'invention dérive également du SNV. Le génome SNV est

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par exemple disponible sous forme de plasmide (PpblOl) sous le numéro ATCC 45012.

Les rétrovirus, vecteur rétroviral, ADN proviral selon l'invention, sont soit amphotropes, pour permettre leur utilisation dans différentes espèces ou types cellulaires, soit écotropes.

Il convient de souligner que la présente invention est plus particulièrement destinée à l'utilisation de vecteur rétroviraux et aux cellules d'encapsidation correspondantes. Mais il entre également dans la portée de l'invention de fournir un procédé selon l'invention adapté aux autres types de vecteurs viraux, tels par exemple les vecteurs adénoviraux ou adénovirauxassociés, utilisés en recherche fondamentale, en génie génétique ou en thérapie génique, et qui utilisent des protéines de surface ou des récepteurs pour pénétrer dans la cellule hôte.

Par lignée d'encapsidation, au sens de la présente invention, on entend désigner une lignée cellulaire qui contient tout ou partie de un ou plusieurs génomes rétroviraux intégrés ou non dans le génome cellulaire et qui fournissent les séquences géniques agissant en trans nécessaires à la production de virions intacts.

Ainsi, une séquence d'ADN proviral recombinante contenant une séquence d'ADN d'intérêt, introduite dans une lignée cellulaire d'encapsidation par transfection ou infection sont ensuite transcrites en ARN et encapsidées en virions infectieux contenant la séquence d'intérêt ; de tels virions infectieux ne pouvant synthétiser les protéines GAG, POL, ENV pour réaliser l'encapsidation de l'ARN viral dans des particules susceptibles d'infecter d'autres cellules, les vecteurs

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rétroviraux infectieux résultant peuvent de ce fait infecter d'autres cellules et intégrer la séquence d'ADN proviral recombinante d'intérêt dans l'ADN cellulaire d'une cellule hôte mais ils ne peuvent se répliquer. On entend par non-permissive une cellule qui ne permet pas au virus de pénétrer dans ladite cellule, ne permettant pas ainsi au virus de se multiplier et de reproduire de nouveaux virus. La nonpermissivité des cellules selon l'invention et une nonpermissivité d'infection. Par trans-complémentante , on entend désigner, les cellules d'encapsidation qui expriment de manière transitoire ou permamente, inductible ou constitutive, au moins un gène rétroviral transactivateur GAG, POL, ENV dont le produit d'expression est nécessaire à l'assemblage du rétrovirus dans la cellule.

Par transfection, on entend désigner toute technique expérimentale consistant à faire pénétrer une séquence nucléotidique dans une cellule eucaryote où les techniques de transfection sont connues de l'homme du métier. On peut citer de manière non exhaustive la précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la lipofection, le choc thermique, l'utilisation de polymères cationiques tels que le DEAE-dextran, le polybrène, le polyéthylène glycol.

Par infection, on entend désigner le transfert de matériel génétique d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus. Selon un mode préféré de réalisation, ledit vecteur rétroviral est introduit dans les cellules d'encapsidation par infection rétrovirale.

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La lignée d'encapsidation selon la présente invention peut dériver de cellules de toutes espèces animales ou végétales. De préférence, ces cellules dérivent de cellules murines, de cellules de singe, de cellules aviaires, de cellules humaines. A titre d'exemple, une liste non exhaustive de cellules d'encapsidation de vecteurs rétroviraux est donnée ciaprès ; cette liste n'est pas exhaustive et ne saurait en rien limiter la présente invention. Parmi les cellules d'encapsidation murines, il convient de citer les cellules dérivées des (i) cellules NIH 3T3, et leurs cellules dérivées telles par exemple les cellules ATCC CRL 9078, ATCC CRL 10686, (ii) les cellules COS et leurs cellules dérivées, (iii) les cellules 293 et leurs cellules dérivées telles que ATCC CRL 11270, ATCC CRL 11268, ATCC CRL 11269, ATCC CRL 11554. Parmi les cellules d'encapsidation humaines, il convient de citer les cellules de fibrosarcome humain notamment les cellules HT 1080 et leurs cellules dérivées. Les cellules d'encapsidation selon la présente invention présentent à leur surface cellulaire des récepteurs qui participent à l'entrée des rétrovirus dans la cellule.

De préférence, ces récepteurs lient un large spectre de virus, permettant ainsi aux cellules d'encapsidation selon l'invention d'être infectées par un large spectre de virus, notamment de rétrovirus. A l'inverse, il peut être avantageux d'avoir des cellules d'encapsidation dont les récepteurs cellulaires au virus sont spécifiques d'une seule espèce virale.

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite sélection est effectuée en

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éliminant, de la dite population de cellules d'encapsidation, les cellules exprimant ledit gène marqueur . Selon ce premier mode de réalisation, ledit gène marqueur est un gène suicide dont l'expression cellulaire provoque la mort des cellules exprimant ledit gène suicide . Par gène suicide selon la présente invention, on entend désigner un acide nucléique codant pour un produit protéique, caractérisé en ce que ce produit provoque par lui-même la mort cellulaire, ou en présence d'un autre composé, tel par exemple une pro-drogue. C'est la raison pour laquelle, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape d'administrer dans le milieu de culture une pro-drogue en quantité suffisante pour que ladite pro-drogue après avoir été métabolisée par le produit d'expression dudit gène suicide soit convertie en un composé toxique pour ladite cellule exprimant ledit gène marqueur . Le gène suicide selon la présente invention correspond entre autres aux gènes utilisés par l'homme du métier en biologie moléculaire pour réaliser une sélection négative de cellule (pour revue, voir brevet US 5 627 059). Ledit gène suicide selon l'invention code de préférence pour une protéine choisie dans le groupe composé des kinases, de la cytosine déaminase bactérienne, de l'hypoxanthine-phosphoribosyl- transférase (HPRT) et de la guanine-phosphoribosyltransférase (GpT).

Plus particulièrement, ladite kinase est choisie dans le groupe composé de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex et de la thymidine kinase du virus de la varicelle ( Varicella zoster virus ). De

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manière préférée, il s'agit de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type I ; lorsque la kinase utilisée est la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type I, la pro-drogue est choisie dans le groupe composée de l'acyclovir, du ganciclovir, du FIAU (l- (2-déoxy-2-fluoro-P-D-arabinofuranosyl) 5-iodouracile ou de leurs dérivés. Lorsque la kinase utilisée est la thymidine kinase du virus de la varicelle, la prodrogue est choisie dans le groupe composée de la 6méthoxypurine arabinoside ou l'un de ses dérivés.

Lorsque la protéine exprimée à partir dudit gène suicide est la cytosine déaminase bactérienne, la prodrogue est choisie dans le groupe composée de la 5fluorocytosine et ses dérivés qui sont convertit en 5fluoro-uracile, composé hautement toxique pour la cellule. Lorsque la protéine exprimée à partir dudit gène suicide est HPRT (Hypoxanthine phosphoribosyl transférase, la pro-drogue est la 6-thio-guanine et ses dérivés. Lorsque la protéine exprimée à partir dudit gène suicide est la guanine-phosphoribosyltransférase (GpT) la pro-drogue est la 6-thio-xanthine et ses dérivés. Lorsque le gène suicide selon la présente invention, code pour un produit protéique qui provoque par lui-même la mort cellulaire, le dit produit protéique peut être une toxine, telle que la toxine diphtérique ou la toxine du ricin.

