EP0799053A1 - Vaccin presentant une immunogenicite accrue - Google Patents

Vaccin presentant une immunogenicite accrue

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EP0799053A1
EP0799053A1 EP95943246A EP95943246A EP0799053A1 EP 0799053 A1 EP0799053 A1 EP 0799053A1 EP 95943246 A EP95943246 A EP 95943246A EP 95943246 A EP95943246 A EP 95943246A EP 0799053 A1 EP0799053 A1 EP 0799053A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
vaccine
alum
group
per
hepatitis
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95943246A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Louis Chedid
Françoise Audibert
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Vacsyn SA
Original Assignee
Vacsyn SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Vacsyn SA filed Critical Vacsyn SA
Publication of EP0799053A1 publication Critical patent/EP0799053A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/5555—Muramyl dipeptides

Definitions

  • the present invention relates to an improvement to vaccines containing alum in their compositions and in which the antigen may be partially or wholly absorbed onto alum.
  • the improvement consists in the association in the constituent composition of these vaccines of 2 to 120 ⁇ g per kg of body weight or 0.1 to 6 mg per dose of muramyl peptide; these vaccines thus perfected have the particular advantage of conferring increased immunity so that the number of injections necessary for immunization is reduced.
  • the only immunoadjuvants currently used in human vaccines are aluminum-based compounds such as aluminum hydroxide or aluminum phosphates.
  • the active principle of which consists of an antigen obtained by m vitro genetic recombination, such as Havrix, a vaccine against hepatitis A, the active principle of which is an antigen obtained from a strain of hepatitis A virus cultured in cell culture, and containing aluminum hydroxide at a rate of 1.5 mg per dose (0.5 mg of aluminum) and marketed by the company Smith Kline & French (6, Esplanade Charles De Gaulle, 92731 Nanterre Cedex) under the trade name of Havrix. Two administrations conducted a month apart are used to induce seroconversion in 98% of individuals.
  • m vitro genetic recombination such as Havrix
  • a vaccine against hepatitis A the active principle of which is an antigen obtained from a strain of hepatitis A virus cultured in cell culture, and containing aluminum hydroxide at a rate of 1.5 mg per dose (0.5 mg of aluminum) and marketed by the company Smith Kline & French (6, Esplan
  • Vaccines against hepatitis B mentioned above are effective after at least three injections at 0, 30, 60 or 180 days followed by a mandatory recall after one year, in addition to a number of topics are not very responsive or non-responsive In the total population they represent around 5% and the ability to obtain seroconversion depends very much on the subject's age, it is already significantly weaker from 30-35 years of age. particularly poorly responding groups are hemodialysis patients (30 to 45% of this population) and kidney transplant recipients, 75 to 95% of whom do not respond to vaccines.
  • Ala-D-GIn-n-methyl-ester and Murametide or Nac-Mur-L-Ala-D-GIn methyl ester have already been developed in preclinical efficacy, acute, subacute and chronic toxicity tests as well as in phase 1 trials in humans; excellent tolerance was demonstrated following administration to over 200 subjects and 50 subjects Murabutide for Murametide
  • the inventors have had the idea of associating peptides muramyls existing vaccines antigens formulated in the presence of alum.
  • the adjuvant doses contain an amount between 2 and 120 ⁇ g per kg of body weight, or 0.1 to 6 mg per unit dose of water-soluble muramyl peptide of formula •
  • the muramyl peptide of the invention is l one of those entering the above formula in which the group R is a methyl group and the group R2 is a group
  • MDP derivatives are murabutide, murametide, muradimetide or MDP-threonyl
  • MDP-L-Lys-GDP Nac-Mur-L-Lys-D- iso Gin glyceryl-sn-dipalmitoyl
  • the preferred adjuvant doses are 6 to 60 ⁇ g per kg of body, that is, for a 50 kg person 0.3 to 3 mg per vaccinating dose.
  • the invention therefore relates to hepatitis vaccines absorbed on alum and improved by the combination of 2 to 120 ⁇ g per kg of body weight or 0.1 to 6 mg per vaccinating dose, preferably 6 to 60 ⁇ g per kg or 0.3 to 3 mg per dose, either of a compound of formula (I) or MDP-Lys - GDP
  • the vaccines of the invention can in particular be improved by a derivative of formula (I) in which
  • the group R is a methyl group
  • the group R 2 is an NH 2 group and more particularly still the murabutide the murametide, the muradimetide the MDP-threonine or the MDP-Lys-GDP
  • a vaccine according to the invention is characterized in that it contains a recombinant hepatitis B antigen, it can act
  • the hepatitis B vaccines of the invention preferably contain as antigen vaccinating the S region and all or part of the pre-S region, in particular the pre-S2 region of the virus surface antigen
  • the invention also relates to a method for manufacturing a vaccine having increased immunogenicity, characterized in that said vaccine consists of antigens absorbed on alum or formulated in a composition containing alum and in which are added 2 to 120 ⁇ g per kg of body weight or 0.1 to 6 mg per vaccinating dose, preferably between 6 and 60 ⁇ g per kg or 0.3 to 3 mg per muramyl vaccinating dose peptide of formula (I) above or MDP-Lys- GDP
  • the derivative of the muramyl peptide is chosen from murametide, murabutide, muradimetide, threonyl MDP.
