WO1986001226A1 - Fish calcitonin derivative, process for its preparation, and gene system therefor - Google Patents

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WO1986001226A1 PCT/JP1985/000459 JP8500459W WO8601226A1 WO 1986001226 A1 WO1986001226 A1 WO 1986001226A1 JP 8500459 W JP8500459 W JP 8500459W WO 8601226 A1 WO8601226 A1 WO 8601226A1
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gly
thr
plasmid
gene
leu
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PCT/JP1985/000459
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Muneki Omori
Tetsuzo Miki
Hiroyuki Narushima
Takaomi Ikari
Akemi Saito
Noriko Ikushima
Reiko Matsumoto
Kazuo Watanabe
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Sagami Chemical Research Center
Central Glass Company, Limited
Hodogaya Chemical Company, Limited
Nippon Soda Company, Limited
Nissan Chemical Industries, Limited
Toyo Soda Manufacturing Company, Limited
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    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • the present invention relates to a novel fish calcitonin derivative having calcitonin activity and a method for producing the same by genetic engineering, and a gene for fish calcitonin and a derivative thereof for the production method.
  • salmon calcitonin and salmon calcitonin which are referred to as fish calcitonin
  • fish calcitonin are both boropeptides consisting of 32 amino acids, and the carboxyl group of proline which is a C-terminal amino acid has an amino acid. It is believed that this amide is required for calcitonin activity (eg, S.Guttman..exepter / medica / interlinker *). ⁇ Senoré '(see Excerpta Medica Int. Cong. Ser.) 540, 11, 1981).
  • the present inventors have found that a new derivative of fish calcitonin, T, which does not have such an amide structure, exhibits calcitonin activity when administered to mammals. I got
  • the present invention provides a novel fish calcitonin derivative.
  • This derivative is composed of 33 amino acids, which have amino acid proline at the C-terminus of the polypeptide of fish calcitonin consisting of 32 amino acids, followed by additional amino acid dalysine. It is a polypeptide composed of amino acids.
  • This derivative shows significant calcitonin activity when administered to mammals.
  • this derivative can be prepared by known methods i.e., CK. Breddam, F. Widmer, 3 ⁇ 4 ⁇ > * JT Johonsen, Richiichi Rusberg's Research Communication (Carlsberg. Res. Commun.) Vol 5, 237-247. Vol. 45, 361-367 (1980) 3 Naturally composed of 32 amino acids with an aminated proline at the C-terminus by in vitro treatment It can be converted into a type of fish power, lucitonin.
  • the present invention also provides a gene system useful for producing the fish calcitonin derivative.
  • This gene system includes a structural gene encoding a fish calcitonin derivative, a DNA fragment in which the structural gene is linked to another white matter structural gene, A plasmid containing the gene or the DNA fragment, and a microorganism containing the plasmid.
  • the present invention further provides a method for producing these gene systems.
  • the present invention further provides a method for producing a fish calcitonin derivative using the above-described gene system, the method comprising encoding a gene encoding a fish calcitonin derivative and another protein.
  • Escherichia coli transformed with a plasmid containing the gene and capable of expressing these genes in Escherichia coli is cultured to obtain a fusion protein comprising the fish calcitonin derivative and the other protein ,
  • the fusion protein is recovered, the recovered fusion protein is cleaved to release the fish calcitonin derivative, and this is collected.
  • fish calcitonin derivatives can be produced economically and industrially.
  • Figure 1 an alien a DNA sequence of Sakekarushi phosphatonin ⁇ beauty derivative gene designed according to the invention comprises a structural gene ⁇ beauty peripheral portion thereof, and has a 5 'side H P a I blunt end of the code chain.
  • FIG. 2 is the same as FIG. 1, but has a recognition site for the restriction enzyme HpaI at the 5 ′ end of the code chain.
  • FIG. 3 shows the structure of the salmon calcitonin gene (CT1) and its salmon calcitonin derivative gene (CT2Factory).
  • CT1 salmon calcitonin gene
  • C2Factory salmon calcitonin derivative gene
  • the sub-blocks used in the synthesis process are indicated by hatching.
  • -Fig. 4 shows that sub-blocks 3-5 are added according to method (I).
  • FIG. 3 is a radiograph showing that salmon calcitonin derivative gene (CT 2) -containing DNA fragment is generated from 3-7.
  • FIG. 6 is a system diagram showing the production of the ⁇ -plasmid pLMC 2 and pPMC 2 of the present invention.
  • FIG. 7 is a system diagram showing the production of plasmids pTMC2, pTMC12, pTMC22, and PTMC32 of the present invention.
  • FIG. 9 shows the production of plasmid pPMC 2.
  • FIG. 13 shows the production of the plasmid PTMC22.
  • FIG. 14 shows the production of plasmid PTMC32.
  • Fig. 16 shows the production of the plasmid pKTL1.
  • FIG. 21 shows the purification process of a fusion protein produced by E. coli harboring plasmid PCTM4.
  • Fig. 22 shows the purification of perilla calcitonin derivative by C18 column chromatography.
  • Figure 23 shows the purification of the eluted fraction from the C18 column by gel filtration using a TSK-G2000SW column.
  • the fish calcitonin derivative of the present invention comprises one more glycine (Gly) at the C-terminus of fish calcitonin consisting of amino acid 32 ⁇ . And the following amino acid sequence:
  • dalicin has an additional amino acid, dalicin, at the end of the 32 amino acids pC of natural eel calcitonin.
  • the fish calcitonin derivative of the present invention is limited to the salmon calcitonin derivative represented by the above amino acid sequence ( ⁇ ⁇ ) and the salmon calcitonin derivative represented by the above amino acid sequence (H). Rather, all calcitonin derivatives comprising any specific combination of amino acid residues X, Y and ⁇ in the amino acid sequence of the general formula (I) are described in the present invention. Belongs to the range.
  • a gene encoding a fusion protein of the target peptide and another protein is used. It is said that it is advisable to produce a fusion protein and then cleave it to obtain an S-like peptide.
  • a gene coding for a fish calcitonin derivative is linked to another protein, for example, a gene coding for metapirotropin tickase or a part thereof, and this gene is linked.
  • An expression plasmid for Escherichia coli containing the plasmid is prepared, and the Escherichia coli transformed with the plasmid is cultured to produce a fusion protein. Since this fusion protein is mainly accumulated in the cells of Escherichia coli, the cultured cells are first separated from the culture, then the fusion protein is recovered from the cultured cells, and finally the fusion protein is cleaved.
  • the calcidin derivative of fish is released and collected and purified.
  • this amino acid sequence Due to the degeneracy of the genetic code, this amino acid sequence has a large number of nucleotide sequences that constitute the code of this protein. This In such a case, it is generally recommended to use a trinucleotide codon that is commonly used in E. coli or is preferably used in a protein that is highly expressed. However, in the case of a structural gene having a region where the same amino acid is repeatedly present, such as a salmon calcitonin derivative, it is not possible to synthesize the desired gene by selecting a specific nucleotide 'sequence. Can not.
  • a triblet codon frequently used in Escherichia coli for each amino acid is selected, Temporarily design a double-stranded DNA sequence.
  • a translation initiation codon that is, a methionine codon ATGZTAC is added to the 5'-end of this sequence, and a translation termination codon or, preferably, a plurality thereof is added to the 3 * -end.
  • an appropriate restriction enzyme terminal or restriction enzyme recognition sequence is added to both ends of the DNA sequence.
  • the code fragments are divided into appropriate lengths to give, for example, U-1 to L-7 oligonucleotides.
  • the anti-code chain is divided into appropriate lengths so as to straddle the connecting points of the oligonucleotides of the above-mentioned code chain.
  • the oligonucleotides of L-11 to L-8 are give.
  • the free energy value of hybridization is determined for the adhesion site of the oligonucleotide thus designed, and the two-nucleotide nucleotide sequence selected as described above is constructed. Calculate the cross-hybridization value of each other.
  • the portion where cross-hybridization was determined to have priority over correct adhesion was replaced with another codon that degenerates the triplet codon of amino acid ' Modify the nucleotide sequence of the main protein.
  • a preferable nucleotide sequence is set.
  • the value of the free energy of the noisy hybridisation is determined by a method of estimating the hybridization intensity of the attenuator structure in the nucleotide sequence of RNA (for example, I. Tinoco. Jr. (See Nature New Biology 246 40 (1973)).
  • oligonucleotides U3 and U4 are modified to U31 and U41. These oligonucleotides are related as follows.
  • GGT AAA CTG TCC CAG GAA CTG C 7A i.T AAG CTG
  • the DNA sequence of the salmon calcitonin derivative synthetic structural gene is as follows:
  • oligo nucleocapsid click Reochi de represented by U 1 and L 1 is to form the H P a I-terminus, represented by U l 1 and L 1 1
  • Oligonucleotides form a recognition sequence for the restriction enzyme HpaI.
  • U7 and L8 are oligonucleotides for synthesizing a DNA fragment containing the salmon calcitonin derivative structural gene (CT2), and U7 'and U8 ⁇ are salmon calcitonin structural gene (CT2).
  • the newly added protecting group for the hydroxyl group at the 5'-position of cytidine is removed and condensed with dimer-unit adenosine-adenosine (AA).
  • AA dimer-unit adenosine-adenosine
  • Plasmid pSCT1 was obtained by inserting a fragment containing the salmon calcitonin structural gene (CT1) into the plasmid pHT2, and the salmon calcitonin derivative structural gene (CT2) was inserted into the same plasmid.
  • Plasmid PSCT 2 is obtained by inserting a fragment containing the salmon calcitonin structural gene (CT1) into the plasmid pHT2, and the salmon calcitonin derivative structural gene (CT2) was inserted into the same plasmid.
  • Plasmid PSCT 2 is obtained by inserting a fragment
  • Escherichia coli JM103 / pLMC2 containing this plasmid was deposited with FRI on May 10, 1985 as No. 8220 (FERM P-8220). Was transferred to the International Depositary on August 14, 1985, as FERM BP-867.
  • the structural gene portion of this plasmid is the metabolic enzyme A fusion protein consisting of 33 amino acids, a total of 71 amino acids of a derivative of 37 amino acids, methionine, and salmon lucidin is derived.
  • VarAsp The above mutation can be carried out using a synthetic oligonucleotide having the following formula.
  • This mutation process is performed, for example, as follows. That is, the plasmid PSCT2 is cut with restriction enzymes HpaI and HpaI to obtain a 0.6 kbp fragment. On the other hand, a 2.7 kbp fragment is obtained by cutting the double-stranded DNA of phage M13mp.9 with SmaI and SalI. These are ligated by T4 DNA ligase, Escherichia coli JM103 is transformed using the ligase, and the transformant is cultured to obtain a single recombinant phage DNA. The single-strand DNA having the anti-coding enzyme (negative chain) of the salmon calcitonin derivative gene thus obtained is obtained.
  • CTM41 a phage having a gene (a penguin calcitonin derivative gene) into which the desired mutation has been introduced is selected, and this is called CTM41.
  • a low-molecular-weight peptide such as calcitonin in Escherichia coli first, a stable high-molecular-weight protein fused with another protein is collected, and this is in-vivo. It is said that it is advisable to obtain a desired low molecular weight peptide by cutting with a tro.
  • the eel calcitonin derivative of the present invention as a protein constituting such a fusion protein, it is preferable to use metapyrocatecase or a part thereof from the viewpoint of convenience of purification and the like.
  • the size of the metapyrocatecase structural gene can vary widely.
  • the expression plasmid of the present invention is an E. coli promoter system, and the E. coli plasmid which contains the fusion protein gene in this order.
  • promoter systems e.g. lacUV5 system, P L system, it is possible to use the tac system, and the like.
  • Plasmid pTCCMl is a plasmid having a tac promoter and a metapyrocatecase gene (C230) downstream thereof, and Escherichia coli RB791 / pTCCMl containing it is FERH P-7T80. And JM103 / pTCCill has been deposited with the FRI on August 17, 1984 as FERMP-7778.
  • a double morphology of phage CTM41 containing a perennial calcitonin derivative gene (indicated by CT in the figure) was used.
  • Digest with EcoRI As a result, the J_ ⁇ RI site located upstream and in the vicinity of the methionine codon at position 0 of the eel calcitonin gene is cut off, blunted with fillin, and further downstream of the eel calcitonin derivative gene.
  • the Sal I site present in S. cerevisiae is cleaved with S. al.
  • a small fragment of 590 bp containing the oak calcitonin derivative gene is isolated.
  • FIG. 18 shows the nucleotide sequence of the junction region between the upstream portion of the eel calcitonin derivative gene (derived from CT41) and the downstream portion of the metapyrocatecase gene (derived from pTCC1) in this plasmid. B).
  • This plasmid pCTM4 is a gene encoding a fusion protein consisting of the amino acid of metabicocatecase and the 33 amino acid of a perinacalcitonin derivative downstream thereof under the control of the tac promoter (a total of 174 amino acids). It contains. Escherichia coli JM103 / PCTM4, which has this plasmid, has been assigned to FRI by Microorganisms No. 8239 (FERM P-8239). Deposited on May 20, 1985, and transferred to the International Depositary on August 14, 1985 as FERM BP-870.
  • the gene system for salmon calcitonin derivative and the gene system for salmon calcitonin derivative starting from the structural gene of salmon calcitonin derivative have been described, but the amino acid represented by the general formula (I) is similarly described.
  • the gene systems of various calcitonin derivatives belonging to the scope of the present invention defined by applying the specific amino acids defined in the general formula (I) to X, Y, and ⁇ in the acid sequence are shown below. Can be made.
  • the structural gene of the salmon calcitonin derivative according to the present invention is the corresponding portion in the structural gene of the salmon calcitonin derivative (the portion encoding the amino acid at positions 26, 27 and 29).
  • RR1 strain SM32 strain and the like can be used.
  • W3110 strain and RB791 strain are preferable.
  • Cultivation is carried out according to a conventional method, for example, in an LB medium under aerobic conditions.
  • a desired concentration for example, an optical density of 0.3 to 0.6 at 550 nm
  • an inducer for example, IPTG is added, for example, so that the final concentration becomes 1 mM, and several more are added.
  • Incubate for a time for example, 2 to 8 hours.
  • the cells are separated according to a conventional method such as centrifugation or filtration. If necessary, the cells are added to an appropriate buffer solution, for example, 50 mM potassium phosphate, 10 mM EDTA. Wash with buffer pH 7.5. Next, the cells are disrupted by a conventional method such as lysozyme treatment or ultrasonic treatment, and the precipitated fraction is collected by centrifugation. If desired, the precipitate is washed, for example, by resuspending it in 50 mM phosphate buffer, pH 7.5 and centrifuging again to collect the pellet.
  • a conventional method such as centrifugation or filtration.
  • the fusion protein was dissolved in an aqueous solution of guanidine hydrochloride, and the solution was filtered to remove guanidine hydrochloride, thereby precipitating the fusion protein and centrifuging. Collect by such methods. If desired, the sediment can be redissolved in a guanidine hydrochloride solution and further purified by chromatography, eg, Sephadex G75 column chromatography.
  • the fusion protein thus recovered is cleaved at its methionine portion with CNBr in a conventional manner to release the target fish calcitonin derivative.
  • the fish calcitonin derivative is purified according to a conventional method.
  • this purification for example C. 1 8 month Ramukuroma preparative graph I one, C 4 .BP force Ramuku Loma chromatograph I over, is appropriate TSKG 2000 SW Karamuku Roma Togurafi first prize.
  • the theoretical value of Gly is a value when Gly is present at the C-terminal.
  • the amino acid composition of the peptide obtained according to the present invention was in good agreement with that of the perinatal calcitonin described in the literature, with the addition of the residue glycine.
  • the amino acid sequence was determined using a protein sequencer, it was confirmed that the amino acid sequence was the same as that of the expected perilla calcitonin derivative.
  • the fish force lucitonin derivative of the present invention itself has bioactivity as calcitonin.
  • the activity of salmon calcitonin derivatives is about 1/7 that of salmon calcitonin in mammals, and is equal to or greater than that of human calcitonin. Therefore, the fish calcidin derivative of the present invention is useful as a medicament. This physiological activity was proved as follows.
  • the temperature of the animal is 2 2 ⁇ 2. (: Temperature 55 ⁇ 10%, ventilation 1 hour 13 times, lighting 12 hours a day (7:00 am to 7:00 pm). (250 x 350 x 200 mm: Nippon Cage Co., Ltd.) were housed in groups of 5 and fed the same type of feed (MF: Oriental Yeast Co., Ltd.) and tap water freely.
  • SGE-1 salmon calcitonin derivative (white freeze-dried product)
  • CT commercially available salmon calcitonin I (white freeze-dried product)
  • test substances were dissolved in the following solvents to prepare 10,000 ⁇ g / m test liquids.
  • the animals fasted at 6:00 pm on the day before the administration of the test solution, and were randomly divided into 11 groups, with 110 animals in each group being 10 animals, and the body weight was measured. Based on the body weight, the test solution was administered into the tail vein at a rate of 1.0 m per 100 g body weight. The animals were bled from the abdominal aorta under ether anesthesia exactly 1 hour after administration. The blood was left at room temperature for about 1 hour and then centrifuged at 3000 rpn> 10 minutes to search for serum. The obtained serum was used for calcium concentration measurement by the 0- Cresolphthaiein Conlexone method. The calcium concentration was measured using the clinical analysis automatic analyzer JCA-VX1000 (JEOL Ltd.), and the average of duplicate measurements was taken as the calcium concentration measurement value. ⁇
  • Salmon cane citonin is said to exhibit about 20 to 30 times the activity of human calcitonin on humans, so this value indicates that the salmon calcitonin derivative of the present invention is It strongly suggests that the activity is about 3 to 4 times that of tocalcitonin.
  • the fish calcitonin derivative of the present invention can also be obtained by converting the glycine at position 33 to an amide by a known method, for example, by using carboxylic acid peptidase Y. Widmer and JT Nonodsen, Carlsberg Research's Communique 3 (Carlsberg Res. Conimun., 45, 237; 45, 361 (1980)).
  • the fish calcitonin derivative of the present invention is also useful as an intermediate for producing highly active natural fish calcitonin.
  • oligonucleotides shown in Figs. 1 to 3 were synthesized using the phosphotriester solid phase method.
  • 40 rag (2.2 ⁇ £) cytosine nucleosides should contain 15 I ⁇ of CG and AA.
  • And 10 dimers of AG, CC, CC, TT and AT were sequentially reacted.
  • pyridine aldoxime and tetrame were added to an oligonucleotide containing an L-31 protecting group synthesized by continuous condensation reaction from 40 mg of nucleoside resin.
  • a 50% aqueous solution of tilguanidine (TMG) in dioxane was added at 1.5 ⁇ and reacted at 30 ° C for 2 days. After concentrating and recovering the solvent, the mixture was reacted with 2 m of a pyridine aqueous solution containing 22% ammonia and 55 in a sealed vessel for 5 hours.
  • the resin was removed by filtration, and the ammonia was removed by concentration under reduced pressure.
  • the resulting oligonucleotide having a protecting group at the 5 'end was applied to a C-18 disposable column Seppak (Waters). After flowing 20 m of a 15% aqueous solution of acetonitrile into the column, 2 m of a 30% aqueous solution of acetonitrile were poured into the column. The target substance elutes and flows out when applied to the column.
  • the DMTr group was removed. After removing acetic acid by ether extraction and azeotropic dehydration, the solvent was replaced with ethanol, and the oligonucleotide was sedimented by centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, ethanol was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved in 100 U of distilled water.
  • Figure 3 shows a part of the sub-block produced by the enzymatic reaction.
  • oligonucleotides were mixed and purified using the C-18 disposable ram Seppak (Waters) by the method described above.
  • the eluted DNA solution was concentrated and subjected to ethanol precipitation to precipitate the DNA. After removing the supernatant, the ethanol was removed by depressurization, and the dried product was washed with 40 ⁇ "ligase buffer.
  • composition of the reaction product revealed that D% ⁇ ⁇ corresponding to the pairing of 113 bases and 115 bases was formed at a rate of 23% of the whole.
  • the entire amount of the reaction solution was separated by 12% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea.
  • a gel piece of that part was cut out, put into a permeation tube, filled with 89 mM tris boric acid, 2 m MEDTA buffer, and sealed.
  • the DNA in the gel was eluted by electrophoresis in a buffer at a constant voltage of 50 V for 12 hours.
  • the DNA was taken out from the transparent tube, freeze-dried, and the dried product was dissolved in distilled water of 100 ⁇ "and purified using an ion-exchange discotic column Elup-d (Schleicher & Schiiel 1).
  • subblocks 3-6 and 3-8 are linked via oligonucleotides L5 and U5, which corresponds to the pairing of 113 bases and 115 bases. DNA was obtained at a rate of 11% of the total.
  • HpaI and Clal were added to the HpaI — C1aI fragment of plasmid pHT2.
  • a recombinant plasmid incorporating a gene for salmon calcitonin or a derivative thereof was constructed so that the restriction enzyme recognition sequence could be regenerated (see Fig. 5).
  • Plasmid pHT2 is an expression vector PKC30 (e.g. H.
  • This DNA precipitate was dissolved in 100 ⁇ "HpaI reaction solution (1 OmM Tris-HCl, pH 7.5, 7 mM MgC & 2 , 100 mM Kci. 7 mM ⁇ mercaptoethanol) and restricted. The reaction was performed for 90 minutes at 37 with the addition of 15 units of the enzyme HpaI, and 0.08 units of Escherichia coli alkaline phosphatase was added to the reaction mixture, followed by reaction at 65'c for 30 minutes. The 5 'end was dephosphorylated, and the reaction mixture was washed with 100 ⁇ "phenol, followed by 0.7% agarose gel electrophoresis, and large DNA fragments were recovered by electrophoresis.
  • 100 ⁇ "HpaI reaction solution 1 OmM Tris-HCl, pH 7.5, 7 mM MgC & 2 , 100 mM Kci. 7 mM ⁇ mercaptoethanol
  • the pHT2 ClaI-HpaI fragment DN A0.5 pmo £ obtained in this manner was combined with a salmon calcitonin or a salmon calcitonin having a phosphate group at the 5 'end.
