JPS61501635A - 新規ｐ−フエニレンジアミン−ペプチド及びこれを含有する血液凝固系のプロテア−ゼを測定するための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ｐ−フェニレンジアミン−ペプチド及びこれｔ金石する血液凝固系のプロテ アーゼを測定する九めの試薬 血液凝固系のプロテアーゼの測定は、殊に血液凝固能力の測定及び調節の分野で 、臨床的及び経済的に極めてｌ要である。

それぞれ被測距プロテアーゼにより特異的に分解され、この際光学的に測定可能 な基を離脱する、特定の色原体ペプチドの使用下に、血液凝固系のプロテアーゼ を測定することは既に公知である。この際、この種の人工基質の龜加によシ、血 液凝固段階（Ｂｌｕｔｇｅｒｉｎｎｅｒｕｎｇｓｋａｓｋａ＋ｉｅ　）　１１損 なわれず、即ち、不利に影響されないから、他の起源のプロテアーゼに公知の大 抵の色原体ベゾテド様基質は、血液凝固系のプロテアーゼの測定のためには使用 不能である。基Ｔｏｅ−Ｇ１ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−もしくはＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐ ｉｐ−Ａｒｇ−ｋ　石する２種のｐ−ニトロアニリン誘導体は凝固段階に不利に 影響しない適当なプロテアーゼ基質であることが明らかである。しかしながら、 これらの基質は、プロテアーゼによる七の分解時に生じる色素の測定は赤色又は 重色の物質により防害され、従って血液上れ自体中での測定は可能でない欠点を 石する。

従って、本発明は、この欠点を除き、凝固段階に不利に影響せず、他方、分解時 に吸収最大が５６５　ｎｍよりも長波長の所にあり、完全血液中での、又は他の 妨害性の着色物質の存在での測定ｔも可能にする、血液凝固系のプロテアーゼに 対する基質を得ること金ｌＪ題としている＠ この課題は、本発明により、一般式■：〔式中、人はアミノ酸アルギニン又はリ ジンｋＷわし、ＸはＮ−末端アミノ酸−保＠基又はＤ−アミノ酸を衣わし、Ｙは 単結合又は１〜３個のアミノ酸よシなる連鎖を表わし、ＮＲ１Ｒ２は、〇−又は ｐ−位に存在する基で、Ｒ１とＲ２とは互にＳ関係に、水素又は１〜３個のＣ− 原子を翌するアルキル基を表わし、Ｒ３は水素原子、カルボキシル基、ハロゲン 原子又はＣ−原子数１〜６のアルキル基を表わ丁〕の化合物により解決される。

本発明の新規化合物は、血液凝固系のプロテアーゼにより〇−又にｐ−フェニレ ンジアミン誘導体の発生下に分解でき、これは、酸化剤の存在で、過当なカップ リング成分例えばＮ−メチルアントラニル酸との反応で吸収最大が５６５　ｎｍ より長い波長にある色素を形成する。意外にも、この反応により、血液凝固段階 は負に影響されず、従って、本発明による新規化合物は、血液凝固系そのものの プロテアーゼ又は血液凝固系のプロテアーゼの活性を調節する血液凝固系の他の 因子の測定の交めの基質として好適であることが明らかになった。

式中のＲＩＲ２−Ｈである一般式ｌの化合物が有利である。

更に、式中のＸ　−ＴｏｅでＹ　−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　、Ｘ−Ｅｌ−Ｄ−Ｐｈｅで Ｙ−Ｐｉ、ｐ、Ｘ−Ｅｌ−Ｄ−工１ｅでＹ　−ａ　Ｐｒｏ、Ｘ　−ＣＨ３５Ｏ２ −Ｄ−Ｎｌｅ　テＹ　−Ｇａｙ　ＸＸ　−ＣＨ３０ＣＯ−Ｄ−ＮＩＱ　”ｅ７− 　Ｇａｙ　であるような化合物が七゛利である。

本発明の化合物Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−フェニレンジアミン及び ｇ−Ｄ−ｒｈｏ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−１）−フェニレンジアミンが特に有利である 。

