WO1991002797A1 - Lignees de cellules infectables par un retrovirus et contenant un marqueur activable a l'occasion de l'infection - Google Patents

Lignees de cellules infectables par un retrovirus et contenant un marqueur activable a l'occasion de l'infection Download PDF

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WO1991002797A1
WO1991002797A1 PCT/FR1990/000619 FR9000619W WO9102797A1 WO 1991002797 A1 WO1991002797 A1 WO 1991002797A1 FR 9000619 W FR9000619 W FR 9000619W WO 9102797 A1 WO9102797 A1 WO 9102797A1
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retrovirus
marker
sequence
tat
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PCT/FR1990/000619
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Jean-François Nicolas
Claire Bonnerot
Original Assignee
Institut Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to means (activating cells and methods) applicable to the in vitro detection of the presence of an infectious retrovirus in a biological sample, in particular in a sample coming from a patient or suspected human carrier of the retrovirus or else of an infected animal.
  • a preferred application of the invention is intended for the detection of an infectious or defective AIDS virus (HIV or SIV).
  • the invention aims to allow the study of the influence of external agents, in particular of active principles of drugs capable of inhibiting, at the very least modulating, the infectious nature in vivo or in vitro of the retrovirus studied.
  • retroviral infection in the host (human or animal), even at a very early stage of the evolution of this infection, it has It has already been proposed in French patent application n ⁇ 8714384 to take advantage of the fact that the gene activity of retroviruses, in particular human and higher mammalian retroviruses: HTLV, BLV, etc., generally depended on a trans- activation (or trans-stabilization) by a viral protein encoded by an endogenous gene forming part of the retroviral gene.
  • the gene activity of the virus depends trans-activation (or trans-stabilization) by the HIV-tat gene (also known by the name "Q gene"), at least one of the targets (tar sequence) of the protein coded by the tat gene being consisting of a sequence contained in the R region, itself normally in the 5 'LTR region of the retroviral genome.
  • Trans-activation (or trans-stabilization) of the retrovirus under the control of the tat gene is an important condition for efficient replication of the retrovirus, in particular at the level of transcription of the genes coding for the gag, env and pol proteins.
  • the method for detecting a retroviral infection is based on bringing the biological sample possibly infected with the retrovirus under study, for example HIV, into contact with transformed cells (hereinafter called "indicator cells” and comprising in their genetic heritage a defective recombinant gene or provirus, lacking most of the sequence coding for the above-mentioned retroviral transactivator, in particular HIV-tat, but itself comprising a recombinant sequence resulting from the fusion a sequence activatable by this retroviral trans-activator, on the one hand, and a heterologous marker, on the other hand, said recombinant sequence itself being placed under the control of a promoter allowing expression of the marker in these indicator cells during an infection with the wild retrovirus, and this thanks to the external contribution (in "trans") of the trans-activator coded p ar the corresponding region (in particular tat in the case of HIV) of the retroviral genome of this retrovirus.
  • indicator cells transformed cells
  • a preferred form of a recombinant gene, derived from HIV, described in the above-mentioned European patent application contains: on the one hand, a DNA corresponding essentially to the entire genome of a retrovirus, including the activatable gene (in particular the R region of an HIV retrovirus) by the retroviral tat trans-activator placed under the control of a promoter, but to the exclusion, however, of the essential of this tat sequence and, where appropriate, of parts then deleted, of sequences coding for the proteins gag, env, pol and,
  • the LTR 5 ' placed under the control of the promoter, in this case the LTR 5 ', normally associated with the sequences coding for the proteins gag, pol and env, a marker coding for an enzyme produced in the indicator cells, subsequently transformed by the defective recombinant gene or virus.
  • This enzyme is preferably of the type which confers a particular coloration on the indicator cells or the capacity to act on a substrate penetrating into them and undergoing in situ a modification of coloration or more generally of its spectrum of absorption of radiations. bright. Examples of such enzymes are jS-galactosidase, 3-glucuronidase or luciferase.
  • Indicator cells containing such markers are particularly advantageous, in that they allow, thanks to the revelation of the expression of the marker, individual observation of the cells containing the above-defined recombinant defective genes or proviruses, as soon as they are infected with the retrovirus studied.
  • nlsLac Z a gene sequence located in an easily identifiable cell compartment of the indicator cells, hence the preferred use already suggested previously of a gene sequence called "nlsLac Z" described by Kalderon, D. et al ( 1984), Cell 39, 499-509, and containing a signal signal localization region of the T antigen (nls) of the SV40 monkey virus fused to the Lac Z gene, the whole then being placed, for example, under the control of the HIV 5 'LTR.
  • the corresponding fusion protein nls-0-Gal is enzymatically active and remains associated with the nucleus of the cells in which such a gene sequence is incorporated, more particularly with the membranes of the cell nuclei of said cells, rather than accumulating in the nucleoplasm. This sequence therefore allows increased labeling sensitivity.
  • an indicator line transformed by a defective recombinant virus of this type (pHIV-1 nlsLac Z (hereinafter also referred to as "recombinant A") has been described in the above-mentioned European patent application.
  • pHIV-1 nlsLac Z (hereinafter also referred to as "recombinant A")
  • recombinant A a defective recombinant virus of this type
  • the expression of the LacZ gene can be detected histochemically at the level of the cell, and each cell of the infected LacZ indicator line corresponds to a 3gal + cell detectable by in situ histochemical labeling.
  • the activator of the nlsLacZ gene can also be induced in indicator cells of this type by providing the tat sequence with trans in another form, for example by transformation of these indicator cells with a plasmid containing this sequence.
  • the same effects have been observed during the co-transformation of cells' into a transformable line with, on the one hand, a defective recombinant retrovirus of the pHIV-1 nlsLacZ type (hereinafter also called recombinant A) and, on the other hand, a plasmid containing a tat sequence (pLET or pSET described by M. Emerman et al, The EMBO Journal, 6, 1987, p. 3755-3760), as observed by C. Bonnerot et al in CR Acad. Sci Paris, t. 307, Series III, p. 311-316, 1988.
  • Recombinant B is distinguished from recombinant A by the presence downstream of the LacZ sequence of an undeleted part of the initial retrovirus.
  • it comprises the nucleotide sequence extending between nucleotide 5289 and nucleotide 9194, according to R. eiss et al in R.N.A. Tumor Virues, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1985.
  • This sequence of the HIV-1 genome contains the genes coding for tat, rev, nef, env and the target sequences for the REV protein.
  • Recombinant C is identical to recombinant B, except that it includes downstream of the nlsLacZ sequence an additional promoter (hereinafter called internal promoter) adjoining the LacZ sequence. In other words, it is also under the control of this internal promoter.
  • the internal promoter corresponds to the promoter of the SV40 early region.
  • FIG. 1 of the drawings Schematic representative structures of the structures of these last two retroviruses, as well as of the first cited above appear in FIG. 1 of the drawings.
  • nlsLacZ sequences are shown in fig. 1 with gray bars. They are flanked 5 'and 3' by sequences derived from a proviral copy of the HIV-1 virus.
  • Recombinant retroviruses contain intact viral LTRs (bars of hollowed ends of FIG. 1).
  • the sequences of the three recombinants, between U5 and the SphI site contain the start of the gag gene.
  • the sequences between the BamHI site, downstream of LacZ, and U3 only contain the information for the nef gene.
  • the sequences between the EcoRI site (downstream of LacZ) and U3 contain the coding parts of the tat, rev, nef and env genes, as well as the target sequences involved in regulation by REV .
  • the promoter of the SV40 early region is indicated (in (C)) by a short black bar.
  • the SphI and EcoRI sites were destroyed during construction. Reference is also made to the article by Bonnerot et al for details of their construction.
  • the invention is based on the discoveries:
  • cells comprising a receptor for a retrovirus and transformed by a genetic sequence derived from the same retrovirus or from a homologous retrovirus and comprising both an internal tat region coding for a retroviral transactivator and a tar region activatable by the transactivator coded by tat or by a transactivator brought in trans can be the subject of a genetic rearrangement which gives these cells the character tat " .
  • Cells transformed by a “C” type construction and having been the subject of such a rearrangement exhibit a reduced expression of, 5-galactosidase comparable to a background noise compared to cells that have not undergone genetic rearrangement.
  • the transactivation of these tat cells " which takes place in the presence of an infectious retrovirus leads to expression of the marker in the case of transformation by the construction of type "B” and, in the case of construction of the type "C", to an increase in the expression of the marker.
  • the difference between the level of expression of the marker observed before contact with the infectious agent and that observed after this contact is very large, that is to say at least 10 times, and often between 50 and 100 times.
  • the spontaneous expression of the marker under the effect of internal stimulation if necessary supported by the additional internal promoter, can be controlled in such a way that one can then make a clear departure between the spontaneous expression of the marker and the expression caused in the presence of an infectious retrovirus, under the conditions of an in vitro diagnostic test of the existence or not of an infection by the corresponding retrovirus or by a retrovirus homologous in a biological sample to the study, and this at an early stage of infection.
  • this control can be carried out by incorporating recombinant vectors of this type into cells which can be infected with the corresponding native retrovirus and by subsequent selection as indicator cells for those in which the labeling observed is more reduced. that in others, as soon as the indicator cells chosen demonstrate a "labeling reserve" manifested by an amplified labeling of these indicator cells, when these are infected with the native or homologous retrovirus.
  • the invention therefore relates more particularly to a line of indicator cells comprising a receptor for a retrovirus and in their genetic heritage, preferably in form integrated into their genome, a recombinant genetic sequence derived from the same retrovirus or from a homologous retrovirus, comprising both an internal tat region encoding for a retroviral transactivator and a tar region under the control of a first promoter and activatable by the transactivator coded by the aforementioned tat region (internal stimulation) or by a transactivator provided in trans (external stimulation) by the native retrovirus or an external retrovirus coming to infect these indicator cells, these being characterized in that.
