KR20010021622A - 보조제로서의 모노글리세리드 또는 디글리세리드 유도체를함유하는 항원 전달계 - Google Patents

보조제로서의 모노글리세리드 또는 디글리세리드 유도체를함유하는 항원 전달계 Download PDF

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KR20010021622A
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Abstract

항원의 투여, 특히 점막 투여를 위한 보조제 뿐만아니라 이러한 보조제를 항원 및 생리학적으로 허용가능한 부형제와 함께 함유하는 조성물이 기재되어 있다. 본 발명의 보조제 조성물을 사용하여 면역 반응을 유도 및 증강시키는 방법이 또한 기재되어 있다. 보조제는 하나 이상의 수용성 중합체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 (PEG2-30)을 함유하는 모노- 또는 디글리세리드를 포함한다. 항원은 보조제에 결합될 수 있다. 보조제는 또한 식물의 처리에도 사용될 수 있다.

Description

보조제로서의 모노글리세리드 또는 디글리세리드 유도체를 함유하는 항원 전달계 {Antigen Delivery System Comprising Monoglyceride or Diglyceride Derivatives As Adjuvant}
항원 또는 백신의 비경구적 투여 (근육내 및 피하 투여)가 통상 가장 효과적인 투여 경로로 간주되고 있다. 그러나, 주사에 의한 투여는 다수의 단점을 가지고 있다. 항원 또는 백신의 주사는 살균 주사기를 사용해야 하고 유자격자가 투여해야 하며, 특히 반복된 주사의 경우에 통증 및 자극을 일으킬 수도 있다. 이러한 투여 경로는 또한 감염의 위험을 야기한다. 더욱 중요한 것은, 개개인들이 종종 근육내 주사를 견디기 힘들어 하고, 근육내 주사가 주사 부위에서 경화 (조직의 경화), 출혈 및/또는 괴사 (조직의 국소사)를 일으킬 수 있다는 것이다.
점막은 뛰어난 항원 제시 세포인 다수의 수지상 세포를 함유한다. 점막은 또한 유림프 기관에 연결되어 점막-결합 유림프 조직이라 불리며, 이는 다른 점막 부위에 대한 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 이러한 점막의 일례는 필수적으로 단층의 상피 세포 (다열양의 상피)로 구성된 코 상피 막이며; 점막은 2 종의 유림프 조직인 아데노이드와 편도에 연결된다. 코 점막 아래에 모세혈관의 광범위한 망과 T 및 B 세포의 고 밀도는, 항원의 빠른 인식을 제공하고 급속한 면역학적 반응을 제공하기에 특히 적합하다.
다른 점막 표면을 통한 투여와 아울러, 약독화된 바이러스, 세균 및 기생충을 비내 투여하는 것은, 통상 비내 경로에 의해 숙주를 감염시키는 특정한 병원체에 대하여 시도되어 왔다. 이러한 경우에 상기와 같은 항원에 의한 면역 반응이 점막 표면을 통해 유발될 것으로 기대되는데, 그 이유는 백신의 변이된 생 병원체는 야생형 병원체의 자연적인 감염 경로를 따르고 준-임상적 감염을 통해 면역성을 일으키기 때문이다. 면역원성 조성물의 점막 투여 경로는 국소-생성된 항체 (분비형 IgA 항체)를 자극할 수 있고 비경구적 투여에 의해 유발된 문제점을 피할 수 있기 때문에, 이러한 투여 경도가 특히 중요하다. 또한, 점막 투여는 전형적으로 치료받는 환자를 포함한 비자격자에 의해서도 수행될 수 있고, 유아들도 대개 비경구적 투여에서와 같은 정도로 점막 투여를 싫어하지는 않는다. 약독화 및 변이된 생 병원체의 투여와 관련된 위험으로 인하여, 소단위 백신을 사용하는 것이 종종 요망된다. 그러나, 정제된 항원을 소단위 백신으로 점막 투여하는 것은 통상 면역 반응이 불량해지는 것과 연관된다.
항원의 전달을 위한 여러가지 부형제 체계가 개발되어 있다. 예를 들어 비내 또는 점막 투여를 위해 이러한 부형제 체계를 사용함에 있어서 부딛히는 문제점의 하나는, 항원 및/또는 백신이 부분적으로는 비강내에서의 짧은 접촉 시간으로 인하여 인식 없이, 즉 면역학적 반응을 자극하지 않은채로 흡수 및 분해된다는 것이다. 폴리에틸렌 글리콜 치환된 카프릴산/카프린산 글리세리드와 Tween 20(등록상표)의 혼합물이 점막 보조제로서 사용된다는 것이 기재되어 있다 (Gizurarson 등, Toxicology 107:61-68 (1996); Gizurarson 등, Vaccine Research 5:69-75 (1996); Gizurarson 등, Vaccine Research 6:41-47 (1997)); 그러나, 이러한 제제는 수용자에게 투여 부위에서 불쾌한 찌르는듯한 느낌을 일으킨다. 즉, 만족할만한 면역 반응을 생성하기 위하여 항원의 점막 투여를 위한 효과적인 제제가 요구되고 있다.
유럽 특허 제 0544612 A2호는 경구 또는 비내 투여될 수 있는 면역원 및 트리글리세리드를 함유하는 조성물을 개시하고 있다. 조성물은 면역원의 효과를 증강시킬 수 있다.
하나의 참고문헌 (미국 특허 제4,610,868호, 1986 년 9 월 9일)에는, 약물의 비경구적 투여를 위한 지질 매트릭스 담체가 기재되어 있다. 이러한 체계는 소수성 화합물, 양친매성 화합물 및 직경 500∼100000 nm의 구형 구조를 갖는 생활성제를 함유하는 지질 매트릭스 담체를 필요로 한다. 여기에서, 소수성 화합물은 글리세리드의 혼합물을 포함할 수 있으며, 양친매성 화합물은 스핑고리피드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 제제는 코 부위에 투여될 수도 있다. 이러한 체계는 코내에서 빠르게 제거되고 큰 구형 구조를 갖기 때문에 비내 제제로서 허용될 수 없다. 따라서, 이러한 체계는 생활성제가 방출되기 전에 섬모에 의해 위로 제거되어진다. 상기 특허는 본 발명에 따른 보조제 물질의 사용에 대해서 기재하고 있지 않다.
일본 특허 제309347/91호 (우선권 주장일 1991년 11월 25일)에는, 포화 또는 불포화 지방산의 C6-26잔기를 갖는 트리글리세리드로 이루어진 보조제를 사용하여 포유동물을 면역화할 수 있는, 면역원을 포함하는 경구 또는 비내 투여 면역원 조성물이 기재되어 있다. 포화 지방산의 사용으로는 본 발명에 따른 면역 반응을 유발할 수 없으며, 트리글리세리드의 사용은 보조제를 용해시킬 수 있는 하나의 친수성기를 갖거나 또는 항원을 보조제에 연결시킬 수 있는 가능성을 제공하지 못한다.
WO 94/17827호 (우선권주장일 1993년 2월 15일)에는, 점막을 통해 항원을 포유동물에 국소 투여하기 위한 제약학적 제제가 기재되어 있다. 보조제/부형제 제제는 (a) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에스테르, (b) 폴리옥시에틸렌 피마자유, (c) 카프릴/카프린 글리세리드 및 (d) 강글리오시드로부터 선택된다.
발명의 요약
본 발명은, 항원 및 백신의 투여, 특히 점막 투여를 위한 보조제로서 사용될 수 있는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 점막에 대한 항원의 점착성을 향상시킬 뿐만아니라 점막을 통한 항원의 흡수를 향상시킨다. 본 발명의 조성물을 사용하면, 상피 막을 허용될 수 없을 정도로 자극하지 않고도, 조성물의 수용자에게 전신적 (예: IgG 이소타입의 항체) 및 국소적 (예: IgA 이소타입의 분비형 항체) 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 식물에서 식물 면역 방어 체계를 자극하기 위한 보조제로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 점막에 적합하고 적은 부피로 항원의 필요량을 투여할 수 있는, 비내 투여를 위해 조절된 전달 체계를 제공한다.
본 발명은 항원 및 모노글리세리드, 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 글리세리드 0.01∼70 % v/v를 함유한 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 글리세리드는 하기 화학식 I을 갖는다:
상기 식에서, R1, R2및 R3은 포화 또는 불포화 C6-24지방산, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되며; 단 글리세리드는 R1, R2또는 R3에서 하나 이상의 수용성 중합체를 함유한다.
보조제는 소량의 트리글리세리드를 함유할 수 있다. 특별한 구현양태에서, 수용성 중합체는 2∼30개의 폴리옥시에틸렌 단위를 갖는 폴리옥시에틸렌의 PEG2-30잔기 또는 그의 유도체로 구성된다. 다른 구현양태에 있어서는, 기 R1, R2및 R3의 하나 또는 두개가 결합 항원으로 치환된다.
본 발명의 다른 구현양태에 있어서, 수용성 중합체는 3 내지 6개의 폴리옥시에틸렌 단위를 갖는 폴리옥시에틸렌의 PEG3-6잔기이다. 본 발명의 다른 구현양태에서, 글리세리드는 하기 화학식들로 구성된 군에서 선택된 구조를 갖는다:
상기 각각의 화학식에서, R1및 R2는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 특정한 구현양태에 있어서, R1, R2및 R3은 포화 C6-14지방산, 더욱 바람직하게는 포화 C8-10지방산으로부터 선택된다.
본 발명의 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 조절한다: 즉, 면역원성 또는 백신 조성물은 백신접종된 숙주의 항체 반응을 양적으로 및/또는 질적으로 향상시킬 수 있다. 이는 예를 들면 항원으로 면역시 생성되는 항체의 수를 증가시킴으로써 (예를 들어 양적 향상) 또는 면역 반응의 프로파일을 예컨대 Th1 반응으로부터 Th2 반응으로 변경시킴으로써 (예를 들어, 질적 향상) 달성될 수 있다.
