BE1024284B1 - Compositions immunogenes - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne des compositions immunogènes, particulièrement des compositions vaccinales, pour une utilisation permettant de fournir une protection contre une maladie provoquée suite à une infection bactérienne par des souches de Shigella.

Description

(30) Données de priorité :

16/06/2015 EP 15020097.0 (73) Titulaire(s) :

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA

1330, RIXENSART

Belgique (72) Inventeur(s) :

GERKE Christiane 53100 SIENA Italie

MARTIN Laura Bartle 53100 SIENA Italie

SAULAIIan James 53100 SIENA Italie (54) COMPOSITIONS IMMUNOGENES (57) Cette invention concerne des compositions immunogènes, particulièrement des compositions vaccinales, pour une utilisation permettant de fournir une protection contre une maladie provoquée suite à une infection bactérienne par des souches de Shigella.

0,6-,

Temps apres l’injection (heures)

Figure 1

BREVET D'INVENTION BELGE

SPF Economie, PME, Classes Moyennes & Energie

Numéro de publication : 1024284 Numéro de dépôt : BE2016/5444

Office de la Propriété intellectuelle Classification Internationale : A61K 39/112 A61K 39/00 Date de délivrance : 15/01/2018

Le Ministre de l'Economie,

Vu la Convention de Paris du 20 mars 1883 pour la Protection de la propriété industrielle ;

Vu la loi du 28 mars 1984 sur les brevets d'invention, l'article 22, pour les demandes de brevet introduites avant le 22 septembre 2014 ;

Vu le Titre 1er “Brevets d’invention” du Livre XI du Code de droit économique, l'article XI.24, pour les demandes de brevet introduites à partir du 22 septembre 2014 ;

Vu l'arrêté royal du 2 décembre 1986 relatif à la demande, à la délivrance et au maintien en vigueur des brevets d'invention, l'article 28 ;

Vu la demande de brevet d'invention reçue par l'Office de la Propriété intellectuelle en date du 15/06/2016.

Considérant que pour les demandes de brevet tombant dans le champ d'application du Titre 1er, du Livre XI du Code de Droit économique (ci-après CDE), conformément à l'article XI. 19, §4, alinéa 2, du CDE, si la demande de brevet a fait l’objet d’un rapport de recherche mentionnant un défaut d’unité d’invention au sens du §ler de l'article XI.19 précité et dans le cas où le demandeur n'effectue ni une limitation de sa demande ni un dépôt d’une demande divisionnaire conformément aux résultats du rapport de recherche, le brevet délivré sera limité aux revendications pour lesquelles le rapport de recherche a été établi.

Arrête :

Article premier. - II est délivré à

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA, Rue de l'Institut 89, 1330 RIXENSART Belgique;

représenté par

PRONOVEM - Office Van Malderen, Avenue Josse Goffin 158, 1082, BRUXELLES;

un brevet d'invention belge d'une durée de 20 ans, sous réserve du paiement des taxes annuelles visées à l’article XI.48, §1 du Code de droit économique, pour : COMPOSITIONS IMMUNOGENES.

INVENTEUR(S) :

GERKE Christiane, c/o GSK Vaccines Institute for Global Health S.r.l., Via Fiorentina 1, 53100, SIENA;

MARTIN Laura Bartle, c/o GSK Vaccines Institute for Global Health S.r.l., Via Fiorentina 1, 53100, SIENA;

SAUL Allan James, c/o GSK Vaccines Institute for Global Health S.r.l., Via Fiorentina 1, 53100, SIENA;

PRIORITE(S) :

16/06/2015 EP 15020097.0;

DIVISION :

divisé de la demande de base : date de dépôt de la demande de base :

Article 2. - Ce brevet est délivré sans examen préalable de la brevetabilité de l'invention, sans garantie du mérite de l'invention ou de l'exactitude de la description de celle-ci et aux risques et périls du (des) demandeur(s).

Bruxelles, le 15/01/2018, Par délégation spéciale :

BE2016/5444

COMPOSITIONS IMMUNOGENES compositions compositions

Domaine technique

Cette invention concerne des immunogènes, particulièrement des vaccinales, pour une utilisation dans la fourniture d'une protection contre une maladie provoquée par une infection bactérienne avec des souches de Shigella.

Contexte de l'invention

La shigellose représente un problème sanitaire global majeur, responsable de plus de 7 millions d'années de vie corrigée de 1'incapacité et de 100 000 décès par an, spécialement chez les enfants de moins de 5 ans dans les pays en développement [1,2,3]. La shigellose est provoquée par des bactéries Gram négatif du genre Shigella, qui se divise en 4 espèces différenciées en outre en 50 sérotypes basés sur la structure et la composition de l'antigène polysaccharidique externe (antigène O, AgO) du lipopolysaccharide (LPS) : S. sonnei (1 sérotype),

S. flexneri (15 sérotypes), S. boydii (19 sérotypes) et

S. dysenteriae (15 sérotypes) [4]. Un nombre limité de

BE2016/5444 sérotypes contribuent à la charge globale de la maladie et ceux-ci varient entre les régions et dans le temps [4,5,6,7]. Shigella sonnei et Shigella flexneri 2a sont les sérotypes actuellement dominants dans le monde [4,6] .

Le signe distinctif d'une shigellose clinique est une rectocolite aiguë associée à de la fièvre, des nausées, une anorexie, une déshydratation, des diarrhées mucopurulentes et sanguinolentes, et un ténesme. La dysenterie provoquée par une Shigella est endémique et provoque des millions d'épisodes pathologiques dans les pays en développement. Par exemple, il est estimé y avoir 125 millions de cas de diarrhée due à Shigella par an, dont 99 % surviennent dans des pays en développement et 69 % chez des enfants de moins de cinq ans. La morbidité et la mortalité dues à la shigellose sont spécialement élevées parmi les enfants dans les pays en développement.

Les approches existantes de vaccins contre Shigella (décrits dans [8]) ont été basées sur des souches vivantes atténuées pour une immunisation orale, des saccharides O conjugués pour une injection, des protéosomes (vésicules de la membrane externe du méningocoque avec le LPS de Shigella fixé) pour une utilisation intranasale, des invaplex (extraits subcellulaires de Shigella comprenant l'IpaB, 1'IpaC et le LPS) pour une utilisation intranasale, et des complexes protéines nucléaires-ribosomes préparés à partir de souches AmsbB avec un LPS détoxifié. Bien que deux de ces vaccins aient été efficaces dans des essais

BE2016/5444 sur le terrain, aucun ne protège contre de multiples sérotypes de Shigella.

Le vaccin candidat récent le plus performant, un conjugué de l'AgO de S. sonne! parentale, a démontré 74 % de protection contre une infection par S. sonnei homologue chez des jeunes adultes après une immunisation [9] et 71 % d'efficacité chez des enfants âgés de plus de 3 ans après deux immunisations [10]. Au contraire, le vaccin a affiché une faible immunogénicité et un manque de protection chez les enfants de moins de 3 ans [10] . Le taux de protection est en parallèle avec le taux de réponse en anticorps spécifiques du vaccin à base de l'AgO, mesuré en réponse en anticorps contre le LPS de S. sonnei avec l'AgO homologue (réponse anti-LPS) [10].

Ainsi, un objet de l'invention est de fournir des compositions immunogènes améliorées, particulièrement des compositions vaccinales qui peuvent être utilisées pour protéger contre des sérotypes multiples de Shigella. Plus particulièrement, un objet est de fournir des compositions vaccinales qui produisent des réponses plus fortes contre l'AgO, spécialement chez les jeunes enfants.

Brève description de l'invention

Dans un premier aspect, l'invention fournit une composition immunogène comprenant des modules généralisés pour les antigènes membranaires (GMMA) purifiés à partir de Shigella sonnei et Shigella flexneri. Particulièrement, les GMMA comprennent un lipide A modifié. Particulièrement, le lipide A modifié

BE2016/5444 est une forme moins toxique ou détoxifiée du lipide A, à titre d'exemple non limitatif, un lipide A pentaacylé, un lipide A hexa-acylé n'existant pas à l'état naturel dans lequel l'un des groupes acyle est substitué et/ou un lipide A hexa-acylé dans lequel la chaîne lauroyle est remplacée par une chaîne palmitoléoyle. Encore plus particulièrement, au moins 75 % des GMMA de Shigella sonnei ont un diamètre situé dans la plage de 25 nm à 40 nm, déterminé par microscopie électronique. Les GMMA de Shigella sonnei peuvent avoir un rayon moyen situé dans la plage de 32 nm à 38 nm (déterminé par HPLC-SEC MALLS) et les GMMA de S. flexneri peuvent avoir un rayon moyen (HPLCSEC MALLS) situé entre 21 nm et 28 nm. Dans un mode de réalisation, les GMMA de Shigella flexneri sont purifiés à partir d'au moins une souche choisie dans le groupe constitué de 2a, 3a et 6. Particulièrement, la composition immunogène comprend des GMMA de Shigella flexneri purifiés à partir de chacune des souches 2a, 3a et 6. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend des GMMA purifiés à partir de (a) Shigella sonnei, (b) Shigella flexneri 2a, (c) Shigella flexneri 3a et (d) Shigella flexneri 6. Particulièrement, les GMMA sont présents dans un rapport de l/l/l/l. Encore plus particulièrement, la composition immunogène comprend des protéines GMMA à une concentration inférieure à 100 pg/ml. Particulièrement, la composition immunogène comprend des GMMA de Shigella flexneri purifiés à partir de chacune des souches 2a, 3a et 6 et des GMMA purifiés à partir d'au moins une autre souche de Shigella flexneri

BE2016/5444 choisie dans le groupe constitué des souches lb et 2b. Particulièrement, la composition immunogène comprend des GMMA purifiés à partir de (a) Shigella sonnei AtolR, AhtrB, virG::nadAB, (b) Shigella flexneri 2a AtolR, AmsbB, (c) Shigella flexneri 3a AtolR, AmsbB et (d) Shigella flexneri 6 AtolR, AmsbB ou AhtrB. Encore plus particulièrement, la ou les souches de Shigella flexneri sont dépourvues du plasmide de virulence. La composition peut également contenir des GMMA d'autres souches de S. flexneri.

Particulièrement, la composition immunogène comprend un adjuvant. Encore plus particulièrement, l'adjuvant est un adsorbant. Encore même plus particulièrement, l'adjuvant est un adsorbant qui n'amplifie pas l'immunogénicité des GMMA, par exemple, comme il est mesuré par la réponse en anticorps antiLPS. Les adjuvants particuliers comprennent, par exemple, des adjuvants d'aluminium y compris 1'hydroxyde d'aluminium, ALHYDROGEL®, le phosphate d'aluminium, le sulfate de potassium et d'aluminium et 1'alun.

Dans un deuxième aspect, l'invention fournit un procédé d'immunisation d'un patient contre une infection par Shigella comprenant l'étape d'administration au patient d'une composition immunogène du premier aspect de l'invention.

Dans un troisième aspect, l'invention fournit une composition du premier aspect de l'invention pour une utilisation dans un procédé d'immunisation d'un patient contre une infection par Shigella.

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Brève description des figures

Figure 1 : Augmentation de la température moyenne (moyenne de la température après vaccination - avant vaccination) chez des lapins après une injection IM d'une dose contenant 100 pg de protéines de 17 90GAHB (cercles) ou d'un volume équivalent de sérum physiologique (losanges). Les barres verticales montrent l'écart-type de la moyenne. N = 12 pour

90GAHB et 6 pour les lapins auxquels il est injecté du sérum physiologique.

Figure 2(A) : Taux d'anticorps anti-LPS de

S. sonnei (taux médians après vaccination) produits après la dose d'immunisation 1, 2 et 3 dans un essai clinique avec des sujets humains.

Figure 2(B) : Taux d'anticorps anti-LPS de

S. sonnei (taux médians après vaccination) sur l'étude entière y compris un suivi de 6 mois après l'immunisation 3 dans un essai clinique avec des sujets humains.

Figure 3 - Diagrammes en boîte montrant la distribution des anticorps dans les groupes immunisés avec des 1790GAHB, S. flexneri-2a, S. flexneri-3a et une combinaison tétravalente estimée par un test ELISA utilisant du LPS purifié provenant de (A) S. sonnei, (B) S. flexneri 3a, et (C) S. flexneri 2a en tant qu'antigène de sensibilisation. Sur (A) et (B), les unités ELISA sont tracées, sur (C) , les DO ELISA sont présentées. Le 25ème au 75ème percentile est représenté sous la forme de rectangle, les valeurs minimales et maximales sous la forme de moustaches et la médiane sous la forme de la barre horizontale dans le rectangle.

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Les limites de détection dans les tests ont été de 2,2 (A) et 1,6 (B) unités ELISA. Aux résultats sous la limite de détection, il a été attribué la valeur de la moitié de la limite de détection (1,1 sur A, 0,8 sur B). La DO moyenne du bruit de fond dans les tests représentés sur (C) a été de 0.056.

Figure 4 : Diagrammes de dispersion montrant les résultats individuels transformés en log des anticorps anti-AgO de S. sonnei (A) , anti-S. flexneri 3a (B) ou les résultats de DO ELISA de la distribution des anticorps anti-S. flexneri 2a (C) dans chaque groupe contre les dosages transformés en log. Les courbes dose-réponse parallèles des formulations simples et de la formulation tétravalente sont présentées.

(A) Courbes	dose-réponse	pour	les 1790GAHB	et	la
combinaison	tétravalente	sur le	LPS de S. sonnei.	(B)
Courbes dose-réponse pour S.	flexneri 3a	et	la
combinaison	tétravalente	sur le	LPS de S. flexneri	3a.
(C) Courbes	dose-réponse	pour	S. flexneri 2a	et	la
combinaison	tétravalente	sur le	LPS de S. flexneri	2a.

Les points d'intersection avec l'axe Y des courbes ne sont pas significativement différents, P = 0,31 (A), P = 0,74 (B), P = 0,75 (C).

Description détaillée de l'invention

Les modules généralisés pour les antigènes membranaires ou GMMA sont des particules dérivées de la membrane externe de bactéries Gram négatif qui présentent des taux élevés de LPS, de lipoprotéines, de protéines et d'autres antigènes qui activent la réponse immunitaire innée. Les GMMA sont produits à partir de

BE2016/5444 les antigènes exemple, les souches bactériennes génétiquement modifiées qui sont mutées pour amplifier la production des vésicules et pour éliminer ou modifier des antigènes (par exemple, le lipide A). La production spontanée amplifiée des vésicules peut être obtenue, par exemple, par une délétion ciblée de protéines impliquées dans le maintien de l'intégrité de la membrane (voir cidessous) . La surface externe des GMMA correspond à la surface externe de la bactérie à partir de laquelle ils sont dérivés, préservant tous membranaires (y compris, par lipopolysaccharides, les lipooligosaccharides, les lipoprotéines, les protéines) dans le contexte de la membrane. Les GMMA (à la différence des OMV extraites par un détergent) conservent ces composants de la membrane externe dans leur conformation native et orientation correcte, préservant mieux l'immunogénicité contre la souche bactérienne à partir de laquelle ils sont dérivés. Ainsi, les GMMA sont hautement immunogènes et cette forte activation de l'immunité innée peut mener à des réactions inacceptables chez des sujets humains, par exemple, une réponse fébrile ou, dans des cas extrêmes, un choc septique spécialement s'ils sont administrés par voie parentérale.

L'invention est basée sur la découverte que la manipulation génétique peut être utilisée pour fournir des souches bactériennes de Shigella qui produisent des GMMA qui sont immunogènes, même à des doses faibles, avec un risque réduit, par exemple, de pyrogénicité. Les inventeurs ont également découvert que l'utilisation d'un adjuvant d'aluminium est avantageuse

BE2016/5444 dans l'augmentation de la tolérance in vivo des compositions immunogènes comprenant des GMMA, réduisant en outre le risque, par exemple, de pyrogénicité. Comme résultat, des doses de GMMA purifiés à partir de multiples souches bactériennes de Shigella peuvent être combinées pour préparer une composition immunogène multivalente présentant une concentration en protéines totales de GMMA par dose allant jusqu'à 100 pg/ml ou supérieure. Cette découverte est surprenante parce que, dans la littérature, les études ont généralement cherché à réduire la teneur en OMV pour éviter la fièvre qui pourrait compromettre l'acceptabilité des vaccins contenant des OMV dérivées par un détergent dans les calendriers de vaccination des nourrissons. Par exemple, dans des études du vaccin 4CMenB, Bexsero, il a été observé qu'approximativement la moitié des sujets expérimentent une température >38,5 °C après vaccination avec la première dose [11] . Au contraire, les données d'essais cliniques fournies dans les exemples ici démontrent que la vaccination avec une composition immunogène comprenant 100 pg/ml de GMMA de

S. sonnei (quatre fois la teneur équivalente en OMV dans 4CMenB) a été bien tolérée. Les données chez les êtres humains sont supportées par des résultats d'immunogénicité produits chez des souris et des lapins.

