WO1983003199A1 - Procede d'obtention de variants a infectivite reduite a partir de parasites protozoaires, variants ainsi obtenus et leur utilisation - Google Patents

Procede d'obtention de variants a infectivite reduite a partir de parasites protozoaires, variants ainsi obtenus et leur utilisation Download PDF

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WO1983003199A1 PCT/BE1983/000006 BE8300006W WO8303199A1 WO 1983003199 A1 WO1983003199 A1 WO 1983003199A1 BE 8300006 W BE8300006 W BE 8300006W WO 8303199 A1 WO8303199 A1 WO 8303199A1
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cruzi
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myocardial cells
trypanosome
inorganic salts
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International De Pathologie Cellulaire ... Institut
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Boon, Thierry
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    • A61K39/002—Protozoa antigens
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining variant parasites with reduced infectivity from protozoan parasites, to the variant parasites thus obtained as well as to live or killed vaccines containing such variants.
  • Many immunization procedures using either strains of slow aviru protozoan parasites (Seah and Marsden, 1969: The protection of mice against a virulent strain of Trypanosoma cruzi by previous inoculation with an avirulent strain. Ann. Trop. Med. Parasitol., 63 , 211-214), either antigenic extracts (Seneca et al., 1966: Active immunization of mice with Chagatoxin.
  • the present invention therefore consists in overcoming the drawbacks of known vaccination methods and it essentially consists in bringing in vitro a virulent strain of protozoan parasites with at least one chemogenic mutagenic agent under conditions which make it possible to obtain variant parasites, and more particularly of variant clones with reduced infectivity and increased immunogenicity.
  • the protozoan parasite is chosen from the group formed by Trypanosome cruzi, African Trypanosome (Rhodesiense, Gambiense, Brucei, Vivax, Congolense), Leishmania (Donovani, Tropica) and Plasmodium Falciparum
  • the chemical mutagen is chosen from the group formed by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, ethylmethanesulfonate, N-methyl-N-nitrosourea and their mixtures, the agent chemical mutagen N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine particularly suitable for Trypanosome cruzi.
  • the process for obtaining variants of Trypanosome cruzi with reduced infectivity comprises in particular the incubation of the strain of Trypanosome cruzi with N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine, in an aqueous nutrient medium containing glucose and inorganic salts at a temperature of about 36 ° C, clonal infection of cells mouse myocardial cells by the preparation of the above-mentioned mutagenized Trypanosome at a temperature of the order of 37 ° C., the separation by centrifugation of the cells, the suspension of the pellet of infected cells in an aqueous nutritive medium containing inorganic salts, glucose, amino acids, vitamins and fetal calf serum, incubation of microwells containing a mixture of the above-mentioned infected cell suspension and a separation of myocardial cells from uninfected mice, and harvesting of variant clones of Trypanosome cruzi with reduced infect
  • the incubation solution thus obtained is centrifuged until a pellet of Trypanosome cruzi is obtained, the pellet of Trypanozoms cruzi is introduced into an aqueous nutritive medium containing glucose, salts inorganic, amino acids, vitamins and fetal calf serum so as to obtain an aqueous suspension of Trypanosome cruzi, the suspension of Trypanosome cruzi thus obtained is brought into contact with mouse myocardial cells in an aqueous nutritive medium containing glucose, of inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum, the number of myocardial cells used being appreciably greater than the number of T.
  • the solution is incubated thus obtained for a period of approximately 3 to 6 days at a temperature of approximately 37 ° C in an atmosphere of air and carbon dioxide, so as to thus obtain a penetration of the order of 1% of myocardial cells of crypi Trypanosomes and their multiplication inside these cells, this stage constituting the clonal infection of myocardial cells, the myocardial cells thus treated are separated from their incubation solution and they are introduced into a nutritive medium aqueous comprising glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum, said nutrient medium is centrifuged until a cell pellet is obtained, the abovementioned cell pellet is reintroduced into a nutrient medium aqueous comprising glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum so as to obtain an aqueous suspension of cells of which approximately 1% are infected, dilute the suspension, distribute it in microwells in which is also added a preparation
  • the incubation of the aforementioned solution allowing the penetration by Trypano somes cruzi of myocardial cells and their multiplication inside these is carried out in dishes of the type for tissue culture, nutritive culture medium used during this incubation being separated by aspiration after a period of the order of 48 hours to replace it with fresh medium of the same composition so as to eliminate the Trypanosomes cruzi which have not penetrated into the myocardial cells , the myocardial cells agglutinating on the interior walls of said boxes.
  • the present invention also relates to the variant parasites with reduced infectivity thus obtained as well as to live or killed vaccines against parasitic diseases, which comprise, as active ingredient, a strain of variant parasites with reduced inactivity and of increased immunogenicity such as 'obtained by the above process, in combination with a pharmacologically acceptable diluent.
  • the immunogenic variants of the invention were obtained, as in the case of cell variants (tum-) obtained from mouse tumor cells, by mutagenesis and cloning .
  • the present invention is completely different from the mitigation methods frequently used for the preparation of vaccines. These methods aim to obtain preparations of pathogenic agents which are physically intact but whose viability, that is to say the intrinsic capacity to multiply, is reduced. On the contrary, the invention aims to obtain clones of parasites with intact viability, as measured by their multiplication in vitro, but whose infectivity is reduced due to an increased susceptibility to the defenses of the host.
  • the method of the invention consists in bringing in vitro a circulating strain of protozoan parasite with a chemical mutagenic agent under conditions which allow variant parasites to be obtained, and more particularly of variant clones with reduced infectivity.
  • the method of the invention can be applicable to all protozoan parasites and with any chemical mutagen effective in vitro.
  • protozoan parasites include the African Trypanosome (Rhodesiense, Ganbien-se, Brucei, Vivax, Congolense), Leishmania (Donovani, Tropica) and Plasmodium Falciparum, and as mutagenic agents, ethylmethanesulfonate and N-methyl-N-nitrosourea.
  • the virulent strain of Trypanosome cruzi is incubated with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine as chemical mutagen, in an aqueous nutritive medium containing inorganic salts and glucose.
  • Hanks medium the composition of which is given below, is particularly suitable for this purpose: Middle of Hanks (qr) / l)
  • the duration of this incubation is of the order of one hour and it takes place at a temperature of around 36 ° C.
  • the incubation solution thus obtained is then centrifuged until a pellet of Trypanosome cruzi is obtained, and the pellet of Trypanosome cruzi is introduced into an aqueous nutritive medium containing glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins , to which fetal calf serum was added, which makes it possible to obtain an aqueous suspension of Trypanosome cruzi containing, for example, approximately 1 million Trypanosomes cruzi per ml.
  • the Eagle medium modified by Dulbecco which corresponds to the following composition, will preferably be used as aqueous nutritive medium:
  • DMEM mg / liter Medium of Eagle modified by Dulbecco
  • L-Histidine HCl H 2 O 42.00 L-Isoleucine 105.00 L-Leucine 105.00 L-Lysine HCl 146.00 L-Methionine 30.00 L-Phenylalanine 66.00
  • DMEM mg / liter Medium of Eagle modified by Dulbecco
  • the suspension of Trypanosome cruzi (T. Cruzi) thus obtained is brought into contact with mouse myocardial cells in an aqueous nutrient medium containing glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum, the number of myocardial cells used being significantly higher than the number of T. cruzi, and the solution thus obtained is incubated for a period of approximately 3 to 6 days at a temperature of approximately 35 ° C in an atmosphere of air and carbon monoxide, which makes it possible to obtain a penetration of the order of 1% of myocardial cells of mice, by Trypanosomes cruzi and their multiplication inside these cells, this stage constituting in fact the clonal infection myocardial cells.