  • this recombinant genetic sequence also contains a sequence containing a marker, if necessary under the control of a second promoter or internal promoter distinct from the first, interposed between the above tar and tat regions under conditions leading to activation of the marker following the activation of the tar region, and in that these indicator cells are or have been rendered such that the activation of the tar region under the effect of internal stimulation is below activations resulting from the cumulation of internal stimulation and d '' external stimulation.
  • the detection of a retroviral infection is assessed by the differential levels of intensity of expression of the marker in the indicator cells according to the invention, depending on whether they are the subject of a trans supply of tat trans-activator or not.
  • the "internal stimulation” provided by the internal tat transactivator is zero following a genetic rearrangement in the indicator cell, this rearrangement conferring a tat character " on the cell.
  • the indicator cells of the invention can be obtained by the following steps: i) transfection of a cell comprising a receptor for a retrovirus with a recombinant genetic sequence derived from the same retrovirus or from a homologous retrovirus and comprising both a region internal tat coding for a retroviral transactivator and a tar region activatable by the transactivator coded by the aforementioned tat region, and a sequence containing a marker.
  • This marker is positioned between the tat and tar regions either so that the activation of the tar region results in the expression of the marker gene, or so that it is under the control of an internal promoter, its expression thus being freed from the need for transactivation.
  • the genetic sequence may also include the retrovirus env gene; ii) Selection, among the transformants, of cells which have acquired a tat character " following a genetic rearrangement.
  • the tat character is expressed, in the case where the expression of the marker gene is dependent on the transactivation of the tar region, by the complete absence of expression of the marker gene.
  • the tat " character results in a low level of expression compared to that observed in cells which have not undergone the rearrangement.
  • this rearrangement leads to an env character " .
  • This character env "results in a reduced ability to spontaneous fusion and a high meltability when the cells are infected with retroviruses or when infected with a vector comprising the env sequence intact.
  • Cells having this character ca. - are selected iii) Verification for each of the cells selected under (ii) that the transactivation leads to a differential level of intensity of expression of the marker gene, and if necessary, to the formation of syncitia.
  • the indicator cells according to the invention result from the transformation by the recombinant genetic sequence of cells which are normally able to merge together to form syncitia, when they are transformed by a intact HIV env sequence and when this is expressed, said indicator cells then being characterized, on the one hand, by a reduced aptitude for spontaneous fusion and, on the other hand, by a strong aptitude for fusion when they are infected with an infectious native retrovirus or even, when they are transfected with a vector or recombinant DNA modified by an intact env sequence.
  • a selection protocol capable of being used to obtain indicator cell lines of this type is summarized below. It is explained below, in more detail, about the selection of indicator cells within a transformed culture of cells of the HT4LacZ type.
  • the recombinant nucleic acid sequence in accordance with the present invention contains the set of elements acting in "cis” to authorize the activation of the transcription of the tar sequences under the effect of a transactivator coded by a tat sequence, as well as, where appropriate, the parts acting in "cis” of the wild virus and normally ensuring the packaging of the retrovirus, its reverse transcription into a DNA molecule and its integration into the genome of the host cell, as well as the polyadenylation site of this RNA.
  • the first promoter under whose control the tar sequence activatable by the tat trans ⁇ activator is placed is a promoter capable of being recognized by the polymerases of the infectable cell host.
  • the tar sequence can be placed under the direct control of the U3 region of the 5 'LTR of the retrovirus.
  • one or the other of the LTR regions, or both at the same time are devoid of promoter (s), the tar sequence and therefore the marker then being under the control of a distinct substitute promoter the U3 region so that transcription is always carried out from the trans-activating R region.
  • the marker itself consists of a sequence coding for a colorable enzyme or acting on a colorable substrate, as indicated above.
  • the characteristics already presented as preferred in the aforementioned European patent application, with regard to the described characteristics of the defective recombinant retrovirus, other than those which directly concern the tat (deleted) region are also preferred characteristics. usable in the context of the present invention: for example the fusion of the LacZ gene and the sequence of the nuclear localization peptide of SV40 (nlsLacZ).
  • the internal promoter or second promoter immediately upstream of the marker sequence can be constituted by any promoter capable of being recognized by the polymerases of the cell host.
  • the recombinant strain HT4LacZ-1 was deposited at the National Collection of Cultures of the Institut Pasteur de Paris (CNCM) under N ° 1-899, on July 27, 1989.
  • the invention also relates to the method using the aforementioned indicator cells for the detection of a retroviral infection in a sample containing possibly infected cells (such as a sample of human serum containing T4 lymphocytes, with regard to assessing if infected with an HIV virus) or the medium, such as a culture supernatant, with which these cells had previously been in contact.
  • a sample containing possibly infected cells such as a sample of human serum containing T4 lymphocytes, with regard to assessing if infected with an HIV virus
  • the medium such as a culture supernatant
  • Such a method allows very sensitive detection, within a very short time, of the presence of a retroviral infection in the initial cell sample which was to be tested, and even the determination of the degree of 1 • retroviral infection in the tested sample. , at the time the test was performed.
  • the amplification of transactivation can be in a ratio of at least 10 times, and preferably from 50 to 100 times compared to that then comparable to background noise, which can be observed in the same indicator cells in the presence of 'an uninfected sample.
  • this test also makes it possible to study the evolution of the infection in a patient suffering from the disease induced by the wild retrovirus, if it is repeated over time, on samples of sera, of any other fluid or infected biological tissue from this patient.
  • the indicator cells of the invention can be used for the detection, in the serum of patients, of strains of retroviruses, for example HIV, capable of causing the formation of syncitia.
  • strains of retroviruses for example HIV
  • the capacity of a strain of HIV to cause the formation of syncitia is shown, according to the results of the detection method of the invention, indicative of the severity of the disease, the level of CD4 + cells, and the presence of a detectable level of p24 antigen. It has also been shown that strains capable of causing syncitia formation are among the HIV isolates with a high replication rate.
  • the method of the invention is thus capable of detecting, first of all, the presence of the retrovirus and then, its capacity to cause the formation of syncitium.
  • the method of the invention can also be implemented for the study of the possible efficacy of an active principle of a medicament with regard to the interaction between the retrovirus considered and sensitive cells, in particular when the aforementioned The above-mentioned contacting is carried out in the presence of this active ingredient. It is appreciated that the test thus modified makes it possible both to select the active principle of the drug which could prove to be the most active, to determine the doses which could be effective for treating the patient who provided the sample, these effective doses arising in particular from those which, in the implementation of the above-mentioned test does not lead to an amplification of the marker of the indicator cells, when they are brought into contact with samples originating from the patient to be treated or from the supernatant of the medium in which this cell sample had been maintained.
  • the invention allows the in vitro study of the influence of factors liable to interfere with viral infection, the above-defined method then comprising bringing the indicator cells according to the invention into contact, in the presence of this factor, with determined amounts of external retrovirus and the detection of doses - of factors, in particular of the active principle of the drug, which prevent retroviral infection, detectable by activation of the marker, of said cells.
  • kits or kits allowing the implementation of the process which has just been described, these kits comprising:
  • the marker means for revealing the expression of the marker, in particular when the marker is an enzyme, a specific substrate for the enzyme,
  • the indicator cells used in these kits consist of "immortalized" cell lines which can be infected with the corresponding recombinant retrovirus.
  • said modified sensitive cells and healthy cells would both belong to cell lines of the HT4, CEM, HUT, etc. type.
  • the invention is intended for the detection of any type of retrovirus that may be infectious with respect to determined cell cultures and having the essential structural characteristics of which it has been discussed above.
  • it applies to the production of indicator cells allowing, under the conditions which have been indicated, the detection of the infectious power (or the modulation of the infectious power) of the retroviruses known under the denominators HTLV I, HTLV II, HIV I (or LAV or HTLV III), HIV II (or LAV II), HTLV IV.
  • HTLV I, HTLV II, HIV I (or LAV or HTLV III), HIV II (or LAV II), HTLV IV The same is still the case for many retroviruses infectious against animals.
  • FIG. 1 schematically provides the essential structural elements of the three recombinant retroviruses (A) (B) and (C) which have been discussed above;
  • FIG. 2 shows schematically the activity levels / 9-galactosidase ( ⁇ .gal on the ordinate axis) which have been measured by activating the marker in different situations mentioned later in the description ;
  • - Figure 3 is a curve representative of the response time of the indicator cells of the invention following a viral infection under the conditions also indicated below;
  • - Figure 4 provides titration curves of the indicator cell used as it was implemented with viral dilutions obtained from different retroviruses also identified in Figure 4;
  • FIG. 5 provides curves of variation of activation of the marker in indicator cells in accordance with the invention when these are infected but in the presence of increasing doses of the CD4 protein;
  • FIG. 7 shows the correlation between the number of syncitia induced by peripheral blood lymphocytes isolated from people infected with HIV, and the level of p24 antigen detected in the corresponding supernatant.
  • FIG. 8 shows the concentration of p24 antigen in the supernatants of PBL co-cultures with a high replication rate:
  • HT4 is a cell clone which expresses the CD4 molecule derived from a recombinant T4 retroviral vector of murine origin. These cells are therefore infectable by HIV (Chesebro, B. and ehrlly, K. (1988) J. of Virol. 62, 3779-3788).
  • the vector used for the transformation is that which has already been mentioned above: pHIVSnlsLacZtat (Bonnerot et al. 1988).
  • HeLa T4 cells are cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum.