본 발명은 또한, 항원 및 모노글리세리드, 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되고 상기 기재된 화학식 I 내지 V으로 표시되는 글리세리드 0.01∼70 %v/v를 함유한 보조제를 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 척추동물 숙주에 투여하는 것으로 구성된, 숙주의 체액성 및 세포 매개성 면역 반응을 유발 또는 증가시키는 방법에 관한 것이다, 특별한 구현양태에 있어서, 면역 반응은 조성물의 점막 투여에 의해 유발된다.
본 발명은 또한, 항원 및 모노글리세리드, 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되고 상기 기재된 화학식 I 내지 V으로 표시되는 글리세리드 0.01∼70 %v/v를 함유한 보조제를 포함하는 백신 조성물의 유효량을 척추동물 숙주에 투여하는 것으로 구성된, 방어 면역 반응을 위한 백신의 체액성 및/또는 세포 매개성 면역을 유발 또는 증가시키는 방법에 관한 것이다. 특정한 구현양태에 있어서, 면역 반응은 조성물의 점막 투여에 의해 유발된다.
면역 체계는 병원체를 공격하기 위한 많은 메카니즘을 사용한다; 그러나, 이러한 메카니즘의 모두가 면역후에 반드시 활성화되는 것은 아니다. 백신접종에 의해 유도되는 방어 면역성은, 병원체에 저항하거나 병원체를 제거하기 위해 적절한 면역 반응을 유발할 수 있는 백신의 능력에 의존된다. 병원체에 따라서, 이는 세포 매개성 및/또는 체액성 면역 반응을 필요로 할 수도 있다. 종종, 면역화되는 유기체에서 더욱 강한 면역 반응을 수득하고 항원-포함 작용제에 대한 숙주 내성을 강화시키기 위하여, 항원의 면역원성 효력을 증강시키는 것이 요망된다. 일반적으로, 항원과 함께 투여(동시에 또는 일시에 단독으로)되어 항원의 면역성을 증강시키는 물질은 보조제로서 알려져 있다. 본 발명의 조성물에 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "보조제"는 종래의 면역보강 효과 (예를 들어, 항체 반응을 증가 또는 변경시킴으로써 항원의 면역원성을 증강시키는 효과)를 갖는 조성물 뿐만아니라 적절한 조직 또는 세포에 대한 항원의 제시를 향상시키는 조성물 (예를 들어 항원 전달 부형제)을 포함하는 것으로 해석된다.
비내 투여를 위하여, 항원은 점막 또는 유림프 조직을 통해 면역담당 세포에 침투하거나 흡수되어, 그 결과 코 분비물에 의해 씻겨지지 않도록 점막에 투여되어야 한다. 항원은 또한 항원 제시 세포가 항원을 흡수하고 그것을 국소적인 유림프 체계에 운반할 수 있는 방식으로 코 점막상에 투여되어야 한다. 점막을 침투하기 위하여, 전달 부형제는 점막에 대해 특정한 정도의 생체적합성을 가져야 하며, 특정한 정도의 친수성 및 소수성을 가져야 한다.
본 명세서에 기재된 연구는 본 명세서에 기재된 조성물의 점막 보조제로서의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 항원 및 모노글리세리드, 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 글리세리드 0.01∼70 %v/v를 함유한 보조제를 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드는 치환될 수도 있다. 본 발명의 조성물에 혼입되는 모노글리세리드 및 디글리세리드는 하기 화학식 I로 표시된다:
<화학식 I>
상기 식에서, R1, R2및 R3은 포화 또는 불포화 C6-24지방산, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되며, 단 글리세리드는 하나 이상의 수용성 중합체를 함유한다. 보조제는 또한 소량의 트리글리세리드를 함유할 수 있다.
카프로산, 카프린산, 카프릴산, 아라키돈산, 프로피온산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산으로부터 유도된 지방산 잔기에 한정되지는 않지만 이들을 포함하는 임의의 포화 또는 불포화된 C6-24지방산이 선택될 수 있다. 지방산 잔기는 하나의 잔기 또는 둘 이상의 잔기의 혼합물일 수도 있다. 이들은 유지와 같이 천연 또는 합성원으로부터 유래될 수 있다. 통상적으로 구입가능한 글리세리드를 사용할 수 있거나, 또는 1;2;1,2;1,3과 같은 특정한 위치상에 지방산을 위치시키는 특이적 및 비-특이적 리파아제를 포함한 리파아제에 의해 글리세리드 및 특이한 라세미 구조를 갖는 글리세리드를 효소적으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 1 g 실리카겔상에 흡착된 글리세롤 (0.92 g)을 20 ml tBuOMe로 현탁시킨다. 비닐 카프릴레이트 (3.4 g) 및 라이조퍼스 델레마 (Rhizopus delemar)에서 유래된 리파아제 (50 mg)를 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 96 시간동안 교반하고, 반응 진행을 TLC에 의해 감시하였다. 여과에 의해 고체 성분을 제거하고 용매를 증발시킨 후에, 조 반응 혼합물을 수득하였으며, 이는 약 91 %의 1,3 디카프릴린 글리세리드를 함유한다.
수용성 중합체는 수용액 중에서 더욱 높은 친수성 (바람직하게는 계면활성제를 사용하지 않고도 완전히 용해될 수 있는 성질)을 글리세리드에 부여할 수 있는 것, 특별하게는 백신 투여를 위해 생리적으로 허용가능한 부형제일 수 있다, 바람직한 수용성 중합체는 투여되는 조직, 특히 점막에 대해 생체적합성을 갖는 것이다. 이러한 특성을 갖는 적절한 수용성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 유도체 (아미노-PEG, 친핵성-PEG, PEG-티올, PEG-숙시네이트, PEG-숙신이미드, PEG-트레실레이트, 카르복시메틸화-PEG, PEG-프로피온산, PEG-실란, PEG-인지질, 바이오틴-PEG 및 PEG-오르토피리딜-디술파이드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다), 글리코푸롤, 프로필렌글리콜, 덱스트란 및 당류를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
바람직한 것은, 약 2 내지 약 30개의 폴리에틸렌글리콜 단위 (PEG2-30)를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 중합체이며, 약 3 내지 약 6 개의 폴리에틸렌글리콜 단위 (PEG3-6)가 가장 바람직하다. 하나 또는 두개의 PEG 부분, 기타 수용성 중합체 또는 이들의 조합이 글리세리드 화학식에 혼입될 수 있다. 수용성 부분은 글리세리드의 R1, R2및 R3부분의 어느 하나에 존재할 수 있다.
중합체는 화학적으로 또는 효소적으로 형성된 공유결합을 통해 글리세리드에 결합될 수 있다. 중합체는 글리세리드에 아실화될 수 있거나, 또는 예를 들면 에스테라제-조정된 합성에 의하여 에스테르 결합을 사용하여 연결될 수도 있다. 예를 들면, 솔케탈을 트리에탄올아민 및 트리클로로메탄 중에서 폴리머 글로라이드와 혼합할 수 있고, 그후에 묽은 수성 아세트산 중에서 가열함으로써 유리 글리세롤 결합이 탈보호될 수 있다. 촉매로서 트리에틸아민 및 4-디메틸아미노피리딘의 존재하에 과량의 카프로일 클로라이드를 사용하여, 지방산을 유리 글리세롤 결합에 연결시킨다. 이러한 합성의 결과 카프로일/중합체 글리세리드가 얻어진다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, 기 R1, R2및 R3의 하나 또는 두개가 결합 항원으로 치환된다. 항원은 공유 결합에 의해 글리세리드 부분에 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 구현양태에 있어서, 조성물은 모노글리세리드 대 디글리세리드의 비율(% v/v)이 0.1:99.9 내지 99.9:0.1, 바람직하게는 5:95 내지 95:5의 범위가 되도록 모노글리세리드 및 디글리세리드의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 다른 구현양태에 있어서, 수용성 중합체는 3 내지 6 개의 폴리옥시에틸렌 단위를 갖는 폴리옥시에틸렌의 PEG3-6잔기이다. 본 발명은 또한 글리세리드가 하기 화학식들로 구성된 군에서 선택된 구조를 갖는 상기 기재된 조성물에 관한 것이다:
<화학식 II>
<화학식 III>
<화학식 IV>
<화학식 V>
상기 식에서, R1및 R2는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 하나의 구현양태에서, R1, R2및 R3는 포화 C6-14지방산, 더욱 바람직하게는 포화 C8-10지방산에서 선택된다. 본 발명의 다른 구현양태에 있어서, 글리세리드는 약 0.1 중량% 내지 약 99 중량%의 농도, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 20 중량%의 농도, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 15 중량%의 농도를 갖는다. 본 발명의 특정한 구현양태에 있어서, 글리세리드의 키랄 탄소는 S- 또는 R-형태이다.
본 발명의 보조제 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 조절한다; 다시 말해서, 면역원성 또는 백신 조성물은 백신접종된 숙주의 세포 매개성 면역을 유발하여 병원성 항원에 대해 면역 반응, 예를 들면 방어 면역 반응을 생성할 수 있다.
본 발명의 항원은 본 발명에 따른 하나 이상의 보조제 조성물과 조합될 수 있으며, 이러한 제제는 포유동물 숙주와 같은 척추동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 항원은, 이에 한정되는 것은 아니지만 파상풍 독소, 인플루엔자 바이러스, 디프테리아 유독소, HIV gp120, IgA-프로테아제, 인슐린 펩티드 B, 비브리오스, 살모넬라, 스폰고스포라 서브테라네아 (Spongospora subterranea), 호흡 합포체성 바이러스 (RSV) (예를 들어 RSV 서브유니트 백신), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenza) 외막 단백질, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 우레아제 및 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis) 및 엔. 고노로호에 (N.gonorrohoeae)의 재조합 필린, 또는 면역 반응을 자극하는 능력을 보유하는 그들의 일부분을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 특정 항원의 일부가 면역 반응을 자극하는 능력은 당 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면 항체를 검출하는 부분내에서 그 특정 부분을 인지하는 특이한 펩티드 (체액성 반응)에 대한 효소 면역학적 분석, 또는 세포 매개성 면역 반응이 검출되는 부분내에서 특이한 펩티드에 대한 지연형 과민반응 분석에 의해 평가될 수 있다.
