JP6930927B2 - 免疫原性組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、志賀赤痢菌、S.フレキシネリ、S.ボイディ及びS.ソネイの血清型の1種以上から選択されるシゲラ細菌の使用に基づく。特に、本発明は、S.フレキシネリ及びS.ソネイの血清型から選択される、特にS.ソネイ、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及びS.フレキシネリ6からなる群から選択されるシゲラの少なくとも2種の菌株の使用に基づく。ある特定の実施形態では、S.ソネイ53G、S.フレキシネリ1b STANSFIELD、S.フレキシネリ2a 2457T、S.フレキシネリ2b 69/50、S.フレキシネリ3a 6885及び又はS.フレキシネリ6 10.8537を使用してもよい。
本発明において使用するシゲラ細菌は、その対応する野生型菌株に対して、高ブレブ形成性である、すなわち、シゲラ細菌は、野生型菌株よりも多量のGMMAを培養培地中に放出する。これらのGMMAは、本発明のシゲラワクチンの構成成分として有用である。用語GMMAは、従来の界面活性剤により抽出した外膜ベシクル(dOMV)、及びグラム陰性細菌から自然発生的に放出される天然外膜ベシクル(NOMV)と明確な区別を与えるために使用される。GMMAは、2つの重要な態様においてNOMVと異なる。第一に、GMMA形成を誘導するために、主要構造構成成分をコードする遺伝子、具体的にはtolRの欠失により膜構造が改変されている。第二に、遺伝子改変の結果として、多量の外膜が「出芽(bud off)」(出芽(bud)に対するイタリア語は「gemma」である)し、ワクチン産生のための膜材料の実用的供給源をもたらし、製造容易性増加と有効なコスト低減をもたらす。NOMVは免疫原性研究に使用されてきたが、実用的ワクチンとしては収率が低すぎる。
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも2、3、3、4、5又は6つの異なるシゲラ菌株から精製したGMMAを含んでもよい。特に、免疫原性組成物は、シゲラ・ソネイ及びシゲラ・フレキシネリから精製したGMMAを含む。シゲラ・フレキシネリGMMAは、2a、3a及び6からなる群から選択される少なくとも1種の菌株から精製してもよい。特に、免疫原性組成物は、菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを含む。免疫原性組成物は、1b及び2bからなる群から選択される少なくとも1種の菌株から精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを更に含み得る。一実施形態では、免疫原性組成物は、(a)シゲラ・ソネイ、(b)シゲラ・フレキシネリ2a、(c)シゲラ・フレキシネリ3a及び(d)シゲラ・フレキシネリ6から精製したGMMAを含む。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、シゲラ・ソネイ53G、シゲラ・フレキシネリ2a 2457T、シゲラ・フレキシネリ3a 6885及びシゲラ・フレキシネリ6 10.8537並びに任意選択でシゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD及び/又はシゲラ・フレキシネリ2b 69/50から精製したGMMAを含む。
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体を更に含んでもよい。典型的な「薬学的に許容される担体」は、それ自体が、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の生成を誘導しない任意の担体を含む。適切な担体は、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖、トレハロース、ラクトース、及び脂質凝集体(油滴又はリポソーム等)等の大きく、ゆっくりと代謝される高分子である。このような担体は当業者に周知である。本発明の免疫原性組成物は、希釈剤、例えば水、食塩水、グリセロール等を含有してもよい。更に、補助剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質等が存在していてもよい。リン酸緩衝食塩水中のリン酸がアルミニウムへのGMMAの結合を妨げる場合があるため、特に、アルミニウムアジュバントを使用する場合は、滅菌発熱性物質除去Tris緩衝生理食塩水が好ましい担体である。
本発明は、哺乳動物の免疫反応を上昇させるための方法であって、本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法も提供する。免疫反応は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体を含む。この方法は、ブースター反応を上昇させてもよい。
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」及び「からなる(consisting)」を包含し、例えばXを「含む(comprising)」組成物は、排他的にXからなってもよく、又は付加的なものを含んでもよい(例えば、X+Y)。
S.ソネイ菌株の生成
S.ソネイ53G [15]を親株として選択した。S.ソネイ菌株NVGH1859(S.ソネイ53G ΔtolR::kan ΔvirG::nadAB)を、S.ソネイ53G ΔtolR::kan[17]のプラスミドにコードされたvirG遺伝子[16]を大腸菌由来の遺伝子nadA及びnadB[18]で置き換えることによって得た。virGの上流及び下流領域を、プライマー対virGup-5/virGup-3(上流)及びvirGdown-5/virGdown-3(下流)を使用して増幅した(表1)。「nadAB」カセットは、プライマー対nadA-5/nadA-3及びnadB-5/nadB-3(表1)を使用して大腸菌由来のnadA及びnadBを増幅することによって生成した。nadAとnadBを連結させ、virGの隣接領域で挟むように、断片をpBluescript(Stratagene)に挿入した。置き換えた構築物(virGup-nadAB-virGdown)を、プライマーvirGup-5/virGdown-3を使用して増幅し、以前に記載した組換えを起こしやすいS.ソネイΔtolR::kan[17]を形質転換するために使用した。