La bactérie Shigella

L'invention est basée sur l'utilisation de bactéries Shigella choisies parmi un ou plusieurs des sérogroupes S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et

S. sonnei. Particulièrement, l'invention est basée sur l'utilisation d'au moins deux souches de Shigella

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S.

S.

choisies parmi les sérogroupes S. flexneri et S. sonnei, choisis particulièrement dans le groupe constitué de

S. sonnei, S. flexneri 2a, S. flexneri 3a et flexneri 6. Dans certains modes de réalisation, sonnei 53G, S. flexneri lb STANSFIELD, S. flexneri

2a 2457T, S. flexneri 2b 69/50, S. flexneri 3a 6885 et/ou S. flexneri 6 10.8537 peuvent être utilisées.

Particulièrement, les souches de Shigella pour une utilisation dans l'invention sont des souches AtolR présentant un système Tol-Pal perturbé qui pousse la bactérie à libérer des quantités supérieures de GMMA dans le milieu de culture durant la réplication bactérienne. La délétion d'autres gènes dans le complexe Tol-Pal (par exemple, TolA) pourrait être également envisagée, par exemple, comme il est divulgué dans le document WO 2011/036564.

Les souches de Shigella pour une utilisation dans l'invention comprennent un ou plusieurs autres changements par rapport à une souche de type sauvage. Particulièrement, les souches pour une utilisation avec l'invention comprennent une ou plusieurs mutations produisant une inactivation de htrB, msbBl et/ou msbB2. A titre d'exemple non limitatif, des mutations appropriées peuvent être choisies dans le groupe constitué de AhtrB, AmsbBl et AmsbB2. Pour des raisons de simplicité, les délétions doubles à la fois de msbBl et de msbB2 peuvent être également appelées ADmsbB. L'inactivation de htrB ou de msbBl et de msbB2 réduit l'acylation dans le lipide A. Dans certains modes de réalisation, aux souches pour une utilisation avec l'invention, il manque l'antigène O dans le LPS,

BE2016/5444 évitant de cette façon des réponses spécifiques du sérotype. Dans S. sonnei, l'antigène O est absent lorsque le plasmide de virulence est éliminé. Dans d'autres modes de réalisation, les souches pour une utilisation avec l'invention produisent du LPS comprenant l'antigène O. La présence de l'antigène O peut être bénéfique puisque que les compositions immunogènes déclencheront des réponses immunitaires croisées à la fois spécifiques du sérotype et supplémentaires. L'absence de lipide A hexa-acylé dans le LPS est préférée. La perte du plasmide de virulence mène à la perte du gène msbB2, et le gène chromosomique msbBl peut être inactivé, éliminant de cette façon l'activité myristoyl-transférase et fournissant un lipide A penta-acylé dans le LPS. Pour les mutants msbB de S. flexneri, l'absence du plasmide de virulence qui contient le gène msb2, est préférée. Les souches préférées de Shigella pour une utilisation dans l'invention comportent un LPS penta-acylé. En variante, l'inactivation de htrB entraîne la perte de la chaîne lauroyle et produit ainsi un LPS penta-acylé dans certaines souches et/ou formes de lipide A qui sont moins toxiques que le lipide A de type sauvage. Par exemple, dans S. flexneri, l'inactivation de htrB peut être compensée par l'activité d'une autre enzyme, LpxP qui produit un lipide A hexa-acylé, dans lequel la chaîne lauroyle est remplacée par une chaîne palmitoléoyie. Le lipide A hexa-acylé comprenant des chaînes palmitoléoyie est moins toxique que le lipide A de type sauvage. Ainsi, dans certains modes de réalisation, l'invention fournit une composition

BE2016/5444 immunogène comprenant des GMMA purifiés à partir de Shigella sonnei et Shigella flexneri dans laquelle les GMMA comprennent un lipide A penta-acylé et/ou un lipide A hexa-acylé dans lequel la chaîne lauroyle est remplacée par une chaîne palmitoléoyle. Particulièrement, les souches appropriées pour une utilisation dans l'invention comprennent les mutations suivantes (a) Shigella sonnei : AtolR, AhtrB, virG::nadAB, (b) Shigella flexneri 2a : AtolR, AmsbB, (c) Shigella flexneri 3a : AtolR, AmsbB et (d) Shigella flexneri 6 : AtolR, AmsbB ou AhtrB. Des souches appropriées sont divulguées dans les exemples. D'autres souches appropriées sont connues dans l'art, par exemple dans le document WO 2011/036564. Les conditions de culture pour développer Shigella sont bien connues dans l'art, par exemple, voir les références [12] à [14]. Par exemple, elles peuvent être développées en utilisant une source d'azote organique (comme des mélanges d'acides aminés, par exemple, contenant Ala, Arg, Asn, Asp ; des casamino-acides peuvent être utilisés), du glycérol en tant que source de carbone, etc. L'inclusion d'acide L-aspartique dans le milieu est particulièrement utile et peut fonctionner comme source à la fois d'azote et de carbone.

Pour S. sonnei, les gènes des antigènes O sont sur le plasmide de virulence et un composant AgO est souhaitable pour les GMMA purifiés ou isolés à partir de celle-ci. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la souche S. sonnei est mutée pour remplacer virG par nadA et nadB provenant d'E. coli, éliminant de cette façon 1'auxotrophie pour l'acide nicotinique de

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Shigella tout en conservant le plasmide de virulence ; la production de l'AgO codé par le plasmide est assurée par la croissance dans un milieu sans acide nicotinique. Un exemple de souche mutante de S. sonnei peut comprendre les modifications suivantes : AtolR::kan AvirG: :nadAB AhtrB::cat.

Les exemples de souches mutantes de S. flexneri peuvent comprendre les modifications suivantes : AtolR::kan AhtrB:: cat ou AtolR::kan AmsbBl::cat. Seule la mutation de msbBl est introduite dans la souche dépourvue du plasmide parce que l'élimination du plasmide élimine la seconde copie de msbB (msbB2).

Modules généralisés pour les antigènes membranaires (GMMA)

Les bactéries Shigella utilisées dans l'invention sont, par rapport à leurs souches de type sauvage correspondantes, hyperbourgeonnantes, c'est-à-dire qu'elles libèrent dans leur milieu de culture des quantités plus importantes de GMMA que la souche de type sauvage. Ces GMMA sont utiles en tant que composants des vaccins contre Shigella de l'invention. Le terme GMMA est utilisé pour fournir une distinction nette des vésicules de la membrane externe extraites par un détergent traditionnelles (dOMV), et des vésicules de la membrane externe natives (NOMV), qui sont libérées spontanément à partir des bactéries Gram négatif. Les GMMA diffèrent dans deux aspects cruciaux des NOMV. En premier, pour induire la formation de GMMA, la structure de la membrane a été modifiée par la délétion des gènes codant pour les composants structuraux clés, spécifiquement tolR. En second, comme

BE2016/5444 conséquence de la modification génétique, des grandes quantités de la membrane externe bourgeonnent (le nom italien pour bourgeon est « gemma ») pour fournir une source pratique de matériaux membranaires pour la production de vaccins, menant à une plus grande facilité de fabrication et à une réduction potentielle des coûts. Alors que des NOMV ont été utilisées pour des études d'immunogénicité, les rendements sont trop faibles pour des vaccins pratiques.

Les GMMA de S. sonnei utilisés dans l'invention ont généralement un diamètre de 25 nm à 140 nm par microscopie électronique, par exemple de 25 nm à 40 nm. Les GMMA peuvent également présenter une distribution bimodale des tailles. Par exemple, la majorité des GMMA ayant une taille moyenne de 25 nm à 40 nm en diamètre (par ME) et une fraction des particules ayant une taille moyenne de 65 nm à 140 nm. Particulièrement, au moins 70 %, au moins 71 %, au moins 72 %, au moins 73 %,

au	moins	74 %,	au moins 75 %,	au moins 80	%, au moins
85	%, au	moins	90 % des GMMA	auront un	diamètre de
25	nm à 14 0 nm.
	Les	GMMA	sont libérés	spontanément	durant la

croissance bactérienne et peuvent être purifiés à partir du milieu de culture. La purification implique idéalement la séparation des GMMA des bactéries Shigella vivantes et/ou intactes, par exemple, par une filtration basée sur la taille en utilisant un filtre, comme un filtre de 0,2 pm, qui permet aux GMMA de passer à travers mais qui ne permet pas aux bactéries intactes de passer à travers, ou en utilisant une centrifugation à faible vitesse pour obtenir un culot

BE2016/5444 cellulaire tout en laissant les GMMA en suspension. Des procédés de purification appropriés sont connus dans l'art. Un procédé de purification par filtration en deux étapes préféré est décrit dans le document WO 2011/036562 incorporé ici en référence. Particulièrement, le procédé de filtration en deux étapes est utilisé pour séparer les GMMA de la biomasse de la culture cellulaire sans utiliser de centrifugation.

Les compositions contenant des GMMA de l'invention seront généralement sensiblement dépourvues de bactéries entières, qu'elles soient vivantes ou mortes. La taille des GMMA signifie qu'ils peuvent être facilement séparés des bactéries entières par filtration, par exemple, comme il est généralement utilisé pour une stérilisation par filtration. Bien que les GMMA passent à travers des filtres standard de 0,22 pm, ceux-ci peuvent être rapidement obstrués par d'autres matériaux, et ainsi il peut être utile d'effectuer des étapes séquentielles de stérilisation par filtration à travers une série de filtres de taille de pore décroissante avant d'utiliser un filtre de 0,22 pm. Les exemples de filtres précédents seront ceux avec une taille de pore de 0,8 pm, 0,45 pm, etc. Les GMMA sont libérés spontanément à partir des bactéries et la séparation à partir du milieu de culture, par exemple, en utilisant une filtration, est pratique. Les vésicules de la membrane externe formées par des procédés qui impliquent une perturbation délibérée de la membrane externe (par exemple, par traitement avec un détergent, comme une extraction avec du

BE2016/5444 désoxycholate, ou une sonication) pour provoquer la formation de vésicules de la membrane externe sont exclues de l'étendue de l'invention. Les GMMA utilisés dans l'invention sont sensiblement dépourvus d'une contamination de la membrane interne et cytoplasmique et ils contiennent des lipides et des protéines.

Compositions immunogènes

Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre des GMMA purifiés à partir d'au moins deux, trois, quatre, cinq ou six souches différentes de Shigella. Particulièrement, les compositions immunogènes comprennent des GMMA purifiés à partir de Shigella sonnei et Shigella flexneri. Les GMMA de Shigella flexneri peuvent être purifiés à partir d'au moins une souche choisie dans le groupe constitué de 2a, 3a et 6. Particulièrement, la composition immunogène comprend des GMMA de Shigella flexneri purifiés à partir de chacune des souches 2a, 3a et 6. La composition immunogène peut comprendre en outre des GMMA de Shigella flexneri purifiés à partir d'au moins une souche choisie dans le groupe constitué de lb et 2b. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend des GMMA purifiés à partir de (a) Shigella sonnei, (b) Shigella flexneri 2a, (c) Shigella flexneri 3a et (d) Shigella flexneri 6. Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène comprend des GMMA purifiés à partir de Shigella sonnei 53G, Shigella flexneri 2a 2457T, Shigella flexneri 3a 6885 et Shigella flexneri 6

10.8537 et éventuellement Shigella flexneri lb STANSFIELD et/ou Shigella flexneri 2b 69/50.

BE2016/5444

Où au moins deux types différents de GMMA sont utilisés, ils peuvent être présents dans un rapport de

1/1, 1/2, 1/3, 1/4, 2/1, 3/1 ou 4/1, de préférence environ 1/1. Particulièrement, au moins deux des quatre GMMA différents dans la composition immunogène sont présents dans un rapport de 1/4 à 4/1. Où des GMMA provenant d'au moins quatre sérotypes différents sont utilisés, ils peuvent être présents dans un rapport choisi parmi les options fournies dans le tableau ci10 dessous, par exemple, un rapport de l/l/l/l (option de rapport 1). Lorsqu'il est fait référence à de tels rapports, il est évident qu'il sera généralement difficile de formuler une composition immunogène présentant le rapport exact et qu'une certaine variabilité existera.

S. sonnei (Ss), S.	flexneri 2a (2a), S. flexneri 3a	(3a) et
		S. flexneri 6 (6)
Option de	Ss / 2a /	Option de	Ss / 2a /	Option de	Ss / 2a /
rapport	3a / 6	rapport	3a / 6	rapport	3a / 6
1	l/l/l/l	23	1/4/2/2	45	2/4/2/1
2	1/1/1/2	24	1/4/2/4	46	2/4/4/1
3	1/1/1/4	25	1/4/4/1	47	4/1/1/1
4	1/1/2/1	26	1/4/4/2	48	4/1/1/2
5	1/1/2/2	27	1/4/4/4	49	4/1/1/4
6	1/1/2/4	28	2/1/1/1	50	4/1/2/1
7	1/1/4/1	29	2/1/1/2	51	4/1/2/2
8	1/1/4/2	30	2/1/1/4	52	4/1/2/4
9	1/1/4/4	31	2/1/2/1	53	4/1/4/1
10	1/2/1/1	32	2/1/2/2	54	4/1/4/2
11	1/2/1/2	33	2/1/2/4	55	4/1/4/4
12	1/2/1/4	34	2/1/4/1	56	4/2/1/1
13	1/2/2/1	35	2/1/4/2	57	4/2/1/2
14	1/2/2/2	36	2/1/4/4	58	4/2/1/4

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15	1/2/2/4	37	2/2/1/1	59	4/2/2/1
16	1/2/4/1	38	2/2/1/2	60	4/2/4/1
17	1/2/4/2	39	2/2/1/4	61	4/4/1/1
18	1/2/4/4	40	2/2/2/1	62	4/4/1/2
19	1/4/1/1	41	2/2/4/1	63	4/4/1/4
20	1/4/1/2	42	2/4/1/1	64	4/4/2/1
21	1/4/1/4	43	2/4/1/2	65	4/4/4/1
22	1/4/2/1	44	2/4/1/4

Les compositions immunogènes peuvent comprendre toute quantité appropriée de GMMA par dose unitaire. Le terme « dose unitaire » se rapporte à une quantité de principe actif pharmaceutique, par exemple une quantité de protéines de GMMA, appropriée pour une administration dans une seule dose, selon les bonnes pratiques médicales. Les quantités de protéines de GMMA peuvent être de 0,1 à 200 pg par dose unitaire, particulièrement 10 pg, 20 pg, 25 pg, 50 pg ou 100 pg. Par dose unitaire, les compositions immunogènes aqueuses de l'invention peuvent comprendre une concentration totale de protéines de GMMA de moins de

200 pg/ml, de moins de	100 pg/ml	ou	inférieure,
80	pg/ml	ou inférieure,	50 pg/ml	ou	inférieure,
25	pg/ml	ou inférieure,	20 pg/ml	ou	inférieure,
15	pg/ml	ou inférieure, 10	pg/ml ou	inférieure. Par

dose unitaire, les compositions immunogènes aqueuses de l'invention peuvent comprendre une concentration totale de protéines de GMMA de 5 pg/ml à 200 pg/ml, de 5 pg/ml à 100 pg/ml, de 10 pg/ml à 100 pg/ml, de 10 pg/ml à 80 pg/ml, de 10 pg/ml à 50 pg/ml, 25 pg/ml à 50 pg/ml. Par dose unitaire, les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre une concentration totale de protéines de GMMA supérieure à 100 pg/ml, supérieure

BE2016/5444 à 80 pg/ml, supérieure à 50 pg/ml, supérieure à 25 pg/ml, supérieure à 20 pg/ml, supérieure à 15 pg/ml ou supérieure à 10 pg/ml. La quantité de GMMA peut être également quantifiée en mesurant le polysaccharide de l'AgO. Par exemple, le rapport du polysaccharide de l'AgO sur les protéines (AgO/protéines, exprimé en termes de p/p) peut se situer dans la plage de 0,06 à

1,1 pg d'AgO/pg de protéines, de 0,65 à 1,1 pg d'AgO/pg de protéines, 0,75 à 1,1 pg d'AgO/pg de protéines ou de 0,85 à 1,0 pg d'AgO/pg de protéines. Particulièrement, pour S. flexneri 2a, le rapport AgO/protéines peut être de 0,85 à 1,0 pg d'AgO/pg de protéines, pour

S. flexneri 3a, le rapport AgO/protéines peut être de 0,75 à 1,1 pg d'AgO/pg de protéines, pour S. sonnei et

S. flexneri 6, le rapport AgO/protéines peut être de 0,06 à 1,0 pg d'AgO/pg de protéines, particulièrement environ 0,06 pg d'AgO/pg de protéines. Ainsi, en se basant sur un rapport AgO/protéines de 0,75 pg d'AgO/pg de protéines, des quantités particulières de GMMA par dose unitaire peuvent se situer comme ci-dessus dans la plage de 150 à 200 pg/ml et en se basant sur un rapport AgO/protéines de 0,8 à 1,0 pg d'AgO/pg de protéines, des quantités particulières de GMMA par dose unitaire peuvent être comme ci-dessus particulièrement dans la plage de 160 à 200 pg/ml.