Selon un second mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit gène marqueur est un gène tueur qui code pour une protéine pro-apoptotique dont l'expression cellulaire provoque la mort des cellules exprimant ledit gène marqueur . On entend désigner par

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protéines pro-apoptotiques les protéines qui interviennent dans l'apoptose ou promeuvent l'apoptose. Parmi les protéines pro-apoptotiques, il convient de citer les protéines de la famille de Bic12, et plus particulièrement les protéines BIK ( Bc-Z2-Jnteracting Protein ), BAX (Oltvai et al. 1993), BAK (Chittenden et al. 1995 ; Kiefer et al. 1995) et BID ( BH3- Interacting Domain Death Agonist ) (Wang et al. 1996).

Parmi les protéines pro-apoptotiques, il convient également de citer les caspases, la protéine AIF ( Apoptosis-Inducing Factor ) (Susin et al. 1999) et les protéines de la famille du facteur nécrosant des tumeurs (TNF, Tumor Necrosing Factor ), et plus particulièrement le TNF lui-même (Old 1985), la protéine FASL ( FAS-Ligand ) (Takahashi et al. 1994).

Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite sélection est effectuée en triant dans ladite population de cellules d'encapsidation les cellules qui expriment et qui n'expriment pas ledit gène marqueur . Selon ce troisième mode de réalisation, le procédé est caractérisé en ce que ledit gène marqueur est un gène reporter dont l'expression cellulaire permet de trier les cellules exprimant ledit gène de sélection. On entend désigner par gène reporter , un gène qui permet aux cellules comportant ce gène d'être détectées de manière spécifique, c'est-à-dire d'être distinguées des autres cellules qui ne portent pas ce gène marqueur. Ledit gène reporter selon l'invention code pour une protéine choisie de préférence dans le groupe composé des protéines auto-fluorescentes, telles

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que la protéine de fluorescence verte (GFP, pour Green Fluorescence Protein ), la protéine de fluorescence rouge (RFP pour Red Fluorescence Protein ), ainsi que les variants de ces protéines de fluorescence obtenues par mutagenèse pour générer une fluorescence de couleur différente. Ledit gène reporter code également pour toute enzyme détectable de manière fluorescente, phosphorescente, ou visible par un procédé histochimique sur des cellules vivantes. De façon non exhaustive, il convient de citer la ss-galactosidase (ss-GAL), la ss-glucoronidase (0-GUS), la phosphatase alcaline, notamment la phosphatase alcaline placentaire (PLAP), la déshydrogénase alcoolique, notamment la déshydrogénase alcoolique de drosophile (ADH), la luciférase, notamment la Firefly Luciferase, la chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT), l'hormone de croissance (GH). Lorsque ledit gène marqueur est un gène reporter , il est intéressant de trier la population de cellules d'encapsidation, au lieu d'éliminer certaines cellules de la culture. C'est la raison pour laquelle, la présente invention concerne également le procédé selon l'invention caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape de trier la population de cellules d'encapsidation. A titre d'exemple non limitatif, ce tri peut être réalisé au moyen d'un trieur de cellules (FACS pour Fluorescence Analysis Cell Sorter ). Mais d'autres appareils ou technologies destinés à réaliser du tri cellulaire, connus de l'homme du métier peuvent être utilisés.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit vecteur rétroviral comprend en outre un second

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gène de sélection. Par gène de sélection, on entend désigner un gène qui permet aux cellules qui le possèdent d'être sélectionnées spécifiquement pour ou contre la présence d'un agent sélectif correspondant.

Pour illustrer ce propos, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif qui permet à une cellule hôte d'être sélectionnée positivement en présence de l'antibiotique correspondant. Une variété de marqueurs positifs et négatifs sont connus de l'homme du métier (pour revue voir brevet US 5 627 059). Ce gène de sélection peut se trouver soit à l'intérieur ou à l'extérieur du génome rétroviral encapsidable. Lorsque le second gène de sélection se trouve à l'intérieur du génome rétroviral encapsidable, c'est-à-dire entre les séquences LTR5'et LTR3', celui-ci peut être présent sous la forme d'une entité génique distincte du gène marqueur. Dans ce cas, ledit second gène de sélection est lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler l'expression dudit second gène. Ces séquences, connues de l'homme du métier, correspondent notamment aux séquences promotrices, facultativement aux séquences activatrices, aux signaux de terminaison de la transcription aux séquences d'épissage. Facultativement, ledit second gène de sélection peut constituer un gène de fusion avec le gène marqueur. Ledit gène de fusion est alors lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler l'expression dudit gène de fusion. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ledit second gène de sélection dudit vecteur rétroviral est situé à l'extérieur du génome

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rétroviral encapsidable. Comme décrit dans les exemples ci-après, la localisation dudit gène de sélection à l'extérieur du génome rétroviral encapsidable permet d'augmenter le taux maximal de clones producteurs de particules rétrovirales indépendamment du taux de dérive de la lignée d'encapsidation. Ledit second gène de sélection selon l'invention est de préférence choisi parmi les gènes de résistance aux antibiotiques. Parmi les antibiotiques, il convient de citer de manière non exhaustive la néomycine, la tétracycline, l'ampicilline, la kanamycine, la phléomycine, la bléomycine, l'hygromycine, le chloramphénicol, la carbénicilline, la généticine. Les gènes de résistance correspondant à ces antibiotiques sont connus de l'homme du métier ; à titre d'exemple, le gène de l'aminoglycoside phosphotransférase bactérienne (APH) rend les cellules résistantes à la présence de l'antibiotique néomycine dans le milieu de culture. Le second gène de sélection peut également être sélectionné parmi le gène HisD, l'agent sélectif correspondant étant l'histidinol. Le second gène de sélection peut également être sélectionné parmi le gène de la guanine-phosphoribosyl-transférase (GpT), l'agent sélectif correspondant étant la xanthine. Le second gène de sélection peut également être sélectionné parmi le gène de l'hypoxanthine-phosphoribosyl-transférase (HPRT), l'agent sélectif correspondant étant la l'hypoxanthine. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le second gène de sélection est sélectionné dans le groupe de gènes codant pour des enzymes du métabolisme pour lesquels on possède des cellules d'encapsidation mutantes qui en sont

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dépourvues, par exemple le gène de la dihydrofolate réductase pour les cellules dhfr-, le gène de la thymidine kinase pour les cellules TK-. Les transformants sont alors sélectionnés pour leur aptitude à se multiplier en milieu sélectif tel que le milieu hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) par exemple. Ainsi, parmi les gènes codant pour des enzymes du métabolisme, il convient de citer de manière non exhaustive la thymidine kinase, la dihydrofolate réductase, l'hygromycine ss-phospho-transférase, la xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (XGPRT), la CAD (carbamyl phosphate synthase, aspartate transcarbamylase, dihydroorotase), l'adénosine déaminase, l'asparagine synthétase.

