<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte à la production de préparations pharmaceutiques et plus particulièrement elle concerne la production de ma- tières contenant des antigènes, par exemple des vaccins,des toxoides et des réactifs diagnostiques.
Il est connu de préparer des matières contenant des antigènes, par exemple des agents immunisants*, 'tels que des vaccins contenant des antigènes en traitant des micro-organismes infectieux, par exemple des ,virus infectieux par des-agents' inactivants particuliers par exemple le phénol, le formal- déhyde, leeperoxyde d'hydrogène, ou en les soumettant à l'action de la cha- leur ou à l'action de la lumière -ultraviolette, détruisant ainsi les propri- étés infectieuses des micro-organismes tout en conservant leurs propriétés antigènes. Ces agents inactiyants présentent certains inconvénients en ce , qu'ils sont parfois trop destructeurs à l'égard des structures antigènes de micro-organismes, par exemple des virus,
et il est souvent difficile d'assu- rer une destruction complète des propriétés infectieuses des micro-organis- mes tout en conservant leurs propriétés antigènes. En outre, il est possi ble que certains micro-organismes infectieux qui sont inactivés au moment du traitement par un agent incacvtivant@t particulier, par exemple le formaldéhy- de puissent retrouver leurs propriétés infectieuses et ainsi devenir des a- gents causatifs de maladies, soit au cours de l'entreposage soit après l'ad- ministration à un patient sous forme d'un vaccin.
De surcroît;, il est égale- ment possible que des agents inactivants particuliers, par exemple le formai# déhyde ou l'action de la lumière ultra-violette puissent provoquer la forma- tion d'agrâgats de micro-organismes et ces agrégats peuvent conserver des particules non traitées de micro-organismes infectieux.
On a découvert à présent que ces inconvénients peuvent être sup- primés en utilisant une classe particulière d'agents inactivants. par exem- ple la N-acétyléthylèneimine,pour produire des agents; immunisants contenant des antigènes;, par exemple des vaccins et des toxoïdes.
Suivant la présente invention, dans un procédé de fabrication d'une matière contenant des antigèneson soumet.les microorganismes infectieux et/ ou leurs .antigènes à l'action d'un composé de la formule g R CO N CH2 CH2 où R représente un radical méthyle éthyles n-propyle ou isopropyleo
Il est clair que l'expression "micro-organismes infectieux" couvre le groupe comprenant les virus, par exemple le virus de 1'encéphale-myélite équine, le virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris), les rioket- tsies, par exemple Roburnetti, et les bactéries, par exemple,Staphylococcus albus.
Lesdits micro-organismes infectieux et/ou leurs antigènes utilisés comme matières premières peuvent se trouver sous forme d'une suspension aqueu- se qui peut facultativement contenir des agents protecteurspar exemple un tampon, par exemple une quantité appropriée de phosphate monoacide de sodium, pour former une suspension aqueuse au pH 8,0 Ces micro-organismes infectieux et/ou leurs antigènes utilisés comme matières premières peuvent également être facultativement additionnés de tissu animal, par exemple, de cervelle de cobaye ou de cervelle et de moelles épinière de souris.
Comme composé particulièrement approprié de la formule donnée ci-dessus, la N-acétyléthylèneimine peut être mentionnée à titre d'exemple.
Ce composé est généralement ajouté aux micro-organismes infectieux et/ou leurs antigènes, de préférence sous forme d'une suspension aqueuse, à une bas-
<Desc/Clms Page number 2>
se température, comprise, par exemple entre environ 0 C et environ 37 C afin d'obtenir une matièrecontenant un taux élevé de matière antigène non toxique et non infectieuse. Il est toutefois évident que des températures de travail plus élevées peuvent être utilisées,mais la matière ainsi obtenue contiendra un taux moins élevé de matière antigène non toxique et non infectieu- se..
La durée nécessaire pour déterminer l'inactivation en ce qui concerne l'infectivité des micro-organismes infectieux ou en ce qui concerne la toxicité de leurs antigènes est fonction de plusieurs facteurs;, par exemple de la nature du micro-organisme particulier ou de l'antigène particulier utilisé, de la concentration de composé de formule donnée utilisée.de la concen- tration initiale du micro-organisme infectieux ou de l'antigène utilisé,'de la concentration d'un tissu animal quelconque pouvant être présent et de la tem- pérature à laquelle le procédé est exécuté.