용어 "항원"이란, 체액성, 세포성 및/또는 분비성 면역학적 반응을 일으키기 위하여 숙주의 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 본 발명의 항원은 서브유니트 항원 뿐만 아니라 사멸, 약독화 또는 비활성화된 세균, 바이러스, 원충, 진균, 기생충 또는 기타 미생물일 수 있다. 항원은 예를 들면 단백질, 펩티드, 다당류, 지질 또는 DNA 항원일 수 있다. 적절한 항원은 예를 들면 파스퇴렐라 (Pasteurella), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 클라마이디아 (Chlamydia), 모라셀라 (Moraxella), 네이세리아 (Neisseria), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 해모필루스 (Haemophilus), 살모넬라 (Salmonella) 및 에이메리아 (Eimeria) 종 뿐만아니라, 로타바이러스, 헤르페스 바이러스 (예, BHV-1, EHV-1), PRV, 파르보바이러스, 광견병바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스, HIV, 피코르나바이러스, 종양 항원, 호르몬, 호르몬 유사체 등에서 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 제제 중의 항원은 백신접종, 면역화, 알레르기 치료, 암 치료, 감염성 질병의 치료, 자기면역 질병의 치료 또는 면역 체계의 작용을 받은 질병의 치료를 유도하기 위해 적합하다. 따라서, 항원은 항-세균성, 항-바이러스성, 항-진균성, 항-프리온, 항-기생충성 백신 또는 IgA-프로테아제, 단백질 p38, 단백질 p43 또는 뮤신아제와 같은 미생물에 의해 생성된 성분과 같은 백신일 수 있다. 항원은 또한 말 진애 진드기, 애완용 고양이 알레르겐, 호밀 화분 알레르겐, 짧은 돼지풀 화분 알레르겐, 모기붙이, 난백, 우유 단백질, 벌 독액, 흰반점 말벌 알레르겐 등과 같은 알레르겐, 또는 마이엘린, 인슐린 펩티드 B 등과 같은 자기면역 질병의 유발에 관련된 성분일 수 있다. 항원은 또한 헤르페스, HIV, 파필로마, 칸디다, 다발성 경화증과 같은 감염성 질병의 치료, 당뇨병, 갑상선기능저하증 및 기능항진증, 건선, 관절염과 같은 자기면역 질병의 치료 또는 암의 치료를 위한 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물을 위해 적절한 항원은, 항원에 노출된 척추동물에서, 항체 또는 그 항원에 대해 특이적으로 반응하는 세포 매개성 면역학적 반응을 일으킬 수 있는 임의의 항원을 포함한다. 하나 이상의 항원이 사용될 수 있다. 항원 또는 항원들은 바이러스, 세균, 마이코플라즈마, 진균, 원충류 및 기타 기생충을 포함한 병원성 미생물로부터 유래된다. 또한, 항원 또는 항원들은 미생물 이외의 원천, 예를 들어 암 세포 또는 알레르겐으로부터 유래될 수도 있다. 항원 또는 항원들은 병원성 미생물의 전부 또는 일부, 또는 미생물과 연관된 단백질, 당단백질, 당지질, 다당류 또는 리포다당체의 전부 또는 일부일 수도 있다.
항원이 유래될 수 있거나 백신 목적을 위해 생성되는 병원성 미생물은 감염성 질병의 분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Medical Microbiology, 제2판, (1990), J.C.Sherris (ed.), Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York]에 기재되어 있다.
항원은 입자 형태로 사용되거나 용해될 수 있다. 제제는 용해된 항원이 특히 적절하지만, 입상 형태가 제제로 제조하기 용이하다. 백신접종 및 면역화를 위하여, 입상 형태가 종종 유리하지만 예를 들어 알레르기 또는 자기면역 질병의 치료를 위한 관용성을 유도하기 위해서는 용해된 항원이 바람직하다.
본 발명에 따른 보조제의 면역학적 면역보강 활성은 단독으로 또는 특정한 항원과 함께 당 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 ELISAs, 적혈구응집 분석시험 및 중화반응 분석시험을 사용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "면역학적 보강 활성"은 보조제 및 항원이 투여된 숙주에서 면역학적 반응을 강화시키는 능력을 의미하는 것으로 이해된다. 전형적으로, 보조제는 항원과 함께 동일한 혼합물 또는 조성물로 투여되거나 (예를 들어 국제 출원 공고 제 WO93/05789호 참조), 또는 별도의 조성물 또는 제형으로 동시에 투여될 수 있다. 항원은 보조제에 결합되거나 (예를 들어 공유결합) 또는 단순히 그것과 혼합될 수 있다. 보조제는 또한 항원의 투여전에 또는 투여후에 투여될 수 있다. 면역보강 활성은 항원의 면역원성을 증가시킴으로써 또는 면역 반응을 일으키기 위해 요구되는 항원의 투여량 또는 수준을 감소시킴으로써 항원에 대한 면역학적 반응을 증강시키는 능력을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 특정 항원에 대한 "면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은 항원에 대해 분비성, 세포성, 체액성 또는 항체 매개성 반응 (또는 전신성 반응)의 생성을 포함하는 것으로 해석된다. 면역화된 숙주에서의 반응의 발현은 항체 (예, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체)의 생성, B 및/또는 T 림프구의 증식, 항원 제시 세포를 인식하는 세포독성 T 림프구의 자극, T 세포 집단의 팽창, 및 면역 체계의 세포의 분화, 활성화 또는 성장을 일으키는 시그날의 상승작용을 포함할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 보조제를 투여하면, 중요한 항원에 대한 증강된 면역 반응이 일어난다. 본 명세서에서, "증강된"이란 항원에 대한 면역 반응이 보조제의 부재시에 비해 보조제의 존재시에 양적으로 커지고 및/또는 질적으로 향상되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 보조제의 존재 및 부재시에 면역 반응의 비교는 통상적인 방법, 예를 들면 보조제 및 항원을 포함한 제제와 적절한 대조군과의 방사선면역분석시험 또는 ELISA에 의한 항체역가 비교에 의해 수행될 수 있다. 증강된 면역 반응은 개개의 면역 체계에 대한 직접적인 효과(예를 들어 항원에 대한 반응을 증가시키기 위한 T 및 B 세포의 초외항원자극)의 결과일 수 있거나, 또는 (예를 들어 항원과 점막간의 접촉을 더욱 장기간 유지시키기 위해 점막에 대한 양호한 점착성을 제공하거나, 또는 예를 들어 점막의 침투성의 증가에 의해 점막을 통한 항원의 흡수성을 강화시킴으로써) 점막에 항원을 더욱 유리하게 제공한 결과일 수 있다.
본 발명의 보조제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 항원에 대한 면역학적 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용될 수 있다. 특정한 구현양태에 있어서, 보조제는 점막 보조제이다. 예를 들면, 보조제는 특정한 병원체 또는 서브유니트 항원에 대해 포유동물을 면역화하거나, 또는 특정한 항원에 대한 면역 반응을 준비하기 위한 조성물에서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은, 항원 및 본 발명의 보조제의 면역보강 량을 함유하는 면역원성 또는 백신 조성물의 면역학적 유효 투여량을 포유동물, 특히 인간 또는 다른 영장류에게 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 보조제의 "면역보강 량" 또는 "유효량"이란, 동시투여된 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 양을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 전형적으로 면역보강 효과를 제공하기 위하여 약 0.01 % 내지 약 40 %, 더욱 특별하게는 약 0.1 % 내지 약 20 %의 투여량이 효과적이지만; 특정한 보조제에 따라 이러한 투여량 범위에서의 변화가 일어날 수 있다. 또한, 특정한 투여량은 치료하고자 하는 포유동물의 연령, 체중 및 의학적 상태 뿐만 아니라 투여 방법에 의존된다. 적절한 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정되어진다.
백신 또는 면역원성 조성물은 임의로 생리적 또는 인산염 완충 식염수, 물, 덱스트로스, 에탄올 폴리올 (예를 들어 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜) 및 이들의 조합과 같은 제약학적 또는 생리적으로 허용가능한 부형제 중에서 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 현탁액, 유화액 또는 분산액일 수 있으며, 분산 또는 습윤제, 현탁제 및/또는 하나 이상의 보존제와의 혼합물로서 보조제를 제공할 수 있다. 적절한 분산 또는 습윤제는 예를 들면 천연 포스파티드, 예를 들어 레시틴 또는 대두 레시틴; 에틸렌 옥사이드와 예를 들어 지방산, 장쇄 지방족 알콜 또는 지방산에서 유래된 부분 에스테르 및 헥시톨 또는 헥시톨 무수물과의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테라레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 등이다. 적절한 현탁제는 예를 들면 천연 고무, 예를 들어 아라비아 고무, 크산탄 고무 또는 트라가간트 고무; 셀룰로우스, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스 (예: AvicelRC591), 메틸셀룰로스; 알긴산염, 예를 들어 알긴산 나트륨 등이다. 본 발명에 따른 제제에서 사용하기 위해 적절한 보존제의 예는 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 파라벤, 및 벤즈알코늄 클로라이드이다.
직장 또는 질 점막에의 적용을 위하여, 본 발명에 따른 적절한 제제는 좌약 (에멀젼 또는 현탁액 유형), 관장제 및 직장 젤라틴 캡슐 (용액 또는 현탁액)을 포함한다. 적절한 제약학적으로 허용가능한 좌약 기제는 코코아 버터, 에스테르화 지방산, 글리세르화 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르와 같은 각종 수용성 또는 수분산성 기제를 포함한다. 각종 첨가제, 예를 들어 증강제 또는 계면활성제를 또한 혼입할 수 있다.