  • the plasmid dusdit was transfected by phosphocalcic coprecipitation according to the method described by Rubenstein, JR, Nicolas, J.F. and Jacob, F. (1988) C.R. Acad. Sci. Paris, 299, 271-274, except that the precipitate is directly added to the culture medium.
  • the transformants were then analyzed using conventional methods of analysis by the Southern method and detection of RNA by hybridization on task (dot blot).
  • X-gal For the detection of X-gal, cells were rapidly fixed (2 to 5 minutes) in 1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde in 150 mM NaCl, 15 mM, solium phosphate pH 7.3 (PBS) , then placed twice in PBS and incubated at 30 ° C for 10 to 60 minutes in a reaction medium containing 1 mg / ml of 4-chloro-5-bromo-3-indolyl -? - galactoside (X -gal), potassium ferrocyanide 5 mM and MgCl 2 , 2 mM in PBS. X-gal was dissolved at 40 mg / ml in dimethyl sulfoxide.
  • the enzymatic reaction was stopped by elimination of the X-gal.
  • the stained cells can be stored in PBS or water.
  • FDG fluorescein ⁇ - ⁇ -O-galactopyranoside
  • HT4-LacZ-1 is one of the clones which was isolated after this sorting. It does not give rise to spontaneous fusions, even though it contains genetic sequences derived from those encoding the env glycoprotein, a sequence nevertheless present as evidenced by the capacity of this genetic sequence to express the viral receptor on cell membranes. cells of this clone at a level compatible with the formation of syncitia under the effect of an infection. This clone is transactivable, as will also be explained below. Analysis by the Southern method by hybridization on a support (Southern blotting) of the LacZ sequence revealed that its properties had to be due to a rearrangement within the TAT env region. It was found that apparently the LTRSVnlsLacZ sequence was intact. As a result, therefore, the selected clone combines the biological properties of a tat " / env " provirus and a genetically modified 3 * regulatory region.
  • HT4-LacZ-1 has a low level of expression of 3-galactosidase in a culture in the course of exponential growth, this activity being however very reduced (background noise) when the culture comes to confluence. This background noise remains stable when the clone and the subclones which are derived therefrom are maintained in culture in the absence of selective pressure for ⁇ -galactosidase.
  • the detection of a transactivation of the integrated HIV LacZ gene by the supply of exogenous viral products was analyzed by transfection of the indicator cells with appropriate plasmids in HT4MacZ-1.
  • pSVtat induces an increase in the expression of LacZ which is quickly identified by examining cells stained with X-gal, then confirmed by quantitative measurements of the enzymatic activity using ONPG as a substrate.
  • Figure 2 illustrates the results observed during the measures mentioned above and here. It reports the level of expression of ⁇ -galactosidase under the effect of a transactivation by the TAT protein in HT4LacZ. On the ordinate appear the 3-galactosidase activities measured by the hydrolysis of the ONPG substrate by the protein extracts.
  • the height of the vertical bars is a direct function of the intensity of the enzymatic activity measured in the indicator cells maintained in culture under the conditions recalled below:
  • HT4 acZ cells were infected with HIV-1 virus (BRU isolate) previously cultivated on Sup Tl cells and harvested therefrom. X-gal staining was caused at various times after infection. Syncitia with blue nuclei were not observed until 40 to 50 hours later. The number of ⁇ - stained syncitia galactosidase reached a maximum value after 60-80 hours. It then tends to decrease.
  • HIV-1 virus BRU isolate
  • the sensitivity of indicator cells can be increased when HIV infection is done in the presence of DEAE dextran. At the rate of 10 ⁇ g / ml of the latter polygadion, an increase in the number of syncitia stained with 0-galactosidase is observed which is higher. All the other experiments referred to in the following were therefore carried out in the presence of DEAE dextran and at the same cell density. Similar tests have been done with isolates from other viruses, in particular HIV-2 (R0D) SIV ag5 , SIV ag and SIV ⁇ . The results obtained are illustrated in FIG. 4 in which the results appear, expressed in number of colored syncitia as a function of the dose of infectious virus used.
  • the figure shows a greater coloration of the indicator cells with HIV- than with the other viruses. This being the case, this figure shows at the same time that the indicator cells HT4LacZ comprising in their genome a recombinant sequence resulting from HIV-1 can also be used very effectively, to detect in a biological sample the presence of an infectious virus homologous in the meaning which has been indicated above: the differences are explained by the different intensities of transactivation likely to be induced by the date proteins of the different viruses tested.
  • Figures 5 and 6 finally provide an illustration of the principle mentioned above, namely that the indicator cells 1 'invention can be used to test the effectiveness of alleged principles have neutralizing action against retroviruses.
  • Figure 5 shows the influence of the CD4 protein
  • Figure 6 that AZT at different molar concentrations on the transactivation capacity induced by retroviruses in their presence on the indicator cells of the invention.
  • the action of infection-inhibiting substances is manifested by reductions in the number of colored syncitia and in the relative intensity of the coloring itself.
  • PBLs freshly isolated from patients infected with HIV were co-cultured for 4 days with normal PBLs, activated with 2 ⁇ g / ml PHA and 5 ⁇ g / ml of IL-2 contained in the supernatant of activated normal PBLs. Then, the PBLs were brought into contact with HT4LacZ-1 cells (CNCM 1-899).
  • HIV infection had been confirmed in these patients by detection by anti-HIV-1 antibodies by ELISA and by "western blot". None of these patients were on Zidovudine treatment.
  • the clinical stage of the disease in these people was defined according to the C.D.C. (M.M.W.R. 1986,35: 334-339). Twenty of these forty patients were classified as class II, three as class III and seventeen as class IV.
  • the syncitia obtained after contact of the HT4LacZ-1 cells with the HIV isolates were easily detectable.
  • the detection method of the invention makes it possible to detect a simple syncitium. This test therefore makes it possible to identify an infected cell fused with 3 ⁇ 10 5 cells (the number of co-cultured cells tested). The specificity of this reaction was confirmed by the absence of syncitia formation by co-cultured PBLs and from people who are HIV-negative. After 4 days of co-culture, the test of the invention allowed the detection of 14 isolates capable of causing the formation of syncitia among 47 isolates tested.
  • a syncitium is considered to be positive as soon as it contains at least three colored nuclei.
  • the results are expressed as the number of syncitia detected by 10 5 co-cultured cells added to the HT4LacZ-1.
  • the detection method of the invention was also used for the detection of free viruses in the supernatant of PBL co-cultured for 4 days. On average, the number of syncitia induced by the supernatants was lower than the number caused by the corresponding co-cultured PBLs.
  • the number of transactivated syncitia caused by PBLs co-cultured for 4 days and measured according to the method of the invention was compared with the concentration of p24 antigen detected in the supernatant of these co-cultures.
  • the concentration of p24 antigen is measured according to the method of Goudsmit J. et al, (Lancet 1986 ii: 177-180), the "threshold" concentration being 30 ⁇ g / ml.
  • the isolates identified by the method of the invention as being capable of causing the formation of syncitia were subjected, on the fourth and seventh days of co-culture, to a test for detection of the presence of the p24 antigen.
  • the presence of the p24 antigen at this stage indicates a high replication rate.
  • Table 1 the figures represent the number of patients in each group. SI: isolates capable of causing syncitia formation; NSI: isolates incapable of causing syncitia formation. Then, on the fourth, seventh and eleventh days, the concentration of p24 antigen was determined in the co-culture supernatants of isolates with high replication rate.
  • the inventors have also demonstrated, using the process of the invention, the presence of syncitia-inducing isolates in class II and III patients. These patients did not have p24 antigen and had only a moderate decrease in circulating CD4 + cell levels.
  • the detection method of the invention can then be used in the detection of patients infected with an isolate capable to induce syncitia before the development of AIDS disease.

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Abstract

L'invention concerne une lignée de cellules indicatrices comportant un récepteur CD4 pour un rétrovirus infectieux et, intégré à leur génome, un provirus recombinant défectif comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactiveur rétroviral et, sous le contrôle d'un premier promoteur, une région tar activable par le transactiveur codé par la région tat (stimulation interne). Le provirus recombinant contient également une séquence agissant comme marqueur, intercalée entre les susdites régions tar et tat. L'aptitude de ces cellules indicatrices à former des syncitia a été réduite de façon telle que l'activation de la région tar sous l'effet de la stimulation interne soit également réduite.

Description

LIGNEES DE CELLULES INFECTABLES PAR UN RETROVIRUS ET CONTENANT UN MARQUEUR ACTIVABLE A L'OCCASION DE
L'INFECTION
L'invention concerne des moyens (cellules activatrices et procédés) applicables à la détection in vitro de la présence d'un retrovirus infectieux dans un échantillon biologique, notamment dans un prélèvement provenant d'un patient ou porteur humain présumé du retrovirus ou encore d'un animal infecté. Une application préférée de l'invention s'adresse à la détection d'un virus du SIDA (HIV ou SIV) infectieux ou defectif.
Dans une autre variante d'application, 1'invention a pour but de permettre 1'étude de 1'influence d'agents extérieurs, notamment de principes actifs de médicaments susceptibles d'inhiber, à tout le moins moduler, le caractère infectieux in vivo ou in vitro du retrovirus étudié.
La mise au point d'un système de détection directe et ultrasensible plus particulièrement des virus HIV représente encore à ce jour une urgence pour la communauté scientifique et médicale.