S.フレキシネリ突然変異体を、J Biol Chem. 2014 Sep 5; 289(36): 24922-24935に以前に記載されているように調製した。S.フレキシネリ2a 2457Tを親株として選択した。病原性プラスミドを有さないS.フレキシネリ2a由来の突然変異体の生成のために、遺伝子改変の開始前に、白色コロニーをコンゴーレッド寒天培地上の白色の外観によって選択した。病原性プラスミド(pINV)のキュアリングを、PCRを使用して、複製起点(ori)並びにプラスミドにコードされた遺伝子virG及びospD3が存在しないことによって確認した。プライマーを表2に列挙する。S.フレキシネリ2aにおけるtolRの欠失及びプラスミドをキュアリングしたS.フレキシネリ2a-pINVを生成するために、S.ソネイΔtolR突然変異体(2)の生成のために以前に記載したのと同じ戦略及びプライマーを使用した。
S.フレキシネリ1b、2b、3a及び6突然変異体を[32]に記載されている方法を採用することによって調製した。
シゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD、シゲラ・フレキシネリ2b 69/50、シゲラ・フレキシネリ3a 6885及びシゲラ・フレキシネリ6 10.8537を親株として選択した。病原性プラスミドを有さない突然変異体の生成のために、遺伝子改変の開始前に、白色コロニーをコンゴーレッド寒天上の白色の外観によって選択した。病原性プラスミド(pINV)のキュアリングを、PCRを使用して、プラスミドにコードされた病原性遺伝子、特にvirG(プライマー88/89)及びmxiA(プライマー53/54)が存在しないことによって確認した。プライマーを表3に列挙する。
シゲラ・ソネイ及びシゲラ・フレキシネリのGMMA産生菌株は、通常、炭素供給源としてグルコースを有するS.ソネイDefined Medium(SSDM, [17])で培養した。SSDMは以下のように調製した:13.3g/kgのKH2PO4、4g/kgの(NH4)2HPO4、1.7g/kgのクエン酸一水和物、2.5g/kgのL-アスパラギン酸、493mg/kgのMgSO4*H2O、2.7mg/kgのCo(NH3)6Cl3、15mg/kgのMnCl2 *4H2O、1.5mg/kgのCuCl2 *H2O、3mg/kgのH3BO3、2.5mg/kgのNa2MoO4 *2H2O、2.5mg/kgの酢酸亜鉛一水和物、0.49mg/kgのクエン酸第二鉄、50mg/kgのチアミン。グルコースは、固体培地に対して5g/kgの濃度で添加し、フラスコの培地を振盪した。発酵器での増殖のために、27.3g/kgのグルコース及び0.25g/kgのポリプロピレングリコール(PPG)を添加した。固体SSDMは18g/Lの寒天を含有した。シゲラ・フレキシネリの培地には、更にアミノ酸、ビタミン、及び高濃度の鉄を補充した。
伝達性海綿状脳症(TSE)又は他の外来性作用因子による夾雑のリスクを最小限にするために、S.ソネイ細胞株を、SSDMを用いて調製した寒天プレート上での3継代培養により、GMPの下で清浄化した、及びS.フレキシネリ株も同様に清浄化する。GMPマスター及び又はワーキングセルバンクバイアルを調製する。
発酵器又はフラスコスケールの培養からのシゲラ細菌を、0.5%のホルムアルデヒド中で固定することによってフローサイトメトリー分析のために保存した。9×104から9×105個の細胞を、シゲラ血清型についてALHYDROGEL(登録商標)を配合したGMMAに対して上昇したO抗原(OAg)又はポリクローナルマウス抗血清と反応する、一価ウサギ抗血清(デンカ生研株式会社)で染色した。結合した抗体を、フルオレセインコンジュゲートF(ab')2断片ヤギ抗ウサギ又は抗マウスIgG、IgM又はIgA(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)を使用して検出した。試料を4%のホルムアルデヒドを使用して固定し、FACScanto(商標)IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して分析した。データは、FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc.)を使用して処理した。
以下の記載は、S.ソネイ1790-GMMAの産生に基づく。プロセスがS.フレキシネリからのGMMAの産生と異なる場合、更なる指示が与えられる。
各産生バッチに対して、リサーチ又はGMPセルバンクからのシゲラ菌株を、600nmで測定した光学密度(OD600)が0.02から開始し、培地のOD600が1.5±0.5に等しくなるまで(通常は9±2時間)、SSDM中、30℃で撹拌しながら(200rpm)、振盪フラスコ内で増殖させた。バイオリアクター(Sartorius社のBiostat D75 Bioreactor中30Lのスケール、又はLP35 Bioengineering Bioreactor中25Lのスケール)中で、制御された培養条件:28%のNH4OHの添加によりpH6.7に保たれ、30℃、1分間当たり培地量当たりの通気量(vvm)が1のエアフローで30%の飽和を保って溶解された酸素、撹拌及び圧力のカスケード(200〜800rpm、50〜1250mbarg)で、2%の接種サイズから開始して最終OD600が35まで、菌株をバッチモードで培養する。
発酵ブロスに放出されたGMMAを2つの連続するタンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)ステップを使用して精製した:GMMAを含有する培養上清を細菌から分離する精密濾過、及びGMMAを可溶性タンパク質から分離する限外濾過。精密濾過ステップでは(1.2m2の0.2μm孔径セルロース膜)、バイオリアクターをTFFシステムに接続して、再循環タンクとして発酵容器を使用した。培養上清を最初に3回濃縮し、「1容量」の濃縮上清とし、続いて増殖培地中の緩衝剤(13.3g/kgのKH2PO4、4g/kgのNH4HPO4、1.7g/kgのクエン酸、4mL/LのNH4OH、pH 6.7)5容量に対する断続的な透析を行った。生理食塩水を使用することもできる。次いで、GMMAを含有する精密濾過した材料を、0.45μmのフィルターカプセル、次いで0.2μmのフィルター(Sartorius)を通して濾過し、更なる処理の前にいかなる生存可能なシゲラ細菌も存在しないことを確保した。限外濾過ステップ(1.4m2の300kDa孔径PES膜)は、濃縮、続いて、10容量のTris緩衝食塩水(TBS)、0.9%のNaCl、10mMのTris/Tris HCl pH 7.4又は0.9%w/vの塩化ナトリウムに対して精密濾過したGMMA溶液の連続透析、並びに核酸及び可溶性タンパク質の可能な実質的除去からなった。精製したGMMAの最終濃度は、製剤化プロセスに必要な濃度を得るために実施され、GMMAバルクに関する抽出可能性、溶出可能性及び細菌保持能について検証されたSartorius社の酢酸セルロース滅菌フィルターを通して濾過した。S.ソネイGMMAの3つの非GMPコンシステンシーバッチを、30Lの発酵体積から調製した。更に、2つのGMPロットを産生し、毒物学及び臨床ワクチンの更なる製造を支持するためにリリースした。S.ソネイGMMAのバルクを、外観、同一性、総タンパク質含量及び可溶性タンパク質含量、O抗原含量、LPS含量、pH浸透圧、純度及びサイズについて試験した。
