JP2013528623A - 経鼻免疫化 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年6月4日出願の米国特許出願第12/794,629号に対する優先権を主張し、当該米国特許出願第12/794,629号は、2007年6月7日出願の米国出願第11/811,304号の一部継続出願であり、当該米国出願第11/811,304号は現在、米国特許第7,244,703号である、2004年3月5日出願の米国出願第10/895,465号の継続出願であり、当該米国出願第10/895,465号は、2003年12月18日出願の米国出願第10/481,309号の一部継続出願であり、当該米国出願第10/481,309号は、2002年6月24日出願の国際出願第PCT/US02/19849号の国内段階への移行であり、当該国際出願第PCT/US02/19849号は、2001年6月22日出願の米国仮出願第60/300,293号に対する優先権を主張し、それらのそれぞれの開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
式中、XおよびYは上記に定義した通りであり、mおよびnは1〜20の値を有する整数であり、和m+nは25以下であり、pは0または1の値を有する整数であり、qは0または1の値を有する整数であり、rは0または1の値を有する整数であり、R、R1、R2、R3、R4、R5およびR6はそれぞれ独立に、水素、または直鎖状もしくは分枝状であってよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基(ただし、R1〜R6のうちの1つのみがアルキル基であり得る)であり、ただし、p、qおよびrが0の値を有し、Yが酸素である場合、m+nは少なくとも11であり、さらに、Xがイミノ基であり、qが1であり、Yが酸素であり、pおよびrが0である場合、m+nは少なくとも11であり、前記化合物が、抗原(または抗体)が身体の膜を越える通過速度を増強する]。以下、これらの化合物を、増強剤と呼ぶ。R、R1、R2、R3、R4、R5またはR6がアルキルである場合、それは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、アミル、ヘキシル等であってよい。そのような浸透増強剤が、米国特許第5,023,252号および第5,731,303号に記載されている。
下記の例は、例示的な本発明の組成物である。組成物を構成する成分の濃度を、組成物の総重量に対する重量パーセントで示す。
この例は、オキシコドンの送達のための鼻腔内スプレーとして使用することができる組成物の調製を記載する。オキシコドンは、その遊離塩基の形態で使用し、遊離塩基は、市販されている塩酸塩から、20部の水および化学量論量の1.0N水酸化ナトリウム中に溶解させることによって調製した。沈殿物を収集し、水を用いて洗浄した。次いで、沈殿物を、真空ポンプを使用して室温で乾燥した。
組換え炭疽抗原を用いた経鼻免疫化
材料および方法
バチルス・アントラシス由来の炭疽防御抗原、rPaを、Calbiochem(www.emdchemicals.com)から購入する。上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−2−オンを含有するプレミックスを調製する。rPAを含有する溶液を別個に調製する。rPAを、(i)アジュバントなしで、PBS中に配合するか、(ii)アジュバントとしての水酸化アルミニウム(70mgの水酸化アルミニウム/10mgのrPA)(Alhydrogel;Superfos Biosector)上に吸着させるか、または(iii)アジュバントとしての非メチル化、ホスホロチオエート連結、CpG含有オリゴヌクレオチド(以下、「CpG」; 10mgのCpG/10mgのrPA)(番号1826、5’−TCCATGACGTTCCTGACGTT−3’;Proligo)と共に配合する。プレミックスを、rPAを含有する溶液に室温で添加し、得られた混合物を、ローラーミル上、120rpmで転がすことによって、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。当業者であれば、製剤中の各成分の特定の量を、過度の実験をせずとも決定することができる。
雌のBALB/cマウス(Charles River Laboratories)、6〜8週齢(10匹のマウス/群)を、10μgのrPAを用いて第0、21および42日に免疫化する。鼻腔内送達のために、液体を、麻酔を施したマウスの鼻腔内に滴下注入する(各鼻孔中に15μL)。麻酔を施したマウスから、それらの後眼窩鼻腔を介して第21、42および56日に採血する。
rPA特異的抗体価のELISA分析を実施する。Maxisorp96ウエルプレート(Nunc)を、0.05モル/Lの炭酸コーティング用緩衝液(pH9.6)中の1mg/mLのrPAを用いて4℃で一晩コーティングする。プレートを、ブロック用緩衝液(PBS−Tween20中の5%の脱脂粉乳の粉末)中、37℃で1.5時間ブロックし、次いで、PBS−Tween20を用いて3回洗浄する。試料を、二つ組でプレートにわたりブロック用緩衝液中に2倍段階希釈し、37℃で1時間インキュベートする。3回の洗浄の後、プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG(Southern Biotechnology)を加えて37℃で45分間インキュベートする。洗浄後、プレートを、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(Sigma)を加えて室温で30分間発色させ、発色を、0.5モル/LのH2SO4の添加により停止し、光学密度を450nmで読み取る。エンドポイントの力価を、未免疫化対照動物から得られた血清試料について得られたバックグラウンドの少なくとも3倍のOD450nmの値をもたらす、試料の最も高い希釈度と定義する。抗体のアイソタイプを、HRP標識ヤギ抗マウスIgG1またはIgG2a抗体およびマウス参照標準物質(Bethyl Laboratories)の使用により決定する。