  • the myocardial cells thus treated are then separated from their incubation solution and are introduced into an aqueous nutritive medium based on glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum (for example DMEM + medium 10% fetal calf), this nutrient medium is centrifuged until a centrifugation pellet formed of cells is obtained, the abovementioned cell pellet is reintroduced into an aqueous nutrient medium of the same composition or a similar composition in the nutrient medium used in the previous step, so as to obtain an aqueous suspension of cells of which approximately 1% are infected containing, for example 10,000 cells per ml, and this suspension is diluted to obtain, for example, a concentration of approximately 200 cells per ml.
  • an aqueous nutritive medium based on glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum (for example DMEM + medium 10% fetal calf)
  • the incubation of the aforementioned solution allowing the penetration by Trypanosomes cruzi of myocardial cells and their multiplication inside these is preferably carried out in dishes of the type for tissue culture, for example the boxes Falcon.de Becton Dickinsonje nutritive culture medium used during this incubation being separated by aspiration after a period of the order of 48 hours to replace it with fresh medium of the same composition, so as to eliminate the Trypanosomes cruzi which do not have not entered the cells myocardial.
  • the myocardial cells which agglutinate on the interior walls of these boxes are separated from them by treatment at room temperature with a saline solution containing a mixture of trypsin and ethylenediaminetetraacetate (EDTA), for example a saline solution containing 0.5 gr / liter of this trypsin and 0.2 gr / liter of EDTA. Then, to the saline solution containing the myocardial cells, aqueous nutrient medium containing glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum is added and the nutrient medium is centrifuged until the pellet is obtained. of myocardial cells mentioned above.
  • the concentration of which per ml is, for example, about 200 myocardial cells of which about 1% are infected, it is distributed in microwells in which we also add a preparation of myocardial cells from uninfected mice based on glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum, the microwells are incubated at a temperature of approximately 37 ° C. for a period of approximately 10 to 22 days, preferably for 20 days, in an atmosphere of air and carbon dioxide, and the variant clones of Trypanosome cruzi with reduced infectivity are collected from the microwells which contain them.
  • the cells actually infected are distributed in these wells in many such that approximately 5 to 15% of the wells receive an infected cell and therefore most positive wells contain only one clone of parasites. After the incubation period of 10 to 22 days mentioned above, and preferably after an incubation of 20 days, thanks to several cycles of intracellular multiplication, a production of approximately 10 6 parasites per clone is obtained.
  • microwells which is significantly higher than the number of infected cells used.
  • the microwells are in fact small recesses, the depth and width of which are, for example, between 5 and 20 mm, molded on a transparent plastic plate, provided with a cover which is also transparent. These microwell plates are well known to those skilled in the art.
  • the variant clones of Trypanosome cruzi (T. cruzi) with reduced infectivity collected from the microwells can either be transferred to cultures of myocardial cells to allow their multiplication, or be stored by freezing, for example at a temperature of about -70 ° C in aqueous nutrient medium containing glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum, to which is added, for example, about 10% dimethyl sulfoxide.
  • T. cruzi these are cultured in vitro in a manner known per se, for example with mouse myocardial cells in an aqueous nutritive medium containing glucose, inorganic salts, amino acids, vitamins and fetal calf serum at a temperature of about 37 ° C in a mixture of air and carbon dioxide, the infection ratio of the number of T. cruzi to the number of cells being of the order of 2/1.
  • the chemical mutagen that is to say N-methyl-N '-nitro-N-nitrosoguanidine
  • N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine during its use, is preferably used in the form of an aqueous solution whose concentration is of the order of 0.3 to 10 ⁇ g / ml, and preferably about 8 ⁇ g / ml.
  • Example. A strain of Trypanosome cruzi (T. cruzi) obtained by Doctor F. Kierszenbaum (Michigan State University, Department of Microbiology and Public Health, East Lansing, Michigan, United States of America) is cultivated in vitro with cells from the PCDl mouse myocardial line, obtained by T. Boon (Boon
  • the culture medium used is the Eagle medium modified by Dulbecco (DMEM, pH of the order of 7), of which question previously, to which 10% of fetal calf serum (FCS) is added.
  • DMEM Dulbecco
  • FCS fetal calf serum
  • T. cruzi containing about 50 million para sites (2 million PCDl cells were infected 6 days before with 4 million T. cruzi in 20 ml of medium in a tissue culture dish ("tissue culture" Falcon 3003, from Becton Dickinson)).
  • the supernatant is centrifuged at room temperature at 160 g for 5 minutes to precipitate the PCD1 cells.
  • the centrifugation supernatant is then centrifuged at 1400 g for 20 minutes to precipitate the T. cruzi, which is resuspended in Hanks medium (see above, pH about 7), at the rate of 2 million. parasites per ml.
  • the parasites (10 million in 5 ml) are incubated with the mutagenic agent N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (8 ⁇ g / ml) for 60 minutes at 36 ° C, in the closed centrifuge tube (mutagenesis ).
  • the tube is centrifuged at 1400 g for 10 minutes to separate the parasites from the medium containing the mutagen.
  • the T. cruzi pellet is resuspended in 10 ml of DMEM medium + 10% FCS. It is again centrifuged at 1400 g for 10 minutes. It is resuspended in the same medium to obtain a million T. cruzi per ml.
  • a large number of tissue culture dishes (Falcon 3002, Becton Dickinson) are infected with 1 million T. cruzi, which were each inoculated 24 hours before with 200,000 PCDl cells in 5 ml of DMEM + 10% FCS. These dishes are incubated at 37 ° C in an atmosphere of air and CO 2 (10%). After 48 hours of culture, the medium is aspirated and replaced with fresh medium to eliminate the parasites which have not penetrated into the PCDl cells (clonal infection of the PCDl cells).
  • the culture medium is aspirated.
  • the PCDl cells of which approximately 1% are infected with Trypanosomes, are detached from each dish by a treatment of 4 minutes at ordinary temperature with 2 ml of a mixture of trypsin and ethylenediaminetetraecatate (EDTA) (saline solution containing 0, 5g / liter of trypsin and 0.2g / liter of EDTA supplied by Grand Island Biological Company 043-5300). After 4 minutes, add 2ml of DMEM
  • the 4 ml containing the cells are placed on top of 20 ml of DMEM medium + 10% FCS (at 4 ° C.) in a centrifuge tube. The tube is centrifuged at 160 g for 5 minutes to precipitate the cells. The cell pellet is resuspended in DMEM + 10% FCS to have 10,000 cells per ml. These cells are then diluted in the same medium to have 200 cells per ml.
  • microwell plates from Linbro 76 -033-05, from Flow Laboratories
  • the microwells are incubated at 37 ° C in an air atmosphere containing 10% CO 2 . 10 days later, 0.5 cc of DMEM medium + 10% FCS is added. 20 days later, we observe that approximately 15% of the wells contain approximately 1 million parasites. The other wells do not contain any (cloning of infected cells).
  • the parasites of the supernatant from each microwell are then transferred to PCDl cultures, as described above. This allows them to be multiplied indefinitely.
  • the parasite clones can also be stored by freezing at -70 ° C in DMEM medium + 10% FCS, to which 10% dimethyl sulfoxide is added (harvesting and amplification of the mutagenized T. cruzi clones).
  • Parasite clones were obtained from an untreated population of FK strain trypanosomes (control clones) and also from a population treated in vitro immediately before cloning with 8 ⁇ g / ml of the mutagen N-methyl -N'-nitro-N-nitrosoquanidine for 1 hour (mutagenized clones). This mutagenic treatment killed around 80% of the parasites, judging by their efficacy in infecting myocardial cells, which was five times lower than that of infection by untreated parasites. Ten control clones were tested in vivo.
  • mice were injected intraperitoneally (ip) at the rate of 200,000 parasites per mouse in 3 adult 129 / Sv mice having received immediately before sublethal irradiation of 600 rads of gamma radiation from a cesium source. All the mice showed a parasitaemia greater than 10 per ml of blood on day 10 after the injection.