  • 0.5 pm OJ g of the DNA fragment containing the structural gene of the derivative was added to a T4 DNA ligation reaction solution 20 (25 mM HBPES.pH 7.8, 7.5 mM MgC & 2 , 0. 2 mM ATP. 6 mM DTT), and react with 3 units of T4 DNA ligase for 20 hours for 16 hours.Transform E. coli strain RRI with 10 of them and use 100 g Zm Transformants resistant to amblysin were selected.
  • Escherichia coli Rl / pSCT1 transformed with plasmid (pSCTl) having salmon calcitonin structural gene (CT1) and salmon calcitonin structural gene (CT1) Escherichia coli transformed with plasmid (PSCT2) containing (CT2)
  • each plasmid of PSCT1 and pSCT2 was cut with 15 units of restriction enzyme HpaI, and E. coli was used. alkali Phosphor synthetase by 5 to 32 P labeled end 'r one after de re phosphorylated end [32 P] ATP and poly quinuclidine Reochi Doki, 5 using a kinase'.
  • the target DNA fragment was purified after digestion with 15 units of the restriction enzyme BamH1, and the nucleotide sequence was determined by the Maxam and Gilbert method. As a result, all plasmids had the nucleotide sequence as designed.
  • pHT3 plasmid 5 « « and 15 units of BamHI in buffer (10 mil Tris-HC, pH 8.0, 7 mM MgC & 2 , 100 mM NaC ⁇ 2 mM-mercaptoethanol) The reaction was carried out in 20 an for 3 hours. After sedimentation, the precipitate was buffered (50 raM Tris-HC £ pH 7.2, 10 mM MgC £ z. 0.1 mM DTT, 80 M dNTP) in 20 With the unit's cleannow fragment
  • the reaction was performed for 0.5 hours. After phenol treatment, ethanol precipitation was performed.
  • the ⁇ was buffer - in (lOmM Tris-HC ⁇ P H 7. 5 7 mM MgC 2, 6 0 mM NaCjg, 7 mM 2. Menu Rukapu Toetano Lumpur) 2 0, 2 0 Units P vu
  • the reaction was carried out with ⁇ and 37 for 3 hours.
  • the ⁇ product buffer (66mM Tris-HC ⁇ pH 7. 6, 6. 6 mM MgC £ 2, 1 0 DTT, 1 mM ATP) in 2 0, T 4 DNA ligase 2
  • the reaction was carried out at 15 with the .8 unit for 20 hours. This reaction was used to transform Escherichia coli HB101 strain. A strain having the PHT31 plasmid as shown in FIG. 15 was isolated from the amblysin-resistant transformants.
  • Example 3 Preparation of plasmid pKTL1 (Fig. 7 and Fig. 16) 13 g of pST21 was added to 37'C3 with 18 units of I in 40 Hinf I buffer. After digestion for an hour, they were sunk with ethanol. This was reacted with 2 units of DNA polymerase Ilenow fragment for 30 minutes at room temperature in a 25 ⁇ "nicktranslation buffer containing 80 M dNTPs. After treatment with 70'C for 5 minutes, the mixture was treated with phenol and precipitated with ethanol, and the precipitate was dissolved in 40 ⁇ i of JL ⁇ I buffer and mixed with 6 units. After digestion with Hpa I for 1.5 hours at 37, the cells were killed with ethanol, which was combined with 0.02 OD 26O unit of Hind.
  • the DNA fragment (about 1) (about 5.5 Kb) and the DNA fragment (about 2) were purified with Elutip-d (trade name) Schleicher & Schue 11) column, and then precipitated with ethanol. This was dissolved in 2 () 01 ⁇ ligase buffer and 2 for 4 hours at 1 2 added of T 4 ligase in 350 units.
  • the transformation was carried out to obtain colonies growing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / S, ambicilin. Plasmid DNA was extracted from the obtained transformant, and its size was approximately
  • Digestion was carried out with 24 units of Alu I in Tris-HC &, 7 mM MgC & 2 , 20 mM ⁇ NaC ⁇ , 7 mM2—mercaptoethanol) at 37 for 3 hours. This was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and a 245 bp DNA fragment (fragment A) was isolated by electrophoretic elution.
  • I0 ⁇ g of PTMC22 was digested at 37 with 16 units with 45 units of PstI in 100 ⁇ l of PstI buffer. 5 g of the obtained PstI digest of pTMC22 was precipitated in ethanol, and 100 ⁇ l of a ⁇ buffer (10 mM Tris-HC £, pH 7.5, 7 mM MgC & 2 , 60 mM NaCl, 7 mM Digestion was carried out at 37'C for 2 hours using 30 units of PVU II in 2-methanol (ethanol). After subjecting this to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1800 bp
  • the above DNA fragments A, B, and C were mixed, treated with Elutip-d (trademark) column, precipitated with ethanol, and then mixed with 350 ⁇ l of ligase buffer at 350 units. The reaction was performed for 17 hours at 12 by adding T ⁇ DNA ligase. Using this reaction product, Escherichia coli JM103 strain was transformed, and a transformant having PTMC32 was selected.
  • the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method according to (supra), and the sequence of the cloned single DNA was confirmed. In this way, a single DNA containing the anticoding chain of the salmon calcitonin derivative gene was obtained. This recombinant phage was named CTM31.
  • Escherichia coli JM103 was transformed using the double-stranded DNA.lpM according to the method of messing.
  • the mutant phage was screened by plaque-noid hybridization.
  • methods such as benton ⁇
  • the plaques were transferred from the soft agar medium to a nitrocellulose filter, and were baked at 80 ° C. in a vacuum for 2 hours.
  • 6 x SSC In a lOxDenhardt solution, 1 ⁇ hybridization was carried out at 23 using a primer labeled with 32 P-labeled primer oligonucleotide. Next, put this filter in 6 XSSC
  • the base sequence was determined by the dideoxy method using the mutant phage DNA as type I, and it was confirmed that a base substitution mutation had occurred and a phage having the gene of the eel calcitonin derivative was obtained.
  • This mutant phage plaque strain was named JM103 / CTM41.
  • DNA was purified using ImM Tris-HC ⁇ (pH 7.5), 0.7 mM MgC £ 2 , 15 mM NaCi, 0.7 mM monocaptoethanol and O.O2 mM 8 units / 100 buffer containing 100% EDTA It was digested with SalI at 37 for 2 hours. This reaction solution is subjected to electrophoretic separation on a 1.2% agarose gel containing ethidium bromide, the gel portion containing small DNA fragments is cut out, and the target is electroeluted using a transparent membrane. The DNA fragment was eluted. DNA fragments were eluted from the eluate with ethanol, and the sediment was dried and dissolved in 40% water.
  • This reaction mixture 10 ⁇ was used to transform Escherichia coli JM103 (combinant cells that had been stored frozen).
  • the E. coli colonies thus treated were transformed with the calcitonin derivative structural gene U3.
  • one fragment GGGAAGTTGAGTCAG
  • Kishigen test was performed on these positive strains, and strains expressing a protein of about 19,100 daltons were selected.
  • Plasmid DNA was prepared from these strains, and didoxy sequencing was performed using the calcitonin derivative structural gene L-41 fragment (GTAATTCCTGACTCA) (see Example 1 and FIG. 1) as a probe.
  • the nucleotide sequence was determined according to the above, and it was confirmed that the oak calcitonin gene was inserted properly. This plasmid is called pCTM4.
  • the E. coli RB791 strain containing plasmid pTMC2 was cultured at 37 ° C. in 10 ml of LB medium containing 50 g of ampicillin at 37 ° C. Next, the culture solution was inoculated into the same medium (1), cultured for 2 hours, and then IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and further cultured for 6 hours.
  • the cells were suspended in 50 mM 50 mM potassium phosphate buffer solution containing 1 O mM .EDTA, 100 mg of lysozyme was added thereto, and the mixture was placed on ice for 30 minutes, and further suspended. Crushed by sonication for 30 minutes. This was centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes to obtain an insoluble fraction. This insoluble fraction is 5 Qm £ 7 M guanidine hydrochloride
  • the fusion protein was suspended in an aqueous solution and left at 0 for 30 minutes to solubilize the fusion protein. When the aqueous solution was folded through 1 ⁇ of 2 distilled water, the fusion protein became insoluble white sediment.
  • FIG. 19 shows the elution pattern (A) and the gel pattern (B) of each fraction by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the fusion protein was eluted as a nearly single band in the fraction corresponding to about 20,000 daltons.
  • the fusion protein-containing surface obtained as described above was bent through distilled water 2 overnight, and then centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes.
  • the methabilocatecase and salmon calcitonin derivative were cleaved by treating the obtained Shen Yi with CNBr as follows. That is, 20 m of 70% formic acid and 500 mg of CNBr were added to the precipitate, mixed, and allowed to react at room temperature in a dark place for 24 hours. After the reaction was completed, 180 ml of water was added, and the mixture was freeze-dried to obtain a white powder. This powder was dissolved in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and fractionated by HPLC using I5P304 column (manufactured by Bio-Rad).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Escherichia coli JM103 strain containing brassmid pCTM4 was cultured with shaking overnight at 37 V in 1 Omi of LB medium containing 50 ⁇ g. / M & Then the thus obtained culture solution was inoculated 1 0 Paiiota the same medium 1, and cultured for 6 hours at 3 7 'C 0 D 55. When the concentration reached about 0.5, IPTG was added to a final concentration of 1 ml, and the cells were further cultured for 6 hours.
  • the cells were collected by centrifugal away 15 minutes at 6000Rp m the obtained culture solution as described above. To this, 50 mg of lysozyme was added, and suspended in 5 OmM potassium phosphate buffer (pH 7.5, 10 mM EDTA provided) to make 50 m. , 0, and 30 minutes, and sonicated twice for 15 minutes each. This was centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4'C to separate the supernatant (S-1 in Fig. 21) and the insoluble fraction (P-1 in Fig. 21). . As shown in FIG. 21, most of the proteins were detected by SDS-polyacrylamide gel gel electrophoresis. White matter was present in the insoluble fraction.
  • the insoluble fraction was resuspended in 50 m & litre of the same phosphate buffer as above and centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 to obtain the supernatant (S12 in Fig. 21). ) And the insoluble fraction (P-2 in Fig. 21). As shown in FIG. 21, most of the protein containing the desired fusion protein of about 19,100 daltons was present in the insoluble fraction. This insoluble fraction was suspended in 50 7 M guanidine hydrochloride aqueous solution, and left still at 0 for 30 minutes to solubilize the fusion protein. This solubilized fraction mainly contained the target fusion protein (SP-3 in Fig. 21).
  • fish calcitonin derivatives can be economically produced on a large scale.
  • the fish calcitonin derivative thus produced can be used as a medicament in the same manner as other calcitonins already used.
  • this calcitonin derivative can also be used as an intermediate when producing natural calcitonin.

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Description

明 細 書
発明の名称
魚類カルシ ト二ン誘導体及びその製造方法並びに そのための遺伝子系 技 術 分 野
この発明は、 カルシ トニン活性を有する新規な魚類カルシ トニン誘導体及びその遺伝子工学的製造方法、 並びにこの製 造方法のための魚類カルシ ト二ン及びその誘導体のための遺 伝子系に関する。 背 景 技 術
カルシ トニンは、 高カルシウム血症、 Paget (ページエ ツ ト） 病について治療効果が見出されている。 このものは、 骨 吸収抑制作用、 骨新生促進作用を有することも確認されてお り老人性の骨粗鬆症に対する治療効果も期待されている。 力 ルシ トニンはすでにブタ、 ゥ シ、 ヒ ト、 ラ フ ト 、 ニヮ ト リ 、 サケ及びゥナギから分離されている。
由来する生物種間におけるカルシ トニンの血中での生理活 性を比較すると魚類の鰓後腺から得られるものは、 哺乳類の 甲状腺由来のものに比較して約 3 0倍の比活性を示し、 効力 の持繞時間も長い。 この理由として、 例えばサケカルシ トニ ンにおいては、 他のカルシ トニンと較べて血中で不活性化さ れに く いこ とが、 例えば、 H . Copp等、 カルシ トニン、 プロ シ 一ディ ングス ' ォブ ' セカ ン ド * イ ンターナショ ナル ' シン ポジゥム（Calci tonin， Proc. 2nd. Int. Sympo · )ロ ン トーン， ハイ ネマン 281 (1981)により報告されている。 また、 ゥナギ カルシ ト ニ ンは特に、 活性が高いのみならずイ ンー ビ ト ロに おける血清中又は肝、 腎等の臓器の抽出液中での安定性が極 めて高い。 このため、 魚類カルシ トニンが特に医薬として使 用するのに有利である。
現在までに、 ブタ、 ゥシ、 ヒ ト、 ラ フ ト、 ニヮ ト リ、 サケ 及びゥナギから単離されたカルシ トニ ンの構造が明らかにさ れている。 例えば、 本発明において魚類カルシ トニ ンと称す るサケカルシ トニシ及びゥナギカルシ トニンはいずれも 3 2 個のアミノ酸か、ら成るボリペプチ ドであり、 C -末端ア ミノ 酸であるプロ リ ンのカルボキシル基がアミ ド化されておりそ してカルシ トニン活性のためにこのァ ミ ド搆造が必要である と信じられている （例えば、 S.Guttman..ェクセ一プタ · メデ イカ · イ ンタ ' コ ンク * · セノレ ' （Excerpta Medica Int. Cong. Ser.) 540, 11, 1981 を参照のこと） 。 しかしながら、 本発 明者等は、 このようなア ミ ド構造を有しない魚類カルシ ト二 ンの誘導体であつ Tも、 それが哺乳類動物に投与された場合、 カルシ トニン活性を表わすという全く新しい知見を得た。
現在治療用のカルシ トニンとして市販されているものは、 ブタ、 サケ、 ゥナギのカルシ トニ ンである力 、 これらは生体 から抽岀したりまたは化学的に合成することによって得られ ている。 しかしその生産量はわずかでありまた高価である。 従って-魚類カルシ ト二ン及びその誘導体を経済的、 且つ大量 に製造することができる新規な方法の開発が強く望まれてい る。
このような目的を達成するためには遺伝子操作技術を用い る方法が最も好ましい。 特開昭 58— 203953にはヒ ト カルシ ト ニンの化学合成遺伝子と大腸菌におけるその発現が記載され ている。 P C T公表特許公報昭 58— 501121にはヒ トカルシ ト ニンの前駆体遺伝子が記載されている。 P C T公表特許公報 昭 59— 501095にはヒ トカルシ トニンの化学合成遺伝子とその 発現について記載されている。 また、 P C T公表特許公報昭 59 - 501243には天然由来ヒ トカルシ トニン遺伝子及びその発 現について記載されている。
しかしながら、 魚類力ルシ トニン遺伝子又はその誘導体の 遺伝子の合成及び大腸菌における発現についてはまだ記載さ れていない。 発 明 の 開 示
この発明は新規な魚類カルシ トニン誘導体を提供する。 こ の誘導体は、 3 2偭のァ ミノ酸から成る魚類カルシ トニンの ボリ ぺプチ ドの C一末端のァ ミノ酸プロ リ ンの次に追加のァ ミノ酸ダリ シンを有する 3 3個のア ミノ酸から成るポリ ぺプ チ ドである。 この誘導体は哺乳動物に投与された場合、 有意なカルシ トニン活性を示す。 また、 この誘導体は公知の 方法 iこ従って CK.Breddam, F.Widmer, ¾ζ>* J. T. Johonsen, 力 一ルスベルグ ' リ サーチ · コ ミ ュニケーショ ン（Carlsberg. Res. Commun.) Vol 5, 237-247 (1980) ； 及び同 Vol 45, 361-367 (1980) 3 生体外で処理するこ とにより、 C -末端に ア ミ ド化されたプロ リ ンを有する 3 2個のア ミノ酸から成る 天然型の魚類力ルシ トニンに転換する こ とができる。
この発明はまた、 前記の魚類カルシ トニン誘導体を製造す るために有用な遺伝子系を提供する。 この遺伝子系は、 魚類 カルシ トニン誘導体をコー ドする構造遺伝子、 該構造遣伝子 と他の蜜白質の構造遺伝子とが連結された D N A断片、 該構 造遺伝子又は該 D N A断片を舍有するプラスミ ド、 及びこ の プラス ミ ドを舍有する微生物を包舍する。 この発明はさらに、 これらの遺伝子系の製造方法をも提供する。
この発明はさらに、 上記の遺伝子系を用いる魚類カルシ ト ニ ン誘導体の製造方法を提供し、 この方法は、 魚類カルシ ト 二ン誘導体をコ一ドする遺伝子と他の蛋白質をコ一ドする遺 伝子を含有しこれらの遺伝子を大腸菌中で発現することがで きるプラスミ ドにより形質転換された大腸菌を培養して該魚 類カルシ トニ ン誘導体と該他の蛋白質とを含んで成る融合蛋 白質を生成せしめ、 この融合蛋白質を回収し、 回収された融 合蛋白質を切断して前記魚類カルシ トニン誘導体を遊離せし め、 そしてこれを採取することを特徴とする。 この方法によ れば、 魚類カルシ ト 二 ン誘導体を経済的且つ工業的に製造す ることができる。
' 図面の簡単な説明
第 1図はこの発明に従って設計されたサケカルシ トニン及 びその誘導体の遺伝子の D N A配列であつて、 構造遺伝子及 びその周辺部分を含み、 そしてコー ド鎖の 5 ' 側 H Pa I 平滑 末端を有する。