不発ＢＡＫよる新規化合物の製造は、当業者に慣用の、被ゾチド合成の方法で行 なうことができる。有利に、この製造は、一般式ｌ： 〔式中Ｘ、Ｙ、Ａ及びＲ，Ｕ　１式に対して記載のもの１表わ丁〕の化合物ｔ″ 還元、生じ友ＮＨ，−基を場合によりアルキル化して、式中のＲ１及びＲ２がア ルキル基である化合物ｔｍ造することによシ行なう。

一般式亘の化合物の還元は、有利に、触媒としてのパラジウム／炭を用い、還元 的水素添加に慣用の浴剤例えはメタノール／氷酢酸中での接触的水素添加により 行なう。

前記のように、本発明の化合物は、特に、プロテア−ぜ殊に血液凝固系のプロテ アーゼ例えはトロンリン、プラスミン、プラスミノーゲン、第ｘａ因子、カリク レイン、プラスミノーデン活性化剤の測定の九めの色ｚｍ性基質として好適であ る。しかしながら、これは、同様に他のプロテアーゼ例えばキ七トリプシン、ト リジシン等に対する基質としくも好適である。

その都度のプロテアーゼによシ、本発明の化合物は、フェニレンジアミンもしく はフェニレンジアミン誘導体の発生下に分解され、これは、酸化剤例えばＫｓ（ ７ｅ（ＣＮ）ｓｌの存在で、適当なカップリング成分を用いて酸化さｎ％５６５ ｎｍよシ太ぎい所ＫＱＩＬ収最大を肩する色素にされる。Ｉ）−７二二レンジア ミン七のものでは、その測定は特Ｋ　６４４　ｎｍで実施できる。この波長でに 、屡々、血液、血漿、血清又扛他の体液中に存在する着色物質中でもはや妨Ｗは ない。血液又は浴血注（赤色）又は＊痕性（黄色）の血漿又は血清の固有色は、 この測定系に何の影Ｉ＃ｔも有しない。従つて、凝固因子、−維累浴解系又はカ リクレイン−キニン−系の因子、細胞例えは白血球から振出され九蛋白質分解酵 素例えば、顆粒白血球−エラスターゼ又は体液中のカップリングＧは、本発明の 化合物を用いて測定することができる。これら化合？ｌは、凝固系の全酵素段階 の分析測定例えば、プロトロンビン時間法（ＰＴ−又にクイックテスト）もしく は部分トロンボプラスチン時間法（ＰＴＴ−テスト）の場合での測定を可能とす る＠ 同様に、本発明の化合物は、プロテアーゼの活性低下の測定による脣定活性の蛋 白質分解酵素の阻害剤の測定のために好適である。このための１例は、アンチト ロンビンの存在によるトロンビンの活性低下の測定である。

カップリング成分としては、この反応のために、芳香族アミン又はフェノールが 好適である。１式の化合物が符に好適である： Ｃ式中Ｘ　Ｂ　ＮＲ２Ｒ３又は−〇−Ｒ３−基であ、す、Ｒ１は水素又に塩素で あり、この除Ｒ４及び／又はＲ６も塩素であり、Ｒ２及びＲ３は同−又は異なる もので、水素、Ｃ−原子数８までのアルキル−、アルアルキル−又はアリール基 であり、これらはヒドロキシ、Ｃ−原子数５′ｆ、でのアルコキシ、−ＣＯ２Ｈ ｓ　−８０５８で置換されていてもよい〕。

Ｒ４及びＲ６は水素、Ｃ−原子数５までの低級アルキル、塩素、臭素、沃素、− ＣＯＯＲｓ、５ｏ３ａ２、ＯＲ２、ＮＲ２Ｒ３’ｌ　衣わし、ここでＲ２及びＲ ５は前記のものを表わし、Ｒｓ及びＲ？はＣ−原子数５までのアルキル基を表わ し、この際、Ｒ４とＲ５もしく　ａ　Ｒ６とＲ？　Ｂペンゾール璋と一緒になっ てす７テルー及びアントラニル骨格で形成してもよい。

前記化合物中のアルキル基はＣ−原子数６まで有利に１〜６を肩する。特にメチ ル基及びエチル基が有利である。

この有利な例は、既述のかつ特に有利なＮ−メチルアントラニル酸以外に、キシ レノール例えは２．６−キシレノール、ジアルキルメタニル酸例えば、ジエチル メタニル酸及び七の塩、Ｎ−アルキル−（３′−スルホベンジル）アニリン、殊 にＮ−エチル化合物、Ｎ−アルキル−Ｎ　−（３’−スルホベンシル）−３−） ルイジン、殊にメチル−、エテル−及びプロピル−化合物及び塩殊にナトリウム 塩の形のＮ−ビス−カルボキシベンジル−３−アニンジンである。

