UA83027C2 - Штам bifidobacterium bifidum, композиція, що містить галактоолігосахариди, її застосування та спосіб виробництва речовини для стимулювання росту біфідобактерій - Google Patents

Description

25905 мас/об, тетрасахариду і від 10 до 2095 пентасахариду.

Термін «ферментативна активність», що використовується в тексті відносно галактозидазної ферментативної активності згідно з даним винаходом, означає активність, що виявляється, принаймні, одним ферментом галактозидазою.

В одному аспекті було виявлено, що суміш галактоолігосахаридів містить дисахарид сСа!1-саї, трисахарид

Са!-Са!І-СіІс, тетрасахарид Са1І-СаІ-СаІ-сіс і пентасахарид Са1І-Са!І-Са1І-СаІ-сіс, де Са! являє собою залишок галактози і біс являє собою залишок глюкози.

За допомогою аналізу шляхом метилування і ферментативного гідролізу суміші галактоолігосахаридів було виявлено, що суміш містить баї (81-6)-сза(рі-6)-Са! (р1-4)-сІс тетрасахарид; Саї (р1-6)-Са(р1-4)-сіс і

Сац(р1-3)-Са|(р1-4)-сіс трисахариди; Са|(р1-3)-Сіс, Сза|(р1-3)-Саї, Са|(рті-6)-саї і са(с1-6)-Сса! дисахариди.

Штам Війдорасіегішт рійайцт, здатний продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, як визначено вище, був депонований під інвентарним номером МСІМВ 41171 в Національній колекції промислових і морських бактерій, м.Абердин (Шотландія) 31 березня 2003.

Такий штам Війаорасіегішт ріййит або його біологічно функціональний еквівалент може бути використаний для продукування суміші галактоолігосахаридів, як визначено вище. Суміш галактоолігосахаридів може бути частиною продукту, що використовується для поліпшення стану кишки шляхом стимулювання зростання біфідобактерій в кишці, особливо вихідного штаму-продуценту. Такий продукт може бути вибраний з групи, що складається з молочних продуктів (наприклад, рідкого молока, сухого порошкового молока, такого як незбиране сухе молоко, збиране сухе молоко, збагачене жирами сухе молоко, порошкова сироватка, молоко для немовлят, морозива, йогурту, сиру, сброджених молочних продуктів), напоїв, дитячого харчування, круп'яних продуктів, хліба, сухого печива, кондитерських виробів, тортів, харчових добавок, добавок до раціону, кормів для тварин, кормів для домашньої птиці або будь-якого іншого продукту харчування або напою.

Суміш олігосахаридів також може бути використана для отримання лікарських препаратів, спрямованих на запобігання адгезії патогенів або токсинів, що продукуються патогенами, до стінки кишки. Суміш може бути введена хворому після курсу терапії антибіотиками, який часто змінює або навіть руйнує нормальний стан кишкової флори, або після операції на кишці, для того, щоб "знову посіяти" або відновити в кишці нормальну флору, властиву здоровій кишці. Суміш галактоолігосахаридів може бути використана в комбінації з штамом

Віпаорасієгічт рійдит, вказаним вище, або біологічно функціональним еквівалентом.

Фраза "біологічно функціональний еквівалент" використовується для позначення штаму Війдорасіегійт ріїдит, який виявляє здатність продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, як визначено вище.

Згідно з іншим аспектом даного винаходу пропонується галактоолігосахаридна композиція для стимулювання зростання біфідобактерій, що містить як ефективні компоненти, принаймні, один дисахарид, принаймні, один трисахарид, принаймні, один тетрасахарид і, принаймні, один пентасахарид.

Галактоолігосахаридна композиція переважно являє собою суміш галактоолігосахаридів, як описано в тексті вище.

Переважно, галактоолігосахаридна композиція містить від 20 до 3595 мас./об. дисахариду, від 20 до 35905 мас/об, трисахариду(ів), від 15 до 2595 мас/об. тетрасахариду і від 10 до 2095 мас/об, пентасахариду.

Згідно з іншим аспектом винаходу пропонується спосіб виробництва речовини, призначеної для стимулювання зростання біфідобактерій, який відрізняється тим, що лактозу або лактозовмісний матеріал обробляють штамом Війдобрасіегіт рійдит, як визначено вище.