  • the process of the invention makes it possible to manufacture improved vaccine compositions against hepatitis B, and also makes it possible to manufacture mixed vaccine compositions allowing to vaccinate a population at the same time against the hepatitis B virus or any mixed vaccine provided that it contains the recombinant antigen against hepatitis B and in particular a mixed vaccine hepatitis A + B or hepatitis A + B + C, as soon as their formulation contains alum
  • the invention relates to the use of 2 to 120 ⁇ g per kg of body weight or 0.1 to 6 mg per dose and preferably from 6 to 60 ⁇ g per kg of weight or 0.3 to 3 mg per vaccinating dose of a muramyl peptide of formula (1) above or of MDP-Lys-GDP, to improve the immunogemicity of a vaccine composed of recombinant
  • a vaccine comprising at least one hapten as a vaccinating antigen also forms part of the invention, as well as the vaccines containing as immunogen at least one hapten coupled or not with a carrier molecule Vaccines comprising at least one hapten and at least one recombinant antigen, one of them being absorbed on alum, associated with a muramyl peptide derivative, form part of the invention
  • T cells capable of proliferating in the presence of the antigen which have therefore been sensitized specifically to it are the cells responsible for the establishment of the immune memory. It is thanks to them that the vaccinated individual can immediately respond to aggression by the virus against which he sought to acquire protection It is therefore essential to offer a vaccine capable not only of inducing antibodies in the long term but also of memory T cells This allows vaccinated individuals to benefit from two lines of immune defense
  • FIG. 1 represents the proliferation of T cells measured by incorporation of tritiated thymidine, as a function of increasing quantity of hepatitis antigens.
  • Example 1 increase in specific T cells
  • the surprising effect obtained, and in particular that of rendering a currently non-immunogenic vaccine immunogenic in certain categories of the population, may be linked to the specific increase in a proliferative T-cell response.
  • This increase in the number of T cells sensitized to l antigen also makes it possible to evaluate the level of immunological memory which has been induced. This is illustrated by the following experiment. Mice were sensitized to the hepatitis B virus surface antigen, the proliferation of T cells was measured by incorporation of tritiated thymidine after incubation with the antigen present in the culture medium.
  • balb / C mice received 5 ⁇ g of HBS antigens by subcutaneous injection at the base of the tail in 0.1 ml of PBS buffer with or without adjuvants
  • the T lymphocytes were grown in PBS. or with increasing doses of HBS antigens as indicated on the abscissa.
  • the proliferative response was measured by incorporation of tritiated thymidine
  • the results of figure (I) are indicated as the average number of strokes per minute in t ⁇ plicates
  • Lys-GDP in the presence of alum can also be demonstrated by a relative increase in the response to specific immunoglobulins following the vaccination effect.
  • a hepatitis B recombinant vaccine absorbed on alum was used.
  • Various experiments have been carried out either on Swiss mice or on Balb / C mice, they constantly demonstrate the effect of the addition of murabutide on the Hepatitis B vaccines absorbed on alum.
  • Table 1 represents the cumulative results obtained in 6 similar experiments The anti-HBS antibody titers are expressed in milli-units per ml as a function of time A control group received two vaccinations, a second control group received three vaccinations and an experimental group received two injections of the vaccine supplemented with murabutide Table 1
  • the Swiss mice (8 per group) received by subcutaneous injection 1 ⁇ g of HBS antigen and 135 ⁇ g of alum with or without 100 ⁇ g of murabutide on day 0 They receive a booster injection on day 30 On day 60 only on control group with alum and without murabutide receives a third injection Antibodies are measured by EIA
  • Balb / C mice (8 per group) received by subcutaneous injection 1 ⁇ g of HBS antigen and 135 ⁇ g of alum with or without 100 ⁇ g of murametide on days 0 and 30. Antibodies are measured by ELISA on days 28 and 54.
  • HBS + alum (Control) 10,700 HBS + alum + Muradimetide 60 2,250 HBS + alum + MDP-Lys-GDP 35 2,600
  • the invention can also be applied to other antigens as shown in Example 5.
  • the antigen is a conjugate containing the ⁇ chain of cho ⁇ ogo ⁇ atrope hormone (hCG) coupled to the anatoxme toxoid (TT) (20% ⁇ HCG in the conjugate)
  • hCG cho ⁇ ogo ⁇ atrope hormone
  • TT anatoxme toxoid
  • Balb / C mice received subcutaneously 10 ⁇ g of ⁇ HCG conjugated to anatoxme
  • the antigen was administered either alone or in a Freund's Incomplete emulsion (FIA) or with alum (200 ⁇ g ) either with Murabutide (100 ⁇ g) or with alum and Murabutide Antibodies combining with HCG were measured by ELISA on day 20
  • the conjugate ⁇ HCG-TT is administered absorbed on alum and the results obtained shown in table 4 ci -after
  • Example 5 The data obtained in Example 5 are very much reinforced by those described in Example 6 below.
  • Example 6 Haptene-carner system where the muramyl peptide / alum association makes it possible to obtain high antibody titers but especially biologically active antibodies essential result for successful vaccination
  • Example 6 the purpose of the vaccination is to obtain antibodies capable of neutralizing the biological activity of a hormone
  • This hormone is a decapeptide produced by the hypothalamus and is absolutely not immunogenic Even after coupling on a carrier molecule "Carrier", it is unable after several injections to induce the production of a significant level of antibodies.
  • LH-RH The hormone considered called Luteineizmg Hormone - Releasing Hormone or LH-RH is synthesized centrally in the hypothalamus and following a cascade of interactions, it fully controls the synthesis of sex hormones in the male or female and in particular the production of testosterone Consequently, LH-RH controls the development and functioning of the testes, prostate and seminal vesicles If the level of LH-RH is low but especially for what interests us, if its activity is neutralized by biologically active antibodies, there is a decrease in the level of circulating testosterone and mvolution of the sexual organs II has been shown by many authors and in all the tested species (mouse, rat and guinea pig, cattle), that a conjugate LH-RH on tetanus toxoid (LH-RH-TT) only allows biologically active antibodies (i.e.
  • Examples 5 and 6 described above show that the association of muramyl peptides with antigens absorbed on alum is particularly advantageous in the case where the vaccinating principle is a hapten requiring coupling with a carrier molecule This case can arise when the the vaccinating principle is a peptide, a weakly immunogenic protein or a sugar.