本発明のもう１つの目的物は、血液凝固系のプロテアーゼを測定するための試薬 であり、これは、１式の化合物、酸化剤、フェニレンジアミンと酸化的に色素を 形成するアニリン−又はフェノール誘導体及び緩衝剤を含有する＠ 酸化剤としては、ＫＩＦｅ（ＣＮ）６又はペルオキシド／ペルオキシダーゼが有 利である。

本発明の試薬は、細石の反応に必要な成分即ち一般式■の化合物、カップリング 成分、酸化剤及び緩ｔｖ＋質（ＰＨ６〜１０）と共になお、活性剤（例えはマグ ネシウム塩）、湿潤剤、安定剤、粘稠化剤及び他の慣用の助剤會含庸していてよ い。この試薬は、乾燥形で、水性浴剤中に酊かされて、又は吸収性担持材（試験 片）上に含浸されて存在しうる◎ 次の例につぎ本発明上説明する。

例１〜１５ 次に記載の４−アミノアニリドに相当するそれぞれの４−ニトロアニリド０．２ ｍモルｔメタノール／氷氷酸酸中浴かし、１０％パラジウム／炭（１０１ｔ−加 え、室温で、振動鴨型フラスコ中で、反応完結まで水素弗加する（ＤＣ−コント ロール）。ずイツーフィルグーを通して吸引し、水を加え、メタノールを真を中 で溜去する。水性残分を凍Ｍ乾燥させる。メルク社の既製プレートシリカゲル６ ０１Ｆ２５４上で、展開剤：ｎ−ブタノール−氷酢酸−水１５０−１５−２５１ −用いて丁べてのＲＦ−値を測足する（発色：Ｃ１ｇ／）ルイジン）。次の化付 物でこのように製造する：１、Ｎ−トシル−グリシル−Ｌ−７’ロリルーＬ−ア ルギニル−４−アミノアニリド（Ｘ　ＡＣＯＨ）、ＲＦ　−０，１７、〔α］ｐ 　−−４９°（ｃ　−ＭｅＯＨ１００Ｔ！Ｌｔ中０．５　ｇ）２、Ｎ−スクシニ ル−Ｌ−アラニル−ｂ−７’ロリルーＬ−フェニルアラニル−４−アミノアニリ ド（水索龜加、ａｏＡｃの添加なし）、ＲＦ　−０−４９、〔α）、−−９０’ （ｃ−ＭｓＯＨ１０Ｑｍ＆中ｏ、ｓｇ）。

３、Ｎ−）ジル−グリシル−Ｌ−ゾロリルーＬ−リジル−４−７ミノアニリド（ ｘ　Ａｃｏａ　）、ＲＦ　−０，４１、〔α）Ｄ−−５２°　（Ｃ＝　Ｍ２Ｏ日 　１００−中０．３　ｇ　）　。

４、Ｎ−ペンソイル−Ｌ−７’ロリルーＬ−フェニルア５、Ｎ−メシル−Ｄ−ノ ルロイシル−グリシル−Ｌ−アｂｅ二ｈ−４−アミノアニリド（Ｘ　ＡＱＯＨ） 、ＲＦ−０，３９、〔α）Ｄ−−９°（Ｃ−Ｍ＠ＩＯＨ９８＋１１７！＋　ＨＯ Ａ０２ｍｔ中０．５　ｇ）　。

６、Ｎ−メトキシカルざニルーＤ−ノルロイシルーグＩＪ　シｔｂ　−Ｌ−アル ギニル−４−アミノアニリド（ＡＣＯＨ）、ＲＦ　−０，４０、〔α）Ｄ−−１ ５，８″′（Ｃ−ＭｅＯＨ９８ｄ＋ＨＯＡＣ２ｄ中０．５．９　）。