Dans le but de permettre une détection, in vitro, de l'existence ou non d'une infection rétrovirale chez l'hôte (humain ou animal), et ce même à un stade très précoce de 1'évolution de cette infection, il a déjà été proposé dans la demande de brevet français nβ 8714384 de mettre à profit le fait que l'activité génique des retrovirus, notamment de retrovirus humains et de mammifères supérieurs : HTLV, BLV, etc., dépendait en général d'une trans- activation (ou trans-stabilisation) par une protéine virale codée par un gène endogène faisant partie du gène retroviral. Par exemple dans le cas des retrovirus HIV, l'activité génique du virus dépend d'une trans-activation (ou trans-stabilisation) par le gène HIV-tat (également connu sous la dénomination "gène Q") , l'une au moins des cibles (séquence tar) de la protéine codée par le gène tat étant constituée par une séquence contenue dans la région R, elle-même normalement dans la région LTR5' du génome retroviral. La trans-activation (ou trans-stabilisation) du retrovirus sous le contrôle du gène tat est une condition importante pour une réplication efficace du retrovirus, en particulier au niveau de la transcription des gènes codant pour les protéines gag, env et pol.
Le procédé de détection d'une infection rétrovirale, selon la demande de brevet européen susdite repose sur la mise en contact de l'échantillon biologique éventuellement infecté par le retrovirus à l'étude, par exemple HIV, avec des cellules transformées (ci-après dénommées "cellules indicatrices) et comportant dans leur patrimoine génétique un gène ou provirus recombinant defectif, dépourvu de 1'essentiel de la séquence codant pour le susdit transactivateur retroviral, notamment HIV-tat, mais comprenant lui-même une séquence recombinante résultant de la fusion d'une séquence activable par ce trans-activateur retroviral, d'une part, et d'un marqueur hétérologue, d'autre part, ladite séquence recombinante étant elle-même placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression du marqueur dans ces cellules indicatrices à l'occasion d'une infection avec le retrovirus sauvage, et ce grâce à l'apport extérieur (en "trans") du trans-activateur codé par la région correspondante (notamment tat dans le cas de HIV) du génome retroviral de ce retrovirus.
Une forme préférée d'un gène recombinant, dérivé de HIV, décrit dans la susdite demande de brevet européen contient : - d'une part, un ADN correspondant essentiellement à la totalité du génome d'un retrovirus, y inclus le gène activable, (notamment la région R d'un retrovirus HIV) par le trans-activateur retroviral tat placé sous le contrôle d'un promoteur, mais à l'exclusion cependant de l'essentiel de cette séquence tat et, le cas échéant, de parties alors délétées, de séquences codant pour les protéines gag, env, pol et,
- d'autre part, placé sous le contrôle du promoteur, en l'occurrence le LTR5', normalement associé aux séquences codant pour les protéines gag, pol et env, un marqueur codant pour une enzyme produite dans les cellules indicatrices, ultérieurement transformées par le gène ou virus recombinant defectif. Cette enzyme est de préférence du type de celles qui confèrent une coloration particulière aux cellules indicatrices ou la capacité d'agir sur un substrat pénétrant dans celles-ci et subissant in situ une modification de coloration ou plus généralement de son spectre d'absorption des radiations lumineuses. La jS-galactosidase, la 3-glucuronidase ou la luciférase sont des exemples de telles enzymes.
Des cellules indicatrices contenant de tels marqueurs sont particulièrement avantageuses, en ce qu'elles permettent grâce à la révélation de l'expression du marqueur une observation individualisée des cellules contenant les gènes ou provirus defectifs recombinants sus-définis, dès qu'elles sont infectées par le retrovirus étudié.
Il est avantageux d'avoir recours à un marqueur localisé dans un compartiment cellulaire aisément identifiable des cellules indicatrices, d'où l'utilisation préférée déjà suggérée antérieurement d'une séquence génique dénommée "nlsLac Z" décrite par Kalderon, D. et al (1984), Cell 39, 499-509, et contenant une région signal de localisation de l'antigène T (nls) du virus de singe SV40 fusionnée au gène Lac Z, l'ensemble étant alors placé, par exemple, sous le contrôle du LTR5' du HIV. La protéine de fusion correspondante nls-0-Gal est enzymatiquement active et reste associée avec le noyau des cellules auxquelles une telle séquence génique est incorporée, plus particulièrement avec les membranes des noyaux cellulaires desdites cellules, plutôt que de s'accumuler dans le nucléoplasme. Cette séquence autorise par conséquent une sensibilité de marquage accrue.
Une lignée indicatrice, transformée par un virus recombinant defectif de ce type (pHIV-1 nlsLac Z (ci-après également désignée sous l'expression "recombinant A") a été décrite dans la susdite demande de brevet européen. Quand cette lignée indicatrice est infectée par le virus sauvage, 1'expression du gène LacZ peut être détectée histochimiquement au niveau de la cellule. A chaque cellule de la lignée indicatrice LacZ infectée correspond alors une cellule 3gal+ décelable par marquage histochi ique in situ.
L'activateur du gène nlsLacZ peut aussi être induit dans des cellules indicatrices de ce type par un apport en trans de la séquence tat sous une autre forme, par exemple par transformation de ces cellules indicatrices avec un plasmide, contenant cette séquence. Les mêmes effets ont été observés à l'occasion d'une co-transformation de cellules 'une lignée transformable avec, d'une part, un retrovirus recombinant defectif du type pHIV-1 nlsLacZ (ci-après aussi dénommé recombinant A) et, d'autre part, un plasmide contenant une séquence tat (pLET ou pSET décrits par M. Emerman et al, The E.M.B.O. Journal, 6, 1987, p. 3755-3760), comme le constatèrent C. Bonnerot et al dans le C.R. Acad. Sci Paris, t. 307, Série III, p. 311-316, 1988.
Ces derniers auteurs rapportent d'ailleurs des obervations semblables dans des essais de co- transformation des cellules du même type de lignée cellulaire avec deux autres retrovirus recombinants dénommés respectivement :
(B) HIV-1 nlsLacZ tat et .
(C) HIV-l SVnlsLacZ tat.
Le recombinant B se distingue du recombinant A par la présence en aval de la séquence LacZ d'une partie non délétée du retrovirus initial. En particulier il comprend la séquence nucléotidique s'étendant entre le nucléotide 5289 et le nucléotide 9194, selon R. eiss et al dans R.N.A. Tumor Virues, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1985. Cette séquence du génome HIV-l contient les gènes codant pour tat, rev, nef, env et les séquences cibles pour la protéine REV.
Le recombinant C est identique au recombinant B, si ce n'est qu'il comporte en aval de la séquence nlsLacZ un promoteur supplémentaire (ci-après dénommé promoteur interne) jouxtant la séquence LacZ. En d'autres termes, celle-ci se trouve également sous le contrôle de ce promoteur interne. Dans le cas de la construction représentée, le promoteur interne correspond au promoteur de la région précoce de SV40.
Des structures représentatives schématiques des structures de ces deux derniers retrovirus, ainsi que du premier cité ci-dessus apparaissent dans la fig. 1 des dessins.
Les séquences nlsLacZ sont représentées dans la fig. 1 par des barres en grisé. Elles sont flanquées en 5' et 3' de séquences dérivées d'une copie provirale du virus HIV-l. Les retrovirus recombinants contiennent des LTR viraux intacts (barreaux d'extrémités évidés de la fig. 1) . Les séquences des trois recombinants, entre U5 et le site SphI contiennent le début du gène gag. Dans le recombinant A, les séquences entre le site BamHI, en aval de LacZ, et U3 ne contiennent que l'information pour le gène nef. Dans les recombinants (B) et (C) , les séquences entre le site EcoRI (en aval de LacZ) et U3 contiennent les parties codantes des gènes tat, rev, nef et env, ainsi que les séquences cibles impliquées dans la régulation par REV. Le promoteur de la région précoce de SV40 est indiqué (dans (C) ) par une courte barre noire. Les sites SphI et EcoRI ont été détruits au cours de la construction. Il est encore fait référence à 1'article de Bonnerot et al pour ce qui est des détails de leur construction.
Des observations faites par les auteurs à l'occasion de la transfection des systèmes cellulaires utilisés, avec d'une part les trois retrovirus recombinants et, d'autre part, les plasmides pSET et pLET, il découle que l'apport en trans du transactivateur codé par la région tat de pSET et pLET conduit à une stimulation de la β- galactosidase, non seulement dans les cellules indicatrices transformées par le retrovirus recombinant A, confirmant en cela les résultats du brevet antérieur, mais également dans les cellules indicatrices transformées par le retrovirus recombinant B, dans lesquelles une certaine expression était déjà observée en l'absence de l'apport en trans, expression qui s'interprète naturellement comme le résultat de la stimulation induite par la séquence tat interne à ce retrovirus recombinant (stimulation interne) . En revanche la stimulation externe par cet apport en trans ne semble pas ajouter à l'expression nettement plus élevée observée, sous l'effet de la stimulation interne. dans les cellules transformées par le recombinant C comportant le promoteur interne supplémentaire, immédiatement en amont de nlsLacZ.
L'invention repose sur les découvertes :
- que des cellules comportant un récepteur pour un retrovirus et transformées par une séquence génétique dérivée du même retrovirus ou d'un retrovirus homologue et comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactivateur retroviral et une région tar activable par le transactivateur codé par tat ou par un transactivateur apporté en trans, peuvent faire l'objet d'un réarrangement génétique qui confère à ces cellules le caractère tat". Par exemple, suite à ce réarrangement, des cellules transformées par la construction type "B" citée ci- dessus n'expriment pas le gène Lac Z. Des cellules transformées par une construction de type "C" et ayant fait l'objet d'un tel réarrangement présentent une expression réduite en ,5-galactosidase assimilable à un bruit de fond par rapport aux cellules qui n'ont pas fait l'objet du réarrangement génétique. La transactivation de ces cellules tat" qui a lieu en présence d'un retrovirus infectieux conduit à une expression du marqueur dans le cas de transformation par la construction du type "B" et, dans le cas de la construction du type "C", à une augmentation de l'expression du marqueur. La différence entre le taux d'expression du marqueur observé avant le contact avec 1'agent infectieux et celui observé après ce contact est très important, c'est-à-dire au moins 10 fois, et souvent entre 50 et 100 fois.
