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La présente invention se rapporte à la production de préparations pharmaceutiques et plus particulièrement elle concerne la production de ma- tières contenant des antigènes, par exemple des vaccins,des toxoides et des réactifs diagnostiques.
Il est connu de préparer des matières contenant des antigènes, par exemple des agents immunisants*, 'tels que des vaccins contenant des antigènes en traitant des micro-organismes infectieux, par exemple des ,virus infectieux par des-agents' inactivants particuliers par exemple le phénol, le formal- déhyde, leeperoxyde d'hydrogène, ou en les soumettant à l'action de la cha- leur ou à l'action de la lumière -ultraviolette, détruisant ainsi les propri- étés infectieuses des micro-organismes tout en conservant leurs propriétés antigènes. Ces agents inactiyants présentent certains inconvénients en ce , qu'ils sont parfois trop destructeurs à l'égard des structures antigènes de micro-organismes, par exemple des virus,
et il est souvent difficile d'assu- rer une destruction complète des propriétés infectieuses des micro-organis- mes tout en conservant leurs propriétés antigènes. En outre, il est possi ble que certains micro-organismes infectieux qui sont inactivés au moment du traitement par un agent incacvtivant@t particulier, par exemple le formaldéhy- de puissent retrouver leurs propriétés infectieuses et ainsi devenir des a- gents causatifs de maladies, soit au cours de l'entreposage soit après l'ad- ministration à un patient sous forme d'un vaccin.
De surcroît;, il est égale- ment possible que des agents inactivants particuliers, par exemple le formai# déhyde ou l'action de la lumière ultra-violette puissent provoquer la forma- tion d'agrâgats de micro-organismes et ces agrégats peuvent conserver des particules non traitées de micro-organismes infectieux.
On a découvert à présent que ces inconvénients peuvent être sup- primés en utilisant une classe particulière d'agents inactivants. par exem- ple la N-acétyléthylèneimine,pour produire des agents; immunisants contenant des antigènes;, par exemple des vaccins et des toxoïdes.
Suivant la présente invention, dans un procédé de fabrication d'une matière contenant des antigèneson soumet.les microorganismes infectieux et/ ou leurs .antigènes à l'action d'un composé de la formule g R CO N CH2 CH2 où R représente un radical méthyle éthyles n-propyle ou isopropyleo
Il est clair que l'expression "micro-organismes infectieux" couvre le groupe comprenant les virus, par exemple le virus de 1'encéphale-myélite équine, le virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris), les rioket- tsies, par exemple Roburnetti, et les bactéries, par exemple,Staphylococcus albus.
Lesdits micro-organismes infectieux et/ou leurs antigènes utilisés comme matières premières peuvent se trouver sous forme d'une suspension aqueu- se qui peut facultativement contenir des agents protecteurspar exemple un tampon, par exemple une quantité appropriée de phosphate monoacide de sodium, pour former une suspension aqueuse au pH 8,0 Ces micro-organismes infectieux et/ou leurs antigènes utilisés comme matières premières peuvent également être facultativement additionnés de tissu animal, par exemple, de cervelle de cobaye ou de cervelle et de moelles épinière de souris.
Comme composé particulièrement approprié de la formule donnée ci-dessus, la N-acétyléthylèneimine peut être mentionnée à titre d'exemple.
Ce composé est généralement ajouté aux micro-organismes infectieux et/ou leurs antigènes, de préférence sous forme d'une suspension aqueuse, à une bas-
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se température, comprise, par exemple entre environ 0 C et environ 37 C afin d'obtenir une matièrecontenant un taux élevé de matière antigène non toxique et non infectieuse. Il est toutefois évident que des températures de travail plus élevées peuvent être utilisées,mais la matière ainsi obtenue contiendra un taux moins élevé de matière antigène non toxique et non infectieu- se..
La durée nécessaire pour déterminer l'inactivation en ce qui concerne l'infectivité des micro-organismes infectieux ou en ce qui concerne la toxicité de leurs antigènes est fonction de plusieurs facteurs;, par exemple de la nature du micro-organisme particulier ou de l'antigène particulier utilisé, de la concentration de composé de formule donnée utilisée.de la concen- tration initiale du micro-organisme infectieux ou de l'antigène utilisé,'de la concentration d'un tissu animal quelconque pouvant être présent et de la tem- pérature à laquelle le procédé est exécuté.
Comme indiqué ci-dessusdes micro-organismes appropriés peuvent être par exemple des virus par exemple le virus de l'encéphalo-myélite équine (souche de New-Jersey) et le virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris).Il est avantageux d'utiliser une suspension à 20 % poids/volume d'un mélange .de micro-organismes infectieux et de tissu animal en solution saline aqueuse stérile comme matière de départ avant le traitement de centrifugationo Le composé de la formule indiquée,
par exemple la N-acétyléthylène imine est généralement utilisé sous forme d'une solution dans de l'eau distillée stérile et la concentration du composé est de préférence comprise entre les limites d'environ 09005 % volume/volume et environ 1% volume/volume sur la base du volume combiné de suspension aqueuse du micro-organismeou de son antigène;, et de solution du composé. Dans les conditions ci-dessus la durée nécessaire pour déterminer l'inactivation en ce qui concerne l'infectivité des micro-organismes infectieux ou la toxicité de leurs antigènes à une température d'environ 18 à environ 22 C ou 37 C9 est généralement de l'ordre d'environ une demi-heure à environ douze heures.
Les préparations aqueuses ainsi obtenues contenant la matière antigène non infectieuse et non toxique peut être séchée par congélation suivant le procédé décrit dans le brevet de même date de la Demanderesse intitulé g "Production de préparations pharmaceutiques", pour obtenir une préparation sèche stable et pouvant être entreposée sous vide jusqu'au moment de son utilisation. Ainsi les préparations aqueuses peuvent être additionnées de solution aqueuse stérile de saccharose, de préférence de solutions d'environ 5% poids/volume et les mélanges ainsi obtenus sont séchés par congélation pendant environ 24 heures et entreposées ensuite sous vide.
Les préparations séchées conservent leurs propriétés antigènes pendant l'entreposage et sontrendues facilement utilisablessous' forme d'un vaccin par une addition d'eau distillée ou de solution saline stérile.
Les préparations non infectieuses de micro-organismes par exemple de virus,de bactéries et d'autres organismes, qui possèdent des propriétés antigènes non toxiques;, ou qui possèdent d'autres propriétés en plus de l'infectivité, peuvent .être préparées en utilisant un des composés indiqués;, par exemple l'aoétyléthylèneimine. Ces préparations,par exemple le virus de la poliomyélite ou le virus de l'influenza, traitées par de l'acétyléthylèneimine, peuvent être utilisées comme agent de diagnostic à des fins médicales vétérinaires et autres.