Ｚ　Ｈ−Ｄ−インロシルーＬ−７’ロリルーＬ−アルギニル−４−アミノアニリ ド−２塩は塩、ＲＩＦ　−０−１４、［α］Ｄ−−４１．９°（Ｃ−水１ＱＱａ ｔ中ＩＮ）。

８、Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−４−アミノアニリド−２ 塩酸塩、Ｒ，−０，３２゜９　Ｎ−アセチル−Ｌ−インロイシルー−−グルタミ ルーグリシルーＬ−フルイニル−４−アミノアニリド−塩酸塩、碇−０，３４゜ １０、Ｈ−Ｄ−７ｘニルアラニル−Ｌ−ピペコリルーＬ−アルギニルー４−アミ ノアニリド−２塩酸塩、ＲＦ−０，３３゜ １１ＥＩ−ｎ−パリルーＬ−ロイシルーＬ−リジル−４−アミノアニリド−２塩 酸塩、Ｒ，−０，３５゜１２、Ｎ−ペンソイル−Ｌ−インロイシル−Ｌ−ガンマ −ぎベリジルグルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−アミノアニリド（ｘ 　ＡａｏＨ）、Ｒ，−０−４２゜１５、Ｆｉ−Ｄ−Ｂｕｔ、−シクロヘキシルア ラニル−リジル−４−アミノアニリド（ｘ　ＡｃＯＨ）。

１４、スクシニルーアラニルーアラニルーゾロリルーフェニルアラニルー（３− カルざキシ−４−アミノ）−アニリド。

１５、スクシニルーアラニルーアラニルーゾロリルーフェニルアラニル（３−ハ ロゲノ−４−アミ）’）−７二−リ　ド　。

例１６ 基質Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−７ｘ　ニレンジアミン（例１の化合 物）ｔ＃３いるクイック−テストの＋ｍ：必要俗液０製造： 浴液１ニ ドリス−ＭＣＩ−緩衝剤（ｐＥ４８．１　）　１０ｄｋ　）ロンボブラステン（ ベーリンガー・マンノ）イム整理番号２４４２５２）ｌｌｊ及び基質温液（水中 ６．８３　ｍモル／Ｊ）１１１７と混会し、引続き、付加的にＣａＣ１□６ｍモ ル／ｌ及び尿素０．２５モル／ノを含有するトリス緩衝液（ｐＨ８，１）で１： １０に稀釈する。

浴液２： 水中のＮ−メチルアントラニル酸、Ｎａ−［０，２５モル／ｌ。

浴液３： カリウムへキサシアノフエレートー［１、Ｋ３（１’ｅ（ＣＮ）６）、５ｍモル ／ｌ。

！！施； フィルター６４４　ｎｍ及び記録装ｆ［１１０ｃｍ／ｍ１ｎｈ石する光度計を３ ７℃に恒温保持する。すべての溶液に３７℃に予備加熱する。

ピペット導入快領： 浴液１　１１１１ｊ 浴液２　０．１１１ｊ 浴液３　０．１１７ 全混合する。

試料（クエン歌壇血漿）　０．１１１１ｊ會混合する。

試料の添加と同時に記録装置を始動さセる。

欧州物許出ａ第８２１０２７７３．７号８Ａ細誉中に記載のような反応曲軸が得 られる。反応の開始から０．１の吸光度差の到達までの時間は、関連曲線上で基 亀の百分本で表現されうる試料のクイック値に関する尺度である。

例１７ Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐ−フェニレンジアミンを用いるＰＴＴ’− テスト（部分トロンボプラスチン時間）の実施：必要ｍ液の製造： 鹸ｓｉ： 光学的に記録する自動凝固装置に使用されるようなＰＴＴ　−試薬（ＭＬハ７り ｆ　ン（Ａｃｔｉｎ　）　（デート社Ｆａ−Ｄａｄｅ　）又はネオトＯＡ　５− 　ｙ　（Ｎｅｏｔｈｒｏｍｔｉｎ　）　（ベーリング社Ｆａ、　Ｂｅｈｒｉｎｇ 　）　）　１　ｍｌ　ｉｔ　）リス／　ＨＣＬ−緩衝液（０，１モル／ｌ、ｐＨ ７−６）で１：１０に稀釈する。