  • the infected mice were sacrificed and 500,000 parasites were taken from their blood, which were reinjected ip into each of three 129 / Sv adult non-irradiated mice. All these mice died between 15 and 20 days after the injection. This delay is very similar to that obtained with the non-cloned FK strain and maintained in culture.
  • Table 1 The results obtained with 5 of these control clones are shown in Table 1 below.
  • Burker the minimum number of parasites that can be detected here is 10 3 per ml of blood. The mice indicated as survivors lived more than 90 days after the injection.
  • the clones which produced an acute infection in the irradiated mice were injected into normal mice (500,000 parasites per mouse).
  • mice When the mutagenized clones were injected like the others into groups of mice irradiated at 600 rads, it was observed that for 20 of them the mice did not exhibit the symptoms indicating a high parasitaemia and all survived more than 100 days, at which time most of the smiles showed a weak parasitaemia located between 10 3 and 104 per ml of blood. For the other 22 mutagenized clones, all groups of irradiated mice showed symptoms of acute disease as well as blood parasitaemia greater than 10 6 per ml of blood at a time between 12 and 29 days after the injection.
  • mice were then sacrificed and for each clone, 500,000 parasites taken from their blood were injected ip into three 129 / Sv non-irradiated mice. Unlike the control clones, 21 of these 22 mutagenized clones were unable to produce an acute infection in normal mice. All mice survived more than 90 days. At this time, parasitaemia of less than 10 4 per ml of blood was observed. The results obtained with 4 mutagenized clones producing a particularly weak parasitaemia are given in Table 1 above.
  • mice to which these four clones were injected received an ip injection of 3x10 5 parasites 100 from the control clone # 100 100 days later.
  • the animals showed no symptoms of acute infection and survived for 150 days after this secondary injection. They were then sacrificed and their blood parasitemia was examined. No parasite was observed, which made it possible to estimate that their parasitaemia was less than 250 per ml of blood.
  • the injection of the same control clone into 7 normal mice caused their death in acute illness (more than 10 parasites per ml of blood) after 14 days on average.
  • mice unirradiated or irradiated at 750 rads received an i.p. parasites at the doses indicated.
  • the parasites came from the blood of mice that had been irradiated at 750 rads before infection.
  • the animals indicated as survivors lived more than 100 days after the injection.
  • mice injected by these clones had a para weak but not zero siteremia of the order of 10 3 per ml of blood. It has also been confirmed that these clones regularly induce protection against the injection of the virulent control clone.
  • mice were injected ip with 500,000 parasites from a mutagenized clone. 40 days later, these mice received an ip injection of 500,000 virulent parasites of clone # 4 from the blood of irradiated mice and injected with this clone. The non-immunized mice were injected with the same dose of clone # 4.
  • the trypanosome clones can be preserved by freezing, passage in culture or passage in mice irradiated at 750 rads. It has been observed that the reduced infectivity of mutagenized clones No. 46, 59, 64 and 69 is a stable character, persisting after two months of continuous transfers in irradiated mice. For clones 46 and 69, it was possible to verify that the character persists after 10 months of in vivo passages. The results described here indicate that it is possible to obtain, by mutagenic treatment of a strain of Trypanosome cruzi, variant clones with reduced infectivity. The frequency of variants with reduced infectivity in the population of mutagenized parasites is very high and these variants appear to be stable.
  • the variants retained the ability to cause acute infection in irradiated mice.
  • these variants induce significant protection against virulent trypanosomes. It is therefore likely that, like the tum variants, obtained from mouse tumor cells, the variant parasites, which one could call "vir-” as opposed to "vir + " with intact virulence, have acquired an increased immunogenicity which causes their rejection by the normal mice but not by the immunosuppressed mice by irradiation.
  • the present invention also relates to live or killed vaccines comprising, as active ingredient, a strain of variant parasites with reduced infectivity as obtained according to the invention, for example a strain of T. cruzi or Leishmania Tropica, in combination with a pharmacologically acceptable diluent or vehicle.
  • a strain of variant parasites with reduced infectivity as obtained according to the invention, for example a strain of T. cruzi or Leishmania Tropica
  • a pharmacologically acceptable diluent or vehicle pharmacologically acceptable diluent or vehicle.
  • vaccines according to the invention combined with at least one other live or killed vaccine against parasitic diseases, so as to obtain polyvalent live or killed vaccines.
  • the process for obtaining variant parasites of Trypanosoma cruzi by mutagenesis in vitro with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine as chemical mutagen could also be applied to the protozoan parasite Leishmania Tropica.
  • Variants with reduced infectivity were obtained, as indicated by the following results, by injecting 10 live parasites subcutaneously into groups of 5 12-week-old BALB / c mice.

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Abstract

Procédé d'obtention de parasites variants à infectivité réduite à partir d'un parasite protozoaire, consistant à mettre en contact in vitro une souche virulente du parasite protozoaire, tel que le Trypanosome cruzi, avec au moins un agent mutagène chimique, tel que la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, dans des conditions qui permettent l'obtention de clones variants à infectivité réduite, variants ainsi obtenus et vaccins les contenant.

Description

"Procédé d'obtention de variants à infectivité réduite à partir de parasites protozoaires, variants ainsi obtenus et leur utilisation'.
La présente invention est relative à un procédé d'obtention de parasites variants à infectivité réduite à partir de parasites protozoaires, aux parasites variants ainsi obtenus ainsi qu'aux vaccins vivants ou tués contenant de tels variants. De nombreurx procédés de vaccination utilisant soit des souches de parasites protozoaires aviru lents (Seah et Marsden, 1969 : The protection of mice against a virulent strain of Trypanosoma cruzi by previous inoculation with an avirulent strain. Ann. Trop. Med. Parasitol., 63, 211-214), soit des extraits antigénigues (Seneca et coll., 1966 : Active immunization of mice with Chagatoxin. Nature, 209, 309-310), soit des parasites protozoaires tués par irradiation (Hanson et coll., 1974 : Current status of vaccination against Chagas' disease: use of irradiated parasites in Parasitic zoonoes : clinical and experimental studies. Ed. by E. Soulsby, 117-131. Academie press.), par traitement à la mitomycine (Tarleton et coll., 1981 : Mitomycin C-treated Trypanosoma cruzi in vaccination of mice : induction of immunosuppression but not protection. Infect. Immun., 31, 693-697), par désintégration mécanique (Yanovsky et coll., 1969 : Trypanosoma cruzi; experimental immunization of mice. Exp. Parasitol. 26, 73-85; Gonzales Cappa et coll. 1974: Trypanosoma cruzi; protection of mice with epimastigote antigens from immunologically différent parasite strains. Exp. Parasitol., 35, 179-186), par congélation (McHardy et Elphick, 1978 : Immunization of mice against infection with Trypanosoma cruzi. Cross - immunization between five strains of the parasite using freezethawed vaccines containing epimastigotes of up to five strains. Int. J. Parasitol., 8, 25-31) ou par traitement au perchlorate (Kierzenbaum et coll., 1975 : Immunization against experimental Chaga's disease by using culture forms of Trypanosoma cruzi killed with a solution of sodium perchlorate. Infect. Immun. 12, 461-465) ont été décrits dans la littérature. Bien que des protections significatives aient été obtenues, il semble qu'aucun de ces procédés n'ait permis de développer une manière générale de conférer sans danger une protection efficace contre les parasites protozoaires, et en particulier de permettre une immunité stérile et efficace.