코 점막으로의 적용을 위하여, 본 발명에 따른 적절한 조성물은 코 분무제 및 흡입용 에어로졸이다. 전형적인 코 제제에 있어서, 활성 물질은 적절한 부형제에 임의로 분산된 입상 제제의 형태로 존재한다. 제약학적으로 허용가능한 부형제 및 보형약 및 조성물에 존재하는 임의의 기타 제약학적으로 허용가능한 물질, 예컨대 희석제, 증강제, 향료, 보존제 등은 모두 당업자가 알고 있는 방식으로 통상적인 제약학적 관행에 따라 선택되어진다. 본 발명에 따른 코 제제의 투여후에, 항원이 코 점막상에 흡착될 수 있다. 점막으로의 흡착은, 예를 들어 침투 증강제 또는 촉진제를 함유하는 액체 부형제가 사용될 때에 비하여, 낮은 자극 효과를 일으키는 것으로 생각된다. 본 발명의 제제의 투여를 위해 적합한 기타 점막 표면은 코, 폐, 입, 눈, 귀, 위장관, 생식관, 질, 직장 또는 피부, 또는 어류의 경우 아가미이다. 또한 이러한 제제는 식물의 종자 또는 잎에 적용하기 위해 적절할 수도 있다.
피부에 적용을 위하여, 본 발명에 따른 제제는 미소구 및 리포좀을 포함하여 통상적인 비-독성의 제약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 함유할 수도 있다. 제제는 크림, 연고, 로숀, 도포제, 겔, 하이드로겔, 용액, 현탁액, 스틱, 스프레이, 페이스트, 경고, 및 기타 종류의 경피 약물 전달 체계를 포함한다. 하나의 구현양태에 있어서, 제제는 비 분무제, 점비제, 비 분말제, 비 포말제, 또는 점막 표면 또는 코의 아데노이드로의 비 연고로서, 또는 경구용 스프레이, 경구용 적제, 경구용 분말, 경구용 포말, 또는 입 부분 또는 입안의 편도에 특히 작용하는 경구용 연고로서 투여될 수 있다. 제제는 또한 점안제의 형태일 수 있다.
제약학적으로 허용가능한 부형제는 유화제, 산화방지제, 완충제, 보존제, 습윤제, 침투 증강제, 킬레이트제, 겔형성제, 연고 기제, 향료 및 피부 보호제를 포함할 수도 있다. 유화제의 예는 천연 고무, 예를 들어 아라비아 고무 또는 트라가간트 고무, 천연 포스파티드, 예를 들어 대두 레시틴 및 소르비탄 모노올레에이트 유도체이다. 산화방지제의 예는 부틸화 히드록시 아니졸 (BHA), 아스코르브산 및 그의 유도체, 토코페롤 및 그의 유도체, 부틸화 히드록시 아니졸 및 시스테인이다. 보존제의 예는 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 파라벤, 및 벤즈알코늄 클로라이드이다. 습윤제의 예는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및 우레아이다. 침투 증강제의 예는 프로필렌 글리콜, DMSO, 트리에탄올아민, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드, 2-피롤리돈 및 그의 유도체, 테트라히드로푸르푸린 알콜, 및 Azone이다. 킬레이트제의 예는 소듐 EDTA 시트르산 및 인산이다. 기타 부형제의 예는 아몬드유, 피마자유, 카카오 버터, 코코넛 오일, 옥수수유, 면실유, 아마인유, 올리브유, 팜유, 땅콩유, 양귀비씨유, 평지씨유, 참깨유, 대두유, 해바라기유, 및 차종자유와 같은 식용유; 카멜로스, 소듐 카멜로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀릴로스, 히드록시프로필셀룰로스, 키토산, 펙틴, 크산탄 고무, 카라게난, 구주콩 고무, 아라비아 고무, 젤라틴 및 알긴산염과 같은 중합체이다. 연고 기제의 예는 밀랍, 파라핀, 세틸 팔미테이트, 식물성유, 지방산의 소르비탄 에스테르 (Span), 폴리에틸렌 글리콜, 및 지방산의 소르비탄 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (Tween)이다. 국소 투여를 위해 상기 언급된 제제는 또한 피부, 어류의 아가미 또는 식물의 외피 또는 종자에 적용될 수 있다. 본 발명의 제제는 또한 직장, 요도, 질 또는 경구와 같은 신체의 적절한 구멍(들)에 도입하거나 직접 적용하기 위해 적합할 수 있다. 제제는 간단하게 예를 들어 점막과 같은 면역화되는 부위에 직접 적용될 수도 있다.
많은 점막 제제는 부형제들의 일부 특정한 혼합물을 필요로 한다. 따라서, 많은 제제들은 하나 이상의 계면활성제 및/또는 흡수 촉진제 및/또는 물 흡수 중합체 및/또는 효소적 분해를 억제하는 물질 및/또는 알콜, 유기 용매, 오일, pH-조절제, 가용화제, 안정제, HLB-조절제. 점도 조절제, 보존제, 삼투압 조절제, 추진제, 공기 치환제, 물 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 계면활성제는 논옥시놀, 옥트옥시놀, 트윈스, 스판스 소듐 라우릴 설페이트, 소르비탄 모노팔미테이트 중에서 선택될 수 있으며; 흡수 촉진제는 폴리옥시에틸렌 알콜 에테르, 담즙염 및 그의 유도체, 후시딘 산 및 그의 유도체, 올레산, 레시틴, 리졸레시틴, 트윈스 20-85, 모노-/디- 및 트리글리세리드, 키토산, 시클로덱스트린 중에서 선택될 수 있고, 물 흡수 중합체는 글리코푸롤 및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜 200-7500 및 그의 유도체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 프로필렌글리콜, 젤라틴, 셀룰로스 및 그의 유도체 중에서 선택될 수 있으며, 효소 분해를 억제하는 물질은 아프로티닌, DFP 카르보폴 중에서 선택될 수 있고; 오일은 식물성유, 대두유, 땅콩유, 코코넛유, 옥수수유, 올리브유, 해바라기유, 미글리올 중에서 선택될 수 있고; pH-조절제는 아세트산, 염산, 질산, 메타인산 칼륨, 인산칼륨, 아세트산 나트륨, 암모니아, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 붕산나트륨, 트롤아민 중에서 선택될 수 있으며; 가용화제는 알콜, 이소프로필알콜, 물 글리코푸롤, 폴리에틸렌글리콜 200-7500 중에서 선택될 수 있고; 안정화제는 시클로덱스트린이고; HLB 조절제는 Tween20-85, Span 20-80, Brij 30-98, 아라비아고무 중에서 선택될 수 있고; 점도 조절제는 셀룰로스 및 그의 유도체, Tween및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜 및 그의 유도체, 세틸 알콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 젤라틴 중에서 선택될 수 있으며; 보존제는 벤즈알코늄 염, 벤질 알콜, 페놀, 티모로살, 페닐수은 질산염, 페닐에틸 알콜, 클로로부탄올, 세틸피리디늄 클로라이드 중에서 선택될 수 있고; 삼투압 조절제는 덱스트로스, 염화나트륨, 만니톨 중에서 선택될 수 있고; 추진제는 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 트리클로로모노플루오로메탄 및 부탄과 같은 기타 비-오존 파괴 추진제 중에서 선택될 수 있으며; 공기 치환제는 질소일 수 있다.
액체 조성물에 대하여, 유효량의 항원을 적절한 부피로 투여할 수 있는 것이 필수적이다. 비내 투여를 위한 부피는 인체에 대해 약 300 ㎕를 초과하지 않아야 한다. 더욱 많은 부피는 환자에게 불쾌감을 주며, 비공을 통해 전방으로 유출되거나 인두쪽으로 후방으로 유출된다. 그 결과 항원 및/또는 백신의 일부가 흡수 부위에서 소실된다. 부피는 바람직하게는 약 20 ㎕ 내지 약 125 ㎕이고, 하나의 외비공에 투여하는 것이 바람직하다. 구강 및 직장 부위에 투여를 위해서는 10 ml를 넘지않는 부피를 사용해야 한다. 눈과 귀에 투여를 위해서는, 300 ㎕를 넘지 않는 부피를 사용해야 한다. 폐에 투여를 위해서는, 2 ml를 넘지 않는 부피를 사용해야 한다. 질에 투여를 위해서는, 30 ml를 넘지 않는 부피를 사용해야 한다. 위장관에 투여를 위해서는, 100 ml를 넘지않는 부피를 사용해야 한다.
백신 조성물은 임의로 추가의 성분들, 예를 들어 완충제, 보존제, 유화제 및 보존제, 예컨대 식물성 유 또는 그의 유화액, 표면 활성 물질, 예를 들어 헥사데실아민, 옥타데실아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 리졸레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N'-N'비스(2-히드록시에틸-프로판 디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루론 폴리올; 폴리아민, 예를 들어 피란, 덱스트란술페이트, 폴리 IC, 카르보폴; 펩타이드, 예를 들어 뮤라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 터프트신; 면역 자극 복합체; 오일 유화액; 리포다당류, 예를 들어 MPL(3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana); 미네랄 겔 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 항원은 리포좀, 와우상, 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리-락티드, 폴리-글리콜리드 및 폴리-락티드-코-글리콜리드, 또는 ISCOMS (면역 자극 복합체)내에 혼입될 수 있으며, 보충 활성 물질을 또한 사용할 수도 있다.
본 발명의 항원은 또한 추가의 보조제 또는 담체 분자로서의 세균 독소 및 그의 약독화된 유도체와 함께 투여될 수 있다. 기타 적절한 담체 분자는 혈청 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌, 면역글로블린 분자, 면역글로블린, 난알부민, 다당류 (예: 세파로스, 아가로스, 셀룰로스), 불활성 바이러스 입자 및 아미노산 공중합체를 포함한다. 본 발명의 항원은 또한 인터류킨-2, IPN-γ 및 GM-CSF를 포함하는(이에 한정되는 것은 아니다) 림포카인과 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항원은 또한 이러한 항원을 코딩하는 DNA의 투여후에 생체내에서 발현될 수 있다.