溶液２： 水中のＮ−メチル−アントラニル酸、ＮＩＬ−塩、０．２５そル／！。

浴液３： 水中のカリウム−へキサシアノフエレート−■（Ｋ　３　Ｆ　＠　（ＯＮ　）　 ａ、Ｏ−００５８＝ル／ｌ　）。

隘ｇ４： 水中のＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−フェニレンジアミン０．３５　ｍ モル／ｌ及び酢酸カルシウム０．０４４モル／丁べての重液’に３７°Ｇにし、 次のように使用する：光度計装境及び同調整は例１（クイック−テスト）と同様 。

次の溶液ｔキュベツト中で混合する。

試料（血漿クエン酸塩）　Ｑ、１ｍ 浴液１　１−Ｏｄ 俗液液２　０．１１１１ｔ ３７°Ｃで５分間恒温保持、 溶液３　０．１　ｍ 溶液４　０．１１１１７ 浴液４の添加と同時に記録会ｋｋ始動させる。反応曲縁の種類は、例１における と同様である。反応時間として開始時（溶液４の添加）から０．１の吸光度差の 達成までの時間を記録する。

この試験原理で構成された著るしく限定され九凝固因子■の欠乏（血友病Ａ）を 測定する迄めの検査試鱗を次の例に記載する： 例１８ 第糧因子の測定のための関連曲′ｆＭは次のようにして整える： 成分１： 正常供血者１０人のクエン酸塩血漿ｔプールし、基準の１００％の第■因子含Ｉ ｋ會表出する。

成分２： 基準の１チよシ低い残留活性を石する着るしく限られた血友病Ａｔ−Ｍする供血 者のクエン酸塩血漿〔例えはジョーク・キング・バイオメディカル社（Ｐａ。

Ｇｅｏｒｇｅ　Ｋｉｎｇ　ＢｉｏｍｅｃＬｉｃａｌ、□ｖｅｒｘａｎａ　Ｐａｒ ｋ　ＸＫａｎｅａａ。

Ｕ、８．Ａ、）。

成分１及び２１基亀の１００％（純粋成分１）、５０％（成分１　ト２ｏ１　＋ １　ｈ合物）、２５％、１゜チ及び５％の第４因子活性が生じるように混曾する 。

これらの試料で、偽２と同様にＰ’ｌ’Ｔ−テス）ｋ実施する。第１表に記載の 反応時間が得られる。反応時間を第糧因子−活性（％）に対して誉ぎ込むと１第 ■因子に関する関連曲線が得られ、これにより患者試料の反応時間にわたる七の 患者の第■因子含分ｔ＃Ｉ定することができる。

第　１　表 例２によるＰＴＴ−テストにおける血漿試料の第糧因子含分と反応時間との関係 例１９ Ｎ−ペンジルオキシカルボニルークリシルーフｏ　９ルー（ｇ　Ｂｏａ　）−リ ジン Ｈ２Ｏ１００−中のＮ、　−Ｂｏａ−リジ：ｙ４．９９及びＮａＨＣＯ３３−７ Ｊｉ’に、撹拌下にテセトニトリル１０Ｑｉｕ中のＣＩ）Ｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ− ヒドロキシスクシンイミドエステル６−Ｏｇｔ−添加し、呈温で１夜更に撹拌す る。

