FR2651005A1 - Lignees de cellules infectables par un retrovirus et contenant un marqueur activable a l'occasion de l'infection - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une lignée de cellules indicatrices comportant un récepteur CD4 pour un rétrovirus infectieux et, intégré à leur génome, un provirus recombinant défectif comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactiveur rétroviral et, sous le contrôle d'un promoteur, une région taractivable par le transactiveur codé par la région tat (stimulation interne). Le provirus recombinant contient également une séquence agissant comme marqueur, intercalée entre les susdites régions tar et tat. L'aptitude de ces cellules indicatrices à former des syncitia a été réduite de façon telle que l'activation de la région tar sous l'effet de la stimulation interne soit également réduite.

Description

LIGNES DE CELLULES INFECTABLES PAR UN RETROVIRUS ET
CONTENANT UN MARQUEUR ACTIVABLE A L'OCCASION DE
L 'INFECTION
L'invention concerne des moyens (cellules activatrices et procédés) applicables à la détection in vitro de la présence d'un rétrovirus infectieux dans un échantillon biologique, notamment dans un prélèvement provenant d'un patient ou porteur humain présumé du rétrovirus ou encore d'un animal infecté.

Une application préférée de l'invention s'adresse à la détection d'un virus du SIDA (HIV ou SIV) infectieux ou défectif.

Dans une autre variante d'application, l'invention a pour but de permettre l'étude de l'influence d'agents extérieurs, notamment de principes actifs de médicaments susceptibles d'inhiber, à tout le moins moduler, le caractère infectieux in vivo ou in vitro du rétrovirus étudié.

La mise au point d'un système de détection directe et ultrasensible plus particulièrement des virus HIV représente encore à ce jour une urgence pour la communauté scientifique et médicale.

Dans le but de permettre une détection, in vitro, de l'existence ou non d'une infection rétrovirale chez l'hâte (humain ou animal), et ce même à un stade très précoce de l'évolution de cette infection, il a déjà été proposé dans la demande de- brevet français nO 8714384 de mettre à profit le fait que l'activité génique des rétrovirus, notamment de rétrovirus humains et de mammifères supérieurs : HTL, BLV, etc.., dépendait en général d'une trans-activation (ou trans-stabilisation) par une protéine virale codée par un gène endogène faisant partie du gène rétroviral.

Par exemple dans le cas des rétrovirus HIV, l'activité génique du virus dépend d'une trans-activation (ou trans-stabilisation) par le gène HIV-tat (également connu sous la dénomination "gène Q"), l'une au moins des cibles (séquence tar) de la protéine codée par le gène tat étant constituée par une séquence contenue dans la région R, elle-même normalement dans la région LTR5 du génome rétroviral. La trans-activation (ou trans-stabilisation) du rétrovirus sous le contrôle du gène tat est une condition importante pour une réplication efficace du rétrovirus, en particulier au niveau de la transcription des gènes codant pour les protéines gaq, env et pol.

Le procédé de détection d'une - infection rétrovirale, selon la demande de brevet européen susdite repose sur la mise en contact de l'échantillon biologique éventuellement infecté par le rétrovirus à l'étude, par exemple HIV, avec des cellules transformées (ci-après dénommées "cellules indicatrices) et comportant dans leur patrimoine génétique un gène ou provirus recombinant défectif, dépourvu de l'essentiel de la séquence codant pour le susdit transactivateur rétroviral, notamment HIV-tat, mais comprenant lui-même une séquence recombinante résultant de la fusion d'une séquence activable par ce trans-activateur rétroviral, d'une part, et d'un marqueur hétérologue, d'autre part, ladite séquence recombinante étant elle-même placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression du marqueur dans ces cellules indicatrices à l'occasion d'une infection avec le rétrovirus sauvage, et ce grâce à l'apport extérieur (en "trans") du trans-activateur codé par la région correspondante (notamment tat dans le cas de HIV) du génome rétroviral de ce rétrovirus.

Une forme préférée d'un gène recombinant, dérivé de HIV, décrit dans la susdite demande de brevet européen contient, - d'une part, un ADN correspondant essentiellement à la totalité du génome d'un rétrovirus, y inclus le gène activable, (notamment la région R d'un rétrovirus
HIV) par le trans-activateur rétroviral tat placé sous le contrôle d'un promoteur, mais à l'exclusion cependant de l'essentiel de cette séquence tat et, le cas échéant, de parties alors délétées, de séquences codant pour les protéines gaq, env, pol et, - d'autre part, placé sous le contrôle du promoteur, en l'occurrence le LTR5 , normalement associé aux séquences codant pour les protéines qaq, pol et env, un marqueur codant pour une enzyme produite dans les cellules indicatrices, ultérieurement transformées par le gène ou virus recombinant défectif. Cette enzyme est de préférence du type de celles qui confèrent une coloration particulière aux cellules indicatrices ou la capacité d'agir sur un substrat pénétrant dans celles-ci et subissant in situ une modification de coloration ou plus généralement de son spectre d'absorption des radiations lumineuses. La - galactosidase, la -glucuronidase ou la luciférase sont des exemples de telles enzymes.