Придатний лактозовмісний матеріал може бути вибраний з комерційної лактози, незбираного молока, напівзбираного молока, збираного молока, сироватки і збагаченого жирами молока. Такі молочні продукти можуть бути отримані з молока корів, самиць буйвола, овець або кіз. Збагачене жирами молоко визначають як незбиране молоко, з якого зібрані вершки для видалення молочних жирів, які згодом замінюють шляхом додання рослинних жирів або масла.

Використовуючи середовище для зростання, доповнене вуглеводними субстратами, відмінними від лактози, виявили, що Віїйдобасіегішт рійдит, згідно з винаходом, може утилізувати мальтозу, рафінозу, ксилан і фруктозу. Культивування бактерій в середовищі, доповненому одним з вказаних вуглеводів, індукує експресію о-глюкозидази, о-галактозидази, ксилозидази і Д-фруктофуранозидази, відповідно, і, таким чином, приводить до продукування о-глюкоолігосахаридів, о-галактоолігосахаридів, ксилоолігосахаридів |і фруктоолігосахаридів, відповідно.

У дослідженні, яке привело до даного винаходу, ізольовані кишкові бактерії були перевірені з метою виявлення бактерій, які здатні продукувати галактозидазу і, таким чином, мають високий потенціал для продукування галактоолігосахариду(ів). У результаті було виявлено, що деякі бактерії, які належать до роду біфідобактерій, зокрема Війдорасіегішт ріїйадит, були здатні не тільки продукувати фермент з галактозидазною активністю, але також, що фермент міг перетворювати лактозу в галактоолігосахаридну суміш, що містить від 20 до 3595 мас/об, дисахариду, від 20 до 3595 мас/об, трисахариду, від 15 до 2595 мас/об. тетрасахариду, від до 2095 мас/об, пентасахариду. Окремий примірник Війдорасіегішт рітацт був депонований 31 березня 2003 в МСІМВ, м.Абердин, під інвентарним номером 41171.

Для культивування вказаних бактерій може бути використане будь-яке поживне джерело, за умови, що воно може засвоюватися бактеріями. Відповідне культуральне середовище може бути приготоване, наприклад, з вуглеводами, такими як лактоза, сахароза або глюкоза; азотовмісними неорганічними або органічними поживними джерелами, такими як дріжджовий екстракт, триптон, м'ясний екстракт (Гар Гетосо) і тому подібне; неорганічними поживними джерелами, такими як фосфати, калій і тому подібне. Для культивування рН поживного середовища повинен знаходитися в діапазоні від 6,0 до 8,0, переважно 7,0, |і культивування здійснюють. в анаеробних умовах при температурі, що знаходиться в діапазоні від 35" до 402, переважно 37"С, протягом від 40 до 64 годин, переважно 50 годин.

Штам може бути культивований будь-яким з відомих способів вирощування культур, таких як стаціонарна культура, анаеробна зважена культура або культура, вирощена при струшуванні. Бактерійні клітини збирають центрифугуванням або фільтрацією, і клітини можуть бути використані як такі як каталізатор реакції без подальшої обробки. Як альтернатива, клітини можуть бути використані в іммобілізованому стані за допомогою відповідної процедури іммобілізації.

Бактерії Війаорасіегчт рійдит згідно з винаходом можуть бути використані для перетворення лактози як такої або лактози, що міститься в молочному продукті, в нову галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом. Після перетворення бактерійні клітини можуть бути видалені центрифугуванням. Будь-який присутній моносахарид може бути видалений, наприклад, шляхом інкубації з дріжджами Засспаготуеев5 сегемізіае. Згодом суміш може бути піддана центрифугуванню і мікрофільтрації. Отриманий розчин СО5 потім може бути висушений розпиленням з утворенням порошку.

Молоко, що містить галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом, приготовану даним способом, можуть вживати діти, дорослі або тварини. Як альтернатива, композиція може бути використана для отримання продуктів, таких як хліб, кондитерські вироби або тому подібне, де стійкість галактоолігосахаридів при кислих умовах і при високій температурі робить можливим використати їх без розкладання. Як альтернатива, порошок 5О5 може бути доданий до продуктів, перерахованих вище.