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Abstract

Vaccins composés d'antigènes absorbés sur alum ou formulés dans une composition contenant de l'alum présentant une immunogénicité accrue comparée à celle des vaccins existant et caractérisés en ce qu'ils sont associés à 2 à 120 mu g par kg ou 0,1 à 6 mg par dose préférentiellement entre 6 et 60 mu g par kg ou 0,3 à 3 mg par dose d'un muramyl peptide hydrosoluble.

Description

VACCIN PRESENTANT UNE IM UNOGENICITE ACCRUE
La présente invention concerne un perfectionnement aux vaccins contenant de l'alum dans leurs compositions et dans lesquels l'antigène peut être partiellement ou totalement absorbé sur alum. Le perfectionnement consiste en l'association dans la composition constitutive de ces vaccins de 2 à 120 μg par kg de poids corporel ou 0, 1 à 6 mg par dose, de muramyl peptide ; ces vaccins ainsi perfectionnés ont notamment l'avantage de conférer une immunité accrue de telle façon que le nombre d'injections nécessaires à l'immunisation soit réduit. Les seuls immuno adjuvants actuellement utilisés dans les vaccins humains sont les composés à base d'aluminium tels que l'hydroxyde ou les phosphates d'aluminium (alum).
C'est le cas notamment de différents vaccins dont le principe actif est constitué d'un antigène obtenu par recombinaison génétique m vitro, tel Havrix, vaccin contre l'hépatite A dont le principe actif est un antigène obtenu à partir d'une souche du virus de l'hépatite A cultivée en culture cellulaire, et contenant de l'hydroxyde d'aluminium à raison de 1 ,5 mg par dose (0,5 mg d aluminium) et commercialisé par la société Smith Kline & French (6, Esplanade Charles De Gaulle, 92731 Nanterre Cedex) sous la dénomination commerciale d'Havrix. Deux administrations effectuées à un mois d'intervalle permettent d'induire une séroconversion chez 98% des individus.
Trois vaccins recombinants contre le virus de l'hépatite B sont actuellement commercialisés, il s agit de
- Genhevac B de Pasteur Méπeux Sérums et Vaccins (58, avenue Leclerc 69007 LYON FRANCE) lequel vaccin contient au maximum 3.5 mg d'hydroxyde d'aluminium par dose,
- Engerix B, commercialisé par Smith, Kime & French contenant 1.9 mg d'hydroxyde d'aluminium par dose,
- Recombivax HB commercialisé par Merck, Sharp et Dhome contenant 1.5 mg d'hydroxyde d'aluminium par dose. Les vaccins contre l'hépatite B cités ci-dessus ne sont efficaces qu'après au moins trois injections à 0, 30 et 60 ou 180 jours suivies d'un rappel obligatoire au bout d'un an , en outre un certain nombre de sujets sont peu répondeurs ou non répondeurs Dans la population totale ils représentent environ 5% et la capacité d'obtenir une séroconversion dépend beaucoup de l'âge du sujet, elle est déjà significativement plus faible à partir de 30-35 ans De plus il existe des groupes particulièrement peu répondeurs, ce sont les hémodialysés (30 à 45% de cette population) et les transplantés rénaux dont 75 à 95% d'entre eux ne répondent pas aux vaccins Différents travaux ont étudié cette résistance à l'immunisation par des vaccins anti hépatite B il faut citer les travaux de Stevens et al (1 ) Zacnoval et al (2) Grob PJ et al (3) Ce problème de non réponse à un vaccin contre l'hépatite B devient extrêmement grave dans les pays où l'endémie de cette infection virale est importante et où environ 5% de la population représente un nombre d'individus considérable, elle est en outre particulièrement critique dans les populations à risques telles les hémodialysés qui sont justement amenés a subir de nombreuses transfusions sanguines avec les risques de contamination virale subséquents Enfin le fait d'avoir a pratiquer au minimum trois injections SUIVI d'un rappel pour immuniser les patients repondeurs, la quatrième injection venant un an après la première représente un suivi particulièrement difficile et à risques
Le problème de la mise au point d'un vaccin qui puisse d une part conférer aux non répondeurs existants une immunisation contre une infection au virus de l'hépatite et d'autre part permettre de diminuer le nombre de doses vaccinantes chez des répondeurs normaux permettant un suivi et une prophylaxie beaucoup plus rigoureuse dans les zones endémiques ou les populations à risque s'avère une nécessité médicale Un autre problème posé pour la prophylaxie des hépatites dans les zones endémiques est la constitution d'un vaccin mixte contre les différentes hépatites et notamment les hépatites A et B Aujourd'hui la double vaccination contre les hépatites A et B nécessite six injections dont quatre pour l'hépatite B et deux pour l'hépatite A , aussi la prophylaxie des hépatites serait avantageusement améliorée par
- l'amélioration du pouvoir immunogène des vaccins recombinants contre l'hépatite B, - l'existence d'un vaccin mixte hépatite B + hépatite A permettant en un nombre minimum d'injections d'obtenir une immunisation contre l'infection par ces deux virus ce qui aujourd'hui est impossible compte tenu du pouvoir immunisant des vaccins actuels contre l'hépatite B,
- la possibilité d'immuniser les sujets non répondeurs, - la possibilité d'établir une prophylaxie après 1 ou 2 injections chez des répondeurs normaux,
- la possibilité d'établir une prophylaxie ou une immunisation quand le principe actif du vaccin est un haptène ou de façon plus générale une molécule difficilement immunogène. Certains muramyl peptides comme le murabutide ou Nac-Mur-L-