GMMA懸濁液を室温で2時間絶えず撹拌しながらALHYDROGEL(登録商標)に添加し、続いてバイアルに入れることによって、GMMAを水酸化アルミニウム(ALHYDROGEL(登録商標)2%、Brenntag Biosector, Denmark)に吸着させた。GMMA ALHYDROGEL(登録商標)製剤は、TBS中に12.7μg/mLのS.ソネイO抗原、200μg/mLのGMMAタンパク質及び0.7mg/mLのALHYDROGEL(登録商標)としてのアルミニウム-III-イオン(Al3+)を含有する。ヒスチジン緩衝剤を使用することもできる。製剤を、3mLの単回用量バイアル当たり0.7mL分注した。製剤を、同一性、総タンパク質含量、アルミニウム含量、抽出可能体積、非吸着タンパク質、視覚による外観、pH、浸透圧、無菌性、免疫原性、及び発熱性について試験した。
希釈剤としても使用されるプラセボ(TBS中にALHYDROGEL(登録商標)として0.7mg/mLのAl3+を含有する)を調製し、3mLバイアル当たり0.7mLで分注した。ヒスチジン緩衝剤を使用することもできる。GAHB-プラセボを、同一性、アルミニウム含量、抽出可能体積、視覚による外観、pH、浸透圧、無菌性及び発熱性について試験した。2つのGAHB-プラセボのGMPロットを製造し、リリースした。
GMMAのタンパク質定量
菌株NVGH1790から産生されたGMMAを1790-GMMAと呼ぶ。タンパク質定量は、通常、Lowryアッセイによって実施した。GMMAのタンパク質濃度を決定するために、アッセイは、定量的アミノ酸分析で決定したタンパク質含量に関する一次1790-GMMA基準に対し、以前に[28]に記載されているように較正した二次BSA基準を使用した。したがって、全てのGMMAタンパク質濃度は、アミノ酸分析によって決定したタンパク質濃度を間接的に基準としている。Trisを含有する試料を希釈して、Lowryアッセイにおける干渉を避けるために最終Tris濃度を1mM以下とした。GMMAタンパク質定量のために、microBCAアッセイを使用することもできる。
ALHYDROGEL(登録商標)に吸着したGMMA(例えば、1790GAHB)のタンパク質定量のために、Lowry又はmicroBCAも使用し、二次BSA基準をALHYDROGEL(登録商標)に吸着させた。発色現象の後、試料を遠心分離して、上清の吸光度を決定した。GMMA調製物に吸着されなかった可溶性タンパク質を、定量的アミノ酸分析で定量した一次可溶性タンパク質基準に対して較正した二次BSA基準を使用して、186,000gで4℃で2時間限外濾過した後のALHYDROGEL(登録商標)製剤の上清中で決定した。
1790-GMMAを、SDS(Invitrogen、LDS NuPAGE試料緩衝剤)及び50mMのジチオトレイトール(DTT)を含有するドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)試料緩衝剤において100℃で10分間変性させた。3μgのタンパク質を10%(wt/vol)のポリアクリルアミドゲル(Invitrogen、Novex 10%)にロードした。3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝剤(Invitrogen)中で40mAで75分間、電気泳動を実施した。分離したタンパク質をブリリアントブルーG-コロイダルクマシー(Sigma-Aldrich)で染色し、濃度測定を使用して定量し、ImageScanner IIIソフトウェアを使用して分析した。試験試料のタンパク質プロファイルを、同じゲル上に電気泳動した基準GMMAのプロファイルと比較した。
詳細な特徴付け及びロットリリースアッセイのために、O抗原(OAg)濃度をHPAEC-PAD分析により測定した。定量は、試料中に存在する総OAgのmg重量を決定する。
HPAEC-PAD分析によるコア糖ガラクトースの定量的決定[21]を使用して、コア当たり2つのガラクトースに基づき[22]、1790-GMMAにおけるLPSの量を定量した。定量は、LPS分子のモル数を決定する。ガラクトースの標準的希釈系列を各分析において実行する。1790-GMMA及びガラクトース標準を2Mのトリフルオロ酢酸で100℃で4時間同時に処理する。試料を2〜8℃で冷やし、終夜乾燥させ、水に再度溶解させ、濾過して分析する。HPAEC-PADをCarboPac PA10カラム及びPA10 guardカラムを使用してDionex ICS3000で実施する。分離は、18mMのNaOHで溶出する均一溶媒条件を使用して実施する。S.フレキシネリのGMMAについて、LPSの定量のための一般的方法として、リピド構造中にエステルとして存在する3-ヒドロキシ脂肪酸の定量を使用する。試料のアルカリ加水分解反応とそれに続くHPLC-RP-QqQ(SRM)によって、較正曲線を製作するために3OH脂肪酸標準を使用して定量を実施する。