Порошок 5О5 може бути введений хворим, страждаючим від таких кишкових розладів, як запальне кишкове захворювання і синдром подразненої кишки, в такому випадку хворий може вживати добову дозу від 2 до 20г, переважно від 5 до 10г, найбільш переважно 7г, у вигляді двох окремих доз.

Як альтернатива, галактоолігосахаридна композиція згідно з винаходом може бути змішана з культурою

Віїаорасіегішт Біїдит згідно з винаходом для отримання суміші з метою поліпшення стану кишечнику. | таку суміш класифікують як синбіотична, яку визначають як "суміш пробіотика і пребіотика, яка благотворно діє на хазяїна за рахунок поліпшеної життєздатності і: введення живої мікробної харчової добавки в шлунково- кишковий тракт» (дивись ірзоп апа Кобегігоїд, 1995, Оіеїагу тоашіайоп ої те питап тісгобріоїа: іпігодисіпд пе сопсері ої ргебріоїісв. дошгпаї ої Миййіоп 125, 1401-1412. Така комбінація підвищує життєздатність пробіотика в несприятливому середовищі товстої кишки завдяки наданню доступного селективного субстрату. Бактерійний пробіотик може бути мікроіїнкапсульованим в галактоолігосахаридному пребіотику у вигляді, наприклад, порошку, який потім можна додавати до молочних продуктів, таких як йогурт, або використовувати як харчову добавку.

Перевага вживання молока або інших продуктів, що містять галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом, полягає в тому, що воно стимулює підвищення рівнів сприятливих біфідобактерій в кишці, при збіднінні інших менш бажаних бактерій, присутніх в кишковій мікрофлорі, таких як клостридії. Таким чином, відбувається зменшення деяких природних бактерій, які можуть надавати шкідливий вплив на стан здоров'я індивідууму. Цей ефект повинен привести до скорочення інфекцій шлунково-кишкового тракту.

Галактоолігосахаридна композиція допомагає запобігти або лікувати коліт, зменшує випадки діареї і знижує ризик хронічних кишкових захворювань, таких як виразковий коліт і рак Вона також може допомогти в послабленні симптомів синдрому подразненої товстої кишки.

Вага сільськогосподарських тварин, що утримуються на кормі з доданою галактоолігосахаридною композицією згідно з винаходом у вигляді, наприклад, порошку, може поліпшуватися завдяки харчуванню.

Даний винахід буде описаний далі за допомогою посилання на приклади.

Приклад 1

Тл середовища (рН 7,0), що містить 10,Ог/л триптону, 5,0г/л Гар--ЕМСО (м'ясний екстракт), 5,0г/л дріжджового екстракту, З,0г/л КаНРО», 0,05г/л цистеїну: НСІ, 10г/л лактози і 1 мл/л твін 80, стерилізували при 12 ГО протягом 15хв. Після стерилізації середовище засівали 1,095 (об./06.) свіжою культурою Віїйдорасіегінт рійайит МСІМВ 41171 і інкубували при анаеробних умовах при 372С протягом 50год. Бактерійні клітини збирали центрифугуванням (300009 протягом 20хв.). Після промивання двічі фосфатним буфером (0,02М, рН 7,0) клітини були готові до використання в реакціях синтезу олігосахаридів.

Бактерійні клітини (40 одиниць р-галактозидазної активності) знову суспендували в 100 мл фосфатного буферу (0,02М, рн 7,0), що містить 50г лактози. Реакцію проводили при 402С, і після 7год. суміш складалася з 3595 (мас/об.) продуктів гідролізу (глюкоза, галактоза), 3795 (мас/об.) лактози і 1895 (мас/об.) галактоолігосахаридів із мірою полімеризації між 2 і 5. Після видалення бактерійних клітин центрифугуванням (30009 протягом 20хв.) моносахариди (глюкоза і галактоза) видаляли за допомогою інкубації з дріжджами засспаготусевз сегемізіае. Згодом дріжджі видаляли центрифугуванням (10000 д протягом 10Охв.), і потім суміш фільтрували через мікрофільтр ОД мкм, щоб забезпечити мікробіологічні показники продукту. Розчин цукру потім сушили розпиленням для отримання порошку. Продукти кількісно аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи систему Мегок-Ніаспі ГаСпгот (Мегск, Рооїіе, рогзеї, ОК), забезпечену колонкою АРЕХ Сагропуагаге (опе5 Спготаїодгарпу, Міа Сіатогдап, ШК) і детектор

Мегек-Нігасні ГаСпгот РІ. Як елюент використовували 7095 (06./об.) ацетонітрил при 252С і швидкості потоку

О,дмл/хв.

