FR2478470A1 - Preparations cellulaires applicables en therapeutique humaine, procede d'obtention et applications - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES PREPARATIONS CELLULAIRES APPLICABLES EN THERAPEUTIQUE HUMAINE. LES PREPARATIONS SELON L'INVENTION SONT CONSTITUEES DE CELLULES SUR LESQUELLES SONT FIXEES, A LEUR SURFACE, DES SUBSTANCES AYANT UNE ACTIVITE PHARMACOLOGIQUE. APPLICATION : PREPARATIONS DE VACCINS.

Description

La présente invention concerne des préparations cellulaires ayant des propriétés pharmacologiques, un procédé pour leur obtention et leurs applications. L'invention concerne notamment des préparations cellulaires à pouvoir immunogène élevé.

Les préparations cellulaires selon l'invention sont constituées de cellules sur lesquelles sont fixées, à leur surface, des substances ayant une activité pharmacologique, et notamment des substances capables d'engendrer la formation ou la fixation d'anticorps.

Les préparations cellulaires selon l'invention sont obtenues par couplage des cellules avec la substance ayant une activité pharmacologique, par l'intermédiaire d'un agent de pontage approprié.

L'agent de pontage mis en oeuvre pour la fabrication des préparations cellulaires selon l'invention est un agent bifonctionnel qui permet le couplage des cellules avec la substance considérée. On peut utiliser tous les agents de couplage couramment utilisés dans le domaine biochimique et immunologique pour le couplage de protéines entre elles. A titre d'agents de pontage appropriés aux fins de l'invention,on peut citer notamment le glutaraldéhyde,la benzoquinone et similaires.

Dans le domaine immunologique,le glutaraldéhyde est un réactif couramment utilisé, notamment comme agent de couplage de protéines / AVRAMEAS Bull. Soc. Chim. Biol. 1968, 50 n 5-6 7 ou comme agent de polymérisation pour la fabrication d'immunoadsorbants / AVRAMEAS et TERNYNCK, Immunochemistry,vol.9, pages 53-66(1969) 7.

On n'a jamais proposé jusqu'a présent d'utiliser des cellules comme supports de substances à activité pharmacologique et notamment dgantigénes.

La fixation de la substance ayant une activité pharmacologique sur les cellules est réalisée par mise en contact desdites cellules avec la substance en présence d'un tel agent de pontage en quantité suffisante et pendant un temps suffisant pour coupler les cellules et ladite substance.

A titre de cellules, on peut utiliser selon l'invention des cellules de toutes origines,telles que des cellules humaines ou animales, et des microorganismes, tels que
Bordetella pertussis Les cellules peuvent être normales ou tumorales. Dans la pratique, on préfère utiliser des cellules normales telles que par exemple les lymphocytes, les cellules fibroblastiques, telles que MRC5 et Wi38.

Les substances à activité pharmacologique qui entrent dans la composition des préparations cellulaires selon l'invention sont toutes substances qui ont des actions physiologiques sur un être vivant. Selon l'invention, on préfère utiliser les substances capables d'engendrer la formation d'anticorps ou de fixer des anticorps.

Parmi les substances à activité pharmacologique, on peut citer notamment les hormones, les haptènes,les substances toxiques, les substances toxiques détoxifiées ou inactivées,les constituants sériques.

Selon une variante de l'invention, pour l'obtention de préparations cellulaires dans lesquelles la substance à activité pharmacologique est une substance toxique détoxifiée ou inactivée, on peut d'abord fixer sur les cellules des substances toxiques, qui, par détoxication ou inactivation ultérieure fournissent sur les cellules des substances à activité pharmacologique.

Au sens de la présente description,on entend par "substance toxique" toute substance contenant des produits antigéniques ou portant des groupements antigéniques ,de nature protéique ou non, (par exemple haptène),susceptibles de provoquer la formation d'anticorps spécifiques chez l'homme et l'animal, et en particulier les toxines,les bactéries,les fractions bactériennes,les substances libérées par les bactéries,les virus entiers et leurs fractions,les parasites, leurs fractions, les venins,et autres substances similaires,par exemple les cellules tumorales et leurs fractions.

A titre d'exemples de telles substances toxiques, on peut citer notamment les toxines tétaniques et diphtériques.

On va maintenant décrire plus en détail cette variante de l'invention sans pour autant limiter la portée de l'invention à cette seule variante.