Il peut être également avantageux à ce que le vecteur rétroviral selon l'invention comprenne en outre au moins un troisième gène situé à l'intérieur du génome rétroviral encapsidable. Le dit troisième peut être présent sous la forme d'une entité génique distincte du gène marqueur ou constituer un gène de fusion avec le dit gène marqueur. Le dit troisième gène codant pour un enzyme peut être particulièrement utile pour estimer le titre de la préparation rétrovirale.

C'est pourquoi le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit vecteur rétroviral comprend en outre un gène codant pour un enzyme situé à l'intérieur du génome rétroviral encapsidable. Selon ce mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de titration des particules virales par dosage de l'activité de ladite enzyme. Les techniques de dosage d'activité enzymatique sont largement connues de l'homme du métier en

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biochimie. Ces techniques font appel de préférence à des dosages photométriques, fluorimétriques, isotopiques, immunologiques, radioimmunologiques, manométriques (pour revue, voir P. Kamoun Appareils et Méthodes en Biochimie , 3éme Ed. Medecine-Sciences Flammarion). Les enzymes susceptibles d'être mises en oeuvre dans le procédé selon l'invention sont connues de l'homme du métier ; il s'agit de préférence d'enzymes qui catalysent la transformation d'un produit en un substrat dont la détermination quantitative et qualitative est aisée et rapide. Parmi les enzymes selon l'invention, il convient de citer de manière non exhaustive l'alcool déshydrogénase, et notamment l'alcool déshydrogénase de drosophile, lacticodéshydrogénase, les transaminases, telles que la transaminase glutamate-pyruvate.

L'invention concerne également l'utilisation de vecteur rétroviral pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention de cellules d'encapsidation de rétrovirus trans-complémentantes non-permissives, caractérisée en ce que ledit vecteur comprend au moins un gène marqueur tel que précédemment défini et choisi parmi les gènes suicides, les gènes tueurs, les gènes reporter situé entre les séquences LTR5'et LTR3'.

Facultativement, mais de manière préférée, ledit vecteur comprend un second gène de sélection et/ou undit troisième gène.

L'invention concerne également un procédé de préparation de rétrovirus recombinant non-réplicatif, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes :

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(i) obtention de cellules d'encapsidation nonpermissives trans-complémentantes par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention ; (ii) transfection dans les dites cellules obtenues en (i) d'un vecteur rétroviral comprenant au moins le génome encapsidable dudit rétrovirus recombinant ; (iii) culture des cellules ainsi transfectées dans des conditions permettant l'expression des protéines d'encapsidation ; (iv) récolte desdits rétrovirus recombinants.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, il est possible d'introduire le génome encapsidable du rétrovirus recombinant dans les cellules d'encapsidation par infection virale.

Ledit vecteur rétroviral mis en oeuvre dans le procédé de préparation précédent comprend au moins une séquence ou un gène d'intérêt. Facultativement, il comprend au moins un gène de sélection positif ou négatif ; de préférence ledit gène de sélection est situé à l'extérieur du génome rétroviral encapsidable.

De manière plus préféré, il s'agit d'un gène de sélection positif de résistance à un antibiotique ; dans ce cas ladite culture de l'étape iii) est réalisée en présence dudit antibiotique.

L'invention concerne également le rétrovirus recombinant non-réplicatif obtenu par le procédé de préparation précédent. Le rétrovirus est préparé dans des cellules d'encapsidation sélectionnées par le procédé d'obtention selon l'invention qui utilise des rétrovirus de la même espèce virale. Néanmoins, l'utilisation de lignées amphotropiques permet d'utiliser des espèces virales différentes.

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De manière générale, dans les vecteurs rétroviraux de la présente invention, le gène marqueur, et/ou le gène de sélection, et/ou le dit troisième gène et/ou la séquence génique d'intérêt sont liés de manière opérationnelle à des éléments contrôlant leur expression. Par éléments contrôlant l'expression, on entend désigner toutes les séquences d'ADN impliquées dans la régulation de l'expression génique, c'est-à- dire la séquence promotrice minimale, les séquences amonts, les séquences activatrices ( enhancers ), éventuellement les séquences inhibitrices ( silencers ), les séquences insulator , les séquences d'épissage. Les éléments contrôlant l'expression permettent soit une expression constitutive, ubiquitaire, inductible, spécifique d'un type cellulaire ( tissu-spécifique ) ou spécifique d'une étape du développement.

L'article de Metzger et Feil (1999) donne à titre d'exemple non limitatif (cf. tableau page 471) une liste de promoteurs cellulaires tissus-spécifiques susceptibles d'être utilisés pour diriger l'expression de séquences géniques dans différents tissus. Les éléments d'expression tissus-spécifiques sont de préférence choisis parmi les promoteurs qui permettent d'obtenir une expression spécifique, et de préférence forte, dans une ou plusieurs cellule (s), tissu (s), type (s) cellulaire (s) ou organe (s) de l'organisme selon l'invention.

Les éléments d'expression ubiquitaire ou promoteurs ubiquitaires sont choisis parmi les promoteurs qui permettent d'obtenir une expression, de préférence forte, dans l'ensemble, ou pour le moins dans une

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grande proportion d'organes, ou de tissus de l'organisme selon l'invention. A titre d'exemple non limitatif de promoteurs ubiquitaires, on peut citer le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (Schmidt et al., 1990) et le promoteur inductible par l'interféron (Mxl) (Hug et al., 1998), le promoteur précoce et immédiat du cytomégalovirus humain (HCMV-IE) (Boshart et al., 1987), le promoteur de la bêta-actine (Gunning et al.

1984), le promoteur de Histone H4 (Guild et al. 1988), le promoteur de la métallothionéine murine (Mc Ivor et al., 1987), le promoteur de l'hormone de croissance de rat (Miller et al., 1985), le promoteur de l'adénosine déaminase humaine (Hantzapoulos et al., 1989), le promoteur de la thymidine kinase de HSV (Tabin et al., 1982), l'activateur ( enhance ) du gène de l'antitrypsine alpha-1 (Peng et al., 1988), le promoteur/enhancer des immunoglobulines (Blankenstein et al. 1988), les promoteurs précoces ou tardifs du SV40, le promoteur tardif majeur de l'adénovirus 2 ou d'autres promoteurs viraux dérivés du virus du polyome, du virus du papillome bovin ou d'autres rétrovirus ou d'autres adénovirus. En outre, parmi les éléments d'expression, ou promoteurs selon l'invention, certains peuvent assurer un contrôle constitutif ou inductible de l'expression du gène d'intérêt. Parmi les éléments assurant une expression inductible, il convient de citer les promoteurs eucaryotiques inductibles par les métaux lourds (Mayo et al., 1982 ; Brinster et al., 1982 ; Seark et al., 1985), par un choc thermique (Nover et al., 1991), par les hormones (Lee et al. l' 1981 ; Hynes et al., 1981 ; Klock et al., 1987 ; Israel

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et al., 1989), par l'interféron (Hug et al., 1998 ; Arnheiter et al., 1990). Il convient également de citer les éléments d'expression procaryotiques inductibles tels que le système répresseur Lac (LacR/opérateur/inducteur) d'E. coli (Hu et al., 1987 ; Brown et al., 1987 ; Labow et al., 1990), le système de résistance à la tétracycline d'E. coli (Gossen et al., 1992) (WO 94 04 672, EP 804 565).