Des cellules indicatrices contenant de tels marqueurs sont particulièrement avantageuses, en ce qu'elles permettent grâce à la révélation de l'expression du marqueur une observation individualisée des - cellules contenant les gênes ou provirus défectifs recombinants sus-définis, dès qu'elles sont infectées par le rétrovirus étudié.

Il est avantageux d'avoir recours à un marqueur iocalisé dans un compartiment cellulaire aisément identifiable des cellules indicatrices, d'oû l'utilisation préférée déjà suggérée anterieurement d'une séquence génique dénommée "nlsLac Z" décrite par
Kalderon, D. et al (1984), Cell 39, 499-509, et contenant une région signal de localisation de l'antigène T (nls) du virus de singe SV40 fusionnée au gène Lac Z, l'ensemble étant alors placé, par exemple, sous le contrôle du LTR: du HIV.La protéine de fusion correspondante nls-ss-Gal est enzymatiquement active et reste associée avec le noyau des cellules auxquelles une telle séquence génique est incorporée, plus particulièrement avec les membranes des noyaux cellulaires desdites cellules, plutôt que de s'accumuler dans le nucléoplasme. Cette séquence autorise par conséquent une sensibilité de marquage accrue.

Une lignée indicatrice, transformée par un virus recombinant défectif de ce type (pHIV-1 nlsLac Z (ciaprès également désignée sous l'expression "recombinant A") a été décrite dans la susdite demande de brevet européen. Quand cette lignée indicatrice est infectée par le virus sauvage, l'expression du gène
LacZ peut être détectée histochimiquement au niveau de la cellule. A chaque cellule de la lignée indicatrice
LacZ infectée correspond alors une cellule Bgal+ décelable par marquage histochimique in situ.

L'activateur du gène nlsLacZ peut aussi être induit dans des cellules indicatrices de ce type- par un apport en trans de la séquence tat sous une autre forme, par exemple par transformation de ces cellules indicatrices avec un plasmide, contenant cette séquence. Les mêmes effets ont été observés à l'occasion d'une co-transformation de cellules 'une lignée transformable avec, d'une part, un rétrovirus recombinant défectif du type pHIV-1 nlsLacZ (ci-après aussi dénommé recombinant A) et, d'autre part, un plasmide contenant une séquence tat (pLET ou pSET décrits par M. Emerman et al, The E.M.B.O. Journal, 6, 1987, p. 3755-3760), comme le constatèrent C. Bonnerot et al dans le C.R. Acad. Sci Paris, t. 307, Série III, p. 311-316, 1988.

Ces derniers auteurs rapportent d'ailleurs des obervations semblables dans des essais de cotransformation des cellules du même type de lignée cellulaire avec deux autres rétrovirus recombinants dénommés respectivement (B > HIV-1 nlsLacZ tat et (C) HIV-1 SVnlsLacZ tat.

Le recombinant B se distingue du recombinant A par la présence en aval de la séquence LacZ d'une partie non délétée du rétrovirus initial En particulier il comprend la séquence nucléotidique s'étendant entre le nucléotide 5289 et le nucléotide 9194, selon R. Weiss et al dans R.N.A. Tumor Virues,
Cold Spring Harbor Laboratory,- Cold Spring Harbor,
N.Y., 1985. Cette séquence du génome HIV-1 contient les gènes codant pour tat, rev, nef, env et les séquences cibles pour la protéine REV.

Le recombinant C est identique au recombinant B, si ce n'est qu'il comporte en aval de la séquence nlsLacZ un promoteur supplémentaire (ci-après dénommé promoteur interne) jouxtant la séquence LacZ. En d'autres termes, celle-ci se trouve également sous le contrôle de ce promoteur interne. Dans le cas de la construction représentée, le promoteur interne correspond au promoteur de la région précoce de SV40.

Des structures représentatives schématiques des structures de ces deux derniers rétrovirus, ainsi que du premier cité ci-dessus apparaissent dans la fig. 1 des dessins.

Les séquences nlsLacZ sont représentées dans la fig. 1 par des barres en.grisé. Elles sont flanquées en 5' et- 3' de séquences dérivées d'une copie provirale du virus HIV-1. Les rétrovirus recombinants contiennent des LTR viraux intacts (barreaux d'extrémités évidés de la fig. 1 > Les séquences des trois recombinants, entre U5 et le site SphI contiennent le début du gène gag. Dans le recombinant
A, les séquences entre le site BamHI, en aval de LacZ, et U3 ne contiennent que l'information pour le gène nef. Dans les recombinants (B) et (C), , les séquences entre le site EcoRI (en aval de LacZ) et U3 contiennent les parties codantes des gènes tat, rev, nef et env, ainsi que les séquences cibles impliquées dans la régulation par REV.Le promoteur de la région précoce de SV4O est indiqué (dans (C)) par une courte barre noire. Les sites SphI et EcoRI ont été détruits au cours de la construction. Il est encore fait référence à l'article de Bonnerot et al pour ce qui est des détails de leur construction.