백신은 비경구적, 동맥내, 피내, 경피 (예를 들어 서방성 중합체의 사용에 의해), 근육내, 복강내, 안내, 설하, 정맥내, 피하, 경구 및 비내 투여 경로를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 경로에 의해 인체 또는 동물에 투여될 수 있다. 바람직한 구현양태에 있어서, 조성물은 점막을 통해 투여된다. 이러한 백신에서 사용되는 항원의 양은 항원의 특성에 따라 변한다, 본 발명의 백신에 적합한 종래의 담체 항원과 함께 사용되는 기정의 투여량 범위는 당업자의 능력의 범위내에서 조절 및 조작될 수 있다. 본 발명의 백신은 미성숙 및 성장한 온혈동물, 특히 인간의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물의 투여는 유전자 치료법을 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,580,859호 및 공고된 PCT 출원 공고 번호 WO93/19183호 (Robinson 등) 및 WO 97/44446호 (Malone 등) 참조).
본 발명의 보조제의 점막 면역보강 작용은 다수의 중요한 의미를 갖는다. 점막 면역보강성은 백신접종된 유기체에서 점막-투여된 항원에 대해 생성되는 방어 항체의 농도를 증가시킬 수 있다. 그 결과, 통상 요구되는 것보다 적은 양의 항원으로도 효과적인 백신접종을 달성할 수 있다. 항원의 필요량의 감소는 제조가 곤란하고 제조비용이 비싼 백신을 더욱 널리 보급할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 보조제의 사용은, 특히 점막 투여시에, 항원성이 약하거나 면역원성이 불량한 항원의 능력을 증강시켜 면역 반응을 유발할 수 있다. 또한, 효과적인 점막 면역화를 위해 통상 요구되는 농도에서 항원이 독성을 나타낼때 더욱 안전한 백신접종을 제공할 수 있다. 항원의 양을 감소시킴으로써, 독성 반응의 위험이 저하된다. 또한, 비경구적 경로에 의해서는 독성이지만 점막 경로에 의해서는 안전한 항원 또는 백신 제제를 사용할 수 있으므로, 더욱 안전한 백신접종을 제공할 수 있다.
전형적으로, 백신접종 섭생법은 "방어성" 면역 반응을 자극하기 위하여 수 주일 또는 수 개월에 걸친 항원의 투여를 필요로 한다. 방어성 면역 반응이란, 백신이 작용하는 특정한 병원체 또는 병원체들에 의해 유발되는 감염을 방지하거나 또는 (유발된 면역 반응의 부재하에서의 감염의 심각성에 비해) 감염의 심각성을 저하시키기에 충분한 면역 반응이다. 본 발명의 보조제의 사용은 효과적인 백신접종 섭생의 시간 경과를 감소시킬 수 있다. 어떤 경우에는, 1 회 투여로도 방어성 반응이 생성되는 결과가 얻어질 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한, 항원으로 이미 감염된 환자에 있어서 증상의 에피소드의 횟수 및 심각성을 감소시키기 위해 치료적으로 유용하다. 백신 조성물은 또한 비경구적으로 투여된 항원에 대해 경구 추가자극 면역화제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제제는 특히 유아, 소년, 청소년, 성인 및 장년을 포함한 인체에 특히 적절하다. 제제의 특성은 다양한 병원체에 대해 면역 반응을 증강시키는 능력을 제공하며, 따라서 제제는 질병에 걸린 인체, 예를 들어 비장절제된 환자, 암에 걸린 환자, 항암제를 사용하는 환자, 항천식제를 사용하는 환자, 항염증제를 사용하는 환자, 갑상선 기능항진 및 기능저하증 환자와 같은 다양한 상태의 환자에게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제제는 또한 말, 양, 개, 고양이, 소, 돼지, 거위, 토끼, 야생동물, 및 생쥐, 쥐, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 개, 고양이 또는 원숭이와 같은 실험용 동물과 같은 동물; 닭, 칠면조, 오리, 타조, 열대성 조류 또는 야생 조류와 같은 조류; 또는 양식 어류, 예를 들어 연어 또는 수족관 어류와 같은 어류에 투여하기 위해 적합하다. 동물에 대하여, 각 성분의 농도를 조절하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 양에 대해서는, 비강이 극히 습도가 높으므로, 제제에 물 흡수 부형제를 첨가하는 것이 필요할 수 있고, 어류에 대해서는 제제를 미소캡슐화하거나 또는 아가미에 흡수되는 제제의 형태로 만드는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 보조제 조성물은 또한 식물에 있어서 생활성 (예를 들어 면역원성) 및/또는 생활성제 (예를 들어 항원)의 흡수를 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 보조제 조성물과 함께 사용될 수 있는 생활성제는 예를 들면 제초제, 살충제, 살진균제, 식물 성장 조절제, 비료 및 백신일 수 있다. 많은 적절한 생활성제는 통상적으로 입수가능하며, 일반적으로 공급자에 의해 추천되는 비율로 적용될 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하기 위한 생활성 성분의 특정한 양은, 접촉되어지는 식물 또는 식물 성장 매질, 일반적인 적용 위치, 다시말해서 들판과 같은 노출된 지역에 비해 온실과 같은 차폐된 지역, 및 제제의 유형 (예를 들어 에어로졸, 액체, 고체)에 따라 변하게 된다. 제제는 목초 (예를 들어, 흑초 (blackgrass), 참새귀리속 잡초, 바랭이, 반야드 그래스(barnyard grass), 갈퀴덩굴속 식물, 독보리, 이탈리아풀 (Italian grass)), 작물 (예를 들어, 밀, 귀리, 수수, 옥수수, 사탕무우, 카놀라, 대두, 목화, 담배, 감자, 과수, 오이, 토마토, 바나나, 콩, 후추, 멜론) 및 관상식물 (관목, 교목, 꽃)에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 임의의 종류의 식물에서 사용될 수 있다. 제제는 잎, 종자, 열매, 수피 또는 목재에 적용될 수 있거나, 또는 성장 매질 (예를 들어 이탄 또는 토양)과 혼합될 수 있다. 제제는 식물에 개별적으로 (예를 들어 분무 도포기를 사용하여) 또는 다량으로 (예를 들어 항공기로부터) 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 보조제 조성물을 사용하여 식물로 항원을 전달함으로써 병원체에 대해 식물을 면역화 (예를 들면 식물항체의 생성에 의해 또는 국소적 및 전신적으로 획득된 내성의 활성화에 의해)할 수 있다 (예를 들면, Agrois. Plant Pathology, 제 4 판 (Academic Press, 1997) 제 108-114 면 및 그에 인용된 참고문헌들 참조).
하기 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하지 말아야 한다. 본 출원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공고된 특허 출원들의 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된다.
실시예 I - 파상풍 톡소이드
하기 제제: (I) 등장 식염수; (II) 등장 식염수 중의, 6 개의 폴리옥시에틸렌 (PEG6)단위를 함유하는 카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드/디글리세리드 혼합물인, 20% PEG6-CCG (Softigen; Huls AG, Witten, Germany); 및 (III) 등장 식염수 중에서 Tween 20(22:78)으로 가용화된 카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드/디글리세리드 혼합물 (Imwitor)의 20% 혼합물 (CCG-폴리소르베이트 20 (CCG-PS): WO94/17827) 중에 1.5 ㎕ 파상풍 톡소이드 백신 (Lyfjathroun, Reykjavik, Iceland)을 함유하는 5 ㎕ 제제를 생쥐 (BALB/c)에 비내 투여하였다. 첫번째 백신접종후 4 주째에, 동일한 백신을 함유하는 추가자극제를 생쥐에 가하였다. 1 주일후에, 혈액 시료를 뽑아내고, 하기 혈청 IgG 반응을 수득하였다:
제제 혈청 IgG 반응
I 0.01
II 2.1
III 0.65
상기 결과는 비-독성 PEG6-CCG (제제 II)가 WO94/17827에 기재된 것과 같은 백신 제제 (제제 III)에 비하여 현저히 증강된 IgG 반응을 생성함을 나타낸다.
실시예 II - 인플루엔자 바이러스
20 마리의 Balb/c 생쥐를 인플루엔자 바이러스 백신 (균주 Harbin으로부터의 HA 분자)로 면역화하였다. 인플루엔자 HA 분자를 본 발명에 따라 0 %, 1 %, 5 % 및 20 % PEG6-CCG와 함께 제제화하였다. 첫번째 면역화후 4 주째에, 동일한 제제를 함유하는 추가자극제를 생쥐에 가하였다. 추가자극제 투여후 1 주일째에, 하기 결과가 얻어졌다:
% 보조제 IgG (혈청) 농도
0 % 1.1
1 % 4.2
5 % 6.8
20 % 8.4
실시예 III
등장 식염수 중에 6 개의 폴리옥시에틸렌 (PEG6)단위를 함유하는 카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드/디글리세리드 혼합물인 20 % PEG6-CCG를 함유하고, 하기항원들: (I) 생쥐 1 마리당 1 ㎍ HA 인플루엔자 바이러스; (II) 1.5 Lf (서상반응의 한계) 파상풍 톡소이드 백신; (III) 1.5 Lf 디프테리아 톡소이드 백신; (IV) 1 ㎍ rgp 120 HIV 백신; (V) 백신으로서의 1 ㎍ IgA-프로테아제 및 (VI) 1 ㎍ 인슐린 펩티드 B를 첨가한 5 ㎕의 제제를 생쥐 (BALB/c)에 비내 투여하였다. 첫번째 백신접종후 4 주째에, 동일한 백신을 함유하는 추가자극제를 생쥐에 가하였다. 1 주일후에, 혈액 시료를 뽑아내고 분석하였다.
