WO1987003965A1 - Multi-indicator test strips for immuno-assays, their production and use - Google Patents

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WO1987003965A1
WO1987003965A1 PCT/CH1986/000173 CH8600173W WO8703965A1 WO 1987003965 A1 WO1987003965 A1 WO 1987003965A1 CH 8600173 W CH8600173 W CH 8600173W WO 8703965 A1 WO8703965 A1 WO 8703965A1
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WO
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strips
test
antigen
antibody
strip
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Application number
PCT/CH1986/000173
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hana Lefkovits
Original Assignee
Celldynamics Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celldynamics Ag filed Critical Celldynamics Ag
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements

Definitions

  • Multi-indicator test strips for immunological analyzes their production and use
  • a relevant substance is bound covalently or by adsorption forces to a solid support.
  • the relevant substance has a stable, three-dimensional one
  • the sample which may contain the corresponding antibody and is intended for determination, is brought into contact with the U antigen-bound carrier; in this way the binding of a complementary antibody molecule (if antibodies are present in the sample) to the antigen is effected.
  • the binding of the antibody 5 contained in the sample to the corresponding antigen is determined by adding a further or second complementary structure.
  • This complementary structure is usually an antibody that is conjugated to either an enzyme or a radioactive isotope.
  • the solid support consists of the actual test tube, latex particles, Sephadex beads, glass beads, mitrocellulose sheets or even intact cells and tissues [K. Catt and GW Tregear, Science 15 8 j (1967), 1570; H. Towbin and co-workers, Proc. Natl. Acad. Be. (USA) 76, (1979), 43 * 50].
  • the antigen to be bound to this carrier can be any molecule, a subcellular structure, an organelle, an enzyme, a hormone, lymphokines, etc., but also an endogenous substance. Under certain circumstances, even antibodies can behave as antigens.
  • the antibody contained in the sample is a structure that needs to be determined. This molecule can be present both in human or animal serum or another body fluid and in the cell culture supernatant.
  • the second complementary structure is an antibody with specificity for a structure of the antibody contained in the sample.
  • An enzyme or radioactive isotope is bound to this second complementary structure; the connection of the Antikör ⁇ pers and 'the enzyme or the radioactive isotope is: hereinafter referred Konjuga.
  • the color changes are measured after adding a suitable substrate or radioactive decay.
  • the process according to the invention is characterized in that one sheet each of a water-insoluble, porous, homogeneous, adsorbable, polymeric material in a solution or suspension of a different antigen or a different substance (A) acting as an antigen in a living organism, ( A ⁇ ), (A ") etc. can be incubated, the leaves for blocking unoccupied binding sites can be incubated in a solution of proteins not specific for the antigen or the substance and then dried, each leaf cut in parallel lanes and a web of each of the sheets (A), (A '), (A ") etc.
  • the result is a multi-indicator test strip consisting of (a) neutral, non-adsorbing carrier strips made of solid, coherent, non-brittle material for the biological fluid to be analyzed, on which (b) square test surfaces made of water-insoluble porous, homogeneous, adsorbable polymer. Material. -. -
  • test surfaces each (c) a different antigen or another, in a living organism nism act as an antigen substance (A), (A '), (A ") etc. in a uniform distribution and not be affected by the antigen or the substance (A), (A'), (A") etc. set binding sites of the test areas are blocked by (d) proteins not specific for the antigen or the substance.
  • the new test strips (with the adsorbed antigens or substances (A), (A '), (A ”) etc. which act as antigens in a living organism) are used to identify and quantify a specific antibody (B) in one biological fluid to be examined by allowing said or said test strips to be incubated in the liquid to be examined, optionally containing the antibody (B), and then freed from the unbound components of the liquid by washing, the test strip (s) in a solution of a conjugate ( CD), which consists of an antibody (C) complementary for the antibody to be determined in the liquid and an enzyme covalently bound to the latter, radioactive isotope, fluorescent agent or coloring agent (D), and then incubated by the Unbound portion of the conjugate (CD) freed by washing, and the presence and amount of the antibody (B) un ter utilization of the enzymatic reaction, the radioactivity, the fluorescence or the color of component (D) of the substance formed on the test strip (s) (ABCD).
  • CD conjugate
  • CD which
  • the sheet used for the uptake and binding of the antigens can generally be made from any suitable, i.e. consist of water-insoluble, .porous, homogeneous, adsorbable polymeric material. Among other things, they are suitable for this purpose, without this list being intended to be conclusive: natural and chemically modified carbohydrates, e.g. Regenerated cellulose
  • Cellulose (chemical cellulose fibers), cellulose esters such as cellulose acetate, nitrocellulose etc., cellulose ethers such as highly etherified methyl cellulose, ethyl cellulose etc., crosslinked dextran and starch products, then fully synthetic polymeric compounds, e.g. from the series of polyvinyl compounds such as polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyethylene, polypropylene, polystyrene etc., from the series of polyacrylic compounds such as the polyacrylates and polymethacrylates, the rolyacrylairi ⁇ e etc., or from the series of polymeric organic condensation products, e.g. Polyamides, polyurethanes, polyesters, polyepoxides etc.
  • polyvinyl compounds such as polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyethylene, polypropylene, polystyrene etc.
  • polyacrylic compounds such as the polyacrylates and polymethacrylates, the rolyacrylair
  • Sheets of nitrocellulose are preferred, whose natural adsorption capacity and binding capacity for antigens are quite sufficient for the purposes of the invention.
  • sheets made of nitrocellulose of the HAWG type from Millipore Corporation can be used; among others, those with an average pore size of 0.01 to 10 m, e.g. from 0.5 ⁇ m
  • the carrier film on which the individual antigen webs are bound can be made in general any suitable, ie solid, coherent, non-brittle material, which should also be neutral and non-adsorbing for the biological fluid to be analyzed. Suitable for this purpose include other films made of appropriate plastics, glass, porcelain, wood and the like. Thin films made of non-porous polyethylene or polypropylene are preferred.
  • the solid support preferably a nitrocellulose sheet from Schleicher and Schuell GmbH (Dassel, FRG) of 21 cm x 21 cm, is soaked in the solution or suspension of the antigen substance.