- que, même dans le cas de cellules indicatrices comportant dans leur patrimoine génétique une séquence nucléique du type de celle du recombinant (C) , et comprenant par conséquent à la fois une séquence tat et un marqueur de contrôle lui-même également placé sous le contrôle d'un promoteur interne distinct, s*ajoutant au LTR51, on pouvait en fait disposer d'une "réserve d'expression" du marqueur, lorsque les cellules indicatrices le contenant étaient infectées par un retrovirus natif ou un retrovirus homologue et
- que l'expression spontanée du marqueur sous l'effet de la stimulation interne, le cas échéant soutenue par le promoteur interne supplémentaire, peut être contrôlée de façon telle que l'on puisse ensuite faire le départ net entre l'expression spontanée du marqueur et l'expression provoquée en présence d'un retrovirus infectieux, dans les conditions d'un essai de diagnostic in vitro de l'existence ou non d'une infection par le retrovirus correspondant ou par un retrovirus homologue dans un échantillon biologique à l'étude, et ce à un stade précoce de l'infection.
Conformément à l'invention, ce contrôle peut être réalisé par 1'incorporation de vecteurs recombinants de ce type à des cellules infectables par le retrovirus natif correspondant et par la sélection ultérieure en tant que cellules indicatrices de celles dans lesquelles le marquage observé est plus réduit que dans d'autres, dès lors que les cellules indicatrices choisies témoignent d'une "réserve de marquage" se manifestant par un marquage amplifié de ces cellules indicatrices, lorsque celles-ci sont infectées par le retrovirus natif ou homologue.
L'invention concerne donc plus particulièrement une lignée de cellules indicatrices comportant un récepteur pour un retrovirus et dans leur patrimoine génétique, de préférence sous forme intégrée à leur génome, une séquence génétique recombinante dérivée du même retrovirus ou d'un retrovirus homologue, comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactivateur retroviral et une région tar sous le contrôle d'un premier promoteur et activable par le transactivateur codé par la région tat susdite (stimulation interne) ou par un transactivateur apporté en trans (stimulation externe) par le retrovirus natif ou un retrovirus extérieur venant infecter ces cellules indicatrices, celles-ci étant caractérisées en ce que . cette séquence génétique recombinante contient également une séquence contenant un marqueur, le cas échéant sous le contrôle d'un second promoteur ou promoteur interne distinct du premier, intercalé entre les susdites régions tar et tat dans des conditions entraînant l'activation du marqueur consécutivement à l'activâtion de la région tar, et en ce que ces cellules indicatrices sont ou ont été rendues telles que l'activation de la région tar sous l'effet de la stimulation interne soit en deçà des activations résultant du cumul de la stimulation interne et d'une stimulation externe. En d'autres termes, la détection d'une infection rétrovirale s'apprécie par les niveaux différentiels d'intensité de l'expression du marqueur dans les cellules indicatrices conformes à l'invention, selon qu'elles font l'objet d'un apport en trans de trans-activateur tat ou non. Dans ce qui suit, il sera alors quelquefois fait référence au "marquage différentiel" que permettent les cellules indicatrices. Selon un mode de réalisation préféré, la "stimulation interne" fournie par le transactivateur tat interne est nulle suite à un réarrangement génétique dans la cellule indicatrice, ce réarrangement conférant un caractère tat" à la cellule.
Lorsqu'il a été fait référence dans ce qui précède à une "séquence" génétique dérivée d'un retrovirus homologue", il faut entendre la possibilité que celui-ci peut ne pas être identique au "retrovirus infectieux" spécifique du récepteur CD4 desdites cellules indicatrices. Il doit cependant être fonctionnellement équivalent. En particulier la région tar doit néanmoins être activable en trans par la région tat du retrovirus infectieux. Par exemple le retrovirus dont est issue la séquence génétique recombinante est dérivée . d'un SIV, alors que le retrovirus infectieux considéré est un HIV2, voire même un HIV-l. Les mêmes observations s'étendent aux régions tat et tar contenues dans une même séquence recombinante. Elles peuvent être issues de deux retrovirus distincts, mais fonctionnellement homologues.
Les cellules indicatrices de 1'invention peuvent être obtenues par les étapes suivantes: i) transfection d'une cellules comportant un récepteur pour un retrovirus avec un séquence génétique recombinante dérivée du même retrovirus ou d'un retrovirus homologue et comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactivateur retroviral et une région tar activable par le transactivateur codé par la région tat susdite, et une séquence contenant un marqueur. Ce marqueur est positionné entre les régions tat et tar soit de manière à ce que l'activation de la région tar entraîne l'expression du gène marqueur, ou bien de manière à ce qu'il soit sous le contrôle d'un promoteur interne, son expression étant ainsi libérée de la nécessité de transactivation. La séquence génétique peut également comporter le gène env du retrovirus ; ii) Sélection, parmi les transformants, des cellules ayant acquis un caractère tat" suite à un réarrangement génétique. Le caractère tat" se traduit, dans le cas où l'expression du gène marqueur est dépendant de la transactivation de la région tar, par l'absence totale d'expression du gène marqueur. En revanche, dans le cas où l'expression du gène marqueur est sous le contrôle d'un promoteur interne, le caractère tat" se traduit par un taux d'expression faible par rapport à celui observé chez des cellules n'ayant pas subi le réarrangement. Dans le cas où la séquence génétique contient, également le gène env, ce réarrangement conduit à un caractère env". Ce caractère env" se traduit par une aptitude réduite à la fusion spontanée et une forte aptitude à la fusion lorsque les cellules sont infectées par le retrovirus ou lorsqu'elles sont infectées par un vecteur comportant la séquence env intacte. Les cellules présentant ce caractère env- sont sélectionnées. iii) Vérification pour chacune des cellules sélectionnées sous (ii) que la transactivation conduit à un niveau différentiel d'intensité d'expression du gène marqueur, et le cas échéant, à la formation de syncitia.
L'homme de métier appréciera que selon la nature des cellules mises en oeuvre, il peut influer sur les paramètres lui permettant d'opérer parmi les lignées cellulaires initialement mises en oeuvre, à l'occasion de leur transformation par un vecteur approprié contenant lui-même une séquence génétique recombinante qui doit être incorporée à leur patrimoine génétique, pour sélectionner parmi les cellules transformées celles qui permettent le "marquage différentiel" dans les conditions qui ont été indiquées plus haut.
De préférence, les cellules indicatrices selon 1*invention résultent de la transformation par la séquence génétique recombinante de cellules qui sont normalement aptes à fusionner entre elles pour former des syncitia, lorsqu'elles sont transformées par une séquence env intacte de HIV et lorsque celle-ci est exprimée, lesdites cellules indicatrices étant alors caractérisées, d'une part, par une aptitude réduite à la fusion spontanée et, d'autre part, par une forte aptitude à la fusion lorsqu'elles sont infectées par un retrovirus natif infectieux ou même, lorsqu'elles sont transfectées par un vecteur ou ADN recombinant modifié par une séquence env intacte.
Un protocole de sélection susceptible d'être mis en oeuvre pour obtenir des lignées de cellules indicatrices de ce type est résumé ci-après. Il est exposé plus loin, de façon plus détaillée, à propos de la sélection de cellules indicatrices au sein d'une culture transformée de cellules du type HT4LacZ.
(1) Transfection du plasmide selon Maniatis et al, 1982.
(2) Passage des cellules dès qu'elles atteignent la confluence (1-10 x 105/cm2) ; dissociation au 1/3 pendant 2 semaines.
(3) Sélection des cellules LacZ* à l'aide d'un trieur de cellules, tel que le "cell sorter" (Nolan et al, 1988) (ou toute autre méthodologie) .
(4) Isolement de clones et, après leurs divisions respectives, vérification pour des cellules de chacun d'entre eux,
(a) la non-fusion en maintenant 3 jours les cellules à confluence et simultanément leur coloration nucléaire (examen visuel) ;
(b) la transactivation et la fusion des cellules colorées à la suite de transfection ou d'infection, notamment par co-culture avec des cellules infectées par le retrovirus ; (5) la retenue en tant que cellules indicatrices possibles, conformes à l'invention, de ceux des clones cellulaires qui, lorsqu'ils ont été testés dans les conditions sous 4(b) , ont conduit à des cellules à la fois colorées et fusionnées. Au contraire les cellules qui ne donnent pas lieu à des fusions et/ou qui ne sont pas davantage transactivées dans les conditions sous 4(b) doivent être rejetées.
Comme dans le cas des retrovirus recombinants de la demande de brevet européen n° 87.14384, la séquence nucléique recombinante conforme à la présente invention contient 1*ensemble des éléments agissant en "cis" pour autoriser l'activation de la transcription des séquences tar sous l'effet d'un transactivateur codé par une séquence tat, ainsi que, le cas échéant, les parties agissant en "cis" du virus sauvage et assurant normalement l'empaquetage du retrovirus, sa réverse-transcription en une molécule ADN et son intégration dans le génome de la cellule hôte, ainsi que le site de polyadénylation de cet ARN.
Le premier promoteur sous le contrôle duquel est placée la séquence tar activable par le trans¬ activateur tat est un promoteur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire infectable. La séquence tar peut être placée sous le contrôle direct de la région U3 du LTR5' du retrovirus. En variante encore, l'une ou l'autre des régions LTR, ou les deux à la fois, sont dépourvues de promoteur(s) , la séquence tar et, par conséquent le marqueur étant alors sous le contrôle d'un promoteur distinct remplaçant la région U3 de façon à ce que la transcription se fasse toujours à partir de la région R trans-activatrice.