On a en effet trouvé que les préparations cellulaires obtenues en partant de substances toxiques et en effectuant une détoxication ou inactivation ultérieure, possèdent un pouvoir immunogène élevé.

On rappdlera brièvement ci-après l'état de la technique relatif aux vaccins.

Les micro-organismes qui servent d'antigènes pour la préparation de vaccins sont généralement inactivés par la chaleur, le formol,le phénol ou une combinaison de ces moyens.Ces procédés connus dénaturent parfois les antigènes protecteurs. Il en résulte donc, dans certains cas, une perte de spécificité de la réponse immunologique du sujet vacciné.

Pour inactiver les virus en vue de la préparation de vaccins, on utilise généralement le formol, la P propiolactone, les rayons U.V. ou l'action combinée d'agents chimiques et physiques,
Un autre moyen pour préparer des vaccins consiste à traiter le produit toxique avec du glutaraldéhyde à une concentration et pendant une durée juste suffisantes pour détoxifier ou inactiver ledit produit toxique, et à arrêter la réaction, dès que ce stade de détoxication ou d'inactivation est atteint, par des moyens physiques et/ou chimiques. Le produit détoxifié ou inactivé ainsi obtenu est utilisable comme vaccin. Un tel procédé est décrit dans le brevet FR 73.16 131 (publié sous le 2.227 861 ) et le premier certificat d'addition y attaché n"74 16 936 publié sous le nO 2.270.891).

Par ailleurs, on sait que les vaccins sont utilisés soit sous la forme fluide,soit sous la forme adsorbée sur des supports habituels, tels que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate de calcium et produits similaires. La stimulation antigénique des vaccins sous la forme adsorbée est en général renforcée par rapport à celle des mêmes vaccins sous la forme fluide.

On a maintenant trouvé que l'on pouvait augmenter le pouvoir immunogène d'antigènes en utilisant des cellules comme supports pour lesdits antigènes, lesdits antigènes étant couplés à la surface desdites cellules à l'aide d'un agent de couplage, tel que le glutaraldéhyde.

Comme on l'a rappelé précédemment, le glutaraldéhy- de est utilisé dans le domaine immunologique comme agent de pontage ou de polymérisation.

On a également utilisé le glutaraldéhyde comme agent d'activation de supports solides porteurs de groupes NH2, lesdits supports ainsi activés étant utilisés pour la fabrication de produits solides pour la purification d'anticorps, par la mise en contact dudit support activé avec une substance toxique, ladite substance toxique fixée étant ensuite inactivée par traitement avec du glutaraldéhyde. De tels procédé et produit sont décrits dans le second certificat d'addition FR 79 05 088 rattaché au brevet FR 73 13 131 cité ci-dessus. Les supports solides utilisés pour la fabrication de tels produits sont quelconques et peuvent être par exemple des billes de silice poreuse.

A la connaissance de la demanderesse, on n'a jamais utilisé des cellules comme supports d'antigènes. Cependant, il faut noter que l'on a déjà proposé de traiter des cellules avec du glutaraldéhyde. A cet effet,on peut citer les travaux de T.

KATAOKA et al. relatés dans les articles ci-après:
-Transplantability of L 1210 Cell in BALB/ c x DBA/ 2 Fl Mice associated with cell agglutinability by Concanavalin A / Cancer Research 35,531-534,Mars 1975 7.

-Induction of Resistance to L 210 Leukemia in BALB/c x DBA/2 Cr Fl Mice,with L 1210 cells treated with glutaraldehyde and Concanavalin A / Cancer Research 37,964-968,
April 1977 J
-Enhanced induction of immune resistance by
Concanavalin A-bound L 1210 Vaccine and an immunopotentiator prepared from Coriolus Versicolor / Cancer Research 37,44164419, DecembFe 1977 7
-Blastogenic potency of Concanavalin-A-bound
L 1210 leukemic vaccine associated with its immunogenic activity / Gann,70, 155-1641 Avril l979?o
-Potentiation of-L 1210 murine leukemia vaccine in vivo by levamisole / Gann, 70, 515-519, Août l9797
Dans ces documents, il est indiqué que l'antigène tumoral spécifique des cellules L 1210 est présent à la surface des cellules. En ce qui concerne le glutaraldéhyde,il est noté que le traitement des cellules avec une quantité spécifique de 0,125 % de glutaraldéhyde ne semble pas altérer l'immunogénicité des collules tumorales. Par contre,l'utilisation de quantités de glutaraldéhyde plus importantes semble modifier la surface de cellules puisque les cellules ainsi traitées ne sont plus capables de former une lyse immune avec un sérum anti-cellule L 1210 et du complément.En outre, il est noté que la concentration en gluta raNdéhyde est importante pour supprimer la malignité des cellules leucémiques,donc pour les rendre non malignes,et que le glutaraldéhyde aide la concanavaline a rester fixée à la surface des cellule l'activité immunogénique associée aux antigènes de transplantation des cellules étant préservée en présence de la concanavaline A.