  • Schleicher and Schuell GmbH Dassel, FRG
  • Carrier depends on the nature of the antigen substance
  • the solution or suspension usually contains the antigen substance in excess, so that several nitrocellulose sheets can be treated in succession in one and the same solution or suspension.
  • the nitrocellulose sheet is removed from the solution or suspension of the antigen substance and immersed in a solution of bovine serum albumin or rabbit serum in order to block the binding sites which may not be occupied. The leaf is then dried.
  • the nitrocellulose sheet is cut into sheets approximately 3 mm wide. About 60 sheets are obtained from one sheet. 4. Steps 1-3 are repeated with further antigen substances and in each case a new nitrocellulose sheet. Binding conditions, temperature and pH can be individually adapted to the respective antigen substance. 5.
  • a solid plastic film (for example made of polypropylene, manufacturer: Papyrus AG, Basel) of 10 cm x 20 cm is provided with a double-sided adhesive tape, and one sheet of each of the nitrocellulose sheets treated with the antigen substance is glued onto the plastic film.
  • the spacing between the individual tracks can be chosen freely; However, a close arrangement with a distance of approximately 1 mm is advantageous.
  • a typical test strip is 8 cm long, 3 mm wide and has 10 areas of 3 x 3 mm each with a spacing of 1 mm, the lower half of the strip accommodating all 10 test strips and the upper half serving as a grip area.
  • test strip is used for immunological analysis (EIA) as follows:
  • a strip is immersed in the test liquid and left to incubate for one hour.
  • Unbound components of the test liquid are removed by immersing the strip in containers filled with water or a buffer solution.
  • the strip is immersed in an antibody-enzyme conjugate and allowed to incubate for one hour.
  • the unbound portion of the conjugate is removed by washing the strip in a container filled with water or a buffer solution.
  • the strip is immersed in a substrate solution. After the reaction, the discoloration (or other changes) of the individual areas of the strip are measured.
  • each test strip is immersed in a tube of diluted serum (usually 1/100 to 1/1000 dilutions) and allowed to incubate for one hour with occasional agitation of the strips.
  • the strip is then washed in tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer in physiological saline, pH 7.5 (TBS buffer) and incubated in the solution of an enzyme-antibody conjugate (dilution 1/1000) for a further hour. After 15 minutes of washing in TBS buffer, the strip is immersed in a substrate specific for the enzyme and, after 15 minutes of reaction, washed, dried and evaluated.
  • test strips according to the invention are distinguished by the following advantages:
  • the small square test areas have the greatest possible homogeneity and there are therefore no edge effects, as can be the case with Gordon's dropping method.
  • the test areas attached to the strips are, for example, 3 "3 mm in size, but they can certainly be miniaturized to a size of, for example, 0.3 x 0.3 mm.
  • the Gordon method is in this With regard to limits.
  • Antigen with low binding ability can achieve an improved total binding in this process by repeated soaking. This is difficult to do with the dot immunoassay.
  • the advantage of the new test strips when they are used for the actual analysis is that they consist of a relatively rigid material and are therefore easy to handle; at one end you can touch the strip, add a code, label it and manipulate it as you wish.
  • the test strips can be immersed in tubes, individual strips or groups of strips can be removed from the solution (tube or other container) by hand or by means of a "comb", washed under the water jet or by immersing them in a washing liquid, etc.
  • strips to be used for the dot immunoassay are incubated in horizontal containers; the individual strips must be handled with a pincer or another device; the washing processes are accordingly complicated and cumbersome.
  • both methods ie the dot immunoassay and the present method, are equivalent.
  • Densitometry makes it easy to align the measurement beam in the new system, since a uniform distribution of the antigen is ensured over the entire width of the strip.
  • the measurement beam In the Gordon dot immunoassay, the measurement beam must pass exactly through the center of the spot or else capture and integrate the entire spot, otherwise the
  • Nitr ⁇ cellulose sheets of 21 cm x 21 cm are immersed in tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer in physiological saline, pH 7.5 (TBS buffer).
  • 50 ml of the following antigen solutions are placed in 10 plastic containers measuring 23 cm x 23 cm with a pipette: (a) rabbit immunoglobulin, (b) lysate from HeLa cells, (c) nuclear antigen, (d) salmon DNA, (e) mitochondria, (f) streptolysin 0, (g) histone, (h) single-stranded DNA, (i) normal rabbit serum, (j) control TBS buffer.
  • Each of the moistened nitrocellulose sheets is placed in one of the plastic containers (a) to (j) and incubated for 2 hours at room temperature.
  • the nitrocellulose sheets (a) to (h) are then immersed (if necessary after drying) in 3 fc-normal rabbit serum in order to block the free binding sites.
  • Nitrocellulose sheet (i) is in the original Leave container in.
  • Leaf (j) does not come into contact with the rabbit serum and serves as an unblocked control. After 30 minutes, all leaves are removed from the solutions and air-dried.
  • Leaf (d) is dried in a hot air cabinet at 8 ° C. .
  • 60 polypropylene films of 10 cm x 20 cm are provided with double-sided adhesive tape 665 (manufacturer: Minnesota Mining and Manufacturing Co., St. Paul, MN / USA).
  • the pasted area corresponds to 4 cm x 20 cm.
  • Each of the 10 nitrocellulose sheets is cut into 3 mm wide strips using a precision cutting machine. In this way, 60 sheets are obtained from each of the 10 nitrocellulose sheets.
  • the individual webs are glued onto the polypropylene film in the order (a) to (j).
  • the foil matrices created in this way are then vertically in 3 mm wide strips cut (Fig. 3) - 3600 test strips are obtained in this way.
  • the antigen substances are the following molecules: (a) antibody against mouse - ⁇ chain, (b) antibody against mouse - chain, (c) antibody against mouse "chain,. (D) antibody against mouse. Chain , (e) Antibody against mouse ⁇ chain, (f) Antibody against mouse f chain, all of these antibodies were produced in rats.
  • the test strips in hybridoma cell cultures [G. Köhler and C.
  • miniaturized strips for its determination in small volumes, the miniaturization consisting of, on the one hand, webs of 1.5 mm width and, in addition, two foils different Stick the color back to back so that both sides of the strip can be used for analysis.