Ala-D-GIn-n-méthyl-ester et le Muramétide ou Nac-Mur-L-Ala-D-GIn méthyl ester ont déjà été développés en essais précliniques d'efficacité et de toxicité aiguè, subaiguë et chronique ainsi que dans des essais de phase 1 chez l'homme ; une excellente tolérance a été démontrée suite à une administration à plus de 200 sujets pour le Murabutide et 50 sujets pour le Muramétide Afin de résoudre le problème posé ci-dessus d'améliorer les vaccins notamment ceux existant contre l'hépatite B ou de créer un vaccin mixte contre les hépatites présentant une immunogénicité accrue permettant de réduire le nombre d'injections d'une part et de protéger contre une infection des sujets qui étaient jusqu'à présent non répondeurs avec les vaccins classiques d'autre part, les inventeurs ont eu l'idée d'associer des muramyls peptides aux vaccins existants dont les antigènes sont formulés en présence d'alum. Les doses adjuvantes contiennent une quantité comprise entre 2 et 120 μg par kg de poids corporel, ou 0,1 à 6 mg par dose unitaire de muramyl peptide hydrosoluble de formule •
R - CH- C0 C- NH-CH-C0-R1 \
(CH2)2 I
COR 2 dans laquelle le groupe R est un hydrogène ou un groupe méthyl ; X est un résidu L-alanyl ou L-thréonyl, et R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre, des groupes hydroxyle, amino, 0(CH2)XH avec „ = 1 , 2, 3 ou 4, étant entendu que, lorsque X est un résidu L-alanyle, l'un au moins de ces deux groupes R1 et R2 est toujours un groupe 0(CH2)XH tel que précédemment défini Plus particulièrement encore le muramyl peptide de l'invention est l'un de ceux entrant dans la formule ci-dessus dans laquelle le groupe R est un groupe méthyl et le groupe R2 est un groupe
NH2.
Dans cette formule les dérivés de MDP préférés sont le murabutide, le muramétide, le muradimétide ou le MDP-thréonyle Un autre dérivé du MDP est également préféré est le MDP-L-Lys-GDP (Nac- Mur-L-Lys-D-iso Gin glyceryl-sn-dipalmitoyl) qui a la propriété d'être hydrosoluble.
Les doses adjuvantes préférées sont de 6 à 60 μg par kg corporel soit, pour une personne de 50 kg de 0,3 à 3 mg par dose vaccinante.
La combinaison d'un dérivé du MDP tel que décrit ci-dessus avec un vaccin hépatite B contenant des antigènes obtenus par recombinaison génétique et absorbés sur hydroxyde d'aluminium (Alum) est particulièrement intéressante - soit pour l'obtention d'un vaccin hépatite B recombinant efficace en deux injections au lieu des trois ou quatres aujourd'hui nécessaires dans les vaccins existants,
- soit pour formuler un vaccin mixte notamment hépatite A + hépatite B, permettant de vacciner une population avec un nombre restreint d'injections,
- soit d'immuniser des populations qui étaient jusqu'alors constituées de sujets non répondeurs au vaccin existant, et notamment les hémodialysés ou les transplantés rénaux L'invention est donc relative aux vaccins hépatite absorbés sur alum et améliorés par l'association de 2 à 120 μg par kg de poids corporel ou 0,1 à 6 mg par dose vaccinante, préférentiellement de 6 à 60 μg par kg ou 0,3 à 3 mg par dose soit d'un composé de formule (I) soit le MDP-Lys- GDP Les vaccins de l'invention peuvent en particulier être améliorés par un dérivé de formule (I) dans lequel
- le groupe R est un groupe méthyl, et
- le groupe R2 est un groupe NH2 et plus particulièrement encore le murabutide le muramétide, le muradimétide le MDP-thréonine ou le MDP-Lys-GDP
Un vaccin selon l'invention est caractérisé en ce qu'il contient un antigène de l'hépatite B recombinant , il peut s agir
- soit d'un vaccin hépatite B
- soit d'un vaccin mixte hépatite A+B - soit de tout autre vaccin mixte, pourvu qu'il contienne l'antigène recombinant contre l'hépatite B
Les vaccins contre l'hépatite B de l'invention contiennent préférentiellement comme antigène vaccinant la région S et tout ou partie de la région pré-S, en particulier la région pré-S2 de l'antigène de surface du virus
L'invention est également relative à un procédé de fabrication d'un vaccin présentant une immunogénicité accrue caractérisée en ce que ledit vaccin est constitué d'antigènes absorbés sur alum ou formulés dans une composition contenant de I alum et dans laquelle sont ajoutés 2 à 120 μg par kg de poids corporel ou 0, 1 à 6 mg par dose vaccinante, préférentiellement entre 6 et 60 μg par kg ou 0,3 à 3 mg par dose vaccinante de muramyl peptide de formule (I) ci-dessus ou le MDP-Lys- GDP
Avantageusement le dérivé du muramyl peptide est choisi parmi le muramétide, le murabutide, le muradimétide, le MDP thréonyle Le procédé de l'invention permet de fabriquer des compositions vaccinantes améliorées contre l'hépatite B, et permet également de fabriquer des compositions vaccinantes mixtes permettant de vacciner une population à la fois contre le virus de l'hépatite B ou tout vaccin mixte pourvu qu'il contienne l'antigène recombinant contre l'hépatite B et notamment un vaccin mixte hépatite A+B ou hépatite A+B+C, dès lors que leur formulation contienne de l'alum Enfin l'invention est relative à l'utilisation de 2 à 120 μg par kg de poids corporel ou 0,1 à 6 mg par dose et de préférence de 6 à 60 μg par kg de poids ou 0,3 à 3 mg par dose vaccinante d'un muramyl peptide de formule (1 ) ci-dessus ou de MDP-Lys-GDP, pour améliorer I immunogémcité d'un