Comme indiqué ci-dessus, l'utilisation des composés de la formule indiquée conformément au procédé de la présente invention permet de réaliser des préparations régulières et sûres de matières non infectieuses et non toxiques qui possèdent des propriétés antigènespar exemple des agents immu-
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nisants, par exemple des vaccins, et l'élimination complète des propriétés infectieuses de micro-organismes ou des. propriétés toxiquesudesleursiantigènesiest réaldséepaveciuné pertetrès reduite du nulie des propriés antigènes.
L'invention est illustrée, mais non limitée, par les exemples suivants EXEMPLE 1.On broie de la cervelle de cobaye infectée de virus de l'encéphalomyélite équine (souche de New-Jersey) avec du sable stérile.dans des conditions stériles, et on en forme une suspension à 20 % poids/volume en ajoutant de la solution aqueuse stérile à 0985 % poids/volume de chlorure de sodium. La suspension à 20 % poids/volume ainsi obtenue est centrifugée pendant 15 minutes à 40000 tours par minute et le liquide surnageant est soigneusement séparé. On centrifuge le liquide ainsi obtenu pendant 5 minutes encore à 4 000 tours par minute et on sépare avec soin le liquide surnageant.
On mélange ce liquide surnageant avec un volume égal d'une solution stérile à 2 % volume/volume de N-aoétyléthylèneimine dans l'eau distillée refroidie et on maintient le mélange obtenu à environ 18-22 0 pendant 90 minutes, en agitant modérément de temps à autre, Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intracérébrale à 12 souris (0903 cm3 par souris) pour déterminer la présence de virus vivants.La survie en bon état de santé de toutes les souris indique l'absence de virus vivant.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules on le sèche par congélation pendant 24 heures, et on le scelle ensuite 'sous video Les ampoules scellées contenant la prépartion de vaccin séchée sont alors entreposées à 2 C, Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile, ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquidé limpide,, Des échantillons de ce liquide sont essayés en vue d'en déterminer n'ionfectivcité et la toxicité en injectant 3 fois séparément par voie intrapéritonéale 0,5 cm3 à chacune de 20 souris (ce qui fait au total 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler 7 jours entre chaque injection.
On constate l'absence complète d'infectivité et de toxicité par la survie en très bon état de santé de toutes les souris quatre mois plus tard.
On vaccine un second lot de 20 souris et on les soumet à une épreuve par le virus vivant par le procédé suivant. On injecte par voie intrapéritonéale 3 fois séparément à 20 souris nouvellement sevrées d'un poids moyen de 12-15 g 0,5 cm3 du vaccin, reconstitué comme décrit ci-dessus, (ce qui fait au total 1,5 cm3 par souris) avec un intervalle de 7 jours entre chaque injection. Sept jours après la dernière vaccination, on inocule aux souris par voie intracérébrale le virus vivante la quantité de la dose étant trente fois la dose qui9 administrée par voie intracérabrale, est léthale pour 100% des souris. On constate que 40 % des souris survivent à cette épreuve par le virus vivant. Dans une expérience témoin, pour laquelle on se sert de souris non vaccinées, toutes sont tuées lorsqu'elles sont soumises à une épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 2 On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant une solution à 0,5% volume/volume de N-acétyléthylèbneimine au lieu de la solu-
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tion à 2 % volume/volume de !T-acéty3thy,lènBimine9. et on maintient le mé- lange ainsi obtenu à environ l8-22 C pendant 3 heures en agitant modérément de temps à astre.
On inocule par voie intracérébrale un échantillon de la préparation ainsi obtenue à 12 souris (0,03 cm3 par souris) pour établir la présence de virus vivant.On constate l'absence de virus vivant par la survie en bon état de santé de toutes les souris.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 partie en volume d'une solution stérile aqueuse de saccharose à 5 % poids/volume. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le sèche par congélation pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vide. Les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors en-
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tr76 sées à 2 Cô
Pour l'utilisation 9 on reconstitue le contenu de chaque ampoule en y ajoutant 2 cm3 d'eau distillée stérile ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
Des échantillonss de ce liquide sont essayés en vue d'en déterminer ltinfectivité et la toxicité en injec- tant 0,5 om3 par voie intrapéritonéale à chacune de 20 souris, trois fois séparément (ce qui fait un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écou- ler 7 jours entre chaque injection. La survie en très bon état de santé de toutes les souris quatre mois plus tard indique l'absence complète d'infec- tivité et de toxicité.
On vaccine un second lot de 20 souris et on les-soumet à une épreu-
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ve par le virus vivant par le procédé suivante On injecte à 20 souris nou# *#'# ' vellement sevrées, d'un poids moyen de 12 (15 g9 095 éu3¯dta. vacoïn (reconstitué comme décrit plus haut) par voie intrapéritôné8lej) trois fois séparé- ment (ce qui constitue un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler une période de 7 jours entre chaque injection. Sept jours après la dernière vaccination, on inocule aux souris le virus vivant par voie intracérébrale, la quantité dela dose étant trente fois la dose qui, administrée par voie in-
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traeéré.brale$ est léthale pour 100 % des souriso On constate que50 % des souris survivent à cette épreuve par le virus vivante Dans une expérience
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témoin,
pour laquelle on S3 sert de souris non vaccinées toutes sont tuées par l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 3.
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1, en utilisant une so-
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lution de il-acétyléthylèneimine à 0925 volume/volume au lieu de la solution de N-aoe'sîtmNBG à 2 % volume/volume;, et on maintient le mélan- ge ainsi obtenu à 37 C pendant 3'heures,en agitant,modérément de temps à autre
La préparation ainsi obtenue ne contient pas de virus vivant ainsi que le montre l'inoculation par voie intracérâbrale d'un échantillon de la préparation à des souris.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 de partie en volume de solution stérile aqueuse de saccharose à 5 % poids/volume. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules, on le sèche par congélation pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vide. Les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors entreposées à 200,
Pour l'utilisation 9 on reconstitue le contenu de chaque ampoule
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par :[vad1ilfifton de 2 cm3 d 9 eau distillée stérile ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
Des échantillons d'un tel liquide sont essayés en vue d'en déterminer 1 ïnfectivïté et la toxicité en injectant trois fois séparément, 0,5 cm3 par voie intrapéritonéale à chacune
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de 20 souris (ce qui fait au total 1,5 cm3 par sourds) en laissant s'écou- ler une période de 7 jours entre chaque injection. La survie de toutes les souris en très bon état de santé quatre mois plus tard indique l'absence complète d'infectivité et de toxicité.
On vaccine un second lot de 20 souris et on les soumet ensuite à une épreuve par le virus vivant par le procédé suivant.On injecte à 20 souris nouvellement sevrées,d'un poids moyen de 12-15 g, 0,5 cm3 du vaccin (reconstitué comme décrit ci-dessus) par voie intrapéritonéale 3 fois séparément ( ce qui fait un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler une période de 7 jours entre chaque injection.