Il est également connu qu'en traitant in vitro avec un agent mutagène des cellules tumorales de souris, il est possible d'obtenir des variants cellulaires (tum-) qui sont incapables de former des tumeurs dans les souris syngéniques normales, tout en restant capables de former des tumeurs dans des souris immunodéprimées par une irradiation sublétale (Boon, T. et Kellerman, O. (1977) : Rejection by syngeneic mice of cell variants obtained by mutagenesis of a malignant teratocarcinoma cell line Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 272-275; Van Pel et coll., (1979) : Tumor cell variants obtained by mutagenesis of a Lewis lung carcinoma cell line : immune rejection by synge neic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. : USA , 76, 5282- 5285; Uyttenhove et coll., 1980; Immunogenic variants obtained by mutagenesis of mouse mastocytoma P815: T Lymphocyte mediated cytolysis. J. Exp. Med. 152, 1184- 1193). Ces variants tum- sont obtenus à des fréquences très élevées . Leur incapacité à former des tumeurs est due au fait qu'ils provoquent un rejet immunitaire chez l'hôte. La plupart des variants tum- portent un nouvel antigène, absent sur la cellule tumorale originale et propre à chaque variant (Boon et Van Pel, 1978 : Tera tocarcinoma cell variants rejected by syngeneic mice; protection of mice immunized with these variants against other variants and against the original cell line.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1519-1523; Van Pel et coll., 1979 : Mouse teratocarcinoma cell variants obtained by mutagenesis; rejection by syngeneic mice and immunization against the original tumor cell line. Protides of biological fluids, 27th colloquium, 173-177; Uyttenhove et coll., 1980 : Immunogenic variants obtained by mutagenesis of mouse mastocytoma P815 : T lymphocyte mediated cytolysis. J. Exp. Med., 152, 1184-1193). En rejetant les variants tum-, les souris syngéniques acquièrent souvent une protection immunitaire vis-à-vis de la tumeur originale, même lorsque celle-ci paraît complètement incapable de susciter une réaction de rejet (Boon et Van Pel, 1978 : Teratocarcinoma cell variants rejected by syngeneic mice : protection of mice immunized with thèse variants against other variants and against the original malignant cell line. Proc. Natl.: Acad. Sci. USA 75, 1519-1523). On a donc examiné, suivant l'invention, la possibilité d'obtenir une protection efficace contre les parasites protozoaires , totalement différente des procédés utilisés jusgu'à présent, au départ de souches virulentes de parasites.
La présente invention consiste donc à pallier aux inconvénients des procédés de vaccination connus et elle consiste essentiellement à mettre en contact in vitro une souche virulente de parasites protozoaires avec au moins un agent mutagène chimigue dans des conditions qui permettent l'obtention de parasites variants, et plus particulièrement de clones variants à infectivité réduite et d'une immunogénicité accrue.
Suivant une forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, le parasite protozoaire est choisi dans le groupe formé par le Trypanosome cruzi, le Trypanosome africain (Rhodesiense, Gambiense, Brucei, Vivax, Congolense), le Leishmania (Donovani, Tropica) et le Plasmodium Falciparum, et l'agent mutagène chimique est choisi dans le groupe formé par la N—mêthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, l'éthylméthanesulfonate, la N-méthyl-N-nitrosourée et leurs mélanges, l'agent mutagène chimique N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine convenant particulièrement bien avec le Trypanosome cruzi. Suivant une autre forme de réalisation particulière de l'invention, le procédé d'obtention de variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite comprend notamment l'incubation de la souche de Trypanosome cruzi avec de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose et des sels inorganiques à une température de l'ordre de 36°C, l'infection clonale de cellules myocardiques de souris par la préparation de Trypanosome mutagénisé précitée à une température de l'ordre de 37°C, la séparation par centrifugation des cellules, la mise en suspension du culot de cellules infectées dans un milieu nutritif aqueux contenant des sels inor ganiques, du glucose, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, l'incubation de micropuits contenant un mélange de la suspension de cellules infectées susdite et d'une séparation de cellules myocar diques de souris non infectées, et la récolte de clones variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite à partir de ces micropuits.
Avantageusement, après l'incubation de la souche de Trypanosome cruzi en contact avec la N-méthyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans le milieu nutritif aqueux précité, à une température de l'ordre de 36 °C, la durée de cette incubation étant d'environ 1 heure, on centrifuge la solution d'incubation ainsi obtenue jusgu'à l'obtention d'un culot de Trypanosome cruzi, on introduit le culot de Trypanozoms cruzi dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal de manière à obtenir une suspension aqueuse de Trypanosome cruzi, on met en contact la suspension de Trypanosome cruzi ainsi obtenue avec des cellules myocardiques de souris dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, de sels inorganigues, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, le nombre de cellules myocardiques utilisées étant sensiblement supérieur au nombre de T. cruzi, on incube la solution ainsi obtenue pendant une durée d'environ 3 à 6 jours à une température d'environ 37°C dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone, de manière à obtenir ainsi une pénétration de l'ordre de 1% des cellules myocardiques de souris par les Trypanosomes cruzi et leur multiplication à l'intérieur de ces cellules, cette étape constituant l'infection clonale des cel lules myocardiques, on sépare les cellules myocardiques ainsi traitées de leur solution d'incubation et on les introduit dans un milieu nutritif aqueux comprenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, on centrifuge ledit milieu nutritif jusqu'à l'obtention d'un culot de cellules , on réintroduit le culot de cellules précité dans un milieu nutritif aqueux comprenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal de manière à obtenir une suspension aqueuse de cellules dont environ 1% sont infectées, on dilue la suspension, on la répartit dans des micropuits dans lesquels on ajoute également une préparation de cellules de souris myocardiques non infectées à base de glucose, de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal, le nombre de micropuits étant sensiblement plus élevé que le nombre de cellules effectivement infectées qui y sont distribuées, on incube les micropuits à une température de l'ordre de 37°C pendant une période de l'ordre de 10 à 22 jours dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone et on recueille les clones variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite des micropuits qui en contiennent.
Suivant une forme ce réalisation particulièrement avantageuse , l'incubation de la solution précitée permettant la pénétration par les Trypano somes cruzi des cellules myocardiques et leur multiplication à l'intérieur de celles-ci est réalisée dans des boîtes du type pour culture de tissus, le milieu de culture nutritif utilisé lors de cette incubation étant séparé par aspiration après une période de l'ordre de 48 heures pour le remplacer par du milieu frais de même composition de manière à éliminer les Trypanosomes cruzi qui n'ont pas pénétré dans les cellules myocardiques, les cellules myocardiques s'agglutinant sur les parois intérieures desdites boîtes.
La présente invention est également relative aux parasites variants à infectivité réduite ainsi obtenus ainsi qu'aux vaccins vivants ou tués contre les maladies parasitaires, qui comprennent, comme ingrédient actif, une souche de parasites variants à inféctivité réduit et d'une immunogénicité accrue telle qu'obtenue par le procédé susmentionné, en association avec un diluant pharmacologiquement acceptable. Ainsi qu'on pourra le noter, compte tenu de ce qui précède, les variants immunogeniques de l'invention ont été obtenus, comme dans le cas des variants cellulaires (tum-) obtenus au départ de cellules tumorales de souris, par mutagénèse et clonage. Toutefois, on précisera, à cet effet, que les parasites protozoaires sont tellement différents des cellules cancéreuses et les maladies parasitaires tellement différentes du cancer, qu'il n'est pas raisonnable de traiter l'obtention de parasites variants à infectivité réduite et leur usage en tant que vaccins comme une simple extension des résultats obtenus avec les variants de cellules cancéreuses. En d'auties termes, le procédé d'obtention de variants de parasites par mutagénèse et clonage n'avait rien d'évident et il n'était pas du tout certain à priori que des variants protecteurs de parasites protozoaires et en particulier de Trypanosome cruzi pourraient être obtenus. D'autre part, outre le fait que les procédés exacts de mutagénèse et de clonage utilisés pour les parasites protozoaires et les cellules cancéreuses soient très différents, on notera, par exemple, que la protection obtenue contre le Trypanosome cruzi dans les souris "vaccinées" avec les variants de ce parasite est largement supérieure à celle obtenue contre le tératocarcinome original dans les souris "vaccinées" avec les variants de
cette lignée tumorale.