vaccin composé d antigènes recombinants absorbés sur alum ou formulés dans une composition contenant de l'alum Cette utilisation s applique tout particulièrement au vaccin recombinant contre I hépatite B ou à un vaccin mixte pourvu qu'il contienne I antigène recombinant contre l'hépatite B et notamment un vaccin mixte hépatite A+B ou hépatite A+B+C, dès lors que leur formulation contienne de I alum Dans cette utilisation sont plus particulièrement préférés le murabutide le muramétide, le muradimétide et le MDP thréonyle La vaccination à l'égard de molécules de petites tailles, comme les haptènes, est problématique compte tenu de leur faible immunogénicité Afin de stimuler cette dernière l'haptène peut être couplé à une molécule porteuse (« carrier » en anglais) , mais le risque est de provoquer une réponse à rencontre de la molécule porteuse au détriment de l'haptène L'utilisation de 0,1 à 6 mg par dose vaccinante, et de préférence 0.3 à 3 mg de muramylpeptides de formule (1 ) ou de MDP-Lys-GDP dans la fabrication d'un vaccin comprenant au moins un haptène comme antigène vaccinant fait également partie de l'invention, ainsi que les vaccins contenant comme immunogène au moins un haptène couplé ou non à une molécule porteuse Les vaccins comprenant au moins un haptène et au moins un antigène recombinant, l'un d'entre eux étant absorbés sur alum, associés à un dérivé de muramyl peptide, font partie de l'invention
Comme le montrent les exemples ci-dessous, non limitatifs et les figures, l'association d'un dérivé de formule (I) ou du MDP-Lys-GDP à l'alum d ans une composition vaccinante a pour effet d'induire
1 ) des cellules T spécifiques II est connu que les cellules T capables de proliférer en présence de l'antigène qui ont donc été sensibilisées spécifiquement à celui-ci sont les cellules responsables de l'établissement de la mémoire immunitaire C'est grâce à elles que l'individu vacciné peut répondre immédiatement à une agression par le virus vis-à-vis duquel il a cherché à acquérir une protection II est donc capital de proposer un vaccin capable non seulement d'induire durablement des anticorps mais également des cellules T mémoire Ceci permet aux individus vaccinés de bénéficier de deux lignes de défenses immunitaires
2) une synthèse accrue d'anticorps spécifiques Cette synthèse accrue se fait au détriment de la synthèse d'IgE qui sont connues pour les risques qu'elles entraînent de provoquer des réactions de nature allergiques Les exemples suivants illustrent la capacité des divers muramyl peptides de donner un effet de synergie avec l'alum
3) d'induire une réponse spécifique contre un haptène utilisé comme immunogène dans un vaccin
Dans tout ce qui précède, ces effets sont plus particulièrement induits quant le rapport poids/poids entre l'alum et les muramylpeptides reste à l'intérieur d'une certaine fourchette qui est de 0,15 à 35 et de préférence 1 et 4-5 10 Ce rapport est calculé sur les quantités suivantes par dose vaccinante
- 1 à 3,5 mg d'alum, - 0, 1 à 6 mg de muramylpeptide
La figure et les exemples ci-après illustrent le perfectionnement apportée par l'invention sans la limiter.
La figure 1 représente la prolifération des cellules T mesurée par incorporation de thymidine tritiée, en fonction de quantité croissante d'antigènes de l'hépatite.
Exemple 1 - augmentation de cellules T spécifiques
L'effet surprenant obtenu, et notamment celui de rendre immunogène un vaccin actuellement non immunogène dans certaines catégories de la population peut être lié à l'augmentation spécifique d'une réponse proliférative des cellules T. Cette augmentation du nombre de cellules T sensibilisées à l'antigène permet aussi d'évaluer le niveau de mémoire immunologique qui a été induit Ceci est illustré par l'expérience suivante . Des souris ont été sensibilisées à l'antigène de surface de virus de l'hépatite B , la prolifération des cellules T a été mesurée par incorporation de thymidine tritiée après incubation avec l'antigène présent dans le milieu de culture. La figure 1 représente cette réponse dans quatre cas de figure en ce qui concerne l'adjuvant utilisé a) pas d'adjuvant (carrés blancs); b) de l'alum seul à la dose de 40 μg (triangles noirs), c) du murabutide seul à la dose de 100 μg (cercles blancs) et d) l'association du murabutide à 100 μg et de l'alum à 40 μg (carrés noirs) Les résultats indiqués sur cette figure montrent que l'alum seul est capable d'augmenter la prolifération des cellules T mais que la combinaison avec le murabutide induit une réponse 3 fois plus élevée à celle obtenue en présence d'alum seul comme le montre la mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (45000 CPM versus 15000)
Le protocole de cette expérience est le suivant les souris balb/C ont reçues 5 μg d antigènes HBS par injection sous cutanée à la base de la queue dans 0, 1 ml de tampon PBS avec ou sans adjuvants Deux semaines plus tard, les lymphocytes T ont été cultivées dans du PBS. ou avec des doses croissantes d'antigènes HBS comme indiqué en abscisse. Après cinq jours la réponse proliférative a été mesurée par incorporation de thymidine tritiée Les résultats de la figure (I) sont indiqués comme le nombre de coups moyen par minute dans des tπplicates
Exemple 2 : Effet des murabutides sur la synthèse d'anticorps spécifiques L'effet de l'addition d'un dérivé de MDP de formule (I) ou de MDP-