De préférence le marqueur lui-même consiste en une séquence codant pour une enzyme colorable ou agissant sur un substrat colorable, comme il a été indiqué plus haut. D'une façon générale, les caractéristiques déjà présentées comme préférées dans la demande de brevet européen susdite, pour ce qui est des caractéristiques décrites du retrovirus recombinant defectif, autres que celles qui intéressent directement la région tat (délétées) , sont également des caractéristiques préférées utilisables dans le contexte de la présente invention : par exemple la fusion du gène LacZ et de la séquence du peptide de localisation nucléaire de SV40 (nlsLacZ) .
Le promoteur interne ou second promoteur immédiatement en amont de la séquence marqueur (lorsqu'il est présent) peut être constituée par tout promoteur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire.
La souche recombinante HT4LacZ-l a été déposée à la Collection Nationale des Cultures de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le N° 1-899, le 27 juillet 1989.
L'invention concerne aussi le procédé mettant en oeuvre les cellules indicatrices susdites pour la détection d'une infection rétrovirale dans un échantillon contenant des cellules éventuellement infectées (tel qu'un prélèvement de sérum humain contenant des lymphocytes T4, s'agissant d'apprécier s'il est infecté par un virus HIV) ou le milieu, tel qu'un surnageant de culture, avec lequel ces cellules avaient auparavant été en contact.
Ce procédé est caractérisé par les étapes que constituent :
- la mise en contact de cet échantillon avec les cellules indicatrices selon l'invention, et ce dans des conditions (notamment de température et de durée d'incubation appropriées) permettant l'infection desdites cellules par le retrovirus éventuellement présent dans l'échantillon, et
- la détection de 1'infection éventuelle desdites cellules par révélation de l'expression amplifiée du marqueur, le cas échéant à l'aide d'un révélateur approprié.
Un tel procédé permet la détection très sensible, dans des délais très rapides, de la présence d'une infection rétrovirale dans l'échantillon cellulaire initial qui était à tester, et même le dosage du degré de 1•infection rétrovirale dans l'échantillon testé, au moment où le test a été réalisé.
L'amplification de la transactivation peut être dans un rapport d'au moins 10 fois, et de préférence de 50 à 100 fois par rapport à celle alors assimilable à un bruit de fond, qui peut être observée dans les mêmes cellules indicatrices en présence d'un échantillon non infecté.
On appréciera que ce test permet aussi d'étudier l'évolution de l'infection chez un patient atteint de la maladie induite par le retrovirus sauvage, s'il est répété dans le temps, sur des prélèvements de sérums, de tout autre fluide ou tissu biologique infecté provenant de ce patient.
Les inventeurs ont démontré que les cellules indicatrices de l'invention, et notamment celles qui présentent à la fois une aptitude réduite à le. fusion spontanée et une forte aptitude à la fusion lorsqu'elles sont infectées par un retrovirus natif, peuvent être utilisées pour la détection, dans le sérum de malades, de souches de retrovirus, par exemple le H.I.V., capables de provoquer la formation de syncitia. La capacité d'une souche de HIV à provoquer la formation de syncitia se montre, d'après les résultats du procédé de détection de l'invention, indicatrice de la gravité de la maladie, du taux de cellules CD4+, et de la présence d'un taux d'antigène p24 détectable. Il a également été démontré que les souches capables de provoquer la formation de syncitia font partie des isolats de HIV ayant un taux de réplication élevé.
Le procédé de 1'invention est ainsi apte à détecter, tout d'abord, la présence du retrovirus et ensuite, sa capacité à provoquer la formation de syncitium.
Le procédé de 1'invention peut aussi être mis en oeuvre pour l'étude de l'efficacité éventuelle d'un principe actif de médicament vis-à-vis de l'interaction entre le retrovirus considéré et des cellules sensibles, notamment lorsque la susdite mise en contact sus-indiquée est opérée en présence de ce principe actif. On apprécie que le test ainsi modifié permet à la fois de sélectionner le principe actif de médicament qui pourrait se révéler le plus actif, de déterminer les doses qui pourraient être efficaces pour traiter le patient ayant fourni le prélèvement, ces doses efficaces découlant notamment de celles qui, dans la mise en oeuvre du test sus-indiqué n'entraîne pas une amplification du marqueur des cellules indicatrices, lorsqu'elles sont amenées au contact de prélèvements provenant du malade à traiter ou du surnageant du milieu dans lequel cet échantillon cellulaire avait été maintenu.
Plus généralement, l'invention permet l'étude in vitro de l'influence des facteurs susceptibles d'interférer avec l'infection virale, le procédé sus-défini comprenant alors la mise en contact des cellules indicatrices selon l'invention, en présence de ce facteur, avec des quantités déterminées de retrovirus extérieur et la détection des doses - de facteurs, notamment de principe actif de médicament, qui préviennent l'infection rétrovirale, détectable par l'activation du marqueur, desdites cellules.
L'invention concerne donc également des nécessaires ou kits permettant la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être décrit, ces kits comportant :
- des cellules indicatrices telles que sus-définies,
- des moyens de révélation de l'expression du marqueur, notamment lorsque le marqueur est une enzyme, un substrat spécifique de l'enzyme,
- éventuellement les tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la mise en contact, avec l'échantillon biologique, des cellules indicatrices et l'incubation du mélange de réaction dans des conditions permettant 1'infection éventuelle de ces cellules indicatrices au contact de l'échantillon étudié,
- le cas échéant des milieux de conservation ou de culture desdites cellules saines et modifiées.
Avantageusement les cellules indicatrices utilisées dans ces kits sont constituées par des lignées cellulaires "immortalisées" infectables par le retrovirus recombinant correspondant. Par exemple, dans le cas d'un kit destiné à la détection d'un virus HIV, lesdites cellules sensibles modifiées et les cellules saines appartiendraient toutes deux à des lignées cellulaires du type HT4, CEM, HUT, etc.
Dans les exemples indiqués plus loin, les possibilités de l'invention sont illustrées en rapport avec la production de cellules indicatrices dérivées d'une lignée de cellules HT4.
Il est donc tout à fait clair que l'invention s'adresse à la détection de tout type de retrovirus éventuellement infectieux vis-à-vis de cultures cellulaires déterminées et présentant les caractéristiques essentielles de structure dont il a été question plus haut. En particulier, elle s'applique à la fabrication de cellules indicatrices permettant, dans les conditions qui ont été indiquées, la détection du pouvoir infectieux (ou la modulation du pouvoir infectieux) des retrovirus connus sous les dénominateurs HTLV I, HTLV II, HIV I (ou encore LAV ou HTLV III) , HIV II (ou LAV II) , HTLV IV. Il en est encore .de même pour de nombreux retrovirus infectieux à l'égard de l'animal. A titre d'exemple, on mentionnera les retrovirus leucémiques des bovins (Bovine Leuke ia Viruses) et des félins (FeLV) .
Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'un exemple de réalisation, appliquée à la production de lignées indicatrices contenant une séquence génétique des retrovirus recombinants defectifs conformes à l'invention, dérivé de HIV-l.
Il sera dans ce qui suit fait référence aux figures dans lesquelles :
- la figure 1 fournit de façon schématique les éléments essentiels de structures des trois retrovirus recombinants (A) (B) et (C) dont il a été question plus haut ;
- la figure 2 montre de façon schématique les niveaux d'activité /9-galactosidase (β.gal sur l'axe des ordonnées) qui ont été mesurés grâce à l'activation du marqueur dans différentes situations évoquées plus loin au cours de la description ;
- la figure 3 est une courbe représentative du délai de réponse des cellules indicatrices de 1'invention comme suite à une infection virale dans les conditions également indiquées plus loin ; - la figure 4 fournit des courbes de titrage de la cellule indicatrice utilisée telle qu'elle a été mise en oeuvre avec des dilutions virales obtenues à partir de différents retrovirus également identifiés dans la figure 4 ;
- la figure 5 fournit des courbes de variation d'activation du marqueur dans des cellules indicatrices conformes à l'invention lorsque celles- ci sont infectées mais en présence de doses croissantes de la protéine CD4 ; et enfin
- la figure 6 est également représentative des variations observées dans les mêmes conditions que pour la figure 5 mais en présence de doses variables AZT.
- la figure 7 montre la corrélation entre le nombre de syncitia induits par des lymphocytes du sang périphérique isolés chez des personnes infectées du HIV, et le taux d'antigène p24 détecté dans le surnageant correspondant.
- la figure 8 montre la concentration d'antigène p24 dans les surnageants des co-cultures de PBL à taux de réplication élevé :
-43- capables d'induire la formation de syncitia mis en évidence à l'aide des cellules indicatrices de l'invention;
— — incapables d'induire la formation de syncitia.
Développement d'une lignée cellulaire HeLa T4 HIV nlsLacZ
Une lignée de cellules humaines adhérentes a été choisie en raison de sa capacité à former des syncitia lorsqu'elle est infectée par un virus HIV. La formation des syncitia contribue à l'aisance de la détection éventuelle de cellules infectées au sein d'une suspension. HT4 est un clone cellulaire qui exprime la molécule CD4 issue d'un vecteur recombinant retroviral T4 d'origine murine. Ces cellules sont par conséquent infectables par HIV (Chesebro, B. and ehrlly, K. (1988) J. of Virol. 62, 3779-3788) . Le vecteur utilisé pour la transformation est celui qui a déjà été mentionné plus haut : pHIVSnlsLacZtat (Bonnerot et al. 1988).