Des observations faites par lés auteurs à l'occasion de la transfection des systèmes cellulaires utilisés, avec d'une part les trois rétrovirus recombinants et, d'autre part, les plasmides pSET et pLET, il découle que l'apport en trans du transactivateur codé par la région tat de pSET et pLET conduit à une stimulation de la B-galactosidase, non seulement dans les cellules indicatrices transformées par le rétrovirus recombinant A, confirmant en cela les résultats du brevet antérieur, mais également dans les cellules indicatrices transformées par le rétrovirus recombinant B, dans lesquelles une certaine expression était déjà observée en l'absence de l'apport en trans, expression qui s 'interprète naturellement comme le résultat de la stimulation induite par la séquence tat interne à ce rétrovirus recombinant (stimulation interne).En revanche la stimulation externe par cet apport en trans ne semble pas ajouter à l'expression nettement plus élevée observée, sous l'effet de la stimulation interne, dans les cellules transformées par le recombinant C comportant le promoteur interne supplémentaire, immédiatement en amont de nlskacZ
L'invention repose sur les découvertes - que, même dans le cas de cellules indicatrices comportant dans leur patrimoine génétique une séquence nucléique du type de celle du recombinant (C), et comprenant par conséquent à la fois une séquence tat et un marqueur de controle lui-même également placé sous le contrôle d'un promoteur interne distinct, s'ajoutant au LTR5', on pouvait en fait disposer d'une "réserve d'expression" du marqueur, lorsque les cellules indicatrices -le contenant étaient infectées par un rétrovirus natif ou un rétrovirus homologue et - que l'expression spontanée du marqueur sous l'effet de la stimulation interne, le cas échéant soutenue par le promoteur interne supplémentaire, peut être contrôlée de façon telle que l'on puisse ensuite faire le départ net entre l'expression spontanée du marqueur et l'expression provoquée en présence d'un rétrovirus infectieux1 dans les conditions d'un essai de diagnostic in vitra de l'existence ou non d'une infection par le rétrovirus correspondant ou par un rétrovirus homologue dans un échantillon biologique à l'étude, et ce à un stade précoce de l'infection
Conformément à l'invention, ce contrôle peut être réalisé par l'incorporation de vecteurs recombinants de ce type à des cellules infectables par le rétrovirus natif correspondant et par la sélection ultérieure en tant que cellules indicatrices de celles dans lesquelles le marquage observé est plus réduit que dans d'autres, dès lors que les cellules indicatrices choisies témoignent d'une "réserve. de marquage" se manifestant par un marquage amplifié de ces cellules indicatrices, lorsque celles-ci sont infectées par le rétrovirus natif ou homologue.

L'invention concerne donc plus particulièrement une lignée de cellules indicatrices comportant un récepteur pour un rétrovirus et dans leur patrimoine génétique, de préférence sous forme intégrée à leur génome, une séquence génétique recombinante dérivée du même rétrovirus ou d'un rétrovirus homologue, comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactivateur rétroviral et une région tar sous le contrôle d'un premier promoteur et activable par le transactivateur codé par la région tat susdite (stimulation interne) ou par un transactivateur apporté en trans (stimulation externe) par le rétrovirus natif ou un rétrovirus extérieur venant infecter ces cellules indicatrices, celles-ci étant caractérisées en ce que cette séquence génétique recombinante contient également une séquence contenant un marqueur, le cas échéant sous le contrôle d'un second promoteur ou promoteur interne distinct du premier, intercalé entre les susdites régions tar et tat dans des conditions entraînant l'activation- du marqueur consécutivement à l'activation de la région tar, et en ce que ces cellules indicatrices sont ou ont été rendues telles que l'actination de la région tar sous l'effet de la stimulation interne soit en deça des activations résultant du cumul de la stimulation interne et d'une stimulation externe En d'autres termes, la détection d'une infection rétrovirale s'apprécie par les niveaux différentiels d'intensité de l'expression du marqueur dans les cellules indicatrices conformes à l'invention, selon qu'elles font l'objet d'un apport en trans de transactivateur tat ou non.Dans ce qui suit, il sera alors quelquefois fait référence au "marquage différentiel" que permettent les cellules indicatrices.

Lorsqu'il a été fait référence dans ce qui précède à une "séquence" génétique dérivée d'un rétrovirus homologue", il faut entendre la possibilité que celui-ci peut ne pas être identique au "rétrovirus infectieux" spécifique du récepteur CD4 desdites cellules indicatrices. I1 doit cependant être fonctionnellement équivalent. En particulier la région tar doit néanmoins être activable en trans par la région tat du rétrovirus infectieux. Par exemple le rétrovirus dont est issue la séquence génétique recombinante est dérivée d'un SIV, alors que le rétrovirus infectieux considéré est un HIV2, voire même un HIV-1. Les mêmes observations s'étendent aux rétions tat et tar contenues dans une même séquence recombinante.Elles peuvent être issues de deux rétrovirus distincts, mais fonctionnellement homologues.