  • the different " film color serves as a color code. 1.5 ' mm was chosen as the strip width.
  • TBS Tris-buffered isotonic saline, pH 7.5
  • rabbit serum 3% rabbit serum.
  • To two tubes are added to 20 ul each and to the other two tubes 2 ul of test serum.
  • One test strip each is immersed in a tube and allowed to incubate for 1 hour at room temperature with occasional movement. The strips are then removed from the tubes and washed for 15 minutes ⁇ h excess TBS (cup content 100 ml).
  • conjugate solution antibodies produced in rabbits with a specificity against human immunoglobulins, coupled with peroxidase, are commercially available from Dakopatts, Copenhagen /
  • Tube prepared with substrate solution For 10 ml of substrate solution, 0.6 ml of 4-chloronaphthol stock solution (the stock solution contains 3 mg of 4-chloronaphthol in 1 ml of methanol) and 4 ⁇ l of H 2 0 2 (30%) are added to 9.4 ml of TBS. Each 2 ml of substrate 'are pipetted into each tube, and the dipped a strip in its content. After 15 minutes, the strips are removed from the tube and washed in distilled water. The color reaction is read either with the naked eye or with the densitometer. A blue colored area indicates a positive reaction. As a rule, only some of the surfaces will change color. These are then positive for the corresponding antibody.
  • a test with nine sera and a negative control was carried out.
  • the negative control consists of 3% rabbit serum, and the possible staining of individual areas of the strip provides information about non-specific binding of the conjugate.
  • three were positive controls.
  • Positive control means sera in which antibodies have been previously detected by another method. In this case, 'it was a serum that was positive for anti-DNA antibody, another serum was positive for streptolysin antibodies and the third serum positive for rheumatoid factor.
  • Six sera were previously non-analyzed patient samples s in which an independent determination of the antibodies only after the
  • the comparative tests were the Crithidia test for the anti-DNA antibodies [LA-Aarden and R. Smeenk, Immunological Methods, editor I. Lefkovits and B. Pernis, Vol. 2, page 75 (1981)], the HäiiDlyse inhibition -Test for the streptolysin antibodies [K. Kalbak, Acta . Med. ' Scand. 130 (1984) ' , 358] and an enzyme immunoassay in microtiter plates for the rheumatoid factor [A. Faith and co-workers, J. Immunol. Methods 55 (1982), 169].
  • Tests were considered all four strips to avoid false positives and false negatives.
  • the test is false positive if the coloring is produced by a non-specific binding; Under certain circumstances, this can occur either when the concentration of irrelevant serum proteins is too high or when the concentration of conjugate is too high.
  • the test is false negative if the staining to be performed does not occur due to excessive dilution of the specific serum components or the conjugate.
  • Serum 1 positive for streptolysin serum 2 positive for streptolysin, serum 3 negative for all tested antigens, serum 4 positive for the rheumatoid factor, serum 5 negative for all tested antigens, serum 6 positive for streptolysin, the rheumatoid factor and anti-DNA.

Description

Multiindikator-Teststreifen für immunologische Analysen, ihre Herstellung und Verwendung
Die Verfahren und Methoden sowohl der Radioim- 5 munoassay (RIA) als auch der Enzymimmunoassay (EIA) sind aus methodologischen Aspekten der Grundlagenforschung ent¬ wickelt worden [E. Engvall und P. Perlmann, Immunochemistry 8_ (197D, 1971]; sie sind allgemein bekannt.
0 Ganz allgemein sind für diese Verfahren und
Methoden drei Schritte charakteristisch:
1. Eine relevante Substanz wird kovalent oder durch Adsorp¬ tionskräfte an einen festen Träger gebunden. Die rele- 5 vante Substanz weist eine stabile, dreidimensionale
Struktur auf und wird im folgenden als Antigen bezeich¬ net.
2. Die gegebenenfalls den entsprechenden Antikörper enthal¬ tende, zur Bestimmung vorgesehene Probe wird mit dem U Antigen-gebundenen Träger in Kontakt gebracht; auf diese Weise wird die Bindung eines komplementären Anti¬ körpermoleküls (wenn in der Probe Antikörper vorhanden sind) an das Antigen bewirkt.
3. Die Bindung des in der Probe enthaltenen Antikörpers 5 an das entsprechende Antigen wird durch Zugabe einer weiteren bzw. zweiten komplementären Struktur bestimmt. Diese komplementäre Struktur ist meist ein Antikörper, der entweder mit einem Enzym oder einem radioaktiven Isotop konjugiert ist. 0
Der feste Träger besteht in den meisten Fällen aus dem eigentlichen Teströhrchen, aus Latex-Par ikeln, Sephadex-Perlen, Glas-Perlen,' Mitrocellulose-Blättern oder auch aus intakten Zellen und Geweben [K. Catt und G.W. Tregear, Science 15j8 (1967), 1570; H. Towbin und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76, (1979), 43*50]. Das Antigen, das an diesen Träger gebunden werden soll, kann ein beliebiges Molekül, eine subzelluläre Struktur, eine Organell-e, ein Enzym, ein Hormon, Lymphokine usw. sein, aber auch eine körpereigene Substanz. Selbst Anti¬ körper können sich unter Umständen als Antigene verhalten. Der in der Probe enthaltene Antikörper ist eine Struktur, die es zu bestimmen gilt. Dieses Molekül kann sowohl in humanem oder tierischem Serum oder einer anderen Körper¬ flüssigkeit als auch im Zellkulturüberstand vorhanden sein.
Die zweite komplementäre Struktur ist in den meisten Fällen ein Antikörper mit Spezifität für eine Struktur des in der Probe enthaltenen Antikörpers. An diese zweite komplementäre Struktur ist ein Enzym oder radioaktives Isotop gebunden; die Verbindung des Antikör¬ pers und' des Enzyms bzw. des radioaktiven Isotopes wird : im folgenden Konjuga genannt. Zur Messung gelangen die Farbveränderungen nach Zugabe eines geeigneten Substrates bzw. der radioaktive Zerfall.