Ces promoteurs peuvent être ou non hétérologues à l'organisme, être naturellement présents ou non dans le génome de l'organisme. Ainsi, ils peuvent être d'origine virale.

Facultativement, le qène marqueur et/ou le gène de sélection et/ou ledit troisième gène et/ou la séquence génique d'intérêt peuvent être dépourvus de promoteurs ou d'éléments d'expression et être placés sous le contrôle d'un promoteur ou d'éléments d'expression endogènes du rétrovirus, tels par exemple les éléments d'expression présents dans les LTR. Il est évident qu'en fonction du résultat recherché, l'homme du métier choisira et adaptera les éléments de régulation de l'expression des gènes. Ainsi, lorsque le vecteur rétroviral selon l'invention contient plusieurs gènes à exprimer, il peut être intéressant d'utiliser des signaux d'épissage, ou d'utiliser des séquences IRES (Internal Ribosome Entry site) ; les séquences IRES permettent de réaliser la traduction de plusieurs protéines à partir d'un seul ARN polycistronique. Enfin, il peut être également intéressant d'avoir au moins un gène du rétrovirus sous le contrôle d'un promoteur endogène, et au moins un autre gène sous le contrôle d'un promoteur hétérologue.

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A ce jour, de nombreuses constructions provirales ont été utilisées avec succès pour exprimer des gènes d'intérêt (pour revue, voir Coffin J. M., Hughes S. H. and Varmus H. E., Retrovirus , EDS. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997), chapitre 9 Development and applications of retroviral vectors , pages 437-474.

Les technologies de l'ADN recombinant utilisées pour la construction du vecteur rétroviral selon l'invention sont celles connues et communément utilisées par l'homme du métier. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement de l'ADN, l'amplification, et la purification ; les réactions enzymatiques impliquant l'ADN ligase, l'ADN polymérase, les endonucléases de restriction sont effectuées selon les recommandations du fabricant. Ces techniques et les autres sont généralement réalisées selon Sambrook et al. (1989).

Le gène d'intérêt selon l'invention code pour un produit génique qui a une fonction particulière, par exemple qui agit comme un marqueur pour produire un produit détectable ou, de manière préférée, il s'agit d'un gène thérapeutique dont le produit est actif contre une infection ou une maladie. Ainsi les gènes thérapeutiques peuvent coder par exemple pour un ARN antisens, un ribozyme ou un peptide ou une protéine telle un mutant négatif trans-dominant d'une protéine cible, une toxine, une toxine conditionnelle, un antigène qui induit un anticorps ou qui induit les cellules T-Helper ou cytotoxiques, un anticorps simple chaîne ou une protéine suppresseur de tumeur. Le gène d'intérêt peut également coder pour des protéines

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tueuses telles que précédemment définies. Dans le vecteur rétroviral selon l'invention, un ou plusieurs gènes d'intérêt peuvent être présents.

Plus généralement, la présente invention porte également sur un vecteur viral, notamment rétroviral, caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène de sélection à l'extérieur du génome encapsidable. Un tel vecteur rétroviral augmente le pourcentage de clones cellulaires producteurs de virus recombinants obtenus après transfection des cellules d'encapsidation comparé au taux obtenu avec un vecteur viral dont le gène de sélection se trouve situé dans le génome viral encapsidable, et ceci, quelque soit le taux de dérive de la lignée d'encapsidation. Lorsqu'il s'agit d'un vecteur rétroviral selon l'invention, le gène de sélection est situé à l'extérieur des séquences LTR5' et LTR3'. Le vecteur viral peut en outre contenir dans son génome encapsidable un ou plusieurs gènes choisis dans le groupe des gènes d'intérêt, des gènes marqueurs, des gènes de sélection, des dits troisième gène selon l'invention. Ces gènes sont sous le contrôle d'éléments d'expression tels que précédemment définis.

Un tel vecteur rétroviral peut être utilisé pour produire des particules rétrovirales non-réplicatives pour une utilisation en recherche fondamentale mais également pour la préparation d'un médicament destiné à des thérapies préventives et curatives. Un tel vecteur peut être préparé selon les techniques classiques de l'ADN recombinant à la disposition de l'homme du métier. Il est évident que ce type de vecteur peut être utilisé pour la préparation de différents virus

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encapsidés tels par exemple les adénovirus et les adénovirus-associés.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront mieux mis en évidence à la lecture des exemples suivants.

Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : Représentation schématique du vecteur SAITK (SVN-ADH-IRES-TK : : Sh Ble) : LTR : Long Termjnal repeat ; ADH : séquence nucléotidique codant pour l'alcool déshydrogénase de drosophile ; IRES 1518 : site interne de liaison aux ribosomes TK : : Sh Ble : gène de fusion entre la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex et du gène de résistance à la phléomycine.

Figure 2 : Représentation schématique du vecteur SASS BLE (SNV-ADH/SV40-Sh Ble) :
Les sites de restriction SspI en position 3 et Nde I en position 2728 sont indiqués ; LTR : Long terminal repeat ; ADH : séquence nucléotidique codant pour l'alcool déshydrogénase de drosophile ; Prom SV40 : promoteur du SV40 ; Sh Ble : gène de résistance à la phléomycine ; Poly A-SV40 : séquence de polyadénylation du SV40.

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EXEMPLES EXEMPLE 1 : MATERIE ET METHODES 1.1. Culture de cellules et transfection
Les lignées cellulaires QT6 et DSH-134G sont cultivées dans des conditions standard. Brièvement, les cellules de la lignée cellulaire QT6 dérivée de la caille japonaise (Moscovici et al., 1977) sont cultivées dans un milieu Ham's F10 (GIBCO-BRL-Life Technologies) complémenté avec 10% de tryptose phosphate broth (GIBCO-BRL-Life Technologies), 5% de sérum de veau nouveau-né (EUROBIO), 1% de sérum de poulet (GIBCO-BRL-Life Technologies) et 1% de pénicilline-streptomycine (10 000 unités par ml, GIBCOBRL-Life Technologies). La lignée cellulaire d'encapsidation DSH-134G dérivée d'ostéosarcome canin (Martinez et Dornburg, 1995) est cultivée dans un milieu DMEM contenant 1 g/l de D-glucose, 3,6% de NaHCO3 supplémentés avec 6% de sérum de veau foetal (EUROBIO), 1% de glutamine (GIBCO-BRL-Life Technologies) et 1% de pénicilline-streptomycine (10 000 unités/ml, GIBCO-BRL-Life Technologies).