スクリーニング目的として、SDS-PAGE分析を使用してもよい。LPSは、改変を加えたフェノール-水方法(上記を参照のこと)を使用して精製した。GMMA(1mg/mL)を3分間沸騰させ、0.5μg/μLのプロテイナーゼK(Sigma Aldrich)を用いて60℃で終夜インキュベートし、pH8.0の飽和フェノール(Sigma Aldrich)を用いて1:1(vol/vol)で混合し、70℃で30分間インキュベートし、室温で10,000gで1時間遠心分離した。上部相を回収し、100%エタノールを用いて2:1(vol/vol)で混合し、LPSを-80℃で1時間沈殿させ、室温で12,000gで30分間遠心分離することによってペレット化した。ペレットをSpeedVacを使用して乾燥させ、水に溶解させ、LPSを12%ビス-トリスポリアクリルアミドゲル(Life technologies)で電気泳動し、Silver Quest(商標)銀染色キット(Life technologies)を使用して染色した。より正確な特徴付けのために、HPLC-SECを使用してよい。リピドA及びタンパク質を1%酢酸加水分解(2時間 100℃)/低速遠心分離(14000rcf 5分)によって試験試料から除去し、乾燥した(又は脱塩した)上清を、屈折率検出器を備えたTSK-GEL(登録商標) 3000 PWカラムを使用するHPLCに注入する。分子サイズをMW標準デキストランを使用するGPCソフトウェアによって決定する。試料をセミカルボジド(semicarbozide)を用いて誘導体化する場合、得られるピークを使用してOAgの量を確認することができる。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI_TOF)方法によるリピドAの同一性アッセイにより、LPS中のリピドAのタイプを決定する。100℃で2時間1%酢酸を用いる緩やかな酸加水分解を使用して、以前に記載したように[20]、リピドAをGMMA又は細菌セルバンクから沈殿させた。試料を14,000gで15分間遠心分離し、ペレットを水に再懸濁させ、水で2回洗浄した。Speedvacを使用してペレットを終夜乾燥させ、クロロホルム-メタノール4:1中に再懸濁させ、同等の体積のSuper DHB(Sigma-Aldrich)の水/アセトニトリル1:1(vol/vol)中溶液と混合した。2μLの混合物を標的プレート(MTP 384 target plate ground steel BC、Bruker Daltonics)にロードし、リフレクトロンイオン-ネガティブモードでUltraflex MALDI-TOF(Bruker Daltonics)によって分析した。Super DHB溶液と混合したペプチド較正標準(Bruker Daltonics)は、各分析において含まれた。m/z比は、ペプチド標準と比較してFlex Analysisソフトウェアで決定した。リピドAの種を、試料に対して期待される分子ピーク質量m/zの比較によって特定する。
動的光散乱により、Malvern Zetasizer Nano ZS(商標)を使用してGMMAのサイズ分布が決定される。粒子サイズ分布を、材料設定として「タンパク質」及び「一般的目的(通常の解像度)」に関して、173°の後方散乱光の3つの異なる測定値のz-平均値を使用して散乱光の強度として得た。この技法によって得た直径は、測定された粒子と同じ移動拡散係数を有する球のものである。電子顕微鏡で測定したものと異なることが期待されるサイズは、粒子サイズの範囲と製造の一貫性についての有効な尺度となる。
ALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAの同一性は、免疫学ベースの技術によって決定することができる。
PBMC単離及びMAT
GMMAを用いた刺激後のPBMCによるin vtroインターロイキン6(IL-6)産生をin vitroサロゲートとして使用し、Rossi et al. [20]に記載されている手順を使用して反応可能性を評価した。簡単には、異なるドナーからのバフィーコートを使用して、[24]で報告されているFicoll密度遠心分離を使用してPMBCを単離した。PBMCを、96ウェル丸底プレート中、25mMのHEPES、2mMのグルタミン、10%のFBS、1%のPen-Strep(InvitroGen)を補充した180μLのRPMI-1640を用いて2×105細胞/ウェルの密度で播種した。TBS中GMMAの10倍連続希釈液20μL(アッセイの最終濃度が0.0001〜1,000ng/mL)を添加し、細胞を37℃で4時間インキュベートし、遠心分離(5分、400g)後に上清を回収し、IL-6濃度を分析するまで-80℃で保存した。
1群当たり8頭のBALB/cマウス又はCD-1マウス(雌、4から6週齢)は、0.5mLの容量で、0日目及び21日目に、異なる用量のGMMA製剤化ALHYDROGELの1又は2回の腹腔内注射を受けた。対照マウスは、0.5mLのGAHB-プラセボを受けた。7、14、21、28、35日目に、又は一部の研究では21日目だけに、血液試料を採取した。効能アッセイでは、マウスの群を4種の異なる用量のワクチン又は効能標準(-80℃で保存し、ALHYDROGELで新たに製剤化した基準GMMA)で免疫化した。
S.ソネイ又はS.フレキシネリGMMAに誘発された抗体を、プレート被覆抗原としてシゲラ・ソネイのLPS又はS.フレキシネリ血清型O抗原を使用するELISAで評価する。Nunc(商標) Maxisorp(商標) 96ウェルプレートを、2〜8℃で、リン酸緩衝食塩水(PBS)中0.5μg/mLのLPS又は5μg/mL未満のOAgを用いて終夜被覆した。PBS中5%のミルクを用いてプレートを1時間ブロックし、次に、0.05%のTWEEN(登録商標) 20を含有するPBS(PBST)で3回洗浄した。マウス血清を、0.1%BSAを有するPBST中で1:100及び1:4000希釈し、ウサギ血清を、PBS中5%ミルク中に希釈した。希釈した血清をELISAプレートで2時間、三連でインキュベートした。以前に確立し、較正したプレートのそれぞれについて二連の希釈液に含まれる抗S.ソネイLPS又は抗S.フレキシネリ血清型O抗原と比較して、試料を試験した。試料と基準血清を用いるインキュベーション後、上記のようにプレートを3回洗浄した。結合した抗体を、PBSTで希釈したアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG又はヤギ抗ウサギIgGを使用して検出し、続いて、3回洗浄ステップとp-ニトロフェニルリン酸基質を用いる呈色反応を実施した。1時間後、405nm及び490nm波長で吸光度(光学密度、OD)を測定し、OD405nm〜490nmを計算した。結果は、標準血清に対して決定したELISA単位で表す。1ELISA単位は、標準アッセイでOD405nm〜490nm 1を与える標準血清の希釈率の逆数に等しい。