第 2図は第 1図と同様であるが、 コー ド鎖の 5 ' 一末端に 制限酵素 H pa I の認識部位を有する。
第 3図は、 サケカルシ トニン遺伝子 （ C T 1 ) 及びそのサ ケカルシ トニ ン誘導体遺伝子 （ C T 2厂 ώ合成過程で使用し たサブブロ ックの構成図であつて、 秦印は酵素によるリ ン酸 基の付加を示す。 - 第 4図は、 方式 （ I ) に従って、 サブブロ ック 3 — 5 と 3 - 7 とからサケカルシ トニン誘導体遺伝子 （ C T 2 ) 含有 D N A断片が生成することを確認するラジオォー トグラム図 である。
第 5図は、 岀発ブラスミ ド PHT2と、 この発明の遺伝子 C T 1 含有断片、 又は C T 2含有断片から組換プラスミ ド PSCT 1、 又は pSCT 2を造成する場合の工程図である。
第 6図は本発明 φプラス ミ ド pLMC 2、 及び pPMC 2 の作製の 系統図である。
第 7図は本発明のプラス ミ ド pTMC 2、 pTMC12、 pTMC22、 及 び PTMC32の作製を示す系統図である。
第 8図はプラ ス ミ ド pLMC 2 の作製 （ A ) 、 及びメ タ ビロ カ テカ ー'ゼ（C230)コ ー ド領域とサケカノレシ ト ニ ン ( C T ) コ ー ド領域との連結部の塩基配列 （ B ) を示す。
第 9図はプラスミ ド pPMC 2 の作製を示す。
第 1 0図はプラ ス ミ ド PSCT12の作製を示す。
第 1 1図はプラス ミ ド PUCT22の作製を示す。
第 1 2図はプラス ミ ド pTMC 2 の作製 （ A ) 、 及びメ タピロ カテカーゼ（C230)コ一 ド領域とサケカルシ トニン誘導体 （ C T ) コー ド領域との連結部の塩基配列 （ B ) を示す。
第 1 3図はプラ ス ミ ド PTMC22の作製を示す。
第 1 4図はプラスミ ド PTMC32の作製を示す。
第 1 5図はプラ ス ミ ド PHT31 の作製を示す。
第 1 6図はプラ ス ミ ド pKTL 1 の作.製を示す。
第 1 7図はサケカルシ ト ニ ン誘導体遺伝子の塩基配列及び サケカルシ ト ニ ン誘導体のア ミノ酸配列、 ゥナギカルシ ト ニ ン誘導体遺伝子の塩基配列及びゥナギカルシ トニン誘導体の ア ミ ノ 酸配列、 プラ イ マーオ リ ゴヌ ク レオチ ド、 並びにプロ 一ブオリ ゴヌク レオチ ドの関係を示す。
第 1 8図 （A ) はファージ CTM41 とプラスミ ド pTCCMlとか らのプラス ミ ド PCTM 4の作製を示し、 （B ) は pTCCMl由来
D N A.断片と CTM41由来 D N A断片との連結部の塩基配列を 示す。
第 1 9図はセフア デ フ ク ス G — 7 5カラムク ロマ トグラ フ ィ 一における融合蛋白質の溶出 （ A ) ·、 及び各画分の S D S ボリアク リルアミ ドゲル電気泳動のゲルバターン （ B ) を示 す。
第 2 0図は CNBr処理生成物の PR304による C 4 逆相 HPLCの パター ン （ A ) 、 及びこれによつて精製された画分の TSK- G2000SW カ ラムを用いる HPLC ( B ) を示す。
' 第 2 1図は、 プラス ミ ド PCTM 4を舍有する大腸菌により生 産された融合蛋白質の精製過程を示す。
第 2 2図はゥナギカルシ トニン誘導体の C 1 8 カ ラムク ロ マ トグラフィ ーによる精製の様子を示す。
第 2 3図は C 1 8 カラムからの溶出画分の TSK— G2000SW カ ラムを用いるゲル濾過による精製の様子を示す。
第 2 4図は、 RP-304カ ラ ムを用いる逆相 HPLCによる精製の 様子を示す。
第 2 5図は、 最終画分の PR304逆相 HPLCによる分折の結果 ( A ) 及び TSK-G2000SW ゲルによる分折の結果 （ B ) を示す。 発明を実施するための最良の形態
A . 魚類カルシ ト二ン誘導体
この発明の魚類カルシ トニン誘導体はァミノ酸 3 2偭から 成る魚類カルシ トニ ンの C末端にさ らに 1個のグリ シン（Gly) が付加されたものであり、 次のア ミノ酸配列 ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gl
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His し ys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr X Y Gly Z Gly Thr Pro Gly
(配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） を有する。
例えばサケカルシ トニン誘導体は次のア ミノ酸配列 （ Π )：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val leu Gly
Lys Leu Ser G 1 n Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly
Thr Pro Gly
を有し、 天然サケカルシ トニン I の 3 2個のァ'ミノ酸の C末 端に追加のァミノ酸であるグリ シンを有する。
また、 ゥナギカルシ トニン誘導体は次のア ミノ酸配列 （ 1Π)：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly
Thr Pro Gly
を有し、 天然ゥナギカルシ トニ ンの 3 2個のア ミノ酸 p C末 端に追加のア ミノ酸であるダリ シ ンを有する。
しかしながら、 この発明の魚類カルシ トニン誘導体は前記 のア ミノ酸配列 （ Π ) で表わされるサケカルシ ト ニ ン誘導体、 及び前記ア ミノ酸配列 （ H ) で表わされるゥナギカルシ トニ ン誘導体に限定される.のではな く、 一般式 （ I ) のア ミノ酸 配列におけるァ ミノ酸残基 X , Y、 及び Ζの具体的な任意の 組み合わせから成るすべてのカルシ ト ニ ン誘導体がこ の発明 の範囲に属する。
B · 魚類カルシ ト二ン誘導体の製造のための遺伝子系
一般にカルシ トニ ンのごとき比較的分子量の小さいぺプチ ドを遺伝子工学的手法により大腸菌を用いて製^するには、 まず目的べプチ ドと他の蛋白質との融合蛋白質をコー ドする 遺伝子を用いて融合蛋白質を生成せしめ、 次にこれを切断し て S的とするぺプチ ドを得るのが得策であるといわれている。
このため本発明においては、 まず、 魚類カルシ ト二ン誘導 体をコー ドする遺伝子と他の蛋白質、 例えばメ タピロ力チカ ーゼ又はその部分をコー ドする遺伝子とを連結し、 この遺伝 子を含有する大腸菌用発現プラス ミ ドを作製し、 このプラ ス ミ ドにより形質転換された大腸菌を培養することによって融 合蛋白質を生成せしめる。 この融合蛋白質は主として大腸菌 の菌体内に蓄積されるため、 培養物からまず培養菌体を分離 し、 次にこの培養菌体から前記融合蛋白質を回収し、 最後に この融合蛋白質を切断して目的とする魚類カルシ ト二 ン誘導 体を遊離せしめてそしてこれを採取精製する。
1. サケカルシ ト ニ ン誘導体の遺伝子系の作製
(1) サケカルシ トニ ン誘導体構造遺伝子の合成
サケカルシ トニン誘導体をコー ドする構造遺伝子中には 5 個の反復するロイ シ ン（Leu) を舍む領域が存在し、 このよう な強いホモ ロ ジ一を有する二重鎮ポリ ヌ ク レオチ ドは合成が 困難である.と言われていた （例えば、 J . ウ ィ ンダス等、 二 ュ ク レイ 'ン ク · ァ シズ · リ サーチ（N uc l e i c Ac i ds Res earch) , 10 , 6639 ( 1982) 参照〕 。
このア ミノ酸配列には、 遺伝暗号の縮重の故に、 この蛋白 質の暗号を構成.するヌ ク レオチ ド配列が多数存在する。 この 様な場合には大腸菌の中でよ く使用されている、 あるいは高 発現をしている蛋白質において好んで用いられている ト リ ヌ ク レオチ ドコ ドンを使用することが一般にすすめられている。 しかしサケカルシ トニン誘導体のよう に、 同一ア ミ ノ酸が反 復して存在する領域を持つ構造遺伝子の場合には、 特定のヌ ク レオチ ド'配列の選択では目的とする遺伝子を合成すること はできない。 このため本発明においては、 まず、 前記のサケ カルシ トニン又はその誘導体のァ ミノ酸配列に基き、 それぞ れのァ ミノ酸について大腸菌において高頻度で使用される ト リ ブレツ トコ ドンを選択し、 2本鎖 D N A配列を仮に設計す る。 次にこの配列の 5'—末端に翻訳開始コ ドン、 すなわちメ チォニンのコ ドン ATG Z TAC を付加し、 そして 3*—末端に詡 訳終止コ ドンを好ま し く は複数付加する。 さ らに、 この D N A配列の両端に適当な制限酵素末端又は制限酵素認識配列を 付加する。 このようにして想定された 2本鎮 D N A配列の内 コ ー ド鎮を適切な長さに区分し、 例えば U— 1 ないし L — 7 のオリ ゴヌク レオチ ドを与える。 次にアンチコー ド鎖を、 上 記のコ ー ド鎖のオリ ゴヌク レオチ ドの連結点をまた ぐように 適切な長さに区分し、 例えば L一 1 ないし L — 8 のオリ ゴヌ ク レオチ ドを与える。 次に、 このようにして設計されたオリ ゴヌク レオチ ドの接着部位についてハイ ブリダィゼーショ ン の自由エネルギーの数値を求め、 さ らに前記のようにして選 んだニ本鎮ヌク レオチ ド配列を構成するォリ ゴヌク レオチ ド 相互のク ロスハイ ブリダィゼーシヨ ンについて数値を求める。 両者の数値の比較により、 クロスハイ ブリダィゼーショ ンが 正しい接着に優先すると判定された部分について、 アミノ酸 ' の ト リ プレツ ト コ ドンを縮重する他のコ ドンに置き換え、 二 本鎮ヌク レオチ ド配列を修正する。 このような修正操作を缲 り返すことにより好ま しいヌク レオチ ド配列を設定する。 な お、 ノヽイ ブリダィゼーシヨ ンの自由エネルギーの値は、 R N Aのヌク レオチ ド配列におけるァテェ二ユエ一ター構造のハ ィブリダイゼーショ ンの強さを推定する計箕方法 （例えば、 I.Tinoco. Jr 等の Nature New Biology 246 40 (1973)参照） を用いて求められる数値で代替することができる。
具体的には、 オリ ゴヌク レオチ ド U 3及び U 4を、 U 3 1 及び U 4 1 に修正する。 これらのオリ ゴヌク レオチ ドは次の 様な関係にある。
10 11 12 13 14 15 16 18 19 Gly し ys Leu Ser Gin Glu Leu し ys Leu
U - 3 U - 4
H 1
GGT AAA CTG TCC CAG GAA CTG C 7A i.T AAG CTG
GGG AAG TTG AGT CAG GAA TTA CAT AAG CTG
U -31 U -41 ·
さらに、 対応する負鎮 L 3及び L 4についても対合するよ うに L 3 1及び L 4 1に修正する。
このようにして最終的に設計された配列を第 1図及び第 2 図に示す。 これらの配列ば、 Cys1 から P ro32に至る 3 2偭 ア ミノ酸からなるサケカルシ トニン又は Cys1 から Gly33に 至る 3 3個のア ミノ酸から成るサケカルシ トニン誘導体をコ — ドする構造遺伝子を含み、 さらにこの構造遺伝子の 5' -末 端には翻訳開始コ ドン ATGZTAC が付加され、 末端には 2偭の翱訳終止コ ドン TAAZATT 、 及び TAGZATC が付加さ れている。 さらにこれらの D N A断片をプラス ミ ドに組込む 場合に便利なように、 前記開始コ ドンの 5'側にはさらに H pal 末端 （第 2図） 、 又は制限酵素 Hpa I で処理するこ とにより Hpa I末端を与える配列が付加されており、 前記終止コ ドン の 3*—側にはさらに C 1 a I 末端が付加されている。 これらの 構造遺伝子の内、 サケカルシ トニン構造遺伝子を C T 1 と称 し、 サケカルシ トニン誘導体構造遺伝子を C T 2 と称する。 上記のよう にして設計されたサケカルシ トニン合成構造遺 伝子の D N A配列は次の通りである ：
コー ド鎖 ： T G C T C C A A T C T C T C T A C T— アンチコ一 ド鎖 ： A C G A G G T T A G A G A G A T G A—
T G C G T T C T G G G G A A G T T G A G T -
A C G C A A G A C C C C T T C A A C T C A - C A G G A A T T A C A T A A G C T G C A A - G T C C T T A A T G T A T T C G A C G T T - A C T T A C C C G C G T A C C A A C A C T - - T G A A T G G G C G C A T G G T T G T G A -
G G T T C T G G T A C A C C T C C A A G A C C A T G T G G A。
また、 サケカルシ トニン誘導体合成構造遺伝子の D N A配 列は次の通りである ：
コー ド鎖 ： T G C T C C A A T C T C T C T A C T— ア ンチコ一ド鎮 ： A C G A G G T T A G A G A G A T G A—
T G C G T T C T G G G G A A G T T G A G T - A C G C A A G A C C C C T T C A A C T C A - C A G G A A T T A C A T A A G C T G C A A - G T C C T T A A T G T A T T C G A C G T T -
A C T T A C C C G C G T A C C A A C A C T - T G A A T G G G C G C A T G G T T G T G A - G G T T C T G G T A C A C C T G G T
C C A A G A C C A T G T G G A C C A。
この発明においては、 まず前記のように設計されたオリ ゴ ヌク レオチ ド、 すなわち、 コー ド鎮については U 1又は U 11、 U 2、 U 3 1、 U 4 1 s U 5、 U 6、.及び U 7又は U 7'を合 成し、 アンチコー ド鎖については L 1又は L 1 1、 L 2、
L 3、 L 3 1、 L 4 1、 L 5、 L 6、 7、 及びし 8又は を合成し、 これを連桔して目的とする構造遺伝子を含有 する D N A断片を化学合成する。 上記の記号により示される オリ ゴヌク レオチ ドの内、 U 1及び L 1で示されるオリ ゴヌ ク レオチ ドは HPa I 末端を形成するものであり、 U l 1及び L 1 1で示されるオ リ ゴヌク レオチ ドは制限酵素 H pa I の認 識配列を形成ずるものである。 また、 U 7及び L 8 はサケカ ルシ トニン誘導体構造遺伝子 （ C T 2 ) を舍有する D N A断 片を合成するためのオリ ゴヌク レオチ ドであり、 U 7'及び U 8^はサケカルシ トニン構造遺伝子 （ C T 1 ) を舍有する D N A断片を合成するためのオリ ゴヌク レオチ ドである。 このようなオリ ゴヌク レオチ ドから百的とする D N A断片 を合成する場合、 まずオリ ゴヌク レオチ ドから複数のサブブ ロ ックを形成し、 次にこれらのサブブロ ックを連結して目的 D N Aを得るのが好ましい。 本発明においては、 第 3図に示 すような各種のサブブロ ックを合成した。 この図において横 棒はオリ ゴヌク レオチ ドを示し、 その一端の黒点はリ ン酸化 された 5 ' —末端を示す。 これらのサブズロ ッ クの連結方式 として例えば次のような方式を使用することができる。 (3-5) (3-7)
Ul U2 U31 U41 U5 U6 U7
+ ( I )
LI L2 L31 L41 L5 L6 L7 L8
(3-6) (3-8)
Ull U2 U31 U41 U5 U6 U7 '
* # * * « «
+ + + ( I )
— # * * し 11 し 31 L41 Lし55 L6 し 7 L8 ' 方式 （ I ) に従えば、 サケカルシ トニン誘導体構造遺伝子を 舍有し、 5 ' 端が HPa I 末端である D N A断片が得られ、 方 式 （ Π ) に従えばサケカルシ トニン構造遺伝子を含有し、 5' 端に制限酵素 Hpa I認識配列を有する D N A断片が得られる < 設計されたオ リ ゴヌク レオチ ドをホスホ ト リ エステル法に より小ュニッ 卜から作り上げる方法、 及び酵素を用いてォ.リ ゴヌク レオチ ドを連結してい く方法は公知である 〔例えば、 . H.Hsivng等、 ニューク レイ ッ ク ' ァシズ ' リ サーチ（Nucleic Acids Research) _6_ 1371 (1979)、 および K. Agarwal 等、 ネイ チユア一 (Nature) 227 27 (1970)参照〕 。 オ リ ゴヌク レ ォチ ドを合成するためには固相ホスホ ト リ エステル法を用い る こ とが好ま しい。
1例として、 オリ ゴヌク レオチ ド L — 3 1を合成する方法 を示せば、 まず樹脂担体上に 3 立の水酸基を用いて固定され たベンゾィ ルデォキシシチジン （以下デォキシシチジンを単 にシチジンと記載する。 デォキシグァノ シン、 デォキシアデ ノ シンもまた同じ） の 5'位の水酸基と、 核酸塩基、 イ ンター ヌク レオチ ドリ ン酸基と 5'位の水酸基が保護されたダイ マ ー ユニッ ト シチジン一グアノ シン （ C G ) のグアノ シンの 位 の水酸基とを、 リ ン酸基の活性化剤を用いて縮合させる。 次に新し く付加したシチジンの 5'位の水酸基の保護基を除 去してダイ マ一ユニッ トアデノ シン一アデノ シン （A A ) と 縮合させる。 このようにして以下、 A G、 C C、 C C、 T T、 A Cのダイマ ュニッ トを順次縮合させることによって保護 基を含むオリ ゴヌク レオチ ド L — 3 1が合成される。
オリ ゴヌク レオチ ド L一 3 1 は、 担体樹脂につながるベン ゾィルシチジンの 位の、 核酸塩基、 イ ンターヌク レオチ ド リ ン酸基とオリ ゴヌク レオチ ド鎖の先端のアデノ シンの 5'位 に存在する保護基をすベて除去することによって得られる。 オリ ゴヌク レオチ ドを連結して構造遺伝子を合成するため には、 酵素反応を用いることが好ましい。 酵素ボリ ヌク レオ チ ドキナーゼとアデノ シン ト リ リ ン酸 （A T P ) を用いてォ リ ゴヌク レオチ ドにリ ン酸基を付加する。 このオリ ゴヌク レ ォチ ドの複数を一旦加熱しさらに再冷却することによって物 理的に凝集させ、 酵素、 T 4ボリ ヌク レオチ ドリガーゼを作 用させて、 オリゴヌク レオチ ド相互の 5'末端のリ ン酸基と 末端の水酸基とを縮合させることにより遺伝子の一部を構成 するサブブロ ックを合成することができる。 構造遺伝子はサ ブブロ ック相互を同様に縮合させることにより製造できる。 サブブロ ック 3 — 5 と 3 — 7 とから C T 2舍有 D N A断片を 形成する場合のラジオォー トグラム図を第 4図に示す。
上記のようにして合成されたサケカルシ トニン又はその誘 導体の構造遺伝子を含有する D N A断片は、 公知の方法によ り適当なブラス ミ ドベクターに揷入する とができる。 ブラ ス ミ ド pHT2にサケカルシ トニン構造遺伝子 （ C T 1 ) 含有断 片を挿入することによりプラス ミ ド pSCT 1が得られ、 同じプ ラス ミ ドにサケカルシ トニン誘導体構造遺伝子 （ C T 2 ) 舍 有断片を挿入することによりプラス ミ ド PSCT 2が得られる
(第 5図） 。 ェ シエ リ シャ ' コ リ (Escherichia col i) RR 1 株をプラ ス ミ ド PSCT 2により形質転換することにより得られ た形置転換体をヱシヱ リ シャ · コ リ （Escherichia coli) RB 1 ZPSCT 2 と称し、 微ェ研菌寄第 77T5号（FERM P-7775) と して、 1984年 8月 17Bに、 通商産業省工業技術院微生物工業 技術研究所 （茨城県筑波郡谷田部町東 1 丁目 1番 3号 〔Fer- mentation eseach Institute, Agency of Industrial
Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry; 1-3, Higashi 1 - chome , Yatabe-cho, Tsukuba- gun, Ibaraki-ken, Japan 〕 （以下 F R I と略す）' に寄託さ れ、 そして 1985年 8月 14日に微ェ研条寄第 866号（FERM BP— 866)として特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する ブタ ペス ト条件に基く国際寄託 （以下国際寄託と略す） に移 管された。 また、 ェ シヱ リ シ ャ ' コ リ (Escherichia coli) R R 1株をブラス ミ ド PSCT 1 により形質転換することにより 得られた形質転換体をェシヱ リ シ ャ · コ リ (Escherichia coli) R R 1 /pSCT 1 と称し、 1984年 8月 17日に微ェ研菌寄 第 7774号（FERM P-7774) として F R I に寄託された。
(2) 融合蛋白質をコー ドす'る D N A断片
一般にカルシ トニ ンのような低分子量べプチ ドを大腸菌で 生産するには、 まず他の蛋白質と融合した安定な高分子量蛋 白質として採取し、 これをイ ン — ビ ト ロで切断して所望の低 分子量ペプチ ドを得ることが得策である。 このような融合蛋 白質を構成する蛋白質として、 本発明のサケカルシ トニン誘 導体の生産においては精製の便利等を考慮してメ タピロカテ カーゼ又はその部分を用いるのが好ましい。 また、 融合蛋白 質を採取した後にこれを切断して百的とする力ルシ トニン誘 導体を得るために切断部位、 すなわちカルシ トニン誘導体の 第 1 ア ミノ酸とメタビロカチカーゼ蛋白質の C末端ア ミノ酸 の間にメチォ二ンを介在せしめるのが好ましい。
従って、 本発明においては、 この部分の D N A断片として、 例えばサケカルシ トニン誘導体をコー ドする遺伝子及びメ チ ォニンのコ ドン A T Gを介してその上流に位置するメ タ ピロ カテカーゼ遺伝子又はその部分からなる D N A断片を用いる ことができる。 このメ タビコカテ力一ゼ遺伝子又はその部分 は、 高い翻訳効率を得るため、 メ タピロカテカーゼ遺伝子の S D配列と、 メ タピロカテカーゼ構造遺伝子又はその部分と から成ることが好ましい。
メ タビロカテカーゼ構造遺伝子部分の大きさは広範囲に変 えることができ、 例えばメ タビコカテカーゼの約 35〜 200偭 の.ア ミノ酸をコー ドする構造遺伝子を使用することができる。 この発明において、 メ タ ピロカテカーゼの 37偭、 98個、 142 偭、 及び 197偭のァ ミノ酸をコー ドする構造遺伝子を用いた 場合、 いずれも本発明のサケカルシ トニン誘導体のペプチ ド を舍む融合蛋白質が発現されることが確認された。
(3) 発現プラス ミ ド
本発明の発現プラス ミ ドは、 大腸菌又はファ ージのプロモ 一ター系、 前記融合蛋白質遺伝子、 及びター ミネータ一系を この順序で含む大腸菌プラス ミ ドである。 プロモータ一系と ' して、 例えば l acUV5系、 P !_ 系、 tac系等を使用する こと ができ、 又ター ミネータ一として例えば λ tL l trp a 等を 使用することができる。
具体的には、 このような発現ブラス ミ ド系として、 例えば 次の表に示すものを挙げることができる プラス ミ ド プ π ター ミ 融合蛋白質の
モーター ネーター ァ ミ ノ酸数
Pし MC2 lacUV5 ス t い 2 3 1
PPMC2 P L ^ t L l 2 3 1
PTMC2 tac trp a 1 7 6
PTMC22 tac trp a 7 1
PTMC32 tac trp a 1 3 2
(4) 形質転換体大腸菌
上記のごとき発現プラス ミ ドにより融合蛋白質を発現せし めるために使用する宿主大腸菌として、 例えば SB791株、 HB101株、 JM103株、. C600株、 RR1株、' SM32株、 W3110株等 を使用することができる。
ほ） 各種ブラス ミ ドの作製及び発現の確認
出発プラス ミ ド
本発明において前記のブラス ミ ドを作製する場合、 カ ルシ トニン誘導体構造遺伝子を舍有する前記ブラス ミ ド pSCT 2か ら適当な制限酵素によつて該構造遺伝子を舍む D N A断片を 切り出し、 これを適当な発現用プラス ミ ドに組み込む。 . 本発明の癸現ブラス ミ ドの作製の系統図を第 6図及び第 7 図に示す。 これらの図中、 〔pSCT 2〕 はカルシ 卜ニ ン誘導体 構造遺伝子を舍む出発ブラス ミ ドであり、 箱で囲んだブラス ミ ドは本発明の発現プラス ミ ドである。
プラ ス ミ ド pSLMKlはプロ モータ一 lacUV5及びメ タ ピロカ テ 力一ゼ遣伝子（C230)を含有するプラス ミ ドであり、 このブラ ス ミ ドを有する大腸菌株ヱシユ リ シャ · コ リ （Escherichia con.) HBlOl/pSLMKlが PERM P-7616として、 W3110ノ pSLMKl が FESM P-7617として、 RBl/pSLMKlが FEIiM P-7618として、 そして RB791ZPSLMK1が FEUM P-7619としてそれぞれ 1984年 5月 11日に F R I に寄託されている。
プラス ミ ド pHT3はプロモーター P L およびメ タピロカテカ ーゼ遺伝子（C230)を含有するプラス ミ ドであり、 これを有す る大腸菌ェシヱリ シャ · コ リ (Escherichia coli) HB 101/ pHT3が FEBM P-7776として、 C600ZPHT3が FERM P-7777とし て、 そして W3110ZPHT3が FEBM P-7778としてそれぞれ 1984 年 8月 17日に F R I に寄託されている。
プラスミ ド pST21 は ト リ ブ トファ ン · プロモーター/オペ レーター系 （trp P/0)及びリ —ダー領域を舍有するブラス ミ ドであ.る。 - プラス ミ ド pTCCMlは tacプロモーター及びメ タビロカテカ ーゼ遺伝子（C230)を舍有するプラス ミ ドであり、 これを含有 する大腸菌ェ シエ リ シャ · コ リ (Escherichia coli) B791/ pTCCMl力 FERM P-7780として、 そして JM103/pTCCMl力く FERM P-7781として、 1984年 8月 17日に F R I に寄託され、 1985年 8月 8 日に微ェ研条寄第 862号（FERM BP-862) として国際寄 託に移管されている。
プラス ミ ド pUC9は公知のプラス ミ ドである 〔J.ビエイ ラ及 び J.メ ッ シ ング， ジー ン （Gene) Vo 19, 259- 258頁，（1982)〕 。
発現プラス ミ ド PL C2
実施例 4 〔第 6図 ， 第 8図 （A ) 〕 に靜細に記載する方法 により、 プラス ミ ド pSL Klと、 pSCT 2 とから.発現プラスミ ド PLMC 2を作製する。 なお、 プラス ミ ド pSCT 2 は実施例 1 に記 載する方法により作製する。 このプラス ミ ド pL C 2 には lacUV5ブ口モーター及びそれに続く メ タピロカテカーゼ遺伝 子（C230)の部分の下流にフ レームが整合するようにサケカル シ トニン誘導体の遺伝子が組み込まれており、 さらにその下 流に tいター ミネータ一が存在する。 メ タピロカテカーゼ の構造遺伝子とサケカルシ トニン誘導体の構造遺伝子との連 結部位は第 8図 （ B ) に示す塩基配列を有する。 このプラス ミ ドの構造遺伝子部分はメ タビロカテカーゼの 197個のア ミ ノ酸、 メ チォニ ン、 及びサケカルシ トニ ン誘導体の 3 3個の ア ミノ酸 （合計 231偭のァ ミ ノ酸） から成る融合蛋白質をコ ー ドする。
このプラス ミ ドを含む大腸菌ェシェ リ シャ ' コ リ （Esche richia col i) JM103/pLMC 2 は、 F R I に微ェ研菌寄第 8220号 (FERM P-8220) として 1985年 5月 10日寄託され、 1985年 8月 14日に微ェ研条寄第 867号（FERM BP- 867) として国際寄託に 移管された。
このプラス ミ ドにより大腸菌 R R 1 を形質転換し、 L B培 地中、 イ ソプロ ピル一 /9 一 D —チォガラク ト ピラノ シ ド（ i so- propyl - β - Ό — th i oga 1 ac topy ranos i de j以下 I PTGと略す） 存在下及び非存在下で培養し、 菌体を集め、 これらの菌体か ら蛋白質を抽出し、 S D Sポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動 にかけた φころ、 IPTG存在下で約 25, 000ダル ト ンの蛋白質が 誘導されていることが確認された。 また、 この蛋白質はサケ カルシ トニン I に対する抗体と反応する こ とがウェスタ ンブ ロ ッ ト法により確認され、 前記約 25, 000ダル ト ンの発現生成 物がメ タ ピロカテカーゼの部分とサケカルシ ト ニン誘導体と の融合蛋白質であることが確認された。 棻現ブラス ミ ド PPMC 2
実施例 5 (第 6図 ， 第 9図） に詳細に記載する方法により プラスミ ド pLMC 2 と PHT31 とから発現プラスミ ド pPMC 2を作 製する。 なお、 プラス ミ ド PHT31 はプラス ミ ド PHT3から実施 例 2に記載する方法により作製する。 このプラス ミ ドは P L プロモーター及びそれに続く メ タ ビロカテカ一ゼ遺伝子
(C230)の部分下流にフ レームが整合するようにサケカルシ ト ニン誘導体遺伝子が組み込まれており、 さ らにその下流に λ t L ターミネ一ターを有する。 このプラスミ ドの構造遺伝 子部分はメ タ ピロカテカーゼの 197個のア ミ ノ酸、 メ チォ二 ン、 及びサケカルシ トニン誘導体の 3 3個のア ミノ酸 （合計 2—31個のア ミノ酸） からなる融合蛋白質をコー ドする。
このプラス ミ ド 舍む大腸菌ェシヱ リ シャ · コ リ .