De plus, la présente invention diffère complètement des procédés d'atténuation fréquemment utilisés pour la préparation de vaccins. Ces procédés visent à obtenir des préparations d'agents patho gènes physiquement intacts mais dont la viabilité, c'est-à-dire la capacité intrinsèque à se multiplier, est réduite. Au contraire, l'invention vise à obtenir des clones de parasites à viabilité intacte, telle que mesurée par leur multiplication in vitro, mais dont le pouvoir infectieux est réduit en raison d'une susceptibilité accrue aux défenses de l'hôte. Ainsi qu'on l'a déjà mentionné précédemment, le procédé de l'invention consiste à mettre en contact in vitro une souche cirulente de parasite protozoaire avec un agent mutagène chimique dans des conditions qui permettent l'obtention de parasites variants, et plus particulièrement de clones variants à infectivité réduite. Bien que la description donnée ci-après soit essentiellement relative à l'obtention de variants à infectivité réduite à partir de Trypano some cruzi avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguani dine comme agent mutagène chimique, on notera que le procédé de l'invention peut être applicable à tous les parasites protozoaires et avec n'importe quel agent mutagène chimique efficace in vitro. On citera, à cet effet, à titre d'exemple comme parasites protozoaires le Trypanosome africain (Rhodesiense, Ganbien-se, Brucei, Vivax, Congolense), le Leishmania (Donovani, Tropica) et le Plasmodium Falciparum, et comme agents mutagènes, l'éthylméthanesulfonate et la N-méthyl-N-nitrosourée.
Suivant l'invention, on réalise l'incubation de la souche virulente de Trypanosome cruzi avec de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine comme agent mutagène chimique, dans un milieu nutritif aqueux contenant des sels inorganiques et du glucose. Le milieu de Hanks, dont la composition est donnée ci-après, convient particulièrement bien à cet effet : Milieu de Hanks (qr)/l)
Glucose : 1,00
Rouge de phénol: 0,01
Sels inorganiques :
CaCl2 0,14
KCl 0,40
KH2PO4 0,06
MgSO4 0,0977
NaCl 8,00
Na2HPO4 0,048
La durée de cette incubation est de l'ordre de l heure et elle se fait à une température d'environ 36°C. On centrifuge ensuite la solution d'incubation ainsi obtenue jusqu'à l'obtention d'un culot de Trypanosome cruzi, et on introduit le culot de Trypanosome cruzi dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines, auquel on a ajouté du sérum de veau fétal, ce qui permet d'obtenir une suspension aqueuse de Trypanosome cruzi contenant, par exemple, environ 1 million de Trypanosomes cruzi par ml. On utilisera de préférence, à cet effet, comme milieu nutritif aqueux le milieu de Eagle modifié par Dulbecco, qui répond à la composition suivante :
Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM mg/litre).
Sels inorganiques :
CaCl2 (anhydre) 200,00
Fe (NO3)3 :9H2O 0,10
KCl 400,00
MgSO4 (anhydre) 97,67
NaCl 6400,00
NaH2PO4:H2O 125,00
Autres composants :
Glucose 1000,00 Rouge de phénol 15,00
Pyruvate de sodium 110,00
Aminoacides : L-Arginine:HCl 84,00 L-Cystine:2HCl 62,57 L-Glutamine 584,00 Glycine 30,00
L-Histidine HCl:H2O 42,00 L-Isoleucine 105,00 L-Leucine 105,00 L-Lysine HCl 146,00 L-Méthionine 30,00 L-Phénylalanine 66,00
Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM mg/litre).
L-Sérine 42,00
L-Thréonine 95,00
L-Tryptophane 16,00
L-Tyrosine 104,20
L-Valine 94,00
Vitamines :
D-pantothénate de Ca 4,00
Chlorure de choline 4,00
Acide folique 4,00 i-Inositol 7,20
Nicotinamide 4,00
Pyridoxal HCl 4,00
Riboflavine 0,40
Thiamine HCl 4,00
On met en contact la suspension de Trypanosome cruzi (T.Cruzi) ainsi obtenue avec des cellules myocardiques de souris dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, le nombre de cellules myocardiques utilisé étant sensiblement plus élevé que le nombre de T.cruzi, et on incube la solution ainsi obtenue pendant une durée d'environ 3 à 6 jours à une température d'environ 35°C dans une atmosphère d'air et d'oxyde de carbone, ce qui permet d'obtenir une pénétration de l'ordre de 1 % de cellules myocardiques de souris, par les Trypanosomes cruzi et leur multiplication à l'intérieur de ces cellules, cette étape constituant en fait l'infection clonale des cellules myocardiques. Cette faible multiplicité d'infection, de l'ordre de 1 % , garantit statisti- quement que la presque totalité des cellules infectées l'a été par un seul parasite. On sépare ensuite les cellules myocardiques ainsi traitées de leur solution d'incubation et on les introduit dans du milieu nutritif aqueux à base de glucose, de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal (par exemple milieu DMEM + 10% de veau fétal ), on centrifuge ce milieu nutritif jusqu'à l'obtention d'un culot de centrifugation formé de cellules, on réintroduit le culot de cellules précité dans un milieu nutritif aqueux de la même composition ou d'une composition similaire au milieu nutritif utilisé dans l'étape précédente, de manière à obtenir une suspension aqueuse de cellules dont environ 1% sont infectées contenant, par exemple 10.000 cellules par ml, et on dilue cette suspension pour obtenir, par exemple, une concentration d'environ 200 cellules par ml.
Suivant l'invention, l'incubation de la solution précitée permettant la pénétration par les Trypanosomes cruzi des cellules myocardiques et leur multiplication à l'intérieur de celles-ci est de préférence réalisée dans des boîtes du type pour culture de tissus, par exemple les boîtes Falcon.de Becton Dickinsonje milieu de culture nutritif utilisé lors de cette incubation étant séparé par aspiration après une période de l'ordre de 48 heures pour le remplacer par du milieu frais de même composition, de manière à éliminer les Trypanosomes cruzi qui n'ont pas pénétré dans les cellules myocardiques. Les cellules myocardiques qui s'agglutinent sur les parois intérieures de ces boîtes, sont séparées de celles-ci par un traitement à température ambiante avec une solution saline contenant un mélange de trypsine et d'éthylènediaminetétraacétate (EDTA) , par exemple une solution saline contenant 0,5 gr/litre ce trypsine et 0,2 gr/litre d'EDTA. Ensuite, on ajoute à la solution saline contenant les cellules myocardiques, du milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal et on centrifuge le milieu nutritif jusqu'à l'obtention du culot de cellules myocardiques précité.
Une fois que l'on a obtenu la sus pension dont question ci-dessus dont la concentration par ml est, par exemple, d'environ 200 cellules myocardiques dont environ 1% sont infectées , on la répartit dans des micropuits dans lesquels on ajoute également une préparation de cellules myocardiques de souris non infectées à base de glucose, de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal, on incube les micropuits à une température d'environ 37°C pendant une période d'environ 10 à 22 jours, de préférence pendant 20 jours, dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone, et on recueille les clones variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite des micropuits qri en contiennent .Lescellules effectivement infectées sont distribuées dans ces puits en nombre tel qu'environ 5 à 15% des puits reçoivent une cellule infectée et que dès lors la plupart des puits positifs ne contiennent qu'un clone de parasites. Après la période d'incubation de 10 à 22 jours dont question ci-dessus, et de préférence après une incubation de 20 jours, grâce à plusieurs cycles d'une multiplication intracellulaire on obtient une production d'environ 106 parasites par clone.
L'obtention de ces clones variants à infectivité réduite nécessite donc l'utilisation d'un nombre de micropuits sensiblement plus élevé que le nombre de cellules infectées utilisées. Les micropuits sont en fait de petits évidements, dont la profondeur et la largeur sont, par exemple, comprises entre 5 et 20 mm, moulés sur une plaque de matière plastique transparente, pourvue d'un couvercle également transparent. Ces plaques à micropuits sont bien connues des spécialistes de la technique.