Sept jours après la dernière vaocination9 on inocule aux souris par voie intraoérabrale le virus vivant, la quantité de la dose étant vingt fois la dose, qui administrée par voie intracérébrale, est léthale pour 100% des souriso On constate que 74 % de souris survivent à cette épreuve par le virus vivante Dans une expérience témoin, pour laquelle on se sert de souris non vaccinées toutes sont tuées par l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 4
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant une solution de N-acétyléthylèneimine à 0,1% volume/volume au lieu de la solution de N-acétyléthylènoeimine à 2 % volume/volume et on maintient le mélange ainsi obtenu à 37 C pendant 4 heures en agitant modérément.', de temps à autre. La préparation ainsi obtenue est séchée par congélation par le procédé décrit ci-dessus et le produit séché est reconstitué par de l'eau distillée stérile pour former un vaccin. Lorsque ce vaccin est inoculé à des souris qui son ensuite soumises à une épreuve par le virus vivant par le procédé décrit dans l'exemple 3, on constate que 100 % des souris survivent à cette épreuve.
Dans une expérience témoin pour laquelle on se sert de souris non vaccinées toutes sont tuées par l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE5
On broie de la cervelle et de la moelle épinière de souris infectées de virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris) avec du sable stérile dans des conditions stériles et on en forme ensuite une suspension à 20 % poids/volume par l'addition de solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0985 % poids/volume. On centrifuge la suspension à 20 % poids/volume ainsi obtenue pendant300 minutesà 4 000 tours par minute et on sépare soigneusement le liquide surnageant.
On centrifuge le liquide surnageant ainsi obtenu pendant 5 minutes encore à 4.000 tours par minute et on sépare soigneusement ensuite le liquide surnageant. On mélange ce liquide surnageant avec un volume égal d'une solution stérile à 2 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine, dans l'eau distillée refroidie et on maintient le mélange ainsi obtenu à environ l8-22 C pendant 2 heures en agitant modérément de temps à autre.
Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intracérébrale à 17 sourse (0903 cm3 par souris) pour déterminer la présence de virus vivant. On ne.détecte pas de virus vivant, toutes les souris survivant 28 jours après l'inoculation en bon état de santé. On inocule par voie intracérébrale à un groupe témoin de 38 souris une suspension à 10 % poids/ volume de virus Lansin de la poliomyélite (adapté aux souris) dans une solution aqueuse stérile à 0,85% poids/volume de chlorure de sodium (003 cm3 par souris) avant le traitement par l'acétyléthylèneimine. Ces animaux sont tous infectés par le virus vivant et tous meurent dans les onze jours qui suivent l'inoculation.
Au reste de la préparation;, on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile de saccharose à 5 % poids/volume. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le lyophilise
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pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vidée Les amppules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors entreposées à 2 C
Pour l'utilisation on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile, ce qui assure une dissolution rapide et la fermât ion d'un liquide limpide.
Des échantillons de ce liquide sont essayés en vue de déterminer son infectivité etsa toxicité par injection de 0,5 om3 par voie intrapéritonéale à chacune de 20 souris 3 fois séparément (ce qui constitue un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler 7 jours entre chaque injection. L'infectivité et la toxicité s'avèrent être absentes, ce qu'indique la survie de toutes les souris en très bon état de santé plusieurs mois après l'injection.
EXEMPLE 6.-
On reprend le procédé dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,5% volume/volume de N-acéthyléthylèneimine, au lieu de la solution à 2% volume/volume de N-acéthléthylènecimine et on maintient le mélange ainsi obtenu à environ i8-22 C pendant 6 heures,en agitant modérément de temps à autre.
La préparation ainsi obtenue ne contient pas de virus vivant et elle peut être séchée par lyophilisation par le procédé décrit dans l'exemple 5o La matière séchée ainsi obtenue peut être reconstituée par l'addition d'eau distillée stérile. Le liquide limpide ainsi obtenu injecté par voie intrapéritonéale à des souris s'avère exempt d'infectivité et .de toxicité, ainsi que le montre la survie de toutesles souris en très bon état de santé plusieurs mois après l'injection.
EXEMPLE 7.-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,25% volume/volume de N-aééthléthylèneiminek au lieu de la solution à 2 volume/volume de N-acétyléneimine et on maintient le' mélange ainsi obtenu à envirdnn 37 C pendant 4 heures,en agitant modérément de temps à autre.
La préparation ainsi obtenue'ne contient pas de virus vivant et peut être séchée par lyophilisation par le procédé décrit dans l'exemple 5.
La matière séchée ainsi obtenue peut être reconstituée par l'addition d'eau distillée stérile.Le liquide limpide ainsi obtenu injecté à des souris par voie intrapéritonéale -s'avère exempt d'infectivité et de toxicité,ainsi que l'indique la survie de toutes les souris en très bon état plusieurs mois après l'injection.
EXEMPLE 8,,-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,1% volume/volume de N-acétyléthylèneimine, au lieu de la solution à 2% volume/volume de N-acétyléthylèneimine et on maintient le mélange ainsi obtenu à 37 C pendant 4 heures, en agitant modérément de temps à autre.
Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intracérébrale à 20 jeunes souris (0,03 cm3 par souris) en vue de déterminer la présence de virus vivante On ne détecte pas de virus vivant, ainsi que l'indique la survie de toutes les souris 40 jours après l'inoculation en bon état de santé.On inocule à un groupe témoin'de 38 souris par voie intracérébrale le virus Lansing de la poliomyélite (adapté aux souris) à 20 % poids/ volume dans une solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,85 % (0,03 cm3 par souris ) avant le traitement par l'aoétyléthylèneimine. Ces animaux sont infectés par le virus vivant et meurent tous dans les 11 jours qui suivent l'inoculation.
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Au reste de la préparation9 on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile à 5 % poids/-volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules;,on le lyophi- lise pendant 24 heures et on le scelle ensuite sous vide. On entrepose ensui- te à 2 C les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée-.
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile ce qui assure une dissolution ra- pide et la formation d'un liquide limpide. On essaie des échantillons de ce liquide en vue d'en déterminer l'infectivité, la toxicité et la puissance d'immunisation en injectant 4' fois 'séparément 0,5 cm3 par voie intrapérito- néale à chacune de 20 souris, (ce qui fait un total de 2 cm3 par souris) en laissant s'écouler 10 jours entre chacune des trois premières doses et 14 jours entre les troisième et quatrième doses.
Quatorze jours après la derniè- re injection, les souris-sont dans un très bon était de santé ce qui indique que le vaccin ne possède aucune infectivité ni aucune toxicité.On inocule alors à ces souris par voie intracérébrale le virus vivant, la quantité de la dose étant trente fois la dose*: qui, administrée par voie intracérébrale, est léthale pour 100%des souriso On constate que 25 % de souris survivent à cette épreuve par le virus vivanteDans une expérience témoin pour laquelle on utilise des souris non vaccinées;, toutes meurent à l'épreuve par le virus vivant.