Daraus wurde in' den letzten Jahren ein Verfahren entwickelt, welches in der Literatur als "Dot-Immunoassay" von Gordon bekannt ist [europäische Patentanmeldung 63 810; J. Gordon und M. Rosenthal, J. Rheumatol. L2 (1985), 257 - 264]. Nach diesem Verfahren werden die Antigensubstanzen in Form von kleinen Tröpfchen (0,5 ul) auf einen Nitrocellu- losestreifen aufgetragen; die Auswertung der Ergebnisse wird mit Vorteil durch Densitometrie vorgenommen.
Ueberraschenderweise wurde nun ein Verfahren gefunden, durch welches neuartige Multiindikator-Testreifen erhalten werden, welche von den den Streifen von Gordon innewohnenden Beschränkungen frei sind und die serien¬ weise Durchführung von immunologischen Analysen auf be¬ sonders elegante und sichere Art ermöglichen. Insbeson¬ dere können dabei alle analytischen Schritte, unter glei- chen Bedingungen für alle Antikörper-Antigen-Bindungen, gleichzeitig durchgeführt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man je ein Blatt eines wasserunlöslichen, porösen, homogenen, adsorptionsfähigen, polymeren Materials in einer Lösung oder Suspension eines jeweils anderen Antigens oder einer jeweils anderen, in einem lebenden Organismus als Antigen wirkenden Substanz (A), (Aτ), (A") usw. inkubieren lässt, die Blätter zur Blockierung von nicht besetzten Bindungsstellen in einer Lösung von für das Antigen. oder die Substanz nicht spezifischen Proteinen inkubieren lässt und danach trocknet, jedes Blatt in paral¬ lele Bahnen schneidet und je eine Bahn eines jeden der Blätter (A), (A'), (A") usw. auf einer Trägerfolie aus festem, zusammenhängendem, nicht brüchigem, für die zu analysierende biologische Flüssigkeit neutralem, nicht adsorbierendem Material derart befestigt, dass die Bah¬ nen parallel nebeneinander liegen, und den entstandenen Bahnen-Trägerfolieverbund in parallele Streifen, quer zur Längsrichtung der zuvor befestigen Bahnen schneidet, so dass jeder Streifen in -nebeneinander angeordneten, voneinander getrennten viereckigen Testflächen die Anti¬ gene oder Substanzen (A), (A1), (A") usw. trägt.
Erhalten werden also Multiindikator-Teststreifen, bestehend aus (a) für die zu analysierende biologische Flüssigkeit neutralen, nicht adsorbierenden Trägerstreifen aus festem, zusammenhängenden., nicht brüchigem Material, auf welchen (b) viereckige Testflächen aus wasserunlöslichem porösem, homogenem, adsorptionsfähigerπ, polymeren. Material. - . -
von der Breite der Trägerstreifen, in voneinander ge¬ trennter Anordnung nebeneinander befestigt sind, derart, dass an einem Ende der Streifen eine Grifffläche freige¬ lassen ist, wobei besagte Testflächen jeweils (c) ein anderes Antigen oder eine andere,in einem lebenden Orga¬ nismus als Antigen wirkende Substanz (A), (A'), (A") usw. in einheitlicher Verteilung tragen und die durch das Antigen oder die Substanz (A), (A'), (A") usw. nicht be¬ setzten Bindungstellen der Testflächen durch (d) für das Antigen oder die Substanz nicht spezifische Proteine blockiert sind.
Die neuen Teststreifen (mit den adsorbier¬ ten Antigenen oder in einem lebenden Organismus als Antigen wirkenden Substanzen (A), (A'), (A") usw.)werden zur Iden¬ tifizierung und Quantifizierung eines spezifischen Antikörpers (B) in einer zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit verwendet, indem man besagten oder besagte Teststreifen in der zu untersuchenden, gegebenenfalls den Antikörper (B) enthaltenden Flüssigkeit inkubieren lässt und danach von den nicht gebundenen Komponenten der Flüssigkeit durch Waschen befreit, den oder die Teststreifen in einer Lösung eines Konjugates (CD), welches aus einem für den in der Flüssigkeit zu bestimmenden Antikörper (B) komplementären Antikörper (C) und einem an letzteren kovalent gebundenen Enzym, radioaktiven Isotop, fluores¬ zierenden Mittel oder Färbemittel (D) besteht, inkubieren lässt und danach von dem nicht gebundenen Anteil des Kon¬ jugates (CD) durch Waschen befreit, und die Anwesenheit und Menge des Antikörpers (B) unter Ausnutzung der enzy- matischen Reaktion, der Radioaktivität, der Fluoreszenz bzw. der Farbe der Komponente (D) des auf dem oder den Teststreifen gebildeten Stoffes (ABCD) bestimmt. Im folgenden wird die Erfindung ausführlicher erläutert.
Das Blatt, das zur Aufnahme und Bindung der Antigene dient, kann ganz allgemein aus jedem geeigneten, d.h. wasserunlöslichen, .porösen, homogenen, adsorptions¬ fähigen, polymeren Material bestehen. Es eignen sich dazu unter anderen, ohne dass diese Aufzählung abschlies- senden Charakter haben soll: natürliche und chemisch ab- gewandelte Kohlehydrate, z.B. Cellulose, regenerierte
Cellulose (Cellulose-Chemiefasern), Celluloseester, wie Celluloseacetat, Nitrocellulose usw, Celluloseether wie hochveretherte Methylcellulose, Ethylcellulose usw., ver¬ netzte Dextran- und Stärkeprodukte, sodann vollsynthetische polymere Verbindungen, z.B. aus der Reihe der Polyvinyl- verbindungen wie Polyvinylchlorid, Pol inylacetat, Poly- ethylen, Polypropylen, Polystyrol usw., aus der Reihe der Polyacrylverbindungen wie die Polyacrylate und Poly- methacrylate, die rolyacrylairiαe usw., oder aus der Reihe der polymeren organischen Kondensationsprodukte, z.B. Polyamide, Polyurethane, Polyester, Polyepoxide usw.
