Neue p-Phenylendiamin-Peptide und diese enthaltende
Reagenzien zur Bestimmung von Proteasen des
Blutgerinnungssystems ----------------------------------------------------------------------------
Die Bestimmung von Proteasen des Blutgerinnungssystems hat erhebliche klinische und wissenschaftliche Bedeutung, insbesondere im Rahmen der Bestimmung und Regulierung der Blutgerinnungsfähigkeit.
Es ist bereits bekannt, die Proteasen des Blutgerinnungssystems unter Verwendung von bestimmten chromophoren Peptiden, die von der jeweils zu bestimmenden Protease spezifisch gespalten werden und dabei eine optisch bestimmbare Gruppe abspalten, zu messen. Da es hierbei wesentlich ist, durch Zusatz derartiger künstlicher Substrate die Blutgerinnungskaskade nicht zu stören, d. h. nicht nachteilig zu beeinflussen, sind die meisten, für Proteasen anderer Herkunft bekannten chromogenen, peptidartigen Substrate nicht brauchbar für die Bestimmung der Proteasen des Blutgerinnungssystems. Als geeignete Proteasesubstrate, welche die Gerinnungskaskade nicht nachteilig beeinflussen, erwiesen sich zwar zwei p-Nitroanilinderivate, welche den Rest Tos-Gly-Pro-Arg- bzw. H-D-Phe-Pip-Arg- enthalten. Diese Substrate haben jedoch den Nachteil, daß die Messung des bei ihrer Spaltung durch die Protease gebildeten Farbstoffes durch rot oder gelb gefärbte Substanzen gestört ist und daher eine Messung im Blut selbst nicht möglich ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diesen Nachteil zu beseitigen und ein Substrat für die Proteasen des Blutgerinnungssystems zu schaffen, welches die Gerinnungskaskade nicht nachteilig beeinflußt und anderer
seits bei der Spaltung eine Farbe bildet, deren Absorptionsmaximum längerwellig als 565 nm ist und dadurch auch eine Bestimmung im Vollblut oder in Gegenwart anderer störender gefärbter Substanzen ermöglicht.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch Verbindungen der allgemeinen Formel I
in der
A die Aminosäure Arginin oder Lysin,
X eine N-terminale Aminosäure-Schutzgruppe oder eine
D-Aminosäure, Y eine Einfachbindung oder eine aus 1 bis 3 Aminosäuren bestehende Kette, NR1R2 eine in o- oder p-Stellung stehende Gruppe mit R1 und R2 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen und R3 ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe, ein Halogenatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 C-Atomen bedeutet.
Die neuen Verbindungen der Erfindung lassen sich durch die Proteasen des Blutgerinnungssystems spalten unter Freisetzung eines o- oder p-Phenylendiaminderivates, welches in Gegenwart eines Oxidationsmittels mit einem geeigneten Kupplungspartner, wie z. B. N-Methylanthranilsäure eine Farbe bildet, deren Absorptionsmaximum
längerwellig als 565 mn ist. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß durch diese Reaktion die Blutgerinnungskaskade nicht negativ beeinflußt wird und die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen eignen sich daher als Substrate für die Bestimmung der Proteasen des Blutgerinnungssystems selbst oder von anderen Faktoren des Blutgerinnungssystems, welche die Aktivität der Proteasen des Blutgerinnungssystems regeln.
Bevorzugt werden solche Verbindungen der allgemeinen Formel 1, in denen R1R2 = H ist. Weiter werden bevorzugt solche Verbindungen, in denen X=Tos und Y=Gly-Pro, X=H-D-Phe und Y=Pip, X=H-D-Ile und Y=Pro, X=CH3SO2-D-Nle und Y=Gly, X=CH-OCO-D-Nle und Y=Gly ist.
Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen Tos-Gly-Pro-Arg-p-Phenylendiamin und H-D-PhePip-Arg-p-Phenylendiamin.
Die Herstellung der neuen Verbindungen gemäß der Erfindung kann unter Anwendung der dem Fachmann geläufigen Methoden der Peptidsynthese erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Herstellung dadurch, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II
in der X, Y, A und R
3 die zu Formel I angegebene Bedeutung haben, reduziert und die gebildete NH
2-Gruppe gegebenenfalls alkyliert zur Herstellung derjenigen Verbindungen, in denen R
1 und R
2 eine Alkylgruppe darstellt.