Ces travaux sont donc relatifs à des cellules leucémiques et à l'étude de vaccins leucémiques obtenus à partir de telles cellules traitées avec du glutaraldéhyde et sur lesquelles est liée de la concanavaline A. Les structures antigéniques de ces vaccins sont constituées par les cellules elles-memes ou des motifs antigéniques portés à leur surface.

Ce mode de réalisation de l'invention consiste à mettre en oeuvre des cellules comme supports d'antigènes,qui sont différents des antigènes spécifiques des cellules utilisées.

Dans cette forme de réalisation,le procédé selon la présente invention consiste à mettre en contact des cellules et une substance toxique en présence d'un agent de pontage tel que le glutaraldéhyde en quantité suffisante pour coupler la substance toxique sur les cellules et à détoxifier ou inactiver ladite substance toxique tout en conservant les structures antigéniques de ladite substance.

Selon cette variante de l'invention, on utilise une substance toxique quelconque, telle que définie précédemment,qui est susceptible d'être détoxifiée ou inactivée par le glutaraldéhyde dans des conditions contrôlées de manière à ce que le produit résultant reste antigénique et conserve son pouvoir immunisant.

Comme indiqué précédemment > l'agent de pontage, qui peut être du glutaraldéhyde,de la benzoquinone ou produits similaires, doit être présent en une quantité suffisante pour coupler la substance toxique sur les cellules. On utilise de préférence le glutaraldéhyde. Dans ce cas particulier, la quantité de glutaraldéhyde mise en oeuvre doit être suffisante pour, d'une part,coupler la substance toxique sur les cellules et, d'autre part,assurer la détoxication ou l'inactivation de la substance toxique. Ainsi,au cours du procédé de l'invention,on met à profit deux types de propriétés du glutaraldéhydetses propriétés de pontage d'une part et ses propriétés de détoxication ou d'inactivation d'autre part.

Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention,la mise en contact des cellules et de la substance toxique en présence de glutaraldéhyde est réalisée en ajoutant du glutaraldéhyde à un mélange constitué des cellules et de la substance toxique, ledit mélange et l'addition de glutaraldéhyde étant avantageusement réalisés à la température ambiante. Le mélange réactionnel résultant est maintenu pendant environ 2 à 60 minutes, toujours à la même température, par exemple pendant 15 minutes,puis lavé avec une solution tampon, par exemple une solution tampon phosphate.

Comme indiqué précédemment,la quantité de glutaraldéhyde mise en oeuvre doit permettre le couplage de la substance toxique et en meme temps sa détoxication ou inactivation.L'homme de l'art dispose de moyens objectifs de contrôle dans un système donné pour connaître la concentration en glutaraldéhyde,le degré de couplage et la durée du traitement pour réaliser la détoxication tion QU l'inactivation.A titre d'indicationyqui ne doit en aucune façon etre considérée comme limitative, on précisera que, dans le cas où la substance toxique est la toxine tétanique, la quantité de glutaraldéhyde à mettre en oeuvre selon la variante ci-dessus correspond à environ lO fois la quantité nécessaire à l'obtention de l'anatoxine tétanique, selon les enseignements du brevet
FR 73 16 131 .

La durée du contact correspond approximativement à la durée nécessaire pour la détoxication ou l'inactivation.Selon les enseignements du brevet FR 73ç16 131,la réaction est stoppée par les moyens physiques et/ou chimiques définis ci-après,tels que centrifugation des cellules ou méthodes similaires.

Selon une autre variante de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on opère en plusieurs étapes successives:
1) on met en contact les cellules avec du gluta raldéhyde pour activer les cellules;
2)on met les cellules ainsi activées en contact avec la substance toxique;
3)on détoxifie ou inactive la substance toxique fixée sur les cellules par traitement avec du glutaraldéhyde dans des conditions contr8lées,c'est-à-dire avec une concentration de glutaraldéhyde et pendant une durée juste suffisantes pour détoxifier ou inactiver la substance toxique, la réaction étant arrêtée par centrifugation ou méthodes similaires dès que ce stade de détoxication ou d'inactivation est atteint. On ratera que l'étape 3)ci-dessus est une étape connue, décrite en détail dans le brevet FR 73.16 131,auquel on pourra se référer en cas de besoin.