TNA力価を、Littleら、Production and characterization of monoclonal antibodies against the lethal factor component of Bacillus anthracis lethal toxin、Infect.Immun.1990;58:1606〜13に記載されている方法の改変バージョンの使用により決定する。コンフルエントなJ774A.1細胞を、37℃および5%CO2中で、無菌96ウエル透明底黒色プレート(Corning Costar)中に蒔く(7×104細胞/ウエル)。100ng/mLのLF(List Biological Laboratories)および200ng/mLのrPAを含有する新鮮な溶液を、三つ組の、等しい体積の希釈試料と混合し、37℃で1時間インキュベートする。次いで、培地を、LF、PAおよび試験試料の希釈溶液100mLと交換し、これを、5%CO2中、37℃で4時間インキュベートする。細胞生存率を、ATP含有量により決定し(ViaLight HS;Cambrex Bio Sciences Rockland)、未処理の細胞を参照対照として使用する。エンドポイントのTNA力価を、対照の血清試料の中和の3倍超である、PA−LTの二成分の毒素による細胞傷害性の(t検定による)有意な中和をもたらす最も高い血清の希釈度の逆数と定義する。
経鼻免疫化の防御の有効性を決定するために、致死的なチャレンジによる研究を、ウサギにおいて実施する。エアロゾルチャレンジを、Pittら、In vitro correlate of immunity in a rabbit model of inhalational anthrax、Vaccine 2001;19:4768〜73の記載に従って実施する。提示するエアロゾルの用量を、曝露前に実施する呼吸器機能の測定から誘導する毎分換気量(Vm)の推定値を使用することによって計算して決定する。次いで、提示するエアロゾルの用量を、各動物が吸入する実験の大気(Vt/Vm×曝露の長さ)の総体積(Vt)と、チャンバーからの試料採取から実験的に決定する曝露濃度(Ce)とを乗じることによって計算する(提示する用量=Ce×Vt)。用量を、1.1×105cfuが1致死用量に等しいことに基づいて、致死用量の倍数として表す。ウサギに、103±45LD50の平均±SD吸入用量を投与する。生存率を、フィッシャーの直接確率検定の使用により、倍数の比較のためにブートストラップ調節を用いて比較する。死亡までの時間の比較を、t検定の使用により、倍数の比較のためにブートストラップ調節を用いて行う。
大腸菌抗原を用いた免疫化
毒素原性大腸菌(ETEC)は、旅行者下痢症の主要な原因である。ETECは、汚染されている食品および飲料を介して伝染する。ETECは、小腸においてコロニー形成し、熱不安定性エンテロトキシン(LT)もしくは熱安定性エンテロトキシン(ST)、または組合せを分泌し、これらのエンテロトキシンは、分泌性下痢を引き起こす。
未変性の大腸菌LTを、大腸菌株HE22 TP 235 Kmから産生する。上記の記載に従って、LTをオキサシクロヘキサデカン−2−オンおよびその他の構成成分と混合して、鼻用製剤を調製する。
健常な成人(18〜45歳)を、この研究のために登録する。排除の判断基準は、旅行者下痢症の病歴、過去12ヵ月間に流行国へ旅行したことがあること、コレラ、LTまたはETECワクチンの以前の使用、顕著な疾病、免疫抑制等を含む。
ワクチンを、2回に分けて投与する。第1の用量を第0日に、第2の免疫化を第15日に投与する。
ボランティアを、それぞれの投与後、即時の有害作用の発生について20分間観察する。ボランティアに、ワクチン接種後に観察される徴候および症状を記録するための日記帳を与える。報告される症状を、軽度(認め得る)、中等度(通常の日々の活動に影響を及ぼす)、または重度(通常の日々の活動を中断させる)に段階付ける。ボランティアを、臨床評価および副作用の可能性の評価について第24および48時間時に評価する。ワクチンの皮膚反応の徴候を示すボランティアに、さらなる臨床評価のために第72時間時に外来を再度訪れるように指示する。次いで、ボランティアを、必要に応じて、副作用が完全に消散してしまうまで追跡する。
抗体分泌細胞(ASC)のワクチン抗原に対する応答を、この研究についての免疫学的エンドポイントとして選ぶが、これは、以前の研究が、ASC応答が腸粘膜の免疫応答と相関することを示しているからである。Wennerasら 1992、Antibody−secreting cells in human peripheral blood after oral immunization with an inactivated enterotoxigenic Escherichia coli vaccine、Infect.Immun.60:2605〜2611。静脈血試料を、ボランティアから、免疫化前の第0日、ならびに最初の免疫化後の第7、28、35、56、84、91、98および112日に得る。血液標本を、EDTA処理チューブ(Becton Dickinson Vacutainer Systems、Rutherford、N.J.)を使用して収集する。末梢血単核球(PBMC)を、血液試料から、Ficoll−Hypaque(Sigma Chemical Co.、St.Louis、Mo.)上で勾配遠心分離することによって単離し、IgAおよびIgG ASCの総数およびワクチンに特異的な数について、酵素結合イムノスポット(ELISpot)の技法によりアッセイする。ニトロセルロース製底部の96ウエルプレート(Millititer HA;Millipore Corp.、Bedford、Mass.)の個々のウエルを、0.1mlの精製CS6(20μg/ml)またはGM1ガングリオシド(0.5μg/ml)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートする。GM1でコーティングしたウエルを、PBS洗浄の後、LT(0.5μg/ml)に37℃で2時間曝露する。プレートを、PBSを用いて洗浄した後、5%ウシ胎仔血清(Gibco BRL)および50μg/mlのゲンタマイシン(Gibco BRL)を補充した完全RPMI培地(Gibco BRL、Grand Island、N.Y.)を用いてブロックする。PBMCを、完全RPMI培地中で、2×107個の生存細胞/mlに調節する。最終的なPBMC懸濁液0.1mlを、各ウエルに添加し(1ウエル当たり106個のPBMCを添加する)、プレートの内容物を、5.0%CO2中、37℃で4時間インキュベートする。プレートを洗浄する。それらの内容物を、明確に異なるアイソタイプ特異性を有する、親和性により精製されているヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体2つの混合物(一方は、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた抗体(IgG)であり、他方は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗体(IgA)(Southern Biotech Associates、Birmingham、Ala.)である)を加えて4℃で一晩インキュベートし、適切な色素原−酵素基質(Sigma)に曝露する。個々の細胞が分泌した抗体の帯域に対応するスポットを、三つ組のウエル中で、×40の倍率下で計数し、データを、106個のPBMC当たりのスポット形成細胞の数として表す。以前の記載に従って(Jertbornら、2001、Dose−dependent circulating immunoglobulin A antibody−secreting cell and serum antibody responses in Swedish volunteers to an oral inactivated enterotoxigenic Escherichia coli vaccine、Clin.Diagn.Lab.Immunol.8:424〜428)、我々は、ベースラインの試料中のASCの数が、106個のPBMC当たり≧0.5である場合には、106個のPBMC当たりのASCのベースラインの値と比べた≧2倍の増加と、陽性のASC応答を定義する。免疫前のASCの数が、106個のPBMC当たり0.5未満である場合には、投与後の、106個のPBMC当たり>1.0の値を陽性の応答とみなす。
静脈血試料を、ボランティアから、免疫化前、ならびに各免疫化後の第14および28日に得て、血清抗体価を測定する。LTに対するIgAおよびIgG抗体価を、GM1−酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の方法により測定する(Jertbornら、1998、Safety and immunogenicity of an oral inactivated enterotoxigenic Escherichia coli vaccine、Vaccine 16:255〜260)。LTを固相抗原として使用する。ELISAのために使用するLTは、ワクチンの調製のために使用するのと同じロットから得る。個々のマイクロタイターウエル(immunoplates;Nunc、Roskilde、デンマーク)を、GM1ガングリオシド(0.5μg/ml)(Sigma)を用いて、室温で一晩、37℃で一晩コーティングする。次いで、GM1でコーティングしたウエルを、PBSを用いて洗浄し、0.1mlのLT(0.5μg/ml)を加えて37℃で2時間インキュベートする。血清試料を、0.1%ウシ血清アルブミン(Sigma)を用いてブロックした後、3倍段階希釈し(最初の希釈度は、1:5)、次いで、室温で90分間インキュベートする。結合している抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたウサギ抗ヒトIgAまたはIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、Pa.)の添加により実証し、室温で90分間インキュベートし、続いて、o−フェニレンジアミン−H2O2(Sigma)を添加する。バックグラウンドを0.4上回る450nmにおける光学密度(450nmにおける吸光度)をもたらす、内挿された試料の希釈度としてエンドポイントの力価を割り当てる。力価を、各試験に含めた参照標本に関して調節して、毎日の変動を償う。同じボランティアから得られる投与の前および後の血清試料を、常に並べて試験する。各試料に帰属させる抗体価は、異なる日に実施する二つ組の決定の幾何平均を示した。<5であるエンドポイントの力価の逆数には、計算のために2.5の値を割り当てる。我々は、有意な応答(血清転換)を、免疫化前と免疫化後との間における、エンドポイントの力価の≧2倍の増加と定義し、免疫化後の力価の逆数が≧10であることを追加の判断基準とする。Guerena−Burguenoら、Safety and Immunogenicity of a Prototype Enterotoxigenic Escherichia coli Vaccine Administered Transcutaneously、INFECTION AND IMMUNITY、2002、1874〜1880頁。
炭水化物抗原を用いた免疫化
血液型に関連するTn、T、シアリル−Tn、シアリル−T抗原(T抗原のファミリー)ならびに糖脂質GM2、GD2およびGD3等の炭水化物抗原は、種々の癌と関連がある。Lo−Mannら、Cancer Research 64:4987(2004)。悪性の形質転換により、グリコシル化の調節不全が生じるように見える。炭水化物に対する抗体を開発することによって、腫瘍に対する攻撃の新しいモードを提供することができる。例えば、CA−19−9は、膵臓、胃および結腸直腸を含めた、種々の消化器の腫瘍と関連がある。Duffy M.J.、CA 19−9 as a marker for gastrointestinal cancers:a review、Ann.Clin.Biochem.1998、35(Pt3):364〜70。CA−19−9を含有する鼻用製剤を、以下に従って調製する。