Die Reduktion der Verbindungen der allgemeinen Formel II erfolgt vorzugsweise durch katalytische Hydrierung, beispielsweise mit Palladium/Kohle als Katalysator in für die reduktive Hydrierung üblichen Lösungsmitteln wie Methanol/Eisessig.
Wie oben bereits erwähnt, eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders als chromophobe Substrate für die Bestimmung von Proteasen, insbesondere von Proteasen des Blutgerinnungssystems wie Thrombin, Plasmin, Plasminogen, Faktor Xa, Kallikrein, Plasminogenaktivator usw. Sie eignen sich aber ebenfalls als Substrate für andere Proteasen wie z. B. Chymotrypsin, Trypsin und dergleichen.
Durch die jeweilige Protease werden die erfindungsgemäßen Verbindungen unter Freisetzung des Phenylendiamins bzw. eines Phenylendiaminderivates gespalten und dieses wird in Gegenwart eines Oxidationsmittels wie K3[Fe(CN)6] mit einer geeigneten Kupplungskomponente zu einem Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum größer als 565 nm oxidiert. Bei p-Phenylendiamin selbst läßt sich die Bestimmung besonders gut bei 644 nm durchführen. Bei dieser Wellenlänge stören häufig in Blut, Plasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten vorhandene gefärbte Substanzen nicht mehr. Die Eigenfärbung des Blutes oder von hemolytischen (Rotfärbung) oder ikterischen (Gelbfärbung) Plasmen oder Seren hat daher keinen Einfluß auf das Meßsystem. Daher können Gerinnungsfaktoren, Faktoren des fibrinolytischen Systems oder des Kallikrein-kinin-Systems, aus Zeilen
wie z. B. Leukocyten ausgeschüttete proteolytische Enzyme wie Granulocyten-Elastase oder Cathepsin-G in Körperflüssigkeiten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmt werden. Diese Verbindungen ermöglichen auch die analytische Bestimmung ganzer Enzymkaskaden des Gerinnungssystems, wie dies in den Testsystemen der Prothrombinzeitmethode (PT- oder Quicktest) bzw. der partiellen Thromboplastinzeitmethode (PTT- Test) der Fall ist.
Ebenfalls eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Bestimmung der Inhibitoren bestimmter aktiver proteolytischer Enzyme durch Messung der Aktivitätsverminderung dieser Proteasen. Ein Beispiel hierfür ist die Messung der Aktivitätsverminderung von Thrombin durch das Vorhandensein von Antithrombinen.
Als Kupplungskomponenten eignen sich für diese Reaktion aromatische Amine oder Phenole. Besonders geeignet sind Verbindungen der Formel II
(II)
X eine NR2R3 oder -O-R--Gruppe,
R1 Wasserstoff oder Chlor, wenn R4 und/oder R6 auch
Chlor sind, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, eine Alkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe mit bis zu 8 C-Atomen, die gegebenenfalls auch durch Hydroxy, Alkoxy mit bis zu 5 C-Atomen, -CO2H, SO3H substituiert sein kann.
R4 und R6 Wasserstoff, niedrig Alkyl mit bis zu 5 CAtomen Chlor, Brom, Jod, -COOR2, SO3H2,
OR2, NR2R3 wobei R2 und R3 die obige Bedeutung haben;
R5 und R7 eine Alkylgruppe mit bis zu 5 C-Atomen bedeuten, wobei
R4 und R5 bzw. R6 und R7 zusammen mit dem Benzolring auch ein Naphthyl- und Anthrylgerüst bilden können.
Die Alkylgruppen in den vorstehenden Verbindungen haben bis zu 6, vorzugsweise 1 bis 3 C-Atome. Besonders bevorzugt ist die Methylgruppe und Ethylgruppe.
Bevorzugte Beispiele hierfür sind außer der bereits genannten und besonders bevorzugten N-Methylanthrahilsäure Xylenole wie 2,3-Xylenol, Dialkylmethanilsäuren wie Diethylmethanilsäure und deren Salze, N-Alkyl-(3'sulfobenzyl) aniline, insbesondere die N-Ethylverbindung, N-Alkyl-N-(3'-sulfobenzyl)-3- toluidin, insbesondere die Methyl-, Ethyl- und Propyl- Verbindung und N-biscarboxybenzyl-3-anisidin in Form der Salze, insbesondere des Natriumsalzes.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung der Proteasen des Blutgerinnungssystems, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Verbindung gemäß Formel 1, ein Oxidationsmittel, ein mit Phenylendiamin oxidativ einen Farbstoff bildendes Anilin- oder Phenolderivat und Puffer enthält.