EXEMPLE 9.-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,05% volume/volume de N-acétylétyléthylèneimine. au lieu de la solu- tion à 2 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine, et on maintient le mélange ainsi obtenu à 37 C pendant 12 heures, en l'agitant modérément de temps à autre.
Un échantillon de la préparation ainsi obtenue est inoculé par voie intrascébrale à 27 jeunes souris (0,03 cm3 par souris) pour déterminer la présence de virus vivant.On ne détecte pas de virus vivant,toutes les souris survivant en bon-état de santé 35 jours après l'inoculation.
Au reste de la préparationg on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse stérile à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le sèche par congélation pendant 24 heures et on scelle ensuite les ampoules sous vide.
Les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée sont alors entreposées à 2 C.
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile, ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
On essaie des échantillons de ce liquide pour en déterminer l'in- fectivité, la toxicité et la puissance d'immunisation en injection séparément 4 fois 0,5 cm3 par voie intrapéritonéale à chacune de 25 souris (ce qui fait un total de 2 cm3 par souris) en laissant s'écouler une période de 10 jours entre chacune des trois premières doses9 et 14 jours entre les troisième et quatrième doses.
Dix jours après la dernière vaccination, les souris sont en très bon état de santé:, ce qui montre que le vaccin ne possède pas d'infectivité ni de toxicité. On inocule ensuite à ces souris par voie intracérébrale le virus vivant, la quantité de la dose étant trente fois la dose qui administrée par voie intracérébrale, est léthale pour 100 % des souris. On constate que 44 % des souris survivent à cette-épreuve. Dans une expérience témoin, pour laquelle on se sert de souris non vaccinées aucune des souris ne survit à " l'injection intracérébrale du virus vivant.
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EXEMPLE 10.-
On reprend le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant une solution à 0,025 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine au lieu de la solution à 2 % volume/volume de N-aoétyléthylèneimine et on maintient le mé- lante à 37 0.pendant 12 heures, en agitant modérément de temps à autre.
On inocule par voie intracérébrale un échantillon de la préparation ainsi obtenue à 20 jeunes souris (0,03 cm3 par souris) en vue de déterminer la présence de virus vivant.On ne détecte pas de virus vivant, toutes les souris survivant en bon état de santé 35 jours après l'inoculation.
Agreste de la préparation;, on ajoute 1/4 de partie en volume d'u- ne solution aqueuse stérile à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des.ampoules et on le sèche par congélation pendant 24 heures et on scelle ensuite les ampoules sous video On entrepose à 2 C les ampoules scellées contenant la préparation de vaccin séchée.
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée ce qui assure une dissolution rapide et la formation d'un liquide limpide.
On essaie des échantillons de ce liquide pour en déterminer l'in- fectivité, la toxicité et la puissance d'immunisation en injectant 3 fois sé- parément par voie intrapéritonéale 0,5 cm3 à 20 souris (ce qui constitue un total de 1,5 cm3 par souris) en laissant s'écouler 7 jours entre les premiè- re et deuxième doses de vaccin et 14 jours entre les deuxième et -troisième do- ses. Dix jours après la dernière dose de vaccin, toutes les souris sont en très bon état de santé,ce qui montre l'absence d'infectivité et de toxicité du vaccin. On inocule ensuite à ces souris par voie intracérébrale le virus vivant, la quantité de la dose étant dix fois la dose qui, administrée par voie intracérébrale est léthale pour 100 % des souris. On constate que 55% des souris survivent à cette épreuve.
Dans une expérience témoin, pour laquel- le on se sert de souris non vaccinées, aucune, d'elles -ne survit à l'injec- tion intracérébrale de virus vivant.
EXEMPLE 11.-
On centrifuge-une culture de Staphylococcus albus pleinement dé- veloppée, isolée initialement de peau humaine. On met en suspension les cel- lules bactériennes dans une solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,85 % poids/volume, on les centrifuge et on les remet en suspension dans de la nouvelle solution auqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,85 % poids/ volume pour obtenir une suspension de cellules indiquant une densité optique de 1,6 par l'examen d'un échantillon dans une cellule spectrophotométrique à
1 cm en utilisant de la lumière d'une longueur d'onde de 5.800 .
A 4 parties de la suspension de cellules ainsi obtenue, on ajoute 1 partie d'une solu- tion à 1 % volume/volume de N-acétyléthylèneimine, dans l'eau distillée refroidie, et on maintient le mélange résultant à 37 C pendant 24 heures, en agitant modérément de temps à autre.
On inocule un échantillon de la préparation ainsi obtenue à un bouillon nutritif bactérien et également à un bouillon nutritif bactérien sur agar dans une cuvette de culture. On ne détecte pas de bactéries vivantes, ainsi que le montre la non croissance des bactéries dans chacun des cas à 37 C dans les 6 jours.
Au reste de la préparation, on ajoute 1/4 de partie en volume d'une solution aqueuse à 5 % poids/volume de saccharose. On répartit le mélange ainsi obtenu en parties de 2 cm3 dans des ampoules et on le lyophilise pendant 18 heures et on le scelle ensuite sous vide. Les ampoules scellées con-
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tenant la préparation de vac.cin séchée sont alors entreposées à 18-22 C
Pour l'utilisation, on reconstitue le contenu de chaque ampoule par l'addition de 2 cm3 d'eau distillée stérile,ce qui assure une dissolu- tion rapide et la formation d'une suspension uniforme et régulière., On essaie des échantillons de cette matière en vue de déterminer la présence de bacté- ries vivantes par injection dans un bouillon nutritif bactérieu qu'on incubeensuite à 37 C pendant 6 jours.
L'absence de bactéries viables est montrée par l'ab- sence de croissance de bactéries dans ces conditions. Le vaccin reconstitué est injecté par voie sous-cutanée à des lapins. Dans aucun cas, le lapin ne présente de symptômes toxiques résultant de l'injection du vaccine Deux in- jections de vaccination, de 0,5 cm3 par lapin sont administrées la première semaine et deux injections de 1,0 cm3 par lapin sont administrées la seconde semaine. On recueille alors du sérum chez ces lapins et chez des lapins non vaccinés. La tttration d'anticorps du sérum est estimée par la réaction d'agglutination avec une suspension vivante des mêmes bactéries.
On constate un accroissement considérable de l'agglutination des anticorps sur les lapins vaccinés ayant servi à préparer'le sérum par comparaison avec, les lapins non vaccinés ayant servi à préparer le sérum EXEMPLE 12.-
24 heures après 1'infection au moyen de petites quantités de virus de l'influenza type A, les membranes chorio-allantoiques sont récoltées sur 30 oeufs de poules fécondés au 12 ème jour., Les membranes mises en commun sont alternativement congelées à -70 C et dégelées à 37 C, trois fois et 30 cm3 de solution saline tamponnée par du phosphate M/100 sont ajoutés.