Comme indiqué ci-dessusdes micro-organismes appropriés peuvent être par exemple des virus par exemple le virus de l'encéphalo-myélite équine (souche de New-Jersey) et le virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris).Il est avantageux d'utiliser une suspension à 20 % poids/volume d'un mélange .de micro-organismes infectieux et de tissu animal en solution saline aqueuse stérile comme matière de départ avant le traitement de centrifugationo Le composé de la formule indiquée,
par exemple la N-acétyléthylène imine est généralement utilisé sous forme d'une solution dans de l'eau distillée stérile et la concentration du composé est de préférence comprise entre les limites d'environ 09005 % volume/volume et environ 1% volume/volume sur la base du volume combiné de suspension aqueuse du micro-organismeou de son antigène;, et de solution du composé. Dans les conditions ci-dessus la durée nécessaire pour déterminer l'inactivation en ce qui concerne l'infectivité des micro-organismes infectieux ou la toxicité de leurs antigènes à une température d'environ 18 à environ 22 C ou 37 C9 est généralement de l'ordre d'environ une demi-heure à environ douze heures.
Les préparations aqueuses ainsi obtenues contenant la matière antigène non infectieuse et non toxique peut être séchée par congélation suivant le procédé décrit dans le brevet de même date de la Demanderesse intitulé g "Production de préparations pharmaceutiques", pour obtenir une préparation sèche stable et pouvant être entreposée sous vide jusqu'au moment de son utilisation. Ainsi les préparations aqueuses peuvent être additionnées de solution aqueuse stérile de saccharose, de préférence de solutions d'environ 5% poids/volume et les mélanges ainsi obtenus sont séchés par congélation pendant environ 24 heures et entreposées ensuite sous vide.
Les préparations séchées conservent leurs propriétés antigènes pendant l'entreposage et sontrendues facilement utilisablessous' forme d'un vaccin par une addition d'eau distillée ou de solution saline stérile.
Les préparations non infectieuses de micro-organismes par exemple de virus,de bactéries et d'autres organismes, qui possèdent des propriétés antigènes non toxiques;, ou qui possèdent d'autres propriétés en plus de l'infectivité, peuvent .être préparées en utilisant un des composés indiqués;, par exemple l'aoétyléthylèneimine. Ces préparations,par exemple le virus de la poliomyélite ou le virus de l'influenza, traitées par de l'acétyléthylèneimine, peuvent être utilisées comme agent de diagnostic à des fins médicales vétérinaires et autres.
Comme indiqué ci-dessus, l'utilisation des composés de la formule indiquée conformément au procédé de la présente invention permet de réaliser des préparations régulières et sûres de matières non infectieuses et non toxiques qui possèdent des propriétés antigènespar exemple des agents immu-
<Desc/Clms Page number 3>
nisants, par exemple des vaccins, et l'élimination complète des propriétés infectieuses de micro-organismes ou des. propriétés toxiquesudesleursiantigènesiest réaldséepaveciuné pertetrès reduite du nulie des propriés antigènes.
L'invention est illustrée, mais non limitée, par les exemples suivants EXEMPLE 1.On broie de la cervelle de cobaye infectée de virus de l'encéphalomyélite équine (souche de New-Jersey) avec du sable stérile.dans des conditions stériles, et on en forme une suspension à 20 % poids/volume en ajoutant de la solution aqueuse stérile à 0985 % poids/volume de chlorure de sodium. La suspension à 20 % poids/volume ainsi obtenue est centrifugée pendant 15 minutes à 40000 tours par minute et le liquide surnageant est soigneusement séparé. On centrifuge le liquide ainsi obtenu pendant 5 minutes encore à 4 000 tours par minute et on sépare avec soin le liquide surnageant.