Галактоолігосахаридна суміш складалася з 2595 Са1І-Саї, 3595 СаІ-Са1І-сіс, 24925 (заІ-Са1І-Са1І-сіс і 1695 са!1-

СхаІ-СаІ-Са!1І-(іс.

Приклад 2

Клітини Війдобрасієгішт ріййшт МСІМВ 41171 отримували способом прикладу 1 і додавали до 500мл збираного молока в перемішуваному резервуарі, додавали (300 одиниць Др-галактозидазної активності).

Перетворення лактози відбувалося при 402С. Після 8год. концентрація галактоолігосахаридів становила 2295 (мас/об.), і суміш містила 2895 са1-сзаї, 3295 (хаІ-СаІ-с1іІс, 2195 Са!І-сза!-СЗа1-с1с і 1995 (заІ-СаІ-СхаІ-Са1І-(1с.

Приклад З

Іп міго модель кишки

Умови, що мають місце в товстій кишці, відтворювали в тристадійному безперервному ферментері

ІМастапапе еї аї., 1998, Місгобріо! Есоіоду, 35, 180-187), в який вносили 1095 (мас/об.) фекального гомогенату від здорових добровольців в середовищі для зростання без 5БО5 суміші і з 195 (мас/об.) 505 суміші, приготованої способом прикладу 1 (таблиця 2). Модель складалася з трьох посудин, МІ, М2 і М3, з відповідними робочими об'ємами 270, 300 і З00мл. Температуру встановлювали на 372 і її разом з рн контролювали автоматично. рН культур в трьох посудинах підтримували при 5,5, 6,2 і 6,8, відповідно. Кожний ферментер перемішували за допомогою магніту, і в ньому підтримували анаеробні умови шляхом безперервного барботування суміші М», вільного від О» (15мл/хв.).

Середовище для зростання містило наступні інгредієнти: крохмаль 8г/л, муцин 4г/л, казеїн Зг/л, лептонну воду 5г/л, триптонну воду 5г/л, жовч МеЗ 0,4г/л, дріжджі 4,5г/л, РебОхї 0,005г/л, Масі 4,5г/л, КСІ 4,5г/л, КНгРОХ

О,5г/л, МазО»4:7НгО 1,25г/л, Сасі»бНгО 0,15г/л, Мансо»з 1,5г/л, твін 80 мл, гемін 0,05г/л, цистеїн" НСІ 0,вг/л.

Середовище подавали до М1 за допомогою перистальтичного насоса, і М1 послідовно забезпечував М2 і 3 через серію трубок. Система працювала при часі втримання приблизно 36 годин. Модель кишки залишали на ніч, щоб врівноважити систему до того, як підключали насос для подачі середовища, і він працював протягом, принаймні, 10 днів до того, як була введене середовище, що містить тестований субстрат, і систему залишали протягом ще 10 днів. Зразки відбирали на початку і в кінці кожного циклу. Об'єм видаленого зразка становив 5мл, і цю кількість використовували для встановлення кількості групи бактерій.

Гібридизація іп 5йш із застосуванням флуоресцентно мічених зондів (РІЗН) Відмінності між бактерійними популяціями оцінювали за допомогою використання методу РІЗН з олігонуклеотидними зондами, сконструйованими для націлення на діагностичні області 163 рРНК. Дані олігонуклеотиди були комерційно синтезованими і міченими флуоресцентним барвником СуЗз (наданим Еигодепіес ШК Ца). Використані молекулярні зонди представлені в таблиці 1. Для загального бактерійного рахунку використали барвник нуклеїнових кислот 4,6-діаміно-2-феніліндол (АРІ). Зразки, взяті з ферментаційних посудин, розбавляли в 495 (мас/об.) параформальдегіді і фіксували протягом ночі при 42С. Потім клітини центрифугували при 1500 х 4 протягом 5 хвилин, промивали двічі забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5; 0,1М, рН 7,0), знову суспендували в суміші РВ5/9995 етанол (1:11 мас/об.) і зберігали при -202С протягом, принаймні, 1 години. Потім суспензію клітин додавали до гібридизованої суміші і гібридизували при відповідній для кожного зонда температурі протягом ночі. Гібридизовану суміш піддавали вакуум-фільтрації, використовуючи мембранний фільтр Ізороге 0,2мкм (МіПіроге Согрогайоп, Негі5, ОК). Фільтр відставляли, вміщували на предметне скло з 5іомРаде (МоїІесшаг Ргоре5, Еидап, ОК, ОА) і перевіряли за допомогою флуоресцентного мікроскопа (Місоп Ерсіїрзе, Е400)|. Клітини, забарвлені за допомогою ОАРІ, перевіряли в УФф-світлі, і гібридизовані клітини оцінювали, використовуючи фільтр ОМ510. Для кожного предметного скла було оцінено, принаймні, 15 різних полів зору.