Les protéines de GMMA provenant de chaque sérotype différent peuvent être présentes dans une quantité de 0,1 à 200 pg, par exemple de 0,1 à 80 pg, 0,1 à 100 pg et en particulier de 5 à 25 pg. Les quantités appropriées de GMMA provenant de chaque sérotype différents peuvent comprendre 0,1, 1, 5, 10, 20, 25, 30,

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35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 et 100 pg par dose unitaire. Les compositions immunogènes de l'invention comprennent des GMMA purifiés ou isolés à partir de plus d'une souche de Shigella et il est typique que les GMMA soient préparés avant le mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, tels que des tampons. Les GMMA provenant de chaque souche peuvent être formulés individuellement avec un adjuvant, tels que ALHYDROGEL®, avant la combinaison avec des GMMA purifiés ou isolés à partir d'une autre souche et le mélange avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. En variante, les GMMA provenant de chaque souche peuvent être purifiés/isolés, combinés avec des GMMA purifiés ou isolés à partir de l'autre ou des autres souches, formulés avec un adjuvant et ensuite mélangés avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. D'autres procédés seront évidents pour l'homme du métier.

Les termes « purifié » et « isolé » sont généralement pris comme ayant la signification de l'art. De préférence, les GMMA purifiés ou isolés sont des préparations dépourvues de cellules, de façon encore davantage préférée les GMMA présentent des taux faibles de contamination par des protéines cytoplasmiques, par exemple, moins de 10 %, moins de 9 %, moins de 8 %, moins de 7 %, moins de 6 %, moins de 5 % ou moins de 4 %. Par exemple, mesurée en utilisant une spectrométrie de masse de haute sensibilité avec un indice de quantification absolue basé sur l'intensité (iBAQ) sans marqueur comparativement à des compositions de cellules solubilisées des souches productrices de

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GMMA, pratiquement la totalité de la teneur en protéines dans les GMMA est dérivée de protéines localisées dans la membrane externe ou périplasmiques, particulièrement plus de 90 %, encore plus particulièrement plus de 95 %, plus de 96 %, plus de 97 %, plus de 98 % ou plus de 99 %. Ainsi, plus de 95 % de la teneur en protéines dans les GMMA comprend des protéines localisées dans la membrane externe ou périplasmiques. Particulièrement, les GMMA purifiés/isolés comprennent un enrichissement d'approximativement 10 fois des protéines à la fois périplasmiques et de la membrane externe dans les GMMA comparativement aux protéines cellulaires totales des souches productrices de GMMA.

En bref, les compositions immunogènes de l'invention peuvent être administrées en doses uniques ou multiples. Une dose unique des compositions immunogènes de l'invention peut être efficace. En variante, une dose unitaire suivie d'une seconde dose unitaire peut être efficace. Généralement, la deuxième (ou troisième, quatrième, cinquième etc.) dose unitaire est identique à la première dose unitaire. La seconde dose unitaire peut être administrée à tout moment approprié après la première dose unitaire, en particulier après 1, 2 ou 3 mois. Généralement, les compositions immunogènes de l'invention seront administrées par voie intramusculaire, par exemple, par administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras comme il est décrit ci-dessous mais elles peuvent être également administrées par voie intradermique ou intranasale.

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Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. Les adjuvants particuliers comprennent des adjuvants d'aluminium, par exemple, 1'hydroxyde d'aluminium, ALHYDROGEL®, le phosphate d'aluminium, le sulfate de potassium et d'aluminium et l'alun. L'utilisation d'adjuvants d'aluminium est avantageuse puisque 1'adsorption des GMMA sur l'adjuvant réduit la réponse pyrogène permettant d'administrer, chez les lapins, des doses 100 fois supérieures de GMMA comparativement aux GMMA seuls. L'utilisation d'autres adjuvants qui réduisent également la réponse pyrogène est également envisagée et pourra être identifiée par l'homme du métier en utilisant les tests exemplifiés ci-dessous. Alors que le terme « adjuvant » se rapporte généralement à toute substance qui augmente la réponse immunitaire envers un antigène, dans le cas présent, et sans souhaiter être lié par des hypothèses, l'adjuvant, tel que ALHYDROGEL®, est également un adsorbant réduisant la réponse immunitaire envers les GMMA. Ainsi, le terme « adsorbant » se rapporte à un substrat solide ou à un matériau auquel les GMMA peuvent se lier, se fixer ou s'adsorber (par exemple, par des interactions de Van der Waals ou des liaisons hydrogène) de telle façon que la réponse pyrogène aux GMMA est réduite comparativement aux GMMA qui ne sont pas ainsi liés, fixés ou adsorbés. A titre d'exemple non limitatif, l'immunogénicité des GMMA peut être mesurée en comparant la réponse en anticorps anti-LPS.

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Procédés et utilisations pharmaceutiques

Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre en outre un support pharmaceutiquement acceptable. Les « supports pharmaceutiquement acceptables » types comprennent tout support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement de grosses macromolécules métabolisées lentement telles que des protéines, des polysaccharides, des polyacides lactiques, des polyacides glycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose, et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes). De tels supports sont bien connus d'une personne ayant des compétences moyennes dans le domaine Les compositions immunogènes de l'invention peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou des émulsifiants, des substances tampons du pH, et analogues, peuvent être présentes. Le sérum physiologique tamponné par du Tris apyrogène stérile est un support préféré particulièrement lors de l'utilisation d'adjuvants d'aluminium parce que le phosphate dans la solution tampon phosphate peut interférer avec la liaison des GMMA à l'aluminium.

Les compositions peuvent être préparées sous la forme d'injectables, sous la forme soit de solutions soit de suspensions liquides. Des formes solides appropriées pour une solution dans, ou une suspension

BE2016/5444 dans, des véhicules liquides avant injection peuvent être également préparées (par exemple, une composition lyophilisée ou une composition cryodesséchée par pulvérisation). La composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple, sous la forme d'une pommade, d'une crème ou d'une poudre. La composition peut être préparée pour une administration orale, par exemple, sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, sous la forme d'une pulvérisation, ou sous la forme d'un sirop (éventuellement aromatisé). La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de gouttes. La composition peut être sous forme de kit, conçu de telle façon qu'une composition combinée est reconstituée juste avant l'administration à un mammifère. De tels kits peuvent comprendre un ou plusieurs antigènes sous forme liquide et un ou plusieurs antigènes lyophilisés. Les compositions peuvent être présentées dans des flacons, ou elles peuvent être présentées dans des seringues préremplies. Les seringues peuvent être fournies avec ou sans aiguille. Une seringue comprendra une dose unique de la composition, tandis qu'un flacon peut comprendre une dose unique ou des doses multiples.

Les compositions aqueuses de l'invention sont également appropriées pour reconstituer d'autres vaccins à partir d'une forme lyophilisée. Lorsqu'une

BE2016/5444 composition de l'invention doit être utilisée pour une telle reconstitution extemporanée, l'invention fournit un kit, qui peut comprendre deux flacons, ou qui peut comprendre une seringue préremplie et un flacon, avec le contenu de la seringue utilisé pour réactiver le contenu du flacon avant injection.

Les compositions de l'invention peuvent être conditionnées sous une forme de dose unitaire ou sous une forme de doses multiples. Pour les formes de doses multiples, les flacons sont préférés aux seringues préremplies. Les volumes posologiques efficaces peuvent être établis en routine, mais une dose humaine type de la composition a un volume de 0,5 ml, par exemple, pour une injection intramusculaire.

Le pH de la composition est situé de préférence entre 6 et 8, de préférence environ 7. Pour les compositions comprenant des antigènes O acétylés, particulièrement le pH de la composition est inférieur à 7, de préférence environ 6 (pour ralentir la vitesse de désestérification). Un pH stable peut être maintenu par l'utilisation d'un tampon. Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un tampon Tris [Tris(hydroxyméthyl)aminométhane]. Le tampon Tris peut comprendre environ 1 à 20 mM de [Tris (hydroxyméthyl) aminométhane] , par exemple, 1,25 mM, 2,5 mM, 5,0 mM ou 10,0 mM. Pour les compositions comprenant des antigènes O acétylés, particulièrement le tampon n'est pas un tampon Tris. Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un tampon succinate à 5 à 20 mM, par exemple, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 17,5 mM ou 20 mM. Les compositions immunogènes

BE2016/5444 de l'invention peuvent comprendre un tampon histidine à 5 à 20 mM, par exemple, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 17,5 mM ou 20 mM. La composition sera stérile. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques par rapport aux êtres humains.

Ainsi, les compositions de l'invention peuvent être utiles en tant que vaccins. Les vaccins selon l'invention peuvent être soit prophylactiques (c'est-àdire pour prévenir une infection) soit thérapeutiques (c'est-à-dire pour traiter une infection), mais ils seront généralement prophylactiques. Le terme « protégé contre une infection » signifie que le système immunitaire d'un sujet a été sensibilisé (par exemple, par vaccination) pour déclencher une réponse immunitaire et repousser l'infection. Il sera clair pour l'homme du métier qu'un sujet vacciné peut ainsi se retrouver infecté, mais est mieux capable de repousser l'infection qu'un sujet témoin. Le terme « traitement » comprend à la fois un traitement thérapeutique et un traitement prophylactique ou préventif, où l'objet est de prévenir ou d'amoindrir une infection. Par exemple, le traitement peut comprendre une influence directe ou une guérison, une suppression, une inhibition, une prévention, une réduction de la gravité, un retard dans l'installation, une réduction des symptômes associés à, par exemple, une infection ou l'une de leurs combinaisons. « Prévention » peut se rapporter, entre autres, à un retard dans l'installation des symptômes, à une prévention de la rechute d'une maladie, et analogues. Le traitement peut également comprendre une

BE2016/5444 « suppression » ou une « inhibition » d'une infection ou d'une maladie, par exemple, une réduction de la gravité, du nombre, de l'incidence ou de la latence des symptômes, une amélioration des symptômes, une réduction des symptômes secondaires, une réduction des infections secondaires, une prolongation de la survie des patients, ou leurs combinaisons. Les compositions immunogènes utilisées en tant que vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace d'un ou de plusieurs antigènes, ainsi que tous les autres composants, selon les besoins. Par « quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, soit en une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon l'état de santé et la condition physique de l'individu à traiter, de son âge, du groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'estimation par le médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée par des essais de routine.

Les compositions de l'invention peuvent comprendre un antimicrobien, particulièrement lorsqu'elles sont conditionnées dans des formats de doses multiples. Les compositions de l'invention peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, le chlorure de sodium) pour

BE2016/5444 donner la tonicité. Une concentration de 10 ± 2 mg/ml de NaCl est typique. Dans certains modes de réalisation, une concentration de 4 à 10 mg/ml de NaCl peut être utilisée, par exemple, 9,0, 7,0, 6,75 ou 4,5 mg/ml. Les compositions de l'invention comprendront généralement un tampon.

Procédés de traitement

L'invention fournit également un procédé permettant de soulever une réponse immunitaire chez un mammifère, comprenant l'administration d'une composition pharmaceutique de l'invention au mammifère. La réponse immunitaire est de préférence protectrice et elle implique de préférence des anticorps. Le procédé peut soulever une réponse de rappel.

Le mammifère est de préférence un être humain. Lorsque le vaccin est destiné à une utilisation prophylactique, l'être humain peut être un adulte, un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson) ou un adolescent ; lorsque le vaccin est destiné à une utilisation thérapeutique, l'être humain est de préférence un enfant. Un vaccin prévu pour des enfants peut être également administré à des adultes, par exemple, pour estimer l'innocuité, le dosage, l'immunogénicité, etc. Une classe préférée d'êtres humains pour le traitement consiste en les femmes en âge de porter un enfant (par exemple, les adolescentes et plus âgées). Une autre classe préférée consiste en les femmes enceintes.

L'invention fournit également une composition de l'invention pour une utilisation en tant que médicament. Le médicament est de préférence capable de soulever une

BE2016/5444 réponse immunitaire chez un mammifère (c'est-à-dire qu'il s'agit d'une composition immunogène) et il est de façon davantage préférée un vaccin.

L'invention fournit également l'utilisation d'une composition de l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné à soulever une réponse immunitaire chez un mammifère.

Ces utilisations et procédés sont de préférence pour la prévention et/ou le traitement de maladies provoquées par Shigella, par exemple, la shigellose, la dysenterie et les symptômes associés y compris les diarrhées, la fièvre, la douleur abdominale, le ténesme, etc. Ces utilisations et procédés sont de préférence pour la prévention et/ou le traitement de maladies provoquées à la fois par Shigella sonnei et Shigella flexneri.

Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. Une administration directe peut être accomplie par une injection parentérale (par exemple, par voie souscutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par une administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre mucosale. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut être effectuée à l'aide d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut en variante être utilisée. Une dose intramusculaire type est de 0,5 ml. Pour une

BE2016/5444 administration à un être humain, la dose peut être d'environ 100 pg mesurée par les protéines, par exemple, administrées dans une dose de 0,5 ml à une concentration de 200 pg de protéines/ml. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale. Le traitement posologique peut être un calendrier d'une dose unique ou un calendrier de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un calendrier d'immunisation primaire et/ou dans un calendrier d'immunisation de rappel. Un calendrier de doses primaires peut être suivi d'un calendrier de doses de rappel. Le temps approprié entre les doses de sensibilisation (par exemple, entre 4 et 16 semaines), et entre les doses de sensibilisation et de rappel, peut être déterminé en routine.

Généralités

Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou elle peut inclure quelque chose de supplémentaire, par exemple, X + Y.

Le terme « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme « sensiblement » peut être omis de la définition de 1'invention.

Sauf indication contraire, un procédé comprenant une étape de mélange de deux composants ou plus ne nécessite pas un ordre spécifique de mélange. Ainsi,

BE2016/5444 les composants peuvent être mélangés dans n'importe quel ordre. Lorsqu'il y a trois composants, alors deux composants peuvent être combinés l'un avec l'autre, et ensuite la combinaison peut être combinée avec le troisième composant, etc.

Sauf indication contraire, l'identité entre des séquences polypeptidiques est déterminée de préférence par l'algorithme de recherche d'homologie de SmithWaterman tel qu'implémenté dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular), en utilisant une recherche de brèche affine avec des paramètres de pénalité d'ouverture de brèche = 12 et de pénalité d'extension de brèche = 1.

La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire, des procédés traditionnels de chimie, de biochimie, de biologie moléculaire, d'immunologie et de pharmacologie, au sein des compétences de l'art. De telles techniques sont expliquées pleinement dans la littérature.

Dans certaines mises en œuvre, le terme « comprenant » se rapporte à l'inclusion de l'agent actif indiqué, tel que les polypeptides cités ou les GMMA, ainsi qu'à l'inclusion d'autres agents actifs, et de supports, excipients, émollients, stabilisants, etc. pharmaceutiquement acceptables, comme il est connu dans l'industrie pharmaceutique. Dans certaines mises en œuvre, le terme « constitué essentiellement de » se rapporte à une composition, dont le seul principe actif est le ou les principes actifs indiqués, toutefois, d'autres composés peuvent être inclus, lesquels sont destinés à la stabilisation, la conservation, etc. de

BE2016/5444 la formulation, mais ne sont pas impliqués directement dans l'effet thérapeutique du principe actif indiqué. L'utilisation de la phrase de transition « constitué essentiellement » signifie que l'étendue d'une revendication doit être interprétée comme englobant les matériaux spécifiés ou les étapes citées dans la revendication, et ceux/celles qui ne touchent pas matériellement la ou les caractéristiques de base et nouvelles de l'invention revendiquée. Voir, dans Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (souligné dans l'original) ; voir également MPEP § 2111.03. Ainsi, le terme « constitué essentiellement de », lorsqu'il est utilisé dans une revendication de cette invention n'est pas censé être interprété comme un équivalent de « comprenant ». Le terme « constitué de » et ses variations comprennent y compris et limité à, sauf s'il est expressément précisé le contraire. Le terme « environ » en rapport avec une valeur numérique x signifie, par exemple, x + 10 %, x + 5 %, x + 4 %, x+3%, x + 2%, x + 1%.