Bevorzugt werden Blätter aus Nitrocellulose, deren natürliche Adsorptionsfähigkeit und Bindungsfähig- keit für Antigene den Zwecken der Erfindung durchaus ge¬ nügen. Beispielsweise können Blätter aus Nitrocellulose vom Typus HAWG der Firma Millipore Corporation (Bedford, MA/USA) verwendet werden; es eignen sich unter anderen solche mit einer durchschnittlichen Porengrösse von 0,01 bis 10 m, z.B. von 0,5 μm-
Die Trägerfolie, auf welcher die einzelnen Antigenbahnen gebunden werden, kann ganz allgemein aus jedem geeigneten, d.h. festen, zusammenhängenden, nicht¬ brüchigen Material, das zudem für die zu analysierende biologische Flüssigkeit neutral und nicht adsorbierend sein soll, bestehen. Es eignen sich dazu unter anderen Folien aus entsprechenden Kunststoffen, aus Glas, Por¬ zellan, Holz- und dergl.. Bevorzugt werden dünne Folien aus nicht porösem Polyethylen oder Polypropylen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Er- findung wird folgendermassen vorgegangen (Fig. 1) :
1. Der feste Träger, am besten ein Nitrocellulose-Blatt der Firma Schleicher und Schuell GmbH (Dassel, BRD) von 21 cm x 21 cm, wird mit der Lösung oder Suspension der Antigensubstanz getränkt. Die Bind'ungskapazität des
Trägers hängt von der Beschaffenheit der Antigensubstanz
2 ab und liegt in der Grδssenordnung von 100 iiς/cm und mehr. Die Lösung oder Suspension enthält die Antigensub- stanz meist im Ueberschuss, so dass mehrere Nitrocellu- lose-Blätter in ein und derselben Lösung oder Suspension nacheinander behandelt werden können.
2. Das Nitrocellulose-Blatt wird nach einer Inkubations¬ zeit von 1-2 Stunden aus der Lösung oder Suspension der Antigensubstanz herausgenommen und in eine Lösung von Rinderserumalbumin oder Kaninchenserum eingetaucht, um die eventuell nicht besetzten Bindungsstellen zu blockieren. Danach wird das Blatt getrocknet.
3. Das Nitrocellulose-Blatt wird in ca. 3 mm breite Bahnen geschnitten. Aus einem Blatt erhält man ca. 60 Bahnen. 4. Die Schritte 1-3 werden mit weiteren Antigensubstanzen und jeweils einem neuen Nitrocellulose-Blatt wiederholt Bindungsbedingungen, Temperatur und pH-Wert können der jeweiligen Antigensubstanz individuell angepasst werden. 5. Eine feste Kunststofffolie (beispielsweise aus Poly¬ propylen, Hersteller: Papyrus AG, Basel) von 10 cm x 20 cm wird mit einem Doppelklebeband versehen, und je eine Bahn der mit der Antigensubstanz behandelten Nitrocellulose-Blätter wird auf die Kunststofffolie aufgeklebt. Die Zwischenabstände der einzelnen Bahnen können frei gewählt werden; vorteilhaft ist jedoch eine enge Anordnung mit einem Abstand von ca. 1 mm.
6. Die auf solche Weise behandelte Kunststofffolie wird danach vertikal in einzelne Streifen geschnitten.
Jeder Streifen (ca. 3-4 mm breit) enthält alle zuvor benutzten Antigensubstanzen. Auf das ganze Nitrocellu¬ lose-Blatt errechnet, ergibt dies 60 mit entsprechenden Bahnen beklebte Kunststofffolien und davon 60 x 60 = 3600 Teststreifen
Ein typischer Teststreifen ist 8 cm lang, 3 mm breit und weist 10 Flächen von je 3 x 3 mm mit einem Zwischenabstand von jeweils 1 mm auf, wobei die untere Hälfte des Streifens alle 10 Teststreifen beherbergt und die obere Hälfte als Grifffläche dient.
Der Teststreifen wird für die immunologische Analyse (EIA) wie folgt verwendet:
- In die Testflüssigkeit wird ein Streifen eingetaucht und eine Stunde inkubieren gelassen.
- Nichtgebundene Komponenten der Testflüssigkeit werden durch Eintauchen des Streifens in mit Wasser oder einer Pufferlösung gefüllte Behälter entfernt.
- Der Streifen wird in ein Antikörper-Enzym-Konjugat ein- • getaucht und eine Stunde inkubieren gelassen. - Der nichtgebundene Anteil des Konjugates wird durch Waschen des Streifens in einem mit Wasser oder einer Pufferlösung gefüllten Behälter entfernt.
- Der Streifen wird in eine Substratlösung eingetaucht. Nach dem Reaktionsablauf werden die Verfärbung (oder andere Veränderungen) der einzelnen Flächen des Streifens gemessen.
Beispielsweise wird jeder Teststreifen in ein Röhrchen mit verdünntem Serum (meistens Verdünnungen 1/100 bis 1/1000) eingetaucht und eine Stunde unter gelegentlicher Bewegung der Streifen inkubieren gelassen. Anschliessend wird der Streifen in Tris(hydroxymethyl)-aminomethan- Puffer in physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,5 (TBS- Puffer) gewaschen und in der Lösung eines Enzym-Antikörper- Konjugates (Verdünnung 1/1000) eine weitere Stunde in¬ kubiert. Nach 15 Minuten Waschvorgang in TBS-Puffer wird der Streifen in ein für das Enzym spezifisches Substrat eingetaucht und nach 15 Minuten Reaktionsablauf gewaschen, getrocknet und ausgewertet.