Таблиця 1

Олігонуклеотидні зонди, що використовуються для характеристики кишкової мікрофлори з допомогою ІБН

Зонд Послідовність Видмішені Температура Посилання с 0 5 ССААТаТОпОбОЛеСТТУ Вссівгоідех грі. сс ізодезйк м ді (1995) вігіб4 в'СКТООВОСАТТАССАСССУ ВІйобасветиит хро. дис й Мал ві ві. (1996У сь) 3ЗАЛАСЧААОАСЛІААЦАССОСАЦАІ Січі пілобуйсь Пра щ-- Есилкя ес аг. (1998) звід 0 ЗоТКТТАОСАТКСІСТОТТТОСАЗ ГаподавійноЕьютсвевяю ОС Нагтитей а ві. (1999)

Результати

Таблиця 2

Бактерійні популяції, визначені за допомогою ЕІ5Е в іп уйто моделі кишки при використанні комерційних СО5 (Уіхіпа! (КТМ)) як субстрату в кількості 7 г на день

У1 Уг УЗ

Час (дні) 1 10.5..21 1 105 21 1 105. 21

Усього бактерій (ор) 9,5 95 96 95 ЖД.94 Д95 Д 95 94 96

Війдобасісгійт зрр. 80 7,9 83 80 80 83 80 80 82

Ї астобасіШиз 5рр. 72 72 71 7070 71.70 7,0 69

Васіетоїдез рр. в Ви 07,5 80 82 7,5 80 81 7,9

СІозцідішт вібіобуйсшп 6,8 6,9 71 69 68 70 69 68 70 (група)

Таблиця 3

Бактерійні популяції, визначені з допомогою ЕЇ5Н в іл уйго моделі кишки при використанні синтезованих СОБ5, згідно з даним винаходом, як субстрат в кількості й І 7 г на день

У1 У2 УЗ Ї

Час (дні) 1 10,5 21 1 10,5 21 1 10,5 721

Усього бактерій (Іов) 94 97 96 94 95 96 96 Щ95 9,5

Вібдобасістішт рр. В1 80 89 80 80 87 8,72 82 84

Іастобасіи» 5рр. 74 76 76 73 73 7,5 74 7,3 73

Васіетоідез рр. 850 852 82 850 81 81 78 78 7,

СіІозіпдішт Візіоїуйсоі 6,9 70 68 68 68 67,70 70 69 (трупа)

Висновок

З таблиці З видно, що 505 суміш, приготована згідно з даним винаходом, виявляла кращі пребіотичні властивості (тобто, спостерігали більш значне збільшення біфідобактерій, а також зменшення бактероїдів, ніж спостерігали для комерційного еквівалента 5О5 (дивись таблицю 2). Пребіотичний ефект був більш вираженим в посудині 1 (М11) і 2 (М2), що пояснюється тим фактом, що 505 суміш згідно з даним винаходом складається з низькомолекулярних олігосахаридів.

Приклад 4

Метод метилування

Синтетичні галактоолігосахаридні продукти, отримані за способом прикладу 1, очищали гель-фільтрацією на колонці Віоде! Р2 (Рпагтасіа), проводячи елюювання водою з швидкістю Змл хв.7.

Положення зв'язків для відповідних галактоолігосахаридних препаратів визначали методом метилування.