上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−2−オンを含有するプレミックスを調製する。CA−19−9を含有する溶液を別個に調製する。プレミックスを、CA−19−9を含有する溶液に添加し、得られた混合物を、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。
雌のBALB/cマウス(Charles River Laboratories)、6〜8週齢(10匹のマウス/群)を、上記の記載に従って配合した500μg〜2mgのCA−19−9を用いて、第0、21および42日に免疫化する。免疫化を、鼻腔内スプレーデバイスを使用して実施する。
96ウエルプレート(Nunc)を、0.05モル/Lの炭酸コーティング用緩衝液(pH9.6)中の0.25mg/mLのCA−19−9を用いて4℃で一晩コーティングする。プレートを、ウシ血清アルブミンを使用してブロックする。免疫化したおよび対照のマウスから得られた血清試料を、二つ組でプレートにわたりブロック用緩衝液中に2倍段階希釈し、37℃で1時間インキュベートする。プレートを、洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG(Southern Biotechnology)を加えてインキュベートする。プレートを、洗浄後、テトラメチルベンジジン基質(Sigma)を用いて室温で30分間発色させ、反応を停止する。光学密度を450nmで読み取る。エンドポイントの力価を、未免疫化対照動物から得られた血清試料について得られたバックグラウンドの少なくとも3倍のOD450nmの値をもたらす、試料の最も高い希釈度と定義する。抗体のアイソタイプを、HRP標識ヤギ抗マウスIgG1またはIgG2a抗体およびマウス参照標準物質(Bethyl Laboratories)の使用により決定する。
多糖を用いた免疫化
ストレプトコッカス・ニューモニエは、肺炎球菌性肺炎および肺炎球菌性菌血症を引き起こす恐れがある。ストレプトコッカス・ニューモニエに対する肺炎球菌多糖体ワクチンの構成成分となる精製肺炎球菌多糖体を、ATCC(http://www.atcc.org/culturesandproducts/microbiology/purifiedpneumococcalpolysaccharides/tabid/185/default.aspx)から購入する。また、PNEUMOVAX(登録商標)23(肺炎球菌ワクチン、多価)もMerckから購入することができる。PNEUMOVAX(登録商標)23は、ストレプトコッカス・ニューモニエの23種の最も流行性または侵襲性の肺炎球菌のタイプに由来する高度に精製された莢膜多糖体の混合物からなる。肺炎球菌多糖体を含有する鼻用製剤を、以下に従って調製する。
上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−2−オンを含有するプレミックスを調製する。肺炎球菌多糖体を含有する溶液を、別個に調製する。プレミックスを、肺炎球菌多糖体を含有する溶液に添加し、得られた混合物を、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。
マウスまたはヒト対象を、肺炎球菌多糖体を含有する製剤を用いて鼻から免疫化し、抗体価を試験する。予防接種の実施に関する諮問委員会(ACIP)が、肺炎球菌性疾患の予防についてのワクチンに特定された勧告を示している。それらは、http://www.cdc.gov/mmwr/PDF/rr/rr4608.pdf、およびhttp://www.cdc.gov/vaccines/recs/provisional/downloads/pneumo−Oct−2008−508.pdfから入手可能である。
DNAワクチンを用いた免疫化
DNAワクチンは、防御免疫応答を発生させる新規の方法を提供する。上記の例3では、マウスを、バチルス・アントラシス由来の組換えrPAを用いて免疫化した。以下の実験では、マウスを、防御抗原(PA)の解毒化形態をコードするDNAプラスミドを用いて鼻から免疫化し、抗体価を試験する。
バクテリオファージラムダを送達ビヒクルとして用いるDNAワクチンによる免疫化
DNAワクチン接種においては、ワクチン遺伝子を真核生物発現カセットの制御下に含有するプラスミドを使用して、宿主にワクチン接種することができる(「裸のDNA」によるワクチン接種)。また、全バクテリオファージλ粒子も、DNAワクチンの送達ビヒクルとして使用することができる。この系においては、ワクチン抗原を適切な真核生物発現カセット中でコードする遺伝子を、標準的なλgt11バクテリオファージ内にクローニングし、バクテリオファージ粒子全体を使用して、宿主に接種する。DNAを、安定なタンパク質マトリックス内に含有させ、このマトリックスは、DNAをヌクレアーゼ分解から防御し、併せてまた、ワクチンの抗原提示細胞(APC)に対する標的化も行う。
不活性化ウイルスを用いた免疫化
この例は、経鼻免疫化のために、不活性化した全H1N1インフルエンザウイルスを抗原として使用する。