(Escherichia coli) RRl/pPMC 2 は、 F R I に微ェ研菌寄第 8222号（FESM P- 8222) と して 1985年 5月 10日に寄託され、
1985年 8月 14日に微ェ研条寄第 868号（FERM BP-868) と して 国際寄託に移管された。
このプラス ミ ド pPMC 2 により形質転換された大腸菌は分子 量約 25 , 000ダル ト ンのメ タ ピロカテカーゼの部分とサケカル シ トニン誘導体とから成る融合蛋白質を生産することが前記 のよう にして確認された。
発現プラス ミ ド pTliC 2
実施例 1 0 (第 7図 ， 第 1 2図） に詳細に記載する方法に より プラス ミ ド pTCCMAX と pUCT22とから発現ブラス ミ ド pTMC2 を作製する。 なお、 ブラス ミ ド pTCCMAX は実施例 9 (第 7図， 第 1 2図 A ) に記載する方法により、 プラス ミ ド pTCC lから 作製する。 またプラス ミ ド PUCT22 実施例 6 〜 8、 及び実施 例 3 (第 7図 ， 第 1 0図 ， 第 1 1図 ， 第 1 6図） に記載する 方法によりブラス ミ ド pSCT 2、 pUC9、 ，PST21、 及び pBR322よ り作成する。 プラス ミ ド PT C 2には tacプロモーター及びそ れに繞く メ タビ α力チカーゼ遺伝子の部分の下流にフ レーム が整合するようにサケカルシ トニン誘導体の構造遺伝子が組 み込まれており、 さらにその下流に trp a ター ミネータ—が 存在する。 メ タビロカテカーゼの部分をコー ドする領域とサ ケカルシ ト ニ ン誘導体をコー ドする領域との連結部分の塩基 配列を第 1 2図 Bに示す。
このプラ ス ミ ドの構造遺伝子部分はメ タ ピロカ テカ ーゼの
142個のァ ミノ酸、 メ チォニ ン、 及びサケカルシ トニ ンの 3 3個 0ア ミノ酸 （合計 176個のァ ミノ酸） から成る融合蛋 白質をコ 'ー ドする。
このプラス ミ ドを舍む大腸菌ェシヱリ シャ · コ リ
(Escherichia coli) J 103/pT C 2 は F R I に微ェ研菌寄第 8223号（FERM P-8223) として 1985年 5月 10日に寄託され、 1985年 8月 14日に微工研条寄第 869号（FERM BP-869) として 国際寄託に移管された。
発現プラス ミ ド PT C22
実施例 1 1及び 1 2 (第 7図 ， 第 1 3図） に詳細に記載す る方法により、 プラス ミ ド PTMC12とプラス ミ ド pTCC AX とか ら発現ブラス ミ ド PTMC22を作製する。 このプラス ミ ド PTMC22 には tacプロモーター及びそれに繞く メ タピロカテカーゼ遺 伝子（C230)の部分の下流にフ レームが整合するようにサケカ ルシ ト ニ ン誘導体の遺伝子が組み込まれており、 さ らにその 下流に trp a ター ミネ—ターが存在する。
このプラ ス ミ ドの構造遺伝子部分はメ タ ピロ カ テカ ーゼの 3 7個のア ミノ酸、 メチォニン、 及びサケ力ルシ ト二ン誘導 体の 3 3個のア ミノ酸 （合計 7 1個のア ミノ酸） から成る融 合蛋白質をコ一ドする。
発現プラス ミ ド PT C32
実施例 1 3 (第 7図 ， 第 1 4図） に詳細に記載する方法に より、 ブラス ミ ド PTMC12と PTMC22とから 現ブラス ミ ド pTMC 32を作製する。 このプラス ミ ド PTMC32には tacプロモーター 及びそれに続く メ タピロカテカーゼ遺伝子（C230)の部分の下 流にフ レームが整合するようにサケカルシ トニン誘導体の遺 伝子が組み込まれており、 さ らにその下流に trp a ター ミネ 一ターが存在する。
このプラス ミ ドの構造遺伝子^分はメ タ ビロカテ力一ゼの 9 '8個のア ミノ酸、 メ チォニン、 及びサケカルシ .トニン誘導 体の 3 3個 ア ミノ酸 （合計 132偭のァ ミノ酸） から成る融 合蛋白質をコ一ドする。
このプラス ミ ドを舍む大腸菌ェシエ リ シャ ' コ リ
(Escherichia coli) JM103/pTMC32ま、 F R I iこ微ェ研菌寄 第 8221号（FERM P-8221) と して寄託されている。
プラス ミ ド PT«C 2、 PT C22又は PTMC32のいずれかによつて 形質転換された大腸菌 RB791株のそれぞれを 5 0 μ g/m£ の アンピシリ ンを舍む L B培地で一夜培養し、 この培養液 0.05 m& を 5 m£ の同培地に加え、 3 7 'Cにて振とう培養を行つ た。 いずれの菌株についても IPTGにより誘導を行う場合と行 - わない場合について試験した。 誘導を行う場合.には終濃度が 1 m Mとなるように IPTGを加えた。 培養は合計 8時間行った。 培養後、 培養液菌体を集め、 その全蛋白質を抽出し、 S D Sポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳勖により分折した。 その結果、 PTMC2 を有する株では分子量約 19, 000、 PTMC32 を有する株では分子量約 14, 000のそれぞれの蛋白質が、 IPTG の添加により顕著に誘導されていることが見出された。
2. ゥナギカルシ トニ ン誘導体遺伝子系の作製
(1) ゥナギカルシ トニン誘導体構造遺伝子の作製
前記のごと く 、 ゥナギカルシ トニ ン誘導体においてはサケ カルシ ト ニ ン誘導体中の 2 6 位のア ミ ノ 酸であるァスパラギ ンがァスパラギ ン酸に、 2 7 位のア ミ ノ 酸である ス レオニ ン がバリ ンに、 そして 2 9位のア ミノ酸であるセリ ンがァラニ ンに置き換えられている。 このよ う に、 サケカルシ ト ニ ン誘 導体のア ミノ酸配列と比べて 3個のア ミノ酸が異なるに過ぎ ないゥナギカルシ トニン誘導体の遺伝子の合成は、 すでに合 成されているサケカルシ トニン誘導体遺伝子を、 公知の変異 誘発法、 例えばォリ ゴヌク レオチ ドプライ マ一を用いる特異 的塩基置換変異（Directed mutation) 法により処理すること により行うのが有利である。 従って、 本発明においては、 上 記サケカルシ トニ ン誘導体遺伝子に特異的塩基置換変異をか けることにより、 サケカルシ トニ ン誘導体の第 2 6位、 第 2 7位及び第 2 9位のア ミノ酸であるァスパラギン、 スレオニ ン及びセ リ ンのコ ド ン、 すなわち A A G、 A C T及び T C T をそれぞれァスバラギ ン酸、 ノ、'リ ン及びァ ラ ニ ンのコ ド ン、 例えば G A C、 G T T、 G C Tに変え、 ゥナギカルシ ト ニ ン 誘導体の遺伝子を得る。 これらのコ ドンは塩基配列中で相互 に近接しているため、 1つのプライ マ一オリ ゴヌク レオチ ド、 例えば次の配列 ：
5' TGGTCGTGGTTGCAGCCATGCGC 3'
1 a VarAsp を有する合成ォリ ゴヌク レオチ ドを用いて前記の変異を行う ことができる。
この変異処理は例えば次の様にして行われる。 すなわち、 前記ブラスミ ド PSCT 2を制限酵素 Hpa I及び で切断し て 0. 6 kbp の断片を得る。 他方、 ファ ージ M13mp.9 の 2本鎮 D N Aを S ma I 及び S al I で切断することにより 2. 7 kbp の 断片を得る。 これらを T 4 D N Aリガーゼによって連結し、 これを用いて大腸菌 J M103 を形質転換し、 この形質転換体 を培養することにより 1本鎮組換体ファージ D N Aを得る。 こう して得られた、 サケカルシ トニン誘導体遺伝子のァンチ コ ーディ ング鎮 （負鎖） を舍有する 1本鎮 D N Aを得る。 こ の組換体フ ァ ージを CTM31と称する。 このフ ァ ージ 1本鎮 D N Aを鐯形として前記プライ マーを用いて 2本鎮 D N Aを 形成した後これを精製し、 'これを用いて大腸菌 J M103 を形 質転換する。 次に、 ファ ージプラークを、 例えば32 Pで標識 された次の合成オリ ゴヌク レオチ ドプローブ ：
5' TGGTGGTTGCAGCCA 3'
を用いてスク リ ーニングし、 変異体ファ ージを得る。 この塩 基配列を決定し、 目的とする変異が導入された遺伝子 （ゥナ ギカルシ トニ ン誘導体遺伝子） を舍有するフ ァ ージを選択し、 これを CTM41 と称する。
こ う して得られた、 ゥナギカルシ トニン誘導体をコー ドす る遺伝子は次の塩基配列 ： ' コー ド鎖 ： T G C T C C A A T C T C T C T A C T - ア ンチコー ド鎮 ： A C G A G G T T A G A G A G A T G A—
T G C G T T C T G G G G A A G T T G A G T -
A C G A A G A C C C C T T C A A C T C A - C A G G A A T T A C A T A A G C T G C A A - G T C C T T A A T G T A T T C G A C G T T - A C T T A C C C G C G T A C C G A C G T T - T G A A T G G G C G C A T G G C T G C A A - G G T G C T G G T A C A C C T G G T
C C A C G A C C A T G T G G A C C A
を有する。
なお、 サケカルシ トニ ン誘導体遺伝子 （ファ ージ CTM31 の 部分） 、 ゥナギカルシ ト ニ ン誘導体遺伝子 （フ ァ ー ジ CTM41 の部分） 、 プラ イ マーオ リ ゴヌ ク レオチ ド、 及びプロ ーブォ リ ゴヌ ク レオチ ドのそれぞれの塩基配列を、 サケカルシ ト ニ ン誘導体及びゥナギカルシ > ニ ン誘導体のァ ミノ酸配列と S に第 .1 7図に示す。 .
(2) 融合蛋白質をコ一ドする D N A断片
前記のごと く、 一般にカルシ ト ニ ンのような低分子量ぺプ チ ドを大腸菌で生産するには、 まず他の蛋白質と融合した安 定な高分子量蛋白質として採取し、 これをイ ン ー ビ ト ロで切 断して所望の低分子量べプチ ドを得ることが得策であると言 われている。 このような融合蛋白質を構成する蛋白質として 本発明のゥナギカルシ トニン誘導体の生産においては精製の 便利等の観点からメ タピロカテカ一ゼ又はその部分を用いる のが好ましい。 また、 融合蛋白質を探取した後にこれを切断 して目的とするカルシ トニ ン誘導体を得るために切断部位、 す.なわちカルシ トニ ン誘導体の第 1 ァ ミノ酸とメ タピロカテ カーゼ蛋白質の C末端ア ミノ酸の間にメ チォニンを介在せし めるのが好ま しい。
従って、 本発明においては、 この部分の D N A断片としそ 例えばゥナギカルシ トニン誘導体をコ一ドする遺伝子及びメ チォニンのコ ドン A T Gを介してその上流に位置するメ タビ ロカテカーゼ遺伝子又はその部分からなる D N A断片を用い ることができる。 このメ タピロカテカーゼ遺伝子又はその部 分は、 高い翻訳効率を得るため、 メ タピロカテカーゼ遺伝子 の S D配列と、 メ タピロカテカーゼ構造遺伝子又はその部分 とから成るこ とが好ま しい。
メ タピロカテカーゼ構造遺伝子部分の大きさは広範囲に変 える ことができる。
(3) 発現プラス ミ ド
本発明の発現プラス ミ ドは、 大腸菌プロモーター系、 及び 前記融合蛋白質遺伝子をこの順序で舍む大腸菌プラス ミ ドで ある。 プロモーター系として、 例えば lacUV5系、 P L 系、 tac系等を使用することができる。
冥体的な発現プラス ミ ドの例として、 例えば発現用プラス ミ ド pTCCillに前記ファ ージ CT 41 のゥナギカルシ トニン誘導 体遺伝子を挿入することにより得られる発現ブラス ミ ド pCTM 4を挙げる こ とができる。
プラス ミ ド pTCCMlは tacプロモーター及びその下流にメ タ ピロカテカーゼ遺伝子（C230)を舍有するプラス ミ ドであり、 これを含有する大腸菌ェシヱ リ シャ · コ リ （Escherichia coli) RB791/pTCCMlが FERH P-7T80 と して、 そして JM103/pTCCillが FERMP- 7781として、 1984年 8月 17日に F R I に寄託されてい る。
プラス ミ ド PCT 4の作製に当っては、 第 1 8図 （ A) に示 すように、 ゥナギカルシ トニン誘導体遺伝子 （図中 C Tで示 す） を含有するファ ージ CTM41 の 2本鎮型を EcoRIで消化す ることにより ゥナギカルシ トニン遺伝子の 0位のメ チォニン コ ドンより上流であってその近傍に位置する J_^ RI部位を切 断し、 フィル—イ ンによって平滑化し、 さらにゥナギカルシ ト二ン誘導体遺伝子の下流に存在する S al I 部位を S a 1 I に より切断する。 次にゥナギカルシ トニ ン誘導体遺伝子を含む 590bpの小断片を単離する。
他方、 プラス ミ ド pTCCMlを A va I で消化することにより該 プラス ミ ド中のメ タピロカテカーゼ遺伝子 （図中 C230で示す） の中間に位置する Ava I 部位を切断し、 フ ィ ル— イ ンにより 平滑化する。 次に、 メ タビロカテカーゼ遺伝子の下流に位置 する S al I 部位を S al I により切断し、 メ タピロカテカーゼ 遺伝子の下流部分が除去された 2940bpの大断片を単離する'。
次に、 これらの両断片を T 4 D N Aリガ—ゼにより連結し、 これを用いて大腸菌 J M103 株を形質.転換し、 ゥナギカルシ ト ニ ン誘導体遺伝子が適切に挿入されたプラス ミ ドを含有す ' るク ロー ンをコ ロニーハイ ブリダィゼーショ ン、 塩基配列の 決定等により選択する。 このようなプラス ミ ドの 1 つを PCT 4 と称する。 このプラス ミ ド中のゥナギカルシ トニン誘導体遺 伝子（CT 41由来） の上流部とメ タ ピロ カ テカーゼ遺伝子（pTC C 1 由来） の下流部との連結領域の.塩基配列を第 1 8図 （ B ) に示す。
このブラズミ ド pCTM 4 は tacプロモーターの支配下にメ タ ビコカテカーゼのァ ミノ酸及びその下流のゥナギカルシ トニ ン誘導体の 3 3 ア ミノ酸からなる融合蛋白質 （合計 174ア ミ ノ酸） をコー ドする遺伝子を含有する。 このプラス ミ ドを舍 有する大腸菌ェ シヱ リ シャ · コ リ (Escherichia col i) JM103/ PCTM4 は、 F R I に微ェ研菌寄第 8239号（FERM P- 8239) とし て 1985年 5月 20日寄託され、 1985年 8月 14日に微ェ研条寄第 870号（FERM BP - 870) として国際寄託に移管された。
3. その他のカルシ トニ ン誘導体の遺伝子系の作製
以上、 サケカルシ ト二ン誘導体の遺伝子系、 及びサケカル シ トニン誘導体の構造遺伝子から出発するゥナギカルシ トニ ン誘導体の遺伝子系の作製について記載したが、 '同様にして 一般式 （ I ) で示されるァ ミノ酸配列中の X , Y、 及び Ζに、 この一般式 （ I ) において定義されている具体的なアミノ酸 を適用することにより規定される本発明の範囲に属する各種 のカルシ トニン誘導体の遺伝子系を作製することができる。 すなわち、 本発明のゥナギカルシ ト ニ ン誘導体の構造遺伝子 は、 サケカルシ トニ ン誘導体の構造遺伝子中の該当部分 （第 2 6位、 第 2 7位及び第 2 9位のア ミノ酸をコー ドする部分:） に特定のブライ マ一オリ ゴヌク レオチ ドを用いて特異的塩基 変換変異をかげることによって作製した-が、 適切な塩基配列 を有するプライ マーオリ ゴヌク レオチ ドを用いることによつ て、 該当部分の塩基配列を任意に変え、 任意のカルシ トニ ン 誘導体の構造遺伝子を作製するこ とができる。
次に、 このようにして作製された構造遺伝子を、 例えば前 記のサケカルシ ト ニ ン誘導体遺伝子又はゥナギカルシ ト ニ ン 誘導体遺伝子と同様に操作して発現プラス ミ ドを作製するこ とができ、 そしてこのようにして作製されたプラス ミ ドによ り形質転換された大腸菌を用いて、 後でサケカルシ トニン誘 導体及びゥナギカルシ ト ニン誘導体について詳細に記載する 方法と同様にして、 一般式 （ I ) により定義された任意の力 ルシ トニン誘導体を製造する こ とができる。 3. 融合蛋白質の生産、 単離、 及び魚類カルシ トニ ン誘導 体の製造
前記の各種の発現プラス ミ ドを大腸菌に導入することによ り融合蛋白質生産性の大腸菌株を得ることができる。 このた めの宿主として、 例えば RB791株、 JM103株、 W3110株、
RR1株、 SM32株等を使用することができ、 例えばプラ スミ ド pLMC 2を用いる場合の宿主としては W3110株及び RB791株が 好ましい。
培養は常法に従って、 例えば L B培地中で好気的条件下で 行う。 目的プラス,ミ ドを含有する宿主を維持するため、 培地 中にはアンビシリ ンを例えば 5 0 μ g / m£ 程度添加するの が好ま しい。 菌体濃度が所望濃度、 例えば 550 n mにおける 光学濃度 0. 3 〜 0. 6に達したとき誘導剤として、 例'えば IPTG を、 例えば最終濃度が 1 m Mとなるように添加し、 さらに数 時間、 例えば 2 〜 8時間培養する。
培養終了後、 遠心分離、 濾過等の常法に従って菌体を分離 し、 所望によ り この菌体を適当な缓衝液、 例えば 5 O m Mリ ン酸カ リ ウ ム、 1 0 m M EDTA 緩衝液 p H 7. 5 によ り洗浄す る。 次にこの菌体を、 リゾチーム処理、 超音波処理等の常法 に従って破碎し、 遠心分離により沈澱画分を回収する。 所望 により この沈澱を例えば 5 0 m Mリ ン酸力 リ ウム緩衝液 p H 7. 5 に再懸濁し、 再度遠心分離して沈殺を回収することによ り洗浄する。
このよ う な処理により、 大部分の百的融合蛋白質が沈殺画 分中に回収され、 夾雑蛋白質が上清画分中に溶存し、 除去さ れる。 このような簡単な操作によって S的とする融合蛋白質 を夾雑蛋白質から分離することができることが、 魚類力ルシ ト二ン誘導体をメ タ ピロカテカーゼとの融合蛋白質として発 現させるこの発明の大きな特徴の 1つである。
次に、 こう して得られた不溶性画分をさらに精製するため、 塩酸グァニジン水溶液に溶解し、 この溶液を透折して塩酸グ ァニジンを除去することにより融合蛋白質を沈鏺せしめ、 遠 心分離等の方法により回収する。 所望により、 この沈穀を塩 酸グァニジン溶液に再溶解し、 クロマ トグラフィ ー、 例えば セフアデフ クス G 7 5 カ ラムク ロマ トグラフ ィ ーにより さ ら に精製する こ とができる。
次に、 このようにして回収した融合蛋白質を、 そのメ チォ 二ン部分において常法に従って C N B rにより切断し、 目的とす る魚類カルシ トニ ン誘導体を遊離せしめる。
最後に、 この魚類カルシ トニン誘導体を、 常法に従って精 製する。 この精製においては、 例えば C. 1 8 カ ラムクロマ ト グラフ ィ 一、 C 4.B P力 ラムク ロマ トグラフ ィ ー、 T S K G 2000 S W カラムク ロマ トグラフィ 一等が適当である。
C . 魚類カルシ トニ ンの性質
(1) 精製されたサケカルシ トニン誘導体の分圻
ァ ミノ酸分折の結果を次の表に示す。
Figure imgf000033_0001
表中 Glyの理論値は C末端に G lyを有するものとした場合 の値である。 本発明により得られたペプチ ドのア ミノ酸組成 は目的のサケカルシ トニン誘導体の計算値とよ く一致した。 また蛋白質シーケ ンサ一によ りア ミノ酸配列の決定を行つ たところ、 すべてのァ ミノ酸配列が目的物のそれと'同一であ ることが確認された。 (2) 精製されたゥナギカルシ トニン誘導体の分折