Modes de réalisation de l'invention

Production de la souche de S. sonnei

S. sonnei 53G [15] a été choisie en tant que souche parente. La souche NVGH1859 de S. sonnei {S. sonnei 53G AtolR::kan AvirG::nadAB) a été obtenue en remplaçant le gène virG codé par le plasmide [16] dans S. sonnei 53G AtolR::kan [17] par les gènes nadA et nadB d'E. coli [18]. Les régions en amont et en aval de virG ont été amplifiées en utilisant les paires d'amorces virGup-5/virGup-3 (en amont) et virGdown33

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5/virGdown-3 (en aval) (tableau 1). La cassette « nadAB » a été produite en amplifiant nadA et nadB d'E. coli en utilisant les amorces nadA-5/nadA-3 et nadB-5/nadB-3 (tableau 1). Les fragments ont été insérés dans pBluescript (Stratagene) de telle façon que nadA et nadB soient liés et interposés dans les régions flanquantes de virG. La construction de remplacement (virGup-nadAB-virGdown) a été amplifiée en utilisant les amorces virGup-5/virGdown-3 et utilisée pour transformer S. sonnei AtolR::kan encline à la transformation telle que décrite auparavant [17].

La souche NVGH1790 de S. sonnei {S. sonnei 53G AtolR::kan AvirG::nadAB AhtrB::cat) a été produite à partir de NVGH1859 en remplaçant le gène htrB [19] par le gène de résistance au chloramphénicol cat comme il est décrit par Rossi et al. [20].

Tableau 1

Amorces utilisées dans cette étude pour la production 20 de souches de S. sonnei productrices de GMMA

Amorce	SEQ ID No :	Séquence 5' ->3’
virGup-5	1	ACTCGAGCTCTGTAGTTGATTTGACAGTTGACATCC
virGup-3	2	CTAACCCGGGCACTATATTATCAGTAAGTGGTTGATAAACC
virGdown	3	CTAACCCGGGCGTGTTGATGTCCTGC
virGdown	4	ACGCGTCGACAGTTCAGTTCAGGCTGTACGC
nadA-5*	5	CTAACCCGGGCAAGCAACTCTATGTCGGTGGAAT
nadA-3*	6	TAT CAAGCT T GGCAAGGCCAATACACAGC
nadB-5*	7	TATCAAGCTTAGGGTTAGAGTGTCTCGTTTTTGTA
nadB-3*	8	CTAACCCGGGCCAGACCAGAACTATTCC

*amorces nadA et nadB telles que décrites par Prunier et al. [18] avec des petites modifications.

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Production de la souche de S. flexneri 2a

Des mutants de S. flexneri ont été préparés comme il a été décrit auparavant dans J Biol Chem. 2014 Sep 5;

289(36): 24922-24935. S. flexneri 2a 2457T a été choisie comme souche parente. Pour la production de mutants à partir de S. flexneri 2a sans plasmide de virulence, une colonie blanche a été choisie par son aspect blanc sur une gélose au rouge Congo avant le départ de la modification génétique. L'élimination du plasmide de virulence (pINV) a été confirmée par l'absence de l'origine de réplication (ori) et des gènes codés par le plasmide, virG et ospD3, en utilisant une PCR. Les amorces sont énumérées dans le tableau 2. Pour produire la délétion de tolR dans

S. flexneri 2a et S. flexneri 2a-pINV dépourvue de plasmide, la même stratégie et les mêmes amorces que décrites précédemment pour la production du mutant AtolR de S. sonnei (2) ont été utilisées.

La mutation nulle de msbBl, ou htrB, a été obtenue en remplaçant le gène d'intérêt par une cassette de résistance à un antibiotique, en utilisant la stratégie suivante. Les régions en amont et en aval ont été amplifiées en utilisant les paires d'amorces gene-U et gene-D. La cassette de résistance utilisée pour remplacer le gène a été amplifiée en utilisant les paires d'amorces EcoRV.Ery.F/EcoRV.Ery.R ou

EcoRV.Cm.F/EcoRV.Cm.R. Les fragments ont été insérés dans pBluescript (Stratagene) de telle façon que le gène de résistance à l'antibiotique soit interposé dans les régions flanquantes du gène. La construction de remplacement (région en amont-cassette de résistance35

BE2016/5444 région en aval) a été amplifiée en utilisant les amorces se liant à l'extrémité 5' de la région flanquante en amont et à l'extrémité 3' de la région flanquante en aval du gène (voir le tableau 2) et utilisée pour transformer S. flexneri. Dans S. flexneri 2a, msbBl et htrB ont été remplacés par cat. Seule la mutation msbBl a dû être introduite dans la souche dépourvue de plasmide car le plasmide porte la seconde copie de msbB (msbB2) et celle-ci est absente dans une souche dépourvue de plasmide. Pour simplifier, appelé AmsbB. La souche

2a (S. flexneri 2457T mutant est

S. flexneri le

NVGH2404 de AtolR::kan,

AmsbB:: cat) a été produite.

Tableau 2

Amorces utilisées dans cette étude pour la production de souches de S. flexneri 2a productrices de GMMA

Nom de 1'amorce	SEQ ID NO :	Séquence 5 ' -> 3 '
htrB-Ul Xba Sma	9	CTAGTCTAGAAACCCGGGCAATTGTATGTATTGTCG
htrB-soOZ Sacl	10	ACTCGAGCTCCCGTCATCATCCAACGC
htrB-flexO2 Sacl	11	ACTCGAGCTCATCCGATATACGTTCGCCC
htrB-soDl Sali	12	ACGCGTCGACCTCAGTAATCAGGGTTCTTTG
htrB-soO2 Smal	13	CTAACCCGGGTAAATCTCCCCTGCCGGATG
htrB-flexOl Sali	14	ACGCGTCGACCCTGTAATCTCAGGTCAAATG
htrB-flexO2 Smal	15	CTAACCCGGGTAAATCTCCCATGCCGGATG
msbB-flexU5 Sma	16	CTAGTCTAGAAACCCGGGTGATAGTGTAGCGGCACA
msbB-flexU3 Sac	17	ACTCGAGCTCGTGAGCAAAGCCAGCTG
msbB-flexDS Sali	18	ACGCGTCGACCTCGGTGTGGAAATTGG
msbB-flexD3 Xba Sma	19	CTAACCCGGGCAACGTACTTACTCTACCG
Pl.htrBcompl-EcoRI	20	ACCGGAATTCGTGTAACACTGGCATGGTGTA
P2.htrBcompl-Ncol	21	CATGCCATTGTAGCAATCCGCTGTTGGTGCG
EcoRV.Ery.F	22	AGCTTGATATCAGAGTGTGTTGATAGTGCAGTATC
EcoRV.Ery.R	23	AGCTTGATATCACCTCTTTAGCTTCTTGGAAGCT

BE2016/5444

EcoRV.Cm.F	24	AGCTTGATATCTGTGACGGAAGATCACTTCG
EcoRV.Cm.R	25	AGCTTGATATCGGGCACCAATAACTGCCTTA
Ori-1	26	CGGCATCAGAATAATACAAGCAGC
Ori-2	27	AGGTGTACCGTGCTCTGGG
virG-1	28	GTCACAGGTAACATGACTCTGGAG
virG-2	29	CCATGTGTGAATACTACCTTCACCC
ospD3-l	30	GTTTTGCCTCATTCAAGATATCACC
ospD3-2	31	TGACGATGGTTTGTCAGGATTGC
msbB. F	32	CGCCAAAGTTCCGTGATCCCATT
msbB.R	33	CTCTTCGATGATCTCCAGCCCTT

Production de S. flexneri lb, 2b, 3a et 6

Des mutants de S. flexneri lb, 2b, 3a et 6 ont été préparés en adaptant les procédés décrits dans [32].

Souches

Shigella flexneri lb STANSFIELD, Shigella flexneri 2b 69/50, Shigella flexneri 3a 6885 et Shigella flexneri 6 10.8537 ont été choisies en tant que souches parentes. Pour la production des mutants sans plasmide de virulence, une colonie blanche a été choisie par son aspect blanc sur de la gélose au rouge Congo avant le départ de la modification génétique. L'élimination du plasmide de virulence (pINV) a été confirmée par l'absence des gènes de virulence codés par le plasmide, particulièrement virG (amorces 88/89) et mxiA (amorces 53/54), en utilisant une PCR. Les amorces sont énumérées dans le tableau 3.

Pour produire la délétion de tolR dans S. flexneri lb, 2b, 3a, et 6, la cassette de la kanamycine a été amplifiée à partir du plasmide pKD4 [32] en utilisant les amorces 45/46 (tableau 3). Le remplacement du gène tolR dans des souches portant les plasmides pKD46 ou pAJD434 a été confirmé par PCR (amorces 39/40). L'élimination du marqueur sélectif de l'antibiotique a

BE2016/5444 été effectuée comme il est décrit dans [32], en utilisant le plasmide pCP20. La même stratégie a été utilisée pour la délétion des gènes htrB et msbB dans ces souches, en utilisant les amorces 49/50 et 51/52, respectivement, pour l'amplification de la cassette du chloramphénicol obtenue par PCR à partir du plasmide pKD3 (amorces 45/46). En variante, le remplacement de htrB et msbB a été effectué en utilisant le fragment obtenu à partir de l'amplification de la cassette du chloramphénicol par les amorces 78-81 et 74-77 (tableau 3), respectivement. Le remplacement des gènes htrB et msbB a été vérifié par PCR en utilisant les amorces 82/83 et 55/56, respectivement. Le marqueur sélectif du chloramphénicol (cat) a été éliminé comme il a été décrit [32]. La souche NVGH2766 de S. flexneri 3a (S. flexneri 6885 AtolR::kan, hmsbB::cat) a été produite.

Tableau 3

Amorces utilisées dans la production des mutants de

S. flexneri lb, 2b, 3a et 6

Nom de 1'amorce	SEQ ID NO :	Séquence 5'-3'
45-pKDF	34	CACGTCTTGAGCGATTGTGTAGG
46-pKDR	35	GACATGGGAATTAGCCATGGTCC
39-tolRsF	36	CAATTGGTCTGTTCGCCGC
40-tolRsR	37	CTACCGCACCTGAATCAACCA
47-tolRKOF	38	ACCGCCAGGCGTTTACCGTTAGCGAGAGCAACAAGGGGTAAGCCATGGCCG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC
48-tolRKOR	39	ACCCGCTCTCTTTCAAGCAAGGGAAACGCAGATGTTTAGATAGGCTGCGTCA TATGAATATCCTCCTTAG
49-htrBKOF	40	ACAATACATACAATTGCCCGTATAGGTTGAAAAACAGGATTGATATGACGGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC

BE2016/5444

50-htrBKOR	41	ATGCCGGATGCCATTCTGAAGCATCCGGCATGGGAGATTTAATAGCGTGACA TATGAATATCCTCCTTAG
51-msbBKOF	42	ACTATCACCAGATTGATTTTTGCCTTATCCGAAACTGGAAAAGCATGGAAGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC
52-msbBKOR	43	TTTTATTTGATGGGATAAAGATCTTTGCGCTTATACGGCTGGATTTCGCCCAT ATGAATATCCTCCTTAG
53-mxiAF	44	CGATAGGGATGTTGCCAGGTT
54-mxiAR	45	CTATCGGCACGCACCTCATTTA
55-msbB2F	46	CTTTCCCCTGTTTACTGGTTTACA
56-msbB2R	47	TGTCCGCGCTGGCAATG
7 4-msbBKOuF	48	AACCCGCGTCGAACTAATCC
75-msbBKOuR	49	CCTACACAATCGCTCAAGACGTGCGTTTCCATGCTTTTCCAGTTT
76-msbBKOdF	50	GGACCATGGCTAATTCCCATGTCCCCATCAAATAAAAAAGCCTCTCG
77-msbBKOdR	51	ATCCCGAGCATCAACGTTTC
78-htrBKOuF	52	GCGCAGTACCCAGAAGGAT
79-htrBKOuR	53	CCTACACAATCGCTCAAGACGTGGGTGGAGAACTTGGGTAGATTCG
80-htrBKOdF	54	GGACCATGGCTAATTCCCATGTCCCTTCACGCTATTAAATCTCCCA
81-htrBKOdR	55	TGACTACATCTACACCAGCCCT
82-htrBF	56	GCGTACTTTGGTTGGTCGTG
83-htrBR	57	AACGAAGGGCACCAGACA
88-virGF	58	GGTTATGATGGCTACGGTGGTA
89-virGR	59	GTTTATAGTCCTTCTGCGCCCA
7 4-msbBKOuF	60	AACCCGCGTCGAACTAATCC
75-msbBKOuR	61	CCTACACAATCGCTCAAGACGTGCGTTTCCATGCTTTTCCAGTTT
76-msbBKOdF	62	GGACCATGGCTAATTCCCATGTCCCCATCAAATAAAAAAGCCTCTCG
7 7-msbBKOdR	63	ATCCCGAGCATCAACGTTTC
78-htrBKOuF	64	GCGCAGTACCCAGAAGGAT
79-htrBKOuR	65	CCTACACAATCGCTCAAGACGTGGGTGGAGAACTTGGGTAGATTCG
80-htrBKOdF	66	GGACCATGGCTAATTCCCATGTCCCTTCACGCTATTAAATCTCCCA
81-htrBKOdR	67	TGACTACATCTACACCAGCCCT

Conditions de croissance de Shigella

Les souches de Shigella sonnei et Shigella flexneri productrices de GMMA ont été cultivées en 5 routine dans du milieu défini de S. sonnei (SSDM, [17]) avec du glucose comme source de carbone. Le SSDM a été préparé comme suit : 13,3 g/kg de KH₂PO₄, 4 g/kg de (NH₄)₂HPO₄, 1,7 g/kg d'acide citrique monohydraté,

BE2016/5444

2.5 g/kg d'acide L-aspartique, 493 mg/kg de MgSO4*H2Û,

2,7 mg/kg de Co(NH3)gCl3, 15 mg/kg de MnCl2*4H2O,

1.5 mg/kg de CuCl2*H₂O, 3 mg/kg de H3BO3, 2,5 mg/kg de Na2MoC>4*2H20, 2,5 mg/kg d'acétate de zinc monohydraté, 0,49 mg/kg de citrate ferrique, 50 mg/kg de thiamine. Du glucose a été ajouté à une concentration de 5 g/kg pour les cultures en milieu solide et dans des flacons agités. Pour une croissance dans des fermenteurs, il a été ajouté 27,3 g/kg de glucose et 0,25 g/kg de polypropylène glycol (PPG). Le SSDM solide contenait 18 g/1 de gélose. Le milieu de Shigella flexneri a été en outre complémenté avec des acides aminés, des vitamines, et une concentration supérieure de fer.

Préparation de banques cellulaires

Pour minimiser le risque de contamination par l'encéphalite spongiforme transmissible (EST) ou d'autres agents accidentels, la lignée cellulaire de S. sonnei et les lignées cellulaires de S. flexneri ont été nettoyées selon les GMP par trois passages sur des plaques de gélose préparées avec du SSDM. Des flacons de banques cellulaires maîtresses et de travail sont préparés selon les GMP.

Cytométrie en flux des bactéries ou des GMMA

Des bactéries Shigella provenant d'un fermenteur ou d'une culture à l'échelle du flacon ont été préservées pour une analyse de cytométrie en flux par fixation dans du formaldéhyde à 0,5 %. 9 x 10⁴ à 9 x 10⁵ cellules ont été colorées avec un antisérum de lapin monovalent (Denka Seiken Co., Ltd.), réagissant avec l'antigène O (AgO) ou un antisérum polyclonal de souris dirigé contre les GMMA formulés avec ALHYDROGEL®

BE2016/5444 pour les sérotypes de Shigella. Les anticorps liés ont été détectés en utilisant un fragment F(ab')2 de chèvre anti-lapin ou une IgG, IgM ou IgA anti-souris conjugué à la fluorescéine (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Les échantillons ont été fixés en utilisant du formaldéhyde à 4 % et analysés en utilisant un cytomètre en flux FACScantoTM II (BD Biosciences). Les données ont été traitées en utilisant le logiciel FlowJo (Tree Star Inc.).

Production des GMMA

Les descriptions qui suivent sont basées sur la production des 1790-GMMA de S. sonnei. Lorsque le procédé diffère pour la production de GMMA de S. flexneri, des indications supplémentaires sont données.