Pour les transfections, les cellules sont ensemencées le jour précédent dans une plaque à six puits à raison de 105 cellules par puits (COSTAR). Les

plasmides (habituellement 5 gag) sont introduits dans les cellules en utilisant le réactif Transfectam@ (PROMEGA) selon les recommandations du fabricant, excepté que 250 Il de mélange de transfection sont utilisés par puits au lieu de 500 u. l.

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Les plasmides sont introduits dans les cellules QT6 ou D17 dans lesquelles les constructions sont exprimées sous le contrôle du promoteur du CMV (cytomégalovirus).

Les populations cellulaires polyclonales ou clonales sont sélectionnées en présence de 5 ug/ml de phléomycine (CAYLA).

Pour générer les lignées cellulaires produisant les vecteurs rétroviraux SNV-ADH-IRES-TK : : Sh blé, les constructions SNV sont transfectées dans les cellules DSH 134G et sélectionnées avec 50 ig/ml de phléomycine.

Lorsque les colonies atteignent environ cent cellules, les clones cellulaires contenus dans les boîtes de culture sont grattés et aspirés sous microscope avec une pipette type P200 de GILSON@ ; les cellules sont transférées dans des boites de culture à 48 puits (COSTAR) et ensuite criblées pour la présence de particules rétrovirales.

Afin de déterminer le titre viral, les cellules QT6 sont ensemencées dans des plaques à six puits, 24 heures avant l'infection (2 x 105 cellules/puits) et infectées avec des dilutions en série (décimales) de milieux cellulaires ne comportant pas de virus. Deux jours plus tard, les cellules infectées sont lavées deux fois avec du PBS supplémenté avec Ca2+ et Mg2+, puis fixées pendant cinq minutes avec du formaldéhyde à 2% (MERCK-CLEVENOT) /glutaraldéhyde à 0,1% (SERVA), puis lavées avec du PBS supplémenté en Ca2+ et Mg2+ et utilisées dans un test ADH.

1.2. Récolte des virus et infections
Les protocoles de récolte et d'infection sont basés sur ceux décrits par Gautier et al. (2000). Les

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virus sont récoltés à partir de cellules d'encapsidation presque confluentes en monocouche 20 à 24 heures après avoir changé le milieu. Le milieu récolté est centrifugé à 5 000 tours/min pendant dix minutes et le virus est ensuite titré sur des cellules QT6. Brièvement, le jour avant la titration, 5 x 105 cellules QT6 sont ensemencées sur des plaques à six puits. Les cellules sont infectées avec des dilutions décimales du surnageant viral puis retournées dans l'incubateur pour une durée additionnelle de 48 heures.

Les cellules sont alors fixées et colorées pour le test à l'ADH.

1.3. Test ADH
Deux jours après, les cellules infectées sont lavées deux fois avec du PBS supplémenté avec des ions Ca2+ et Mg2+, fixé pendant cinq minutes avec du formaldéhyde 2% (MERCK-CLEVENOT) /glutaraldéhyde 0,1% (SERVA), puis lavées dans du PBS supplémenté en Ca et

Mg2+.

M g
Après fixation et rinçage, les cellules sont recouvertes avec un volume minimal de la solution de coloration qui consiste pour 1 ml en 900 1. de Tris 0, 15M pH8, 5, 70 Al d'une solution de Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) à 10 mg/ml dans de l'eau (ICN), 22 J. l de 2-butanol (PROLABO), 11 l de phénazine méthosulfate à 0,5 mg/ml d'eau distillée (SIGMA) et 10 J. l de TétraNitroBlue Tétrazolium (TNBT) (JANSEN CHEMICA), 10 mg dans 700 ! de diméthyl-formamide + 300 ! d'eau) ; les cellules sont ensuite incubées dans

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le noir pendant six à douze heures à température ambiante. 1. 4. Vecteurs d'expression et constructions rétro virales
1.4. 1. Vecteur SNV-TK : : Sh ble
Le vecteur est construit en utilisant un vecteur basé sur le SNV contenant le gène Sh ble : : NLSlacZ (Jaffredo et al., 2000). Le vecteur est digéré avec HindIII ; les extrémités cohésives sont rendues franches. Le vecteur linéaire est ensuite digéré par NcoI et le fragment du vecteur est purifié sur gel. Le fragment TK : : Sh blé est retiré du vecteur put 102 (CAYLA) par digestion avec SalI. Les extrémités du fragment TK : : Sh ble sont rendues franches puis ce fragment est digéré par Nco I. Le fragment de 1,55 kb est ensuite purifié sur gel puis ligué dans le vecteur SNV préparé tel que décrit précédemment.

1.4. 2. Vecteur SNV-IRES-Sh ble : : lacZ
Le vecteur est construit en utilisant un vecteur basé sur le SNV contenant le fragment Sh ble : : lacZ du gène SNV (Jaffredo et al., 2000). Le vecteur est ensuite digéré avec NcoI et XbaI. L'IRES 1518 est inséré en utilisant les enzymes de restriction XbaI et NcoI.

1.4. 3. Vecteur SNV-ADH-IRES-Sh ble : : lacZ
Le vecteur est construit en utilisant un fragment SNV-IRES-Sh ble : : lacZ ouvert par XbaI. Le gène ADH de 0,8 kb est retiré du vecteur de clonage TA (Gautier et al., 1996) par digestion avec SpeI/XbaI puis purifié

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sur gel et enfin ligué dans le vecteur SNV-IRES-Sh ble : : lacZ.

1.4. 4. Vecteur SNV-ADH-IRES-TK : : Sh ble (vecteur
SAITK)
Le vecteur SNV-ADH-IRES-TK : : Sh ble, encore appelé SAITK, est construit en utilisant le fragment SNVTk : : Sh ble, préalablement digéré par les enzymes NcoI/PmlI. Le gène ADH-IRES de 1,5 kb est retiré du vecteur SNV-ADH-IRES-Sh ble : : lacZ par une digestion NcoI/SmaI puis ensuite purifié sur gel et enfin ligué dans le vecteur SNV-TK : : Sh ble.

1.5. Elimination des cellules non interférentes de la culture
Les cellules DSH 134G ou DSH produisant SNV-Shble : : NLS lacZ sont ensemencées à faible densité en double dans des boîtes à six puits. Les cellules sont infectées deux fois sur la nuit à un jour d'intervalle en utilisant 1 ml de surnageant viral SAITK (2 x 1, 5 106 AFU) en présence de 2 gg/ml de polybrène. Deux jours après, l'expression ADN est révélée sur l'une des boîtes à six puits alors que la seconde boîte reçoit 100 whole d'acyclovir par puits. La sélection à l'acyclovir est complète après huit jours. Le milieu de culture est alors retiré et remplacé par du milieu frais sans acyclovir. Les clones cellulaires d'encapsidation résistant à l'acyclovir sont alors testés pour leur aptitude à produire des virus.

EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DE LA DERIVE 2.1. Estimation de la dérive

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Plus une lignée d'encapsidation dérive, moins elle produit de rétrovirus et plus elle devient infectable par les rétrovirus qu'elle est censée produire. Ce phénomène, qui peut être mis en évidence lors de transfections de vecteurs munis d'un gène de sélection, est responsable de l'obtention d'un nombre de clones producteurs récupérés pouvant descendre en dessous de 1% (les 99% de clones non producteurs résultant en majorité de cellules infectées par les virus provenant des quelques cellules productrices transfectées).