Gegenüber dem bereits erwähnten sogenannten Dot-Immunoassay bzw. dem Verfahren nach Gordon zeichnen sich die erfindungsgemässen Teststreifen und ihre Ver- wendung durch folgende Vorteile aus:
la) Die kleinen viereckigen Testflächen weisen eine grösstmögliche Homogenität auf und es kommen daher keine R.andeffekte auf, wie dies bei dem Tropf- chen-Verfahren von Gordon der Fall sein kann. b) Die auf den Streifen befestigten Testflächen sind zwar beispielsweise 3 " 3 mm gross, sie können aber durchaus auf eine Grosse von z.B. 0,3 x 0,3 mm mi¬ niaturisiert werden. Dem Gordon-Verfahren sind jedoch durch die Tröpfchenkoaleszenz in dieser Hinsicht Grenzen ge¬ setzt. c) Gemäss dem Gordon-Verfahren können zwar viele Tröpf¬ chen nebeneinander aufgetragen werden, die Auftragungs¬ weise (Adsorption) jedoch muss für alle Tröpfchen gleich sein. Das Gordon-Verfahren ist also nicht an- gezeigt in Fällen, in welchen ein Antigen (z.B. doppeistrangige DNS) das Zustandekommen einer kovalenten Bindung er¬ fordert. Bei Anwendung hoher "Einbacktemperaturen" müssen alle Tröpfchen das gleiche Verfahren unter¬ laufen, während bei dem neuen Verfahren jedes Blatt individuell und beliebig behandelt werden kann. Ein
Antigen mit geringer Bindungsgähigkeit kann in diesem Verfahren durch wiederholte Tränkung eine verbesserte Gesamtbindung erreichen. Mit dem Dot-Immunoassay ist dies schwierig zu bewerkstelligen. 2.. Der Vorteil der neuen Teststreifen bei ihrer Verwen¬ dung für die eigentliche Analyse besteht darin, dass sie aus einem relativ steifen Material bestehen und somit mühelos zu handhaben sind; am einen Ende kann man den Streifen anfassen, mit einem Code versehen, beschriften und beliebig manipulieren. Die Teststrei¬ fen können in Röhrchen eingetaucht, einzelne Streifen oder Gruppen von Streifen von Hand oder mittels eines "Kamms" aus der Lösung (Röhrchen oder anderen Behäl¬ tern) herausgenommen, unter dem Waserstrahl oder durch Eintauchen in eine Waschflüssigkeit gewaschen werden usw. Die für das Dot-Immunoassay zu verwendenden Strei¬ fen hingegen werden in horizontalen Behältern inku¬ biert; die einzelnen Streifen müssen mit einer Pin¬ zette oder einer anderen Vorrichtung angefasst werden; die Waschvorgänge sind dementsprechend kompliziert und umständlich.
3. Bei der Auswertung mit blossem Auge sind beide Ver¬ fahren, d.h. das Dot-Immunoassay und das vorliegende Verfahren, gleichwertig. Bei der Auswertung durch Densitometrie hingegen ist die Ausrichtung des Mes¬ sungsstrahls im neuen System problemlos, da eine einheitliche Verteilung des Antigens auf der ganzen Breite des Streifens gewährleistet ist. Bei dem Dot- Immunoassay von Gordon muss der Messungsstrahl genau durch die Mitte des Tupfens gehen oder aber den gan¬ zen Tupfen erfassen und integrierden, ansonsten die
Messung fehlerhaft ist.
Darüber hinaus besteht nun die Möglichkeit, neue
Antigene, die sich noch in der Erforschungsphase befinden, neben den bereits bekannten Antigenen in die Analyse mit- einzubeziehen und dadurch eine höhere Zuverlässigkeit der Aussage zu erreichen.
Betrachtet man abschliessend die Herstellung der Teststreifen und ihre Verwendung mitsamt der an- schliessenden Auswertung der Ergebnisse, so hat die Erfindung insgesamt im Vergleich.mit den herkömmlichen Methoden eine nicht zu erwartende, drastische Vereinfa¬ chung aller massgeblichen Schritte mit sich gebracht. Zum ersten Mal eröffnet sich dadurch eine praktische Möglichkeit, aus einer Sammlung vorgefertigter Antigen- bahnen Teststreifen von jeder beliebigen Antigenzusam- mensetzung für einzelne Patientengruppen oder spezielle Bedingungen (Epidemien, geo-spezifische Gegebenheiten) sofort und auf einfache Art anzufertigen. Beispiel 1
10 Nitrόcellulose-Blätter von 21 cm x 21 cm werden in Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer in physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,5 (TBS-Puffer) eingetaucht. Gleich- zeitig werden in 10 Kunststoffbehälter von 23 cm x 23 cm je 50 ml der folgenden Antigenlösungen mit einer Pipette gegeben: (a) Kaninchen-Immunglobulin, (b) Lysat von HeLa- Zellen, (c) Nuklearantigen, (d) Lachs-DNS, (e) Mitochon- drien, (f) Streptolysin 0, (g) Histon, (h) einstrangiges DNS, (i) normales Kaninchenserum, (j) Kontroll-TBS-Puffer.
Jedes einzelne der befeuchteten Nitrocellulose- Blätter wird in einen der Kunststffbehälter (a) bis (j) eingelegt und 2 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Nitrocellulose-Blätter (a) bis (h) werden anschliessehd (gev;ünsch"cenfalls nach Trocknung) in 3 fc-iges normales Kaninchenserum eingetaucht, um die freien Bindungsstellen zu. blockieren. Nitrocellulose-Blatt (i) wird im ursprüng¬ lichen Behälter belassen. Blatt (j) kommt mit dem Kanin- chenserum nicht in Kontakt und dient als nicht-blockierte Kontrolle. Nach 30 Minuten werden alle Blätter aus den Lösungen genommen und luftgetrocknet. Blatt (d) wird in einem Heissluftschrank bei 8θ°C getrocknet.
60 Polypropylenfolien von 10 cm x 20 cm werden mit doppelseitigem Klebeband 665 (Hersteller: Minnesota Mining and Manufacturing Co., St. Paul,MN/USA) versehen. Die beklebte Fläche entspricht 4 cm x 20 cm. Jedes der 10 Nitrocellulose-Blätt-er wird mit einer Präzisionsschneide maschine in 3 mm breite Bahnen geschnitten. Aus jedem der 10 Nitrocellulose-Blätter erhält man auf diese Weise 60 Bahnen. In der Reihenfolge (a) bis (j) werden die ein¬ zelnen Bahnen auf die Polypropylenfolie aufgeklebt. Die so erstellten Folienmatrizen werden sodann vertikal in 3 mm breite Streifen geschnitten (Abb. 3)- Auf diese Weise erhält man 3600 Teststreifen.