Ліофілізовані зразки (5-бмг) диспергували в сухому диметилсульфоксиді (0ОМ5ЗО) при 202С протягом 16бгод. після продування аргоном. Зразки метилували за допомогою послідовного додання порошків гідроокису натрію (0,5г) і йодометану (4мл) (Сіисапи апа Кегек, 1984; МассСопгтіск еї а!., 1993). Після елюції-екстракції на

С18-зв'язаному картриджі ІзЗер-Рак, УмМаїег5, МУанога, ОКІ| метиловані вуглеводи сушили, екстрагували сумішшю СНеСІзЗ/СНЗОН (11, об./о6.) і упарювали досуха. Зразки гідролізували за допомогою трифтороцтової кислоти ІВіакепеу еї а!Ї., 1983| і перетворювали в частково метиловані алдитолацетати (РМАА5) шляхом відновлення за допомогою МавоОх і ацетилування оцтовим ангідридом і М-метилімідазолом (АЇІрегспеїт еї аї., 1967).

РМАА5 аналізували за допомогою ГХ на колонці з поперечно-зв'язаним носієм 5095 ціанопропілметил-509о фенілметилполісилоксаном (Ппате5 СПготаїодгарпу, Маіїдеппеад, КІ, використовуючи полум'яно- іонізаційний детектор і температурну програму: 552С (2хв.), 452С хв." (1,9хв.), 14090 (2 хв.), 220 хв." (3Бхв.), 21020 (4.0хв.). РМАА5 ідентифікували шляхом вимірювання їх часу втримання відносно міо- інозитолгексаацетату і порівняння відносного часу втримання з часом втримання зовнішніх стандартів. Суміш стандартів для кожного цукру готували шляхом цільового метилування метилглікозидів (Осагез еї аї, 19911.

Площі піків були представлені як відносні молярні кількості, використовуючи фактори ефективності відповідей вуглеводнів ІЗугеєї еї аї., 19751|.

Ідентичності РМААЗ5 були підтверджені їх електронно-іонізаційними мас-спектрами ІСагріга апа 5піа, 19891.

Аналіз ГХ-МС виконували на ідентичному ГХ в серії з мас-спектрометром Різоп5 Апаїуїса! Тгіо ІБ, використовуючи температуру джерела 2002 і потенціал іонізації 7бев.

Для того, щоб визначити аномерну конфігурацію продукту синтезу, олігосахариди обробляли с- галактозидазою і р-галактозидазою (Меїїріазе; Зідта) при оптимальних умовах протягом ЗОхв. Продукти реакції аналізували за допомогою ВЕРХ.

Результати

Виходячи з описаного вище аналізу, була встановлена структура олігосахаридів, яка була для тетрасахаридної фракції Са(р1-6)-Сса(Ц(р1-6)-са(рі-4)-Сіс, трисахаридної фракції Сак(р1і-6)-са|(рт-4)-сіс;

Са(р1і1-3)-Са|(р1-4)-Сіс і дисахаридної фракції Са(р1-4)-Сіс (субстрат лактоза); Са|(р1-3)-Сіс; Са!ц(81-3)-саї;

Сац(р1-6)-Саї; СаМої1-6)-Саї! (галабіоза). баї!: галактоза, біс: глюкоза

Посилання: 1. АіІрегеНеїт Р.О., 0.9. Меміпв, Р.О. ЕподіївН апа А. Каїт. 1967. А теїпоа юг Ше апаїузіз ої зидагз оп ріапі сеїІ-маїЇ роїзузасспатіадез Бу давз-іїдиіа спготайодгарну. Сапопуаг Нез 5: 340-345. 2. Віакепеу А.В., Р.у. Наїтіз, В.3. Непгу апа В.А. 5іопе. 1983. А вітріє апа гаріа ргерагайоп ої аїдію! асеїасез г топозасспагіде апаїузіз. Сагропуаг Невз 113: 291-299.

З. Сагтріа М.С. апа Е.М. 5піа. 1989. Ііпкаде взігисіште ої сагропуйгаєз Бу да5 спготайдгарпу-тавзв5 зресігозсору (4С-М5) г рапіапйу теїНуїатеа апа! асеїагев, р.157-216. Іп Су. Віепптапп апа а.О0. Меаіппіз (єд.),

Апа/їувзіз ої сагпропуагаїйез Бу давз-їїдиїа спготаїодгарну апа таз зресігозсору. САС Ргезв Воса Найп, Ріа. 4. Сіисапи ГІ. апа КЕ. Кегек. 1984. А зітріє апа гарій тейїйоа юг їпе регтеїпуїайоп ої сагбопуагаїез. Сагропуаг