Als Oxidationsmittel werden K3Fe (CN)6 oder Peroxid/Peroxidase bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien können neben den für die eigentliche Reaktion notwendigen Bestandteilen: Verbindung gemäß allgemeiner Formel I, Kupplungskomponente, Oxidationsmittel und Puffersubstanz pH 6 bis 10, noch Aktivatoren (z. B. Magnesiumsalze), Netzmittel, Stabilisierungsmittel, Verdickungsmittel und andere übliche Hilfsstoffe enthalten. Das Reagenz kann entweder in getrockneter Form, gelöst in einem wäßrigen Lösungsmittel, oder auch auf einem saugfähigen Träger (Teststreifen) imprägniert vorliegen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
B e i s p i e l e 1 bis 15
0,2 mmol des jeweiligen 4-Nitroanilids, welches den nachstehend angegebenen 4-Aminoaniliden entspricht, werden in Methanol/Eisessig gelöst, mit 10 % Paladium/ Kohle (10%ig) versetzt und bei Raumtemperatur in der Schüttelente bis zur vollständigen Umsetzung hydriert (DC-Kontrolle). Man saugt über einen Seitz-Filter ab, versetzt mit Wasser und destilliert das Methanol im Vakuum ab. Der wäßrige Rückstand wird gefriergetrocknet. Alle RF-Werte werden auf Fertigplatten der Firma Merck, Kieselgel 60 F254 mit dem Fließmittel: n-ButanolEisessig-Wasser/50-15-25, ermittelt (Entwicklung: Cl2/Toluidin). Folgende Verbindungen werden so hergestellt:
1 N-Tosyl-glycyl-L-prolyl-L-arginyl-4-aminoanilid (xAcOH) R
F = 0, [alpha
= -49°C (c = 0,5 g in 100 ml MeOH).
2
N-Succinyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-4-aminoanilid (Hydrierung, ohne Zusatz von HOAc)
RF = 0,49
[alpha] = -90°C (c = 0,3 g in 100 ml MeOH).
3 N-Tosyl-glycyl-L-prolyl-L-lysyl-4-aminoanilid
(xAcOH) R
F = 0,41 [alpha] = -52° (c = 0,3 g in 100 ml MeOH).
N-Benzoyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-4aminoanilid (xAcOH)
RF = 0,48
[alpha
= -61° (c = 0,3 g in 100 ml MeOH).
N-Mesyl-D-norleucyl-glycyl-L-arginyl-4-aminoanilid (xAcOH) RF = 0,39
[alpha]
= -9° (c = 0,5 g in 98 ml MeOH + 2 ml HOAc).
N-Methoxycarbonyl-D-norleucyl-glycyl-L-arginyl-4aminoanilid (AcOH)
RF = 0,40
[alpha]
= -15,8° (c = 0,5 g in 98 ml MeOH + 2 ml
HOAc).
H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginyl-4-aminoanilid-dihydrochlorid
RF = 0 , 14
[alpha]
= -41 , 9 ° ( c = 1 g in 100 ml Wasser)
H-D-Valyl-L-leucyl-L-arginyl-4-aminoaniliddihydroxychlorid
RF = 0,32
N-Acetyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl4-aminoanilid-hydrochlorid
RF = 0,34
H-D-Phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-4-aminoanilid-dihydrochlorid
RF = 0,33
11 H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-4-aminoanilid-dihydrochlorid RF = 0,35
12 N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-gamma-piperidylglutamylglycyl-L-arginyl-4-aminoanilid (xAcOH) RF = 0,42
13 H-D-But-Cyclohexylalanyl-lysyl-4-aminoanilid (xAcOH)
14 Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanyl-(3carboxy-4-amino)-anilid
15 Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanyl-(3halogeno-4-amino)-anilid
B e i s p i e l 16
Durchführung eines Quick-Tests mit dem Substrat Tos-GlyPro-Arg-p-Phenylendiamin (Verbindung von Beispiel 1)
Herstellung der erforderlichen Lösungen:
Lösung 1: 10 ml Tris-HCl-Puffer, pH 8,1 werden mit 4 ml Thromboplastin (Boehringer Mannheim, Bestell Nr. 244252) und 1 ml Substratlösung (6,83 mmol/l in Wasser) gemischt und anschließend 1:10 mit einem Tris-Puffer pH 8,1, welcher zusätzlich 6 mmol/l CaCl2 und 0,25 mol/l Harnstoff enthält, verdünnt.