Les conditions de mise en oeuvre de la première étape définie ci-dessus ne sont pas critiques. Il suffit d'utiliser des conditions propres à assurer la fixation du glutaraldéhyde sur les cellules et, à cet effet,on préfère mettre en oeuvre un certain excès de glutaraldéhyde lors du contact avec les cellules, après quoi on lave celles-ci pour éliminer le glutaraldéhyde libre non fixé,le lavage étant avantageusement réalisé avec une solution tampon, telle qu'une solution tampon phosphate classique. Cette étape est avantageusement réalisée à la température ambiante.

A l'issue de la première étape, on obtient des cellules activées au glutaraldéhyde. On réalise alors la réaction avec la substance toxique après avoir lavé le mélange réactionnel résultant de la première étape pour éliminer-le glutaraldéhyde en excès selon des moyens classiques appropriés,par exemple avec une solution tampon phosphate. Les conditions particulières de la réaction peuvent naturellement varier quelque peu selon la nature de la substance toxique. En général, on utilise la substance toxique sous la forme d'une solution,en quantité suffisante pouisaturer les cellules,ce qui implique l'utilisation d'un léger excès de substance toxique, allant dans la pratique jusqu'à 100 à l00O fois.

On laisse en contact la substance toxique avec les cellules activées pendant le temps nécessaire à la fixation, de préférence en opérant à une température appropriée, qui ne dénature pas l'intégrité de la substance toxique, par exemple à la température ordinaire. On lave ensuite le produit résultant pour éliminer la substance toxique en excès par tout moyen classique approprié, par exemple avec une solution tampon.

On procède ensuite à la détoxification ou inactivation de la substance toxique fixée sur les cellules par traitement avec du glutaraldéhyde dans des conditions contr8lées. Dans ce cas, le glutaraldéhyde n'est pas utilisé comme réactif de pontage ou de réticulation mais comme agent dinuctivation ou de détoxication selon les enseignements du brevet FR 73 16 131.

On rappellera que la détoxicdtion ou inactivation à l'aide de glutaraldéhyde selon le brevet FR 73 16 131 doit être faite dans des conditions controlées, de manière à obtenir notamment une souche virale qui a perdu ses propriétés de multiplication mais a conservé ses structures antigéniques vaccinantes.

Il importe donc de stopper la réaction entre le glutaraldéhyde et le milieu réactionnel résultant de la seconde étape à un moment contrôlé de façon à enlever la toxicité du produit initial mais sans le dénaturer.

Parmi les moyens qui peuvent être utilisés pour arrêter cette réaction1 on indiquera,à titre d'exemple, les moyens ci-après:
-par voie chimique, consistant à éliminer le glutaraldéhyde en excès en ajoutant au milieu réactionnel un agent chimique capable de réagir avec le glutaraldéhyde,tel que par exemple les amino-acides,par exemple la lysine ou la glycine, ou des sels inorganiques, tels que le bisulfite de sodium,
-par voie physique, par exemple par dialyse du milieu réactionnel contre une solution tampon ou encore par centrifugation.

Le produit obtenu selon le procédé de l'invention, qui constitue un autre objet de lsinventiontpeut astre défini comme étant une composition cellulaire dans laquelle les cellules présentent,fixés à leur surface,des groupements antigènes.

Les compositions cellulaires selon l'invention peuvent être aisément identifiées par examen au microscope ou par des méthodes classiques de réactions immunologiques,qui permettent de révéler la présence d'antigènes, ou encore par des méthodes biochimiques.

On peut également mettre en évidence la possibilité de ces préparations cellulaires de produire des anticorps gracie à des antigènes qui n'ont rien à voir avec les antigènes des cellules.

Les préparations cellulaires ou antigènes selon l'invention présentent,de manière surprenante, un pouvir immunogène élevé et supérieur à celui des anatoxines,sous forme fluide ou même sous forme adsorbée.

Ces préparations cellulaires peuvent être utilisées par exemple à titre de vaccins pour le traitement préventif chez l'homme et l'animal d'affections causées par les toxines microbiennes ou venimeuses,les germes,bactéries,virus et microorganismes les plus variés.