ァミノ酸分折の結果を次の表に示す。
Figure imgf000034_0001
表中 G l yの理論値は C末端に G l yを有するものとした場合 の値である。 本発明により得られたぺプチ ドのア ミノ酸組成 は文献記載のゥナギカルシ トニンに残基のグリ シンが付加し たもののそれとよ く一致した。 また蛋白質シーケンサ一によりアミノ酸配列の決定を行つ たところ、 そのア ミノ酸配列が予想されたゥナギカルシ トニ ン誘導体のそれと同一であることが確認された。
(3) 魚類カルシ ト ニ ン誘導体の生理活性
本発明の魚類力ルシ トニン誘導体はそれ自体としてカルシ トニ ンとしての生理活性を有する。 例えばサケカルシ トニン 誘導体の活性の強さは哺乳動物に対してサケカルシ トニ ンの 1/7程度でヒ ト カルシ トニ ンと同等又はそれ以上である。 従 つて本発明の魚類カルシ ト二ン誘導体は、 医薬として有用で ある。 この生理活性は次の様にして証明された。
Crj :Wistarラ フ ト （日本チ ヤ一ルス · リ バ一株式会社） を 3週齢で雄のみ 120匹購入し、 1週間訓化飼育した後、 健康 な動物を 4週齢で 110匹使用した。
勛物は温度 2 2 ± 2 。 (：、 温度 5 5 ± 1 0 %、 換気 1時間 1 3回、 照明 1 日 1 2時間 （午前 7時〜午後 7時） に自動調 節した飼育室で飼育した。 動物は金属製網ケージ（250 x 350 x 200mm:日本ケージ株式会社） に 5匹ずつ収容し、 同型飼料 (M F： オ リ エ ンタル酵母工業株式会社） および水道水を自 由に摂取させた。
被験化合物として、 本発明の方法により調製したサケカル シ ト ニ ン誘導体 （白色凍結乾燥品） （SGE-1と称する） 、 及び 市販のサケカルシ トニン I ( 白色凍結乾燥品）（ C Tと称する） を使用した。
これらの被験物質を下記の溶媒に溶解し、 10,000 η g / m の被験液を調製した。
ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム 1. 3 m M
ク ェ ン酸 2 2 m M 塩化ナ ト リ ウム 120 m M
ゼラチン 0.16%
p H 6. 0
SGE- 1 は最高投与量を 400tigノ kgとし、 以下公比 2 で 283,200, 141, 100, 71および 5 0 ngノ kgの 7用量を、 C Tは最 高投与量を 4 0 ngZkgとし、 以下公比 2で 2 0、 1 0および 5 ngZkgの 4用量を設定した。 被験液は投与液量が体重 100g にっき 1 ιη£ になるように各用量について溶媒を用いて希訳 調製した。
動物は被験液投与前日の午後 6時より絶食し、 無作為に 110匹を 1群 1 0匹として 1 1群にふり分け、 体重を測定し た。 この体重をもとに被験液を体重 100 gあたり 1. 0 m の 割合で尾静脈内投与した。 投与後正確に 1時間柽過した時か ら動物をエーテル麻酔下で腹大動脈より採血した。 血液は室 温で約 1時間放置してから、 3000rpn> 1 0分間遠心分離し、 血清を探取した。 得られた血清は 0— Cresolphthaiein Con- lexone 法でのカルシウム濃度測定に用いた。 カルシウム濃 度測定には臨床検查自動分折装置 JCA-VX1000 (日本電子株式 会社） を用い、 二重測定した平均値をカルシウム濃度測定値 とした。 ·
得られたデータは、 まず Bartletの方法で各群の等分散性 の検定を行い、 等分散性は否定されなかったので 2 X 3点の 平行線検定により C Tに対する SGE- 1 の比活性を求めた。 結 果を次の表に示す。 CT S GE- 1
5 1 0 2 0 4 0 5 0 7 1 100 141 200 283 400
1 9.0 8.4 7.9 7.2 8.9 9.3 8.6 8.2 7.2 7.8 6.8 2 8.6 8.4 7.6 7.0 9.3 9.0 8.1 7.2 7.3 6.3 6.4 3 8.8 8.3 7.0 6.9 died 7.9 8.0 7.3 7.5 6.8 6.4 4 8.5 7.9 7.7 6.6 8.9 7.9 7.3 7.6 7.6 7.0 6.9 5 8.5 8.7 7.7 6.8 9.0 8.1 8.6 7.6 7.8 6.9 6.3 6 8.5 7.6 7.4 6.4 8.3 8.4 8.1 8.0 7.1 6.6 6.1 7 8.6 8.7 7.3 7.0 8.3 8.2 8.0 7.0 7.0 6.8 7.1 8 8.5 7.9 7.0 6.8 8.4 7.9 7.3 7.5 6.6 6.6 6.2
9 . 8.5 8.4 7.4 7.1 8.8 8.0 7.9 7.7 6.9 7.2 6.7 10 9.0 8.6 7.6 6.5 8.6 8.7 8.5 6.8 7.3 6.9 7.7 平 -均 8.65 8.29 7.62 6.83 8.72 8.34 8.04 7.49 7.23 6.89 6.66
0.21 0.37 0.20 0.26 0.35 0.50 0.47 0:43 0.35 0.40 0.49
(1)投与量は n gZkgで示す。
(2) ¾ ^値 ¾mg,d で示す。
C T投与群では
Figure imgf000037_0001
で直線的な用量相閡がみられ. SGE - 1 では 50〜283ngノ kgで同じ く 直線的な用量相関がみら れた。 平行線検定法では各用量とも同数のサンプルが必要で あるので SGE- 1 の 5 O ng Z kg群は検定には使用できない。 そ のため、 C Tは 10 , 20および 4 0 ng Z kg群、 SGE - 1 は C Tと 公比を同じにするため、 71 , 141 および 283ng Z kg群を用い て 2 X 3点の平行線検定を行った。 その結果単位重量あたり C Tに対して SGE- 1 は約 0. 14倍の活性に相当し、 9 5 %信頼 限界は約 0. 11〜 0. 17倍であった。 サケカノレシ トニンは、 ヒ トに対して、 ヒ トカルシ トニンの 約 20〜30倍の活性を示すと言われているので、 この値は、 こ の発明のサケカルシ トニン誘導体が、 ヒ トに対して、 ヒ トカ ルシ トニンの約 3〜 4倍の活性を示すことを強く示唆してい る。
(4) 天然魚類カルシ トニンの前駆体としての有用性
本発明の魚類カルシ トニン誘導体はまた、 その 3 3位のグ リ シンを公知の方法、 例えば力ルボキシぺプチダーゼ Yによ り ア ミ ドに転換するこ とにより、 〔K.ブレ ツダン、 F.ウイ ド マー及び J.T.ョノヽンセ ン， カールスベルグ · リ サーチ ' コ ミ ュニケ -シ 3 (Carlsberg Res. Conimun. ,45, 237; 45, 361 (1980) 、 3 2位のプロ リ ンがア ミ ド化された天然魚類カル . シ トニンに転換することができる。 すなわち、 本発明の.魚類 カルシ トニン誘導体は活性の高い天然魚類カルシ トニンを製 造するための中間体としでも有用である。
次に実施例により、 この発明をさ らに詳細に説明する。
実施例 1. サケカルシ トニン及びその誘導体の遺伝子の合
盧
オ リ ゴヌク レオチ ドの合成
第 1図〜第 3図に示す 2 3種類のオリ ゴヌク レオチ ドの化 学合成を、 ホスホ ト リ エステル固相法を用いて行った。 例え ば、 完全に保護された L — 3 1 のオリ ゴヌク レオチ ドを合成 するためには、 4 0 rag ( 2. 2 ιηο£ ) のシ ト シンヌク レオシ ドに 1 5 I ^ずつの C G及び A A、 並びに 1 0 ずつの A G、 C C、 C C、 T T及び A Tのダイマーュニッ トを順次反応さ せた。
—回の縮合操作を示せば、 縮合には 2 0 の2,4,16- ト リ メ チルベンゼンスルホ二ルー 3 —二 ト ロ ト リ ァゾリ ド（MSNT) を用い 350 の無水ビリ ジン中で室温 1時間反応した。 反 応後、 固形物をビリ ジンで洗浄し、 ジメ チルア ミノ ビリ ジン を触媒として用いて 1 0 %の無水酢酸ピリ ジン溶液中で室温 3分間キヤ ッ ビング反応を行った。 ピリ ジン、 ジク ロルメ タ ン溶液でそれぞれ洗浄後、 3 % T C Aのジク ロルメ タ ン溶液 1 0 m& で固形物を洗う事により 5'末端の保護基であるジメ トキシ ト リ チル（DMTr)基を除去した。 このあと、 ジク ロルメ タ ン、 テ ト ラ ヒ ドロフラ ン（THF) で洗浄し、 ピリ ジンと共沸 脱水を行う事によって反応容器中の水分を完全 除き、 次の 回の縮合反応へと続ける。 DMTr基の除去率によつて算出した 平均の縮合収率は 9 1 %であった。
次に 4 0 mgのヌク レオシ ドレジンより連続縮合反応によつ て合成した L - 3 1 の保護基を含むォ リ ゴヌク レオチ ドに対 して、 0. 5 Mのピリ ジンアル ドキシムとテ ト ラメ チルグァニ ジン（TMG) の 5 0 %ジォキサン水溶液を 1. 5 πι 加え、 3 0 'Cで 2 日間反応した。 濃縮して溶媒を回収した後、 封眚中で 2 2 %ア ンモニアを舍むピリ ジン水溶液 2 m と 5 5 でで 5 時間反応した。
これらの反応に'より、 ヌク レオシ ドと レジンとの結合が切 断され、 ィ ンターヌク レオチ ド結合のリ ン酸基の保護基と核 酸塩基の保護基が除去された。
レジンを濾別により取り除き、 減圧濃縮によってア ンモニ ァを除去した後、 得られた 5'末端に保護基を舍むオリ ゴヌク レオチ ドを C — 1 8 デイ スポーザブルカ ラム Seppak (Waters) にかけた。 1 5 %の濃度のァセ トニ ト リ ル水溶液 2 0 m を カ ラムに流した後、 3 0 %のァセ ト ニ ト リ ル水溶液 2 m を カラムに加えると目的物が溶離、 流出する。
溶離した画分に等量の酢酸を加え半時間室温で反応して
DMTr基を除去した。 ヱ一テル抽出、 共沸脱水によって酢酸を 除去した後溶媒をエタノ ールに置換し、 3, 000回転で 1 0分 間遠心する事によりオリ ゴヌ ク レオチ ドを沈下させた。 上清 を除去した後、 減圧によってエタノ ールを除き、 蒸留水 100 U ί に溶解した。
HPLCによる精製は ^ Bondpak C- 18 (Waters)カラムを用いて 0. 1 M ト リ ヱチルァ ミ ンアセテー ト水溶液と、 ァセ ト ニ リ ル の溶媒系で行つた。 ァセ トニ ト リル濃度を 1 0 %より開始し、 1分毎に 0. 6 %の勾配で 6 0分間上昇させた。 溶出は 1分間 あたり l m£ の流速で行い目的とするピークのものをフラク シヨ ンコ レクター（Gilson)で集めて凍結乾燥した。
3回に分けて分取操作を行う事により、 精製された L - 31 のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを 21 0D (260m //で測定） 得た。
同様にして、 他のオリ ゴヌ ク レオチ ドも合成した。 合成し たフラグメ ン トに対しては 1次元ホモク ロマ トグラフィ ー法 によって純度を確認した。 2 1個のオリ ゴヌ ク レオチ ドの物 理的性状として 1次元ホモク ロマ ドグラフィ 一における R 値を示す。
配 列 Rf 値
U 1 16mer A A C A T G T G C T C C A A T C 0.14
Ull 19mer G T T A A C A T G T G C T C C A A T 0.09
U 2 17mer T C T C T A C T T G C G T T C T G 0.17 U 3 15mer G G T A A A C T G T C C C A G 0.20
U31 15mer G G G A A G T T G A G T C A G 0.19 U 4 15mer G A A C T G C A T A A G C T G . 0.21
U41 15mer G A A T T A C A T A A G C T G 0.17
U 5 15mer C A A A C T T A C C C G C G T 0.15 U 6 17mer A C C A A C A C T G G T T C T G G 0.10 U 7 18mer T A C A C C T G G T T A A T A G A T 0.10
U 7 ' 15mer T A C、A C C T T A A T A G A T 0.17
L 1 8mer C A C A T G T T 0.26
L 11 15mer C A C A T G T T A A C T G C A 0.14 L 2 17mer A A G T A G A G A G A T T G G A G 0.10
L 3 15mer G T T T A C C C A G A A C G C 0.11
L 31 15mer A C T T C C C C A G A A C G C 0.13
L 15mer G C A G T T C C T G G G A C A 0.13
L 41 15nier G T A A T T C C T G A C T C A 0.15 L 5 16mer T A A G T T T G C A G C T T A T- 0.14
L 6 17mer C A G T G T T G G T A C G C G G G 0.08
L 7 14mer A G G T G T A C C A G.A A C 0.17
L 8 13mer C G A T C T A T T A A C C 0.21
L 8 ' lOmer C G A T C T A T T A 0.25 また半数のオ リ ゴヌ ク レ； ί "チ ドに対しては 2次元ホモクロ マ トグラフィ 一法 （たとえば、 R . Bambara 等、 NAR丄 331 (1974)参照） 又はマクサム、 ギルバー ト法 （たとえば、 A， Maxam 等、 メ ソズ ' ィ ン · ェ ンチモ 口ギー （Methods in Enzymology) 499 (1980)参照） によって純度と塩基配列を 確認した。
オリ ゴヌク レオチ ドによるサブプロ フクの作製
第 3図に酵素反応によつて作製したサブプロ ックの一部を 示す。 例えばサブプロ ック 3 — 5を作製するためには、 サブ プロ フ クを構成する 1 0個のオ リ ゴヌ ク レオチ ドそれぞれ
ΙΟΟρΜを蒸溜水で希釈して 9 £ とし、 l O f C i の r一 〔32 P〕 A T P ( 3100Ci/mmojg ) を加え、 溶液を 5 0 m M Tris塩酸、 p H 9. 6、 1 0 m M MgC & 2 、 2 miIスペルミ ン、 100m MKC^ 、 1 0 m M DTTになる様に調整し、 4単位のボ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼを加え全容積を ' 1 5 μ & とした。
3 7 'Cで 3 0分間反応する事により 5 ' 末端を32 Ρでラベル した。 次にすべての 5 ' 末端をリ ン酸化するために 1 η Μの Α Τ Ρと 1単位のポリ ヌク レオチ ドキナーゼを加え 3 7 でで 6 0分間反応させた。
反応後 1 0個のオリ ゴヌ ク レオチ ドを混合し、 C — 1 8デ イスポーザブル力ラム Seppak (Waters)を用いて前述した方法 で精製した。 溶離した D N A溶液を濃縮しヱタノ ール沈殺処 理を行って D N Aを沈下させた。 上清を除去した後減圧によ つてエタノ ールを除き乾固物を 4 0 ί " のリガーゼ緩衝液
( 2 5 mM N— 2—ヒ ドロキ シェチルビペラ ジ ン N ' - 2 - エタ ンスルホ ン酸（HEPES) p H 7. 8、 7. 5 m M MgC & z ) に 溶解した。 この溶液を 1. 5 m £ 容エ ツ ペン ドルフチュ ーブに 入れ、 6 5 でで 1 0分間、 4 2 でで 3 0分間加熱した後、 0 でにおいて 1 0個のフラグメ ン トを接着させた。 この D N A 溶液を 0. 2 mMの A T P、 6 mMの D T Tを会むリガーゼ緩 街溶液とし、 T 4 リガーゼ 8単位を加え、 全容量を 5 0 とし、 1 2 でで 1 6時間反応させた。
反応溶液を一部取り出し 1 2 %のポリ アク リルア ミ ドゲル 電気泳動で検討した。 ゲルは 7 M尿素を含んだものと舍まな いものの 2種類を用い、 電気泳動を行った後ラジォォ一 トグ ラフ ィ 一 亍レヽ、 デンシ トメ一ター（Helena Laboratories) を用いて反応物の組成を検討した。 その結果 7 8塩基と 9 3 塩基に相当する D N Aが 1 5 %と 2 7 %の割合で生成してい た。 同様にして他のサブブロ ックを合成した （第 3図） 。 合成収率は次の通りであった。
サブブロ ック 収率 （％ )
3 一 1 0. 3
3 - 2 2
3 一 3 8 5
3 - 4 6 5
3 - 5 2 3
3 一 6 3 1
3. - 7 5 0
3 - 8 4 8
この表から明らかなごと く 、 本発明により修正されていな - い塩基配列を有するサブブロ ック 3 - 1 、 及び 3. - 2 の収率 は非常に低かったが、 この発明に係るその他のサブプロ ック の収率は十分に高かった。
サブブロ ックによる全遺伝子の製造
サブプロ ックを連結してヌク レオチ ド配列の全体を作製し た
例えば、 前記方式 （ I ) の方法で全遺伝子を製造するため には、 サブブロ ック 3 - 5 と 3 — 7のリガ一ゼ反応終了後の 反応液各 4 5 & を 1. 5 m 容エツペン ドルフチューブ内で 混合し、 6 5 でで 1 0分間、 4 2 でで 3 0分間加熱した後、 0 でにおいてサブブロ ック D N A相互を接着させた。 この D N A溶液に新たに 3 0 n Mの A T P と 500 η·Μの D Τ Τを 加え Τ 4 リガーゼ 1 2単位を加えて全量を 100 «« とし 1 2 でで 1 6時間反応させた。
反応物の組成を検討すると 113塩基と 115塩基の対合に栢 当する D Ν Αが全体の 2 3 %の割合で生成していた。
次に上記の反応溶液全量を 7 M尿素を含む 1 2 %のポリ ア ク リルア ミ ドゲル電気泳勣により分離した。 ラジオオー トグ ラフィ 一により 目的の D M Aを確認したのち、 その部分のゲ ル片を切り出して透折チューブに入れ、 8 9 m M ト リ スホウ 酸、 2 m MEDTA緩衝液を満たしシールした後、 同緩衝液中で 5 0 Vの定電圧で 1 2時間電気泳動する事によりゲル中の D N Aを溶出させた。 次に D N Aを透折チューブより取り出し 凍結乾燥し、 乾固物を 100 <" の蒸溜水に溶解して、 イ オン 交換ディ スボーザブルカ ラム Elu p- d(Schleicher & Schiiel 1) を用いて精製した。
同様にして前記方式 （ Π ) の方法ではサブブロ ック 3 — 6 と 3 — 8 とを、 オリ ゴヌク レオチ ド L 5、 U 5を介して連結 して、 113塩基と 115塩基の対合に相当する D N Aを全体の 1 1 %の割合で得た。
製造した全遺伝子はすべて T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ と A T Pを用いて 5 ' 末端をリ ン酸化した。
組み替えベクターブラス ミ ドの造成
プラス ミ ド pHT2の H pa I — C 1 a I断片に H pa I 、 及び C lal の制限酵素認識配列が再生するようにサケカルシ トニン又は その誘導体の遣伝子を組み込んだ組み替えプラス ミ ドを造成 した （第 5図参照） 。
プラスミ ド pHT2は発現用ベクター PKC30 (たとえば H .