Fermentation

Pour chaque lot de production, la souche de Shigella a été cultivée dans un ballon agité issu de la banque cellulaire de Recherche ou de GMP dans du SSDM à 30 °C avec agitation (200 tr/min), en démarrant à partir d'une densité optique mesurée à 600 nm (D0600) de 0,02 jusqu'à ce que la culture ait atteint une D0600 égale à 1,5 ± 0,5, habituellement en 9 ± 2 heures. Dans le bioréacteur (échelle de 30 1 dans le bioréacteur Biostat D75 de Sartorius ou échelle de 25 1 dans le bioréacteur LP35 de Bioengineering), les souches sont cultivées en mode fermé en démarrant à partir d'une taille d'inoculum de 2 % avec des conditions de culture contrôlées : pH 6,7 maintenu par l'addition de NH₄OH à 28 %, 30 °C, de l'oxygène dissous maintenu à 30 % de saturation par un débit d'air de 1 volume d'air par

BE2016/5444 volume de culture par minute (vvm), une agitation et une pression en cascade (200 à 800 tr/min, 50 à

1250 mbarg) jusqu'à la D0600 finale de 35.

Purification

Les GMMA libérés dans le bouillon de fermentation ont été purifiés en utilisant deux étapes consécutives de filtration à flux tangentiel (TFF) : une microfiltration dans laquelle le surnageant de la culture contenant les GMMA est séparé des bactéries, et une ultrafiltration, dans laquelle les GMMA ont été séparés des protéines solubles. Pour l'étape de microfiltration (1,2 m² de membrane de cellulose avec une taille de pore de 0,2 pm) , le bioréacteur a été relié au système de TFF, afin d'utiliser le récipient de fermentation comme cuve de recirculation. Le surnageant de la culture a été initialement concentré trois fois pour atteindre « un volume » de surnageant concentré, ceci suivi d'une diafiltration discontinue contre cinq volumes du tampon dans le milieu de croissance (13,3 g/kg de KH₂PO₄ ; 4 g/kg de NH₄HPO₄ ;

1,7 g/kg d'acide citrique ; 4 ml/1 de NH₄OH ; pH 6,7). Du sérum physiologique peut être également utilisé. Le matériau microfiltré, contenant les GMMA, a été ensuite filtré à travers une capsule de filtres avec des filtres de 0,45 pm puis de 0,2 pm (Sartorius) pour assurer l'absence de toute bactérie Shigella viable avant un autre traitement. L'étape d'ultrafiltration (1,4 m² de membrane de PES avec une taille de pore de 300 kDa) a consisté en une concentration suivie d'une diafiltration discontinue de la solution microfiltrée des GMMA contre dix volumes de sérum physiologique

BE2016/5444 tamponné par du Tris (TBS) , 0,9 % de NaCl, 10 mM de Tris/Tris HCl pH 7,4 ou 0,9 % p/v de chlorure de sodium, et a permis une élimination substantielle des acides nucléiques et des protéines solubles. Une concentration finale des GMMA purifiés a été effectuée pour obtenir la concentration requise pour le traitement de formulation et filtrée à travers un filtre stérilisant en acétate de cellulose de Sartorius qui a été validé pour la capacité de rétention des produits extractibles, lixiviables et des bactéries avec le vrac des GMMA.

Trois lots de GMMA de S. sonnei non conformes aux GMP ont été préparés à partir d'un volume de fermentation de 30 1. En outre, deux lots GMP ont été produits et libérés pour supporter en outre la fabrication de vaccins de toxicologie et cliniques. Les GMMA en vrac de S. sonnei ont été testés pour leur aspect, leur identité, leur teneur en protéines totales et solubles, leur teneur en antigène O, leur teneur en LPS, leur pH, leur osmolalité, leur pureté et leur taille.

Formulation

Les GMMA ont été adsorbés sur de 1'hydroxyde d'aluminium (ALHYDROGEL® 2 %, Brenntag Biosector, Danemark) en ajoutant la suspension de GMMA à ALHYDROGEL® sous agitation constante à température ambiante pendant 2 h ceci suivi d'une mise en flacon. La formulation des GMMA-ALHYDROGEL® contient 12,7 pg/ml d'antigène O de S. sonnei, 200 pg/ml de protéines de GMMA et 0,7 mg/ml d'ions aluminium-III (Al³⁺) comme ALHYDROGEL® dans du TBS. Un tampon histidine peut être également utilisé. La formulation a été distribuée à 0,7 ml par flacon de dose unique de 3 ml. La

BE2016/5444 formulation a été testée pour l'identité, la teneur en protéines totales, la teneur en aluminium, le volume des composés extractibles, les protéines non adsorbées, l'aspect visuel, le pH, l'osmolalité, la stérilité, l'immunogénicité, et la pyrogénicité.

Trois lots GMP de S. sonnei 1790GAHB, un lot de toxicologie et deux lots cliniques, ont été préparés et libérés. Un lot de stabilité non GMP plus petit (140 ml) a été également produit. Des lots de laboratoire à petite échelle fraîchement formulés ont été produits pour des études initiales de pyrogénicité et d'immunogénicité.

Formulation GMP de GAHB-Placebo

Un placebo, également utilisé en tant que diluant, a été préparé contenant 0,7 mg/ml de Al³⁺ comme ALHYDROGEL® dans du TBS et a été distribué à 0,7 ml par flacon de 3 ml. Un tampon histidine peut être également utilisé. Le GAHB-Placebo a été testé pour son identité, sa teneur en aluminium, son volume de composés extractibles, son aspect visuel, son pH, son osmolalité, sa stérilité et sa pyrogénicité. Deux lots GMP de GAHBPlacebo ont été produits et libérés.

Procédés analytiques physico-chimiques

Quantification des protéines des GMMA

Les GMMA produits à partir de la souche NVGH1790 sont appelés 1790-GMMA. La quantification des protéines a été effectuée en routine par le dosage de Lowry. Pour la détermination de la concentration des protéines des GMMA, les dosages ont utilisé un étalon secondaire de BSA étalonné comme il a été décrit auparavant [28] contre un étalon primaire de 1790-GMMA avec une teneur

BE2016/5444 en protéines déterminée par une analyse quantitative des acides aminés. Ainsi toutes les concentrations en protéines des GMMA sont référencées indirectement à la concentration en protéines déterminée par l'analyse des acides aminés. Les échantillons contenant du Tris ont été dilués jusqu'à une concentration finale de Tris inférieure ou égale à 1 mM pour éviter une interférence avec le dosage de Lowry. Le dosage microBCA peut être également utilisé pour la quantification des protéines des GMMA.

Quantification des protéines des GMMA formulés avec ALHYDROGEL®

Pour la quantification des protéines des GMMA adsorbés sur ALHYDROGEL® (par exemple, 1790GAHB), le dosage de Lowry ou microBCA est également utilisé, et l'étalon secondaire de BSA a été adsorbé sur ALHYDROGEL®. Après le développement de la couleur, les échantillons ont été centrifugés et les absorbances des surnageants ont été déterminées. Les protéines solubles non adsorbées sur les préparations de GMMA ont été déterminées dans le surnageant des formulations de ALHYDROGEL® après ultracentrifugation à 186 000 g à 4 °C pendant 2 h en utilisant un étalon secondaire de BSA étalonné contre un étalon primaire de protéines solubles quantifiées par l'analyse quantitative des acides aminés.

La teneur en protéines non liées dans les GMMA adsorbés sur ALHYDROGEL® était trop faible pour être mesurée par le dosage de Lowry ou microBCA et elle a été estimée comme étant la valeur limite du test par SDS-PAGE (gel de bis-acrylamide à 10 %) des surnageants

BE2016/5444 recueillis après centrifugation de l'échantillon et comparée à une série de 1790-GMMA de référence dans un couloir parallèle. Les bandes des protéines ont été visualisées par coloration à l'argent, quantifiées par densitométrie et les données ont été analysées en utilisant le logiciel ImageScanner III. L'intensité des bandes détectables dans l'échantillon de surnageant a été comparée (comme valeur limite du test) à l'intensité des bandes correspondantes dans l'échantillon de 1790-GMMA. La limite correspond à 5 pg/ml de protéines non adsorbées (2,5 % des protéines totales de la formulation de 1790GAHB).

Profil des protéines des GMMA

Les 17 90-GMMA ont été dénaturés pendant 10 min à 100 °C dans du tampon à échantillon pour électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec du dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) contenant du SDS (Invitrogen, tampon à échantillon LDS NuPAGE) et 50 mM de dithiothréitol (DTT). 3 pg de protéines ont été chargés sur un gel de polyacrylamide à 10 % (p/v) (Invitrogen, Novex 10 %). L'électrophorèse a été réalisée dans du tampon d'acide 3-(N-morphoiino)-propanesulfonique (MOPS) (Invitrogen) à 40 mA pendant 75 min. Les protéines séparées ont été colorées avec du bleu brillant G de Coomassie colloïdal (Sigma-Aldrich), quantifiées en utilisant la densitométrie et analysées en utilisant le logiciel ImageScanner III. Les profils des protéines des échantillons à tester ont été comparés aux profils des GMMA de référence soumis à une électrophorèse sur le même gel.

Quantification de l'antigène O dans les GMMA

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Pour une caractérisation détaillée et les tests de libération des lots, la concentration de l'antigène O (AgO) a été mesurée par une analyse HPAEC-PAD. La quantification détermine le poids en mg de l'AgO total présent dans l'échantillon.

Etalon de référence de l'antigène O : des GMMA de S. sonnei NVGH1859 (1859-GMMA) ont été hydrolysés pendant 2 h à 100 °C dans de l'acide acétique à 1 %. Le lipide A clivé et les protéines précipitées ont été chacun éliminés par centrifugation [21] . La fraction principale (poids moléculaire moyen, PMM) de l'AgO a été récupérée par chromatographie d'exclusion (SEC, colonne GE Sephacryl S-100HR). La taille de l'AgO a été déterminée en mesurant le nombre d'unités répétitives par RMN ¹H [22] . La moyenne a été de 33. La quantité d'antigène O a été déterminée à partir du nombre moyen d'unités répétitives et la concentration molaire du cœur de LPS par galactose mesurée par une analyse HPAEC-PAD telle que décrite ci-dessus et dans Quantification du LPS ci-dessous. Comme variante, la quantification de l'AgO peut être effectuée par une RMN ¹H quantitative (qRMN) en utilisant de l'acide maléique comme étalon interne.

Quantification de l'antigène O dans les GMMA : le LPS a été purifié par une extraction à chaud avec du phénol-eau [23] comme suit : 400 μΐ d'échantillon ont été ajoutés à un volume égal de solution de phénol à 90 % pH 8 (Sigma-Aldrich) et incubés à 80 °C pendant 2 h. Après refroidissement à 4 °C, l'échantillon a été centrifugé à 18 000 g à 4 °C pendant 15 min et la phase aqueuse supérieure contenant le LPS a été récupérée. La

BE2016/5444 phase phénolique a été à nouveau extraite avec 400 μΐ d'eau (1 h à 80 °C) et après centrifugation (18 000 g à 4 °C pendant 15 min), la phase aqueuse a été récupérée, combinée avec le premier extrait aqueux et séchée pendant une nuit dans un évaporateur centrifuge. L'échantillon a été reconstitué dans de l'eau (400 μΐ) et éventuellement dilué avec de l'eau pour donner une concentration d'antigène O située entre 2,5 et 30 pg/ml. Le rendement en LPS a été > 90 % comme il en a été jugé par la récupération du cœur de LPS, mesuré en utilisant du galactose comme il a été décrit ci-dessus. Le LPS a été soumis à une hydrolyse alcaline et les sucres ont été mesurés par une analyse HPAEC-PAD comme il a été rapporté pour le polysaccharide Vi [40] et comparés à l'étalon de référence de l'antigène O.

Quantification du LPS dans les GMMA La détermination quantitative du sucre galactose central par analyse HPAEC-PAD [21] a été utilisée pour quantifier la quantité de LPS dans les 1790-GMMA en se basant sur deux galactoses par cœur [22]. La quantification détermine le nombre de moles de molécules de LPS. Une série de dilutions d'étalons de galactose est exécutée dans chaque analyse. Les étalons de 1790-GMMA et de galactose sont traités en parallèle avec de l'acide trifluoroacétique 2 M pendant 4 h à 100 °C. Les échantillons sont refroidis à une température située entre 2 et 8 °C, séchés pendant une nuit, redissous dans de l'eau, filtrés et analysés. L'analyse HPAEC-PAD est effectuée sur un instrument Dionex ICS3000 en utilisant une colonne CarboPac PA10 et une colonne de garde PA10. La séparation est

BE2016/5444 effectuée en utilisant une condition isocratique d'élution avec 18 mM de NaOH. Pour les GMMA de S. flexneri, comme procédé général pour la quantification du LPS, la quantification des acides gras 3-hydroxylés présents sous forme d'ester dans une structure lipidique est utilisée. Par l'hydrolyse alcaline de l'échantillon suivie d'une HPLC-RP-QqQ (SRM), la quantification est effectuée en utilisant un étalon d'acide gras 3-OH pour construire la courbe d'étalonnage.

Distribution des tailles de LPS dans les GMMA Pour des objectifs de criblage, une analyse SDSPAGE peut être utilisée. Le LPS a été purifié en utilisant le procédé au phénol-eau (voir ci-dessus) avec des modifications. Les GMMA (1 mg/ml) ont été portés à ébullition pendant 3 min, incubés avec 0,5 pg/pl de protéinase K (Sigma Aldrich) à 60 °C pendant une nuit, mélangés dans un rapport de 1/1 (vol/vol) avec du phénol saturé pH 8,0 (Sigma Aldrich), incubés pendant 30 min à 70 °C, et centrifugés pendant 1 h à 10 000 g à température ambiante. La phase supérieure a été récupérée, mélangée dans un rapport de 2/1 (vol/vol) avec de l'éthanol à 100 %, le LPS a été précipité pendant 1 h à -80 °C et transformé en culot par centrifugation à 12 000 g pendant 30 min à température ambiante. Le culot a été séché en utilisant un SpeedVac et dissous dans de l'eau. Le LPS a été soumis à une électrophorèse sur du gel de bis-tris polyacrylamide à 12 % (Life technologies) et coloré en utilisant le kit de coloration à l'argent Silver Quest™ (Life Technologies). Pour une caractérisation plus

BE2016/5444 précise, l'analyse HPLC-SEC peut être utilisée. Le lipide A et les protéines sont éliminés de l'échantillon à tester par hydrolyse avec de l'acide acétique à 1 % (2 h à 100 °C) /centrifugation à vitesse basse (14 000 rcf pendant 5 min) ; le surnageant séché (ou dessalé) est injecté dans la HPLC en utilisant une colonne TSK-GEL® 3000 PW avec détecteur d'indice de réfraction. La taille moléculaire est déterminée par le logiciel GPC en utilisant des étalons de PM de dextranes. Si l'échantillon est dérivatisé avec du semicarbazide, le pic résultant peut être utilisé pour confirmer la quantité d'AgO.

Analyse MALDI-TOF du lipide A dans les bactéries ou les GMMA

Le test d'identité du lipide A par le procédé de désorption et ionisation par laser assistées par matrice à temps de vol (MALDI_TOF) détermine le type de lipide A dans le LPS. Le lipide A a été précipité à partir des GMMA ou des banques de cellules bactériennes comme il a été décrit auparavant [20] en utilisant une hydrolyse par un acide doux avec de l'acide acétique à 1 % pendant 2 h à 100 °C. Les échantillons ont été centrifugés à 14 000 g pendant 15 min, les culots ont été remis en suspension dans de l'eau, et lavés deux fois avec de l'eau. Les culots ont été séchés pendant une nuit en utilisant un Speedvac et remis en suspension dans du chloroforme-méthanol (4/1) et mélangés avec un volume égal de solution Super DHB (Sigma-Aldrich) dans de 1'eau/acétonitrile (1/1, vol/vol) . Deux μΐ du mélange ont été chargés sur la plaque cible (plaque cible de conduction en acier BC

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MTP 384, Bruker Daltonics) et analysés par un instrument Ultraflex MALDI-TOF (Bruker Daltonics) en mode réflectron ions négatifs. Un étalon d'étalonnage de peptides (Bruker Daltonics), mélangé avec de la solution Super DHB, a été inclus dans chaque analyse. Les rapports m/z ont été déterminés par le logiciel Flex Analysis comparativement à l'étalon des peptides. L'espèce de lipide A est identifiée par comparaison de la masse m/z du pic moléculaire à ce qui est attendu pour les échantillons.

Taille des particules des GMMA

La diffusion dynamique de la lumière détermine la distribution des tailles des GMMA en utilisant un

Zetasizer Malvern Nano ZS™. La distribution des tailles des particules a été obtenue sous la forme de l'intensité de la lumière diffusée en utilisant la valeur moyenne de Z des trois mesures différentes de la lumière rétrodif fusée à un angle de 17 3° avec « Protéines » comme réglage de matériau et « Objectif général (résolution normale) ». Le diamètre obtenu par cette technique est une sphère qui présente le même coefficient de diffusion translationnelle que la particule mesurée. On s'attend à ce que la taille soit différente de celle mesurée par microscopie électronique et elle sera une mesure valide de la plage des tailles des particules et de l'homogénéité de la fabrication.