Il apparaît donc important, quand on veut travailler de manière clonale, de connaître la vitesse de dérive de la lignée utilisée. Pour cela, les inventeurs ont infecté la lignée d'encapsidation DSH134G par un rétrovirus produit par cette lignée et muni d'un gène rapporteur. 48 heures après l'infection, il apparaît que la dérive est proportionnelle au nombre d'infections trouvées. Une infection réalisée avec le vecteur SNV-lacZ (encore appelé CXL) (suspension de 5. 105 particules virales par ml) sur les cellules DSH- 134G, après de nombreux passages en culture, a permis aux inventeurs d'atteindre un taux de cellules infectables dépassant les 50%.

Avec les DSH 134G, le phénomène de dérive semble être constant. En effet, quand la lignée a subi une correction de sa dérive, on constate une réapparition des cellules infectables.

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<tb>
<tb>

Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> Infection <SEP> par <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> infectées <SEP> dans <SEP> DSHDSH-PL <SEP> infectées <SEP> dans <SEP> DSH-134G <SEP> immédiatement
<tb> 134G <SEP> après <SEP> traitement
<tb> 105PV/ml <SEP> 2080 <SEP> 82
<tb> 104PV/ml <SEP> 425 <SEP> 9
<tb> 103 <SEP> PV/ml <SEP> 102 <SEP> 2
<tb>
(PV : particule virale ; DSH-PL : lignée d'encapsidation DSH 134G transfectée par un vecteur SNV-phléomycine-LacZ) 2.2. Les cellules infectables ne sont pas productrices de virus
Les cellules DSH-CXL, qui correspondent à la lignée DSH-134G transfectée par un vecteur SNV-lacZ, ensemencées à faible densité, sont infectées par le vecteur SAITK puis sélectionnées par la Phléomycine.

Les clones résistants apparaissent et les cellules sont testées pour leur capacité à produire des particules virales. Aucun clone ne produit de particule virale. Ceci démontre que les cellules permissives ont perdu leur capacité de production.

2.3. Vecteur suicide
Les inventeurs ont pensé éliminer ces cellules infectables non productrices de virus en les infectant par un vecteur SNV porteur d'un gène suicide. Les inventeurs ont construit un vecteur trifonctionnel appelé SAITK (figure 1) qui se compose ainsi :

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Un gène rapporteur qui est l'Alcool DésHydrogénase de Drosophile (ADH), qui permet de connaître facilement, par réaction histochimique, le titre viral des différents clones sélectionnés mais aussi de vérifier si les cellules à éliminer l'ont été complètement par l'absence de cellules ADH

positives dans la lignée d'encapsidation corrigée ; - Un Site Interne de Liaison aux Ribosomes (IRES) qui permet une expression équilibrée des deux unités génétiques du vecteur.

- Un gène de fusion TK : : ShBle qui comporte la fonction suicide portée par le gène de la Thymidine
Kinase (TK) en présence d'Acyclovir et celle de résistance à la Phléomycine (ShBle) qui permet la sélection rapide des clones producteurs. Les cellules exprimant le vecteur peuvent donc être soit tuées soit sélectionnées positivement. Il convient de noter que ce gène suicide ne peut être utilisé sur des cellules qui ont été transfectées avec le gène dihydrofolate réductase qui confère la résistance au méthotrexate car l'Acyclovir tue les cellules qui le possèdent.

Ce vecteur SAITK a été produit par transfection dans la lignée d'encapsidation DSH-134G. Les inventeurs ont récupéré deux clones producteurs sur 93 testés.

2.4. Effet de l'Acyclovir sur la production rétrovirale
Les cellules DSH134G produisant un vecteur SNV- lacZ (encore appelées cellules DSH-CXL ou CXL) ont été ensemencées en plaques de six puits et mises en contact

avec des doses croissantes d'Acyclovir (0, 50 et 100

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pM/puits). Des tests de production de particules virales ont été réalisés au cours du temps pour les trois concentrations. Les deux premières semaines, les cellules sont restées en présence d'Acyclovir. Ce dernier a ensuite été retiré du milieu.

<tb>
<tb>

Concentration
<tb> en <SEP> Acyclovir <SEP> OpMole <SEP> 50 <SEP> whole <SEP> 1OOpMole
<tb> Titre <SEP> des <SEP> CXL
<tb> à <SEP> J0 <SEP> 100% <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> Titre <SEP> des <SEP> CXL
<tb> à <SEP> J0 <SEP> + <SEP> 14 <SEP> 100% <SEP> 71% <SEP> 11%
<tb> Arrêt
<tb> Acyclovir
<tb> Titre <SEP> des <SEP> CXL
<tb> à <SEP> J0 <SEP> + <SEP> 21 <SEP> 100% <SEP> 90% <SEP> 42%
<tb> Titre <SEP> des <SEP> CXL
<tb> à <SEP> JO <SEP> + <SEP> 28 <SEP> 100% <SEP> 100% <SEP> 85-95%
<tb> Titre <SEP> des <SEP> CXL
<tb> à <SEP> JO <SEP> + <SEP> 35 <SEP> 100% <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb>

L'effet de l'Acyclovir, bien que diminuant fortement la production de particules virales au cours du traitement, a un effet réversible.

EXEMPLE 3 : CORRECTION DE LA DERIVE 3.1. Elimination des cellules permissives par un virus portant le gène de la Thymidine Kinase.

La suspension de virus SAITK (1,5 106PV/ml) a été déposée sur les cellules DSH-CXL ou DSH-134G naïves (cellules DSH 134G n'ayant jamais été transfectées par un vecteur rétroviral) préalablement ensemencées à très faible densité dans trois puits (plaque de six puits).

48 heures après, les cellules sont traitées par

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l'Acyclovir phosphorylé (ZOVIRAX@) à une concentration de 100 polaire pendant dix jours.

- Dans les trois puits, seules les cellules interférentes sont sélectionnées par le Zovirax et constituent une lignée enrichie en cellules potentiellement productrices ; - Dans le premier puits, la culture de cellules est amplifiée.

- Sur les deux puits restants, les contrôles de présence de cellules ADH positives ou résistantes à la phléomycine ont été effectués. Ils se sont avérés négatifs.

3.2. Elimination des cellules non interférentes
Les cellules DSH 134G sont ensemencées à faible densité en duplicats dans des plaques de six puits.

Ensuite, les cellules sont infectées deux nuits de suite par 1 ml de surnageant de SAITK (2 x 1, 5. 106 PV/ml) en présence de 4 J. g de polybrène dans un volume final de 2 ml. Après deux jours, on vérifie la présence de particules virales en révélant l'ADH sur l'une des plaques et sur l'autre plaque on traite les cellules avec 100 gnole d'Acyclovir (ZOVIRAX). En sept à dix jours, la sélection est réalisée et on remet les cellules en milieu normal pour laisser pousser plus facilement les clones interférents.