S.ソネイ及びS.フレキシネリ細菌を、ログ相(OD:0.2)に増殖させ、PBSで1:15,000に希釈し、滅菌ポリスチレンU底96ウェルマイクロタイタープレートに分配した。各ウェルに対し、8〜12倍に連続して希釈した(ウェル希釈で1:100から開始する)血清試料を添加した。使用前に、血清を56℃で30分間加熱し、内因性の補体を不活性化した。最終体積の7〜20%で使用した活性幼若ウサギ補体(BRC、Cederlane CL3441 lot6288)を各ウェルに添加した。SBA反応混合物中で使用したBRC供給源、ロット及びパーセンテージは、各特異的細菌に対する毒性の低さについて前もって選択した。BRC又はマウス血清の可能な非特異的阻害作用を評価するために、細菌を、同じ試験血清及び熱不活性化BRC、血清のみ(BRC無し)、SBA緩衝剤及び活性BRCでもインキュベートした。SBAミックスにおける3時間のインキュベーション後、細菌増殖阻害を測定した。殺菌活性を、50%のパーセント細菌増殖を得るために必要な血清希釈率として定義される血清力価について測定した。殺菌活性が検出されなかった場合に、10に等しい血清力価が与えられた。
本発明者らは、筋肉内に送達された総ヒト用量の投与を使用するヨーロッパ薬局方の静脈内発熱性試験方法(Ph.Eur. 2.6.8 pyrogens、[25])の改変法を確立した。2セットの実験を、アッセイを確立するために実施した。最初の実験では(非GMP条件下だが、GMP施設で)、Ph.Eur. 2.6.8 pyrogensに従って予め選択された3頭のウサギからなる3群を、保持箱に入れ、直腸プローブを使用して体温を記録し、初期体温を決定した。ワクチン(0.5mL)の毒性学ロットを2つのワクチン群の3頭のウサギそれぞれに、0.5mLの滅菌生理食塩水を対照群の3頭のウサギに筋肉内注射した。初期体温と投与後の可能な体温上昇を決定するために、注射の90分前から投与後3時間まで、自動システムによって体温を連続して記録した。3.5、4、5、5.5、6、6.5及び7時間に体温を手作業で記録した。次の日、ウサギを保持箱に戻し、順化させ、24時間に別の読取りを実施した。
S.ソネイ1790GAHBワクチンの最大3回の免疫化の臨床投与を支持するために、Good Laboratory Practice(GLP) standards(WIL Research Europe、Lyon、France)に従ってニュージーランドホワイトウサギを用いて毒性学研究を実施した。ワクチンを、2週間おきに4回、筋肉内(IM)、鼻腔内(IN)、又は皮内(ID)臨床ルートに投与し、続いて2週間の観察期間とした。免疫反応を生じる能力を実証する予備調査研究に基づく動物モデルとしてウサギを選択した。試験設計は表3に表す。全ての動物について、試験経過中、疾病率/死亡率、臨床観察/検査、Draize注射部位、眼科学、体重、摂食量について観察した。凝固パラメータ及びC-反応タンパク質(プレ試験、2日目及び両方の解剖時)を含む臨床病理学、抗体分析(プレ試験、投与前及び両方の解剖時)、解剖時の肉眼による観察、器官重量、並びに組織病理学(完全なWHOの組織リスト)も全ての群で実施した。最初の免疫化において群2及び5(IM)の体温は、投与の1.5時間前、0.5時間前、及び2分前(0時間)並びに注射の0.5、2、6、及び24時間後に測定した。-0.5時間と0時間の体温の平均は、ウサギの初期体温とみなした。群2及び5の2回目、3回目、及び4回目の免疫化、並びに群1、3、4、6、及び7の全免疫化において、投与前(0時間)、及び投与の2、6、及び24時間後に体温を記録した。
1790GAHBのIN投与を更に支持するために、神経行動学的総合評価[26]によって判断する中枢及び末梢神経系への1790GAHBの有効な望ましくない作用を特定するために、GLP Irwin試験を実施した。6頭の雄からなる3群、およそ0.3kgのHan Wistarラットを使用した。第1の群は食塩水対照、第2の群はGAHB-プラセボ及び第3の群は1790GAHBを受けた。各ラットは、各鼻の穴に15μlの単回用量を受けた(合計30μl)。この投与量は最大実行用量であった。試験群は、合計6μgの1790GAHBタンパク質を受けた。体重を基準として、0.3kgのラットにおける0.6μgのタンパク質用量は、フェーズ1試験において60kgの対象にIN投与される最も高い推定用量のおよそ15倍である。投与前、投与の0.5、1、2、5、及び24時間後にラットをモニタリングした。
シゲラ・ソネイのNVGH1790細胞株のO抗原発現
菌株NVGH1790は、大腸菌nadA及びnadB遺伝子を病原性プラスミドに組み込むことによって遺伝子改変し、シゲラのニコチン酸栄養素要求性を除去した[18]。したがって、病原性プラスミドの保持及び結果として、プラスミドにコードされたOAgの生成[27]は、ニコチン酸を含まない培地での増殖によって確かめられる。フラスコ内で25世代後及び30Lの発酵後のS.ソネイNVGH1790のFACS分析により、細菌の95%超がOAgに対して陽性であり、したがってこのプラスミドの保持を示したことが示された。
3つの30Lについて整合性の実行を実施した。各バッチについて、30Lで最適化した発酵プロセスは、OD600がおよそ35であった場合、バイオリアクターの注入から20±4時間以内、溶解pO2スパイクが生じ、pHが上昇し始めた場合に停止した。発酵の終わりに、培養物を精密濾過によって採取した。次に、GMMAを限外濾過で精製した。2つの1790-GMMAのGMPロットの製造のために、プロセスを外部の医薬品製造受託機関に移した。GMPバッチを25Lスケールで製造した。データは、NVGH、1790-GMMAバッチNVGH1883(基準バッチ)で製造したコンシステンシーロットの1つに対してと、2つのGMP薬物物質、1790-GMMAバッチ1112及びバッチ1014に対して表す。
サイズ及び完全性
電子顕微鏡で、基準及びGMPバッチから精製したGMMAは、二峰性のサイズ分布を有する粒子を示した。粒子の大多数は、直径およそ25〜40nmの平均サイズの小さいものである。粒子の少数の画分は、65から140nmの間のサイズを有する大きいものであった(粒子の16%)。
基準及び2つのGMPバッチにより、精製GMMAにおいて、それぞれ2.4gのタンパク質(30mLから)、1.7gのタンパク質(25Lから)及び0.42gのタンパク質(25mLから)の最終収率が得られた。これらのロットは、それぞれ145mg、106mg及び25mgのOAgを含有し、タンパク質に対するOAgの比はほぼ同一であった(60.3μg/mg、63.6μg/mg及び59.0μg/mg)。他の2つのコンシシテンシーロット(30mLから)は同様であり、それぞれ収率、2.0g及び3.2g、タンパク質に対するOAgの比、61.6μg/mg及び50.3μg/mgであった。
1790-GMMAのSDS-PAGEプロファイルは、以前の研究[22、36]で示したものと同様であった。およそ39kDaサイズの有力なバンドは、質量分析法によってOmpA及びOmpCと同定された。