On mélange ce liquide surnageant avec un volume égal d'une solution stérile à 2 % volume/volume de N-aoétyléthylèneimine dans l'eau distillée refroidie et on maintient le mélange obtenu à environ 18-22 0 pendant 90 minutes, en agitant modérément de temps à autre, Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intracérébrale à 12 souris (0903 cm3 par souris) pour déterminer la présence de virus vivants.La survie en bon état de santé de toutes les souris indique l'absence de virus vivant.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules on le sèche par congélation pendant 24 heures, et on le scelle ensuite 'sous video Les ampoules scellées contenant la prépartion de vaccin séchée sont alors entreposées à 2 C, Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile, ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquidé limpide,, Des échantillons de ce liquide sont essayés en vue d'en déterminer n'ionfectivcité et la toxicité en injectant 3 fois séparément par voie intrapéritonéale 0,5 cm3 à chacune de 20 souris (ce qui fait au total 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler 7 jours entre chaque injection.
On constate l'absence complète d'infectivité et de toxicité par la survie en très bon état de santé de toutes les souris quatre mois plus tard.
On vaccine un second lot de 20 souris et on les soumet à une épreuve par le virus vivant par le procédé suivant. On injecte par voie intrapéritonéale 3 fois séparément à 20 souris nouvellement sevrées d'un poids moyen de 12-15 g 0,5 cm3 du vaccin, reconstitué comme décrit ci-dessus, (ce qui fait au total 1,5 cm3 par souris) avec un intervalle de 7 jours entre chaque injection. Sept jours après la dernière vaccination, on inocule aux souris par voie intracérébrale le virus vivante la quantité de la dose étant trente fois la dose qui9 administrée par voie intracérabrale, est léthale pour 100% des souris. On constate que 40 % des souris survivent à cette épreuve par le virus vivant. Dans une expérience témoin, pour laquelle on se sert de souris non vaccinées, toutes sont tuées lorsqu'elles sont soumises à une épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 2 On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant une solution à 0,5% volume/volume de N-acétyléthylèbneimine au lieu de la solu-
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
tion à 2 % volume/volume de !T-acéty3thy,lènBimine9. et on maintient le mé- lange ainsi obtenu à environ l8-22 C pendant 3 heures en agitant modérément de temps à astre.
On inocule par voie intracérébrale un échantillon de la préparation ainsi obtenue à 12 souris (0,03 cm3 par souris) pour établir la présence de virus vivant.On constate l'absence de virus vivant par la survie en bon état de santé de toutes les souris.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 partie en volume d'une solution stérile aqueuse de saccharose à 5 % poids/volume. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le sèche par congélation pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vide. Les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors en-
EMI4.2
tr76 sées à 2 Cô
Pour l'utilisation 9 on reconstitue le contenu de chaque ampoule en y ajoutant 2 cm3 d'eau distillée stérile ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
Des échantillonss de ce liquide sont essayés en vue d'en déterminer ltinfectivité et la toxicité en injec- tant 0,5 om3 par voie intrapéritonéale à chacune de 20 souris, trois fois séparément (ce qui fait un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écou- ler 7 jours entre chaque injection. La survie en très bon état de santé de toutes les souris quatre mois plus tard indique l'absence complète d'infec- tivité et de toxicité.
On vaccine un second lot de 20 souris et on les-soumet à une épreu-
EMI4.3
ve par le virus vivant par le procédé suivante On injecte à 20 souris nou# *#'# ' vellement sevrées, d'un poids moyen de 12 (15 g9 095 éu3¯dta. vacoïn (reconstitué comme décrit plus haut) par voie intrapéritôné8lej) trois fois séparé- ment (ce qui constitue un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler une période de 7 jours entre chaque injection. Sept jours après la dernière vaccination, on inocule aux souris le virus vivant par voie intracérébrale, la quantité dela dose étant trente fois la dose qui, administrée par voie in-
EMI4.4
traeéré.brale$ est léthale pour 100 % des souriso On constate que50 % des souris survivent à cette épreuve par le virus vivante Dans une expérience
EMI4.5
témoin,
pour laquelle on S3 sert de souris non vaccinées toutes sont tuées par l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 3.