La microscopie électronique à transmission en coloration négative a été également utilisée pour estimer la taille des particules des GMMA. Les GMMA ont été préparés et observés par microscopie électronique comme il a été décrit auparavant [20]. Les micrographies électroniques ont été enregistrées à un grossissement nominal de 105 000 X. Les diamètres des

GMMA ont été mesurés manuellement sur des copies

BE2016/5444 imprimées des comparativement à technique utilisée micrographies électroniques la barre d'échelle. Une autre pour déterminer la taille qui correspond mieux aux données obtenues par microscopie électronique est la HPLC-SEC couplée à la MALLS (diffusion lumière laser multi-angle) en utilisant des colonnes TSKGEL® 6000PW et 4000PW reliées en série.

Identité et quantification de l'antigène O des GMMA formulés avec ALHYDROGEL®

L'identité des GMMA formulés avec ALHYDROGEL® peut être déterminée par des technologies basées sur 1'immunologie.

Le test immunologique Direct ALHYDROGEL® Formulation [31] a été employé avec des modifications. L'identité des GMMA est confirmée par la détection de l'antigène O présent dans la formulation en utilisant un typage commercial d'antisérums produits chez des lapins ou un typage d'anticorps monoclonal produit chez des souris. Une aliquote de la suspension de GMMAALHYDROGEL® est bloquée avec de la BSA et incubée avec l'anticorps spécifique de l'AgO. La liaison de l'anticorps de typage est ensuite détectée en utilisant un anticorps anti-lapin ou un anticorps anti-souris marqué par une enzyme. La présence de l'antigène O réagissant immunologiquement est détectée par l'addition d'une solution de substrat et la formation d'une couleur qui peut être détectée par l'absorbance.

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L'identité est confirmée par comparaison de l'absorbance de l'échantillon à tester à l'absorbance d'une référence incluse dans le même test.

L'identité et la quantification de l'antigène O peuvent être également réalisées par un test ELISA compétitif. Le principe de travail est basé sur la compétition entre l'antigène O ou le LPS spécifique de Shigella et les GMMA formulés avec ALHYDROGEL® pour la liaison à un anticorps monoclonal spécifique d'un sérogroupe ou à un antisérum polyclonal. Plus de GMMA sont présents dans la suspension, moins d'anticorps monoclonaux ou d'anticorps polyclonaux peuvent se lier à la plaque revêtue de l'antigène, et moins de signal peut être détecté par des procédés ELISA classiques. L'antigène O présent dans la formulation à tester est quantifié comparativement aux signaux obtenus avec une courbe d'étalonnage construite en surchargeant l'anticorps monoclonal avec une quantité connue de GMMA formulés avec ALHYDROGEL®.

Tests biologiques

Isolement des CMSP et test MAT

La production in vitro d'interleukine 6 (IL-6) par les CMSP à la suite d'une stimulation avec des GMMA a été utilisée comme substitut in vitro pour estimer le potentiel réactogène en utilisant la procédure décrite par Rossi et al. [20] . En bref, des couches leucoplaquettaires provenant de différents donneurs ont été utilisées pour isoler les CMSP en utilisant une centrifugation à densité de Ficoll comme il a été rapporté [24] . Les CMSP ont été ensemencées à une densité de 2 x 105 eelluies/puits avec 180 μΐ de RPMI53

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1640 complémenté avec 25 mM de HEPES, 2 mM de glutamine, 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine (InvitroGen) dans des plaques à fond arrondi de 96 puits. 20 μΐ de dilutions en série au 1/10 de GMMA dans du TBS (0,0001 à 1 000 ng/ml de concentration finale dans le test) ont été ajoutés, les cellules ont été incubées pendant 4 h à 37 °C et les surnageants ont été récupérés après centrifugation (5 min, 400 g) et stockés à -80 °C jusqu'à l'analyse pour la concentration de l’IL-6.

Etudes d'immunogénicité/puissance chez des souris Huit souris BALB/c ou CD-I par groupe (femelles, âgées de 4 à 6 semaines) ont reçu une ou deux injections intrapéritonéales de doses différentes de GMMA formulés avec ALHYDROGEL aux jours 0, et 21 dans un volume de 0,5 ml. Les souris témoins ont reçu 0,5 ml de GAHB-Placebo. Des échantillons de sang ont été prélevés aux jours 7, 14, 21, 28, 35 ou dans certaines études, seulement au jour 21. Dans les tests de puissance, des groupes de souris ont été immunisés avec quatre doses différentes du vaccin ou de l'étalon de puissance (GMMA de référence, stocké à -80 °C, et fraîchement formulé sur ALHYDROGEL).

Test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Les anticorps déclenchés contre les GMMA de

S. sonnei ou de S. flexneri sont estimés par un test ELISA en utilisant le LPS de Shigella sonnei ou l'antigène O du sérogroupe de S. flexneri comme antigène de revêtement de la plaque. Des plaques de 96 puits Nunc™ Maxisorp™ ont été revêtues pendant une nuit à une température de 2 à 8 °C avec 0,5 pg/ml de

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LPS ou < 5 pg/ml d'AgO dans de la solution tampon phosphate (PBS). Les plaques ont été bloquées pendant 1 h avec du lait à 5 % dans du PBS et ensuite lavées trois fois avec du PBS contenant 0,05 % de TWEEN® 20 (PBST) . Les sérums des souris ont été dilués au 1/100 et au 1/4000 dans du PBST avec 0,1 % de BSA, les sérums de lapin ont été dilués dans du lait à 5 % dans du PBS. Les sérums dilués ont été incubés en triple pendant 2 h dans les plaques ELISA. Les échantillons ont été testés en comparaison à des sérums étalons établis auparavant et étalonnés anti-LPS de S. sonnei ou anti-antigène O de sérotype de S. flexneri inclus dans une série en double de dilutions sur chacune des plaques. Après incubation avec l'échantillon et les sérums de référence, les plaques ont été lavées trois fois comme ci-dessus. L'anticorps lié a été détecté en utilisant une IgG de chèvre anti-souris ou une IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à de la phosphatase alcaline, diluée dans du PBST, et ceci suivi de trois étapes de lavage et d'une réaction colorée avec du substrat de phosphate de p-nitrophényle. Après 1 h, l'absorbance (densité optique, DO) a été mesurée à une longueur d'onde de 405 nm et de 490 nm et la DO405 nm-490 nm a été calculée. Les résultats sont exprimés en unités ELISA déterminées par rapport au sérum étalon. Une unité ELISA équivaut à l'inverse de la dilution du sérum étalon donnant une DO405 nm-490 nm de 1 dans le dosage de 1'étalon.

Dosage du pouvoir bactéricide du sérum comme mesure de la fonctionnalité des anticorps

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Les bactéries S. sonnei et S. flexneri ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique (DO : 0,2), diluées au 1/15 000 dans du PBS et distribuées dans des plaques de microtitrage stériles en polystyrène à fond en U de 96 puits. Dans chaque puits, il a été ajouté des échantillons des sérums dilués en série du 1/8 au 1/12 (en démarrant à partir d'une dilution au 1/100 dans le puits) . Avant utilisation, les sérums ont été chauffés à 56 °C pendant 30 min pour inactiver le complément endogène. Du complément de lapin bébé actif (BRC, Cederiane CL3441 lot 6288) utilisé à 7 à 20 % de volume final a été ajouté dans chaque puits. La source, le lot et le pourcentage du BRC utilisé dans le mélange réactionnel du test de SBA ont été choisis auparavant pour une faible toxicité contre chaque bactérie spécifique. Pour évaluer des effets inhibiteurs non spécifiques possibles du BRC ou du sérum de souris, les bactéries ont été également incubées avec les mêmes sérums testés plus du BRC inactivé à la chaleur ; les sérums seuls (aucun BRC) ; le tampon du test de SBA et du BRC actif. Après 3 h d'incubation dans le mélange du test de SBA, l'inhibition de la croissance bactérienne a été mesurée. L'activité bactéricide a été mesurée en termes de titres sériques, qui sont définis comme les dilutions de sérums nécessaires pour obtenir 50 % de croissance bactérienne. Des titres sériques égaux à 10 ont été donnés lorsqu'aucune activité bactéricide n'a été détectée.

Pyrogénicité

Nous avons établi une modification du procédé du test de pyrogénicité intraveineux de la Pharmacopée

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Européenne (Ph. Eur. 2.6.8 pyrogens, [25]) en utilisant l'administration d'une dose humaine entière administrée par voie intramusculaire. Deux ensembles d'expériences ont été réalisés pour établir le test. Dans la première expérience (dans des conditions non GMP mais dans un établissement GMP), trois groupes de 3 lapins, présélectionnés selon le critère Ph. Eur. 2.6.8 pyrogens, ont été placés dans des boîtes de rétention et les températures corporelles ont été enregistrées en utilisant une sonde rectale et la température initiale a été déterminée. Le lot du vaccin de toxicologie (0,5 ml) a été injecté par voie intramusculaire à chacun des trois lapins dans deux groupes de vaccin et 0,5 ml de sérum physiologique stérile aux trois lapins du groupe témoin. La température a été enregistrée en continu par un système automatisé à partir de 90 min avant l'injection jusqu'à 3 h après l'administration pour déterminer la température initiale et une élévation possible de la température après l'administration. La température a été enregistrée manuellement à 3,5, 4, 5, 5,5, 6, 6,5 et 7 h. Le jour suivant, les lapins ont été à nouveau placés dans la boîte de rétention, laissés s'acclimater et une autre lecture a été prise à 24 h.

Sur la base des données (voir Résultats), le test suivant a été choisi pour le test de pyrogénicité intramusculaire pour les 1790GAHB. Deux groupes de trois lapins, (un groupe test pour le vaccin et un groupe témoin), sont choisis selon le critère Ph. Eur. 2.6.8, placés dans des boîtes de rétention et la température initiale a été déterminée en utilisant une

BE2016/5444 sonde rectale. Le vaccin (0,5 ml) est injecté par voie intramusculaire aux lapins dans le groupe du vaccin et 0,5 ml de sérum physiologique stérile aux lapins du groupe témoin. La température est enregistrée en continu par un système automatisé pendant 3 h et des lectures supplémentaires sont prises manuellement à 3,5 et 4 h. L'élévation maximale de la température pour chaque lapin est déterminée (la différence entre la température la plus élevée mesurée durant la période de 4 h après l'administration et la température initiale). Pour que le test soit valide, la moyenne de l'élévation maximale de la température de trois témoins doit être ^0,3 °C. Le test passe si la moyenne de l'élévation maximale de la température des trois lapins du groupe du test pour le vaccin est <0,8 °C, et échoue si la moyenne de l'élévation maximale de la température est

1,2 °C. Le test sera répété si la moyenne de l'élévation maximale de la température des trois lapins est >0,8 mais <1,2 °C. Pour la répétition du test chez 3 lapins supplémentaires, le test passera si la moyenne de l'élévation maximale de la température des trois lapins est 0,8 °C et sinon il échouera. La seconde étude a été réalisée dans des conditions GMP dans l'établissement GMP en utilisant les critères cidessus pour estimer la pyrogénicité des lots de vaccins de toxicologie et cliniques. L'enregistrement de la température dans 1'étude a été étendu sur une période de 24 h pour fournir d'autres données sur la fiabilité du test et le choix de 4 h comme période de temps définitif pour estimer l'élévation de la température.

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Le procédé du test de pyrogénicité IM a été utilisé pour libérer trois lots GMP de 1790GAHB de S. sonnei.

Etude de la toxicologie de doses répétées

Pour supporter l'administration clinique de jusqu'à trois immunisations du vaccin à base de 17 90GAHB de S. sonnei, une étude de toxicologie a été conduite avec des lapins New Zealand White en conformité avec les standards des bonnes pratiques de laboratoire (GLP) (WIL Research Europe, Lyon, France). Le vaccin a été administré quatre fois, à deux semaines d'écart par la voie clinique intramusculaire (IM), intranasale (IN), ou intradermique (ID) ceci suivi d'une période d'observation de deux semaines. Les lapins ont été choisis comme modèle animal en se basant sur des études de recherches préliminaires démontrant la capacité de produire une réponse immunitaire. La conception de l'étude est présentée dans le tableau 3. Tous les animaux ont été observés durant l'étude pour la morbidité/mortalité, les observations/examens cliniques, les sites d'injection (test de Draize), l'ophtalmologie, les poids corporels, la consommation d'aliments. La pathologie clinique, y compris les paramètres de coagulation et la protéine C réactive (prétest, au jour 2 et aux deux nécropsies) , l'analyse des anticorps (prétest, prédose et aux deux nécropsies), les observations macroscopiques aux nécropsies, les poids des organes, et l'histopathologie (liste complète des tissus de l'OMS) ont tous étés effectués dans tous les groupes. Les températures corporelles des groupes 2 et 5 (IM) à la première immunisation ont été mesurées à

1,5 h, 0,5 h, et 2 min (0 h) avant l'administration de

BE2016/5444 la dose et à 0,5, 2, 6, et 24 h après l'injection. La moyenne de la température à -0,5 h et Oh a été considérée comme la température initiale des lapins. Aux 2ème, 3ème, et 4ème immunisations des groupes 2 et

5 et à toutes les immunisations des groupes 1, 3, 4, 6, et 7, les températures corporelles ont été enregistrées avant (Oh), et 2, 6, et 24 h après l'administration de la dose.

Tableau 3

Conception expérimentale de l'étude de toxicologie

Groupe/ Traitement	Voie(s)a	Antigène par injection (pg D'AgO/ pg de protéines)	Volume de la dose par injection (pl)	Nombre d'animaux
Nécropsiés au jour 44	Nécropsiés au jour 56
Mâles	Femelles	Mâles	Femelles
lb	0,9 % de NaCl	IM INC ID	0	500 400 50	4	4	4	4
2	GAHB- Placebo	IM	0	500	4	4	4	4
3	G7VHB- Placebo	IN	0	400	4	4	4	4
4	GAHB- Placebo	ID	0	50	4	4	4	4
5	1790GAHB	IM	6,1 / 100	500	4	4	4	4
6	1790GAHB	IN	4,9 / 80	400	4	4	4	4
7	1790GAHB	ID	0,61 / 10	50	4	4	4	4

Jour d'administration des doses : 0, 14, 28 et 42. ^aIM : intramusculaire ; IN : intranasale ; ID : intradermique. ^bChaque animal dans le groupe 1 (témoin) a reçu le sérum physiologique stérile (0,9 % de NaCl) par les trois voies.

^c4 administrations de 100 μΐ par narine à 2 h d'écart, c'est-à-dire 400 μΐ/jour. Les narines ont été alternées entre les vaccinations.

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Etude	d'Irwin	chez	des rats avec	une vaccination
IN
Pour	encore	supporter l'administration IN des
1790GAHB,	un test	GLP	d'Irwin a été	entrepris pour
identifier	les effets	indésirables	potentiels des
1790GAHB sur le système	nerveux central	et périphérique
jugés	par	une	batterie	d'observations

neurocomportementales [26]. Trois groupes de 6 rats Han Wistar mâles, d'approximativement 0,3 kg, ont été utilisés. Le premier groupe a reçu le témoin de sérum physiologique, le deuxième le GAHB-Placebo et le troisième les 17 90GAHB. Chaque rat a reçu une seule dose de 15 μΐ dans chaque narine (total de 30 μΐ) . Ce volume administré a été la dose pratique maximale. Le groupe du test a reçu au total 6 pg de protéines de 17 90GAHB. Sur la base du poids corporel, la dose de 6 pg de protéines chez un rat de 0,3 kg représente approximativement 15 fois la dose prévue la plus élevée qui sera administrée par voie IN à un sujet de 60 kg dans l'essai en Phase 1. Les rats ont été suivis, avant et à 0,5, 1, 2, 5, et 24 heures après l'administration.

Toutes les études animales se sont conformées à la directive EU 2010/63 sur la protection des animaux pour des objectifs scientifiques, et sa mise en œuvre dans les lois locales pertinentes en Italie et en France, respectivement. Le test GMP de pyrogénicité modifié a été approuvé par le comité d'éthique de Charles River France (Numéro d'étude T 13.1446-48, T 13.1678-80, T 13.1702).

Résultats

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Expression de l'antigène O de la lignée cellulaire

NVGH1790 de S. sonnei

La souche NVGH1790 a été génétiquement modifiée par l'intégration des gènes nadA et nadB d'E. coli dans le plasmide de virulence pour éliminer 1'auxotrophie à l'acide nicotinique de Shigella [18]. Ainsi, la rétention du plasmide de virulence et par conséquent la production de l'AgO codé par le plasmide [27] est assurée par une croissance dans un milieu sans acide nicotinique. L'analyse FACS de S. sonnei NVGH1790 après 25 générations dans des flacons et après une fermentation de 30 1 a montré que > 95 % des bactéries étaient positives pour l'AgO montrant ainsi la rétention de ce plasmide.