基準及びGMPバッチから抽出したLPSの銀染色SDS-PAGEは、二峰性の分布を有するLPSラダーを示した(データは示さない)。有力なバンドは、5 OAgまでの繰り返しを有する低分子量LPSであり、中程度の分子量LPSは、少数画分として目に見えた。これらのデータは、屈折率検出を使用する抽出OAg/コアの分析的サイズ排除クロマトグラフィーと一致した(データは示さない)。有力なピークは低分子量多糖である。1790-GMMAにおける有力な低分子量LPSのサイズ分布は、NMRで測定して平均33回の繰り返しを有するLPS改変を有さない親菌株に由来する基準LPS(1859-GMMA)のサイズと著しく異なる。
基準バッチから精製したリピドAの構造を、MALDI-TOFを使用する質量分析法によって決定した(データは示さない)。記録スペクトルは、最も高いピークに相当するペンタアシル化リピドAとその断片化(すなわち、1種以上の脂肪酸鎖の損失)、ナトリウムを有する凝集体の形成(+23m/z)及び脱リン酸化(-80m/z)に起因するいくつかの他のピークを示した。MALDI-TOFでは、ヘキサ又はヘプタアシル化リピドAは検出されなかった。
改変されていないLPSを含有する1859-GMMAは、PBMCから高レベルのIL-6放出を誘導し、0.004ngタンパク質/mLの濃度でバックグラウンドに対してIL-6放出の10倍の増加をもたらす一方、ペンタアシル化LPSを含有する1790-GMMAは、同じIL-6放出をもたらすために600倍高い濃度(2.37ngのタンパク質/mL)を必要とした。
GMMAワクチンを受けた全12頭のウサギにおいて(毒性学ロットを受ける第1研究で6頭、毒性学ロットを受ける第2研究で3頭及び臨床ロットを受ける3頭)、ワクチン接種の7時間後まで、及び24時間後に、異なるインターバルで観察した平均体温上昇を、食塩水を受けた6頭の動物の平均体温上昇と比較して、図1に示す。ワクチン群の平均体温上昇は、静脈内発熱性試験の通常3時間の終点でも依然として増加していた。対照動物における5時間後の平均体温上昇は、著しい増加を示し、ワクチン群と対照群の間の差は減少した。24時間まで、ワクチン群と対照群は有意に異ならなかった(ワクチン群はより低い平均体温上昇を有した)。これらの結果に基づき、4時間を決定的な時点として選択した。上記で詳述したように開発した基準を使用して、毒性学及び2つの臨床群は、繰り返しアッセイを必要とすることなく、発熱性試験を合格した。毒性学ロット及び2つの臨床ロットの投与後最初の4時間の平均「最大体温上昇」は、それぞれ0.48℃、0.53℃及び0.40℃であった。対照群については、値は0.27℃であった。
1790GAHBワクチン又はGAHB-プラセボで処置したウサギにおいて、死亡率、処置に関連する臨床徴候及び体重又は摂食量の変化のいずれも存在しなかった。処置に関連する眼科的な知見もなかった。ワクチン又はプラセボ投与のいずれかに関連すると考えられる器官重量の変化は、44日目又は56日目(すなわち、最終ワクチン接種の2又は14日後)に見られなかった。ワクチンは、鼻腔内及び筋肉内経路で局所的に忍容性が良好であり、IN経路では局所反応は観察されず、IM投与後のウサギの何頭かで非常に軽度(紅斑、浮腫)から中等度の局所反応(浮腫)までが観察された。ID投与は、対応するGAHB-プラセボ群におけるより1790GAHB群においてより明らかであった、非常に軽度から中等度の局所反応(硬結、紅斑及び浮腫)を誘導した。局所反応原性は、IM注射部位では、2週間の回復期の終わりまでに、完全に又は部分的に解決したが、注射のID部位では解決しなかった。しかしながら、ID投与によるワクチンに対する忍容性は、受容可能なままであった。排出リンパ節及び脾臓における変化を含む低い重症度及び大きさの炎症性変化は、組織病理学検査で見られ、これらの変化は、C-反応性タンパク質及びフィブリノーゲンの増加と相関し、免疫原に対するこの薬理学反応と一致した。臨床病理学パラメータにおける変化及び最小から中程度の微視的変化は、一般にIN及びID処置群では回復期の終わりまでに解決するが、IM処置群で見られる変化はわずかに減少し、炎症変化からの回復が進行中であることを示した。
INワクチン接種とそれに続く1790GAHBの単回投与の神経毒性作用を評価するためのラットにおけるIrwin研究は、主な中枢及び末梢神経系機能に関する、一連の行動学的及び生理学的パラメータに対して関連する作用を示さなかった。
最初の免疫原性研究では、腹腔内に注射した29ngから238μgまで(1.75ngから14.35μgのOAg)4倍増加する7種の異なる用量の1790GAHBを評価し、ワクチンの免疫原性が高いことを示した。抗体は、単回注射後の全ての投与で検出可能であり、2回目の注射後にブースティングした。1.86μgのタンパク質(0.11μg OAg)は、最大の抗体反応を誘発した。これらの結果に基づき、効能試験の基礎を形成し、効能によって判断した経時的安定性を評価するために、免疫原性プロトコルを開発した。最終の効能試験設計では、8頭のマウスの群で、29ngから1.86μgまでの4種の4倍増加する用量の1790GAHBを使用し、血清IgGレベルを、単回免疫化の3週間後の同種OAgを有するLPSについてのELISAによって評価した。基準1790GAHB調製物を各効能試験に対して新たに製剤化し、試験ワクチンと同じ用量で投与した。試験ワクチン及び参照基準によって誘発された抗体レベルの用量反応曲線を比較した。対数用量に関して対数変換した抗LPS抗体の線形回帰の傾斜又は切片に有意な差はなく、ワクチン安定性バッチは新たに製剤化した基準材料と同じ効能を有することが示された。
毒性学研究からウサギにおけるIgG反応を各ワクチン接種後及び最終の出血時に評価した。3つの経路全てが、高いレベルの循環抗LPS IgGを与えた(データは示さない)。最大反応は、100μg用量の1790GAHBの単回IM注射の14日後に実現した。IN経路については、最大抗体反応に2回の免疫化が必要であった。最終ワクチン接種の14日後の循環IgG抗LPSレベルは、100μg用量の1790GAHBのIM送達で達成したレベルと有意に異ならなかった。10μgのIDワクチン接種も次のワクチン接種に反応して増加を示したが(Spearmanランク検定 p<0.0001)、効果はIN経路に関するよりも明らかではなかった。最終循環抗LPS IgGレベルは、IM経路よりID経路で有意に高かった(対数変換した抗体のt検定p=0.002)。