L'homme de métier appréciera que selon la nature des cellules mises en oeuvre, il peut influer sur les paramètres lui permettant d'opérer parmi les lignées cellulaires initialement mises en oeuvre, à l'occasion de leur transformation par un vecteur approprié contenant lui-même une séquence génétique recombinante qui doit être incorporée à leur patrimoine génétique, pour sélectionner parmi les cellules transformées celles qui permettent le "marquage différentiel" dans les conditions qui ont été indiquées plus haut.

De préférence, les cellules indicatrices selon l'invention résultent de la transformation par la séquence génétique recombinante de cellules qui sont normalement aptes à fusionner entre elles pour former des syncitia, lorsqu'elles sont transformées par une séquence env intacte de 111V et lorsque celle-ci est exprimée, lesdites cellules indicatrices étant alors caractérisées, d'une part, par une aptitude réduite à la fusion spontanée et, d'autre part, par une forte aptitude à la fusion lorsqu'elles sont infectées par un rétrovirus natif infectieux ou même, lorsqu'elles sont transfectées par un vecteur ou ADN recombinant modifié par une séquence env intacte.

Un protocole de sélection susceptible d'être mis en oeuvre pour obtenir des lignées de cellules indicatrices de ce type est résumé ci-après. Il est exposé plus loin, de façon plus détaillée, à propos de la sélection de cellules indicatrices au sein d'une culture transformée de cellules du type HT4LacZ.

(1) Transfection du plasmide selon Maniatis et al, 1982.

(2) Passage des cellules des qu'elles -atteignent la confluence (1-10 x 105/cm2) ;. dissociation au 1/3 pendant 2 semaines
(3) Sélection des cellules LacZ à l'aide d'un trieur de cellules, tel que le "cell sorter" (olan et al, 1988) (ou toute autre méthodologiel
(4) Isolement de clones et, après leurs divisions respectives, vérification pour des cellules de chacun d'entre eux, (a) la non-fusion en maintenant 3 jours les cellules à confluence et simultanément leur coloration nucléaire (examen visuel) ; (b) la transactivation et la fusion des cellules colorées à la suite de transfection ou d'infection, notamment par co-culture avec des cellules infectées par le rétrovirus ;;
(5) la retenue en tant que cellules indicatrices possibles, conformes à l'invention, de ceux des clones cellulaires qui, lorsqu'ils ont été testés dans les conditions sous 4(b), ont conduit à des cellules à la fois colorées et non fusionnées. Au contraire les cellules qui ne donnent pas lieu à des fusions et/ou qui ne sont pas davantage transactivées dans les conditions sous 4(b) doivent être rejetées.

Comme dans le cas des rétrovirus recombinants de la demande de brevet européen nO 87.14384, la-séquence nucléique recombinante conforme à la présente invention contient l'ensemble des éléments agissant en "cis" pour autoriser l'activation de la transcription des séquences tar sous l'effet d'un transactivateur codé par une séquence tat, ainsi que, le cas échéant, les parties agissant en "cis" du virus sauvage et assurant normalement l'empaquetage du rétrovirus, sa réverse-transcription en une molécule ADN et son intégration dans le génome de la cellule hôte, ainsi que le site de polyadénylation de cet ARN.

Le premier promoteur sous le contrôle duquel est placée la séquence tar activable par le transactivateur tat est un promoteur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire infectable. La séquence tar peut être placée sous le contrôle direct de la région U3 du LTR: ' du rétrovirus. En variante- encore, l'une ou l'autre des régions LTR, ou les deux à la fois, sont dépourvues de promoteur(s), la séquence tar et, par conséquent le marqueur étant alors sous le contrôle d'un promoteur distinct remplaçant la région U3 de façon à ce que la transcription se fasse toujours à partir de la région
R trans-activatrice.

De préférence le marqueur lui-même consiste en une séquence codant pour une enzyme colorable ou agissant sur un substrat colorable, comme il a été indiqué plus haut. D'une façon générale, les caractéristiques déjà présentées comme préférées dans la demande de brevet européen susdite, pour ce qui est des caractéristiques décrites du rétrovirus recombinant défectif, autres que celles qui intéressent directement la région tat (délétées), sont également des caractéristiques préférées utilisables dans le contexte de la présente invention :: par exemple la fusion du gène LacZ et dé la séquence du peptide de localisation nucléaire de SV40 (nlsLacZ)
Le promoteur interne ou second promoteur
Immédiatement en amont de la séquence marqueur (lorsqu'il est présent) peut être constituée par tout promoteur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire.