Lys-GDP en présence d'alum peut également être démontrée par une augmentation relative de la réponse en immunoglobulines spécifiques suite à l'effet vaccinant. Un vaccin recombiπaπt Hépatite B absorbé sur alum a été utilisé. Différentes expériences ont été réalisées soit sur des souris Swiss soit sur des souris Balb/C , elles démontrent de façon constante l'effet de l'addition de murabutide sur les vaccins Hépatite B absorbés sur alum De plus, ces expériences ont montré de façon reproductible que le taux des anticorps de type IgG est augmenté tandis que celui des anticorps IgE est diminué indiquant que l'utilisation du muramyl peptide a permis de réduire les risques du type allergique au vaccin a) Deux groupes de 40 souris ont été immunisées avec deux injections de vaccin à 1 mois d'intervalle en présence ou en absence de Murabutide 70% des animaux traités au murabutide ont des titres anticorps (mesurés en utilisant la trousse EIA AUSAB, Laboratoires Abbot) supérieurs à 50 mUI et ceci durant plus de 4 mois, alors que seulement 25% des témoins montrent ce titre, qui de plus est transitoire car il est déjà effondré après 2 mois. b) Le tableau 1 représente le cumul des résultats obtenus dans 6 expériences similaires Les titres en anticorps anti-HBS sont exprimés en milli-unités par ml en fonction du temps Un groupe témoin a reçu deux vaccinations, un deuxième groupe témoin a reçu trois vaccinations et un groupe expérimental a reçu deux injections du vaccin additionné de murabutide Tableau 1
Immunisation Anticorps Anticorps Anticorps Anticorps J20 J40 J70 J140
HBS+alum 30 120 170 250 2 injections
HBS + alum 30 120 950 1200 3 injections
HBS + alum + Murabutide 40 300 1500 2600 2 injections
Les souris swiss (8 par groupe) ont reçu par injection sous-cutanée 1 μg d'antigène HBS et 135 μg d'alum avec ou sans 100 μg de murabutide au jour 0 Elles reçoivent une injection rappel au jour 30 Au jour 60 seul le groupe témoin avec de l'alum et sans murabutide reçoit une troisième injection Les anticorps sont mesurés par EIA
Il apparaît clairement que les animaux ayant reçu uniquement deux vaccinations avec le murabutide ont un titre en anticorps supérieur à celui des animaux ayant reçu trois injections du vaccin seul, quant aux contrôles ayant reçus deux injections, le titre de leurs anticorps reste modeste et décroît rapidement
Ces expériences montrent que l'amélioration des vaccins anti- Hepatites B existants par I addition d'un muramyl peptide tel que défini dans la formule (I) et plus particulièrement du muramétide, du murabutide du muradimétide, ou du MDP-Lys-GDP peut permettre de résoudre un problème posé aussi important que de vacciner en 1 ou 2 injections les individus répondeurs et de pouvoir vacciner les populations actuellement résistantes à la vaccination soit naturellement soit à la suite de traitements tels l'hémodialyse ou une transplantation
Exemple 3 Effet du muramétide sur la synthèse d'anticorps spécifiques
Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant le muramétide et le muradimétide comme il est montré par les expériences suivantes
Des souris Balb/C (8 par groupe) ont reçu par injection sous cutanée 1 μg d'antigène HBS et 135 μg d'alum avec ou sans 100 μg de muramétide aux jours 0 et 30. Les anticorps sont mesurés par ELISA aux jours 28 et 54.
Tableau 2
Immunisation Anticorps J28 Anticorps J54
HBS + alum (Témoin) 35 520
HBS + alum + 245 2700 Muramétide
Exemple 4 : Effets du muradimétide et du MDP-Lys-GDP sur la synthèse d'anticorps spécifiques
Dans une expérience séparée effectuée chez des souris Swiss recevant les mêmes doses de vaccin et d'adjuvant que celles indiquées dans l'exemple 3, le muradimétide et le MDP-Lys-GDP ont été capables d'induire des réponses primaires et secondaires 3 à 4 fois plus élevées que celles des témoins.
Tableau 3
Immunisation Anticorps J21 Anticorps J80
HBS + alum (Témoin) 10 700 HBS + alum + Muradimétide 60 2250 HBS + alum +MDP-Lys-GDP 35 2600
L'invention peut aussi s'appliquer à d'autres antigènes comme le montre l'exemple 5.
Exemple 5 Efficacité de l'association de Murabutide et de l'alum pour augmenter la réponse humorale à un vaccin βHCG (βHCG conjugué à l'anatoxme tétanigue)
L'antigène est un conjugué contenant de la chaîne β de l'hormone choπogoπatrope (βHCG) couplée à l'anatoxme tétanique (TT) (20% de βHCG dans le conjugué) Ce conjugué est destiné à être utilise comme vaccin contraceptif car les anticorps anti-HCG bloquent I implantation et le développement de l'oeuf
Des souris Balb/C (groupes de 8 femelles) ont reçu par voie sous-cutanée 10μg de βHCG conjugué à l'anatoxme L'antigène a été administré soit seul soit dans une émulsion de Freund's Incomplet (FIA) soit avec alum (200 μg) soit avec du Murabutide (100 μg) soit avec alum et Murabutide Les anticorps se combinant à HCG ont été mesurés par ELISA au jour 20 Le conjugué βHCG-TT est administré absorbé sur l'alum et les résultats obtenus indiqués dans le tableau 4 ci-après
Tableau 4
Efficacité de l'association de Murabutide et de l'alum pour augmenter la réponse humorale à un vaccin βHCG (βHCG conjugué à l'aπatoxine tétanique)
Adjuvant Réponse anticorps au jour 20
Aucun (Témoin) 12 500
FIA (huile) 26 000
Alum 15 500
Murabutide 53 000
Alum + Murabutide 200 000