Suivant l'invention, les clones variants de Trypanosome cruzi (T.cruzi) à infectivité réduite receuillis des micropuits peuvent soit être transférés à des cultures de cellules myocardiques pour permettre leur multiplication, soit être conservés par congélation, par exemple à une température d'environ -70°C dans du milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, auquel on ajoute, par exemple, environ 10% de diméthylsulfoxyde.
Pour ce qui est des souches de T.cruzi, celles-ci sont cultivées in vitro d'une manière connue en soi, par exemple avec des cellules myocardiques de souris dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides , des vitamines et du sérum de veau fétal à une température d'environ 37°C dans un mélange d'air et de dioxyde de carbone, le rapport d'infection du nombre de T.cruzi au nombre de cellules étant de l'ordre de 2/1. Avant l'incubation avec l'agent mutagène chimique, c'est-à-dire la N-méthyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidine, dans le milieu nutritif à base de glucose et de sels inorganiques dont question précédemment, on centrifuge le surnageant de la culture de T.cruzi à la température ambiante pour précipiter les cellules myocardiques de souris et on centrifuge ensuite le surnageant de centrifugation ainsi obtenu pour précipiter les Trypanosomes cruzi.
La N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, lors de son utilisation, est de préférence utilisée sous la forme d'une solution aqueuse dont la concentration est de l'ordre de 0,3 à 10 μg/ml, et de préférence d'environ 8 μg/ml.
L'exemple suivant illustre l'invention, et plus particulièrement l'obtention de clones mutagénisés à infection réduite à partir du Trypanosome cruzi. Il est bien évident que cet exemple est donné uniquement à titre illustratif, et qu'il ne limite en aucun cas l'invention. Exemple . Une souche de Trypanosome cruzi (T.cruzi) obtenue par le Docteur F .Kierszenbaum(Michigan State University,Department of Microbiology and Public Health,East Lansing,Michigan,Etats-Unis d'Amérique) est cultivée in vitro avec des cellules de la lignée myocardique de souris PCDl, obtenue par T.Boon (Boon
T.,Buckingham,Dexter D.,Jakob H.et Jacob F.1974,Ann. Microbiol. (Inst.Pasteur), 125 B: 13-28) comme décrit par Bioul-Marchand, Jadin, Steiger et Boon dans Multiplication of Trypanosoma cruzi in a mouse myocardial cell line, J. Parasitol., 66, 1050-1052. Le milieu de culture utilisé est le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, pH de l'ordre de 7) , dont question précédemment, auquel on ajoute 10% de sérum de veau fétal (FCS) . La culture se fait à 37°C dans un mélange d'air et de 10% de CO2.
On prend le surnageant d'une culture de T. cruzi contenant environ 50 millions de para sites (2 millions de cellules PCDl ont été infectées 6 jours avant avec 4 millions de T.cruzi dans 20 ml de milieu dans une boîte pour culture de tissus ("tissue culture" Falcon 3003, de Becton Dickinson)). Le surnageant est centrifugé à température ordinaire à 160 g pendant 5 minutes pour précipiter les cellules PCDl. Le surnageant de centrifugation est centrifugé ensuite à 1400 g pendant 20 minutes pour précipiter les T. cruzi, que l'on remet en suspension dans du milieu Hanks ( voir ci-dessus, pH d'environ 7) , à raison de 2 millions de parasites par ml.
Les parasites (10 millions dans 5 ml) sont incubés avec l'agent mutagène N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ( 8 μg/ml) pendant 60 minutes à 36°C , dans le tube de centrifugation fermé (mutagénèse).
Le tube est centrifugé à 1400 g pendant 10 minutes pour séparer les parasites du milieu contenant l'agent mutagène. Le culot de T.cruzi est resuspendu dans 10 ml de milieu DMEM + 10% de FCS. On centrifuge à nouveau à 1400 g pendant 10 minutes. On resuspend dans le même milieu pour obtenir un million de T.cruzi par ml. On infecte avec 1 million de T.cruzi un grand nombre de boîtes "tissue culture" (Falcon 3002, Becton Dickinson) qui ont été chacune inoculées 24 heures avant avec 200.000 cellules PCDl dans 5 ml de DMEM + 10% de FCS. On incube ces boîtes à 37°C dans une atmosphère d'air et de CO2 (10%) . Après 48 heures de culture, on aspire le milieu et on le remplace par du milieu frais pour éliminer les parasites qui n'ont pas pénétré dans les cellules PCDl (infection clonale des cellules PCDl) .
3 à 6 jours après l'infection décrite ci-dessus, on aspire le milieu de culture. Les cellules PCDl, dont environ 1% sont infectées par des Trypanosomes, sont décollées de chaque boîte par un traitement de 4 minutes à température ordinaire avec 2 ml d'un mélange de trypsine et d'éthylènediaminetétraécatate (EDTA) (solution saline contenant 0,5g/litre de trypsine et 0,2g/litre d'EDTA délivrée par Grand Island Biological Company 043-5300). Après 4 minutes, on ajoute 2ml de DMEM
+ 10% de FCS à 37°C. Les 4 ml contenant les cellules sont posés au sommet de 20 ml de milieu DMEM + 10% de FCS (à 4°C) dans un tube à centrifuger. Le tube est centrifugé à 160 g pendant 5 minutes pour précipiter les cellules. Le culot de cellules est resuspendu dans du DMEM + 10% de FCS pour avoir 10.000 cellules par ml. Ces cellules sont ensuite diluées dans le même milieu pour avoir 200 cellules par ml. On inocule dans 600 micropuits d'une contenance de 3,5 ml (plaques à micropuits de Linbro 76 -033-05, de Flow Laboratories) 0,5 ml de la préparation de cellules infectées (100 cellules) et 0,1 ml contenant 900 cellules PCDl non infectées. Les micropuits sont incubés à 37 °C dans une atmosphère d'air contenant 10% de CO2. 10 jours plus tard, on ajoute 0,5 ce de milieu DMEM + 10% de FCS. 20 jours plus tard, on observe qu'environ 15% des puits contiennent environ 1 million de parasites. Les autres puits n'en contiennent aucun (clonage des cellules infectées).
Les parasites du surnageant de chaque micropuits sont ensuite transférés à des cultures de PCDl, comme décrit ci-dessus. Ceci permet de les multiplier indéfiniment. Les clones de parasites peuvent également être conservés par congélation à -70°C dans du milieu DMEM + 10% de FCS, auquel on ajoute 10% de diméthylsulfoxyde (récolte et amplification des clones de T.cruzi mutagénisés).
On donne ci-après un certain nombre de résultats biologiques mettant en évidence l'inté rêt des parasites variants à infectvité réduite de la présente invention.
Des clones de parasites ont été obtenus à partir d'une population non traitée de trypanosomes de la souche FK (clones contrôles) et également à partir d'une population traitée in vitro immédiatement avant le clonage avec 8 μg/ml du mutagène N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoquanidine pendant 1 heure (clones mutagénisés). Ce traitement mutagène a tué à peu près 80% des parasites, à en juger par leur efficacité d'infection des cellules myocardiques qui s'est avérée cinq fois plus faible de celle de l'infection par les parasites non traités. Dix clones contrôles ont été testés in vivo. Ils ont été injectés par voie intrapérito- néale (i.p.) à raison de 200.000 parasites par souris dans 3 souris 129/Sv adultes ayant reçu immédiatement avant une irradiation sublétale de 600 rads de rayonnement gamma provenant d'une source de césium. Toutes les souris ont montré une parasitémie supérieure à 10 par ml de sang au jour 10 après l'injection. Pour chaque clone, on a sacrifié les souris infectées et prélevé dans leur sang 500.000 parasites que l'on a réinjectés i.p. à chacune de trois souris 129/Sv adultes non irradiées. Toutes ces souris sont mortes entre 15 et 20 jours après l'injection . Ce délai est fort semblable à celui obtenu avec la souche FK non clonée et maintenue en culture. Les ré sultats obtenus avec 5 de ces clones contrôles sont montrés dans le Tableau 1 ci-après.