La souche recombinante HT4LacZ-l a été déposée à la Collection Nationale des Cultures de l'Institut
Pasteur de - Paris (CSC!) sous le N I-899, le 27 juillet 1989.

L'invention concerne aussi le procédé mettant en oeuvre les cellules indicatrices susdites pour la détection d'une infection rétrovirale dans un échantillon contenant des cellules éventuellement infectées (tel qu'un prélèvement de sérum humain contenant des lymphocytes Tt, s'agissant d'apprécier s'il est infecté par un virus HIV) ou le milieu, tel qu'un surnageant de culture, avec lequel ces cellules avaient auparavant été en contact.

Ce procédé est caractérisé par les étapes que constituent - la mise en contact de cet échantillon avec les cellules indicatrices selon l'invention, et ce dans des conditions (notamment de température-et de durée d'incubation appropriées) permettant l'infection desdites cellules par le rétrovirus éventuellement présent dans l'échantillon, et - la détection de l'infection éventuelle desdites cellules par révélation de l'expression amplifiée du marqueur, le cas échéant à l'aide d'un révélateur approprié.

Un tel procédé permet la détection très sensible, dans des délais très rapides, de la présence d'une infection rétrovirale dans l'échantillon cellulaire initial qui était à ester, et même le dosage du degré de l'infection rétrovirale dans l'échantillon testé, au moment où le test a été réalisé.

L'amplification de la transactivation peut être dans un rapport de 50 à 100 fois par rapport à celle alors assimilable à un bruit de fond, qui peut être observée dans les mêmes cellules indicatrices en présence d'un échantillon non infecté.

On appréciera que ce test permet aussi d'étudier l'évolution de l'infection chez-un patient atteint de la maladie induite par le rétrovirus sauvage, s'il est répété dans le temps, sur des prélèvements de sérums, de tout autre fluide ou tissu biologique infecté provenant de ce patient.

Ce procédé peut ausssi être mis en oeuvre pour l'étude de l'efficacité éventuelle d'un principe actif de médicament vis-à-vis de l'interaction entre le rétrovirus considéré et des cellules sensibles, notamment lorsque la susdite mise en contact susindiquée est opérée en présence de ce principe actif.

On apprécie que le test ainsi modifié permet à la fois de sélectionner le principe actif de médicament qui pourrait se révéler le plus actif, de déterminer les doses qui pourraient être efficaces pour traiter le patient ayant fourni le prélèvement, ces doses efficaces découlant notamment de celles qui, dans la mise en oeuvre du test sus-indiqué n'entraine pas une amplification du marqueur des cellules indicatrices, lorsqu'elles' sont amenées au contact de prélèvements provenant du malade à traiter ou du surnageant du milieu dans lequel cet échantillon cellulaire avait été maintenu.

Plus généralement, l'invention permet l'étude in vitro de l'influence des facteurs susceptibles d'interférer avec l'infection virale, le procédé susdéfini comprenant alors la mise en contact des cellules indicatrices selon l'invention, en présence de ce facteur, avec des quantités déterminées de rétrovirus extérieur et la détection des doses de facteurs, notamment de principe actif de médicament, qui préviennent l'infection rétrovirale, détectable par l'activation du marqueur, desdites cellules.

L'invention concerne donc également des nécessaires ou kits permettant la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être décrit, ces kits comportant - des cellules indicatrices telles que sus-définies, - des moyens de révélation de l'expression - du marqueur, notamment lorsque le marqueur est une enzyme, un substrat spécifique de l'enzyme, - éventuellement les tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la mise en contact, avec l'échantillon biologique, des cellules indicatrices et l'incubation du mélange de réaction dans des conditions permettant l'infection éventuelle de ces cellules indicatrices au contact de l'échantillon étudié, - le cas échéant des milieux de conservation ou de culture desdites cellules saines et modifiées
Avantageusement les cellules indicatrices utilisées dans ces kits sont constituées par des lignées cellulaires "immortalisées" infectables par le rétrovirus recombinant correspondant Par exemple, dans le cas d'un kit destiné à la détection d'un virus
HIV, lesdites cellules sensibles modifiees et les cellules saines appartiendraient toutes deux à des lignées cellulaires du type Hui4, CEM, HUT, etc.

Dans l'exemple indiqué plus loin, les possibilités de l'invention sont illustrées en rapport avec la production de cellules indicatrices dérivées d'une lignée de cellules HT4.

I1 est donc tout à fait clair que l'invention s'adresse à la détection de tout type de rétrovirus éventuellement infectieux vis-à-vis de cultures cellulaires déterminées et présentant les caractéristiques essentielles de structure dont il a été question plus haut. En particulier, elle s'applique à la fabrication de cellules indicatrices permettant, dans les conditions qui ont été indiquées, la détection du pouvoir infectieux (ou la modulation du pouvoir infectieux) des rétrovirus connus sous les dénominateurs HTLV I, HTLV II, HIV I (ou encore LAV ou HT-LV IIIX, HIV II (ou LAV II), , HTLV IV. Il en est encore de même pour de nombreux rétrovirus infectieux à l'égard de l'animal.A titre d'exemple, on mentionnera les rétrovirus leucémiques des bovins (Bovine Leukemia Ruses) et des félins (FeLV > .

Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'un exemple de réalisation, appliquée à la production de lignées indicatrices contenant une séquence génétique des rétrovirus recombinants défectifs conformes à l'invention, dérivé de 11IV-l.

Il sera dans ce qui suit fait référence aux figures dans lesquelles - la figure 1 fournit de façon schématique les éléments essentiels de structures des trois rétrovirus recombinants (A) (B) et (C) dont il a été question plus haut - la figure 2 montre de façon schématique les niveaux d'activité -galactosidase ( gal sur l'axe des ordonnées) qui ont été mesurés grâce à l'activation du marqueur dans différentes situations évoquées plus loin au cours de la description - la figure 3 est. une courbe représentative du délai de réponse des cellules indicatrices de l'invention comme suite à une infection virale dans les conditions également indiquées plus loin - la figure 1 fournit des courbes de titrage de la cellule indicatrice utilisée telle qu'elles été mise en oeuvre avec des dilutions virales obtenues à partir de différents rétrovirus également identifiés dans la figure 4 - la figure 5 fournit des courbes de variation d'activation du marqueur dans des cellules indicatrices conformes à l'invention lorsque celles-ci sont infectées mais en présence de doses croissantes de la protéine CD4 ;; et enfin - la figure 6 est également représentative des variatIons observées dans les mêmes conditions que pour la figure 5 mais en présence de doses variables AZI.

Développement d'une lignée cellulaire HeLa T4 HIV nlsLacZ
Une lignée de cellules humaines adhérentes a été choisie en raison de sa capacité à former des syncitia lorsqu'elle est infectée par un virus HI. La formation des syncitia contribue à l'aisance de la détection éventuelle de cellules infectées au sein d'une suspension. 1114 est un clone cellulaire qui exprime la molécule CD4 issue d'un vecteur recombinant rétroviral 14 d'origine murine. Ces cellules sont par conséquent infectables par HIV (Chesebro, B. and Wehrlln, K. (1988) J. of Virol. 62, 3779-3788). Le vecteur utilisé pour la transformation est celui qui a déjà été mentionné plus haut : pHIVSnlsLacZtat (Bonnerot et al. 1988 > .

Les cellules HeLa T4 sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de serum foetal de veau. Le dusdit plasmide a été transfecté par coprécipitation phosphocalcique selon la méthode décrite par Rubenstein, JR, Nicolas, J.F. and Jacob,
F. (1988) C.R. Acad. Sci. Paris, 299, 271-274, si ce n'est que le précipité est directement ajouté au milieu de culture. Les transformants ont ensuite été analysés en ayant recours aux méthodes classiques d'analyse par la méthode de Southern et de détection des ARN par hvbridation sur tâche (dot blot).

En ce qui concerne la détection de l'expression de D-galactosidase et le tri des cellules, on a procédé comme suit
Pour la détection de X-gal, des cellules ont été rapidement fixées (2 à 5 minutes) dans le formaldehyde 1%, le glutaraldehyde 0,2% dans 150 m NaCl, 15 mM phosphate de solium pH 7,3 (PBS), puis placées deux fois dans du PBS et incubées à 300C pendant de 10 à 60 minutes au sein d'un milieu de réaction contenant lmg/ml du 4-chloro-5-bromo-3-indolyl-ss-galactoside (X-gal), du ferrocyanure de potassium 5mM et MgCl2, 2 mM dans le PBS. X-gal a été dissous à raison de 40 mg/ml dans le diméthylsulfoxide. La réaction enzymatique a été arrêtée par élimination du X-gal.

Les cellules colorées peuvent être conservées dans le
PBS ou l'eau. Pour effectuer le tri des cellules on a eu recours à la procédure FACS et la détection des cellules marquées par coloration de la fluoresceine di-ss-D- galactopyranoside (FDG) a été faite selon la technique de Nolan, G.P., Fiering, S., Nicolas, J.F. & BR<
Herzenberg, L.A. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 2603-2607. L'essai OMPG sur des extraits de protéines a été réalisé comme décrit par Rubenstein et al. déjà cité.

Dans deux premiers essais pris globalement et en l'absence de virus infectieux, un certain nombre de colonies témoignant d'une expression de la (3- galactosidase ont été isolés. En outre la présence de syncitia comportant individuellement plusieurs noyaux bleus a été constatée. Dans le but d'isoler un transformant stable, les cellules ont été cultivées pendant deux semaines après transfection et un clone de cellule dans lesquelles le marqueur était exprimé a été isolé par une méthode de tri fondée sur la détection de l'intensité de l'activité ss-galactosidase dans les cellules vivantes, plus particulièrement l'activité ss-galactosidase a été appréciée avec un équipement de tri permettant l'appréciation de profils de fluorescence.