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1, en utilisant une so-
EMI4.6
lution de il-acétyléthylèneimine à 0925 volume/volume au lieu de la solution de N-aoe'sîtmNBG à 2 % volume/volume;, et on maintient le mélan- ge ainsi obtenu à 37 C pendant 3'heures,en agitant,modérément de temps à autre
La préparation ainsi obtenue ne contient pas de virus vivant ainsi que le montre l'inoculation par voie intracérâbrale d'un échantillon de la préparation à des souris.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 de partie en volume de solution stérile aqueuse de saccharose à 5 % poids/volume. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules, on le sèche par congélation pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vide. Les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors entreposées à 200,
Pour l'utilisation 9 on reconstitue le contenu de chaque ampoule
EMI4.7
par :[vad1ilfifton de 2 cm3 d 9 eau distillée stérile ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
Des échantillons d'un tel liquide sont essayés en vue d'en déterminer 1 ïnfectivïté et la toxicité en injectant trois fois séparément, 0,5 cm3 par voie intrapéritonéale à chacune
<Desc/Clms Page number 5>
de 20 souris (ce qui fait au total 1,5 cm3 par sourds) en laissant s'écou- ler une période de 7 jours entre chaque injection. La survie de toutes les souris en très bon état de santé quatre mois plus tard indique l'absence complète d'infectivité et de toxicité.
On vaccine un second lot de 20 souris et on les soumet ensuite à une épreuve par le virus vivant par le procédé suivant.On injecte à 20 souris nouvellement sevrées,d'un poids moyen de 12-15 g, 0,5 cm3 du vaccin (reconstitué comme décrit ci-dessus) par voie intrapéritonéale 3 fois séparément ( ce qui fait un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler une période de 7 jours entre chaque injection.
Sept jours après la dernière vaocination9 on inocule aux souris par voie intraoérabrale le virus vivant, la quantité de la dose étant vingt fois la dose, qui administrée par voie intracérébrale, est léthale pour 100% des souriso On constate que 74 % de souris survivent à cette épreuve par le virus vivante Dans une expérience témoin, pour laquelle on se sert de souris non vaccinées toutes sont tuées par l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 4
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant une solution de N-acétyléthylèneimine à 0,1% volume/volume au lieu de la solution de N-acétyléthylènoeimine à 2 % volume/volume et on maintient le mélange ainsi obtenu à 37 C pendant 4 heures en agitant modérément.', de temps à autre. La préparation ainsi obtenue est séchée par congélation par le procédé décrit ci-dessus et le produit séché est reconstitué par de l'eau distillée stérile pour former un vaccin. Lorsque ce vaccin est inoculé à des souris qui son ensuite soumises à une épreuve par le virus vivant par le procédé décrit dans l'exemple 3, on constate que 100 % des souris survivent à cette épreuve.
Dans une expérience témoin pour laquelle on se sert de souris non vaccinées toutes sont tuées par l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE5
On broie de la cervelle et de la moelle épinière de souris infectées de virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris) avec du sable stérile dans des conditions stériles et on en forme ensuite une suspension à 20 % poids/volume par l'addition de solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0985 % poids/volume. On centrifuge la suspension à 20 % poids/volume ainsi obtenue pendant300 minutesà 4 000 tours par minute et on sépare soigneusement le liquide surnageant.
On centrifuge le liquide surnageant ainsi obtenu pendant 5 minutes encore à 4.000 tours par minute et on sépare soigneusement ensuite le liquide surnageant. On mélange ce liquide surnageant avec un volume égal d'une solution stérile à 2 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine, dans l'eau distillée refroidie et on maintient le mélange ainsi obtenu à environ l8-22 C pendant 2 heures en agitant modérément de temps à autre.
Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intracérébrale à 17 sourse (0903 cm3 par souris) pour déterminer la présence de virus vivant. On ne.détecte pas de virus vivant, toutes les souris survivant 28 jours après l'inoculation en bon état de santé. On inocule par voie intracérébrale à un groupe témoin de 38 souris une suspension à 10 % poids/ volume de virus Lansin de la poliomyélite (adapté aux souris) dans une solution aqueuse stérile à 0,85% poids/volume de chlorure de sodium (003 cm3 par souris) avant le traitement par l'acétyléthylèneimine. Ces animaux sont tous infectés par le virus vivant et tous meurent dans les onze jours qui suivent l'inoculation.
Au reste de la préparation;, on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile de saccharose à 5 % poids/volume. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le lyophilise
<Desc/Clms Page number 6>
pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vidée Les amppules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors entreposées à 2 C
Pour l'utilisation on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile, ce qui assure une dissolution rapide et la fermât ion d'un liquide limpide.