Madin−Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞(ATCC CCL 34)を、10%仔ウシ血清を含有するダルベッコ変法基本培地(DMEM)中に維持する。105pfuのインフルエンザA/PR8/34(H1N1)を、10または11日齢のニワトリの胚発育卵に接種することによって、インフルエンザウイルスのストックを調製する。40時間のインキュベーション後、卵を4℃に一晩移す。尿膜液を集め、1500×gで20分間遠心分離して、細胞デブリを除去する。透明な上清を、120,000×gで1時間遠心分離して、インフルエンザウイルス粒子をペレット化し、これらを、PBS中に再懸濁し、遠心分離により、不連続スクロース勾配(15%、30%および60%)層を使用してさらに精製する。ウイルスの純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクマシーブルー染色により分析する。赤血球凝集活性を、以前の記載に従って、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.2中で、ニワトリ赤血球(RBC)0.5%(w/v)を用いて決定する。Compans RW、Hemagglutination−inhibition:rapid assay for neuraminic acid−containing viruses、J Virol.1974;14(5):1307〜9。Novakら、Murine model for evaluation of protective immunity to influenza virus、Vaccine 1993;1l(l):55〜60。不活性化のために、精製したウイルスを、1:4000(v/v)ホルマリンを用いて処理し、37℃で3日間インキュベートし、次いで、PBSに対して透析する。ウイルスの不活性化を、10日齢のニワトリの胚発育卵中へのウイルスの接種およびMDCK細胞中でのプラークアッセイにより確認する。Shaら、Induction of CD4(+)T−cell−independent immunoglobulin responses by inactivated influenza virus、J Virol.2000;74(11):4999〜5005。
雌のBalb/cマウス(6〜8週齢)を、Charles River Laboratory(Wilmington、MA)から購入し、鼻腔内免疫化のために使用する。我々は、12匹のマウス/群を使用する(同じ群内の6匹のマウスを、チャレンジ研究のために使用する)。鼻腔内免疫化のために、50μgの不活性化インフルエンザウイルスを、50μlのPBS中で希釈したCT(100μg)を加えてまたは加えずに、3回、第0、3および6週において投与する。
血清を、免疫前試料として予備刺激の4日前に、かつ第1および第3の免疫化の2週間後に収集する。血液を、イソフルラン(Novaplus)を用いた麻酔後に、後眼窩神経叢から、非ヘパリン処理ミクロキャピラリーを用いて収集する。肺洗浄液は、肺を、PBSを用いて洗浄することによって収集する。唾液を、分泌を刺激するための2μgのカルバモイルコリンクロリドの腹腔内注射の後に、Eppendorf管中に収集する。膣洗浄液試料は、膣を、200μlの無菌のPBSを用いて洗浄することによって収集する。糞便試料を、収集し、秤量し、PMSFを有する無菌のPBS、1ml中に再懸濁し、これを、均一になるまで激しくボルテックスし、2000×gで10分間遠心分離し、上清を、収集し、ろ過し、アッセイするまで−20℃で保存する。全ての試料を、プロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニルメチルスルホニル(1mM)と混合し、アッセイするまで−20℃で保存する。
感染後の、無処置および免疫化マウスの肺中のインフルエンザウイルス力価を決定するために、動物に対して、最後の免疫化の11週間後に、25μlのウイルス(600pfu)(1×LD50)の鼻腔内滴下注入によりチャレンジを行う。チャレンジしたマウスを、病的状態の徴候(体重変化、発熱および猫背の姿勢)、ならびに死亡についてモニターする。マウスの体重を、チャレンジの直前に測定し、チャレンジ後は毎日測定する。各群のマウスの半分を、チャレンジ後の第4日および第8日に屠殺する。肺のホモジネートを、血清を含有しないDMEM培地中に調製して、肺組織1g当たりで決定されるウイルス力価を評価する。Shaら、Induction of CD4(+)T−cell−independent immunoglobulin responses by inactivated influenza virus、J Virol.2000;74(11):4999〜5005。プラークアッセイのために、我々は、肺上清の段階希釈物を調製し、それらを、コンフルエントなMDCK単層細胞と共にインキュベートし、0.75%寒天および0.025%トリプシンを有するDMEM培地(Sigma)を用いて覆う。3日間の培養の後、細胞を、20%エタノールを用いて固定し、20%エタノール中の1%クリスタルバイオレットを用いて染色し、プラークを計数する。
全ての血清および粘膜分泌物中のウイルス特異的IgG、IgG1、IgG2aおよびIgAの濃度を、以前の記載に従って、精製不活性化インフルエンザウイルスを用いてコーティングしたELISA用プレート中で決定する。Shaら、Induction of CD4(+)T−cell−independent immunoglobulin responses by inactivated influenza virus、J Virol.2000;74(11):4999〜5005。Kangら、Enhancement of mucosal immunization with virus−like particles of simian immunodeficiency virus、J.Virol.2003;77(6):3615〜23。Kangら、Intranasal immunization with inactivated influenza virus enhances immune responses to coadministered simian−human immunodeficiency virus−like particle antigens、J Virol.2004;78(18):9624〜32。我々は、以前の記載に従って、赤血球凝集阻害(HI)および中和抗体価を決定し、これらの両方を、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答の指標として使用する。Shaら、Induction of CD4(+)T−cell−independent immunoglobulin responses by inactivated influenza virus、J Virol.2000;74(11):4999〜5005。Novakら、Murine model for evaluation of protective immunity to influenza virus、Vaccine 1993;11(1):55〜60。