Les DSH-134G survivantes sont testées pour leur capacité d'encapsidation après transfection de vecteurs SNV. Pour les cellules non-traitées, les inventeurs obtiennent au maximum 6% de clones producteurs. Après traitement, les résultats montent à 85%.

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EXEMPLE 4 : CREATION D'UN NOUVEAU VECTEUR MULTIFONCTIONNEL : SASSHBLE (SNV, ADH,
SV 40, Phléomycine)
Les résultats de transfection obtenus montrent que les vecteurs contenant un gène de sélection à l'intérieur du génome viral encapsidable induisent un nombre de clones sélectionnés très supérieur au nombre de clones réellement transfectés. Ce phénomène est particulièrement vrai lorsque la lignée d'encapsidation a dérivé. Il est possible de co-transfecter deux vecteurs, l'un contenant le génome encapsidable et l'autre, non-encapsidable portant un gène de sélection, on récupère les cellules qui ont reçu le plasmide de sélection mais parmi elles, une partie seulement a reçu le vecteur encapsidable. Le nombre de clones à tester reste donc, dans les deux cas, important. Les inventeurs ont posé l'hypothèse que la majorité des clones non-producteurs provenaient de l'infection de cellules non-interférentes par des virus produits par des cellules transfectées. Les inventeurs ont imaginé dissocier le génome viral du gène de sélection tout en conservant les deux sur le même plasmide (figure 2).

La comparaison entre le vecteur SASSHBLE et le vecteur SNV 818 (Gautier et al., 1996) est donné dans le tableau ci-dessous. Ces deux vecteurs possèdent le gène de l'Alcool Déshydrogénase et le gène de résistance à la phléomycine mais SNV 818 possède l'ADH et la phléomycine fusionnés sur la même unité génétique et sous le contrôle des LTRs de SNV.

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<tb>
<tb>

Nombre <SEP> de <SEP> clones
<tb> Vecteurs <SEP> utilisés <SEP> testés/Nombre <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> clones
<tb> clones <SEP> récupérés <SEP> producteurs
<tb> SNV <SEP> 818 <SEP> 44/48 <SEP> 4/44
<tb> (9%)
<tb> SASSHBLE <SEP> 44/48 <SEP> 18/44
<tb> (41%)
<tb>

Ces résultats ont été obtenus sur des DSH-134G non traitées par le système SAITK-Acyclovir.

Au vu de ces résultats, les inventeurs ont imaginé combiner l'utilisation de ce type de vecteurs et le traitement par SAITK-Acyclovir.

Après transfection dans les DSH-134G, les cellules sont sélectionnées par la phléomycine, puis la titration est effectuée dès que les cellules sont prêtes.

<tb>
<tb>

DSH-134G <SEP> DSHGAR
<tb> SASSHBLE <SEP> 146.000 <SEP> 809.000
<tb>
(DSH-GAR : cellules DSH 134G contrôle , résistantes à l'Acyclovir)
Les inventeurs ont confirmé ce résultat au niveau clonal ; les vecteurs utilisés sont les mêmes que précédemment.

<Desc/Clms Page number 38>

<tb>
<tb> DSH-134G <SEP> non <SEP> traitées <SEP> 27% <SEP> 6%
<tb> DSH-134G <SEP> traitées <SEP> 79% <SEP> 85%
<tb>

On constate, pour les vecteurs de type SNV 818, que le pourcentage de clones producteurs passe de 6% pour les cellules non traitées à 85% pour les cellules traitées. Le pourcentage de clones interférents est encore plus éloquent puisqu'il passe de 7% pour les cellules non traitées à 100% pour les cellules traitées.

Pour les vecteurs de type SASSHBLE, les résultats vont dans le même sens (même si le pourcentage de clones producteurs avant traitement est plus de quatre fois plus important), le pourcentage après traitement est du même ordre de grandeur et atteint 79% avec un taux d'interférence qui passe de 22 à 95%.

Ces résultats indiquent aux inventeurs que pour les DSH 134G, le ratio maximum de clones producteurs est de

l'ordre de 4/5è après transfection et que le 1/5 ne produisant pas, semble un ratio constant. Celui-ci semble être dû à la localisation de l'intégration du vecteur transfecté dans l'ADN génomique de la cellule.

Ce site d'intégration est incompatible avec la production de particules virales.

Les inventeurs ont ainsi montré que, après de nombreux passages, les cellules d'encapsidation DSH 134G ont tendance à perdre leur capacité à produire des particules virales. Un grand nombre d'entre elles deviennent alors permissives et peuvent être infectées par des virus de même type. Le traitement des DSH-134G

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par le système SAITK-Acyclovir, permet d'éliminer la majeure partie des cellules qui étaient permissives et donc non productrices. Ce traitement doit être préalable à la transfection. Il a permis aux inventeurs d'obtenir entre 79 et 85% de clones producteurs. En parallèle, l'utilisation d'un vecteur comme SASSHBLE permet d'obtenir, après transfection, le pourcentage maximum de clones producteurs disponibles quel que soit le taux de dérive de la lignée d'encapsidation.

Il convient de noter que, de manière alternative, on peut substituer au vecteur SAITK, un vecteur SNV-GFP et, après infection, soumettre les cellules à un tri au FACS, afin de permettre d'enrichir de façon plus rapide la lignée d'encapsidation en cellules interférentes et d'éviter le traitement par l'Alcyclovir.

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REFERENCES

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Claims (44)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention de cellules d'encapsidation de rétrovirus, trans-complémentantes non-permissives à l'infection par ledit rétrovirus, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : (i) culture d'une population des dites cellules d'encapsidation ; (ii) introduction par infection rétrovirale dans les dites cellules cultivées en (i) d'un vecteur rétroviral comprenant au moins un gène marqueur compris dans le génome rétroviral encapsidable ; (iii) sélection des dites cellules n'exprimant pas ledit gène marqueur .

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite sélection est effectuée en éliminant, de la dite population de cellules d'encapsidation, les cellules exprimant ledit gène marqueur .

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit gène marqueur est un gène suicide dont l'expression cellulaire provoque la mort des cellules exprimant ledit gène suicide .

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape d'administrer dans le milieu de culture une pro-drogue en quantité suffisante pour que ladite pro-drogue après avoir été métabolisée par le produit d'expression dudit gène suicide soit convertie en un composé toxique pour ladite cellule exprimant ledit gène marqueur .

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit gène suicide code pour une protéine choisie dans le groupe composé des kinases, la cytosine

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déaminase bactérienne, l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT), la guanine phosphoribosyl transférase (GpT).

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite kinase est choisie dans le groupe composé de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex, de la thymidine kinase du virus de la varicelle.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite kinase est la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex et la pro-drogue est choisie dans le groupe composée de l'acyclovir, du ganciclovir, du FIAU ou de leurs dérivés.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite kinase est la thymidine kinase du virus de la varicelle et la pro-drogue est choisie dans le groupe composée de la 6-méthoxypurine arabinoside ou l'un de ses dérivés.

9. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite protéine exprimée à partir dudit gène suicide est la cytosine déaminase bactérienne et la pro-drogue est choisie dans le groupe composée de la 5fluorocytosine et ses dérivés.

10. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite protéine exprimée à partir dudit gène suicide est l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT) et la pro-drogue est choisie parmi la 6-thioguanine et ses dérivés.

11. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite protéine exprimée à partir dudit gène suicide est la guanine-phosphoribosyl-transférase (GpT) et la pro-drogue est choisie parmi la 6-thio-xanthine et ses dérivés.

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12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit gène marqueur est un gène tueur qui code pour une protéine pro-apoptotique dont l'expression cellulaire provoque la mort des cellules exprimant ledit gène marqueur .

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite protéine pro-apoptotique est choisie de préférence parmi les protéines Bcl2, BIK, BAK, BID, BAX, les caspases, la protéine AIF, le TNF et les protéines de la famille du TNF, la protéine FASL.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite sélection est effectuée en triant dans ladite population de cellules d'encapsidation les cellules qui expriment et qui n'expriment pas ledit gène marqueur.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit gène marqueur est un gène reporter .

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit gène reporter code pour une protéine autofluorescente choisie dans le groupe composé de la protéine de fluorescence verte (GFP), de la protéine de fluorescence rouge (RFP), et des variants fluorescents de ces protéines.

17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit gène reporter code pour un enzyme détectable par un procédé histochimique sur des cellules vivantes.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite enzyme est choisie dans le groupe composé de la ss-galactosidase, de la ss-glucoronidase, de la phosphatase alcaline, de la déshydrogénase

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alcoolique, de la luciférase, de la chloramphénicolacétyl-transférase.

19. Procédé selon les revendications 14 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape de trier la population de cellules d'encapsidation au moyen d'un trieur de cellules.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit vecteur rétroviral comprend en outre un second gène de sélection.

21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit second gène de sélection dudit vecteur rétroviral est situé à l'extérieur du génome rétroviral encapsidable.

22. Procédé selon les revendications 20 et 21, caractérisé en ce que ledit second gène de sélection est choisie parmi les gènes de résistance aux antibiotiques.

23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit antibiotique est choisi dans le groupe composé de la néomycine, la tétracycline, l'ampicilline, la kanamycine, la phléomycine, la

bléomycine, l'hygromycine, le chloramphénicol, la carbénicilline, la généticine.

24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit vecteur rétroviral comprend en outre un troisième gène codant pour un enzyme situé à l'intérieur du génome rétroviral encapsidable.

25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre une étape de

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titration des particules virales par dosage de l'activité de ladite enzyme.

26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite enzyme est l'alcool-déshydrogénase.

27. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit rétrovirus est choisi dans le groupe composé du ALV, AEV, AMV, RSV, RAV, MMTV, SNV, Mo-MLV, Fe-LV, BLV, HTLV- 1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV.

28. Procédé selon la revendication 27 caractérisé en ce que ledit rétrovirus est le SNV.

29. Utilisation de vecteur rétroviral pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention de cellules d'encapsidation de rétrovirus trans-complémentantes non-permissives, caractérisée en ce que ledit vecteur comprend un gène marqueur choisi dans le groupe composé des gènes suicides, des gènes tueurs, des gènes reporter situé entre les séquences LTR5'et LTR3'.

30. Utilisation selon la revendication 29, caractérisée en ce que ledit vecteur rétroviral dérive d'un rétrovirus choisi dans le groupe composé de ALV, AEV, AMV, RSV, RAV, MMTV, SNV, Mo-MLV, Fe-LV, BLV, HTLV- 1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV.

31. Utilisation selon les revendications 29 à 30, caractérisée en ce que l'expression dudit gène marqueur est sous le contrôle d'un promoteur rétroviral localisé dans la séquence LTR.

32. Utilisation selon les revendications 29 à 31, caractérisée en ce que ledit gène suicide est choisi le groupe composé des gènes de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex, de la thymidine kinase du virus de la varicelle, de la cytosine déaminase

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bactérienne, de l'hypoxanthine-phosphoribosyltransférase (HPRT), de la guanine-phosphorybosyl- transférase (GpT).

33. Utilisation selon la revendication 29 à 31, caractérisée en ce que ledit gène tueur est choisi parmi les gènes de protéines pro-apoptotiques composées des protéines Bcl2, BIK, BAK, BID, BAX, des caspases, de la protéine AIF, du TNF et des protéines de la famille du TNF, de la protéine FASL.

34. Utilisation selon les revendications 29 à 31, caractérisée en ce que ledit gène reporter code pour une protéine autofluorescente choisie dans le groupe composé de la protéine de fluorescence verte (GFP), de la protéine de fluorescence rouge (RFP), et des variants fluorescents de ces protéines.

35. Utilisation selon les revendications 29 à 31, caractérisée en ce que ledit gène reporter code pour un enzyme détectable par un procédé histochimique sur des cellules vivantes, ladite enzyme étant choisie dans le groupe composé de la ss-galactosidase, de la ss- glucoronidase, de la phosphatase alcaline, de la déshydrogénase alcoolique, de la luciférase, de la chloramphénicol-acétyl-transférase.

36. Utilisation selon les revendications 29 à 35 caractérisée en ce que ledit vecteur comprend en outre un dit second gène de sélection.

37. Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que ledit second gène de sélection est situé à l'extérieur du génome rétroviral encapsidable.

38. Utilisation selon les revendications 36 à 37, caractérisée en ce que ledit second gène de sélection

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est choisie parmi les gènes de résistance aux antibiotiques, ledit antibiotique étant choisi dans le groupe composé de la néomycine, la tétracycline, l'ampicilline, la kanamycine, la phléomycine, la bléomycine, l'hygromycine, le chloramphénicol, la carbénicilline, la généticine.

39. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 29 à 38, caractérisée en ce que ledit vecteur rétroviral comprend en outre un dit troisième gène codant pour un enzyme et localisé entre les séquences LTR5'et LTR3'.

40. Procédé de préparation de rétrovirus recombinant non-réplicatif, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : (i) obtention par la mise en oeuvre d'un procédé selon les revendications 1 à 28 de cellules d'encapsidation non-permissives trans-complémentantes ; (ii) transfection dans les dites cellules obtenues en (i) d'un vecteur rétroviral comprenant au moins le génome encapsidable dudit rétrovirus recombinant ; (iii) culture des cellules ainsi transfectées dans des conditions permettant l'expression des protéines d'encapsidation ; (iv) récolte desdits rétrovirus recombinants.

41. Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que le génome du dit rétrovirus recombinant contient au moins une séquence codant pour une protéine d'intérêt.

42. Procédé selon les revendications 40 et 41, caractérisé en ce que ledit vecteur rétroviral comprend au moins un gène de sélection positif.

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43. Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce que ledit gène de sélection est situé à l'extérieur du génome rétroviral encapsidable.

44. Procédé selon les revendications 42 et 43, caractérisé en ce que ledit gène de sélection est un gène de résistance à un antibiotique et que ladite culture de l'étape iii) est réalisée en présence dudit antibiotique.