Figure imgf000022_0001
* moyenne des jours de mortalité après injection du parasite. Un contrôle de la parasitémie sanguine a été effectué au moyen d'une cellule à numération de
Burker : le nombre minimum des parasites pouvant être détectés est ici de103 par ml de sang. Les souris indiquées comme survivantes ont vécu plus de 90 jours après l'injection.
A partir des parasites mutagénisés, on a pu obtenir 42 clones par multiplication in vitro. Les clones mutagénisés se sont multipliés in vitro à peu près à la même vitesse que les clones contrôles. Par contre, les résultats obtenus in vivo avec ces clones se sont avérés très différents de ceux obtenus avec les contrôles, comme on peut le voir dans le Tableau 2 suivant.
Figure imgf000023_0001
Les clones obtenus in vitro ont été injectés i.p. dans des souris irradiées à 600 rads (200.000 parasites par souris). Les clones qui ont produit une infection aiguë dans les souris irradiées ont été injectés dans des souris normales (500.000 parasites par souris).
Lorsque les clones mutagénisés ont été injectés comme les autres à des groupes de souris irradiées à 600 rads, on a observé que pour 20 d'entre eux les souris n'ont pas présenté les symptômes indiquant une parasitémie élevée et ont toutes survécu plus de 100 jours, moment auquel la plupart des sour is ont montré une parasitémie faible située entre 10 3 et 104 par ml de sang. Pour les 22 autres clones mutagénisés, tous les groupes de souris irradiées ont montré les symptômes de la maladie aiguë ainsi qu'une parasitémie sanguine supérieure à 106 par ml de sang à un moment situé entre 12 et 29 jours après l'injection. Comme pour les contrôles, on a alors sacrifié ces souris et pour chaque clone, 500.000 parasites prélevés dans leur sang ont été injectés i.p. à trois souris 129/Sv non irradiées. Contrairement aux clones contrôles, 21 de ces 22 clones mutagénisés se sont avérés incapables de produire une infection aiguë dans les souris normales. Toutes les souris ont survécu plus de 90 jours. A ce moment, on a observé une parasitémie inférieure à 104 par ml de sang. Les résultats obtenus avec 4 clones mutagénisés produisant une parasitémie particulièrement faible sont donnés dans le Tableau 1 ci-dessus.Afin d'examiner si les clones mutagénisés peuvent induire une protection contre le parasite virulent, les groupes de souris auxquelles on avait injecté ces quatre clones ont reçu 100 jours plus tard une injection i.p. de 3x105 parasites provenant du clone contrôle n° 4. Les animaux n'ont présenté aucun symptôme de l'infection aiguë et ont survécu pendant 150 jours après cette injection secondaire. Ils ont alors été sacrifiés et leur parasitémie sanguine a été examinée. Aucun parasite n'a été observé,ce qui a permis d'estimer que leur parasitémie était inférieure à 250 par ml de sang. L'injection du même clone contrôle à 7 souris normales a causé leur mort en maladie aiguë (plus de 10 parasites par ml de sang) au bout de 14 jours en moyenne.
L'infectivité réduite des clones mutagénisés n° 46, 59, 64 et 69 a pu être confirmée au cours de plusieurs expériences (voir Tableau 3).
Figure imgf000025_0001
Des souris DBA/2 adultes, non irradiées ou irradiées à 750 rads ont reçu une injection i.p. de parasites aux doses indiquées. Les parasites provenaient du sang de souris qui avaient été irradiées à 750 rads avant l'infection . Les animaux indiqués comme survivants ont vécu plus de 100 jours après l'injection.
Des tests effectués à 70 jours après l'injection ont cependant montré que la plupart des souris injectées par ces clones avaient une para sitémie faible mais non nulle de l ' ordre de 103 par ml de sang. On a pu confirmer également que ces clones induisent régulièrement une protection contre l ' injection du clone contrôle virulent
(voir Tableau 4) .
Figure imgf000026_0001
Des souris DBA/2 adultes ont été injectées i.p. avec 500.000 parasites provenant d'un clone mutagénisé. 40 jours plus tard, ces souris ont reçu une injection i.p. de 500.000 parasites virulents du clone n° 4 provenant du sang de souris irradiées et injectées avec ce clone .Les souris non immunisées ont été injectées avec la même dose du clone n° 4.
Comme mentionné précédemment, de nombreux clones mutagénisés n'ont pas produit d'infections aiguës dans les souris irradiées à 600 rads (Tableau 2) . Trois de ces clones ont été injectés à des souris irradiées à 750 rads; Ils y ont produit des infections aiguës. Un de ces clones (n° 38) a été injecté à raison de 500.000 parasites à des souris DBA/2 normales. On a observé qu'après une période de multiplication, ce clone est complètement éliminé par l'hôte environ 20 jours après l'injection. De nombreux tests effectués sur plusieurs souris à des temps supérieurs à 20 jours après l'injection n'ont permis de déceler aucun parasite vivant dans le sang. Le clone n° 38 induit également une protection contre le clone contrôle virulent. Il est donc probable que certains variants obtenus par mutagénèse constitueront des vaccins vivants permettant d'obtenir une immunité stérile contre le T.cruzi virulent.
Les clones de trypanosomes peuvent être conservés par congélation, passage en culture ou passage dans des souris irradiées à 750 rads. On a observé que l'infectivité réduite des clones mutagénisés n° 46, 59, 64 et 69 est un caractère stable, persistant après deux mois de transferts continus dans des souris irradiées. Pour les clones 46 et 69, on a pu vérifier que le caractère persiste après 10 mois de passages in vivo. Les résultats décrits ici indiquent qu'il est possible d'obtenir par traitement mutagène d'une souche de Trypanosome cruzi des clones variants à infectivité réduite. La fréquence des variants à infectivité réduite dans la population de parasites mutagénisés est très élevée et ces variants paraissent stables. De plus, les variants ont conservé la capacité de provoquer une infection aiguë dans les souris irradiées. Finalement, ces variants induisent une protection significative contre des trypanosomes virulent s. Il est dès lors probable que, comme les variants tum , obtenus à partir de cellules tumorales de souris, les parasites variants, que l'on pourrait appeler "vir-" par opposition aux "vir+" à virulence intacte, aient acquis une immunogénicité accrue qui cause leur rejet par les souris normales mais pas par les souris immunodéprimées par irradiation.
Ainsi qu'on l'a déjà décrit précédemment, la présente invention se rapporte également aux vaccins vivants ou tués comprenant, comme ingrédient actif, une souche de parasites variants à infectivité réduite telle qu'obtenue suivant l'invention, par exemple une souche de T. cruzi ou de Leishmania Tropica, en association avec un diluant ou véhicule pharmacologiquement acceptable. On pourrait également envisager l'utilisation de vaccins suivant l'invention combinés à au moins un autre vaccin vivant ou tué contre les maladies parasitaires, de manière à obtenir des vaccins vivants ou tués polyvalents.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation décrites et que bien des modifications peuvent être envisagées sans sortir du cadre du présent brevet.
C'est ainsi que le procédé dLobtention de parasites variants de Trypanosoma cruzi par mutagénèse in vitro avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine comme agent mutagène chimique a également pu être appliqué au parasite protozoaire Leishmania Tropica. Des variants à infectivité réduite ont été obtenus, comme l'indiquent les résultats suivants, en injectant 10 parasites vivants par voie sous-cutanée à des groupes de 5 souris BALB/c âgées de 12 semaines.
Figure imgf000029_0001
L'on pourrait envisager bien entendu d'utiliser également d'autres souches de parasites protozoaires et d'autres agents mutagènes chimiques pour la préparation de vaccins efficaces, que ceux qui ont été cités d'une manière explicite.