(1)サイトカインのELISA
脾臓または鼠径部リンパ節の細胞(0.2×106/200μlの完全RPMI培地)を、最後の免疫化後の第2週に免疫化マウスから調製し、in vitroにおいて、不活性化インフルエンザウイルスを用いて完全RPMI培地中、1μg/mlの最終濃度で刺激する。Shaら、Induction of CD4(+)T−cell−independent immunoglobulin responses by inactivated influenza virus、J Virol.2000;74(11):4999〜5005。Kangら、Enhancement of mucosal immunization with virus−like particles of simian immunodeficiency virus、J.Virol.2003;77(6):3615〜23.Kangら、Intranasal immunization with inactivated influenza virus enhances immune responses to coadministered simian−human immunodeficiency virus−like particle antigens、J Virol.2004;78(18):9624〜32。72時間後、細胞を遠心分離し、上清を収集し、アッセイするまで−80℃で保存する。サイトカインの産生(TNF−α、IFN−γ、IL−4、IL−6およびIL−10)を、製造元の指示に従って決定する。
免疫化マウスから単離して間もない脾細胞およびLN細胞(0.5〜1.0×106/200μlの完全RPMI)を、以前の記載に従って、完全RPMI培地中、1μg/mlのホルマリンの存在下で不活性化インフルエンザウイルスと共に36時間培養する。Kangら、Intranasal immunization with inactivated influenza virus enhances immune responses to coadministered simian−human immunodeficiency virus−like particle antigens、J Virol.2004;78(18):9624〜32。手短に述べると、捕捉抗体IFN−γ、IL−4、IL−2、IL−5およびIL−12p70(炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH9.6中、4μg/ml)を使用して、Multiscreen96ウエルろ過用プレート(Millipore)を4℃で一晩コーティングする。抗体でコーティングしたプレートを、RPMI1640中で10%ウシ胎仔血清を用いて37℃で1時間ブロックした後、完全RPMI緩衝液1640中の単離して間もない脾細胞またはリンパ球を、二つ組のウエル中の各ウエルに添加する。脾臓細胞(1.0×106/200μl)を、不活性化インフルエンザウイルス(1μg/ml)またはペプチド刺激薬と混合し、36〜40時間培養する。同様に、LN細胞(1.0×106/200μl)も、不活性化インフルエンザウイルス(1μg/ml)の存在下で培養する。サイトカインに特異的なスポットを検出するために、我々は、IFN−γ、IL−4、IL−2、IL−5およびIL−12に特異的なビオチン化抗マウス抗体、ならびにストレプトアビジン−HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)を使用する。スポットを、安定なジアミノベンジジン(Research Genetics)を用いて発色させ、ELISPOTリーダー(Cellular Technology)中で計数する。
偽感染性ウイルスを用いた免疫化
西ナイルウイルス(WNV)は、フラビウイルス科のフラビウイルス属に属するポジティブセンス、一本鎖RNAウイルスである。機能性C遺伝子を欠く偽感染性のWNVは、RepliVAX WNと名付けられ、西ナイル脳炎に対するワクチン候補として開発されている。Widmanら、Construction and characterization of a second−generation pseudoinfectious West Nile virus vaccine propagated using a new cultivation system、Vaccine(2008)26、2762〜2771。RepliVAX WNは、RepliVAX WNの成長をトランスに補足するのに必要であるCタンパク質を安定に発現するように工学的に作製されたBHK細胞およびワクチン用に認められているベロ細胞中で、高い力価で安全に増殖することができる。第2世代のRepliVAX WN(RepliVAX WN.2)が近く開発される。