Shimatake 等ネイ チユア一（Na ture) 292 128 (1981) 参照） に、 pCQV 2 (たとえば、 C. Queen. ジャーナル · ォブ · モ レキュ ラー ♦ ア ン ド . アプライ ド . ゼネテイ クス （j.Mo · Αρρ£ ·
Genetics) _2_ 1 (1983)参照） 由来の C I ts遺伝子を組み込ん で宿主域を広げたブラス ミ ドであり、 一ヶ所の制限酵素 Hpal の切断部位を N蛋白構造遺伝子内に有する。 この切断部位に ァ ミノ酸の ト リ ヌク レオチ ドコ ドンの位相を合わせて外来遺 伝子を挿入する事により P Lプロモーターの発現調整支配下 に N蛋白との雑種蛋白を発現する事が可能である。
PHT2の 2 0 gを 100 £ の C la I 反応液 （ 6 mMTris塩 酸、 ρ Η 7· 9、 6 m M MgC i z 、 5 0 m M NaC ） 中で 1 0 単位の制限酵素 C la I により 3 7 で 6 0分間反応を行い、 ェ タノ —ル沈殺処理によつて D N Aを沈下させた。
この D N A沈澱を 100 <" の H pa I 反応液 ( 1 O mMTris 塩酸、 p H 7. 5、 7 m M MgC & 2 、 100m KC i . 7 m M ^ メ ルカプ トエタノ ール） に溶解し制限酵素 H pa I を 1 5単位 加えて 3 7 で 9 0分間反応を行った。 さ らに反応液に、 大腸 菌アルカ リ フォスファ タ一ゼ 0.08単位を加え 6 5 'c 3 0分間 反応させて 5 ' 末端を脱リ ン酸化した。 反応液を 100 <" の フヱノ ールで洗浄したあと 0. 7 %ァガロースゲル電気泳動を 行い、 大きな D N A断片を電気泳動法によって回収した。
このよう にして得た pHT2の C la l — Hpa l 断片 D N A0. 5 pmo£ と、 5 ' 末端にリ ン酸基を有するサケカルシ トニン又 はその誘導体の構造遺伝子を含有する D N A断片 0.5pmOJg を、 T 4 D N Aライゲーショ ン反応液 2 0 ( 2 5 m M HBPES. p H 7. 8、 7. 5 m M gC & 2 、 0. 2 m M ATP. 6 m M DTT) に溶解して、 T 4 D N Aリガーゼ 3単位と 2 0 で 1 6時間反 応し、 そのうちの 1 0 を用いて大腸菌株 R R I に形質転 換させ 100 g Zm のア ンビシリ ンに耐性の形質転換体を 選んだ。 このようにして、 サケカルシ トニン構造遺伝子（CT1) を舍有するプラス ミ ド（pSCTl) により形質転換されたエシュ リ シャ . コ リ (Escherichia coli) Rl/pSCT 1、 及びサケカ ルシ トニン誘導体構造遣伝子（CT2) を含有するプラス ミ ド (PSCT2) により形質転換されたェシヱ リ シャ · コ ひ
(Escherichia col i) RRl/pSCT 2 を得た。
合成サケカルシ ト二ン遺伝子及びサケカルシ ト二ン誘導体 遺伝子の塩基配列の確認
上記プラスミ ド中のサゲカルシ トニン又はその誘導体の遺 伝子の塩基配列を分折するため、 PSCT 1、 pSCT 2 の各プラス ミ ド を 1 5単位の制限酵素 Hpa I を用いて切 断し、 大腸菌アルカ リ フォスファ ターゼにより 5 ' 末端を脱 リ ン酸化した後 r 一 〔 32 P〕 A T P及びポリ ヌク レオチ ドキ ，ナーゼを用いて 5 ' 末端を32 P ラベルした。 次に 1 5単位の 制限酵素 B amH 1を用いて分解後目的とする D N A断片を精 製し、 マクサム、 ギルバー ト法により塩基配列を決定した。 その結果、 すべてのプラスミ ドは設計通りの塩基配列を有し ていた。
実施例 2. プラス ミ ド PHT31の作製 （第 6図 ， 第 1 5図) 第 1 5図）
pHT3プラス ミ ド 5 «« 及び 1 5ュニッ トの B amHIを緩衝液 ( 1 0 mil Tris-HC£ pH8. 0、 7 mM MgC & 2 、 lOOmM NaC ヽ 2 mM ーメ ルカプ トエタノ ール） 2 0 a n 中で 3時間反応さ せた。 工タノ 一ル沈殺後、 沈澱物を緩衝液 （ 5 0 raM Tris- HC£ p H 7. 2、 1 0 m MgC £ z . 0. 1 mM D T T、 8 0 M dNTP) 2 0 中、 1 ユニッ トのク レノ ウ断片と 2 2 でで
0. 5時間反応させた。 フヱノ ール処理後、 エタノ ール沈鏺を 行った。 沈殺物を、 緩衝液 （lOmM Tris-HC^ PH 7. 5 . 7 mM MgC 2 、 6 0 mM NaCjg 、 7 mM 2 —メ ルカプ トエタノ ール） 2 0 中、 2 0ユニッ トの P vu Π と 3 7 でで 3時間反応さ せた。 ヱタノ ール沈殺後、 沈殺物を緩衝液 （66mM Tris-HC^ pH 7. 6、 6. 6 mM MgC £ 2 、 1 0 D T T、 1 mM A T P ) 2 0 中、 T4 D N A リ ガーゼ 2. 8 ユニ ッ ト と共に 1 5 でで 2 0時間反応させた。 この反応物を用いて、 エシュ リ シャ · コ リ HB101株を形質転換した。 ア ンビシリ ン耐性形質転換株 の中から、 第 1 5図に示すような PHT31 プラスミ ドをもつ菌 株を単離した。
実施例 3. プラス ミ ド pKTL 1 の作製 （第 7図 ， 第 1 6図) 1 3 gの pST21 を 4 0 の Hinf I 緩衝液中で 1 8ュニ ッ トの Iで 3 7 'C 3時間消化した後エタノ ールで沈殺さ せた。 これを 8 0 M dNTPを含む 2 5 < " のニック トラ ン スレーシ ョ ン緩衝液中で 2 ュニ ッ トの D N Aポリ メ ラーゼ I lenow フラグメ ン ト と室温で 3 0分間反応させた。 反応 後、 7 0 'Cで 5分間処理した後、 フヱノ ールで処理し、 エタ ノ ールで沈藏させた。 沈殺を 4 0 β i の JL^ I緩衝液に溶解 し、 6 ユニッ トの Hpa I で 3 7 で 1. 5時間消化した後、 エタ ノ ールで沈殺させた。 これを 0.02O D 26O ユニ ッ トの H ind
Π リ ンカ -と 2 0 の T 4 リガーゼ缓衝液中で 350ュニッ トの T 4 リガーゼを用い 2 2 で 6時間反応させ、 エタノ ール で沈殺させた。 これを 4 0 の H ind II緩衝液中で 5 0ュ ニッ トの H ind 111を用い 3 7 で 1. 5時間消化した。 これを 6 %アク リルア ミ ドゲル電気泳動し、 200 b pの D N A断片 (1) を泳動溶出により単離した。
3 β gの pBR322を 4 0 の H ind I緩衝液で 5 0ュニッ トの H ind Πで 3 7 で 3時間消化した後： エタノ ールで沈穀 させた。 これを 200 の 5 0 mM Tris-HC ( H 8.0 ) に溶 解し、 0.04ュニッ トのアルカ リ ホスファタ一ゼで 6 5 'c 3 0 分間反応させた後、 フユノ ールで処理し、 0 入断片(2)をェ タノ一ルで沈殺させた。
D N A断片 (1) (約 0. 5 g ) と D N A断片 (2) (約 3 g ) を Elutip-d(Schleicher & Schue 11 )カ ラムで精製した後、 ェ ' タノ ールで沈殺させた。 これを 2 0 の T4 リガーゼ緩衝 液に溶解し、 350ユニッ トの Τ 4 リガーゼを加え 1 6 'c、 8 時間反応させた-。 3 £ のこの反応溶液 （約 0. 6 g D N A を含む） を用い大腸菌 R R 1株を形質転換した。 5 0 gノ e アンビシリ ンを舍む L B寒天培地で得られた株の中から 1 5 μ g /m£ のテ ト ラサイ ク リ ンを舍む L B寒天培地で生 育できない株を選択した。 これらの株からプラスミ ドを抽出 し、 4. 4 Kb前後のプラス ミ ドを検索した。 さ らに H ind I . R sa I、 H inf I、 E coR I / B amH Iの消化バターンにより 目的 のプラス ミ ドを選択した。
実施例 4. プラス ミ ド pLMC 2 の作製 （第 6図 ， 第 8図)
2 0 g の pSCT 2を 150 £ の Hpa I 緩衝液中で 3 0 ュニ y トの 'HPa I で 3 7 °c , 3時間消化した後、 エタノ ールで沈 澱させた。 0.02O D 26。 ュニッ 卜の S ai l リ ンカ一 d (GGTC GACC) を 1 0 m M A T Pを含む 1 0 £ のキナーゼ緩衝液 ( 5 0 mMTris一 HC 、 p H 7. 6、 1 0 m M MgC 2 、 1 0 m M 2 —メノレカプトエタノ ール） 中で 4 ユニ ッ ト の T 4キ ナーゼと 3 7 で、 1時間反応させた。 この反応液 5 /i £ と Hpa I で消化した D N Aとを 2 0 μ H の Τ 4 リガ一ゼ緩衝液 ( 6 6 m M Tris-HC t、 p H 7. 6、 6. 6 m M MgC £ 2 、 1 0 ni Mジチオス レィ トール、 0. 4 m M A T P ) 中で 350ュニッ トの T 4 リガーゼと共に 2 2 で、 5時間反応させた後ェタノ 一ルで沈殺させた。 沈殺を 5 0 μ & の S al I緩衝液 （ 1 0 m M Tris-HC 、 p H 7. 5、 7 m M MgC 2 、 175m M NaCjg 、 0. 2 mMEDTA. 7 m Mメ ルカブ ト エタノ ール） に溶解し 4 0 ュ ニ ッ ト の I で 3 7 で、 3時間消化した。 反応溶液を 6 % ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動にかけ、 600 b p の D N A断片 (1)を泳動溶出により単離した。
I 0 gの pSLMKlを 100 の S al I緩衝液中で 4 0ュニ ッ ト (D S al I で 3 7 で 、 5時間消化した後、 エタ ノ ールで沈 殺させた。 これを 200 の 5 0 m M Tris-HC ( p H 8. 0 ) に溶解し、 0.04ュニ ッ ト のアルカ リ ホスフ ァ タ 一ゼで 6 5 3 0分間反応させた後フヱノ ールで処理し、 エタノ ールで沈 殺させた（2)。
(1)の D N A断片 （約 0. 5 <" g ) と（2)の D N A断片 （約 1 g ) を Elutip-d (商標）（Schleicher &Schue 11 )カ ラ ムで精製 した後、 エタノ ールで沈殺させた。 これを 2 O の T 4 リ ガーゼ緩衝液に溶解し、 350ユニッ トの Τ 4 リガーゼを加え 1 6 'C . 5時間反応させた。 この反応溶液 5 μ & を用い大腸 菌 R R 1株を形質転換した。 5 0 μ E / mil のア ン ビシ リ ン を含む L B寒天培地で得られた株の中から 1 %カテコ—ル水 溶液の噴霧により黄色を呈さないものを選択した。 これらの 株よりプラスミ ドを抽出し、 EcoR I , S al I , R sa I / Ava I の消化バターンより 目的のブラス ミ ド PLMC 2を選択した。
実施例 5. プラスミ ド PPMC 2 の作製 （第 6図 ， 第 9図) 2 0 gの PLMC 2を 200 の_§_^丄 I緩衝液中で 4 0ュニ ッ トの S al I で 3 7 'Cで 3時間消化した後、 エタノ ールで沈 緵させた。 反応溶液を 0. 7 %ァガロースゲル電気泳勳にかけ、 600 b p の D N A断片 (1)を泳動溶出により単離した。
2 0 ^ gの PHT31を 200 μ & の S al I緩衝液中で 4 0ュニ ッ トの S al I で 3 7 'Cで 3時間消化した後に、 エタノ ールで 沈穀させた。 これを 200 の 5 0 m M Tris-HC^ ( p H 8. 0 ) 緩衝液に溶解し、 0.04ュニッ トのアルカ リ ホスファタ —ゼで 6 5 で、 3 0分間反応させた後、 フヱノ ールで処理し、 エタノ ールで沈殺させた。 この反応溶液を 0. 7 %ァガロース ゲル電気泳動し、 5. 2 K b の D N A断片 (2)を泳動溶出により 単離した。
(1)の D N A断片 （約 と（2)の D N A断片 （約 5. 5 K b ) を Elutip-d (商標） Schleicher & Schue 11 )カ ラムで精製 した後エタノ ールで沈滠させた。 これを 2 () 01^ リガ ーゼ緩衝液に溶解し、 350ユニッ トの T4 リ ガーゼを加え 1 2 でで 2 4時間反応させた。
この反応溶液 1 0 μ & を用い大腸菌 R R 1株を形質転換し、 3 2 でで 5 0 μ g / mi アンビシリ ンを舍む L B寒天培地上 で一晩培養した。 これをさらに 4 2 でで 1時間培養後、 1 % カテコール水溶液の噴霧により黄色を呈さないものを選択し た。 5 0 g Zmjg のアンビシリ ンを舍む L B培地で一晩培 養し、 同組成の培地に 1 %接種し、 さ らに培養した。 0 D 660 = 0. 3において 3 2 でから 4 2 でに昇温しさ らに 3 時間培養した。 培養液 l mjg を遠心し、 沈澱を 12.5% S D S ポリアク リルア ミ ドゲル電気泳動にかけ、 25, 000ダル トンの 蛋白質が大き く誘導される株を選択した。 これらの株からプ ラスミ ドを抽出し、 5. 2 K b前後のプラス ミ ドを検索した。 次に S al I消化バターンにより予想される大きさの D N A断 片を示すものを選択した。 これらのプラス ミ ドで大腸菌 SK383 株を形質転換し、 その株からブラス ミ ドを抽出し、 _QJj_ I の 消化パターンにより 目的のプラス ミ ドを選択した。
実施例 6 プラス ミ ド PSCT12の作製 （第 7 , 第 1 0図) 大腸菌 SK383ZPSCT 2株から得られたブラス ミ ド D N A 5 gを 100 ί の C la I緩衝液 （ 1 0 m M Tris-HC£ 、 p H 7. 5、 7 m M MgC Si 2 、 7 m M 2 —メ ルカブトエタノ ール） 中 2 8ュニッ トの C la I と.共に 3 7 'C、 9 0分間反応させた 後、 フヱノ ール抽出を行い、 エタノ ールにより沈藏'させた。 次にこれを 0. 2 πχ Μの dGTP, dATP, ΤΤΡ, dCTP を舍む 2 0 J2 ■ のニッ ク ト ラ ンス レーショ ン緩衝液 （ 5 0 m M Tris-HCjg 、 P H 7. 2、 1 0 m MMgS04 、 1 m Mジチオスレィ トール） に 溶解し、 大腸菌 D N Aボリ メ ラーゼ I ' ラージフラグメ ン ト 5ュニッ トを加え、 2 2.で、 3 0分間反応させた。 フヱノ ー ル抽出およびエタノ 一ル沈殺を行った後、 活性化した S al I fンカー 0.02Ο D とともにリ ガーゼ緩衝液 2 0 に溶解 し、 T 4 D Ν Αリ ガ一ゼ 700ユニッ トを加え、 1 2 で、 1 2 時間反応を行った後、 エタノ ュル沈殺を行った。 これを . S al I 緩衝液 5 0 に溶解し、 2 4ュニッ トの S al I を加 えて 3 7 で、 120分間反応させた。 6 5 で、 1 0分間の熱処 理を行い、 さ らにエタノ ール沈殺を行った。 これをリガーゼ 緩衝液 200 に溶解し、 T4 D N Aリガーゼ Π0ュニッ ト を加えて 2 2 で、 5時簡反応を行つた。 この反応液 5 0 ί を用い、 HB101株の形質転換を行つた。 アンビシリ ン 5 0 g m& を含む L B寒天培地上で得られた形質転換株からホ ルメ ス及びク イ グレイ の方法 〔D.S.ホルメ ス及び M . ク イ グ レイ、 アナリ ティ カル ' ノ イ オケ ミ ス'ト リ ー（Anal.Biochem.) Vol 114 、 193-197 (1981) 〕 によって抽出したプラスミ ドの う ち、 S al I消化、 および S al I - H pa I 二重消化のバタ一 ンにより、 目的のプラス ミ ド PSCT12を選択した。
実施例 7. プラス ミ ド PUCT12の作製 （第 7図 ， 第 1 1図)
( i ) 1 0 gの p(JC9 を H indm緩衝液 ( 1 0 mM Tris- HCJ8 、 p H 7. 5 7 m M MgC 2 、 6 0 m M NaCjg ) 100 M a に溶解し、 3 5ュニク ト H indlを加え.て 3 7で、 2時間反応させて消化した後、 エタノ ール沈殺を行った。
( ϋ') この沈鏺にニッ ク'ト ラ ンスレーショ ン緩衝^ 2 0 £ を加え、 各 2 mMの dGTP, dATP， dCTP, TTPを含む溶液 2 β d 、 および大腸菌 D N Aボリ メ ラーゼ I Klenowフラグ メ ン ト 2. 5 ユニッ トを加え、 2 2 で、 3 0分間の反応を 行い、 反応終了後フエノ ール抽出およびエタノ一ル沈殺 を行った。
( in ) これにリガ一ゼ锾衝液 （ 6 6 mM Tris-HC 、 6. 6 m M MgC i z 、 0. 4 m M ATP. p H 7. 6 ) 2 0 〃 およ び活性化した X ho I リ ンカー d (CCTCGAGO0.020 Dを加 えて混合し、 さ らに T 4 D N Aリガーゼ 350ュニッ トを 加え、 1 2 でで 1 2時間反応を行った。
( iv ) この反応物をエタノ ール沈殺させた後、 100 の
Sal I緩衝液に溶解した。 この溶液に S al I および X ho I をそれぞれ 2 5ユニッ ト加え、 3 7 'cで 4時間反応さ せた。
( V ) これに 5 0 m M Tris-HC£ 锾衝液 （ p H 8.0) 100 μ & および大腸菌アル力 リ ホスファターゼ 0.04ュニッ トを加 え、 6 5 で、 3 0分間の反応を行った。 続いて 2回のフ
Λノ ール抽出およびエタノ一ル沈殺を行い、 この沈澱を 200 & の Τ Ε緩衝液 （ 1 O m M Tris-HC 、 1 m M EDTA 、 p H 8. 0 ) に溶解した。
( vi ) 2 0 μ gの pSCT12を 100 £ の H pa I緩衝液に溶解し、 P£ 1 3 5ユニッ トを加え、 3 7 でで 4時間反応させて 消化した後、 エタノ ール沈毅を行った。
(νϋ) この消化物に対する Xho I リ ンカーの付与および
S al I、 X ho I による消化を、 （ iii ) 、 （ iv ) に示した ものと同様の方法により行った。 さ らにこの全量を、 6 %ボリアク リ ルア ミ ド電気泳動に供し、 ヱチジゥムブ口 マイ ドで染色した後、 約 120 b p の D N Aフ ラ グメ ン ト を電気泳動溶出により回収した。
(viii) 回収したフ ラ グメ ン ト溶液に、 （ V ) で獲られた D N A溶液 5 0 β & を加え、 EluUp-dカ ラム（Schleicher ί Schull) による処理を行った後、 D N Aをエタ ノ ールで 沈殺させた。
( ix ) この沈毅にリガーゼ緩衝液を 2 0 、 及び T 4 D N Aリガーゼを 8 0 ユニ ッ ト加え、 1 6 'Cで 1 0時間反応 させた。
( X ) この反応液 5 μ ί を用い、 大腸菌 HB101株に対して形 . 質転換を行い、 5 0 〃 gノ ftijg のア ンピシ リ ンを含む L B寒天培地 （ 1 %バク ト ト リ プ ト ン、 0. 5 %酵母ェキ ス、 1 % NaC 、 p H 7. 4、 1. 5 %寒天） 上で生育する コロニーを得た。
(xi) 得られた形質転換株から、 ホルメ ス及びクイ グレイ
(前掲） の方法によりプラスミ ド D N Aを抽出し、 その 大きさおよび制限酵素開裂バタ一ンが PUCT12と一致する プラスミ ドを選択した。
実施例 8. プラス ミ ド PUCT22の作製 （第 7図 ， 第 1 1図) I 0 μ gの pUCT12を 100 & の E coRI緩衝液 ( 5 0 m M Tris-HC^ 、 p H 7. 5、 7 m M MgC & 2 、 100m M NaC 、 7 m M 2 —メ ルカプ トエタノ ール） に溶解し、 2 2 ユニッ ト の E coRIを加え、 3 7 'Cで 2時間反応させて消化した後、 ェ タノ ール沈殺を行った。 この沈殺を 100 の B amHI緩衝液
( 1 0 m Tris-HCjg 、 p H 8.0、 7 m M MgC £ 2 、 100 m M NaC^ 、 2 mM 2 —メ ルカプ トエタノ ール） に溶解し、 2 4ュニッ 卜の B amHIを加え、 3 7 'Cで 2時間反応させて消 化した。 この EcoBI - B am.HI二重消化物について、 実施例 7 ( V ) と同様の方法により、 5 ' 末端の脱リ ン酸を行い、 ェ タノ一ル沈殺を行った（1)。
3 0 gの pKTL 1を 100 の E coRI緩衝液に溶解し、 E coRI 9 0ュニッ トを加え、 3 7 'Cで 4時間反応させて消化 した後、 エタノ ール沈殺を行った。 この沈殺を 100 <" の B amHI緩衝液に溶解し、 7 2ュニッ トの B amHIを加え、 3 7 でで 2時間反応ざせて消化した後、 ェタノ一ル沈殺を行った。 この消化物を 1 %ァガロースゲル電気泳動 （ 5 0 m M Tris- borate. 1 m M EDTA 、 p H 8.3)に供し、 ェチジゥムブロマ ィ ドで染色した後、 約 600 b p の D N Aフラグメ ン トを電気 泳動溶出により HI収した。 回収したフラグメ ン トは Elutip-d カラムによる処理を行った後、 エタノ ールで沈殺させ、 5 0 μ & のリガーゼ缓衝液に溶解した。
このフラグメ ン ト溶液 2 5 β & を前記の D Ν Α消化物 (1)に 加えて混合し、 さ らに T 4 D N Aリガーゼを 8 0ュニッ ト加 5 え、 1 5 でで 6時間反応させた。
この反応物を 5 ϋ 用い、 大腸菌 HB101株に対して形質転 換を行い、 5 0 μ g /mi のアンビシリ ンを舍む L B寒天培 地上で生育するコ ロニーを得た。 得られた形質転換株からプ ラス ミ ド D N Aを抽出し、 その大きさおよび制限酵素開裂バ0 ターンが pUCT22と一致するプラス ミ ドを選択した。
実施例 9. プラス ミ ド pTCCMAX の作製 （第 7図 ， 第 1 2図） 5 g の pTCCMlを 5 0 £ の A va I緩衝液 （ 1 0 m M - Tris-HC 、 p H 8. 0 、 7 m M MgC 2 、 6 0 m M* NaC£ 、
7 m M 2 —メノレカプ トエタノ ール） に溶解し、 2 0ユニッ ト5 の Ava I を加え、 3 7 で、 2時間の反応により消化した後、 エタノ ール沈澱を行つた。 この沈澱を 2 0 ^ のニ ッ ク ト ラ ンス レ一 シ ヨ ン緩衝液に溶解し、 2 m Mの dGTPおよび dCTPを 含む溶液 2 μ & 、 および大腸菌 D N Aポリ メ ラーゼ Klenowフ ラグメ ン ト 2. 5 ユニッ トを加え、 2 2 'C 、 3 0分間の反 、を0 行い、 さらにエタノ ールにより D N Aを沈穀させた。 沈澱を
200 の S 1緩衝液 （ 3 0 m M酢酸ナ ト リ ウ ム、 p H 4. 6 、 5 0 m M NaCjg 、 1 m M ZnS04、 5 0 %グリ セロール） に溶 解し、 3 ユニ ッ ト の S 1 ヌ ク レアーゼを加えて、 3 7 で、 1 0分間の反応を行った。 こ の反応物について、 フヱ ノ ール5 抽出およびエタノ ール沈殺を行った。 さらに実施例 7 ( ϋ , in ) と同様の方法により X ho I リ ンカーの付与を行った。 こ の反応物を用いて大腸菌 JM103株に対する形質転換を行い、 5 Q μ g / m & のアンビシリ ンを含む L B寒天培地上で生育 するコロニーを得た。 得られた形質転換株からプラスミ ド