Production à l'échelle pilote et caractérisation des 1790-GMMA

Trois séries d'uniformité de 30 1 ont été effectuées. Pour chaque lot, le procédé de fermentation optimisé à 30 1 a été stoppé lorsque la D0600 a été d'approximativement 35, en 20 ± 4 heures à partir de l'inoculation du bioréacteur, lorsqu'une surcharge de pC>2 dissous est survenue et que le pH a commencé à augmenter. Au terme de la fermentation, la culture a été récoltée par microfiltration. Ensuite, les GMMA ont été purifiés par ultrafiltration. Le procédé a été transféré à un organisme de fabrication sous contrat externe pour la production de deux lots GMP de 17 90GMMA. Le lot GMP a été produit à une échelle de 25 1. Les données sont présentées pour l'un des lots d'uniformité produits au NVGH, le lot de 1790-GMMA NVGH1883 (lot de référence) , et pour les

BE2016/5444 deux substances médicamenteuses GMP, lot 1112 et lot

1014 de 1790-GMMA.

Rendement et caractérisation des GMMA

Taille et intégrité

Par microscopie électronique, les GMMA purifiés provenant des références et des lots GMP ont présenté des particules avec une distribution bimodale des tailles. La majorité des particules sont petites avec une taille moyenne d'approximativement 25 à 40 nm de diamètre. Une fraction mineure des particules était plus grande avec des tailles situées entre 65 et 140 nm (16 % des particules).

L'analyse dimensionnelle par diffusion dynamique de la lumière (DDL) en utilisant un Zetasizer Malvern Nano a donné une valeur Z moyenne de 117 nm, 113 nm et 116 nm pour la référence et les deux lots GMP, respectivement. Des résultats pour l'indice de polydispersité de 0,19, 0,21 et 0,20 ont été obtenus pour la référence et les deux lots GMP, respectivement. De façon importante, les résultats de DDL ont été inchangés par des cycles multiples de congélation/ décongélation ou un stockage à -80 °C indiquant que les GMMA sont demeurés intacts et ne se sont pas agrégés dans ces conditions. Ainsi, les 1790-GMMA ont été stockés en routine à -80 °C avant la formulation.

Rendement

La référence et les deux lots GMP ont donné un rendement final de 2,4 g de protéines (à partir de 30 1), de 1,7 g de protéines (à partir de 25 1) et de 0,42 g de protéines (à partir de 25 1) dans les GMMA purifiés, respectivement. Ces lots contenaient 145 mg,

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106 mg et 25 mg d'AgO, respectivement, avec des rapports d'AgO sur protéines presque identiques (60,3 pg/mg, 63,6 pg/mg et 59,0 pg/mg). Les deux autres lots d'uniformité (à partir de 30 1) ont été similaires : rendement, 2,0 g et 3,2 g ; rapport d'AgO sur protéines, 61,6 pg/mg et 50,3 pg/mg, respectivement.

Profil des protéines

Le profil de SDS-PAGE des protéines des 1790-GMMA a été similaire à celui observé dans des études précédentes [22,36]. Les bandes dominantes à une taille d'approximativement 39 kDa ont été identifiées comme l'OmpA et 1'OmpC par une analyse de spectrométrie de masse.

Profil du LPS et de l'antigène O

La SDS-PAGE colorée à l'argent du LPS extrait de la référence et des lots GMP a montré une échelle de LPS avec une distribution bimodale (données non présentées). Les bandes prédominantes étaient du LPS de poids moléculaire bas avec jusqu'à 5 répétitions d'AgO ; du LPS de poids moléculaire moyen a été visible sous la forme d'une fraction mineure. Ces données étaient cohérentes avec la chromatographie d'exclusion analytique de l'AgO/cœur extrait en utilisant la détection de l'indice de réfraction (données non présentées). Le pic dominant était le polysaccharide de poids moléculaire bas. Cette distribution des tailles du LPS principalement de poids moléculaire bas dans les 1790-GMMA est de façon marquée différente de la taille dans le LPS de référence dérivé de la souche parente sans la modification du LPS (1859-GMMA) qui présente une moyenne de 33 répétitions mesurée par RMN.

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La composition du core du LPS a été déterminée par une analyse HPAEC-PAD. Ce procédé a démontré que le rapport molaire du galactose sur le glucose dans le LPS présent dans les 1790-GMMA est de 2/4, tandis que dans les GMMA provenant de la souche parente sans la modification du LPS (1859-GMMA), le rapport était de 2/3 et similaire aux souches de type sauvage de S. sonnei [22]. Le changement de teneur en glucose dans le cœur de LPS des 17 90-GMMA a été confirmé par une analyse d'un troisième sucre du cœur de LPS, le KDO terminal. Dans les 1790-GMMA et les 1859-GMMA, le rapport du galactose sur le KDO a été identique. Le rapport du glucose sur le KDO a différé confirmant une teneur supérieure en glucose dans le cœur de LPS des 1790-GMMA.

Structure du lipide A

La structure du lipide A purifié à partir du lot de référence a été déterminée par spectroscopie de masse en utilisant MALDI-TOF (données non présentées). Les spectres enregistrés ont montré un lipide A pentaacylé correspondant au pic le plus élevé et à plusieurs autres pics dus à sa fragmentation (c'est-à-dire, la perte d'une ou de plusieurs chaînes d'acides gras), à la formation d'agrégats avec le sodium (+23 m/z) et à la déphosphorylation (-80 m/z). Il n'a été détecté aucun lipide A hexa- ou hepta-acylé par MALDI-TOF.

Production d'IL-6 dans le test MAT

Les 1859-GMMA contenant un LPS non modifié ont induit des taux élevés de libération d'IL-6 à partir des CMSP, provoquant une augmentation de 10 fois de la libération d'IL-6 par rapport au bruit de fond à une

BE2016/5444 concentration de 0,004 ng de protéines/ml, tandis que les 1790-GMMA, contenant un LPS penta-acylé, ont nécessité une concentration 600x supérieure (2,37 ng de protéines/ml) pour provoquer la même libération d'IL-6.

Test de pyrogénicité intramusculaire

Les augmentations moyennes de la température observées aux différents intervalles jusqu'à 7 h, et à 24 h après la vaccination chez les 12 lapins recevant les vaccins à base de GMMA (6 dans la première étude recevant le lot de toxicologie, 3 dans la seconde étude recevant le lot de toxicologie et 3 recevant le lot clinique) sont représentées sur la figure 1 comparativement à l'augmentation moyenne de la température des 6 animaux recevant le sérum physiologique. L'augmentation moyenne de la température dans le groupe du vaccin a encore augmenté au point final normal de 3 heures pour un test de pyrogénicité intraveineux. Après 5 h, l'augmentation moyenne de la température chez les animaux témoins a montré une augmentation significative et la différence entre les groupes du vaccin et témoin a diminué. A 24 h, les groupes du vaccin et témoin n'étaient pas significativement différents (le groupe du vaccin a présenté une augmentation moyenne de la température inférieure). En se basant sur ces résultats, 4 h a été choisi comme point de temps définitif. En utilisant les critères développés comme il a été détaillé ci-dessus, le groupe de la toxicologie et les deux groupes des vaccins cliniques ont passé le test de pyrogénicité sans nécessiter de répétition du test. « L'augmentation moyenne de la température maximale » sur les

BE2016/5444 premières heures après l'administration du lot de toxicologie et des deux lots cliniques ont été, respectivement, de 0,48 °C, 0,53 °C et 0,40 °C. Pour les groupes témoins, la valeur a été de 0,27 °C.

Etude de toxicologie

Il n'y a eu aucune mortalité, aucun signe clinique associé au traitement et aucun changement de poids corporel ou de consommation d'aliments chez les lapins traités avec le vaccin 1790GAHB ou le GAHB-Placebo. Il n'y a eu aucune observation ophtalmologique associée au traitement. Aucun changement de poids d'organe considéré comme étant associé à l'administration soit du vaccin soit du placebo n'a été noté au jour 44 ou au jour 56 (c'est-à-dire, 2 ou 14 jours après la vaccination finale). Le vaccin a été localement bien toléré par les voies intranasale et intramusculaire sans aucune réaction locale observée par la voie IN et des réactions locales très légères (érythème, œdème) jusqu'à modérées (œdème) observées chez certains des lapins après l'administration IM. L'administration ID a induit des réactions locales très légères à modérées (induration, érythème et œdème) qui n'ont pas été plus prononcées dans le groupe des 17 90GAHB que dans le groupe du GAHB-Placebo correspondant. La réactogénicité locale s'est complètement ou partiellement résolue dès la fin de la phase de récupération de deux semaines au niveau des sites d'injection IM mais pas au niveau du site d'injection ID. Toutefois, la tolérance au vaccin par l'administration ID est demeurée acceptable. Des changements inflammatoires de faible gravité et amplitude y compris dans les ganglions lymphatiques

BE2016/5444 significative recevant les drainants et la rate ont été notés lors de l'examen histopathologique ; ces changements se corrélaient avec les augmentations de la protéine C réactive et du fibrinogène et étaient cohérents avec cette réponse pharmacologique à un immunogène. Les changements des paramètres de pathologie clinique et les changements microscopiques minimes à modérés se sont généralement résolus dès la fin de la période de récupération dans les groupes traités par voie IN et ID alors que ceux observés dans le groupe traité par voie IM ont légèrement diminué, indiquant qu'une récupération depuis des changements inflammatoires était en cours.

Il y a eu une augmentation statistiquement de la température chez les lapins 1790GAHB par IM comparativement aux groupes du placebo par IM. Ceci n'a été observé que pour les groupes IM et principalement chez les mâles. Après la première vaccination IM, il y a eu une augmentation moyenne de la température de 0,43 °C pour les 1790GABH contre 0,12 °C pour le placebo (p = 0,009, test t) à 2 heures et de 0,64 °C pour les 1790GAHB contre 0,38 °C pour le placebo (p = 0,005, test t) à 6 h comparativement à la pré-vaccination. A 24 h après l'injection, il n'y a eu aucune différence dans ces groupes (augmentations de 0,21 et 0,22 °C comparativement aux températures initiales avant la vaccination, respectivement). Des augmentations similaires de la température ont été observées dans les groupes IM à la suite des 3ème et 4ème injections (augmentations de la température de 0,44 contre 0,11 °C et de 0,63 contre 0,33 °C à 6 h comparativement à la

BE2016/5444 pré-vaccination pour les 1790GAHB contre le placebo). Une augmentation plus petite mais statistiquement non significative a été observée à la suite de la deuxième immunisation (0,28 contre 0,14 °C à 6 h comparativement à la pré-vaccination). Alors que les différences ont été considérées comme étant associées aux 1790GAHB, au vu de la très faible amplitude de la variation et de la courte période des augmentations, l'effet n'a pas été considéré comme étant toxicologiquement pertinent.

Etude d'Irwin

L'étude d'Irwin chez des rats pour estimer les effets neurotoxiques de la vaccination IN à la suite d'une seule administration de 1790GAHB n'a montré aucun effet pertinent sur une batterie de paramètres comportementaux et physiologiques couvrant les fonctions principales du système nerveux central et périphérique.

Immunogénicité et puissance chez les souris

L'étude d'immunogénicité initiale a évalué 7 doses différentes de 1790GAHB augmentant de 4 fois de 29 ng à 238 pg de protéines (1,75 ng à 14,35 pg d'AgO) par voie intrapéritonéale et a montré que le vaccin a été hautement immunogène. L'anticorps a été détectable à toutes les doses après une seule injection et a été réactivé à la suite d'une seconde injection. 1,86 pg de protéines (0,11 pg d'AgO) a déclenché la réponse maximale en anticorps. En se basant sur ces résultats, il a été développé un protocole d'immunogénicité pour former la base de tests de puissance et pour estimer la stabilité dans le temps, jugée par la puissance. La conception finale de l'étude de puissance a utilisé

BE2016/5444 quatre doses augmentant de 4 fois de 1790GAHB de 29 ng à 1,86 pg de protéines dans des groupes de 8 souris avec des taux sériques d'IgG estimés par un test ELISA sur le LPS avec l'AgO homologue trois semaines après une seule immunisation. Une préparation de 1790GAHB de référence a été fraîchement formulée pour chaque étude de puissance, et administrée aux mêmes doses que le vaccin à tester. Les courbes dose-réponse des taux d'anticorps déclenchés par le vaccin à tester et l'étalon de référence ont été comparées. Il n'y a pas eu de différences significatives de la pente ou de l'intersection à l'origine de la régression linéaire des anticorps anti-LPS transformés en log sur la dose en log montrant que le lot de stabilité du vaccin avait la même puissance que le matériau de référence fraîchement formulé.

Immunogénicité chez des lapins

La réponse en IgG chez les lapins d'après les études de toxicologie a été estimée à la suite de chaque vaccination et au prélèvement de sang final. Les trois voies ont donné des taux élevés d'IgG anti-LPS circulantes (données non présentées). La réponse maximale a été obtenue 14 jours à la suite d'une seule injection IM d'une dose de 100 pg de 1790GAHB. Pour la voix IN, la réponse en anticorps maximale a nécessité deux immunisations. Les taux d'IgG anti-LPS circulantes 14 jours après la vaccination finale n'ont pas été significativement différents du taux obtenu avec l'administration par voie IM de la dose de 100 pg de 17 90GAHB. La vaccination avec 10 pg par voie ID a également donné une augmentation de la réponse avec les

BE2016/5444 vaccinations subséquentes (test des rangs de Spearman p < 0,0001) mais l'effet a été moins prononcé qu'avec la voie IN. Les taux finaux d'IgG anti-LPS circulantes ont été significativement supérieurs par la voie ID comparativement à la voie IM (test t des anticorps transformés en log p = 0,002).

Essai clinique en phase I avec S. sonnei 1790GAHB

Cet essai clinique a été effectué pour évaluer l'innocuité et l'immunogénicité de 3 doses d'un vaccin candidat contre Shigella sonnei (vaccin 1790GAHB) lorsqu'il est administré à des dosages différents chez des adultes en bonne santé (âgés de 18 à 45 ans à l'enrôlement). Le profil d'innocuité du vaccin 1790GAHB est évalué comparativement à celui du placebo (GAHBPlacebo) , constitué d'une suspension d'hydroxyde d'aluminium ayant la même concentration que les formulations vaccinales de l'étude. Les sujets ont été randomisés pour recevoir trois vaccinations, à quatre semaines d'écart, soit du vaccin 1790GAHB (à cinq concentrations de l'antigène) soit du placebo GAHB.

Souche productrice

Shigella sonnei contenant les modifications génétiques suivantes : AtolR : rompt la liaison entre la membrane interne et externe pour donner une grande quantité de blebs de la membrane externe (GMMA) ; AhtrB : pour réduire la réactogène cité du LPS ; virG nadA/B knock-in (activation) : stabilise le plasmide de virulence codant pour l'antigène O (AgO).

Quantité maximale par dose de 0,5 ml (i.m.)

100 pg de protéines de GMMA

6,1 pg d'AgO

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0,35 mg d'aluminium comme ALHYDROGEL®

Dans du sérum physiologique isotonique tamponné par du Tris

Placebo par dose de 0,5 ml (i.m.)

0,35 mg d'aluminium comme ALHYDROGEL®

Dans du sérum physiologique isotonique tamponné par du Tris

Doses inférieures pour l'administration préparées en diluant la dose maximale dans le placebo

Volume d'injection : i.m. : 0,5 ml

Cohorte	Voie	Dose (AgO/ Protéines)	1790GAHB Nb de sujets	Placebo Nb de sujets	Estimation immunologique
A	IM	0,061/1 pg	8	2	IgG sériques
B	IM	0,31/5 pg	8	2
C	IM	1,4/25 pg	8	2
D	IM	3,0/50 pg	8	2
E	IM	6,1/100 pg	8	2

Toutes les doses de 1790GAHB ont été bien tolérées et les données d'innocuité supportent l'utilisation de L 100 pg de protéines de 1790GAHB lors d'une administration par la voie IM. L'estimation sérologique indique que des taux sériques suffisants d'IgG anti-LPS de S. sonnei sont déclenchés un mois après la première, la deuxième et la troisième vaccination chez les sujets recevant 25 pg, 50 pg et 100 pg de 1790GAHB (figure 2(a) et (b)). Le taux médian des anticorps dans ces groupes est supérieur à celui observé dans le sérum des convalescents. Ces données supportent l'utilisation des 1790GAHB en tant que vaccin à base de GMMA pour S. sonnei et d'une combinaison de quatre à six GMMA différents dans une

BE2016/5444 formulation multivalente, en supposant des profils de réactogénicité-immunogénicité similaires aux 1790GAHB.