실시예 IV - 파상풍 톡소이드 및 디프테리아 톡소이드
하기 제형들: (I) 등장 식염수; (II) 등장 식염수 중에 6 개의 폴리옥시에틸렌 (PEG6)단위를 함유하는 카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드/디글리세리드 혼합물인 PEG6-CCG; (III) 등장 식염수 중에 5 % PEG6-CCG; 및 (IV) 등장 식염수 중에 1 % PEG6-CCG에 12 Lf 파상풍 톡소이드 및 12 Lf 디프테리아 톡소이드 백신을 함유하는 100 ㎕ 제제를 지원자 인체에 비내 투여하였다. 첫번째 백신접종후 4 주째에, 동일한 백신을 함유하는 추가자극제를 참가자에게 가하였다. 연구 과정 동안에, IgG 및 IgA 분석을 위하여 매주 각각의 지원자에게서 혈액 및 타액 시료를 채취하였다.
실시예 V
등장 식염수 중에 6 개의 폴리옥시에틸렌 (PEG6)단위를 함유하는 카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드/디글리세리드 혼합물인 20 % PEG6-CCG 중의 1.5 Lf 파상풍 톡소이드 백신을 생쥐 (BALB/c)에 투여하였다. 제제를 (I) 5 ㎕ 비내 투여, (II) 입의 점막내에 5 ㎕ 경구 투여, (III) 5 ㎕ 질내 투여, (IV) 5 ㎕ 직장 투여, 및 (V) 5 ㎕ 피부 투여하였다. 첫번째 백신접종후 4 주째에, 동일한 백신을 함유하는 추가항원자극제를 생쥐에 가하였다. 1주일후에, 혈액 시료를 뽑아내었다.
인플루엔자 바이러스 백신 (Nanchang 균주로부터의 HA 분자)으로 15 마리의 Balb/c 생쥐를 면역화하였다. 인플루엔자 HA 분자를 본 발명에 따른 5 % PEG6-CCG 와 함께 제제화하고, 비내 투여, 구강 투여 및 직장 투여하였다. 첫번째 면역화후 4 주째에, 동일한 제제를 함유하는 추가자극제를 동일한 경로로 생쥐에 가하였다. 추가자극제 투여후 1 주일째에, 하기 결과가 달성되었다:
경로 흡광도 (OD 492 nm)
비내 0.300
구강 0.334
직장 0.155
실시예 VI
등장 식염수 및 선택된 백신 조성물 중에, 6 개의 폴리옥시에틸렌 (PEG6)단위를 함유하는 카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드/디글리세리드 혼합물인 10 % PEG6-CCG를 함유하는 제제를 다음과 같이 투여하였다: (I) 생쥐에 1.5 Lf 파상풍 톡소이드 투여; (II) 토끼에 6 Lf 파상풍 톡소이드 투여; (III) 양에 20 Lf 파상풍 톡소이드 투여; (IV) 인간 지원자에게 12 Lf 파상풍 톡소이드 투여; (V) 연어에게 비브리오스 백신 3 ㎍ 투여; (VI) 닭에게 살모넬라 백신 3 ㎍ 투여; 및 (VII) 감자 식물에 스폰고스포라 서브테라니 (Spongospora subterranea) 항원 3 ㎍ 투여. 첫번째 백신접종후 4 주째에, 동일한 백신을 함유하는 추가자극제를 투여하였다. 1 주일후에, 혈액 시료를 뽑아내었다 ((VII)에서의 식물의 경우 제외). (VII)의 식물에 대해서는 추가자극제 투여후 1 개월째에 감자 식물을 진균류로 감염시켰다.
실시예 VII
카프릴산 및 카프린산의 모노글리세리드 및 디글리세리드에 결합된, (I) 파상풍 톡소이드 또는 (II) 폐렴구균을 함유하는 5 ㎕ 제제를 생쥐 (BALB/c)에 비내 투여하였다. 이러한 전구-백신을 20 % 농도로 투여하였다. 첫번째 백신접종후 4 주째에, 동일한 백신을 함유하는 추가자극제를 생쥐에 가하였다. 1 주일후에, 혈액 시료를 뽑아내었다.
비내 투여후 백신 항원에 대한 PEG6-CCG의 효과를 평가하기 위하여, 인플루엔자 백신, 호흡 합포체 바이러스 (RSV) 서브유니트 백신, 비-유형화 해모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza) 외막 단백질 (OMPs), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 우레아제, 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis)및 엔. 고노르호에 (N. gonorrhoeae)의 재조합 필린을 포함한 다수의 바이러스 및 세균 항원을 사용하여 실험을 수행하였다. 이 분석의 결과를 하기 실시예에 나타낸다.
실시예 VIII - 인플루엔자 백신
이 실시예는 A/Udorn 백신 (모노풀 분할 인플루엔자 백신; Wyeth Lederle Vaccines and Pediatries, West Henrietta, NY)에 대한 면역 반응에 미치는 CCG-PS 및 PEG-CCG의 면역보강 효과의 평가 및 하행 질병으로부터 호흡관의 보호에 대한 국소적 면역 반응의 성과를 요약한 것이다.
군 면역원 투여량/경로/용적
A A/Udorn/307072 (H3N2) 1.8×105TCID50/IN/5 ㎕
B 없음 없음
C A/Udorn 백신 1.0 ㎍ HA/IM/50 ㎕
D A/Udorn 백신 1.0 ㎍ HA/IN/5 ㎕
E 10 % CCG-PS 중 A/Udorn 백신 1.0 ㎍ HA/IN/5 ㎕
F 5 % PEG6-CCG 중 A/Udorn 백신 1.0 ㎍ HA/IN/5 ㎕
BALB/c 생쥐, 1 군당 8 마리백신접종 : 0일, 19 일 및 38 일감염: 70 일바이러스 역가 측정: 74 일HA-적혈구응집소
ELISA 및 적혈구응집소 억제(HI) 분석시험으로부터의 혈청학적 데이타는 PEG6-CCG 제제가 CCG-PS 제제에 비하여 더욱 높은 혈청 IgGI 및 HI 역가를 유도함을 나타내었다. 비내-도입된 PEG6-CCG 제제는 비경구적으로 투여된 표준 백신에 의해 유발된 것에 필적하는 전신성 항체 반응을 생성하였다.
ELISPOT 데이타는, 백신 단독의 비내 투여에 의해 유발된 것에 비하여 비내 유림프 조직에서 발견되는 IgA-분비 B 세포의 수가 증가되는 것에 의해 증명되는 바와 같이, PEG6-CCG 가 첫번째 발생된 CCG-PS 형성에서와 유사하게 인플루엔자 백신에 대한 국소적 면역 반응을 증가시킨다는 것을 입증하고 있다. 근육내 경로를 통해 투여된 백신은 실험을 받은적이 없는 생쥐에서 발견되는 배경 이상의 국소적 반응을 일으키지 않았다.
PEG6-CCG제제는 비내 투여된 인플루엔자 백신에 대해 체액성 항체 반응을 촉진한다.
면역원/경로 IIIGMT IgGIGMT IgG2aGMT IgA 분비세포/104코 유림프 세포
A/Udorn/IN 512 19,426 436,556 463
없음 8 13 13 1
A/Udorn vax/IM 215 48,537 1,254 6
A/Udorn vax/IN 25 732 73 22
A/Udorn vax/CCG-PS/IN 181 20,556 228 150
A/Udorn vax/PEG6-CCG/IN 512 88,533 173 73
하기 표에 나타낸 바와 같이, 감염 바이러스에 미리 노출된 생쥐는 동종 바이러스로의 연속 감염으로부터 완벽하게 보호된다. 바이러스는 폐 또는 코 조직으로부터 회수될 수 없었다. 반대로, 실험을 받은 적이 없는 생쥐는 폐 및 코 조직 모두에서 A/Udorn 바이러스로 쉽게 감염되었다. 바이러스는 또한 비경구적 또는 보조제가 첨가되지 않은 비내 백신을 투여한 모든 쥐의 코 조직으로부터 회수되었다. 이러한 데이타는 CCG-PS 또는 PEG6-CCG로 면역보강된 백신에 의해 유발된 면역 반응이 바이러스 감염으로부터 상부 호흡관을 보호한다는 것을 시사한다. 코 조직으로부터의 바이러스 회수는 CCG-PS 또는 PEG6-CCG로 면역보강된 비내 백신이 투여된 동물에서 현저히 감소되었다. 하부 호흡관의 일부 보호는 백신 형성 또는 전달 경로에 무관하다는 것이 명백하다.
CCG-PS 또는 PEG6-CCG로 면역보강된 비내 인플루엔자 백신에 의해 유발된 면역 반응은 바이러스 감염으로부터 호흡관을 보호한다.
면역원/경로 양성율(%)코 양성율(%)폐 코로부터의바이러스 회수GMT 폐로부터의 바이러스 회수GMT
A/Udorn/IN 0 0 200 200
없음 100 75 53,724 40,788
A/Udorn vax/IM 100 0 30,211 200
A/Udorn vax/IN 100 25 6,324 563
A/Udorn vax/CCG-PS/IN 75 0 2,081 200
A/Udorn vax/PEG6-CCG/IN 25 25 621 1002
200 TCID50= < 400 (검출 분석 한계), 모든 음성 시료에 200의 값을 부여하였다.
실시예 IX - RSV F 단백질
이 실시예는 RSV F 단백질에 대한 면역 반응에 미치는 CCG-PS 및 PEG6-CCG의 면역보강 효과의 평가 및 하행 질병으로부터 호흡관의 보호에 대한 국소적 면역 반응의 성과를 요약한 것이다.