Sous un autre aspect,l'invention concerne également les sérums hyperimmuns obtenus par prélèvement chez l'homme ou sur un animal,tel que le cheval par exemple, auquel on a administré une préparation cellulaire selon l'invention à périodes rapprochées selon les techniques classiques d'immunisation. Ces sérums peuvent,de façon connue ,être utilisés pour le traitement préventif et curatif chez l'homme et l'animal des affections causées par des microorganismes ou leurs dérivés correspondant au vaccin administré.

Ces sérums sont également applicables comme produits de diagnostic et pour l'analyse immunologique.

L'invention va être maintenant décrite en détail par les exemples illustratifs ci-après,dans lesquels on a utilisé, comme support, des cellules tumorales de la leocémie expérimentale
L 1210 de la souris et la toxine tétanique comme substance toxique.

EXEMPLE i
A-Préparation des cellules
On a utilisé des souris mâles / C 57 B1/ 6 x DBA f F1 âgées de 5 à 6 semaines provenant de l'élevage de IFFA CREDO rBP 109,69210 L'Arbresle, Francs 7 7 de référence B6D2F1/Ico.

Les animaux ont reçu par voie intra-péritonéale un inoculum de 106 cellules L. 1210 ; des prélèvements et repiquages ont été effectués 1 fois par semaine 24 heures environ avant la mort. La mort des animaux est intervenue approximativement:
-après 7 jours pour un inoculum de 106 cellules,
-après 9 jours pour un inoculum de 105 cellules,
-après 11 jours pour un inoculum de 104 cellules.

Les cellules prélevées ont été diluées au 1/100 dans un soluté stérile de tampon phosphate de pH 7,35 et numérées dans une cellule de Mtïlassez;on a calculé ensuite le volume à injecter aux animaux pour les repiquages.

Les cellules leucémiques ainsi obtenues ont été, avant leur mise en oeuvre selon le procédé de l'invention,lavées trois fois avec une solution tampon phosphate (PBS)et centrifugées pendant 5 minutes à 2000 t/min. L'évaluation de la proportion de cellules vivantes par rapport au total a été faite après coloration au bleu trypan.

B-Toxine tétanique
La toxine tétanique utilisée a été préparée en fermenteur et purifiée après ultrafiltration par précipitation saline fractionnée. Le titrage a été effectué par rapport à l'étalon de Copenhague en unités internationales de floculation par ml / UF/ml 7.

C-Glutaraldéhyde
Une solution de glutaraldéhyde à 25% / MERCK-
Schuchardt 7 a été utilisée, diluée en PBS aux concentrations mises
en oeuvre.

On a mélangé en proportions égales une suspension de 4 x 107 cellules/ml avec une solution de glutaraldéhyde à 4%.Le mélange a été maintenu 2 heures à la température ambiante puis a ensuite été lavé trois fois avec une solution tampon phosphate.

La suspension des cellules lavées a été mélangée avec une solution concentrée de toxine tétanique de façon obtenir une concentration de 2 x 107 cellules par ml et 500 UF de toxine par ml.

Le mélange toxine-cellules a été maintenu une nuit à + 4 C et les cellules ont été à nouveau lavées 3 fois avec une solution tampon phosphate.

Des essais effectués chez la souris ont démontré qu a ce stade les cellules étaient fortement toxiques par suite de fixation des molécules de toxine tétanique ; les animaux éprouvés sont morts en effet en présentant des symptômes identiques à ceux observés après injection de toxine tétanique.

Les cellules toxiques obtenues selon le mode opératoire ci-dessus ont été détoxifiées, par action du glutaraldéhyde,par le procédé selon le brevet FR 73 16 131 . A cet effet , on a laissé une suspension de 2 x 1J cellules par ml pendant 10 minutes en contact à 370C avec du glutaraldéhyde à 0,027. Les cellules ainsi détoxifiées ont à nouveau été lavées 3 fois, avec une solution tampon PBS. L'emploi d'une toxine tétanique marquée à l'iode 125 a permis de calculer que dans les conditions de l'expérience ci-dessus la quantité de toxine fixée était égale à 1,34 UF pour 106 cellules et 53,7 UF pour 4 x 107 cellules. Des titrages de toxicité chez la souris ont donné 15.000 doses minima mortelles par UF pour la toxine initiale et 750 pour la toxine initialement fixée sur les cellules.

La composition cellulaire ainsi obtenue sera dénommée ci-après préparation aA.