HT4-LacZ-l est un des clones qui a été isolé au terme de ce tri Il ne donne pas lieu à des fusions spontanées, alors même qu'il comporte des séquences génétiques dérivées de celles codant pour la glycoprotéine env, séquence néanmoins-présente comme en témoigne la capacité de cette séquence génétique d'exprimer le récepteur viral sur les membranes cellulaires des cellules de ce clone à un niveau compatible avec la formation de syncitia sous l'effet d'une infection. Ce clone est transactivable, comme cela sera également exposé plus loin. L'analyse par la méthode de Southern par hybridation sur support (Southern blotting) de la séquence LacZ a permis de constater que ses propriétés devaient être dues à un réarrangement au sein de la région env TAT.Il a été constaté qu'apparamment la séquence LTRSVnlsLacZ était intacte. Il en résulte par conséquent que le clone sélectionné combine les propriétés biologiques d'un provirus tat-/env- et d'une région régulatrice 3' génétiquement modifiée.

- HT4-LacZ-1 a un niveau faible d'expression de - galactosidase dans une culture en cours de croissance exponentielle, cette activité étant cependant très réduite (bruid de fond) lorsque la culture vient à confluence. Ce bruit de fond reste stable lorsque le clone et les sous-clones qui en sont dérivés sont maintenus en culture en l'absence de pression sélective pour la (3-galactosîdase.

Activation de HT4LacZ par apport en trans de protéine
TAT
La détection d'une transactivation du gène intégré 111V LacZ par apport de produits viraux exogènes a été analysé par transfaction des cellules indicatrices avec des plasmides appropriés dans HT4MacZ-1. pSVtat induit un accroissement de l'expression de LacZ qui est rapidement repéré par l'examen de cellules colorées par X-gal, puis confirmé par des mesures quantitatives de l'activité enzymatique en utilisant de l'OSPG en tant que substrat.

La figure 2 illustre les résultats observés à l'occasion des mesures évoquées plus haut et ici meme.

Elle rapporte le niveau d'expression de la (3- galactosidase sous l'effet d'une transactivation par la protéine TAT dans HT4LacZ. En ordonnée apparaissent les activités (3-galactosidase mesurées par l'hydrolyse du substrat ON'PG par les extraits de protéine.

La hauteur des barres verticales est fonction directe de l'intensité de l'activité enzymatique mesurée dans les cellules indicatrices maintenues -en culture dans les conditions rappelées ci-après -:
(a) au moment de la mise en culture, mais en l'absence de tout agent inducteur de l'expression du gène LacZ,
(b) dans les mêmes conditions mais après 4 semaines de culture
(c) dans les mêmes conditions encore, mais après 11 semaines de culture
(d) en présence de pRev
(f) en présence pTat et
(g) pRev e-t pTat.

En l'absence de pRev on observe pas d'accroissement de l'expression du gène LacZ par rapport au bruit de fond (figure 2,g) et pas davantage de formation de syncitia.

En revanche, en présence du plasmide p97 qui exprime la gp120, autrement dit le gène d'enveloppe de
HIV-1 en sus des protéines TAT et REV, une forte coloration des cellules infectées en même temps que d'importantes fusions cellulaires se manifestant par la production de syncitia pouvant contenir jusqu'à 100 noyaux. Le même résultat est obtenu avec pLet, ce plasmide exprimant TAT, REV et le gène d'enveloppe de
HIV à des niveaux inférieurs à celui qui peut être détecté par immunoprécipitation. Ce résultat confirme la sensibilité de HT4LacZ à la fusion.

Titrage de HIV-1, HIV-2, SIVac et SIVag-
Des cellules HT4LacZ ont été infectées avec du virus HIV-1 (isolat BRU) préalablement cultivé sur des cellules Sup T-l et récoltées à partir de celles-ci.

La coloration par X-gal a été provoquée à divers instants après l'infection. Des syncitia avec noyaux bleus n'ont été observés que de 40 à 50 heures plus tard. Le nombre de syncitia colorés à la ss- galactosidase a atteint une valeur maximum au bout de 60-80 heures. Il tend à décroître ensuite.

La sensibilité des cellules indicatrices peut être accrue lorsque l'infection par KIV est faite en présence de DEAE dextrane. A raison de 10 ug/ml de ce dernier polygadion on observe un accroissement du nombre de syncitia colorés à la -galactosidase fois plus élevé. Toutes. les autres expériences dont il est question dans ce qui suit ont dont été effectuées en présence de DEAE dextrane et à la même densité cellulaire.Des essais semblables ont été faits avec des isolats d'autres virus, en particulier HIV-2( ROD) SIVe'' r SIVagl4 et SIX'sac . Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 4 dans laquelle apparaissent les résultats obtenus, exprimés en nombre de syncitia colorés en fonction de la dose de virus infectieux utilisés. La figure fait apparaitre une coloration des cellules indicatrices plus importante avec HIVqu'avec les autres virus.Ceci étant, cette figure fait en même temps apparaître que les cellules indicatrices HT4LacZ comportant dans leur génome une séquence recombinante issue de HIV-1 peuvent être utilisées très efficacement également, pour détecter dans un échantillon biologique la présence d'un virus infectieux homologue dans le sens qui a été indiqué ci-dessus : les différences s'expliquent par les intensités de transactivation différentes susceptibles d'être induites par les protéines dates des différents virus testés.