全ての研究のために使用されたベビーハムスター腎臓細胞、滴定のために使用されたベロ細胞、および盲検法による継代研究が、以前に記載されたことがある。Masonら、Production and characterization of vaccines based on flaviviruses defective in replication、Virology 2006;351(2):432〜43。ワクチン基質のベロ細胞(S.Whitehead、NIH、Bethesda、MD)を、OptiPro無血清培地(SFM)(Gibco/Invitrogen、Carlsbad、CA)中に維持する。所望のフラビウイルス遺伝子をコードするベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン(VEErep)をもつ細胞株をピューロマイシン(10μg/ml)により選択することによって、パッケージング細胞株を生成する(下記を参照されたい)。シロフクロウ単離株のWNV NY99(R.B.Tesh、UTMB)を、全ての動物研究のために使用する。Xiaoら、West Nile virus infection in the golden hamster(Mesocricetus auratus):a model for West Nile encephalitis、Emerg Infect Dis 2001;7(4):714〜21。マウスに対して、1000ffuのウイルス(8週齢のマウスにおける10LD50に対応する)を用いてチャレンジを行い、ハムスターに対して、1×106ffuを用いてチャレンジを行う。
プラスミドの構築、RNA転写およびトランスフェクションを本質的には、Widmanら、Construction and characterization of a second−generation pseudoinfectious West Nile virus vaccine propagated using a new cultivation system、Vaccine(2008)26、2762〜2771の記載に従って実施する。
15匹の5週齢の雌のSwiss Websterマウス(Harlan Sprague Dawley、Indianapolis、IN)からなる群を、RepliVAX WN、RepliVAX WN.2、または希釈剤単独(偽)を用いて鼻腔内から免疫化する。動物を、嗜眠および後肢の麻痺を含めた、ワクチンが誘発する副作用についてモニターする。ワクチン接種後の第21日に、血清を、全ての動物から後眼窩からの採血により収集する。7日後に、動物に対して、10LD50のWNV NY99を用いてi.p.チャレンジを行い、動物を、体重および健康の変化について14日間モニターする。瀕死とスコア化される動物は、翌日、安楽死させ、「死んだ」とスコア化する。
WNV EおよびNS1に対する血清抗体価を、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して測定する。Immulon 2HBマイクロタイタープレート(Thermo Labsystems、Franklin、MA)を、VEErep担持細胞株(上記を参照されたい)から集めたNS1またはEタンパク質で感作し、次いで、個々の血清(1:100に希釈)を加えて1時間インキュベートする。ヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲート抗体(KPL、Gaithersburg、MD)を、プレートに1時間添加し、結合したHRPを、TMB(Sigma)を加えてインキュベートしてから、1M HClを用いてクエンチすることによって検出する。反応生成物を、450nmで分光光学的に定量し、値を、血清の代わりに希釈剤を加えたウエルから検出されるバックグラウンドの活性について補正する。中和抗体(neut)価を、ホタルルシフェラーゼをコードするWNV VLP(WNVLP)に感染させたベロ細胞から得られるルシフェラーゼ活性の90%の低下をもたらす血清の希釈度を測定することによって決定する。これは、古典的なフォーカス減少アッセイ(focus reduction assay)に匹敵することが示されているアッセイである。熱不活性化し、プールした血清試料の2倍段階希釈物を、一定量の、ルシフェラーゼをコードするWNVLPを加えて37℃で1時間インキュベートする。これらのVLP/血清の混合物を使用して、黒色96ウエルプレート(Greiner Bio−One、Monroe、NC)中のベロ細胞の単層に2時間感染させ、この時点で、感染用培地を、維持培地と交換し、24時間インキュベートしておく。25%Steady−Gloルシフェラーゼ基質(Promega、Madison、WI)を有する細胞溶解用緩衝液を含有する溶液を、各ウエルに、培地に対して1:1(v/v)の比で添加する。プレートを、ルミノメーター(Applied Biosystems、Foster City、CA)上で読み取り、WNVLPに感染させ、希釈剤のみの中、37℃でインキュベートした単層から調製する溶解液から得られる活性のパーセントとして、光アウトプットを表す。
抗体のin vitroにおける経粘膜浸透
Prolia(商標)(デノスマブ)は、ヒトRANKL(核内因子カッパ−Bリガンドの受容体活性化因子)についての親和性および特異性を有するヒトIgG2モノクローナル抗体である。Proliaは、RANKLに結合し、RANKLは、骨の再吸収に関与する細胞である破骨細胞の形成、機能および生存に必須の膜貫通性または溶解性のタンパク質である。Proliaは、RANKLが、破骨細胞およびそれらの前駆体の表面上のその受容体RANKを活性化するのを阻止する。RANKL/RANKの相互作用の阻止は、破骨細胞の形成、機能および生存を阻害し、それによって、皮質骨と海綿骨の両方において、骨の再吸収を減少させ、骨の質量および強度を増加させる。
上記の記載に従って、デノスマブの鼻用製剤を、オキサシクロヘキサデカン−2−オンを用いて調製する。in vitroにおける浸透研究を、切除したヤギ鼻粘膜を使用して実施する。浸透プロファイルを、ELISAにより評価する。また、浸透研究の前および後における鼻粘膜の組織学的研究も実施する。
フランツセルin vitro有限投与モデル(Finite Dose Model)は、in vivoにおける薬剤の局所または経鼻粘膜送達および吸収プロファイルを予測するための信頼できる方法を提供している。手短に述べると、フランツセル、ドナーチャンバー、膜(これは、(ヒトまたは動物の)皮膚または鼻粘膜であり得る)、およびレセプターチャンバー。試験製剤を膜上に置き、レセプターチャンバー中の試験薬剤の出現を、種々の時点において測定する。