Il est clair qu après une seule injection de vaccin absorbe sur alum et adjuvante par le Murabutide on obtient des titres très élevés d anticorps qui reconnaissent l'hormone HCG Des expériences séparées nous ont montré que ces anticorps sont biologiquement actifs et neutralisent l'activité de HCG
Les données obtenues dans l'exemple 5 sont très renforcées par celles décrites dans l'exemple 6 ci-dessous
Exemple 6 Système haptène-carner où l'association muramyl peptide/alum permet d'obtenir des titres anticorps élevés mais surtout des anticorps biologiquement actifs résultat essentiel pour le succès d une vaccination
Dans l'exemple 6, la vaccination a pour but d'obtenir des anticorps capables de neutraliser l'activité biologique d'une hormone Cette hormone est un décapeptide produit par l'hypothalamus et n est absolument pas immunogène Même après couplage sur une molécule porteuse « carrier », elle est incapable après plusieurs injections d'induire la production d'un taux notable d'anticorps. L'hormone considérée appelée Luteineizmg Hormone - Releasing Hormone ou LH-RH est synthétisée au niveau central dans l'hypothalamus et à la suite d'une cascade d'interactions, elle contrôle entièrement la synthèse des hormones sexuelles chez le mâle ou la femelle et en particulier la production de la testostérone Par voie de conséquence, LH-RH contrôle le développement et le fonctionnement des testicules, de la prostate et des vésicules séminales Si le taux de LH-RH est faible mais surtout pour ce qui nous intéresse, si son activité est neutralisée par des anticorps biologiquement actifs, il y a diminution du taux de testostérone circulante et mvolution des organes sexuels II a été montré par de nombreux auteurs et dans toutes les espèces testées (souris, rat et cobaye, bétail), qu'un conjugué LH-RH sur l'anatoxme tétanique (LH-RH-TT) ne permet d'obtenir des anticorps biologiquement actifs (c est-a-dire capables de neutraliser l'activité de LH-RH) que s'il est administré combiné à une préparation adjuvante très puissante La préparation généralement utilisée est l'adjuvant complet de Freund (FCA) dont il est également bien connu que ses effets secondaires importants interdisent absolument l'utilisation humaine ou vétérinaire Or il existe des cancers (cancers de la prostate) dont le développement est lié à la sécrétion de testostérone II est donc important si l'on veut mettre au point un traitement immunologique par vaccination de ce type de cancer, de trouver une formulation efficace de la LH-RH compatible avec une administration clinique Le même besoin existe si l'on veut utiliser chez l'animal un vaccin anti-LH-RH afin de provoquer un effet de castration L'association muramylpeptide/alum répond à ces exigences comme le démontre l'exemple suivant
Dans l'expérience décrite, des rats mâles de race Sprague-Dawley et pesant 250 g ont reçu à 30 jours d'intervalle, trois injections de conjugué LH-RH-TT (50 μg) Ce conjugué a été administré a) seul, b) dans un émulsion de FCA, c) mélangé à 100 μg de muramétide, d) absorbé sur alum (400 μg), e) absorbé sur alum et additionné de muramétide
Les anticorps anti-LH-RH sont mesurés à divers temps au cours de I expérience ainsi que les taux de testostérone sanguine Après 130 jours, les animaux sont sacrifiés et leurs organes sexuels prélevés pour l'étude histologique Les résultats d'une expérience caractéristique sont consignés dans le tableau 5 suivant Ils montrent que les taux d'anticorps les plus élevés ont été obtenus dans le groupe recevant le FCA mais aussi dans le dernier groupe (alum/muramétide) De façon encore plus intéressante il n'y a que dans ces deux groupes que l'on observe une baisse considérable du taux de testostérone et une mvolution des organes sexuels
Les résultats de l'association Muramétide-Alum sur la production d anticorps aπti-LH-RH biologiquement actifs sont indiqués dans le tableau 5 ci-après
Tableau 5
Titre anβcorp. î anti-LR-RH Taux de testostérone en Histologie des organes 0 obtenus par B Isa aux jours ng/ml sérum aux jours Testicules Prostate Vésicules séminal
IMMUNISATION Poids 1 Nombre Taille 1 Nombre Taille 1 Nomb
20 40 70 130 20 40 70 130 moyen d'animaux moyenne d'animaux oy-tvne d'anima atteints (mm) atteints (mm) atteint
LH-RH-TT <1000 1200 3800 3200 3,5 1,85 1,50 1,10 2 0/6 2,67 0/6 6,5 0/6
LH-RH-TT + FCA 1000 7500 25000 22000 2,80 0,60 0,20 0,10 0,4 5/6 NT" NT
LH-RH-TT + Muramétide <ιooo 1100 350O 3500 2,95 1,50 1,35 1,5 1,95 0/6 NT NT
LH-RH-TT + Alum 1000 3450 13000 7100 2,70 0,70 0,70 0,80 1,55 1/6 2,8 1/6 5,6 1/6
LH-RH-TT + Alum + 1300 9800 28000 15000 2,55 0,50 0,07 0,14 0,5 5/6 2,08 5/6 3,6 5/6 Muramétide
0 Les organes ont été prélevés puis pesés ou mesurés Après avoir subi une préparation adéquate, ils ont été soumis à des examens anatomopathologiques Les lésions observées chez les animaux atteints sont caractéristiques d'une absence de stimulation par la testostérone ° NT = non testés
Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant le murabutide ou le MDP-lys-GDP associés à l'alum
Les exemples 5 et 6 décrits ci-dessus montrent que l'association de muramyl peptides avec des antigènes absorbés sur alum est particulièrement avantageuse dans le cas où le principe vaccinant est un haptène nécessitant le couplage à une molécule porteuse Ce cas peut se présenter quant le principe vaccinant est un peptide, une protéine peu immunogène ou un sucre.