군 면역원 투여량/경로/부피 Vax 계획
A F 단백질 3 ㎍/IN/5 ㎕ 0. 7, 14 일
B 20% CCG-PS 중 F 단백질 3 ㎍/IN/5 ㎕ 0. 7. 14 일
C 5% PEG6-CCG 중 F 단백질 3 ㎍/IN/5 ㎕ 0. 7. 14 일
D Alum 상의 F 단백질 3 ㎍/IM/100 ㎕ 0 일
E RSV A2 2×106pfu/IN/50 ㎕ 0 일
BALB/c 생쥐, 1 군당 10마리
F 단백질-특이적 혈청 항체 반응 - F 단백질/PBS로 비내 백신 접종하면 약 26,000의 역가를 갖는 순환 IgG 항-F 반응이 유발되었다. 그러나, F단백질을 CCG-PS 또는 PEG6-CCG와 조합함으로써, 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a의 통계적으로 상승된 역가 (p<0.05)가 수득되었다 (표 6 참조). 또한, PEG6-CCG와 함께 제형된 백신에 의해서만 현저한 혈청 IgA 역가가 얻어졌다. 이러한 관찰은 일관되게 행해졌으며, PEG6-CCG의 상이한 면역학적 특성의 결과일 수 있다.
F 단백질-특이적 점막 Ig 반응 - F/PEG6-CCG로 백신접종된 생쥐의 코 및 질 세정물에서 IgA가 관찰되었으며, 이는 이러한 백신 조합에 의한 혈청 IgA의 자극을 반영하는 것이다 (표 6 참조). 이러한 실험에서, 코 세정물에서의 IgA의 수준은 생 RSV로 감염된 생쥐 회수물에 존재하는 것보다 더욱 높은 것으로 밝혀졌다.
F 단백질 및 CCG-PS 또는 PEG6-CCG의 조합으로 비내 백신접종된 BALB/c 생쥐의 면역 반응
면역원 혈청 GMT NW VW
IgG IgG1 IgG2a IgA IgG IgA IgG IgA
F단백질 26,322 +/-51,020 2,909 +/- 5,770 〈100 〈100 〈25 〈25 〈25 〈25
F단백질CCG-PS 115,336 +/- 32,747 14,423 +/- 5,079 254+/- 457 〈100 〈25 〈25 223 261
F단백질 PEG6-CCG 111,761 +/- 108,591 9,218 +/- 7,565 626+/- 665 381+/- 50 〈25 103 〈25 443
F단백질 A1OH 71,756 +/- 36,340 43,136 +/- 19,917 1,553+/- 1,099 〈100 〈25 〈25 258 〈25
RSV A2 79,236 +/- 32,310 5,962 +/- 5,251 20,819 +/- 7,258 752+/- 50 〈25 〈25 〈25 594
생쥐를 27 일째에 사혈하고, 각각의 생쥐를 ELISA에 의해 혈청 항체 역가를 분석하였다. 유사하게, 혼주한 점막 세정물 시료를 28 일째에 취하고, 항-F 단백질 특이 IgG 및 IgA에 대해 분석하였다. 기관지 폐포 세정물(BAW)에서 IgA가 검출되지 않았다. VW=질 세정물, NW= 코 세정물
실시예 X - 비-유형화 해모필루스 인플루엔자 (N-THi)외막 단백질 (OMP) rP4
이 실험은 BALB/c 생쥐에서의 비내 투여후에 NTHi 재조합 P4 단백질에 대한 CCG-PS 및 PEG-CCG의 점막 면역보강 활성을 비교하였다.
백신을 총 5 ㎕의 부피로 0 일 및 21 일째에 비내 투여하였다. 생쥐를 0, 21 및 28 일째에 사혈하였다. 기관지폐포 세정 (BAW) 및 질 세정 (VW)을 수행하고, 타액 시료를 28일째에 수집하였다.
CCG-PS 또는 PEG6-CCG로 전달된 재조합 NTHi 외막 P4 단백질은 재조합 P4 단백질에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 현저히 증강시켰다. 2 종의 전달 부형제 사이에서 재조합 P4 단백질에 대한 혈청 IgA 및 IgG 역가에서의 현저한 차이는 나타나지 않았다 (28 일째에 P, 0.05). 또한, CCG-PS 또는 PEG6-CCG로 전달된 재조합 P4 단백질 1㎍은 타액 및 질 세척물에서 재조합 P4 에 대해 양호한 역가의 IgA 항체를 유도하였다.
PEG6-CCG는 특이적 혈청 항체 역가의 측면에서 CCG-PS에 동등한 것으로 나타났다. 그러나, 단지 PEG6-CCG 제제만이 명백한 rP4-특이적 코 IgA 항체 반응을 유발한다는 것에 주목해야한다.
면역원 28 일째 항-rP4 ELISA 역가
혈청 혈청 코 타액 질
IgG IgA IgA IgA IgA
식염수 중의NTHi rP4 207 79 〈10 〈10 〈10
20% CCG-PS 중의NTHi rP4 16,635 1,295 〈10 128 125
PEG6-CCG 중의NTHi rP4 14,336 830 52 164 92
또한, CCG-PS 또는 PEG6-CCG로 전달된 재조합 P4 단백질 1 ㎍은 식염수 단독에 전달된 것에 비하여 응답자 생쥐의 수를 현저히 향상시킨다.
생쥐 식염수 CCG-PS PEG6-CCG
1 3,840 25,946 22,654
2 3,042 23,280 20,768
3 297 19,540 13,034
4 109 14,192 10,166
5 1 7,606 9,628
기하 평균 ±SD 207±1,835 16,635±7,346 14,336 ±6,136
28 일째에 IgG 반응역가는 최고치로부터 최저치까지 분류된다.
실시예 XI - H. 필로리 우레아제
이 실험은 BALB/c 생쥐에서 10 ㎕ 부피로 비내 투여한 후에 재조합 H. 필로리 우레아제에 미치는 CCG-PS 및 PEG6-CCG의 점막 면역보강 활성을 비교하였다.
백신을 0 일 및 21 일째에 투여하였다. 생쥐를 0 일, 21 일 및 28 일째에 사혈하였다. 기관지 폐포 세정 (BAW) 및 질 세정 (VW)을 수행하고 28 일째에 타액 시료를 수집하였다.
PEG6-CCG 또는 CCG-PS 부형제로 전달된 재조합 H. 필로리 우레아제 단백질은 재조합 우레아제 단백질에 대한 2 차 혈청 IgG 항체 역가를 현저히 향상시켰다. 재조합 우레아제 단백질에 대한 혈청 IgG 역가에서의 현저한 차이는 나타나지 않았다. 2 종의 전달 부형제 사이에서 재조합 우레아제 단백질에 대한 혈청 IgG 역가에서의 현저한 차이도 없었다 (P>0.05). 그러나, CCG-PS 및 PEG6-CCG로 전달된 재조합 우레아제 단백질 5 ㎍은, 이 실험에서 분석된 어떠한 점막 분비에서도, 재조합 우레아제에 대해 검출가능한 IgA 항체를 유발하지 않았다.
면역원 혈청 IgG
식염수 중 H. 필로리 r우레아제 5 ㎍ 〈100
20 % CCG-PS 중 H. 필로리 r우레아제 5 ㎍ 64,787 ± 45,033
5 % PEG6-CCG 중 H. 필로리 r우레아제 5 ㎍ 40,489 ± 28,674
혈청 IgG 항-재조합 우레아제 ELISA 단점 역가는 28 일째에 수집된 각각의혈청 시료 (1 군당 5개)에 대해 결정되었다.
실시예 XII - 엔. 메닌기티디스 (N. meningitidis) r필린
이 실시예에서, 백신 항체로서 재조합 엔. 메닌기티디스 (N. meningitidis) 필린을 사용하여 PEG6-CCG의 점막 면역보강 활성을 연구하였다.
20 % CCG-PS, 5 % PEG6-CCG 또는 식염수에 넣은 5 ㎍ 재조합 엔. 메닌기티디스 필린 (r필린)을 사용하여 10 ㎕ 부피로 0 일, 14 일 및 21 일째에 5 마리 BALB/c 생쥐의 군을 비내 면역화하고, 28 일째에 사혈하였다. 기관지 폐포 세정 (BAW) 및 질 세정 (VW)을 수행하고, 타액 시료를 30 일째에 수집하였다.
백신이 PEG6-CCG 부형제 중에서 IN 투여되었을 때 현저한 점막 면역보강 효과가 증명되었다. PEG6-CCG로 전달된 5 ㎍ r필린을 사용하였을 때, 코 및 질 세정물에서의 sIgA는 28 일째에 식염수 대조군에 비하여 16배 및 32 배 증가되었다. PEG6-CCG 제제와는 반대로, CCG-PS 제제는 코 세정물에서는 sIgA 역가의 2 배 증가 및 질 세정물에서는 11 배 증가만을 나타내었다. 이러한 데이타는 PEG6-CCG가 재조합 엔. 메닌기티디스 필린 단백질에 대해 향상된 전달 부형제일 수 있음을 시사하는 것이다.
면역원 혈청 IgA 코 IgA 질 IgA
식염수중 N. 메닌기티디스 r필린 6,168 12 15
20% CCG-PS중 N. 메닌기티디스 r필린 178,867 26 166
5% PEG6-CCG중 N. 메닌기티디스 r필린 135,994 194 482
실시예 XIII - GC r필린
이 실시예에서는, 백신 항원으로서 재조합 GC 필린을 사용하여 PEG6-CCG의 점막 면역보강 활성을 조사하였다.
5 % PEG6-CCG를 사용하거나 사용하지 않으면서, 0 일 및 14 일째에 10 ㎍ 재조합 GC 필린 (r필린)의 10 ㎕ 부피로 5 마리의 BALB/c 생쥐의 군을 비내 면역화하고, 28 일째에 사혈하였다. 29 일째에 질 세정물을 수집하였다.
백신이 PEG6-CCG 부형제 중에서 IN 투여될때 현저한 면역보강 효과가 증명된다. PEG6-CCG에 첨가한 r필린 10 ㎍을 사용하면, 혈청 항-r필린 IgA 및 IgG 항체 역가가 28 일째에 각각 2 배 및 5 배 증가되었다. 전체 세포 ELISA 역가도 또한 약간 증가되었다 (10,570 대 6,843). 질 세정물에서의 sIgA 는 4 배 이상 증가되었다.