Des échantillons de ce liquide sont essayés en vue de déterminer son infectivité etsa toxicité par injection de 0,5 om3 par voie intrapéritonéale à chacune de 20 souris 3 fois séparément (ce qui constitue un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler 7 jours entre chaque injection. L'infectivité et la toxicité s'avèrent être absentes, ce qu'indique la survie de toutes les souris en très bon état de santé plusieurs mois après l'injection.
EXEMPLE 6.-
On reprend le procédé dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,5% volume/volume de N-acéthyléthylèneimine, au lieu de la solution à 2% volume/volume de N-acéthléthylènecimine et on maintient le mélange ainsi obtenu à environ i8-22 C pendant 6 heures,en agitant modérément de temps à autre.
La préparation ainsi obtenue ne contient pas de virus vivant et elle peut être séchée par lyophilisation par le procédé décrit dans l'exemple 5o La matière séchée ainsi obtenue peut être reconstituée par l'addition d'eau distillée stérile. Le liquide limpide ainsi obtenu injecté par voie intrapéritonéale à des souris s'avère exempt d'infectivité et .de toxicité, ainsi que le montre la survie de toutesles souris en très bon état de santé plusieurs mois après l'injection.
EXEMPLE 7.-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,25% volume/volume de N-aééthléthylèneiminek au lieu de la solution à 2 volume/volume de N-acétyléneimine et on maintient le' mélange ainsi obtenu à envirdnn 37 C pendant 4 heures,en agitant modérément de temps à autre.
La préparation ainsi obtenue'ne contient pas de virus vivant et peut être séchée par lyophilisation par le procédé décrit dans l'exemple 5.
La matière séchée ainsi obtenue peut être reconstituée par l'addition d'eau distillée stérile.Le liquide limpide ainsi obtenu injecté à des souris par voie intrapéritonéale -s'avère exempt d'infectivité et de toxicité,ainsi que l'indique la survie de toutes les souris en très bon état plusieurs mois après l'injection.
EXEMPLE 8,,-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,1% volume/volume de N-acétyléthylèneimine, au lieu de la solution à 2% volume/volume de N-acétyléthylèneimine et on maintient le mélange ainsi obtenu à 37 C pendant 4 heures, en agitant modérément de temps à autre.
Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intracérébrale à 20 jeunes souris (0,03 cm3 par souris) en vue de déterminer la présence de virus vivante On ne détecte pas de virus vivant, ainsi que l'indique la survie de toutes les souris 40 jours après l'inoculation en bon état de santé.On inocule à un groupe témoin'de 38 souris par voie intracérébrale le virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris) à 20 % poids/ volume dans une solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,85 % (0,03 cm3 par souris ) avant le traitement par l'aoétyléthylèneimine. Ces animaux sont infectés par le virus vivant et meurent tous dans les 11 jours qui suivent l'inoculation.
<Desc/Clms Page number 7>
Au reste de la préparation9 on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile à 5 % poids/-volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules;,on le lyophi- lise pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vide. On entrepose ensui- te à 2 C les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée-.
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile ce qui assure une dissolution ra- pide et la formation d'un liquide limpide. On essaie des échantillons de ce liquide en vue d'en déterminer l'infectivité, la toxicité et la puissance d'immunisation en injectant 4' fois 'séparément 0,5 cm3 par voie intrapérito- néale à chacune de 20 souris, (ce qui fait un total de 2 cm3 par souris) en laissant s'écouler 10 jours entre chacune des trois premières doses et 14 jours entre les troisième et quatrième doses.
Quatorze jours après la derniè- re injection, les souris-sont dans un très bon était de santé ce qui indique que le vaccin ne possède aucune infectivité ni aucune toxicité.On inocule alors à ces souris par voie intracérébrale le virus vivant, la quantité de la dose étant trente fois la dose*: qui, administrée par voie intracérébrale, est léthale pour 100%des souriso On constate que 25 % de souris survivent à cette épreuve par le virus vivanteDans une expérience témoin pour laquelle on utilise des souris non vaccinées;, toutes meurent à l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 9.-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,05% volume/volume de N-acétylétyléthylèneimine. au lieu de la solu- tion à 2 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine, et on maintient le mélange ainsi obtenu à 37 C pendant 12 heures, en l'agitant modérément de temps à autre.
Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intrascébrale à 27 jeunes souris (0,03 cm3 par souris) pour déterminer la présence de virus vivant.On ne détecte pas de virus vivant,toutes les souris survivant en bon-état de santé 35 jours après l'inoculation.
Au reste de la préparationg on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le sèche par congélation pendant 24 heures et on scelle ensuite les ampoules sous vide.
Les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors entreposées à 2 C.
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile, ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
On essaie des échantillons de ce liquide pour en déterminer l'in- fectivité, la toxicité et la puissance d'immunisation en injection séparément 4 fois 0,5 cm3 par voie intrapéritonéale à chacune de 25 souris (ce qui fait un total de 2 cm3 par souris) en laissant s'écouler une période de 10 jours entre chacune des trois premières doses9 et 14 jours entre les troisième et quatrième doses.
Dix jours après la dernière vaccination, les souris sont en très bon état de santé:, ce qui montre que le vaccin ne possède pas d'infectivité ni de toxicité. On inocule ensuite à ces souris par voie intracérébrale le virus vivant, la quantité de la dose étant trente fois la dose qui administrée par voie intracérébrale, est léthale pour 100 % des souris. On constate que 44 % des souris survivent à cette-épreuve. Dans une expérience témoin, pour laquelle on se sert de souris non vaccinées aucune des souris ne survit à " l'injection intracérébrale du virus vivant.
<Desc/Clms Page number 8>
EXEMPLE 10.-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,025 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine au lieu de la solution à 2 % volume/volume de N-aoétyléthylèneimine et on maintient le mé- lante à 37 0.pendant 12 heures, en agitant modérément de temps à autre.
On inocule par voie intracérébrale un échantillon de la préparation ainsi obtenue à 20 jeunes souris (0,03 cm3 par souris) en vue de déterminer la présence de virus vivant.On ne détecte pas de virus vivant, toutes les souris survivant en bon état de santé 35 jours après l'inoculation.
Agreste de la préparation;, on ajoute 1/4 de partie en volume d'u- ne solution aqueuse stérile à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des.ampoules et on le sèche par congélation pendant 24 heures et on scelle ensuite les ampoules sous video On entrepose à 2 C les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée.
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
On essaie des échantillons de ce liquide pour en déterminer l'in- fectivité, la toxicité et la puissance d'immunisation en injectant 3 fois sé- parément par voie intrapéritonéale 0,5 cm3 à 20 souris (ce qui constitue un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler 7 jours entre les premiè- re et deuxième doses de vaccin et 14 jours entre les deuxième et -troisième do- ses. Dix jours après la dernière dose de vaccin, toutes les souris sont en très bon état de santé,ce qui montre l'absence d'infectivité et de toxicité du vaccin. On inocule ensuite à ces souris par voie intracérébrale le virus vivant, la quantité de la dose étant dix fois la dose qui, administrée par voie intracérébrale est léthale pour 100 % des souris. On constate que 55% des souris survivent à cette épreuve.
Dans une expérience témoin, pour laquel- le on se sert de souris non vaccinées, aucune, d'elles -ne survit à l'injec- tion intracérébrale de virus vivant.
EXEMPLE 11.-
On centrifuge-une culture de Staphylococcus albus pleinement dé- veloppée, isolée initialement de peau humaine. On met en suspension les cel- lules bactériennes dans une solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,85 % poids/volume, on les centrifuge et on les remet en suspension dans de la nouvelle solution auqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,85 % poids/ volume pour obtenir une suspension de cellules indiquant une densité optique de 1,6 par l'examen d'un échantillon dans une cellule spectrophotométrique à
1 cm en utilisant de la lumière d'une longueur d'onde de 5.800 .
A 4 parties de la suspension de cellules ainsi obtenue, on ajoute 1 partie d'une solu- tion à 1 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine, dans l'eau distillée refroidie, et on maintient le mélange résultant à 37 C pendant 24 heures, en agitant modérément de temps à autre.