アセトニトリル會真空中で溜去し、水性残分を２　Ｎ　ＨＣｌでｐＨ２まで酸性 にする。沈殿を吸引濾過し、２０チメタノールから２回再結晶させる。収量７． ６ｇ。

元素分析：　Ｃ−５８，２３％（Ｃ計算値５８．４１チ）日−７，１２％（Ｆ！ 計算値　７．１６　％　）Ｎ讃１０．６８％（Ｎ計算値１０．４８チ）例２Ｏ Ｎ、Ｎ−ジメチル−２−ブロム−４−ニトロ−アニリン ２−ブロム−４−ニトロ−アニリン５　ｇ　ｋ　ＤＭＦ　１００罰及びアセトニ トリル１００ｄ中に浴かし、ホルマリン２１．５−及びＮａＢ日、ＣＮ　４．５ 　ｇを加え、呈温で４８時間挑押子る。場合により生じる沈殿を８去する。Ｈ２ Ｏ５０！ｌｔ−加え、生じる沈殿上吸引除去する。収量２．５元素分析：　ｃ　 −３９，０８％（Ｃ計算値３９．２１％）Ｈ＝　３．６３％（Ｈ計算慟　６．７ ０％）Ｎ＝１１．５５％（１ｔｔＪ＞値１１．４３％）Ｂｒ　−３２，３７ｆｂ 　（Ｂｒ計算＠　３２．６０％）例２１ Ｎ、Ｎ−ジメチル−２−メチル−４−ニトロ−アニリン 前記例と同様に２−メチル−４−ニトロ−アコ９フ収量：　３．２　ｇ 元素分析：ｃ−５９．７５％（Ｃ計３１Ｎ１５９．９９％）Ｈ−　６。６５チ（ Ｈ計算値　６．７１チ）Ｎ−１５．７４チ（Ｎ計算値１５．５５チ）例２２ Ｎ．Ｎ−ヅメナル−２ーカルざキシ−４−ニトロ−アニリン 先の例と同様に、２−カルボキシ−４−ニトロ−アニリン５ｇをメチル化する〇 収量：　３．２　、９ 元素分析：Ｃ−５１．２２チ（Ｃ計算値５１．４３％）Ｈ−４．７６チ（Ｈ計算 値　４．８０チ）Ｎ−１３．５３％（Ｎ計算値１　３．３　３　％　）例２３ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリル−リジン−４−ジメチルア ミノ−６−プロムーアニリ　ド　Ｘ　２　ＣＦ，Ｃ００Ｅｉ 瘉液Ａ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ブロム−４−ニトロ−アニリン１ｇをｐｕｌＦ １２（）＋ｊ中に溶かし、ｐａ／ｃＯ．１＃ｔ−加え、計算量の水素が吸収され るまで、振動鴨型フラスコ中に水素添加する。引続ぎ窒素気下に触媒′ｔ″濾去 する。

溶液Ｂ　：　（’ｂｏーＧｌｙーＰｒｏ−（　ｇ−Ｂｏａ　）−　Ｌｙｅ　’１ ．’ｌ　／ｌ　１（　ＤＭＦ５〇−中に溶かし、トリエチルアミン１．６−を加 え、−２０℃に冷却する。クロルギ酸イ＼ソゾチルエステル０．７１１７　を加 え、１５分間撹拌する。

浴液Ｂに３０分かかつてｍ液Ａｇ滴加する・−２０℃で１時間撹拌し、夜間室温 にする。反応偏酋物を濃縮乾燥させる。残分ｋ　ＣＨｔｏｌｚ　１　０　＋１を 中に入れ、不浴分會榔去し、トリフルオル酸９８１４を加え、室温で４時間撹拌 する。濃縮乾固させ、残分を少量のメタノール中に入れ、−ｔ７７アデツクスＬ Ｈ　２　０　（　５ｅｐｈａｄｅｘ　ＩＨ　２０）でのクロマトグラフィにより 精製する。収１１．１，ｌｉ＋。

元素分析：　Ｃ　−　４　５．９　３チ（Ｃ計算値Ａ　６．１　１チ）Ｈ−　４ ．７５％＜Ｆ１１１ｉＥ値　４．８　１　％　）Ｎ−１０．０　％（Ｎ計算１１ 　９．７　８　％　）例２４ Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−クリシル−プロリル−リジン−４−ジメチルア ミノ−３−メチルーアニリ　ド　Ｘ　２　ＣＦ，Ｃ００ｆｌ Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−メチル−４−ニトロ−アニリン０．７　５　ｇを前記例 と同様に反応させる。

収量：　１．１　ｇ 元素分析：ｃ−５１．１５％（ｃ計算ｍ５１．３８チ）Ｂ−５．５５＊（Ｈ計算 量　５．５８％）Ｎ−１０．７５チ（Ｎ計算値１０．５８チ）例２５ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリル−リジン−４−ジメチルア ミノ−３−カルボキシ−アニリドＸ　２　ＣＦ２ＣＯＯＨ Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−カルざキシ−４−ニトロアニリン０．８　６　ｇｋ前記 例と同様に反応させる。