면역원 혈청 IgA 혈청 IgG 전체 세포 IgG 질 세정물 IgA
식염수중 r필린 301 6,422 6,843 351
5 % PEG6-CCG 중 r필린 609 34,358 10,570 1,517
코 세정물은 이 실험에서 수집되지 않았다.CCG-PS는 이 실험에 포함되지 않았다.
실시예 XIV - 점막 보조제의 수용가능성 및 관용성의 평가
2 종의 점막 보조제 (CCG-PS 및 PEG6-CCG)의 수용가능성 및 관용성을 임상 연구로 평가하였다. 18 세 또는 그 이상의 29 명의 건강한 개인 (남성 15명, 여성 14 명)이 연구에 등록되었다.
처리는 5 회의 비내 분무 투여로 구성되었다. 등장 식염수를 함유하는 첫번째 2 회의 투여는 조사원 및 피험자에게 보이게 하였다. 이러한 2 회의 식염수 투여는 모두 비공에 동시에 투여되었으며, 이는 시험용 보조제를 평가하기 위하여 피험자 및 조사원에 대한 비교용 기초로서 사용된다. 식염수 (NS), CCG-PS (RV) 및 PEG6-CCG(SG)를 함유하는 다른 투여는 조사원 및 피험자에게 보이지 않게 하였다. 3 회의 시험 투여를 비내 투여하였으며, 각각의 투여는 30분 간격으로 떨어져서 행하고, 하기 섭생법에 따라 투여하였다.
투여 1 - 투여 2 - 투여 3
비공 순서 보조제 순서 # 피험자
우측-좌측-우측 (RLR) NS-RV-SGNS-SG-RVRV-SG-NSSG-RV-NS 5435
좌측-우측-좌측 (LRL) NS-RV-SGNS-SG-RVRV-SG-NSSG-RV-NS 3234
보조제에 대한 조사원과 피험자의 평가를 모두 수집하였다. 조사원의 평가는 각각의 투여후 30 분째에 비강에 대해 조사원이 채점하고, 비강의 발적, 분비물 증가 및 육안적 부작용에 대해 전체적으로 판정하였다.
피험자의 평가는 보조제의 각각의 투여후 0, 5, 10, 20 및 30 분째에 식염수에 대조되는 감응성에 대해 피험자가 평가하였다. 피험자는 또한 각각의 처리에 관련된 자극의 상대 정도를 분류하였다.
각각의 보조제에 대해 조사원의 평가 점수를 요약하였다. 각각의 보조제에 대해 피험자에 의한 감응성 점수를 각각의 시점에서 요약하였으며, 각각의 시점에서 피험자의 평가 점수를 합하면 피험자에 의해 채점된 총 감응성을 나타낸다. 통계 방법은 맨텔-핸스젤 카이-제곱 시험(MH)이다. 분석에서 통계적 의의 수준은 0.05 이다.
23 명의 피험자들은 CCG-PS를 투여후 즉시 "식염수에 비해 명확하게 훨씬 더 자극적이거나 불쾌한" 것으로 평가하였다 (표 13). 20 분내에, 23 명의 피험자중 20 명에게 분명한 자극은 아주 약한 정도로 감소되거나 자극이 없어졌다. 나머지 3 명의 피험자들은 투여후 30 분에도 여전히 강한 자극을 느꼈다. 한편, 조사원은 이들 3 명의 피험자에게 CCG-PS와 관련된 최소 (2/3) 또는 최대 (1/3) 자극을 기록하였다.
반대로, 12 명의 피험자들 (CCG-PS로부터 통계적으로 중요한 차이)은 PEG6-CCG를 투여후 즉시 "식염수에 비해 명확하게 훨씬 더 자극적이거나 불쾌한" 것으로 평가하였다 (표 13). 5 분내에, 12 명의 피험자중 9 명에 대해 강한 자극이 약한 자극으로 감소되었다. 12 명의 피험자중 나머지 3 명과 추가의 피험자는 투여후 30 분 경과한 시간에서도 PEG6-CCG와 관련된 강한 자극을 느꼈다.
각각의 시점에서 보조제에 의한 자극 점수를 합하였다. CCG-PS는 0 및 5 분 시점에서 PEG6-CCG에 비해 훨씬 더 자극적이었다 (p<0.01, 표 13). 2 종의 보조제에 대한 자극 시험은 이후의 시점에서도 통계적으로 다르지 않았다.
총 3 회의 보이지않은 투여와 관련된 자극을 직접적으로 비교 (다시말해서, 식염수에 비교하지 않고 상호간의 비교)함에 있어서, CCG-PS는 가장 자극이 큰 보조제였다. CCG-PS는 피험자의 76 % (29 명중 22 명)에게 가장 자극이 큰 보조제이었다.
수용가능성-피험자의 평가
식염수 CCG-PS Softigen
차이 0 1 2 합계 0 1 2 합계 0 1 2 합계
시간 (분) 05102030 26 3 328 1 128 1 128 1 128 1 5 23 512 13 14 419 13 7 2719 7 3 1322 4 3 10 1 16 12 407 20 2 249 18 2 2212 14 3 2017 8 4 16
주: 식염수에 비교한 차이를 나타낸 부호: 0=상이하지 않음; 1=약간 상이함;2=매우 상이함.주: RS = CCG-PS를 먼저 첨가한 다음 Softigen을 첨가SR = PEG-6-CCG를 먼저 첨가한 다음 CCG-PS를 첨가
본 발명은 바람직한 구현양태를 참조로 하여 특별하게 나타내고 기재하였으나, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 바와 같이, 당업자라면 본 발명의 의도 및 범위를 벗어나지 않으면서 형식 및 세목에 대해 여러 가지 변형을 가할 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (32)

  1. i) 하기 화학식 I을 갖는, 치환된 모노글리세리드 및 치환된 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 글리세리드 0.01∼70 % v/v을 함유하는 보조제;
    ii) 하나 이상의 항원; 및
    iii) 임의로, 생리학적으로 허용가능한 부형제
    를 함유하는 조성물.
    <화학식 I>
    상기 식에서, R1, R2및 R3은 포화 또는 불포화 C6-24지방산, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되며, 단 글리세리드는 하나 이상의 수용성 중합체를 함유한다.
  2. 제1항에 있어서, 지방산이 포화 및 불포화 C6-14지방산에서 선택되는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 지방산이 포화 C8-10지방산에서 선택되는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체가 2∼30개의 폴리옥시에틸렌 단위를 갖는 폴리옥시에틸렌의 PEG2-30잔기, 또는 그의 유도체로 구성된 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 수용성 중합체가 3∼6 개의 폴리옥시에틸렌 단위를 갖는 폴리옥시에틸렌의 PEG3-6잔기인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 글리세리드가 하기 화학식 II, III, IV 및 V로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는 조성물.
    <화학식 II>
    <화학식 III>
    <화학식 IV>
    <화학식 V>
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치환된 모노글리세리드 대 치환된 디글리세리드의 비율(% v/v)이 약 0.1:99.9 내지 약 99.9:0.1, 바람직하게는 약 5:95 내지 약 95:5인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 글리세리드의 농도가 약 0.1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 20 중량%, 더욱 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 15 중량%인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 글리세리드의 키랄 탄소가 S- 또는 R-형태, 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 입상 형태인 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 용해된 형태인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제, 흡수 촉진제, 물 흡수 중합체, 효소 분해를 억제하는 물질, 알콜, 유기 용매, 오일, pH-조절제, 가용화제, 안정제, HLB-조절제, 점도 조절제, 보존제, 삼투압 조절제, 추진제, 공기 치환제, 물 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 더 함유하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 보조제에 결합된 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 기 R1, R2및 R3의 하나가 결합된 항원으로 치환된 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물인 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 식물학적 조성물인 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 면역원성 조성물인 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 백신 조성물인 조성물.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 항원이 자기면역 질병의 치료를 위해 사용되는 조성물.
  20. 인간에게 투여하기 위한 약제 제조를 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 피부 표면 또는 점막 표면을 통해 투여하는 용도.
  22. 제21항에 있어서, 점막 표면이 코, 폐, 입, 눈, 귀, 위장관, 생식기 관, 질, 직장의 점막 표면으로 구성된 군에서 선택되는 용도.
  23. 식물에 투여하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  24. 제23항에 있어서, 식물의 외피, 종자 또는 성장 매질에 투여하는 용도.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 포유동물 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  26. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 포유동물 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 점막 표면에 항원을 전달하는 방법.
  27. 하기 화학식 I을 갖는, 치환된 모노글리세리드, 치환된 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 글리세리드 0.01∼70 % v/v을 함유한 보조제를 포함하는 조성물의 유효량 및 항원을 포유동물 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
    <화학식 I>
    상기 식에서, R1, R2및 R3은 포화 또는 불포화 C6-24지방산, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되며, 단 글리세리드는 하나 이상의 수용성 중합체를 함유한다.
  28. 제27항에 있어서, 글리세리드가 하기 화학식 II, III, IV 및 V로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는 방법.
    <화학식 II>
    <화학식 III>
    <화학식 IV>
    <화학식 V>
  29. 제27항에 있어서, 항원과 보조제를 함유한 조성물을 순차적으로 투여하는 방법.
  30. 하기 화학식 I을 갖는, 치환된 모노글리세리드, 치환된 디글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 글리세리드 0.01∼70 % v/v을 함유한 보조제를 포함하는 조성물의 유효량 및 생활성제를 식물에 투여하는 것을 포함하는, 식물에 생활성제를 전달하는 방법.
    <화학식 I>
    상기 식에서, R1, R2및 R3은 포화 또는 불포화 C6-24지방산, 수용성 중합체 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되며, 단 글리세리드는 하나 이상의 수용성 중합체를 함유한다.
  31. 제30항에 있어서, 글리세리드가 하기 화학식 II, III, IV 및 V로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는 방법.
    <화학식 II>
    <화학식 III>
    <화학식 IV>
    <화학식 V>
  32. 제30항에 있어서, 생활성제가 제초제, 살충제, 살진균제, 식물 성장 조절제, 비료, 항원 및 백신으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
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