On inocule un échantillon de la préparation ainsi obtenue à un bouillon nutritif bactérien et également à un bouillon nutritif bactérien sur agar dans une cuvette de culture. On ne détecte pas de bactéries vivantes, ainsi que le montre la non croissance des bactéries dans chacun des cas à 37 C dans les 6 jours.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le lyophilise pendant 18 heures et on le scelle ensuite sous vide. Les ampoules scellées con-
<Desc/Clms Page number 9>
tenant la préparation de vac.cin séchée sont alors entreposées à 18-22 C
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile,ce qui assure une dissolu- tion rapide et la formation d'une suspension uniforme et régulière., On essaie des échantillons de cette matière en vue de déterminer la présence de bacté- ries vivantes par injection dans un bouillon nutritif bactérieu qu'on incubeensuite à 37 C pendant 6 jours.
L'absence de bactéries viables est montrée par l'ab- sence de croissance de bactéries dans ces conditions. Le vaccin reconstitué est injecté par voie sous-cutanée à des lapins. Dans aucun cas, le lapin ne présente de symptômes toxiques résultant de l'injection du vaccine Deux in- jections de vaccination, de 0,5 cm3 par lapin sont administrées la première semaine et deux injections de 1,0 cm3 par lapin sont administrées la seconde semaine. On recueille alors du sérum chez ces lapins et chez des lapins non vaccinés. La tttration d'anticorps du sérum est estimée par la réaction d'agglutination avec une suspension vivante des mêmes bactéries.
On constate un accroissement considérable de l'agglutination des anticorps sur les lapins vaccinés ayant servi à préparer'le sérum par comparaison avec, les lapins non vaccinés ayant servi à préparer le sérum EXEMPLE 12.-
24 heures après 1'infection au moyen de petites quantités de virus de l'influenza type A, les membranes chorio-allantoiques sont récoltées sur 30 oeufs de poules fécondés au 12 ème jour., Les membranes mises en commun sont alternativement congelées à -70 C et dégelées à 37 C, trois fois et 30 cm3 de solution saline tamponnée par du phosphate M/100 sont ajoutés.
Après le mélange, les membranes sont centrifugées à 30000 tours par minute pendant 5 minutes et l'extrait de membranes surnageant est séparée Un échantillon de l'extrait est essayé en vue de déterminer son infectivité sur des oeufs de poules fécondés et des quantités de 1 cm3 d'une dilution à 10 infectent 50 % des oeufs (c'est-à-dire que l'extrait contient 106,2 doses infectant 50 % des oeufs (EID ) par cm3) A un échantillon de cet extrait de membranes, on ajoute de l'acétyléthylèneimine en quantité choisie pour obtenir une con- centration finale de 1% volume/volume d'acétyléthylèneimine et on incube le mélange à 30 C pendant 4 heureso A la dilution 1:
10, l'extrait traité n'infec- te aucun oeuf sur les 10 auxquels 1 cm3 à été inoculé. L'extrait non dilué est toxique pour les oeufsmais lorsque le virus est séparé par adsorption sur les globules rouges de cobaye et élue dans une solution de chlorure de sodium à 0985 %, on constate qu'il n'infecte aucun oeuf sur 10 inoculés avec 1 cm3. Lorsque les extraits non traités et les extraits traités par l'acétylé- thylèneimine sont essayés parallèlement par le procédé habituel (épreuve type Salk), on constate qu'ils possèdent Les mêmes capacités d'agglutination des globules rouges du cobaye (les titres d'hémagglutinine sont de 103?0 et 102995 unités d'hémagglutinine par cm3,
respectivement ce qui ne constitue pas une différence significative avec le procédé employé). Essayés contre le même échan- tillon de sérum de convalescent humain qui contient des anticorps de l'anti- gène soluble de l'influenza type A9 les extraits non traités et les extraits traités par l'acétyléthylèneimine s'avèrent encore contenir des quantités ne pouvant être distinguées d'angigène soluble;, la mesure étant faite par fixa- tion complémentaire (103,05 et 103,2 unités d'antigène soluble par cm3 res- pectivement).
Dans le diagnostic de l'infection grippale chez l'homme, les anti- corps du sérum sont .mesurés en termes de leur pouvoir conbinant avec de l'hé- magglutinine ou avec'l'antiggne soluble du virus de l'influenza. Les prépara- tions non infectieuses du virus de l'influenza traitées par l'acétyléthylène- imine obtenues comme ,décrit ci-dessus peuvent donc être utilisées à cette fin.