Sur la base de ces résultats, l'homme du métier peut facilement envisager la réalisation de vaccins polyvalents contenant, outre un haptène, un autre antigène vaccinant, à partir du moment où l'une des molécules vaccinantes est absorbée sur alum et où la conjonction vaccinante contient-un dérivé du MDP selon l'invention
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Claims

Revendications
1 Vaccins composés d'antigènes absorbés sur alum ou formulés dans une composition contenant de l'alum présentant une immunogenicite accrue comparée à celle des vaccins existants et caractérisés en ce qu'ils sont associés à 2 à 120 μg par kg de poids corporel ou 0,1 à 6 mg par dose vaccinante :
- soit d'un muramyl peptide de formule
R - CH-C0 C-NH-CH-C0-R1
\
(CH2)2 I
COR 2 dans laquelle le groupe R est un hydrogène ou un groupe méthyl , X est un résidu L-alanyle ou L-thréonyle, et R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre, des groupes hydroxyle, amino, 0(CH2)XH avec „ = 1 , 2, 3 ou 4, étant entendu que, lorsque X est un résidu L-alaπyle, l'un au moins de ces deux groupes R1 et R2 est toujours un groupe 0(CH2)XH tel que précédemment défini
- soit le MDP-Lys-GDP - (II)
2 Vaccins selon la revendication 1 caractérisé en ce que la dose vaccinante contient 6 à 60 μg par kg de poids corporel ou 0,3 à 3 mg par dose vaccinante d'un composé de formule (I) ou (II)
3 Vaccins selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le muramyl peptide est l'un de ceux entrant dans la formule de la revendication 1 dans laquelle - le groupe R est un groupe méthyl et
- le groupe R2 est un groupe NH2
4. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le muramyl peptide est choisi parmi le murabutide, le muramétide, le muradimétide ou le MDP-thréonine.
5 Vaccin selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qui le vaccin permet la prophylaxie simultanée des hépatites A, B et C
6. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qui le vaccin permet la prophylaxie simultanée des hépatites A et B 7 Vaccin selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qui le vaccin permet la prophylaxie de l'hépatite B, notamment chez les hémodialysés, les transplantés rénaux ou autres sujets mauvais répondeurs aux vaccinations classiques
8 Vaccin selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'antigène est constitué de la région S et tout ou partie de la région pré-S de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B
9 Vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le rapport poids d'alum par rapport au poids du dérivé de muramylpeptide est compris entre 0,15 et 35 10 Vaccin selon la revendication 9 caractérisé en ce que le rapport poids d'alum par rapport au poids du dérivé, de muramylpeptide est compris entre 1 et 10
11 Procédé de fabrication d'un vaccin présentant une immunogenicite accrue, ledit vaccin étant constitué d'antigènes absorbés sur alum ou formulés dans une composition contenant de l'alum, caractérisé en ce la composition contient en outre 2 à 120 μg par kg de poids corporel ou 0, 1 à 6 mg par dose vaccinante
- soit d'un muramyl peptide de formule (I) (CH2)2 |
COR 2
- soit du MDP-Lys-GDP (II) dans laquelle le groupe R est un hydrogène ou un groupe méthyl ; X est un résidu L-alanyle ou L-thréonyle, et R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre, des groupes hydroxyles, amino, 0(CH2)XH avec x = 1 , 2, 3 ou 4, étant entendu que, lorsque X est un résidu L-alanyle, l'un au moins de ces deux groupes R1 et R2 est toujours un groupe 0(CH2)XH tel que précédemment défini.
12 Procédé selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que la dose vaccinante contient 6 à 60 μg par kg ou 0,3 à 3 mg par dose d'un composé de formule (I) ou (II).
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le muramyl peptide est l'un de ceux entrant dans la formule de la revendication dans laquelle : - le groupe R est un groupe méthyl, et
- le groupe R2 est un groupe NH2
14 Procédé selon la revendication 11 à 13 caractérisé en ce que muramyl peptide est choisi parmi le murabutide, le muramétide, le muradimétide ou le MDP-thréonine 15 Procédé selon l'une des revendications 11 à 14 caractérisé en ce que le vaccin est choisi parmi
- un vaccin anti-hépatite B, - un vaccin mixte contenant au moins un antigène spécifique du virus de l'hépatite B,
- un vaccin mixte contenant au moins un haptène couplé ou non à une molécule porteuse 16 Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'antigène spécifique du virus de l'hépatite B est un antigène recombinant
17 Utilisation de 2 à 120 par kg de poids corporel ou 0,1 à 6 mg par dose vaccinante d'un muramyl peptide de formule (I) ou (II) dans la fabrication d'un vaccin composé d'antigènes absorbés sur l-alum ou formulés dans une composition contenant de l'alum
18 Utilisation de 2 à 120 par kg de poids corporel ou 0 1 à 6 mg par dose vaccinante d'un muramyl peptide de formule (I) ou (II) dans la fabrication d'un vaccin contenant au moins un haptène couplé ou non à une molécule porteuse absorbé sur alum ou formulé dans une composition contenant de l'alum
19 Utilisation selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit vaccin contient au moins un haptène et antigène recombinant
20 Utilisation selon les revendications 17 à 19 caractérisée en ce que le muramyl peptide est l'un de ceux entrant dans la formule (I) dans laquelle
- le groupe R est un groupe méthyl, et
- le groupe R2 est un groupe NH2
21 Utilisation selon l'une des revendications € 1 7-ΘU à 20 caractéπséee en ce que le muramyl peptide est choisi parmi le muramétide, le murabutide, le muradimétide ou le MDP-Thréonine
22 Utilisation selon l'une des revendications 17 à 20 caractérisé en ce que le vaccin permet une prophylaxie d'une hépatite chez les patients non répondeurs ou mauvais répondeurs aux vaccins usuels notamment chez les hémodyalisés ou les transplantés rénaux 23 Utilisation selon l'une des revendications 17 à 20 caractérisé en ce que le vaccin permet une prophylaxie après une ou deux administrations au heu de trois chez des répondeurs normaux
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