D N Aを抽出し、 その大きさおよび制限酵素開裂バター ンが pTCCMAXと一致するブラス ミ ドを選択した。
実施例 10. プラスミ ド pTMC 2 の作製 （第 7図 ， 第 1 2図)
( i ) 1 Q u gの PUCT22を 5 0 の Xho I 緩衝液 （ 1 0
m M Tris-HCjg 、 p H 7. 5、 7 m M MgC & 2 、 100 m M NaCi 、 7 m M 2 —メ ルカプ トエタノ ール） に溶解し、
2 5ュニッ トの X ho i を加えて 3 7 で、 2時間反応させ た後、 エタノ ール沈穀を行った。
( ii ) 実施例 7 ( ϋ ) と同様の手法により、 Klenowフラグメ · ン トによる処理を行い、 ェタノ一ル沈穀を行つた。
( iii ) この沈殺にリガ一ゼ緩衝液 2 0 μ & 、 および活性化し
た HPa I リ ンカー 0.050 Dを加えて混合し、 さらに
D N Aリガーゼ 350ュニッ トを加え、 12.5でで 1 0時間 反 £、を行った。
( ίν ) この反応物をヱタノ ール沈殺させた後、 5 0 ^ " の
Hpa I緩衝液に溶解し、 1 8ュニッ 卜の H pa I および
2 4ュニッ トの B an HIを加え、 3 7 でで 2時間反応させ た。
( V ) この消化物全量を 1 %ァガロースゲル電気泳動に供し、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色した後、 約 690 b p の D N Aフラグメ ン トを電気泳動溶出により回収した。
( vi ) 5 gの pTCCMAXを 5 0 ^ £ の X ho I緩衝液に溶解し、
2 5ュニッ 卜の X ho i を加えて 3 7 で、 2時間反応させ た後、 エタノ ール沈殺を行った。
( vii) 実施例 7 ( ϋ ) と同様の手法により、 Klenowフラグメ ン トによる処理を行つた。
( viii ) この線状 D N Aに対する H pa I リ ンカ一の付与および
B an fflによる消化を、 ( ϋί ) , ( ίν ) と同様の方法によ り行った。
( ix ) この消化物の半量を 1 %ァガロースゲル電気泳動に供
し、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色した後、 約 3. 4 K b の ' D N Aフラグメ ン トを電気泳動溶出により回収した。
( X ) 得られた D N A溶液を、 （ V ) で得られた D N Aと混
合し、 これを Elutip-dにより処理した後、 エタノ ール沈 殺を行った。
(xi) この沈殺にリ ガ一ゼ緩衝液 2 0 および T 4 D N A
リガ-ゼ 170ユニッ トを加え、 1 6 で、 8時間の反応、を 行った。
(X ii ) 反応物の半量を 0. 7 %ァガロースゲル電気泳動に供し、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色した後、 約 4. 1 K b 0 D N
Aフラグメ ン トを電気泳動溶出により回収した。
(x iii ) 回収した D N Aを用いて大腸菌 JM103株に対して形質
転換を行い、 5 0 μ g / S, のアンビシリ ンを舍む L B 寒天培地上で生育するコ ロニーを得た。 得られた形質転 換体からプラス ミ ド D N Aを抽出し、 その大きさが約
4.1 K b のものを選択した。
実施例 11. プラス ミ ド PTMC12の作製 （第 7図)
3 M. S Φ PTMC2を 100 M i C X ho I緩衝液（10mM Tris- HC^ 、 PH7.5 、 7mM MgC & 2 、 lOOmM NaCU 7 mM 2 了 メ ノレカプ ト エタノ ール） 中、 1 0ユニッ トの X ho I を用いて 3 7 °Cで、 1 5時間消化した。 エタノ ール沈殺の後、 各々 0.2 m Mの
dGTP、 dATP TTP 、 dCTPを舍むニ ッ ク ト ラ ンス レーショ ン掙 衝液 2 0 <« ί に溶解し、 D N Aポリ メ ラーゼ I ク レノ ウ断片 2ユニッ トを加え、 2 2 でで 3 0分間反応させた。 フエノ ー ル抽出およびエタノ ール沈殺の後、 活性化した Hpa I リ ンカ -dGTTAAC 1 g とともに 2 0 のリガ一ゼ緩衝液に溶解 し、 T 4 D N Aリガ一ゼを 700ュニッ ト加えて、 2 2 でで 8 時間反応を行った。 この反応液を用いて大腸菌' JM 103株を形 質転換し、 PTMC12を有する形質転換株を選択した。
実施例 12. プラス ミ ド PTMC22の作製 （第 7図 ， 第 1 3図) 2 0 g の pTCCMAXを 100 £ の H indm緩衝液中、 6 0 ュニッ トの Xho l および 5 0 ュニッ トの H indJTにより、 37 •Cで 3時間消化した。 これをボリ アク リルア ミ ドゲル電気泳 動に供した後、 約 640 b p の D N A断片を電気泳動溶出によ . り単離した。 エタノ ール沈殺の後、 この D N A断片を 100 の S au3A I で緩衝液（10mM Tris- HC & . pH7.5 7m MgC SL 2 lOOmM -'NaC ） 中、 1 6ュニッ トの S au3A I で 2時間消化し た。 さらにエタノ ール沈穀を行い、 この沈殺を、 0.2mM の dGTP、 dATP. TTP 、 dCTPを含むニック ト ラ ンスレ一ショ ン緩 衝液 2 0 β £ に溶解し、 D N Aボリ メ ラーゼ I ク レノ ウ断片 2ユニッ トを加え、 2 2 'Cで 3 0分間反応させた。 フヱノ 一 ル抽出、 エタノ ール沈殺の後、 活性化した Hpa I リ ンカ一 l «" g とともに 2 0 ^ " のリガーゼ緩衝液に溶解し、 T 4 D N Aリガ-ゼを 700ュニッ ト加えて、 1 2 で、 1 2時間の 反応を行つた。 ヱタノ一ル沈鏺の後、 この反応物を 5 0 & の H pa I緩衝液（lOmTris - HC ヽ H7.5 . 7mM MgC
lOOmM KC1 、 7mM 2-メ ノレカプ トエタノ ール） に溶解し、 1 8 ユニッ トの Hpa I により、 3 7 でで 2時間消化した。 さらに エタノ ール沈穀を行つた後、 これを 5 0 の EcoRI緩衝液 (50mM Tris -HCJ2 、 pH7.5 、 7mM MgC SI 2 、 100 mM NaC £ 7 mM 2—メ ルカブ トエタノ ール） に溶解し、 2 0ユニッ トの E coBIにより、 3 7 でで 2時間消化した。 これをポリアク リ ルア ミ ドゲル電気泳動に供した後、 約 240 b p の D N A断片 (断片 A ) を電気泳勣溶出により単離した。
1 0 gの PTMC12を P st I 緩衝液 （10mM Tris-HC^ 、 pH7.5 、 7mM MgC S. % 、 lOOmM NaC 、 7 mM 2—メ ノレカフ' ト エタノ ール） 100 中、 4 5 ユニ ッ トの P st I を用い、 3 7 'Cで 2時間消化した。 得られた pTHC12のの P st I消化物 5 gをエタノ ール沈殺させ、 100 H の E colH緩衝液中、 3 0ュニッ トの E colHにより、 3 7 でで 3時間消化した。 さ らにエタノ ール沈毅を行った後、 これを 100 と C la I緩 衝液 (lOm Tris-HCl 、 pH7.5 、 ΊιαΜ . MgC 、- 7mM 2 -メ ルカブ トエタノ ール） に溶解し、 2 0 ユニ ッ トの C la.I によ り、 3 7 'Cで 2時間消化した。 これをァガロースゲル電気泳 動に供した後、 約 1500 b p の D N A断片 （断片 B ) を電気泳 動溶出により単離した。
PTMC12の P st I消化物 5 gを 100 の H pa I缓衝液中、 2 4ュニッ トの Hpa I を用い、 3 7 でで 3時間消化した。 こ ·れをァガロースゲル電気泳動に供した後、 約 1800 b p の D N A断片 （断片 C ) を電気泳勣溶出により単離した。
上記 D N A断片 A , B , Cを混合し、 Elutip- d (商標） 力 ラムで処理し、 エタノ ール沈殺を行った後、 2 0 β δ. のリ ガ 一ゼ緩衝液中、 . 700ュニッ トの T 4 D Ν Αリガ—ゼを加え、 1 2 'c、 1 2時間の反応を行った。 この反応物を用いて大腸 菌 JM 103株を形質転換し、 PTMC22を有する形質転換株を選択 した。 実施例 13. プラス ミ ド PTMC32の作製 （第 7図 ， 第 1 4図) 2 Q g の PTMC12を 100 の Aat H緩衝液. (10mM Tris- HC£ 、 pH7.5 、 7mM gC & 2 、 60mM CK 7 mM 2—メ ルカプ トエタノ ール） 中、 3 0ユニッ トの Aat Kを用い、 3 7 でで 2. 5時間消化した。 これをポリ アク リ ルアミ ドゲル電気泳動 に供し、 約 00 b p の D N A断片を電気泳動溶出により単難 した。 この D N A断片を の A lu I緩衝液 (10mM
Tris-HC & 、 7mM MgC & 2 、 20m« NaC^ 、 7mM 2 —メ ルカプ トエタノ ール） 中、 2 4ユニッ トの A lu I により、 3 7 でで 3時間消化した。 これをボリアク リ ルアミ ドゲル電気泳動に 供し、 245 b p の D N A断片 （断片 A ) を電気泳動溶出によ り単離した。
I 0 β g の PTMC22を 100 μ & の P st I緩衝液中、 4 5ュニ トの P st I を用いて、 3 7 でで 1 6時間消化した。 得られ た pTMC22の P st I消化物 5 gをヱタノ 一ル沈毂させ、 100 μ i の Ρ νιι Π緩衝液 (lOmM Tris-HC£ 、 pH7.5 、 7m« MgC & 2 、 60mM NaCl 、 7mM 2 —メ ルカブ トエタノ ール） 中、 3 0 ュニ ッ トの P VU ϋを用い、 3 7 'Cで 2時間消化した。 これをァガ ロースゲル電気泳動に供した後、 約 1800 b p の D N A断片
( 断片 B ) を電気泳動溶出により単離した。
PT C22の P st I消化物 gを 100 の Hpa I緩衝液中、 2 4ュニッ トの Hpa I を用い、 3 7 'Cで 2時間消化した。 ェ タノ ール沈殺の後、 これを 100' / の Nde I缓衝液 (10mM Tris-HC ヽ H7.5 、 7mM MgC 、 175mM aC^ 、 7m 2 —メ ノレカプ トエタノ ー ル） に溶解し、 1 8 ュニ ッ トの Nde I を加えて、 3 7 でで 9時間消化した。 これをァガロースゲル 電気泳動に供した後、 約 1820 b p の D N A断片（ 断片 C ) を 電気泳動溶出により単離した。
上記 D N A断片 A , B , Cを混合し、 Elutip-d (商標） 力 ラ ムで処理し、 エタノ ール沈穀を行った後、 2 0 μ & のリガ ーゼ緩衝液中、 350ユニッ トの T < D N Aリガ-ゼを加えて 1 2 で、 1 7時間の反応を行った。 この反応物を用いて大腸 菌' JM103株の形質転換し、 PTMC32を有する形質転換株を選択 した。
実施例 14. M l 3 ファージを用いる特異的塩基置換変異の 導入 （ゥナギカルシ トニン誘導体遺伝子の作製） (第 1 7図)
1 ) 1本鎖鐯型 D N Aの調製
- サケカルシ トニン誘導体の遺伝子を有するプラス ミ ド pSCT 2からのサケカルシ トニン誘導体の遺伝子を舍む JL I - S al I 0. 6 kbp の D N A断片 0. 5 p Mと、 M13フ ァ ージ m p 9 の 2本鎮 D N Aから 0 S ma I - Sal I 2. 7 kbp D N A 断片 0· 5 ρ Μを混合し、 6 6 m M Tris- HC (pHT.5)、 5 m M MgC ί 2 、 5 mM D T T及び I m M A T P含有する溶液 2 0 μ & 中で 100ュニッ トの T 4 D N Aリガーゼを用いて 1 2 で にて 1 6時間連結反応を行った。 反応後、 反応液を用いてメ ッ シ ング等の方法 〔メ フ シ ンダ等、 メ ソズ . イ ン . ェ ンチモ ロ ジ - (Methods in Enzymology) 101, 20 - 78, 1983〕 に従 つて大腸菌 J M103. を形質転換し、 0.02% X-gal及び I mM IPTG を舍有する軟寒天と共にプレー ト し、 3 7 で にて一晩 培養した。 組換体によって形成された白いプラークより一本 鎮铸型 D N Aを調製した。 すなわち、 白いプラークをつまよ う じの先端で約り、 大腸菌 J M 103 が生育している 1. 5 m の 2 X YT培養液 （ 1. 6 %バク ト ト リ プ ト ン、 1 %酵母ヱキス トラク ト及び 0. 5 % NaC ) 中に懸濁して 3 7 でにて 5時間 培養し、 そして培養液上清から、 ボリ エチレングリ コール沈 穀、 フユノ ール処理及びエタノ一ル沈鏺によつて 1本鎮組換 体ファ ージ D N Aを回収した。
得られた 1本鎮 D N Aを铸型としてメ ッ シングらの方法
(前掲） に従ってジデォキシ法により塩基配列を決定し、 ク ローニングされた 1本鎮 D N Aの配列を確認した。 こう して サケカルシ トニン誘導体の遺伝子のァンチコ一ディ ング鎖を 含む 1本鎮 D N Aが得られた。 この組換体ファ一ジを CTM31 と命名した。
2 ) オリ ゴヌク レオチ ドをプライ マーとするニ本鎮 D N A の合成
上記のようにしてえれらた CTM310 1本鎖 D N Aを铸型と して用い、 合成ォリ ゴヌク レオチ ド ：
5' TGGTCGTGGTTGCAGCCATGCGC 3'
をブライ マーとして、 D N Aポリ メ ラーゼ Klenow断片による 修復反応を行った。 すなわち、 鐯型 1本鎖 D N A 0.5PMに 5 ' 末端を瀵酸化したプライ マー 2PMを加え、 そして 7 mM Tris- HC^ (pH7.5) 、 0. 1 m M EDTA 、 2 0 m M NaC 及び 7 m M MgC & z を含有する溶液 1 0 <u 中で 6 0 でにて 2 0分間保 持し、 続いて 2 3 でにて 2 0分間保持した。 さ らに、 この反 応混合物に、 dATP、 dGTP、 TTP、 及び dCTPをそれぞれ 0. 5 m Μ になるように加え、 全体を 2 0 S. として D N Aボリ メ ラー ゼ Klenow断片 2 ュニッ トを加え、 そして 2 3 'Cにて 2 0分間 イ ンキュベー ト した。 繞いて、 l O mMA T Pを 及び T 4 D N Aリ ガーゼ 1 ュニッ トを加え、 1 2 でにてー晚ィ ン キュペー ト した。 3 ) ァガロースゲル電気泳動による 2本鎮 D N Aの分離 上記のようにして得られた 2本鎮 D N Aからバックグラウ ン ドとなる未反応の 1本鎖 D N Aを除去するために反応溶液 全量を 2 〃 §ノ111 のェチジゥムブ口マイ ドを舍む 0. 8 %の ァガロースゲル電気泳動により分離した。 目的とする 2本鎖 D N Aを確認したのち、 その部分のゲル片を切り出して透折 チューブに入れ、 8 9 mM ト リ スホウ酸、 2 mM EDTA 緩衝 液を満たしシールした後、 同緩衝液中で 5 0 Vの定電圧で
1 2時間電気泳動する事によりゲル中の D Aを溶出させた。 次に D N Aを透圻チューブより取り出し凍結乾燥し、 乾固物 を 100 の蒸留水に溶解して、 イオン交換ディ スボーザブ ルカ ラム Elutip-d (Schleicher & Schue 11 )を用いて精製し た
4 ) 大腸菌 J M103 の形質転換
上記 2本鎖 D N A O.lpMを用いてメ ッ シングの方法に従い 大腸菌 J M103 を形質転換した。
5 ) 変異体の検索
上記のようにして得られたファ ージプラークについて、 合 成オ リ ゴヌ ク レオチ ド ：
5' TCGTGGTTGCAGCCA 3'
(32 Pで標識したもの） をプローブとして用いて、 プラーク ノヽイ ブリ ダィ ゼーショ ンによる変異体ファ ージのスク リ 一二 ングを行った。 すなわち、 ベン ト ン ♦ ディ ビス等の方法
〔W.D.ベン ト ン及び R.W.ディ ビス、 サイ エ ンス（Science)
196, 180, 1977] に従って軟寒天培地からニ ト ロセルロース フ ィ ルターにプラークを移し、 真空中 8 0 でにて 2時間べ一 ' キ ングした。 このニ ト ロセルロースフ イ ノレターを 6 x S S C、 lOxDenhardt溶液中で、 32 Pで標識したブライ マ ーオリ ゴヌ ク レオチ ドをプローブとして 2 3 でにて 1晚ハイブリダィゼ ーシヨ ンを行った。 次に、 このフィルターを 6 X S S C中で
4 6 でにて洗浄し、 そしてォー ト ラジオグラフィ ーを行い陽 性シグナルを示す変異体ファ ージプラークを単離した。
6 ) 変異体 D N Aの塩基配列の決定
変異体ファ一ジ D N Aを铸型としてジデォキシ法により塩 基配列を決定し、 塩基置換変異が生じ、 ゥナギカルシ トニン 誘導体の遺伝子を有するファージを得た事を確認した。 この 変異体ファージプラーク株を JM103/CTM41 と命名した。
実施例 15. プラス ミ ド PCTM4の作製 （第 1 8図)
ファ ージ CTM41 の 2本鎮 D N A l OpMを、 1 0 01¾4の！11^3- HC (pH7.5) 、 0. 7 m Mの MgC £ 2 5 m Mの NaC^ 及び 0. 7 m Mの —メ ルカプ トエタノ ールを舍む 100 の緩衝液中 2 0ユニッ トの EcoBIにより 3 7 でにて 4時間消化し、 反応 混合物をフヱノ ール及びク ロ ロホルムで抽出し、 D N Aをェ タノ一ルで沈殺せしめ、 沈緵を乾燥した。 この D N Aを、
5 0 mMの Tris— HC£ (pH 8.0)、 7 5 mMの NaC 、 1 0 mMの MgC £ 2 、 5 mMの ーメ ノレカプ トエタノ ー ル、 並び に 0.25m Mずつの di TP、 dGTP、 dCTP、 TTP 及び A T Pを含有 する 100 の緩衝液中 2 0ュニッ トの D A Nボリ メ ラーゼ Kl enow断片により 3 7 でにて 2時間フ ィ ル—ィ ン反応を行つ た。 この反応抽岀物をフヱノ ール及びクロ口ホルムで抽出し、 D N Aをエタノ ールで沈毅せしめ、 そして乾燥した。 この
D N Aを、 I mMの Tris-HC^ (pH7.5) 、 0. 7 m Mの MgC £ 2 、 1 5 m Mの NaCi 、 0. 7 mMの 一メ ルカプ トエタノ ール及 び O.O2m Mの EDTAを含有する緩衝液 100 中 8ュニッ トの S al I により 3 7 てにて 2時間消化した。 この反応液を、 ェ チジゥムブロマイ ドを舍有する 1. 2 %のァガロースゲル上で 電気泳勖分離し、 D N Aの小断片を含有するゲル部分を切り 取り、 透圻膜を用いる電気溶出法で目的とする D N A断片を 溶出した。 溶出液から D N A断片をエタノ ールにより沈殺せ しめ、 この沈殺を乾燥し、 4 0 の水に溶解した。
ブラス ミ ド pTCCMlの D N A l OpMを、 I mMの Tris— HCJ2 (pH7.4) 、 I m Mの MgC z 、 5 m Mの NaC£ 及び 0. 1 m M の EDTAを舍有する緩衝液 100 <" 中 2 0 ュニッ トの A va I に より 3 7 でにて 4時間消化した。 この反応混合物をフエノ ー ル及びク ロ 口ホルムにより抽出し、 D N Aをェタノ一ルで沈 殺せしめ、 沈澱を乾燥した。 この後 CTM41 D N Aの処理と同 様にしてフ ィ ル—ィ ン反応、 S al I による消化、 及び D N A 断片のゲル分離を行い、 目的とする断片を含む溶液 4 0 β i を得た。
前記の D N A断片を舍有する溶液それぞれ 5 i ずつを、 2 5 mMの N— 2 - ヒ ドロキシェチルビペラ ジン N ' — 2 — エタンスルホ ン酸（HEPES) (pH7.8)、 7 m Mの MgC 2 、 1 2 m Mのジチオスレィ トール及び 0. 4 mMの A T Pを含有する 緩衝液合計 100 ( " 中で、 3 0 ユニ ッ トの T 4 D N Aリガ一 ゼにより 1 6 °cにて 2 4時間連結処理した。 ♦
この反応混合物 1 0 ^ " を用いて大腸菌 J M 103 (凍結保 存してあったコ ンビテン ト細胞） を形質転換した。 こう して 処理された大腸菌コ ロニーについて、 カルシ トニン誘導体構 造遺伝子 U 3 1 フラグメ ン ト （GGGAAGTTGAGTCAG) (実施例 1及 び第 1図を参照のこと） を用いてコ ロニーハイ ブリダィゼー ショ ンを行ったところ約 6 0 %の頻度で陽性コ ロニーが得ら れた。 これらの陽性株について、 癸現試験を行い、 約 19100 ダル ト ンの蛋白質を発現する株を選択した。 これらの株から プラス ミ ド D N Aを調製し、 カルシ トニン誘導体構造遺伝子 L — 4 1 フラグメ ン ト（GTAATTCCTGACTCA) (実施例 1及び第 1 図を参照のこと） をプローブとして用いてジデォキシシーケ ン シ ング法により塩基配列を決定し、 ゥナギカルシ ト ニン誘 導体遺伝子が適切に挿入-されていることを確認した。 このプ ラス ミ ドを pCTM 4 と称する。
このプラス ミ ドは、 tacプロモーターの支配下に、 メ タ ピ ロカテカーゼとゥナギカルシ トニン誘導体との融合蛋白質を コ一 ドする遺伝子を含む。
実施例 16. サケカルシ トニン誘導体の製造
(1) 培養 ，
プラスミ ド pTMC 2を含有する大腸菌 RB791株を 5 0 gノ £ のアンピシリ ンを舍む L B培地 1 0 m £ 中で 3 7 でにて、 1晚振とう培養レた。 次にこの培養液を 1 の同じ培地に接 種し、 2時間培養した後に IPTGを最終濃度が 1 mMとなるよう に添加し、 さらに 6時間培養した。
(2) 融合蛋白質の単離
前記のようにして得た培養液を遠心分離し、
5 O mMリ ン酸カ リ ゥム暧衝液（PH7.5) で洗浄する こ とにより 約 9. 5 gの菌体を得た。
この菌体を 5 0 m の 1 O mM .EDTA を含む 5 0 mMリ ン酸カ リ ウム暖衝液に懸濁し、 これに lOOmgのリ ゾチームを加えて 氷中に 3 0分間置き、 さ らに 3 0分間超音波処理することに より破砕した。 これを 15000rpmにて 3 0分間遠心し不溶性画 分を得た。 この不溶性画分を 5 Q m £ の 7 M塩酸グァニジン 水溶液に懸濁し、 0 でで 3 0分間静置し融合蛋白を可溶化し た。 この水溶液を 2 の蒸留水に対し、 1晚透折すると融合 蛋白は不溶性の白色沈穀となった。 これを遠心し、 沈穀物を 融合蛋白画分として回収した。 回収した沈籙を 4 M塩酸グァ 二ジン水溶液に溶解し、 セフアデフクス G 7 5 カ ラムク ロマ トグラフィ 一にかけた。 このカラムは内径 2. 5 011、 高さ 4 5 cm、 べッ ド体積 220 m であった。 溶出は 4 M塩酸グァニジ ン水溶液で行った。 第 1 9図にその溶出パター ン （A ) 、 及 び各画分の S D Sボリ ァク リルァ ミ ドゲル電気泳動のゲルバ ターン （ B ) を示す。 約 20, 000ダル ト ンに相当する画分に融 合蛋白がほぼ単一バン ドとして溶出された。
このカラムクロマ トグラフ ィ 一における排除体積画分から 融合蛋白質画分まで （画分 Να17〜20) を回収し、 .次の段階で . さ らに処理した。
(3) サケカルシ トニン誘導体の単離