Claims

REVENDICATIONS . 1. Procédé d'obtention de parasites variants à infectivité réduite à partir d'un parasite protozoaire, caractérisé en ce qu'il consiste à ire ttre en contact in vitro une souche virulente du parasite protozoaire avec au moins un agent mutagène chimique dans des conditions qui permettent l'obtention de clones variants à infectivité réduite.
2. Procédé suivant la revendication
1, caractérisé en ce que le parasite protozoaire est choisi dans le groupe formé par le Trypanosome cruzi, le Trypanosome africain (Rhodesiense, Gambiense, Brucei, Vivax, Congolense), le Leishmania (Donovani* Tropica),et lePlasmodium Falciparum et en ce que l'agent mutagène chimique est choisi dans le groupe formé par la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, l'éthylméthanesulfonate, la N-méthyl-N-nitrosourée et leurs mélanges.
3. Procédé suivant la revendication
2, caractérisé en ce que l'on utilise le Trypanosome cruzi comme parasite protozoaire et la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine comme agent mutagène chimique.
4. Procédé suivant la revendication
3, caractérisé en ce qu'il comprend notamment l'incubation de la souche de Trypanosome cruzi avec de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose et des sels inorganiques à une température de l'ordre de 36 °C, l'infection clonale de cellules myocardiques de souris par la préparation de Trypanosome cruzi mutagénisé précitée à une température de l'ordre de 37°C, la séparation par centrifugation des cellules , la mise en suspension du culot de cellules infectées dans un milieu nutritif aqueux contenant des sels inorganiques, du glucose, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, l'incubation de micropuits contenant un mélange de la suspension de cellules infectées susdite et d'une préparation de cellules myocardiques de souris non infectées, et la récolte de clones variants de
Trypanosome cruzi à infectivité réduite à partir de ces micropuits.
5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'après l'incubation de la souche de Trypanosome cruzi un contact avec de la
N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans le milieu nutritif aqueux précité, à une température de l'ordre de 36°C, la durée de cette incubation étant d'environ 1 heure, on centrifuge la solution d'incubation ainsi obtenue jusqu'à l'obtention d'un culot de
Trypanosome cruzi, on introduit le culot de Trypanosome cruzi dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des amino acides, des vitamines et du sérum de veau fétal de manière à obtenir une suspension aqueuse de Trypanosome cruzi , on met en contact la suspension de Trypanosome cruzi ainsi obtenue avec des cellules myocardiques de souris dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, le nombre de cellules myocardiques utilisées étant sensiblement plus élevé que le nombre de T. cruzi on incube la solution ainsi obtenue pendant une durée d'environ 3 à 6 jours à une température d'environ 37°C dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone, ce qui permet ainsi d'obtenir une pénétration de l'ordre de 1% des cellules myocardiques de souris par les Trypanosomes cruzi et leur multiplication à l'intérieur de ces cellules, cette étape constituant l'infection clonale des cellules myocardiques, on sépare les cellules myocardiques ainsi traitées de leur solution d ' incubation et on 1 es introduit dans un milieu nutritif aqueux comprenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, on centrifuge ledit milieu nutritif jusqu'à l'obtention d'un culot de cellules myocardiques infectées, on réintroduit le culot de cellules précité dans un milieu nutritif aqueux comprenant du glucose , des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal de manière à obtenir une suspension aqueuse dont environ 1% sont infectées , on dilue la susperision, on la répartit dans des micropuits dans lesquels on ajoute également une préparation de cellules myocardiques de souris non infec tées à base de glucose, de sels inorganiques, d 'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal, le nombre de puits étant sensiblement plus élevé que le nombre de cellules effectivement infectées utilisées qui y sont distribuées, on incube les micropuits à une température de l'ordre de 37°C pendant une période de l'ordre de 10 à 22 jours dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone, et on recueille les clones variants de Trypanosomes cruzi à infectivité réduite des micropuits qui en contiennent.
6. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'on utilise la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine sous la forme d'une solution aqueuse dont la concentration est de l'ordre de 0,3 à 10 μg/ml.
7. Procédé suivant la revendication
6, caractérisé en ce que la concentration de la solution de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine est de l'ordre de 8 μg/ml.
8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'incubation de la solution précitée permettant la pénétration par les Trypanosomes cruzi des cellules myocardiques et leur multiplication à l'intérieur de celles-ci est réalisée dans des boîtes du type pour culture de tissus , et en ce que l'on sépare par aspiration le milieu de culture nutritif utilisé lors de cette incubation après une période de l'ordre de 48 heures pour le remplacer par du milieu frais de même composition, de manière à éli-miner les Trypanosomes cruzi qui n'ont pas pénétré dans les cellules myocardiques, les cellules myocardiques s'agglutinant sur les parois intérieures desdites boîtes.
9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'après l'incubation précitée, on aspire le milieu nutritif, on sépare les cellules myocardiques dont environ 1% sont infectées par des Trypanosomes cruzi, des boîtes qui les contiennent par un traitement à température ambiante avec une solution saline contenant un mélange de trypsine et d'éthylènediaminetétraacétate, on ajoute à la solution saline contenant les cellules myocardiques, du milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal et on centrifuge le milieu nutritif jusqu'à l'obtention du culot de cellules myocardiques infectées précité.
10. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que la souche de T.cruzi est cultivée in vitro avec des cellules myocardiques de souris aans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal à une température de l'ordre de 37°C dans un mélange d'air et de dioxyde de carbone, le rapport d'infection du nombre de .T.cruzi au nombre de cellules myocardiques étant de l'ordre de 2/1.
11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'avant l'incubation avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans le milieu nutritif à base de glucose et de sels inorganiques précité, on centrifuge le surnageant de la culture de T. cruzi susdit à la température ambiante pour précipiter les cellules myocardiques de souris et on centrifuge le surnageant de centrifugation ainsi obtenu pour précipiter les Trypanosomes cruzi.
12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que les clones variants de T. cruzi à infectivité réduite recueillis des micropuits sont transférés à des cultures de cellules myocardiques pour permettre leur multiplication.
13. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que les clones variants de T. cruzi à infectivité réduite recueillis des micropuits sont conservés par congélation à une température de l'ordre de -70°C dans du milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, auquel on ajoute environ 10% de diméthylsulfoxyde.
14. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 13, caractérisé en ce que la quantité de sérum de veau fétal contenue dans les milieux nutritifs à base de sels inorganiques , de glucose, d 'an inoacides , de vitamines précités est de l'ordre de 10%.
15. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 14, caractérisé en ce que lorsque l'on utilise un mélange d'air et de dioxyde de carbone, celui-ci contient environ 10% de dioxyde de carbone.
16. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 15, caractérisé en ce que la souche de Trypanosome cruzi est la souche FK du Docteur F. Kierszenbaum de la Michigan State University, Department of Microbiology and Public Health, East Lansing , Michigan 48824 ) et en ce que les cellules myocardiques sont des cellules de la lignée myocardique de souris PCDlde T.Boon [Boon T.,Buckingham,Dexter D.,Jakob H. et Jacob F.,
1974. Ann. Microbiol. (inst.Pasteur), 125 B : 13-28].
17. Vaccin vivant ou tué contre les maladies parasitaires, caractérisé en ce qu'il comprend, comme ingrédient actif, une souche de parasites variants à infectivité réduite telle qu'obtenue par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 16, en association avec un diluant ou véhicule pharmacologiquement acceptable.
18. Vaccin vivant ou tué suivant la revendication 17, caractérisé en ce que la souche de parasites variants à infectivité réduite est une souche de Trypanosome cruzi ou de Leishmania Tropica.
19. Vaccin vivant ou tué polyvalent contre les maladies parasitaires, caractérisé en ce qu'il contient, comme substances, un vaccin suivant l'une ou l'autre des revendications 17 et 18, et au moins un autre vaccin vivant ou tué contre les maladies parasitaires.
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