臨床試験を、健康な成人(参加者の年齢は18から45歳)に異なる投薬量で投与した場合に、シゲラ・ソネイに対する3用量の候補ワクチン(1790GAHBワクチン)の安全性及び免疫原性を評価するために実施した。1790GAHBワクチンの安全性プロファイルは、研究ワクチン製剤と同じ濃度を有する水酸化アルミニウム懸濁液で構築したプラセボ(GAHB-プラセボ)のものと比較して評価する。対象を無作為化して、4週おきに、1790GAHBワクチン(5つの抗原濃度で)又はGAHBプラセボのいずれかの3回の免疫化を受けた。
以下の遺伝子改変を含有するシゲラ・ソネイ:ΔtolR:内膜及び外膜の連結を切断し、多量の外膜ブレブを与える(GMMA)、ΔhtrB:LPSの反応原性を低減させるため、virG nadA/Bノックイン:O抗原(OAg)をコードする病原性プラスミドを安定化させる。
100μgGMMAのタンパク質
6.1μgのOAg
ALHYDROGEL(登録商標)として0.35mgのアルミニウム
等張Tris緩衝食塩水中
0.5mL用量当たりのプラセボ(i.m.)
ALHYDROGEL(登録商標)として0.35mgのアルミニウム
等張Tris緩衝食塩水中
プラセボで最大用量を希釈することによって調製した送達のための低用量
注射容量:i.m:0.5mL
この研究では、多価シゲラGMMAワクチン、特に4種の最も流行している血清型のGEMS研究、S.ソネイ、並びにS.フレキシネリ2a、3a及び6由来のGMMAを含有するALHYDROGEL(登録商標)製剤を試験した。
以下の表に記載したように、BALB/cマウス(群当たり8頭)を、4種の異なる用量の製剤を用いて、0日目に腹腔内に免疫化した。対照として、1つの群をALHYDROGEL(登録商標)希釈剤(GAHB-プラセボ)を用いて免疫化した。全ての製剤を、免疫化前に細菌夾雑について試験した。簡単に、50μLの各製剤を三連でLB寒天プレートに入れ、24時間のインキュベーション後、37℃で、プレートを増殖について試験した。細菌増殖のない製剤だけを免疫化に使用した。
ELISAを実施して、それぞれ単独で又は4価ワクチンの一部として投与したS.ソネイ、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及びS.フレキシネリ6由来のALHYDROGEL(登録商標)を用いて製剤化したGMMAを用いて免疫化したマウスの抗S.ソネイLPS、抗S.フレキシネリ2aのOAg、抗S.フレキシネリ3aのOAg、抗S.フレキシネリ6のOAg抗体レベルを決定した。S.ソネイ、S.フレキシネリ2a及びS.フレキシネリ3aに対する結果を図3及び4に示す。
4価のGMMA製剤に対して生じた抗血清は、野生型S.ソネイ、S.フレキシネリ2a、S.フレキシネリ3a及びS.フレキシネリ6を認識した。一方、個々のGMMA抗血清は、同種の細菌株を認識した。
4価のシゲラ製剤によって誘発される特異的シゲラ血清型に対する血清抗体反応は、個々の構成成分と異ならない。したがって、干渉の証拠は存在しない。
多価シゲラGMMAワクチン、特に、S.ソネイ、及びS.フレキシネリ1b、2a、3a及び6由来のGMMAを含有するALHYDROGEL(登録商標)製剤を例示する。
多価シゲラGMMAワクチン、特に、S.ソネイ、及びS.フレキシネリ1b、2a、2b、3a及び6由来のGMMAを含有するALHYDROGEL(登録商標)製剤を例示する。
A)(a)シゲラ・ソネイ53G ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537 ΔtolR、ΔhtrB ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(e)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
B)(a)シゲラ・ソネイ53G ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(e)シゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(f)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
C)(a)シゲラ・ソネイ53G ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(e)シゲラ・フレキシネリ2b 69/50 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(f)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
D)(a)シゲラ・ソネイ53G ΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB突然変異体から精製したGMMA、(b)シゲラ・フレキシネリ2a 2457T ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(c)シゲラ・フレキシネリ3a 6885 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(d)シゲラ・フレキシネリ6 10.8537 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(e)シゲラ・フレキシネリ1b STANSFIELD ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、(f)シゲラ・フレキシネリ2b 69/50 ΔtolR、ΔmsbB1突然変異体から精製したGMMA、及び(g)アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含み、シゲラ・フレキシネリ菌株が病原性プラスミドをキュアリングされている、免疫原性組成物。
E)アジュバントが水酸化アルミニウム、例えばALHYDROGEL(登録商標)である、(A)、(B)、(C)、又は(D)の免疫原性組成物。
F)少なくとも1種の医薬担体及び/又は添加剤を含む、(A)、(B)、(C)、(D)又は(E)のいずれかの免疫原性組成物。
G)医薬組成物又はワクチン組成物である、Fの免疫原性組成物。
H)動物、特にヒトにおけるシゲラによる感染の予防又は処置において使用するための、Gの医薬組成物又はワクチン組成物。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)(a)精製したシゲラ・ソネイGMMA、(b)精製したシゲラ・フレキシネリGMMA、及び(c)アジュバントを含む免疫原性組成物であって、GMMAが改変リピドAを含む、免疫原性組成物。