Вез 131: 209-217. 5. Осагев 5.Н., Р. АІрегзпеїт апа А.а. ВагміїІ. 1991. Ап ітргомед теїной юг їйе ргерагайоп ої зіапдагав г

Ше діусозуї!-ІпКаде апаїузіз ої сотрієх сагропуагайгез. Сагропуаг Нез 210: 311-317. 6. МасСогтіск С.А., У.Е. Наїіз, А. Р. Сиппіпд апа М.уУ. Могтів5. 1993. Спагасіегілайоп ої а мапйапі ої роїузасспагіде асеїап ргодисейд ру а тшїап ої Асеїобасієг хуїїпитвігаіп СА 1/4. У Аррі Васіеєпої! 74: 196-199. 7. Змееї О.Р., А. ЗПпарігюо апа Р. АЇІрегеПпеїйт. 1975. Оцапійайме апаїузізв Бу мапйоив СІ С гезропве-6тасіог

Шеопез юг рапіанпу теїпуїасеа апа рагіаїйу екпуїайгеа аїдію! асеїагез. Сагропуаг Нез 40: 217-225.

Приклад 5

Матеріали і методи

Клітинна лінія НТ29 була отримана з Європейської колекції культур клітин для прикладної мікробіології і дослідження. Лінії клітин культивували при 377С в зволоженій 5906 СО» в стандартному середовищі, що включає в себе модифіковане по Дульбекко середовище Ігла (ОМЕМ) з високим вмістом глюкози, доповнене 595 (о06./06.) телячою фетальною сироваткою (ЕВ5), 100мМ пеніциліном, 0,1М стрептоміцином, неістотними амінокислотами (МЕААХ100) і 200мММ ос-глутаміном. Клітини забезпечували харчуванням шляхом зміни середовища кожні 48 годин і пасирували доти, поки клітини не досягали конфлюентного стану.

Аналіз чутливості до олігосахаридів

Сироваткове стандартне середовище (195 об./06б.), доповнене різними концентраціями олігосахаридів (0,01, 01, 1, 10, 100мМ), використовували для аналізу чутливості до олігосахаридів по методу ОІапо-Мапіп єї а!., 2003. Клітини «підживлювали» експериментальним середовищем (що містить цікавлячий олігосахарид) щодня, і вимірювання прилипаючих клітин здійснювали шляхом видалення експериментальних середовищ і промивання клітин фізіологічним розчином без Са", забуференим фосфатом (рН 7, 9,вгл"). Потім прилиплі клітини трипсинізували і нейтралізували рівним об'ємом сироваткового стандартного середовища. Клітинну суспензію розбавляли в Ізоїоп ІЇ, і клітини підраховували на лічильнику Сошнег Сошпіег. Міру виживання клітин, виражену в процентах, розраховували таким чином (Фіг.1)

Уо виживання - (середнє поглинання оброблених клітин/середнє поглинання контролю) х 100

Аналіз адгезії

НТтТ29 клітини вирощували в 12-ямкових планшетах для культури тканини до стану 29095 конфлюентності за допомогою стандартного середовища. Для останнього до виконання аналізу живлення клітин використовували середовище без антибіотика.

Патогени вирощували в анаеробних умовах в культуральному середовищі без антибіотика протягом, принаймні, трьох пересівань. У день аналізу свіже заздалегідь відновлене середовище для культури тканини засівали 1095 патогенною культурою, вирощеною протягом ночі, і інкубували протягом 4год. до аналізу.

Основний розчин випробуваних олігосахаридів готували при концентрації 5М в забуференому фосфатом фізіологічному розчині і піддавали стерилізації фільтруванням.

Розбавлення 1/1000 патогенної культури, інкубованої протягом 4год., здійснювали в РВ5Б, і число клітин оцінювали шляхом підрахунку планшетів. Середовище видаляли з планшетів для культури тканини, і клітини промивали один раз в РВ5 (мл).

Для кожного досліджуваного олігосахариду О0,5мл розчину олігосахариду (5М) додавали до трьох ямок.

Забуферений фосфатом фізіологічний розчин (РВ5) без якого-небудь олігосахариду включали як контроль.