96ウエルプレート(Nunc)を、0.05モル/Lの炭酸コーティング用緩衝液(pH9.6)中のRANKLを用いて、4℃で一晩コーティングする。プレートを、ウシ血清アルブミンを使用してブロックする。フランツ拡散セルのレセプターチャンバーから得られる試料を、二つ組でプレートにわたりブロック用緩衝液中に段階希釈し、37℃で1時間インキュベートする。プレートを、洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートIgG(Southern Biotechnology)を加えてインキュベートする。プレートを、洗浄後、テトラメチルベンジジン基質(Sigma)を用いて室温で30分間発色させ、反応を停止する。光学密度を450nmで読み取る。
切除した鼻粘膜の組織学的研究を、5時間のin vitroにおける浸透の後に実施して、いずれかの顕著な組織学的変化が実験の間に生じているかを検出する。鼻粘膜は、浸透研究の後、製剤を一掃し、回転式ミクロトームを用いて切片化し、10%ホルマリン溶液中で固定する。次いで、切片化した組織を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色する。別の正常な粘膜を、対照として採取し、同様に処理する。組織切片を、光学顕微鏡下で観察する。
Claims (19)
- 経鼻免疫化のための医薬組成物であって、大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗原を含み、前記大環状浸透増強剤が、以下の構造を有するHsieh増強剤である医薬組成物:
式中、XおよびYは上記に定義した通りであり、mおよびnは1〜20の値を有する整数であり、和m+nは25以下であり、pは0または1の値を有する整数であり、qは0または1の値を有する整数であり、rは0または1の値を有する整数であり、R、R1、R2、R3、R4、R5およびR6はそれぞれ独立に、水素、または直鎖状もしくは分枝状であってよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基(ただし、R1〜R6のうちの1つのみがアルキル基であり得る)であり、ただし、p、qおよびrが0の値を有し、Yが酸素である場合、m+nは少なくとも11であり、さらに、Xがイミノ基であり、qが1であり、Yが酸素であり、pおよびrが0である場合、m+nは少なくとも11である。 - 前記Hsieh増強剤が、3−メチルシクロペンタデカノン、9−シクロヘプタデセン−1−オン、シクロヘキサデカノン、シクロペンタデカノン、オキサシクロヘキサデカン−2−オン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原が、タンパク質またはペプチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記タンパク質が炭疽感染防御抗原である、請求項3に記載の組成物。
- 前記抗原が炭水化物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原がDNAである、請求項1に記載の組成物。
- 結晶化阻害剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 酵素阻害剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記酵素阻害剤が、ロイペプチンおよびアプロチニンからなる群から選択される、請求項8に記載の組成物。
- 哺乳動物を免疫化する方法であって、以下のステップを含む方法:
大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗原を含む組成物を配合するステップであって、前記大環状浸透増強剤が、以下の構造を有するHsieh増強剤であるステップと;
式中、XおよびYは上記に定義した通りであり、mおよびnは1〜20の値を有する整数であり、和m+nは25以下であり、pは0または1の値を有する整数であり、qは0または1の値を有する整数であり、rは0または1の値を有する整数であり、R、R1、R2、R3、R4、R5およびR6はそれぞれ独立に、水素、または直鎖状もしくは分枝状であってよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基(ただし、R1〜R6のうちの1つのみがアルキル基であり得る)であり、ただし、p、qおよびrが0の値を有し、Yが酸素である場合、m+nは少なくとも11であり、さらに、Xがイミノ基であり、qが1であり、Yが酸素であり、pおよびrが0である場合、m+nは少なくとも11である]
前記組成物を経鼻投与により前記哺乳動物に投与するステップと
を含む方法。 - 前記Hsieh増強剤が、3−メチルシクロペンタデカノン、9−シクロヘプタデセン−1−オン、シクロヘキサデカノン、シクロペンタデカノン、オキサシクロヘキサデカン−2−オン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記抗原が、タンパク質またはペプチドである、請求項10に記載の方法。
- 前記タンパク質が炭疽感染防御抗原である、請求項12に記載の方法。
- 前記抗原が炭水化物である、請求項10に記載の方法。
- 前記抗原がDNAである、請求項10に記載の方法。
- 結晶化阻害剤をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 酵素阻害剤をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記酵素阻害剤が、ロイペプチンおよびアプロチニンからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 経鼻免疫化のための医薬組成物であって、大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗体を含み、前記大環状浸透増強剤がHsieh増強剤である医薬組成物。
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