Après le mélange, les membranes sont centrifugées à 30000 tours par minute pendant 5 minutes et l'extrait de membranes surnageant est séparée Un échantillon de l'extrait est essayé en vue de déterminer son infectivité sur des oeufs de poules fécondés et des quantités de 1 cm3 d'une dilution à 10 infectent 50 % des oeufs (c'est-à-dire que l'extrait contient 106,2 doses infectant 50 % des oeufs (EID ) par cm3) A un échantillon de cet extrait de membranes, on ajoute de l'acétyléthylèneimine en quantité choisie pour obtenir une con- centration finale de 1% volume/volume d'acétyléthylèneimine et on incube le mélange à 30 C pendant 4 heureso A la dilution 1:
10, l'extrait traité n'infec- te aucun oeuf sur les 10 auxquels 1 cm3 à été inoculé. L'extrait non dilué est toxique pour les oeufsmais lorsque le virus est séparé par adsorption sur les globules rouges de cobaye et élue dans une solution de chlorure de sodium à 0985 %, on constate qu'il n'infecte aucun oeuf sur 10 inoculés avec 1 cm3. Lorsque les extraits non traités et les extraits traités par l'acétylé- thylèneimine sont essayés parallèlement par le procédé habituel (épreuve type Salk), on constate qu'ils possèdent Les mêmes capacités d'agglutination des globules rouges du cobaye (les titres d'hémagglutinine sont de 103?0 et 102995 unités d'hémagglutinine par cm3,
respectivement ce qui ne constitue pas une différence significative avec le procédé employé). Essayés contre le même échan- tillon de sérum de convalescent humain qui contient des anticorps de l'anti- gène soluble de l'influenza type A9 les extraits non traités et les extraits traités par l'acétyléthylèneimine s'avèrent encore contenir des quantités ne pouvant être distinguées d'angigène soluble;, la mesure étant faite par fixa- tion complémentaire (103,05 et 103,2 unités d'antigène soluble par cm3 res- pectivement).
Dans le diagnostic de l'infection grippale chez l'homme, les anti- corps du sérum sont .mesurés en termes de leur pouvoir conbinant avec de l'hé- magglutinine ou avec'l'antiggne soluble du virus de l'influenza. Les prépara- tions non infectieuses du virus de l'influenza traitées par l'acétyléthylène- imine obtenues comme ,décrit ci-dessus peuvent donc être utilisées à cette fin.
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The present invention relates to the production of pharmaceutical preparations and more particularly to the production of materials containing antigens, for example vaccines, toxoids and diagnostic reagents.
It is known to prepare materials containing antigens, eg immunizing agents *, such as vaccines containing antigens by treating infectious microorganisms, eg infectious viruses with particular inactivating agents eg. phenol, formaldehyde, hydrogen peroxide, or by subjecting them to the action of heat or the action of ultraviolet light, thus destroying the infectious properties of microorganisms while retaining their antigenic properties. These inactivating agents have certain drawbacks in that they are sometimes too destructive with regard to the antigenic structures of microorganisms, for example viruses,
and it is often difficult to ensure complete destruction of the infectious properties of microorganisms while retaining their antigenic properties. In addition, it is possible that certain infectious microorganisms which are inactivated at the time of treatment with a particular incapacitating agent, for example formaldehyde, may regain their infectious properties and thus become causative agents of diseases, either during storage or after administration to a patient as a vaccine.
In addition, it is also possible that particular inactivating agents, for example formaldehyde or the action of ultraviolet light, may cause the formation of aggregates of microorganisms and these aggregates may retain untreated particles of infectious microorganisms.
It has now been found that these drawbacks can be overcome by using a particular class of inactivating agents. for example N-acetylethyleneimine, to produce agents; immunizers containing antigens, eg vaccines and toxoids.
According to the present invention, in a process for the manufacture of a material containing antigens, the infectious microorganisms and / or their antigens are subjected to the action of a compound of the formula g R CO N CH2 CH2 where R represents a radical methyl ethyl n-propyl or isopropyleo
It is clear that the term "infectious microorganisms" covers the group comprising viruses, for example equine encephalon-myelitis virus, polio Lansing virus (adapted to mice), riokettias, for example. example Roburnetti, and bacteria, for example, Staphylococcus albus.
Said infectious microorganisms and / or their antigens used as starting materials may be in the form of an aqueous suspension which may optionally contain protective agents, for example a buffer, for example an appropriate amount of sodium monoacid phosphate, to form an aqueous suspension at pH 8.0 These infectious microorganisms and / or their antigens used as raw materials may also optionally be supplemented with animal tissue, for example, guinea pig brain or mouse brain and spinal cord.
As a particularly suitable compound of the formula given above, N-acetylethyleneimine can be mentioned by way of example.
This compound is generally added to infectious microorganisms and / or their antigens, preferably in the form of an aqueous suspension, at a low level.
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temperature, for example between about 0 C and about 37 C in order to obtain a material containing a high level of non-toxic and non-infectious antigen material. However, it is evident that higher working temperatures can be used, but the material thus obtained will contain a lower level of non-toxic and non-infectious antigen material.
The time required to determine inactivation with respect to the infectivity of infectious microorganisms or with respect to the toxicity of their antigens depends on several factors; e.g., the nature of the particular microorganism or the 'particular antigen used, the concentration of compound of given formula used, the initial concentration of the infectious microorganism or antigen used,' the concentration of any animal tissue that may be present and the time - temperature at which the process is carried out.
As indicated above, suitable microorganisms can be, for example, viruses for example Equine Encephalomyelitis virus (New Jersey strain) and Polio Lansing virus (adapted to mice). 'use a 20% w / v suspension of a mixture of infectious microorganisms and animal tissue in sterile aqueous saline solution as the starting material before the centrifugation treatment The compound of the formula shown,
for example N-acetylethylene imine is generally used as a solution in sterile distilled water and the concentration of the compound is preferably between the limits of about 09005% v / v and about 1% v / v based on the combined volume of aqueous suspension of the microorganism or its antigen ;, and solution of the compound. Under the above conditions the time required to determine the inactivation with respect to the infectivity of infectious microorganisms or the toxicity of their antigens at a temperature of about 18 to about 22 C or 37 C9 is generally 1 'order from about half an hour to about twelve hours.
The aqueous preparations thus obtained containing the non-infectious and non-toxic antigenic material can be dried by freezing according to the process described in the Applicant's patent of the same date entitled "Production of pharmaceutical preparations", to obtain a stable dry preparation which can be used. stored under vacuum until ready to use. Thus the aqueous preparations can be added with sterile aqueous solution of sucrose, preferably solutions of about 5% weight / volume and the mixtures thus obtained are dried by freezing for about 24 hours and then stored under vacuum.
Dried preparations retain their antigenic properties during storage and are made readily usable in vaccine form by addition of distilled water or sterile saline.