EXEMPLE 2
On a utilisé les mêmes matériaux de départ que dans l'exemple tenais dans ce cas on a mélangé rapidement, et dans l'ordre , les constituants suivants pour obtenir un mélange de composition final:
toxine tétanique:500 UF/ml
cellules lavées: 2 x 107 /ml
glutaraldéhyde: 0,27%.

La suspension a été maintenue 15 minutes à la température ambiante et a ensuite été lavée 3 fois avec une solution de PBS. La quantité de glutaraldéhyde est,dans ces conditions, 10 fois supérieure à celle utilisée pour l'obtention de l'anatoxine tétanique, et la toxine fixée sur les cellules est d'emblée détoxifiée.

L'utilisation d'une préparation de toxine marquée à l'iode 125 I, a permis de calculer que la quantité de toxine fixée sous forme d'anatoxine était égule à 0,15 UF pour 106 cellules.

La composition cellulaire obtenue selon cet exemple sera dénommée ci-après préparation B.

Résultats immunologiques a) Détermination des toux d'anticorps antitétaniques circulants
Les compositions cellulaires obtenues selon les exemples 1 et 2 ci-dessus (préparations A et B) ont été injectées à des souris B6D2F1 réceptives à la leucémie L1210 et des souris Swiss non réceptives, afin d'évaluer le pouvoir immunogène de l'anatoxine fixée.

Lgimmunisation a été réalisée par 2 injections de 0,5 ml d'une suspension eontenant 106 cellules par ml et titrant 1,34 UF/ml pour la préparation A et 0,15 UF/ml pour la préparation B.

Les injections,espacées de 8 jours, ont été faites par voie intrG-péritonécle. Des prises de sang par ponction des sinus caverneux ont été effectuées 8 jours après la deuxième injection et les sérums de chaque groupe de 10 animaux ont été mélangés à volume égal.

Les dosages d'anticorps antitoxiques ont été effectués chez la souris aux niveaux L + /100 et L +/lOOO,et les titres,expriméu en unités Internationales Antitoxiques par ml JUTAI / ml 7.

Deux préparations dçanatoxines couramment utilisées et diluées aux concentrations des préparations A et B ont été injectées à des groupes d'animaux témoins afin d'évaluer comparativement le pouvoir immunogène de l'anatoxine fixée sur des cellules selon l'invention. Ces préparations d' anatoxines étaient respectivement:
1. une préparation d'anatoxine fluide obtenue pour l'action du formol sur la toxine tétanique.

2. une préparation d'anatoxine adsorbée sur phosphate de calcium / produit connu sous la dénomination IPAD-T commercialisé par l'Institut Pasteur 7.

Les taux d'anticorps antitétaniques présents dans chaque mélange de sérums, exprimés en UAl/ml, figurent dans les tableaux 1 et 2.

Le tableau 1 montre que les titres d'anticorps circulants obtenus avec la préparation d'anatoxine fixée sur les cellules selon l'invention sont plus élevés que ceux obtenus avec les deux autres préparations, aussi bien chez les souris B6D2F1 que chez les souris Swiss.

Les titres d'anticorps circulants sont aussi plus élevés chez les souris Swiss dans les trois groupes d'essais.

Le pouvoir immunogène de l'anatoxine fixée sur les cellules est donc plus élevé que celui d'une préparation d'anatoxine adsorbée sur un adjuvant minéral,le dernier étant évidemment plus actif qu'un vaccin fluide.

Les résultats obtenus avec la préparation B sont rapportés dans le tableau 2. Les taux d'anticorps circulants sont cette fois-ci inférieurs à ceux obtenus avec la préparation A, parce que la quantité d'anatoxine employée était moins élevée
Les taux d'anticorps circulants obtenus avec la préparation de cellules et l'anatoxine adsorbée sont toutefois égaux dans les deux groupes de souris.

Ces résultats permettent à nouveau de conclure que l'anatoxine fixée sur les cellules possède un pouvoir immunisant élevé.

b)Etude du pouvoir protecteur des préparations A et B après une injection et comparaison avec des vaccins tétaniques connus,au 1/10 de la dose humaine.

On a injecté à des souris les préparations A ou
B à 1 UF/dose de 0,5 ml, et à des souris témoins des vaccins tétaniques connus, au 1/10 de la dose humaine, et on a titré les anticorps circulants pendant 28 semaines après l'injection.