上記のよう にして得られた融合蛋白質含有面分を蒸留水 2 に対して 1晩透折した後 14，000rpn» にて 3 0分間遠心分 離した。 得られた沈毅を次のようにして CNBrで処理すること により メ タ ビロカテカーゼとサケカルシ トニン誘導体を切断 した。 すなわち、 この沈殺に 2 0 m の 7 0 %蟻酸及び 500 mgの CNBrを加え、 混合した後、 室温暗所にて 2 4時間反応さ せた。 反応終了後 180m£ の水を加え、 凍結乾燥するこ とに より白色粉未を得た。 この粉末を 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸 (TFA)に溶解し、 I5P304カ ラム （Bio-Rad 社製） を用いる HPLCにより分画を行った。 溶出 0. 1 % T F Aを含む 2 6 %〜 4 4 %のァセ トニ ト リ ル水溶液の直線的濃度勾配法により溶 出した。 その溶出の様子を第 2 0図 Aに示す。 こう して、 市 販サケカルシ トニン I とほぼ—致する リ テンショ ンタイ ムを もつビーク画分を分取した。 分取した画分をさらに精製する ために 0.05% T F A水溶液を用いて TSKG2000SW力ラム （東洋 曹逹製） によるゲル濾過 HPLCにかけて市販サケカルシ トニン I と一致する分子量のピークを分取した （第 2 0図 B ) 。 分 取した試料の精製度を RP304カ ラムによる HPLC 及び TSKG 2000 SWカ ラムによる HPLCの溶出バターンにより検討した。 これら両 HPLCにおいても市販サケカルシ トニン I とほぼ一致 する リ テンショ ンタイ ムをもつ単一ビークを示した。
実施例 17. ゥナギカルシ トニン誘導体の製造
(1) 培 養
ブラス ミ ド pCTM 4を含有する大腸菌 J M 103 株を 5 0 μ g . / m& のアンビシリ ンを含む L B培地 1 O mi 中で、 3 7 V にて 1晩振とう培養した。 次にこの培養液 1 0 πι を 1 の 同じ培地に接種し、 6時間 3 7 'Cにて培養し 0 D 55。 が約 0. 5 に達した時 IPTGを最終濃度が 1 m Μになるように添加し、 さらに 6時間培養した。
(2) 融合蛋 S質の単離
前記のようにして得た培養液を 6000rpmにて 15分間遠心分 離することにより菌体を回収した。 これに 5 0 m gのリ ゾチ ームを添加して 5 O m Mリ ン酸カ リ ウム緩衝液（pH7.5、 1 0 m Mの EDTAを舍有） に懸濁して 5 0 m とし、 0 でにて 3 0 分間置き、 さらに 1 5分間ずつ 2回超音波処理するこ とによ り破砕した。 これを 10, 000rpmにて 30分間、 4 'Cで遠心分離 するこ とにより上清 （第 2 1図中 S — 1 ) と不溶性画分 （第 2 1図中 P — 1 ) とに分けた。 第 2 1図に示すごと く 、 S D S一ボリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動において、 大部分の蛋 白質が不溶性画分に存在した。 この不溶性画分を 5 0 m& の 上記と同じリ ン酸緩衝液に再懸濁し、 これを 10,000rpm にて 3 0分間 4 でで遠心分離することにより上清 （第 2 1図中 S 一 2 ) と不溶性画分 （第 2 1図中 P — 2 ) とに分けた。 第 2 1図に示すように約 19100 ダル ト ンの目的とする融合蛋白 質を含む蛋白質の多 くが不溶性画分に存在した。 この不溶性 画分を 5 0 の 7 M塩酸グァニジン水溶液に懸濁し、 0 で にて 3 0分間静置して融合蛋白質を可溶化した。 この可溶化 画分には主として目的融合蛋白質が含まれていた （第 2 1図 中 S P — 3 ) 。 これを 8,000rpmにて 1 5分間遠心分離して融 合蛋白質を舍む上清液を得た。 この液を蒸留水に対して透折 して塩酸グァニジンを除去することにより融合蛋白質を折出 せしめた。 この沈殺に約 5 0 m& の蒸留水を加えた後凍結乾 燥し、 約 280m g の淡黄色粉末を得た。
(3) ゥナギカルシ トニン誘導体の単離
これに 2 0 & の 7 0 %蟻酸を加えさ らに 500 m g 0CNBr を加えて室温、 暗所に一晩置く ことにより融合蛋白質を切断 し、 ゥナギカルシ トニン誘導体べプチ ドをメ タピロカテカー ゼ蛋白質から遊離せしめた。 次にこの混合物を水で希釈した 後凍結乾燥し、 約 260m gの白色粉末を得た。
次にこの凍結乾燥粉末に 2 0 m 0. 1 % ト リ フルォ口酢酸 ( T F A ) を加え、 C 1 8 カラムにより ク ロマ トグラフ処理 した。 0. 1 % T F A中 10%〜50% CH3CNによる直線グラジェ ン ト溶出を行って画分を分取した。 この様子を第 2 2図に示 す。 採取した画分を UP- 304カ ラムを用いる逆相高速液体ク ロ マ トグラフィ ー （逆相 HPLC) を用いて分折し、 サケカルシ ト 二ン I 標品とほぼ同じリ テンショ ンタイ ムを有する画分 （第 2 2図中矢印で示す） を分取した。 次にこの画分を TSK - G2000SW を用いるゲル濾過 HPLCにより 0 . 05 % T F A中で精製 した。 この様子を第 2 3図に示す。 サケカルシ トニ ン I標品 とほぼ同じ分子量を有する画分を分取し、 半調製用 UP - 304力 ラムを用いる逆相 HPLCにより さらに 2回精製し、 サケカルシ トニン ί標品とほぼ同じ分子量を有する画分を分取した。 こ の 2回目の逆相 HPLCの様子を第 2 4図に示す。 このゥナギカ ルシ トニ ン誘導体舍有画分を RP304 逆相 HPLC及び TSK - G2000 SWゲル濾過 HPLCにより分折したところ、
それぞれ第 2 5図（A) 及び（B) に示す通り、 サケカルシ トニ ン I標品とほぼ同一の分子量を示す単一ビークが得られ、 均 一なゥナギカルシ ト ニ ン誘導体が得られたことが確認された この均 な画分を凍結乾燥することにより 500 gのゥナギ カルシ トニン誘導体の白色粉末が得られた。
産業上の利用可能性 本発明の方法によれば、 魚類カルシ トニ ン誘導体を経済的 に大規模に製造することができる。 こう して製造された魚類 カルシ トニ ン誘導体はすでに使用されている他のカルシ トニ ン類と同様にして医薬として使用することができる。 さらに このカ ルシ ト ニ ン誘導体は天然型カルシ ト ニ ンを製造する場 合の中間体としても使用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. サケカルシ ト ニ ンの構造遺伝子。
2. 前記構造遺伝子が次の塩基配列 ：
コー ド鎖 ： T G C T C C A A T C T C T C T A C T - アンチコ- 鎮 ： A C G A G G T T A G A G A G A T G A -
T G C G T T-C T G G G G A A G T T G A G T - A C G C A A G A C C C C T T C A A C T C A - C A G G A A T T A C A T A A G C T G C A A - G T C C T T A A T G T A T T C G A C G T T - A C T T A C C C G C G T A C C A A C A C T - T G A A T G G G C G C A T G G T T G T G A - G G T T C T G G T A C A C C T C C A A G A C C A T G T G G A
から成る請求の範囲第 1項記載の遺伝子。 - 3. .サケ 'カルシ トニ ンの構造遺伝子の製造方法であって、
(1)該構造遺伝子の塩基配列の部分を構成する複数のォリ ゴヌ ク レオチ ドを合成し、 )該オリ ゴヌク レオチ ドを連結するこ とによつて複数のサブプロ ックを作製し、 （3)該サブプロ ック を連結する段階を舎んで成る方法。
4. サケカルシ トニンの構造遺伝子を舍有 るプラス ミ ド。
5. pSCT 1である請求の範囲第 4項記載のプラス ミ ド。
6. サケカルシ トニ ンの構造遺伝子を含有するプラ ス ミ ド によって形質転換された大腸菌。
7. ェ シエ リ シ ャ ' コ リ (Escherichia coli) RR 1 /pSCT 1 (FERM-P 7774) である請求の範囲第 6項記載の大腸菌。
8. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ： Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
し ys leu Ser Gin G 1 u Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro ftrg Thr X Y Gly Z Gly
Thr Pro Gly
(配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる 魚類カルシ トニ ン誘導体をコー ドする遺伝子。
9. 次のア ミノ酸配列 （ H ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
Lys Leu Ser Gin G 1 u Leu His Lys し eu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly
Thr Pro Gly
で表わされるサケカルシ トニ ン誘導体をコー ドする請求の範 囲第 8項記載の遺伝子。
10. 次の塩基配列 ：
コ ー ド鎖 ： T G C.T C C A A T C T C T C T A C T - アンチコ一Ι；·鎖 ： A C G A G G T T A G A G A G A T G A - T G C G T T C T G G G G A A G T T G A G T - A C G C A A G A C C C C T T C A A C T C A - C A G G A A T T A C A T A A G C T G C A A - G T C C T T A A T G T A T T C G A C G T T - A C T T A C C C G C G T A C C A A C A T - T G A A T G G G C G C A T G G T T G T G A - G G T T C T G G T A C A C C T G G T C C A A G A C C A T G T G G A C C A
を有する請求 0範囲第 9項記載の遺伝子。
11. 次のア ミノ酸配列 （ HI ) ： Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
Lys Leu Ser G 1 n Glu Leu His し ys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly
Thr Pro Gly
で表わされるゥナギカルシ トニ ン誘導体をコー ドする遺伝子,
12. 次の塩基配列 ：
コー ド鎖 ： T G C T C C A A T C T C T C T A C T - アンチコ一 ： A C G A G G T T A G A G A G A T G A - T G C G T T C T G G G G A A G T T G A G T - A C G C A A G A C C C C T T C A A C T C A - C A G G A A T T A C A T A A G C T G C A A - G T C C T T A A T G T A T T C G A C G T T - A C T T A C C C G C G T A C C G A C G T T - T.G A A T G G G C G C A T G G C T G C A A - G G T G C T G G T A C A C C T G G T .
C C A C G A C C A T G T G G A C C A
を有する請求の範囲第 1 1項記載の遺伝子。
13. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr C s Val Leu Gly
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr X Y Gly Z Gly
Thr Pro Gly
(配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる 魚類カルシ ト ニ ン誘導体と他の蛋白質との融合蛋白質をコー ドする D N A断片。
14. 前記魚類カルシ トニ ン誘導体をコー ドする遺伝子、 及 びメ チォニンのコ ドン A T Gを介してその上流に位置するメ タビコカテカーゼ遺伝子又はその部分から成る請求の範囲第 1 3項記載の D N A断片。
15. 前記メ タピロ力 'チカーゼ遺伝子又はその部分がメ タビ ロカテカーゼ遺伝子の S D配列及びメ タピロカテカーゼ構造 遺伝子の全部又は上流部分から成る請求の範囲第 1 4項記載 の D N A断片。 -
16. 前記メタビロカテカーゼ構造遺伝子の上流部分がメ タ ビロカテカーゼの N端の約 35〜 200 個のア ミノ酸をコー ドす る遺伝子である請求の範囲第 1 5項記載の D N A断片。
17. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
し ys Leu Ser Gin G 1 u Leu Bis し ys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr X Y Gly Z Gly
Thr Pro Gly
(配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる 魚類カルシ トニ ン誘導体をコ— ドする遺伝子を含んで成るプ ラス ミ ド。
18. 次のア ミノ酸配列 （ E ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
し ys Leu Ser G 1 n G 1 u Leu His し ys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly
Thr Pro Gly
で表わされるサケカルシ ト ニ ン誘導体をコ一ドする遺伝子を 含んで成る請求の範囲第 1 7項記載のプラス ミ ド。
19. プラス ミ ド PSCT 2である請求の範囲第 1 8項記載のブ ラス ミ ド。
20. 大腸菌又はファ ージのプロモーター系、 メ タビロカテ カーゼ遺伝子又はその部分、 前記サケカルシ トニン誘導体を コ一ドする遺伝子、 及びターミネータ一をこの順序で含んで 成る請求の範囲第 1 8項記載のプラスミ ド。
21. 前記プロモーター系が、 lacUV5、 P L 、 又は tac系で ある請求の範囲第 2 0項記載のブラス ミ ド。
22. ターミネータ一が tい又は tap aである特許請求の 範囲第 2 0項記載のプラスミ ド。
23. プラス ミ ド pPLMC2、 プラス ミ ド pPMC 2、 プラス ミ ド pTMC 2、 プラス ミ ド pTMC22、 又はプラスミ ド pT"MC32である請 求の範囲第 2 0項記載のプラス ミ ド。
24. 次のァミノ酸配列 （m) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Va 1 Leu Gly
Lys Leu Ser Gin G 1 u Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly
Thr Pro Gly
から成るゥナギカルシ トニン誘導体をコ一ドする遺伝子を含 んで成る請求の範囲第 1 7項記載のブラス ミ ド。
25. 大腸菌プロモータ 系、 メ タ ビロカテカーゼ遺伝子又 はその部分、 及び前記ゥナギカルシ ト二ン誘導体をコ一ドす る遺伝子をこの順序で含んで成る請求の範囲第 2 4項記載の プラス ミ ド。
26. 前記プロモーター系が、 tac 系である請求の範囲第 2 5項記載のブラスミ ド。
27. プラス ミ ド pCTM 4である特許請求の範囲第 2 5項記載 のプラス ミ ド。
28. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
L s Leu Ser G 1 n G 1 u Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr X Y Gly Z Gly
Thr Pro Gly
(配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは T.hr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる 魚類カルシ トニ ン誘導体をコー ドする遺伝子を含んでなるプ ラスミ ドにより形質転換された大腸菌。
29. ェ シェ リ シ コ リ (Escherichia coli) RR 1 /pSCT
2 (FER P-T775； FERil BP-866)である請求の範囲第 2 8項記 載の大腸菌。
30. 宿主大腸菌が RB791、 HB101 株、 JM103 .株、 C600株、 R1 株、 SM32株、 又は W3110 株である請求の範囲第 2 8項記 載の大腸菌。
31. ェ シエ リ シャ · コ リ （Escherichia co 1 i ) JM103/pLi1C 2 (FERM P-8220 ； FERM BP- 867)、 ェ シエ リ シャ · コ リ
(Escherichia col i) RR1 /pPMC 2 (FERM P-8222 ； FERM BP - 868)、 ェ シエ リ シャ ' コ リ （Escherichia col i) JM103/pTMC 2、 (FERM P-8223 ； FERM BP- 869)、 ェ シェ リ シ ャ · コ リ
(Escherichia coli) JM103 /pTMC22 又はェ シェ リ シヤ コ リ (Escherichia coli) JM103 / pTMC32 (FERM P- 8221) である 特許請求の範囲第 2 8項記載の大腸菌。
32. ェ シエ リ シ ャ · コ リ （Escherichia col i) JM103/pCTM 4 (FERM P-8239 ； FERM BP-870)である請求の範囲第 2 8項に 記載の大腸菌。
33. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ： Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
し ys Leu Ser Gin G 1 u Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr X Y Gly Z Gly
Thr Pro Gly
(配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる 魚類カルシ ト二ン誘導体をコ一 ドする遺伝子の製造方法であ つて、 （1)該遺伝子の塩基配列の部分を構成する複数のォリ ゴ ヌ ク レオチ ドを合成し、 （2)該ォリ ゴヌ ク レオチ ドを連結する ことによって複数のサブブロ ックを作製し、 は)該サブブロ ッ クを連結する段階を含んで成る方法。 ―
34. 魚類カルシ トニ ン誘導体がサケカルシ トニ ン誘導体で ある請求の範囲第 § 3項記載の方法。
35. ゥナギカルシ トニン誘導体をコー ドする遺伝子の製造 方法であって、 サケカルシ トニ ン誘導体をコー ドする遺伝子 中、 サケカルシ トニン誘導体の N末端の Cysから 2 6番目の Asn. 2 7番目の Thr及び 2 9番目の Serをコー ドするコ ド ンを、 それぞれ Asp、 Val及び Alaをコー ドするコ ド ンによ り置き換えることを特徴とする方法。
36. 前記の置き換えをオリ ゴヌク レオチ ドプライ マー辛用 いる特異的塩基置換変異法により行う請求の範囲第 3 5項記 載の方法。
37. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val leu Gly
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr X Y Gly Z Gly
Thr Pro Gly (配列中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を 表わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる 魚類カルシ ト二ン誘導体。
38. 次のアミノ酸配列 （ Π ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
し ys Leu Ser Gin Glu Leu His し ys leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly
Thr Pro Gly
で表わされるサケカルシ トニン誘導体である請求の範囲第
3 7項記載の魚類カルシ ト二ン誘導体。
'39. 次のア ミノ酸配列 （ I ) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr X Y . Gly Z Gly
Thr Pro Gly
(式中、 Xは Asn 又は Asp を表わし、 Yは Thr 又は Val を表 わし、 そして Zは Ser 又は Ala を表わす、 ） で表わされる魚 類カルシ トニ ン誘導体の製造方法であって該魚類カルシ トニ ン誘導体をコ一ドする遺伝子と他の蛋白質をコ一ドする遺伝 子を含有しこれらの遺伝子を大腸菌中で癸現することができ るブラスミ ドにより形質転換された大腸菌を培養して該魚類 カルシ トニン誘導体と該他の蛋白質とを含んで成る融合蛋白 質を生成せしめ、 この融合蛋白質を回収し、 回収された融合 蛋白質を切断して前記魚類カルシ トニ ン誘導体を遊離せしめ、 そしてこれを採取することを特徴とする方法。
40. 大腸菌又はフ ァ ージのブ口 モータ 一系、 メ タ ピロ カテ カーゼ遺伝子又はその部分、 次のア ミノ酸配列 （ Π ) ： Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly
Thr Pro Gly
から成るサケカルシ ト ニ ン誘導体をコ一 ドする遺伝子、 及び ターミネ—ターをこの順序で含んで成るブラス ミ ドにより形 質転換された大腸菌を培養して培養菌体内にメ タビロカテカ ーゼ又はその部分とサケカルシ トニン誘導体とを含んで成る 融合蛋白質を生成せしめ、 該培養菌体から該融合蛋白質を回 収し、 この融合蛋白質を切断して前記サケカルシ トニ ン誘導 体を遊離せしめ、 そしてこのサケカルシ トニ ン誘導体を採取 することを特徴とする請求の範囲第 3 9項記載の方法。
41. 大腸菌プロモーター系、 メ タ ピロ カテ力 一ゼ遺伝子又 はその部分、 次のア ミノ酸配列 （m) ：
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly -ー
Lys Leu Ser Gin Glu Leu His Lys Leu Gin
Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly
Thr Pro Gly
から成るゥナギカルシ ト ニ ン誘導体をコー ドする遺伝子をこ の順序で含んで成るプラス ミ ドにより形質転換された大腸菌 を培養して培養菌体内にメ タビロカテカーゼ又はその部分と ゥナギカルシ トニン誘導体とを含んで成る融合蛋白質を生成 せしめ、 該培養菌体から該融合蛋白質を回収し、 この融合蛋 白質を切断して前記ゥナギカルシ ト二ン誘導体を遊離せしめ、 そしてこのゥナギカルシ トニン誘導体を採取することを特徴 とする特許請求の範囲第 3 9項記載の方法。
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