Non-infectious preparations of microorganisms, for example viruses, bacteria and other organisms, which possess non-toxic antigenic properties, or which have other properties in addition to infectivity, can be prepared using one of the compounds indicated ;, for example aoetylethyleneimine. These preparations, for example the polio virus or the influenza virus, treated with acetylethyleneimine, can be used as a diagnostic agent for veterinary and other medical purposes.
As indicated above, the use of the compounds of the indicated formula in accordance with the process of the present invention allows for regular and safe preparations of non-infectious and non-toxic materials which possess antigenic properties, for example immune agents.
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inhibitors, for example vaccines, and the complete elimination of the infectious properties of microorganisms or. toxic properties of their antigens are realigned with a very reduced loss of the nullity of antigen properties.
The invention is illustrated, but not limited, by the following examples EXAMPLE 1 Guinea pig brains infected with Equine Encephalomyelitis virus (New Jersey strain) are ground with sterile sand under sterile conditions, and a 20% w / v suspension is formed by adding sterile 0985% w / v aqueous sodium chloride solution. The 20% w / v suspension thus obtained is centrifuged for 15 minutes at 40,000 revolutions per minute and the supernatant liquid is carefully separated. The resulting liquid is centrifuged for a further 5 minutes at 4000 rpm and the supernatant liquid is carefully separated.
This supernatant liquid is mixed with an equal volume of a sterile 2% v / v solution of N-aoetylethyleneimine in chilled distilled water and the resulting mixture is maintained at about 18-220 for 90 minutes, with moderate agitation. from time to time, a sample of the preparation thus obtained is inoculated intracerebrally into 12 mice (0903 cm3 per mouse) to determine the presence of live virus. Healthy survival of all mice indicates the absence of virus living.
To the remainder of the preparation, 1/4 part by volume of a sterile aqueous solution containing 5% weight / volume of sucrose is added. The mixture thus obtained is distributed into parts of 2 cm3 in ampoules, dried by freezing for 24 hours, and then sealed under video. The sealed ampoules containing the dried vaccine preparation are then stored at 2 ° C. Use, the contents of each ampoule are reconstituted by the addition of 2 cm3 of sterile distilled water, which ensures rapid dissolution and the formation of a clear liquid. Samples of this liquid are tested for determine the infectivity and the toxicity by injecting 3 times separately by the intraperitoneal route 0.5 cm3 to each of 20 mice (which makes a total of 1.5 cm3 per mouse), allowing 7 days to elapse between each injection.
The complete absence of infectivity and toxicity is observed by the survival in very good state of health of all the mice four months later.
A second batch of 20 mice were vaccinated and challenged with live virus by the following method. 20 newly weaned mice with an average weight of 12-15 g are injected intraperitoneally 3 times separately with 0.5 cm3 of the vaccine, reconstituted as described above, (making a total of 1.5 cm3 per mouse) with an interval of 7 days between each injection. Seven days after the last vaccination, the mice were inoculated intracerebrally with the live virus the amount of the dose being thirty times the dose which administered intracerabrally, was lethal in 100% of the mice. It is found that 40% of the mice survive this test by the live virus. In a control experiment, in which unvaccinated mice are used, all are killed when challenged with live virus.
EXAMPLE 2 The process described in Example 1 is repeated using a 0.5% v / v solution of N-acetylethylenimine instead of the solution.
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tion at 2% v / v! T-acetylthy, lènBimine9. and the mixture thus obtained is kept at about 18-22 ° C. for 3 hours with moderate stirring occasionally.
A sample of the preparation thus obtained was inoculated intracerebrally in 12 mice (0.03 cm3 per mouse) to establish the presence of live virus. The absence of live virus was observed by the healthy survival of all the animals. mouse.
To the remainder of the preparation, 1/4 part by volume of a sterile aqueous sucrose solution at 5% weight / volume is added. The resulting mixture was distributed into 2 cc parts in ampoules and freeze dried for 24 hours and then sealed in vacuo. The sealed ampoules containing the dried vaccine preparation are then enclosed.
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tr76 sées at 2 Cô
For use 9, the contents of each ampoule are reconstituted by adding 2 cm3 of sterile distilled water, which ensures rapid dissolution and the formation of a clear liquid.
Samples of this liquid are tested for infectivity and toxicity by injecting 0.5 µm3 intraperitoneally into each of 20 mice, three times separately (making a total of 1.5 cm3 per mouse. ) allowing 7 days to elapse between each injection. The very healthy survival of all mice four months later indicates the complete absence of infection and toxicity.
A second batch of 20 mice are vaccinated and tested.
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ve by the live virus by the following procedure 20 newly weaned new mice, with an average weight of 12 (15 g9 095 eu3¯dta. vacoin (reconstituted as described above) are injected intraperitoneally8lej ) three times separately (which constitutes a total of 1.5 cm3 per mouse) allowing a period of 7 days to elapse between each injection. Seven days after the last vaccination, the mice were inoculated with live virus intracerebrally, the dose amount being thirty times the dose which when administered intracerebrally.
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traeéré.brale $ is lethal for 100% of the mice o It is observed that 50% of the mice survive this test by the live virus In an experiment
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witness,
for which one S3 serves as unvaccinated mice all are killed by the live virus challenge.
EXAMPLE 3.
The process described in Example 1 is repeated, using a so-
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lution of il-acetylethyleneimine at 0925 v / v instead of the 2% v / v N-aoe'sitmNBG solution ;, and the mixture thus obtained is maintained at 37 C for 3 hours, with moderate stirring. sometimes
The preparation thus obtained does not contain live virus, as shown by the inoculation by intracerebral route of a sample of the preparation into mice.
To the remainder of the preparation, 1/4 part by volume of sterile aqueous sucrose solution at 5% weight / volume is added. The resulting mixture is divided into 2 cc parts in ampoules, dried by freezing for 24 hours and then sealed under vacuum. The sealed ampoules containing the dried vaccine preparation are then stored at 200,
For use 9 we reconstitute the contents of each ampoule
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by: [vad1ilfifton of 2 cm3 d 9 sterile distilled water which ensures rapid dissolution and the formation of a clear liquid.
Samples of such a liquid are tested for its infectivity and toxicity by injecting three times separately, 0.5 cm3 intraperitoneally into each.
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of 20 mice (which makes a total of 1.5 cm3 per deaf), allowing a period of 7 days to elapse between each injection. The survival of all very healthy mice four months later indicates the complete absence of infectivity and toxicity.
A second batch of 20 mice was vaccinated and then challenged with live virus by the following method. 20 newly weaned mice, average weight 12-15 g, were injected with 0.5 cc of the vaccine. (reconstituted as described above) intraperitoneally 3 times separately (which makes a total of 1.5 cm3 per mouse) allowing a period of 7 days to elapse between each injection.