Les cellules HeLa T4 sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum foetal de veau. Le dusdit plasmide a été transfecté par coprécipitation phosphocalcique selon la méthode décrite par Rubenstein, JR, Nicolas, J.F. and Jacob, F. (1988) C.R. Acad. Sci. Paris, 299, 271-274, si ce n'est que le précipité est directement ajouté au milieu de culture. Les transformants ont ensuite été analysés en ayant recours aux méthodes classiques d'analyse par la méthode de Southern et de détection des ARN par hybridation sur tâche (dot blot) .
En ce qui concerne la détection de l'expression de J-galactosidase et le tri des cellules, on a procédé comme suit :
Pour la détection de X-gal, des cellules ont été rapidement fixées (2 à 5 minutes) dans le formaldehyde 1%, le glutaraldehyde 0,2% dans 150 mM NaCl, 15 mM , phosphate de solium pH 7,3 (PBS), puis placées deux fois dans du PBS et incubées à 30°C pendant de 10 à 60 minutes au sein d'un milieu de réaction contenant lmg/ml du 4-chloro-5-bromo-3- indolyl-?-galactoside (X-gal) , du ferrocyanure de potassium 5mM et MgCl2, 2 mM dans le PBS. X-gal a été dissous à raison de 40 mg/ml dans le diméthylsulfoxide. La réaction enzymatique a été arrêtée par élimination du X-gal. Les cellules colorées peuvent être conservées dans le PBS ou l'eau. Pour effectuer le tri des cellules on a- eu recours à la procédure FACS et la détection des cellules marquées par coloration de la fluoresceine ài-β-O- galactopyranoside (FDG) a été faite selon la technique de Nolan, G.P., Fiering, S., Nicolas, J.F. & Herzenberg, L.A. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 2603-2607. L'essai ONPG sur des extraits de protéines a été réalisé comme décrit par Rubenstein et al. déjà cité.
Dans deux premiers essais pris globalement et en l'absence de virus infectieux, un certain nombre de colonies témoignant d'une expression de la β- galactosidase ont été isolés. En outre la présence de syncitia comportant individuellement plusieurs noyaux bleus a été constatée. Dans le but d'isoler un transformant stable, les cellules ont été cultivées pendant deux semaines après transfection et un clone de cellule dans lesquelles le marqueur était exprimé a été isolé par une méthode de tri fondée sur la détection de l'intensité de l'activité β- galactosidase dans les cellules vivantes, plus particulièrement l'activité 0-galactosidase a été appréciée avec un équipement de tri permettant l'appréciation de profils de fluorescence.
HT4-LacZ-l est un des clones qui a été isolé au terme de ce tri. Il ne donne pas lieu à des fusions spontanées, alors même qu'il comporte des séquences génétiques dérivées de celles codant pour la glycoprotéine env, séquence néanmoins présente comme en témoigne la capacité de cette séquence génétique d'exprimer le récepteur viral sur les membranes cellulaires des cellules de ce clone à un niveau compatible avec la formation de syncitia sous l'effet d'une infection. Ce clone est transactivable, comme cela sera également exposé plus loin. L'analyse par la méthode de Southern par hybridation sur support (Southern blotting) de la séquence LacZ a permis de constater que ses propriétés devaient être dues à un réarrangement au sein de la région env TAT. Il a été constaté qu'apparamment la séquence LTRSVnlsLacZ était intacte. Il en résulte par conséquent que le clone sélectionné combine les propriétés biologiques d'un provirus tat"/env" et d'une région régulatrice 3* génétiquement modifiée.
HT4-LacZ-l a un niveau faible d'expression de 3-galactosidase dans une culture en cours de croissance exponentielle, cette activité étant cependant très réduite (bruit de fond) lorsque la culture vient à confluence. Ce bruit de fond reste stable lorsque le clone et les sous-clones qui en sont dérivés sont maintenus en culture en l'absence de pression sélective pour la ^-galactosidase. Activation de HT4LacZ par apport en trans de protéine TAT
La détection d'une transactivation du gène intégré HIV LacZ par apport de produits viraux exogènes a été analysé par transfaction des cellules indicatrices avec des plasmides appropriés dans HT4MacZ-l. pSVtat induit un accroissement de l'expression de LacZ qui est rapidement repéré par l'examen de cellules colorées par X-gal, puis confirmé par des mesures quantitatives de l'activité enzymatique en utilisant de l'ONPG en tant que substrat.
La figure 2 illustre les résultats observés à l'occasion des mesures évoquées plus haut et ici même. Elle rapporte le niveau d'expression de la β- galactosidase sous l'effet d'une transactivation par la protéine TAT dans HT4LacZ. En ordonnée apparaissent les activités 3-galactosidase mesurées par l'hydrolyse du substrat ONPG par les extraits de protéine.
La hauteur des barres verticales est fonction directe de l'intensité de l'activité enzymatique mesurée dans les cellules indicatrices maintenues en culture dans les conditions rappelées ci-après :
(a) au moment de la mise en culture, mais en l'absence de tout agent inducteur de l'expression du gène LacZ,
(b) dans les mêmes conditions mais après 4 semaines de culture
(c) dans les mêmes conditions encore, mais après 11 semaines de culture
(d) en présence de pRev
(f) en présence pTat et
(g) pRev et pTat.
En l'absence de pRev on observe pas d'accroissement de l'expression du gène LacZ par rapport au bruit de fond (figure 2,g) et pas davantage de formation de syncitia.
En revanche, en présence du plasmide p97 qui exprime la gpl20, autrement dit le gène d'enveloppe de HIV-l en sus des protéines TAT et REV, une forte coloration des cellules infectées en même temps que d'importantes fusions cellulaires se manifestant par la production de syncitia pouvant contenir jusqu'à 100 noyaux. Le même résultat est obtenu avec pLet, ce plasmide exprimant TAT, REV et le gène d'envelope de HIV à des niveaux inférieurs à celui qui peut être détecté par immunoprécipitation. Ce résultat confirme la sensibilité de HT4LacZ à la fusion. Titrage de HIV-l, HIV-2, SIVmac et SIVag_
Des cellules HT4 acZ ont été infectées avec du virus HIV-l (isolât BRU) préalablement cultivé sur des cellules Sup T-l et récoltées à partir de celles-ci. La coloration par X-gal a été provoquée à divers instants après l'infection. Des syncitia avec noyaux bleus n'ont été observés que de 40 à 50 heures plus tard. Le nombre de syncitia colorés à la β- galactosidase a atteint une valeur maximum au bout de 60-80 heures. Il tend à décroître ensuite.
La sensibilité des cellules indicatrices peut être accrue lorsque 1'infection par HIV est faite en présence de DEAE dextrane. A raison de 10 ug/ml de ce dernier polygadion on observe un accroissement du nombre de syncitia colorés à la 0-galactosidase fois plus élevé. Toutes les autres expériences dont il est question dans ce qui suit ont dont été effectuées en présence de DEAE dextrane et à la même densité cellulaire. Des essais semblables ont été faits avec des isolats d'autres virus, en particulier HIV-2( R0D) SIVag5, SIVag et SIV^. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 4 dans laquelle apparaissent les résultats obtenus, exprimés en nombre de syncitia colorés en fonction de la dose de virus infectieux utilisés. La figure fait apparaître une coloration des cellules indicatrices plus importante avec HIV- qu'avec les autres virus. Ceci étant, cette figure fait en même temps apparaître que les cellules indicatrices HT4LacZ comportant dans leur génome une séquence recombinante issue de HIV-l peuvent être utilisées très efficacement également, pour détecter dans un échantillon biologique la présence d'un virus infectieux homologue dans le sens qui a été indiqué ci-dessus : les différences s'expliquent par les intensités de transactivation différentes susceptibles d'être induites par les protéines dates des différents virus testés.
Les figures 5 et 6 fournissent enfin l'illustration du principe évoqué plus haut, à savoir que les cellules indicatrices de 1»invention peuvent être utilisées pour tester l'efficacité de principes présumés avoir une action neutralisante vis à vis des retrovirus. Ainsi la figure 5 montre-t-elle l'influence de la protéine CD4 et la figure 6 celle de l'AZT à différentes concentrations molaires sur la capacité de transactivation induite par les retrovirus en leur présence sur les cellules indicatrices de l'invention. L'action des substances inhibitrices de l'infection se manifeste par les réductions du nombre de syncitia colorés et de l'intensité relative même de la coloration. a) Formation de syncitia par des isolats de HIV provenant de malades :
Dans le but de démontrer la capacité du procédé de l'invention à détecter la formation de syncitia provoquée par le HIV, des PBL fraîchement isolés de malades infectés par le HIV étaient co-cultivés pendant 4 jours avec des PBL normaux, activés par 2μg/ml PHA et 5μg/ml de IL-2 contenu dans le surnageant de PBL normaux activés. Ensuite, les PBL étaient mis en contact avec des cellules HT4LacZ-l (CNCM 1-899) .
L'infection par HIV avait été confirmée chez ces malades par la détection par ELISA d'anticorps anti- HIV-1 et par "western blot". Aucun de ces malades ne suivait de traitement à la Zidovudine. Le stade clinique de la maladie chez ces personnes avait été défini selon la classification C.D.C. (M.M.W.R. 1986,35 : 334-339). Vingt de ces quarante malades étaient classés comme classe II, trois comme classe III et dix-sept comme classe IV.