Estimation de l'immunogénicité du vaccin multivalent contre Shigella (I) chez des souris

Dans cette étude, un vaccin multivalent à base de GMMA de Shigella a été testé, spécifiquement une formulation de ALHYDROGEL® contenant des GMMA provenant des 4 sérotypes les plus prévalents de l'étude GEMS, S. sonnei, et S. flexneri 2a, 3a, et 6.

Pour cet objectif, la production de GMMA par des souches de S. flexneri a été amplifiée par la délétion de tolR comme dans S. sonnei et la réactogénicité du LPS a été réduite par modification génétique du lipide A par l'intermédiaire de la délétion du gène htrB. Une formulation de ALHYDROGEL® a été choisie pour la formulation tétravalente et les formulations simples de GMMA en se basant sur l'expérience avec les 1790GAHB chez des lapins que 1'adsorption sur l'hydroxyde d'aluminium amplifie la tolérance. Cette étude a été la première étude d'immunogénicité pour les sérotypes de S. flexneri. Les formulations ont été préparées en se basant sur la teneur en protéines comme il a été utilisé pour les 1790GAHB. En se basant sur la caractérisation biochimique, les GMMA de S. flexneri 2a contiennent approximativement 10 fois plus d'AgO par mg de protéines que les 1790-GMMA. Ainsi, une concentration de départ 10 fois inférieure à celle dans l'étude de puissance des 1790GAHB réguliers (29 ng, voir ci-dessus) a été choisie. Des doses similaires ont été établies pour les GMMA de S. flexneri 3a et les GMMA de S. flexneri 6. La réponse à l'AgO avec une

BE2016/5444 seule formulation de GMMA (S. sonnei ou S. flexneri 2a, 3a ou 6) a été comparée à la réponse au même AgO déclenchée par la formule tétravalente. La forte immunogénicité de tous les composants compris dans la formulation tétravalente fournira la preuve du concept d'immunogénicité pour une formulation multivalente et supportera un autre développement d'une formulation multivalente d'AgO-GMMA.

Dans la formule tétravalente, chacun des composants est présent à la même concentration que dans les formulations simples décrites auparavant. Ainsi, la teneur en protéines totales de la formulation tétravalente est de 160 pg/ml. Pour la formulation tétravalente, les GMMA de S. sonnei, les GMMA de S. flexneri 2a, les GMMA de S. flexneri 3a et les GMMA de S. flexneri 6 sont mélangés à la même concentration puis formulés avec de 1'hydroxyde d'aluminium comme il a été spécifié ci-dessus. Le placebo diluant GAHB ALHYDROGEL® contenait : ALHYDROGEL® dans du sérum physiologique tamponné par du Tris aux mêmes concentrations que dans les 1790GAHB (ALHYDROGEL® 0,7 mg de Al³⁺/ml, 10 mM de Tris, pH 7,4, 9 g/1 de chlorure de sodium).

Immunisation

Des souris BALB/c (8 par groupe) ont été immunisées par voie intrapéritonéale au jour 0 avec 4 doses différentes des formulations, comme il est décrit dans le tableau ci-dessous. Un groupe a été immunisé avec le diluant ALHYDROGEL® (GAHB-Placebo) en tant que témoin. Toutes les formulations ont été testées pour une contamination bactérienne avant l'immunisation. En bref, 50 μΐ de chaque formulation ont été déposés sur des plaques de gélose LB en triple et après 24 h d'incubation à 37 °C, les plaques ont été examinées pour la croissance. Seules les formulations sans aucune croissance bactérienne ont été utilisées pour l'immunisation.

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No. du groupe	No. des souris	Nom de 1'antigène	Dosage de 1'antigène (en protéines)	Adj uvant (0,35 mg de Al3+ par dose)	VPA	Voie
1	1-8	S. sonnei (1790GÄHB)	2 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
2	9-16	S. flexneri 2a	2 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
3	17-24	S. flexneri 3a	2 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
4	25-32	S. flexneri 6	2 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
5	33-40	Combinaison tetravalente	8 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
6	41-48	S. sonnei (1790GAHB)	20 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
7	49-56	S. flexneri 2a	20 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
8	57-64	S. flexneri 3a	20 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
9	65-72	S. flexneri 6	20 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
10	73-80	Combinaison tétravalente	80 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
11	81-88	S. sonnei (1790GAHB)	200 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
12	89-96	S. flexneri 2a	200 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
13	97-104	S. flexneri 3a	200 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
14	105-112	S. flexneri 6	200 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
15	113-120	Combinaison tétravalente	800 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
16	121-128	S. sonnei (1790GAHB)	2000 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
17	129-136	S. flexneri 2a	2000 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
18	137-144	S. flexneri 3a	2000 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
19	145-152	S. flexneri 6	2000 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
20	153-160	Combinaison tétravalente	8000 ng	Alhydrogel	500 μΐ	IP
21	161-168	GAHB-Placebo	-	Alhydrogel	500 μΐ	IP

Prélèvement de sang pour la sérologie : du sang a 10 été obtenu au jour 21 de tous les animaux, les sérums

BE2016/5444 ont été recueillis et les sérums ont été stockés à une température de 2 à 8 °C jusqu'au test.

Test ELISA

Des tests ELISA ont été effectués pour déterminer les taux d'anticorps anti-LPS de S. sonnei, anti-AgO de S. flexneri 2a, anti-AgO de S. flexneri 3a, anti-AgO de S. flexneri 6 de souris immunisées respectivement avec des GMMA formulés avec ALHYDROGEL® provenant de S. sonnei, S. flexneri 2a, S. flexneri 3a et S. flexneri 6 administrés seuls ou faisant partie d'un vaccin tétravalent. Les résultats pour S. sonnei, S. flexneri 2a et S. flexneri 3a sont présentés sur les figures 3 et 4.

Les souris immunisées avec des concentrations croissantes de 1790GAHB ont développé des anticorps spécifiques anti-LPS de S. sonnei (mesurés en unités ELISA) qui ont donné un rang de Spearman significatif avec P < 0,0001 (alpha = 0,05) et un coefficient de corrélation de 0,86, les souris immunisées avec des concentrations croissantes de la formulation tétravalente ont développé des anticorps spécifiques anti-LPS de S. sonnei (mesurés en unités ELISA) avec un rang de Spearman significatif avec P < 0,0001 (alpha = 0,05) et un coefficient de corrélation de 0,86.

Les souris immunisées avec des concentrations croissantes de S. flexneri 3a ont développé des anticorps spécifiques anti-AgO de S. flexneri 3a avec un rang de Spearman significatif avec P < 0,0001 (alpha = 0,05) et un coefficient de corrélation de 0,84. De façon similaire, les souris immunisées avec des concentrations croissantes de la formulation

BE2016/5444 tétravalente ont développé des anticorps spécifiques anti-AgO de S. flexneri 3a OAg avec un rang de Spearman significatif avec P < 0,0001 (alpha = 0,05) et un coefficient de corrélation de 0,73. La DO ELISA des anticorps anti-AgO de S. flexneri 2a obtenue avec les sérums de souris immunisées avec des concentrations croissantes de S. flexneri 2a a donné un rang de Spearman significatif avec P < 0,0001 (alpha = 0,05) et un coefficient de corrélation de 0,75. En outre, les souris immunisées avec des concentrations croissantes de la formulation tétravalente ont développé des anticorps anti-AgO de S. flexneri 2a qui ont présenté un rang de Spearman significatif avec P < 0,0001 (alpha = 0,05) et un coefficient de corrélation de 0,75. Les résultats des comparaisons des courbes dose-réponse respectives sont présentés sur la figure 4. Il n'a été observé aucune différence significative entre elles pour n'importe quelle réponse spécifique d'un sérovar

entre la formulation simple de GMMA et	la	formulation
tétravalente indiquant qu'il n'y	a	eu aucune
interférence.
Analyse FACS
Les antisérums produits contre	la	formulation
tétravalente de GMMA ont reconnu	les	S. sonnei,

S. flexneri 2a, S. flexneri 3a et S. flexneri 6 de type sauvage. Tandis que les antisérums produits contre les GMMA individuels ont reconnu la souche bactérienne homologue.

Conclusions

La réponse en anticorps sériques contre le sérovar spécifique de Shigella déclenchée par la formulation

BE2016/5444 tétravalente de Shigella n'a pas été différente des composants individuels. Ainsi, il n'existe aucune preuve d'interférence.

Vaccin multivalent contre Shigella (II)

Un vaccin multivalent à base de GMMA de Shigella est exemplifié, spécifiquement une formulation de ALHYDROGEL® contenant des GMMA provenant de S. sonnei, et S. flexneri lb, 2a, 3a, et 6.

La production de GMMA par les souches de S. flexneri est amplifiée par la délétion de tolR comme dans S. sonnei et la réactogénicité du LPS est réduite par modification génétique du lipide A par l'intermédiaire de la délétion du gène soit msbB soit htrB. Comme précédemment, une formulation de ALHYDROGEL® est choisie pour la formulation pentavalente et les formulations simples de GMMA en se basant sur l'expérience avec les 17 90GAHB chez des lapins que 1'adsorption sur de 1'hydroxyde d'aluminium amplifie la tolérance.

Dans la formulation pentavalente, chacun des composants est présent à la même concentration que dans les formulations simples décrites au préalable. Pour la formulation pentavalente, les GMMA de S. sonnei, les GMMA de S. flexneri lb, les GMMA de S. flexneri 2a, les GMMA de S. flexneri 3a et les GMMA de S. flexneri 6 sont mélangés aux mêmes concentrations puis formulés avec de 1'hydroxyde d'aluminium comme il a été spécifié ci-dessus.

Vaccin multivalent contre Shigella (III)

Un vaccin multivalent à base de GMMA de Shigella est exemplifié, spécifiquement une formulation de

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ALHYDROGEL® contenant des GMMA provenant de S. sonnei, et S. flexneri lb, 2a, 2b, 3a, et 6.

La production de GMMA par les souches de S. flexneri est amplifiée par la délétion de tolR comme dans S. sonnei et la réactogénicité du LPS est réduite par modification génétique du lipide A par l'intermédiaire de la délétion du gène soit msbB soit htrB. Comme précédemment, une formulation de ALHYDROGEL® est choisie pour la formulation hexavalente et les formulations simples de GMMA en se basant sur l'expérience avec les 1790GAHB chez des lapins que 1'adsorption sur de 1'hydroxyde d'aluminium amplifie la tolérance.

Dans la formulation hexavalente, chacun des composants est présent à la même concentration de protéines ou d'AgO que dans les formulations simples décrites au préalable. Pour la formulation hexavalente, les GMMA de S. sonnei, les GMMA de S. flexneri lb, les GMMA de S. flexneri 2a, les GMMA de S. flexneri 2b, les GMMA de S. flexneri 3a et les GMMA de S. flexneri 6 sont mélangés aux mêmes concentrations puis formulés avec de 1'hydroxyde d'aluminium comme il a été spécifié ci-dessus.

Combinaisons spécifiques

A) Une composition immunogène comprenant (a) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella sonnei 53G AtolR, AhtrB, virG: :nacLAB, (b) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 2a 2457T AtolR, AmsbBl, (c) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 3a 6885 AtolR, AmsbBl, (d) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 6

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10.8537 AtolR, AhtrB AmsbBl et (e) un adjuvant d'aluminium, dans laquelle les GMMA comprennent un lipide A modifié et dans laquelle les souches de Shigella flexneri sont dépourvues du plasmide de virulence.

B) Une composition immunogène comprenant (a) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella sonnei 53G AtolR, AhtrB, virG: :nadAB, (b) des GMMA purifiés à partir de Shigella flexneri 2a 2457T AtolR, AmsbBl, (c) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 3a 6885 AtolR, AmsbBl, (d) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 6 10.8537 AtolR, AmsbBl, (e) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri lb STANSFIELD AtolR, AmsbBl et (f) un adjuvant d'aluminium, dans laquelle les GMMA comprennent un lipide A et dans laquelle les souches de Shigella flexneri sont dépourvues du plasmide de virulence.

C) Une composition immunogène comprenant (a) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella sonnei 53G AtolR, AhtrB, virG: :nadAB, (b) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 2a 2457T AtolR, AmsbBl, (c) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 3a 6885 AtolR, AmsbBl, (d) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 6

10.8537 AtolR, AmsbBl, (e) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 2b 69/50 AtolR, AmsbBl et (f) un adjuvant d'aluminium, dans laquelle les GMMA comprennent un lipide A et dans laquelle les souches de Shigella flexneri sont dépourvues du plasmide de virulence.

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D) Une composition immunogène comprenant (a) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella sonnei 53G AtolR, AhtrB, virG::nadAB, (b) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 2a 2457T AtolR, AmsbBl, (c) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 3a 6885 AtolR, AmsbBl, (d) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 6

10.8537 AtolR, AmsbBl, (e) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri lb STANSFIELD AtolR, AmsbBl, (f) des GMMA purifiés à partir d'un mutant de Shigella flexneri 2b 69/50 AtolR, AmsbBl et (g) un adjuvant d'aluminium, dans laquelle les GMMA comprennent un lipide A et dans laquelle les souches de Shigella flexneri sont dépourvues du plasmide de virulence.

E) La composition immunogène de (A) , (B) , (C) ou (D) dans laquelle l'adjuvant est 1'hydroxyde d'aluminium, par exemple, ALHYDROGEL®.

F) La composition immunogène de l'une quelconque de (A) , (B) , (C) , (D) ou (E) qui comprend au moins un ou plusieurs supports et/ou excipients pharmaceutiques.

G) La composition immunogène de F qui est une composition pharmaceutique ou vaccinale.

H) La composition pharmaceutique ou vaccinale de G pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par Shigella chez un animal, particulièrement un être humain.

Alors que certains modes de réalisation de la présente invention ont été décrits et exemplifiés spécifiquement ci-dessus, il n'est pas prévu que l'invention soit limitée à de tels modes de réalisation

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Diverses modifications peuvent y être s'écarter de l'étendue et de l'esprit invention telle que présentée dans les suivantes.

apportées sans de la présente revendications

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Claims (15)

1. REVENDICATIONS

   1. Composition immunogène comprenant (a) des GMMA purifiés de Shigella sonnei, (b) des GMMA purifiés de Shigella flexneri et (c) un adjuvant, dans laquelle les GMMA comprennent un lipide A modifié.
2. 2. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle le lipide A modifié est un lipide A penta-acylé.
3. 3. Composition immunogène selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les GMMA de Shigella flexneri sont purifiés à partir d'au moins une souche choisie dans le groupe constitué de 2a, 3a et 6.
4. 4. Composition immunogène selon la revendication 3, la composition immunogène comprenant des GMMA de Shigella flexneri purifiés à partir de chacune des souches 2a, 3a et 6.
5. 5. Composition immunogène selon la revendication 4, dans laquelle les GMMA sont purifiés à partir de (a) Shigella sonnei AtolR, AhtrB, virG::nadAB, (b) Shigella flexneri 2a AtolR, AmsbB ou Shigella flexneri 2a AtolR, AhtrB, (c) Shigella flexneri 3a AtolR, AmsbB ou Shigella flexneri 3a AtolR, AhtrB et (d) Shigella flexneri 6 AtolR, AmsbB ou Shigella flexneri 6 AtolR, AhtrB.
6. 6. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la souche de S. sonnei est S. sonnei 53G.
7. 7. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la ou les souches de S. flexneri sont choisies dans le groupe

   BE2016/5444 constitué de S. flexneri 2457T (2a), S. flexneri 6885 (3a) et S. flexneri 10.8537 (6).
8. 8. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, ladite composition comprenant au moins une autre souche de Shigella flexneri choisie dans le groupe constitué de lb et 2b.
9. 9. Composition immunogène selon la revendication 8, dans laquelle l'autre ou les autres souches de Shigella flexneri sont choisies dans le groupe constitué de S. flexneri STANSFIELD (sérotype lb) et S. flexneri 69/50 (sérotype 2b).
10. 10. Composition immunogène selon la revendication 4, dans laquelle au moins deux des quatre types de GMMA sont présents dans un rapport de 1/4 à 4/1.
11. 11. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'adjuvant est l'hydroxyde d'aluminium.
12. 12. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle au moins 75 % des GMMA ont un diamètre situé dans la plage de 25 nm à 40 nm.
13. 13. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite composition comprenant au moins un ou plusieurs supports et/ou excipients pharmaceutiques.
14. 14. Composition immunogène selon la revendication 13, ladite composition étant une composition pharmaceutique ou vaccinale.
15. 15. Composition pharmaceutique ou vaccinale selon la revendication 14 pour une utilisation dans la

    BE2016/5444 prévention ou le traitement d'une infection Shigella chez un animal, particulièrement un humain.

    par être

    BE2016/5444

    Augmentation de la température après injection (°C)

    Temps après l'injection (heures)