Seven days after the last vaocination9 the mice are inoculated intraoerabrally with the live virus, the amount of the dose being twenty times the dose, which administered intracerebrally, is lethal for 100% of the mice o It is observed that 74% of mice survive this live virus challenge In a control experiment, in which unvaccinated mice were used, all were killed by the live virus challenge.
EXAMPLE 4
The process described in Example 1 is repeated using a 0.1% volume / volume N-acetylethyleneimine solution instead of the 2% volume / volume N-acetylethylenoeimine solution and the mixture thus obtained is maintained at 37. C for 4 hours with moderate stirring occasionally. The preparation thus obtained is freeze dried by the method described above and the dried product is reconstituted with sterile distilled water to form a vaccine. When this vaccine is inoculated into mice which are then subjected to a challenge with the live virus by the method described in Example 3, it is found that 100% of the mice survive this challenge.
In a control experiment using unvaccinated mice all were killed by live virus challenge.
EXAMPLE 5
The brains and spinal cord of mice infected with polio Lansing virus (adapted for mice) are ground with sterile sand under sterile conditions and then formed into a 20% w / v suspension by the addition of 0985% w / v sterile aqueous sodium chloride solution. The resulting 20% w / v suspension was centrifuged for 300 minutes at 4000 rpm and the supernatant liquid was carefully separated.
The supernatant liquid thus obtained is centrifuged for a further 5 minutes at 4,000 rpm and the supernatant liquid is then carefully separated. This supernatant liquid is mixed with an equal volume of a sterile 2% v / v N-acetylethyleneimine solution in chilled distilled water and the resulting mixture is maintained at about 18-22 C for 2 hours with moderate agitation. sometimes.
A sample of the preparation thus obtained is inoculated intracerebrally at 17 sources (0903 cm3 per mouse) to determine the presence of live virus. Live virus was not detected, all mice surviving 28 days after inoculation in good health. A control group of 38 mice was inoculated intracerebrally with a 10% w / v suspension of poliomyelitis Lansin virus (suitable for mice) in a sterile 0.85% w / v aqueous solution of sodium chloride (003 cm3 per mouse) before treatment with acetylethyleneimine. These animals are all infected with the live virus and all die within eleven days of inoculation.
To the remainder of the preparation, 1/4 part by volume of a sterile 5% weight / volume aqueous sucrose solution is added. The mixture thus obtained is distributed in parts of 2 cm3 in ampoules and freeze-dried.
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for 24 hours and then sealed under vacuum The sealed amppules containing the dried vaccine preparation are then stored at 2 C
For use, the contents of each ampoule are reconstituted by the addition of 2 cm3 of sterile distilled water, which ensures rapid dissolution and the closure of a clear liquid.
Samples of this liquid are tested for its infectivity and toxicity by injection of 0.5 µm3 intraperitoneally into each of 20 mice 3 times separately (which constitutes a total of 1.5 cm3 per mouse) leaving s 'elapse 7 days between each injection. Infectivity and toxicity were found to be absent, which was indicated by the survival of all mice in very good health several months after injection.
EXAMPLE 6.-
The process is repeated in Example 5 using a 0.5% v / v solution of N-acetylethyleneimine, instead of the 2% v / v solution of N-acetylethylenecimine, and the mixture thus obtained is maintained at approximately i8-22 C for 6 hours, stirring moderately occasionally.
The preparation thus obtained does not contain live virus and it can be dried by lyophilization by the method described in Example 5o. The dried material thus obtained can be reconstituted by the addition of sterile distilled water. The clear liquid thus obtained, injected intraperitoneally into mice, is found to be free from infectivity and toxicity, as shown by the survival of all the mice in very good health several months after the injection.
EXAMPLE 7.-
The process described in Example 5 is repeated using a 0.25% v / v solution of N-aééthléthylèneiminek instead of the 2 v / v solution of N-acetyleneimine and the mixture thus obtained is maintained at approxirdnn 37 C for 4 hours, stirring moderately occasionally.
The preparation thus obtained does not contain live virus and can be dried by lyophilization by the method described in Example 5.
The dried material thus obtained can be reconstituted by the addition of sterile distilled water. The clear liquid thus obtained injected into mice intraperitoneally -is found to be free from infectivity and toxicity, as indicated by survival of all mice in very good condition several months after injection.
EXAMPLE 8 ,, -
The process described in Example 5 is repeated using a 0.1% volume / volume solution of N-acetylethyleneimine, instead of the 2% volume / volume solution of N-acetylethyleneimine and the mixture thus obtained is maintained at 37 C for 4 hours, stirring moderately occasionally.
A sample of the preparation thus obtained is inoculated intracerebrally into 20 young mice (0.03 cm3 per mouse) in order to determine the presence of living virus. Live virus is not detected, as indicated by the survival of all mice 40 days after inoculation in good health A control group of 38 mice are inoculated intracerebrally with polio Lansing virus (adapted to mice) at 20% w / v in a sterile aqueous solution of 0.85% sodium chloride (0.03 cm3 per mouse) before treatment with aoetylethyleneimine. These animals are infected with the live virus and all die within 11 days of inoculation.
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To the remainder of the preparation9 is added 1/4 part by volume of a sterile 5% w / v aqueous solution of sucrose. The mixture thus obtained is distributed in parts of 2 cm 3 in ampoules, freeze-dried for 24 hours and then sealed in vacuo. The sealed ampoules containing the dried vaccine preparation are then stored at 2 ° C.
For use, the contents of each ampoule are reconstituted by the addition of 2 cm3 of sterile distilled water, which ensures rapid dissolution and the formation of a clear liquid. Samples of this fluid were tested for infectivity, toxicity, and immunization potency by separately injecting 0.5 cm3 intraperitoneally 4 'times' into each of 20 mice (which total of 2 cm3 per mouse) allowing 10 days between each of the first three doses and 14 days between the third and fourth doses.
Fourteen days after the last injection, the mice are in very good health, indicating that the vaccine has no infectivity or toxicity. These mice are then inoculated intracerebrally with the live virus, the amount of the dose being thirty times the dose *: which, administered by the intracerebral route, is lethal for 100% of the mice. It is observed that 25% of the mice survive this test by the living virus In a control experiment for which unvaccinated mice are used; , all die when tested by the living virus.
EXAMPLE 9.-
The process described in Example 5 is repeated using a 0.05% volume / volume solution of N-acetyletylethyleneimine. instead of the 2% v / v solution of N-acetylethyleneimine, and the resulting mixture is kept at 37 ° C. for 12 hours, with moderate stirring occasionally.
A sample of the preparation thus obtained is inoculated intrascebrally in 27 young mice (0.03 cm3 per mouse) to determine the presence of live virus. Live virus is not detected, all surviving mice in good health 35 days after inoculation.
To the remainder of the preparationg is added 1/4 part by volume of a sterile aqueous solution containing 5% weight / volume of sucrose. The resulting mixture is distributed into 2 cc parts in ampoules and freeze dried for 24 hours and then the ampoules are vacuum sealed.