Lösung 2:
N-Methylanthranilsäure, Na-Salz 0,25 mol/l in Wasser.
Lösung 3:
Kaliumhexacyanoferrat-III, K3[Fe(CN6)], 5 mmol/l.
Durchführung:
Photometer mit Filter 644 nm und Schreiber 10 cm/min, thermostatisiert auf 37°C.
Alle Lösungen werden auf 37°C vortemperiert.
Pipettierschema: 1 ml Lösung 1 0,1 ml Lösung 2 0,1 ml Lösung 3 mischen.
0,1 ml Probe (Citratplasma) mischen.
Mit der Zugabe der Probe wird gleichzeitig der Schreiber gestartet.
Man erhält eine Reaktionskurve, wie sie z. B. in der Europäischen Patentanmeldung 82 102 773.7 dargestellt ist. Die Zeit vom Start der Reaktion bis zum Erreichen einer Extinktionsdifferenz von 0,1 ist ein Maß für den Quickwert der Probe, der über eine Bezugskurve in Prozent der Norm ausgedrückt werden kann.
B e i s p i e l 17
Durchführung eines PTT-Tests (partielle Thromboplastinzeit) mit Tos-Gly-Pro-Arg-p-Phenylendiamin.
Herstellung der erforderlichen Lösungen:
Lösung 1:
1 ml eines PTT-Reagenz, wie es für optisch registrierende Gerinnungsautomaten verwendet wird (z. B. Actin, Fa. Dade oder Neothromtin, Fa. Behring) wird mit Tris/HCl-Puffer 0,1 mol/1, pH 7,6 1:10 verdünnt.
Lösung 2:
N-Methyl-anthranilsäure, Na-Salz, 0,25 mol/1 in Wasser.
Lösung 3:
Kalium-hexacyanoferrat-III (K3Fe(CN)6/, 0,005 mol/l in
Wasser.
Lösung 4:
Tos-Gly-Pro-Arg-p-Phenylendiamin und 0,35 mmol/l,
Ca-Acetat 0,044 mol/l in Wasser.
Alle Lösungen werden auf 37°C gebracht und wie folgt verwendet :
Photometerausrüstung und einstellung, wie im Beispiel 1 (Quick-Test).
Man mischt folgende Lösungen in einer Küvette:
0,1 ml Probe (Citratplasma) 1,0 ml Lösung 1 0,1 ml Lösung 2 Inkubation 5 min 37°C 0,1 ml Lösung 3 0,1 ml Lösung 4
Mit der Zugabe von Lösung 4 wird gleichzeitig der Schreiber gestartet. Die Art der Reaktionskurve ist die gleiche wie im Beispiel 1. Als Reaktionszeit wird die Zeit vom Start (Zugabe von Lösung 4) bis zum Erreichen einer Extinktionsdifferenz von 0,1 registriert.
Ein auf diesem Testprinzip aufgebauter Suchtest zur Feststellung und Bestimmung eines erblich bedingten Mangels an Gerinnungsfaktor VIII (Hamophilie A) wird im folgenden Beispiel 3 beschrieben:
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Es wird eine Bezugskurve zur Bestimmung des Faktors VIII wie folgt erstellt:
Komponente 1 :
Citratplasma von 10 normalen Spendern wird gepoolt und repräsentiert einen Faktor VIII-Gehalt von 100 % der
Norm.
Komponente 2 :
Citratplasma eines Spenders mit erblich bedingter Hamophilie A mit einer Restaktivität von weniger als 1 % der Norm (z. B. zu beziehen von Fa. George King Biomedical, Overland Park, Kansas, U.S.A.).
Komponente 1 und 2 werden so gemischt, daß Faktor VIII-Aktivitäten von 100% (reine Komponente 1), 50 (Komponente 1 und 2 1+1 gemischt), 25, 10 und 5 % der Norm entstehen. Mit diesen Proben wird ein PTT-Test analog Beispiel 2 durchgeführt. Man erhält die in Tabelle 1 aufgeführten Reaktionszeiten. Wenn die Reaktionszeiten gegen die % Faktor VIII-Aktivität aufgetragen wird, erhält man eine Bezugskurve für Faktor VIII, anhand derer über die Reaktionszeit einer Patientenprobe der Faktor VIII-Gehalt dieser Patientenprobe ermittelt werden kann.