Beispiel 2
Das Verfahren bis zur Herstellung der Streifen ist jenem von Beispiel 1 identisch. Je 12 fertige Strei¬ fen werden in Form eines Kamms zusammengefasst und auf eine Pappunterlage aufgeklebt (Abb. 4), so dass 12 Proben parallel und gleichzeitig analysiert werden können.
Beispiel 3
Der Ablauf des Verfahrens ist jenem von Beispiel 1 identisch. Die Antigensubstanzen sind jedoch folgende Moleküle: (a) Antikörper gegen Maus -μ-Kette, (b) Antikör- per gegen Maus - -Kette, (c) Antikörper gegen Mause " Kette, .(d) Antikörper gegen Maus- . -Kette, (e) Antikör¬ per gegen Maus-Λ-Kette, (f) Antikörper gegen Maus-f-Kette. Alle diese Antikörper wurden in Ratten produziert. Für die Bestimmung des Immunglobulinisotyps wurden die Test- streifen in Hybridom-Zellkulturen [G. Köhler und C. Mil- stein, Nature (London) 6 (1975), 495] und für dessen Bestimmung in kleinen Volumen miniaturisierte Streifen verwendet. Die Miniaturisierung besteht darin, einerseits Bahnen von 1,5 mm Breite und ausserdem zwei Folien ver- schiedener Farbe Rücken an Rücken aufzukleben, um auf diese Weise beide Seiten des Streifens für die Analyse verwenden zu können. Die verschiedene"Folienfarbe dient als Farbcode. Als Streifenbreite wurde 1,5' mm gewählt.
Beispiel 4
Vier Röhrchen (Innendurchmesser 7 mm) werden mit je 2 ml TBS (Tris-gepufferte isotonische Salzlösung, pH 7,5), enthallend 3 % Kaninchenserum, gefüllt. Zu zwei Röhrchen werden je 20 ul und zu den anderen zwei Röhrchen je 2 μl Testserum zugegeben. Je ein Teststreifen wird in ein Röhrchen eingetaucht und 1 Stunde bei Zimmer¬ temperatur unter gelegentlicher Bewegung inkubieren gelas- sen. Anschliessend werden die- Streifen aus den Röhrchen herausgenommen und 15 Minuten ±h Ueberschuss TBS (Becher¬ inhalt 100 ml) gewaschen. Inzwischen werden vier Röhrchen mit Konjugatlösung (in Kaninchen produzierte Antikörper mit einer Spezifität gegen menschliche Immunglobuline, mit Peroxidase gekoppelt, im Handel von Dakopatts, Kopenhagen/
Dänemark, erhältlich) vorbereitet. Zwei der Röhrchen werden mit einer Verdünnung (in TBS + ■ _. % Kaninchenserum) 1/100 und die anderen zwei mit 1/1000 versehen (je 2 ml) . Die gewaschenen Streifen werden nach folgendem Schema in die Konjugatlösungen eingetaucht: Serum 1/100, Konjugat 1/100; Serum 1/100, Konjugat 1/1000; Serum 1/1000, Konjugat 1/100; Serum 1/1000, Konjugat 1/1000. Nach 45 Minuten werden die Streifen aus der Konjugatlösung herausgenommen und der nichtgebundene Anteil des Konjugats in Ueberschuss TBS gewaschen (Becherinhalt 100 ml). Inzwischen werden vier .
Röhrchen mit Substratlösung vorbereitet. Für 10 ml Substrat- lösung werden 0,6 ml 4-Chlornaphthol-Stocklδsung (die Stocklösung beinhaltet 3 mg 4-Chlornaphthol in 1 ml Methanol) und 4 μl H202 (30 % ) zu 9,4 ml TBS zugegeben. Je 2 ml Substrat' werden in jedes Röhrchen pipettiert, und je ein Streifen in deren Inhalt eingetaucht. Nach 15 Minuten werden die Streifen aus dem Röhrchen entfernt und in destilliertem Wasser gewaschen. Die Farbreaktion wird entweder mit dem blossen Auge oder mit dem Densitometer abgelesen. Eine blaugefärbte Fläche gibt eine positive Reaktion an. In der Regel werden sich nur einige der Flächen färben. Diese sind dann für den entsprechenden Antikörper positiv. Beispiel 5
Ein Test mit neun Seren und einer negativen Kontrolle wurde durchgeführt. Die negative Kontrolle besteht aus 3 % Kaninchenserum, und die eventuelle Fär- bung einzelner Flächen des Streifens gibt Auskunft über eine unspezifische Bindung des Konjugats. Von den neun Seren waren drei positive Kontrollen. Unter positiver Kontrolle versteht man Seren, in welchen Antikörper im voraus nach einer anderen Methode nachgewiesen worden sind. In diesem Falle handelte 'es sich um ein Serum, das positiv für anti-DNS-Antikörper war, ein anderes Serum war positiv für Streptolysin-Antikörper und das dritte Serum positiv für den Rheumafaktor. Sechs Seren waren vorher nicht-analysierte Patientenserens in welchen eine unabhängige Bestimmung der Antikörper erst nach der
Analyse mit dem Teststreifen erfolgte, um die Korrelation zwischen dem neuen Multiindikator-Teststreifen und bis¬ herigen Tests festzustellen. Die Vergleichstests waren der Crithidia-Test für die anti-DNS-Antikδrper [L.A.- Aarden und R. Smeenk, Immunological Methods, Herausgeber I. Lefkovits und B. Pernis, Bd. 2, Seite 75 (1981)], der HäiiDlyse-inhibition-Test für die Streptolysin-Antikörper [K. Kalbak, Acta.Med.'Scand. 130 (1984)', 358] und ein Enzymimmunoassay in Mikrotiterplat- ten für den Rheumafaktor [A. Faith und Mitarb., J. Im- munol. Methods 55 (1982), 169].
Für den vorliegenden Test wurden zwei Serum¬ verdünnungen (1/100, 1/1000) und zwei Konjugatverdünnungen (1/100, 1/1000) verwendet. Nach der Durchführung des
Tests wurden alle vier Streifen in Betracht gezogen, um falsch positive und falsch negative Aussagen zu vermeiden. Falsch positiv ist der Test, wenn die Färbung durch eine unspezifische Bindung erzeugt wird; dies kann unter Umständen entweder bei zu hoher Konzentration an irrele¬ vanten Serumproteinen oder bei zu hoher Konzentration an Konjugat vorkommen. Falsch negativ ist der Test, wenn die zu erfolgende Färbung wegen zu hoher Verdünnung der spezifischen Serumkomponenten oder aber des Konjugats nicht eintritt.