The sealed ampoules containing the dried vaccine preparation are then stored at 2 C.
For use, the contents of each vial are reconstituted by the addition of 2 cm3 of sterile distilled water, which ensures rapid dissolution and the formation of a clear liquid.
Samples of this liquid were tested for their infectivity, toxicity and potency by injection separately 4 times 0.5 cm3 intraperitoneally to each of 25 mice (making a total of 2 cm3. per mouse) by allowing a period of 10 days between each of the first three doses9 and 14 days between the third and fourth doses.
Ten days after the last vaccination, the mice are in very good health :, which shows that the vaccine does not have infectivity or toxicity. These mice are then inoculated intracerebrally with the live virus, the amount of the dose being thirty times the dose which administered intracerebrally, is lethal for 100% of the mice. It is observed that 44% of the mice survive this test. In a control experiment, in which unvaccinated mice were used, none of the mice survived the intracerebral injection of live virus.
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EXAMPLE 10.-
The process described in Example 5 is repeated using a 0.025% v / v solution of N-acetylethyleneimine instead of the 2% v / v solution of N-aoetylethyleneimine and the mixing is maintained at 37 °. for 12 hours, stirring moderately from time to time.
A sample of the preparation thus obtained is inoculated intracerebrally in 20 young mice (0.03 cm3 per mouse) in order to determine the presence of live virus. Live virus is not detected, all the surviving mice in good condition. health 35 days after inoculation.
Agreste of the preparation ;, 1/4 part by volume of a sterile aqueous solution of 5% weight / volume of sucrose is added. The mixture thus obtained is distributed in parts of 2 cm3 in vials and dried by freezing for 24 hours and the vials are then sealed under video. The sealed vials containing the dried vaccine preparation are stored at 2 ° C.
For use, the contents of each ampoule are reconstituted by the addition of 2 cm3 of distilled water, which ensures rapid dissolution and the formation of a clear liquid.
Samples of this fluid were tested for their infectivity, toxicity and immunization potency by injecting 0.5 cm3 intraperitoneally 3 times separately into 20 mice (making a total of 1. 5 cm3 per mouse), allowing 7 days to elapse between the first and second doses of vaccine and 14 days between the second and third doses. Ten days after the last dose of vaccine, all the mice are in very good health, which shows the absence of infectivity and toxicity of the vaccine. These mice are then inoculated intracerebrally with the live virus, the amount of the dose being ten times the dose which, administered intracerebrally, is lethal for 100% of the mice. It is observed that 55% of the mice survive this test.
In a control experiment, using unvaccinated mice, none of them survived intracerebral injection of live virus.
EXAMPLE 11.-
A fully developed culture of Staphylococcus albus, initially isolated from human skin, is centrifuged. The bacterial cells are suspended in a sterile 0.85% w / v aqueous sodium chloride solution, centrifuged and resuspended in a new sterile aqueous sodium chloride solution at 0%. 85% w / v to obtain a cell suspension indicating an optical density of 1.6 by examining a sample in a spectrophotometric cell at
1 cm using light with a wavelength of 5,800.
To 4 parts of the cell suspension thus obtained, 1 part of a 1% v / v solution of N-acetylethyleneimine in cooled distilled water is added and the resulting mixture is maintained at 37 ° C for 24 ° C. hours, shaking moderately from time to time.
A sample of the preparation thus obtained is inoculated with a bacterial nutrient broth and also with a bacterial nutrient broth on agar in a culture dish. Live bacteria are not detected, as shown by the non-growth of bacteria in each case at 37 C within 6 days.
To the remainder of the preparation, 1/4 part by volume of a 5% weight / volume aqueous solution of sucrose is added. The resulting mixture is distributed into 2 cc parts in ampoules and freeze-dried for 18 hours and then sealed in vacuo. The sealed ampoules con-
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holding the dried vac.cin preparation are then stored at 18-22 C
For use, the contents of each ampoule were reconstituted by the addition of 2 cc of sterile distilled water, which assures rapid dissolution and formation of a uniform and even suspension. this material in order to determine the presence of living bacteria by injection into a bacterial nutrient broth which is then incubated at 37 ° C. for 6 days.
The absence of viable bacteria is shown by the absence of bacteria growth under these conditions. The reconstituted vaccine is injected subcutaneously into rabbits. In no case does the rabbit show toxic symptoms resulting from the vaccine injection Two vaccination injections of 0.5 cm3 per rabbit are given in the first week and two injections of 1.0 cm3 per rabbit are given the first week. second week. Serum is then collected from these rabbits and from unvaccinated rabbits. The antibody titeration of the serum is estimated by the agglutination reaction with a living suspension of the same bacteria.
There is a considerable increase in the agglutination of the antibodies on the vaccinated rabbits which were used to prepare the serum compared with the unvaccinated rabbits which were used to prepare the serum. EXAMPLE 12.
24 hours after infection with small amounts of influenza type A virus, chorioallantoic membranes are harvested from 30 eggs of hens fertilized on day 12., The pooled membranes are alternately frozen at -70 C and thawed at 37 C, three times and 30 cm3 of M / 100 phosphate buffered saline solution is added.
After mixing, the membranes are centrifuged at 30,000 revolutions per minute for 5 minutes and the supernatant membrane extract is separated A sample of the extract is tested in order to determine its infectivity on fertilized chicken eggs and quantities of 1 cm3 of a dilution to 10 infect 50% of the eggs (i.e. the extract contains 106.2 doses infecting 50% of the eggs (EID) per cm3) A sample of this membrane extract is adds acetylethyleneimine in an amount chosen to obtain a final concentration of 1% volume / volume acetylethyleneimine and the mixture is incubated at 30 ° C. for 4 hours at dilution 1:
10, the treated extract did not infect any of the 10 eggs with 1 cm 3 inoculated. The undiluted extract is toxic to the eggs, but when the virus is separated by adsorption on guinea pig red blood cells and eluted in 0985% sodium chloride solution, it is found that it does not infect any egg out of 10 inoculated with 1 cm3. When the untreated extracts and the extracts treated with acetylethyleneimine are tested in parallel by the usual method (Salk-type test), it is found that they possess the same agglutination capacities of guinea-pig red blood cells (the titers of hemagglutinin are 103-0 and 102995 hemagglutinin units per cm3,
respectively which does not constitute a significant difference with the process employed). When tested against the same sample of human convalescent serum which contains antibodies to the soluble influenza antigen type A9, the untreated extracts and the extracts treated with acetylethyleneimine were still found to contain quantities which could not be distinguished from soluble angigen ;, the measurement being made by complementary binding (103.05 and 103.2 units of soluble antigen per cm3, respectively).
In the diagnosis of influenza infection in humans, serum antibodies are measured in terms of their combined potency with he-magglutinin or with soluble influenza virus antigans. The non-infectious preparations of influenza virus treated with acetylethylenimine obtained as described above can therefore be used for this purpose.