Les vaccins tétaniques utilisés titre comparatif, étaient les suivants:
-vaccin IPAD-T commercialisé par l'Institut
Pasteur
-vaccin Etalon Européen [CEE à Strasbourg7
-vaccin TETAVAX commercialisé par l'Institut Mérieux.

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3 ci-après.

On a également porté sur la figure 1 annexée le titre en anticorps circulants en fonction du nombre de semaines après l'injection pour les préparations A et B et le vaccin
IPAD-T. Les résultats du tableau 3 et les courbes de la figure 1 montrent queles préparations A et B ont un pouvoir immunostimulant comparable aux autres vaccins . La montée des anticorps circulants se fait cependant moins rapidement avec la préparation A.

TABLEAU 1
Titres d'anticorps antitétaniques circulants exprimés en unités internationales antitoxiques par ml ( UAI/ml) chez des souris vaccinées par la préparation A et les témoins.

<tb>

<SEP> Titres <SEP> d'anticorps <SEP> circulants <SEP> *
<tb> <SEP> Anatoxines <SEP> obtepues, <SEP> par
<tb> action <SEP> sur <SEP> du <SEP> tormol
<tb> Souris <SEP> Préparation <SEP> Adsorbée <SEP> Fluide
<tb> <SEP> utilisées <SEP> A
<tb> B5D2F1 <SEP> 0,5 <SEP> #0,25 <SEP> 0,05
<tb> SWISS <SEP> #2,5 <SEP> <SEP> 0,75 <SEP> 0,4
<tb> * Après deux injections espacées de 8 jours de 0,5 ml des diverses préparations et déterminées sur des mélanges de saignées à volume égal prélevées 8 jours après la deuxième injection.

TABLEAU 2
Titres d'anticorps antitétaniques circulants exprimés en unités internationales antitoxiques par ml (UAI/ml) chez des souris vaccinées par la préparation B et les témoins.

<tb>

<SEP> Titres <SEP> d'anticorps <SEP> circulants <SEP> *
<tb> Anatoxines <SEP> obtepues, <SEP> par
<tb> <SEP> action <SEP> sur <SEP> du <SEP> tormol
<tb> Souris <SEP> Préparation <SEP> B <SEP> Adsorbée <SEP> Fluide
<tb> <SEP> utilisées
<tb> B5D2F1 <SEP> 0,025 <SEP> #0,025 <SEP> <SEP> #0,01
<tb> SWISS <SEP> 0,025 <SEP> 0,025 <SEP> #0,01
<tb> fital
<tb> * Après deux injections espacées de 8 jours de 0,5 ml de diverses préparations et déterminées sur des mélanges de saignées à volume égal prélevées 8 jours après la deuxième injection. TABLEAU 3
Etude du pouvoir protecteur de différents vaccins tétaniques titrés en anticorps circulants
chez la souris après une injection du 1/10 de la dose humaine

<SEP> Titres <SEP> Après
<tb> Vaccins <SEP> 1 <SEP> sem <SEP> 2 <SEP> sem <SEP> 3 <SEP> sem <SEP> 4 <SEP> sem <SEP> 6 <SEP> sem <SEP> 8 <SEP> sem <SEP> 10 <SEP> sem <SEP> 12 <SEP> sem <SEP> 17 <SEP> sem <SEP> 20 <SEP> sem <SEP> 24 <SEP> sem <SEP> 28 <SEP> sem
<tb> IPAD. <SEP> T <SEP> dilué
<tb> à <SEP> 3 <SEP> UF <SEP> /dose <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> 0,05 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 5
<tb> Etalon <SEP> Européen <SEP> dilué <SEP> à <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> 0,06 <SEP> 0,75 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 7,5 <SEP> 5,5 <SEP> 8 <SEP> 6,5 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> UI/dose
<tb> Tétravax
<tb> Mérieux <SEP> dilué <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> 0,05 <SEP> 1,5 <SEP> 6 <SEP> 15 <SEP> 15 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 13
<tb> au <SEP> 1/10
<tb> Préparation <SEP> A
<tb> diluée <SEP> à <SEP> 1 <SEP> UF/
<tb> dose <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> 0,025 <SEP> 0,08 <SEP> 0,10 <SEP> 0,75 <SEP> 1,5 <SEP> 1,5 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7
<tb> Préparation <SEP> B
<tb> diluée <SEP> à <SEP> 1 <SEP> UF/
<tb> dose <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> - <SEP> 0,75 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 14 <SEP> 19 <SEP> 15 <SEP> > <SEP> 16 <SEP> 16
<tb>

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Préparations cellulaires, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de cellules sur lesquelles sont fixée, à leur surface, des substances ayant une activité pharmacologique .