Les syncitia obtenus après contact des cellules HT4LacZ-l avec les isolats de HIV étaient facilement décelables. Le procédé de détection de l'invention permet de détecter un syncitium simple. Ce test permet par conséquent, l'identification d'une cellule infectée et fusionnée par 3 x 105 cellules (le nombre de cellules co-cultivées testées) . La spécificité de cette réaction a été confirmée par 1'absence de formation de syncitia par des PBL co-cultivés et provenant de personnes séronégatives pour HIV-l. Après 4 jours de co-culture, le test de l'invention a permis la détection de 14 isolats capables de provoquer la formation de syncitia parmi 47 isolats testés.
Dans ces expériences, un syncitium est considéré comme étant positif dès qu'il contient au moins trois noyaux colorés. Les résultats sont exprimés comme le nombre de syncitia détectés par 105 cellules co- cultivées rajoutées aux HT4LacZ-l.
Le procédé de détection de 1*invention a également été utilisé pour la détection de virus libres dans le surnageant de PBL co-cultivés pendant 4 jours. En moyenne, le nombre de syncitia induits par les surnageants était moins élevé que le nombre provoqué par les PBL co-cultivés correspondants.
Il a également été testé si l'étape de co- culture était essentielle pour la production de syncitia transactivés. A cette fin, des PBL fraîchement isolés de 19 malades ont été rajoutés directement aux cultures de cellules HT4LacZ-l. Après quatre jours seulement, trois des dix-huit échantillons de PBL avaient provoqué la formation de syncitia colorés. Parmi les seize échantillons qui n'ont pas induit de syncitia, six en avaient provoqué la formation lors des essais impliquant une période de co-culture de 4 jours avec des PBL normaux activés.
En conclusion, chez certains patients, la présence de cellules infectées par l'HIV peut être détectée sans qu'il soit nécessaire d'effectuer 1'étape de co-culture avec des PBL normaux. b)Sensibilité du procédé de l'invention en comparaison avec celle de la détection de production de l'antigène p24 :
Le nombre de syncitia transactivés provoqués par des PBL co-cultivés pendant 4 jours et mesuré selon le procédé de 1'invention a été comparé avec la concentration d'antigène p24 détectée dans le surnageant de ces co-cultures. La concentration d'antigène p24 est mesurée selon la méthode de Goudsmit J. et al, (Lancet 1986 ii : 177-180) , la concentration "seuil" étant de 30pg/ml. En moyenne, le nombre de syncitia observé était en corrélation avec la quantité d'antigène p24 produite pendant la période de co-culture de 4 jours (r = 0.77, test de Spearman, p = 0.01). Ces résultats sont illustrés dans la figure 7. En appliquant le procédé de détection de l'invention, 2 échantillons se sont avérés positifs dès le quatrième jour, tandis que la présence d'antigène p24 n'a pu être démontrée dans ces mêmes échantillons, que le septième jour . Ces résultats indiquent que le procédé de 1'invention est d'une sensibilité élevée et peut être utilisé pour détecter la présence de virus à un stade auquel la production d'antigène p24 n'est pas encore détectable. c) Relation entre la capacité d'un isolât à provoquer la formation de syncitia et son taux de réplication :
Les isolats identifiés par le procédé de 1•invention comme étant capables de provoquer la formation de syncitia ont été soumis, le quatrième et le septième jours de co-culture, à un test de détection de la présence de l'antigène p24. La présence de l'antigène p24 à ce stade indique un taux de réplication élevé. Parmi les 10 échantillons cliniques testés, tous se sont montrés avoir un taux de réplication élevé. Ces résultats indiquent que les isolats capables de provoquer la formation de syncitia ont un taux de réplication élevé.
Il a également été constaté que, parmi des isolats qui n'étaient pas capables de provoquer la formation de syncitia, certains présentaient un taux de réplication élevé. Les isolats à taux de réplication élevé avaient, . de manière générale, été isolés de malades de la classe IV, tandis que les isolats à taux de réplication faible avaient été isolés chez des patients de classes II et III. Le tableau 1 montre la relation entre le taux de réplication de l'isolât HIV et le stade clinique du malade.
Figure imgf000030_0001
Tableau 1 : les chiffres représentent le nombre de patients dans chaque groupe. S.I. : isolats capables de provoquer la formation de syncitia; N.S.I. : isolats incapables de provoquer la formation de syncitia. Ensuite, les quatrième, septième et onzième jours, la concentration d'antigène p24 a été déterminée dans les surnageants de co-culture des isolats à taux de réplication élevé.
La concentration d'antigène p24 s'est montrée plus élevée dans les surnageants d'isolats capables de provoguer la formation de syncitia que celle dans les surnageants des autres isolats. La figure 8 montre ces résultats (—(ZJ — : isolats à taux de réplication élevé et capables de provoquer la formation de syncitia ; — — : isolats à taux de réplication élevé qui sont incapables de provoquer la formation de syncitia) . d) Relation entre la capacité d'un isolât à provoquer la formation de syncitia et l'état clinique du patient :
Des isolats capables de provoquer la formation de syncitia ont été détectés, dans la plupart des cas, chez des patients de classe IV, chez des patients présentant moins de 200 cellules CD4+ circulantes par μl et chez des patients présentant un antigenaemie p24 détectable. Ces résultats indiquent que la capacité à provoquer la formation de syncitia est une des propriétés virales associées à 1•état grave de la maladie. Ceci étant, le SIDA peut aussi se présenter en l'absence d'isolats capables d'induire des syncitia.
Les inventeurs ont également mis en évidence, grâce au procédé de l'invention, la présence d'isolats inducteurs de syncitia chez des malades de classe II et III. Ces patients ne présentaient pas d•antigenaemie p24 et n'avaient qu'une baisse modérée des taux de cellules CD4+ circulantes. Le procédé de détection de l'invention peut alors être utilisé dans la détection de patients infectés d'un isolât capable d'induire des syncitia avant le développement de la maladie du SIDA.

Claims

REVENDICATIONS
1. Lignée de cellules indicatrices comportant un récepteur pour un retrovirus et dans leur patrimoine génétique, de préférence sous forme intégrée à leur génome, une séquence génétique recombinante dérivée du même retrovirus ou d'un retrovirus homologue, comprenant à la fois une région tat interne codant pour un transactivateur retroviral et une région tar sous le contrôle d'un premier promoteur et activable par le transactivateur codé par la région tat susdite (stimulation interne) ou par un transactivateur apporté en trans (stimulation externe) par le retrovirus natif ou un retrovirus extérieur venant infecter ces cellules indicatrices, celles-ci étant caractérisées en ce que cette séquence génétique recombinante contient également une séquence agissant comme marqueur, intercalée entre les susdites régions tar et tat dans des conditions entraînant l'activation du marqueur consécutivement à l'activation de la région tar, et en ce que ces cellules indicatrices sont ou ont été rendues telles que l'activation de la région tar sous l'effet de la stimulation interne soit en deçà des activations résultant du cumul de la stimulation interne et d'une stimulation externe.
2. Lignées de cellules, selon la revendication
1, caractérisées en ce que l'activation de la région tar sous l'effet de la stimulation interne est nulle, et par conséquent, le cumul de la stimulation interne et externe n'équivaut qu'à la stimulation externe.
3. Lignée selon l'une des revendications 1 ou
2, caractérisée en ce que ces cellules indicatrices sont dérivées de cellules qui sont normalement aptes à fusionner entre elles pour former des syncitia, lorsqu'elles sont transformées par une séquence env intacte de HIV et lorsque celle-ci est exprimée. lesdites cellules indicatrices étant alors caractérisées, d'une part, par une aptitude réduite à la fusion spontanée et, d'autre part, par une forte aptitude à la fusion lorsqu'elles sont infectées par un retrovirus natif infectieux ou même, lorsqu'elles sont transfectées par un vecteur ou ADN recombinant modifié par une séquence env intacte.
4. Lignée selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est dérivée de la lignée HT4, par exemple le HT4 LacZ-1 (CNCM 1-899).
5. Lignée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le marqueur code pour une enzyme qui confère une coloration particulière aux cellules indicatrices ou la capacité d'agir sur un substrat pénétrant dans celles-ci et subissant in situ une modification de coloration ou plus généralement de son spectre d'absorption des radiations lumineuses.
6. Lignée selon la revendication 5, caractérisée en ce que le marqueur est une séquence LacZ.
7. Lignée selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marqueur est une séquence nlsLacZ.
8. Lignée selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par la présence dans la susdite séquence génétique recombinante d'un second promoteur immédiatement en amont du marqueur dans le sens de la transcription.
9. Procédé mettant en oeuvre les cellules indicatrices selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la détection d'une infection rétrovirale dans un échantillon contenant des cellules éventuellement infectées (tel qu'un prélèvement de sérum humain contenant des lymphocytes T4, s'agissant d'apprécier s'il est infecté par un virus HIV) ou le milieu, tel qu'un surnageant -de culture, avec lequel ces cellules avaient auparavant été en contact, caractérisé par les étapes que constituent :
- la mise en contact de cet échantillon avec lesdites cellules indicatrices, et ce dans des conditions (notamment de température et de durée d'incubation appropriées) permettant l'infection desdites cellules par le retrovirus éventuellement présent dans l'échantillon, et
- la détection de l'infection éventuelle desdites cellules par révélation de l'expression amplifiée du marqueur, et éventuellement la formation de syncitia.
10. Kit permettant la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9, ce kit comportant :
- des cellules indicatrices telles que sus-définies, des moyens de révélation de l'expression du marqueur, notamment lorsque le marqueur est une enzyme, un substrat spécifique de l'enzyme,
- éventuellement les tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la mise en contact, avec l'échantillon biologique, des cellules indicatrices et 1•incubation du mélange de réaction dans des conditions permettant 1'infection éventuelle de ces cellules indicatrices au contact de l'échantillon étudié,
- le cas échéant des milieux de conservation ou de culture desdites cellules saines et modifiées.
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