Die Ergebnisse des obenbeschriebenen Tests lassen sich folgendermassen zusammenfassen:
a) Die drei positiven Kontrollen waren positiv für ent¬ sprechende Reaktionen auch im Multiindikator-Test- streifen. b) Bei den sechs unbekannten Seren erzielte man folgende Ergebnisse:
Serum 1 positiv für Streptolysin, Serum 2 positiv für Streptolysin, Serum 3 negativ für alle getesteten Antigene, Serum 4 positiv für den Rheumafaktor, Serum 5 negativ für alle getesteten Antigene, Serum 6 positiv für Streptolysin, den Rheumfaktor und anti-DNS.
Alle sechs Seren wurden ausserdem auch durch die oben erwähnten Standardverfahren analysiert und es wurden identische Aussagen wie mit dem Multiindikator- Teststreifen erzielt. Die Korrelation zwischen den bis- herigen Methoden und dem neuen Test ist also zufrieden¬ stellen. c) Die negative Kontrolle (Kaninchenserum) gab negative Ergebnisse für alle Antigene.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Multiindikator-Teststreifen für immunolo¬ gische Analysen, bestehend aus (a) für die zu analysieren- de biologische Flüssigkeit neutralen, nicht adsorbieren¬ den Trägerstreifen aus festem, zusammenhängendem, nicht brüchigem Material, auf welchen (b) viereckige Testflä¬ chen aus wasserunlöslichem, porösem, homogenem, adsorp¬ tionsfähigem, polymerem Material, von der Breite der Trä- gerstreifen, in voneinander getrennter Anordnung neben¬ einander befestigt sind, derart, dass an einem Ende der Streifen eine Grifffläche freigelassen ist, wobei besagte Testflächen jeweils (c) ein anderes Antigen (A), (A1), (A") usw. in einheitlicher Verteilung tragen und die durch das Antigen (A), (A'), (A") usw. nicht besetzten
Bindungsstellen der Testflächen durch (d) für das Antigen nicht spezifische Proteine blockiert sind.
2. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch ge- kennzeichnet, dass die viereckigen Testflächen (b) aus wasserunlöslichen, natürlichen oder chemisch abgewandel¬ ten Kohlehydraten, insbesondere aus Cellulose, regenerier¬ ter Cellulose, Celluloseestern, Celluloseethern oder ver¬ netzten Dextran- und Stärkeprodukten, oder aus vollsynthesi- sehen polymeren Verbindungen, insbesondere aus der Reihe der Polyvinylverbindungen, der Polyacrylverbindungen oder der polymeren, organischen Kondensationsprodukte, bestehen.
3. Teststreifen nach Anspruch 2, dadurch gekenn- zeichnet, dass die viereckigen Testflächen (b) aus Nitro¬ cellulose bestehen. 4. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass die Trägerstreifen (a) aus einem nicht porösem Kunststoff oder aus Glas, Porzellen oder Holz bestehen.
5. Teststreifen nach Anspruch 4, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass die Trägerstrei en (a) aus Polypropylen
•oder Polyethylen bestehen.
6. Verfahren zur Herstellung der Multiindikator-
Teststreifen für immunologische Analysen nach einem der Ansprüche 1 bis- 5, dadurch gekennzeichnet, dass man je ein Blatt eines wasserunlöslichen, porösen, homogenen, adsorptionsfähigen, polymeren Materials in einer Lösung oder Suspension eines jeweils anderen Antigens (A), (A'), (A") usw. inkubieren lässt, die Blätter.zur Blockierung von nicht besetzten Bindungsstellen in einer Lösung von für das Antigen nicht spezifischen Proteinen inkubieren lässt und danach trocknet, jedes Blatt in parallele Bah- nen schneidet und je eine Bahn eines jeden der Blätter (A), (A'), (A") usw. auf eine Trägerfolie aus festem, zusammenhängendem, nicht brüchigem, für die zu analysie¬ rende biologische Flüssigkeit neutralem, nicht adsorbie¬ rendem Material derart befestigt, dass die Bahnen paral- lel nebeneinander liegen, und den entstandenen Bahnen- Trägerfolieverbünd in parallele Streifen, quer zur Längsrichtung der zuvor befestigten Bahnen schneidet, so dass jeder Streifen in nebeneinander angeordneten, voneinander getrennten viereckigen Testflächen die Anti- gene (A), (A1), ") usw. trägt.
. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass man ausserdem mehrere Teststreifen neben- einander und parallel zueinander durch ein in bezug auf die Antigene (A) , (A'), (A") usw. leeres Ende auf eine gemeinsame Unterlage befestigt.
8. Verwendung des oder der die Antigene (A) , (A1), '
(A") usw. tragenden Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ,zur Identifizierung und Quantifizierung eines spezifischen Antikörpers (B) in einer zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit durch eine immunologische Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass man besagten oder besagte Teststreifen in der zu untersuchenden, gegebenenfalls den Antikörper (B) enthaltenden Flüssigkeit inkubieren lässt und danach von den nicht gebundenen Komponenten der Flüssigkeit durch Waschen befreit, den oder die Test- streifen in einer Lösung eines Konjugates (CD), welches aus einem für den in der Flüssigkeit zu bestimmenden Antikörper (B) komplementären Antikörper (C) und einem an letzteren kovalent gebundenen Enzym, radioaktiven Isotop, fluoreszierenden Mittel oder Färbemittel (D) besteht, inkubieren lässt und danach von dem nicht ge¬ bundenen Anteil des Konjugates (CD) durch Waschen befreit, und die Anwesenheit und Menge, des Antikörpers (B) unter Ausnutzung der enzy atischen Reaktion, der Radioaktivi¬ tät, der Fluoreszenz bzw. der Farbe der Komponente (D) des auf dem oder den Teststreifen gebildeten Stoffes (ABCD) bestimmt.
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