2. Préparations cellulaires selon la revendication 1,caractérisées en ce que les cellules sont des cellules humaines ou animales et des microorganismes.

3. Préparations cellulaires selon l'une des revendications 1 ou 2,caractérisées en ce que les cellules sont des cellules normales ou tumorales,notamment des lymphocytes ou fibroblastes.

4. Préparations cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,caractérisées en ce que les substances ayant une activité pharmacologique sont des substances capables d'engendrer la formation d'anticorps ou de fixer des anticorps.

5. Préparations cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisées en ce que ladite substance est choisie parmi les hormones,les haptènes,les substances toxiques détoxifiées ou inactivées,les constituants sériques.

6. Préparation selon la revendication 5,caractérisée en ce que la substance toxique, choisie parmi les hormones,les haptènes,les substances toxiques détoxifiées ou inactivées,les constituants sériques, est la toxine tétanique ou la toxine diphtérique.

7. Préparations cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,caractérisées en ce que ladite substance est fixée sur les cellules par l'intermédiaire d'un agent de pontage.

8. Préparations cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 7,caractérisées en ce que l'agent de pontage est le glutaraldéhyde ou la benzoquinone.

9. Procédé pour ltobtention des préparations cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact des

cellules avec ladite substance en présence d'un agent de pontage en quantité suffisante pour réaliser la fixation.

Procédé selon la revendication 9, caractérisé

en ce qu'il consiste à mettre en contact des cellules et une

substance toxique en présence de glutaraldéhyde en quantité

suffisante pour coupler la substance toxique sur les cellules

et à détoxifier ou inactiver ladite substance toxique tout en

conservant les structures antigéniques de ladite substance

toxique.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la mise en contact des cellules et de la substance toxique avec le glutaraldéhyde est réalisée par addition de glutaraldéhyde à un mélange constitué des cellules et ds ladite substance toxique.

12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on opère convenablement en ne dénaturant pas l'intégrité de la substance toxiquenotemment à la température ordinaire.

13. Procédé selon la revendication TO,caractérisé en ce qu'il consiste:

(1) à mettre en contact les cellules avec du glutaraldéhyde pour activer les cellules;

(2) à mettre les cellules ainsi activées en contact avec la substance toxique;

(3)d détoxifier ou inactiver la substance toxique fixée sur les cellules par traitement avec du glutaraldéhyde

avec une concentration de glutaraldéhyde et pendant une durée

juste suffisantespour détoxifier ou inactiver la substance toxique

tout en conservant ses structures antigéniques,ledit traitement

avec le glutaraldéhyde étant arrêté par des moyens physiques

et/ou chimiques dès que ce stade de détoxication ou d'inacti

vation est atteint.

14. Procédé selon la revendication 13,caractérisé en ce que, dans l'étape (i),on opère en présence d'un excès de glutaraldéhyde et que le mélange réactionnel est lavé avant l'étape (2) de manière à éliminer le glutaraldéhyde en excès,et en ce que, dans l'étape (2),on opère avec un excès de substance toxique, et qu'après fixation de ladite substance,on lave le milieu réactionnel pour éliminer la substance toxique en excès.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14,caractérisé en ce que la substance toxique est choisie parmi les toxines,les bactéries, les fractions bactériennes, les substances libérées par les bactéries,les virus entiers et leurs fractions, les parasites, leurs fractions, les venins, et autres substances similaires, par exemple des cellules tumorales et leurs fractions.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14,caractérisé en ce que la substance toxique est la toxine tétanique ou la toxine diphtérique.

17.Vaccins,caractérisés en ce qu'ils contiennent,à titre de substance antigénique,une préparation cellulaire selon l'une des revendications 1 ou 8.

18. Sérums hyperimmuns obtenus par prélèvement sur l'homme ou sur un animal,tel que le cheval, auquel on a administré un vaccin selon la revendication 17.

19. Application des vaccins selon la revendication 17,pour le traitement préventif chez l'homme et l'animal d'affec-' tions causées par les toxines microbiennes ou venimeuses, les germes, bactéries,virus et autres microorganismes.

20. Application des sérums selon la revendication 18, au traitement préventif et curatif chez l'homme et l'animal des affections causées par des microorganismes ou leurs dérivés correspondant audit vaccinez

21. Application des sérums selon la revendication 18 au diagnostic et à l'analyse immunologique.