Les figures 5 et 6 fournissent enfin l'illustration du principe évoqué plus haut, à savoir que les cellules indicatrices de l'invention peuvent être utilisées pour tester l'eficacité de principes présumés avoir une action neutralisante vis à vis des rétrovirus. Ainsi la figure 5 montre-t-elle l'influence de la protéine CD4 et la figure 6 celle de l'AZT à différentes concentrations molaires sur la capacité de transactivation induite induite par les rétrovirus en leur présence sur les cellules indicatrices de l'invention. L'action des substances inhibitrices de l'infection se manifeste par les réductions du nombre de syncitia colorés et de l'intensité relative même de la coloration.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Lignée de cellules indicatrices comportant un récepteur CD4 pour un rétrovirus infectieux et dans leur patrimoine génétique, de préférence sous forme de provirus recombinant défectif intégré à leur génome, une séquence génétique recombinante dérivée du même rétrovirus ou d'un rétrovirus homologue, comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactivateur rétroviral et une région tar sous le contrôle d'un premier promoteur et activable par le transactivateur codé par la région tat susdite (stimulation interne) ou par un transactivateur apporté en trans (stimulation externe) par le rétrovirus natif ou un rétrovirus extérieur venant infecter ces cellules indicatrices, celles-ci étant caractérisées en ce que cette séquence génétique recombinante contient également une séquence agissant comme marqueur, intercalée entre les susdites régions tar et tat dans des conditions entraînant l'activation du marqueur consécutivement à l'activation de la région tar, et en ce que ces cellules indicatrices sont ou ont été rendues telles que l'activation de la région tar sous l'effet de la stimulation interne soit en deça des activations résultant du cumul de la stimulation interne et d'une stimulation externe.

2. Lignée selon la revendication 1, caractérisée en ce que ces cellules indicatrices sont dérivées de cellules qui sont normalement aptes à fusionner entre elles pour former des syncitia, lorsqu'elles sont transformées par une séquence env intacte de HIV et lorsque celle-ci est exprimée, lesdites cellules indicatrices étant alors caractérisées, d'une part, par une aptitude réduite à la fusion spontanée et, d'autre part, par une. forte aptitude à la fusion lorsqu'elles sont infectées par un rétrovirus natif infectieux ou même, lorsqu'elles sont transfectées par un vecteur ou ADN recombinant modifié par une séquence env intacte.

3. Lignée selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est dérivée de la lignée

HT4.

4. Lignée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le marqueur code pour une enzyme qui confère une coloration particulière aux cellules indicatrices ou la capacité d'agir sur un substrat pénétrant dans celles-ci et subissant in situ une modification de coloration ou plus généralement de son spectre d'absorption des radiations lumineuses

5. Lignée selon la revendication 4, caractérisée en ce que le marqueur est une séquence LacZ.

6. Lignée selon la revendication 5, caractérisée en ce que le marqueur est une séquence nlsLacZ.

7. Lignée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée par la présence dans la susdite séquence génétique recombinante d'un second promoteur immédiatement en amont du marqueur dans le sens de la transcription.

8. Procédé mettant en oeuvre les cellules indicatrices selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la détection d'une infection rétrovirale dans un échantillon contenant des cellules éventuellement infectées (tel qu'un prélèvement de sérum humain contenant des lymphocytes T4, s'agissant d'apprécier s'il est infecté par un virus HIV) ou le milieu, tel qu'un surnageant de culture, avec lequel ces cellules avaient auparavant été en contact, caractérisé par les étapes que constituent - la mise en contact de cet échantillon avec lesdites cellules indicatrices, et ce dans des -conditions (notamment de température et de durée d'incubation appropriées) permettant l'infection desdites cellules par le rétrovirus éentuellement présent dans l'échantillon, et - la détection de l'infection éventuelle desdites cellules par révélation de l'expression amplifiée du marqueur.

9. Kit permettant la- mise en oeuvre du procédé, ce kit comportant - des cellules indicatrices telles que sus-définies, - des moyens de révélation de l'expression du marqueur, notamment lorsque le marqueur est une enzyme, un substrat spécifique de-l'enzyme, - éventuellement les tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la mise en contact, avec l'échantillon biologique, des cellules indicatrices et l'incubation du mélange de réaction dans des conditions permettant l'infection éventuelle de ces cellules indicatrices au contact de l'échantillon étudié, - le cas échéant des milieux de conservation ou de culture desdites cellules saines et modifiées.