収ｊｊ−：１．Ｏｇ 元素分析：ｃ−４９．５　１（Ｃ計Ｘ（１４９．５２％）Ｈ−５．１２％（Ｈ計 算値　５．１３％）Ｎ−１０．５５チ（Ｎ計算値１　０．１　９チ）Ｐｅｒ／Ｅ Ｎ５１００３１１５ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔｊ［ＩＮＴ’ＲＮＡＴｒＯＮＡＬ　５ＥＡＲ１ＲＥＰＯＲ Ｔ　ＯＮ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ａはアミノ酸アルヤニン又にリジンを表わし、ＸはＮ−末端アミノ酸保護 基又はＤ−アミノ酸を表わし、Ｙは単結合又は１〜３個のアミノ酸よりなる連鎖 を表わし、ＮＲ１Ｒ２は、Ｒ１とＲ２がそれぞれ無関係に水素又はＣ−原子数１ 〜３のアルキルてある０−又はＰ−位に存在する基を表わし、Ｒ３は水素原子、 カルボキシル基ハロゲン原子又にＣ−原子数１〜３のアルキル基を表わす〕の化 合物。
2. ２．Ｒ１Ｒ２−Ｈである、請求の範囲第１項記載の化合物。
3. ３．Ｘ＝Ｔｏｓであり、Ｙ＝Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求の範囲第１項又は第２ 項に記載の化合物。
4. ４．ｘ＝Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅであり、Ｙ＝Ｐ１Ｐである、請求の範囲第１項又に第２ 項に記載の化合物。
5. ５．Ｘ＝Ｈ−Ｄ−Ｉ１ｅであり、１４＝Ｐｒｏである、請求の範囲第１項又に第 ２項に記載の化合物。
6. ６．Ｘ＝ＣＨ３Ｓ０２−Ｄ−Ｎｌｅであり、Ｙ＝Ｇｌｙである、請求の範囲第１ 項又に第２項に記載の化合物。
7. ７．Ｘ＝ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＮＬｅであり、Ｙ＝Ｇｌｙである、請求の範囲第１ 項又は第２項に記載の化合物。
8. ８．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ａにアミノ酸アルギニン又にリジンを表わし、ＸはＮ−末端アミノ酸保護 基又にＤ−アミノ酸を表わし、Ｙは単結合又は１〜５個のアミノ酸よりなる連鎖 を表わし、ＮＲｌＲ２はＲ１とＲ２がそれそれ無関係に水素又はＣ−原子数１− ３のアルキルであるＯ−又はＰ−位に存在する基を表わし、Ｒ３は水素原子、カ ルボキシル基、ハロゲン原子又はＣ−原子数１〜３のアルキル基を表わす〕の化 合物を製造するため、一段式Ｉ：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｘ、Ｙ、Ａ及びＲ３は前記のものを表わす〕の化合物を還元し、生じたＮ Ｈ２基を場合によりアルキル化することを特徴とする、新規Ｐ−フエニレンジア ミン−ペプチドの製法。
9. ９．一般式１の化合物を接触的水素添加する、請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ａにアミノ酸アルギニン又はリジンを表わし、ＸはＮ−末端アミノ酸保護 基又はＤ−アミノ酸を表わし、１に洋結合又ほ１〜３個のアミノ酸よりなる連鎖 を表わし、ＮＲｌＲ２は、Ｒ１とＲ２がそれぞれ無関係に水素又はＣ−原子数１ 〜３のアルキルであるｏ−またはｐ−位に存在する基を表わし、Ｒ３は水素原子 、カルボキシル基、ハロゲン原子又はＣ−原子数１〜３のアルキル基を表わす〕 の化合物、酸化剤、フエニレンジアミンと酸化的に色素を形成するアニリン−文 にフェノール誘導体及び緩衝剤を含有下ることを特徴と下る、血液凝固系のプロ テアーゼを測定下る試薬。
11. １１．酸化剤としてＫ３Ｆｅ（ＣＮ）５又はペルオキシド／ぺモルオキシダーゼ を含有する、請求の範囲第０項記載の試薬。
12. １２．アニリン−又にフエノール誘導体として、Ｎ−メテル−アントラニル酸、 ジメチルアントラニル酸、Ｎ−エチル−Ｎ−（３′−スルホペンゾール）−アニ リン又は２、５−キッレノールを含有する、請求の範囲第１０項又は第１１項に 記載の試薬。
13. １３．吸着性担持材上に含反されて存在下る、請求の範囲第１０項から第１２項 までのいずれか１項記載の試薬。