(2)改変リピドAがペンタアシル化リピドAである、(1)に記載の免疫原性組成物。
(3)シゲラ・フレキシネリGMMAが、2a、3a及び6からなる群から選択される少なくとも1種の菌株から精製される、(1)又は(2)に記載の免疫原性組成物。
(4)菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを含む、(3)に記載の免疫原性組成物。
(5)GMMAが、(a)シゲラ・ソネイΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB、(b)シゲラ・フレキシネリ2a ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ2a ΔtolR、ΔhtrB、(c)シゲラ・フレキシネリ3a ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ3a ΔtolR、ΔhtrB、及び(d)シゲラ・フレキシネリ6 ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ6 ΔtolR、ΔhtrBから精製される、(4)に記載の免疫原性組成物。
(6)S.ソネイ菌株が、S.ソネイ53Gである、(1)〜(5)のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
(7)S.フレキシネリ菌株が、S.フレキシネリ2457T(2a)、S.フレキシネリ6885(3a)及びS.フレキシネリ10.8537(6)からなる群から選択される、(1)〜(6)のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
(8)1b及び2bからなる群から選択される少なくとも1種の更なるシゲラ・フレキシネリ菌株を含む、(3)〜(7)のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
(9)更なるシゲラ・フレキシネリ菌株が、S.フレキシネリSTANSFIELD(血清型1b)及びS.フレキシネリ69/50(血清型2b)からなる群から選択される、(8)に記載の免疫原性組成物。
(10)4種のGMMAのうちの少なくとも2種が1:4から4:1の比で存在する、(4)に記載の免疫原性組成物。
(11)アジュバントが水酸化アルミニウムである、(1)〜(10)のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
(12)GMMAの少なくとも75%が、25nmから40nmの範囲内の直径を有する、(1)〜(11)のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
(13)少なくとも1種の医薬担体及び/又は添加剤を含む、(1)〜(12)のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
(14)医薬組成物又はワクチン組成物である、(13)に記載の免疫原性組成物。
(15)動物、特にヒトにおけるシゲラによる感染の予防又は処置において使用するための、(14)に記載の医薬組成物又はワクチン組成物。
Claims (13)
- (a)精製したシゲラ・ソネイGMMA、(b)精製したシゲラ・フレキシネリGMMAであって、該シゲラ・フレキシネリGMMAは、2a、3a及び6から成る群より選択される少なくとも1種の菌株から精製されたものである、前記精製したシゲラ・フレキシネリGMMA、及び(c)アジュバントを含む免疫原性組成物であって、前記GMMAは、ペンタアシル化リピドA、又はラウロイル鎖がパルミトレオイル鎖で置き換えられているヘキサアシル化リピドAである、改変リピドAを含む、前記免疫原性組成物。
- 菌株2a、3a及び6のそれぞれから精製したシゲラ・フレキシネリGMMAを含む、請求項1記載の免疫原性組成物。
- GMMAが、(a)シゲラ・ソネイΔtolR、ΔhtrB、virG::nadAB、(b)シゲラ・フレキシネリ2a ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ2a ΔtolR、ΔhtrB、(c)シゲラ・フレキシネリ3a ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ3a ΔtolR、ΔhtrB、及び(d)シゲラ・フレキシネリ6 ΔtolR、ΔmsbB又はシゲラ・フレキシネリ6 ΔtolR、ΔhtrBから精製される、請求項1又は2記載の免疫原性組成物。
- S.ソネイ菌株が、S.ソネイ53Gである、請求項1〜3のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- S.フレキシネリ菌株が、S.フレキシネリ2457T(2a)、S.フレキシネリ6885(3a)及びS.フレキシネリ10.8537(6)から成る群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- 1b及び2bから成る群より選択される少なくとも1種の更なるシゲラ・フレキシネリ菌株由来のGMMAを含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- 更なるシゲラ・フレキシネリ菌株が、S.フレキシネリSTANSFIELD(血清型1b)及びS.フレキシネリ69/50(血清型2b)から成る群より選択される、請求項6記載の免疫原性組成物。
- 4種のGMMAのうちの少なくとも2種が1:4から4:1の比で存在する、請求項2記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項1〜8のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- GMMAの少なくとも75%が、25nmから40nmの範囲内の直径を有する、請求項1〜9のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- 少なくとも1種の医薬担体及び/又は添加剤を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
- 医薬組成物又はワクチン組成物である、請求項11記載の免疫原性組成物。
- 動物、特にヒトにおけるシゲラによる感染の予防又は処置において使用するための、請求項12記載の医薬組成物又はワクチン組成物。
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