N-Benzyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-(εBoc)Lysin
Zu 4,9 g Nε-Boc-Lysin und 3,7 g NaHCO3 in 100 ml H2O fügt man unter Rühren 6,0 g Cbo-Gly-Pro-hydroxysuccinimidester in 100 ml Acetonitril zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur weiter.
Man destilliert das Acetonitril im Vakuum ab und säuert den wäßrigen Rückstand mit 2N HCl auf pH 2 an. Der Niederschlag wird abgesaugt und zweimal aus 20 % Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 7,3 g. Elementaranalyse: C=58,23% (b er.58,41 %), H=7,12%
(Hber. 7,16 %) , N=10,68% (Nber.10,48%).
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N,N-Dimethyl-2-brom-4-nitro-anilin
5 g 2-Brom-4-nitro-anilin werden in 100 ml DMF und 100 ml Acetonitril gelöst, mit 21,5 ml Formalin und 4,5 g NaBH3CN versetzt und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ein eventuell entstandener Niederschlag wird abfiltriert. Man versetzt mit 500 ml H2O und saugt den entstandenen Niederschlag ab. Ausbeute: 2,5 g. Elementaranalyse: C=39,08% (Cb er. 39,21 %), H=3,63%
(Hber. 3,70 %), N=11,55% (Nber. 11,43%),
Br=32,37% (Brber. 32,60 %).
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N,N-Dimethyl-2-methyl-4-nitro-anilin
5 g 2-Methyl-4-nitro-anilin werden analog obigem Beispiel methyliert.
Ausbeute: 3,2 g
Elementaranalyse: C=59,75% (Cber 59,99 %), H=6,65%
(Hber. 6,71 %) , N=15,74% (Nber. 15,55%) .
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N,N-Dimethyl-2-carboxy-4-nitro-anilin
5 g 2-Carboxy-4-nitro-anilin werden analog obigem Beispiel methyliert.
Ausbeute: 3,2 g
Elementaranalyse: C=51,22% (Cber. 51,43%), H=4,76%
(Hber. 4,80%), N=13,53 % (Nber. 13,33%)
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N-Benzyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-lysin-4-dimethylamino3-brom-anilidx2CF3COOH
Lösung A: 1 g N,N-Dimethyl-2-brom-4-nitro-anilin werden in 120 ml DMF gelöst, mit 0,1 g Pd/C versetzt und bis zur Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoffs in der Schüttelente hydriert. Anschließend wird unter Stickstoff vom Katalysator abfiltriert.
Lösung B: 2,2 g Cbo-gly-pro-(ε-Boc)-lys werden in 50 ml DMF gelöst, mit 1, 3 ml Triethylamin versetzt und auf -20°C abgekühlt. Man gibt 0,7 ml Chlorameisensäureixobutylester zu und rührt 15 Minuten.
Zur Lösung B läßt man innerhalb von 30 Minuten die Lösung A zutropfen. Man rührt eine Stunde bei -20 °C und läßt über Nacht auf Raumtemperatur kommen. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 10 ml CH2Cl2 aufgenommen, man filtriert vom Ungelösten ab, versetzt mit 8 ml Trifluoressigsäure und rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur. Man engt zur Trockne ein, nimmt den Rückstand in wenig Methanol auf und reinigt durch Chromatographie an "Sephadex LH 20". Ausbeute: 1,1 g Elementaranalyse: C=45,93% (Cber 46,11%), H=4,75%. (Hber. 4,81 %), N=10,0 % (Nber.9,78%)
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N-Benzyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-lysin-4-dimethylamino3-methyl-anilidx2CF3COOH
0,75 g N,N-Dimethyl-2-methyl-4-nitro-anilin werden analog obigem Beispiel umgesetzt.
Ausbeute : 1,1 g
Elementaranalyse: C=51,15% (Cber 51,38%), H=5,55%
(Hber.5,58%), N=10,75% (Nber.10,58%)
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N-Benzyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-lysin-4-dimethylamino -3-carboxy-anilidx2CF3COOH
0,86 g N,N-Dimethyl-2-carboxy-4-nitro-anilin werden analog obigem Beispiel umgesetzt.
Ausbeute: 1,0 g
Elementaranalyse: C=49,5% (Cber. 49,52%), H=5,12%
(Hber.5,13%), N=10,55% (Nber.10,19%).