Суспензію культури 0,5мл додавали до всієї ямки, планшет струшували і інкубували в аеробних умовах при 372С протягом 2год.

Культуру видаляли, і всі ямки промивали три рази в стерильному РВ5 (мл на ямку). Після кінцевого промивання РВ5 видаляли, і 7О0мкл розчину трипсин/ЕОТА додавали до кожної ямки, перемішували і залишали протягом 5 хвилин при 3770.

На ямку додавали їмл РВ5 і піпеткою перемішували для того, щоб пересвідчитися, що всі клітини видалені з дна ямки і злиплі грудки розбиті.

Клітинну суспензію в кількості тїмл за допомогою піпетки вміщували в універсальний бутель МКЕО (Махітит Кесомегу Ойнеп!і) і далі розводили як призначено. Розведені суспензії вміщували на агарові пластини для рахунку (РСА) і інкубували при 37"С протягом 24год.

Після інкубації колонії підраховували і інгібування адгезії розраховували як відношення бактерій (КУО мл" 1), присутніх в зразку, до контролю (РВБ) (Фіг.2).

Висновок

Результати, представлені на Фіг.2, вказують на значне інгібування адгезії Е.соїї ЕРЕС і 5. їурпітигійт в присутності фракції дисахаридів, причому вказане інгібування також властиве суміші 505. Менший анти- адгезивний ефект спостерігається в присутності фракції більш високої, ніж трисахарид (три) в суміші, проти за4урпітигішт.

Аналіз чутливості до олігосахаридів здійснювали для того, щоб пересвідчитися в тому, що олігосахаридна суміш не є токсичною по відношенню до клітин НТ29 (фіг.1).

Посилання:

Оіапо-Мапіп Е., УМіШате М.А., сірзоп С.А8., Навіа! А.А. 2003 Ресіїп5 апа ресііс-оїїдозасснагідез іпнірії

Езспепсніа соїї 0157: Н7 5Ніда Ююхіп аз аїгесієд юмжмагавз те питап соіопіс сеї! їпе НТ29. РЕМ5 Місгобіо! І ецетгв 218 (1): 101-105.

Фіг.1. Виживаність клітин, на які впливали доданням різних концентрацій олігосахаридів (0,01-100МмМ), після 24 і 48год. інкубації.

Ффіг2. Вплив суміші олігосахаридів (всіх) і різних фракцій суміші на адгезію Е.соїї ЕРЕС, Е.соїї МТЕС і заітопеїйа їурпітигішт до клітин НТ29.

Приклад 6

Продукт 505, що використовується в даному експерименті, був зроблений, як описано раніше (приклад 1), і інулін був отриманий від Огаїйй| (ВеїІдіит).

Сорок невихолощених поросят, відлучених від матки, придбавали від 95. Сепеїїсз ЦЯ, Зошприт, Огітенїа,

МУогкзпіге. 025 9ЕО.

Після прибуття в Редінгський університет поросят вміщували в чотири групи по десять поросят протягом періоду сім днів, щоб дати поросятам час заспокоїтися після транспортування і звикнути до секції і харчування. Середня вага поросят при доставці була 14,7Окг.

Після семиденного періоду звикання поросят переміщували в індивідуальні невеликі загороди, в одній і тій же секції. Середня вага поросят при утриманні в індивідуальній загороді була 17,46кг.

Поросят ідентифікували за допомогою унікального татуювання на вухах, їх також індивідуально нумерували, використовуючи водостійкий маркер. Кожну індивідуальну загороду нумерували таким же ідентифікаційним номером, який використали, щоб позначити кожне поросятко.

Десяти поросятам встановлювали одну з чотирьох дієт, контрольну дієту (МЕС), дієту з доданням до контрольної дієти 1,695 (мас/мас.) 505, отриманих способом прикладу 1, дієту з доданням до контрольної дієти 495 (мас/мас.) 505 або дієту з доданням до контрольної дієти 1,695 (мас/мас.) інуліну.

Поросятам підстилали тирсу протягом всього дослідження, крім того, забезпечували соломою для поліпшення навколишнього оточення, а також були іграшки, щоб сприяти ослабленню апатії.

Протягом всього дослідження поросята отримували гранули ОеМКажеап 15 МОР (АВМ, АВМ Ноизе, РО Вох 250, Оцпаіе ка, Ууосазіоп, Регегрогопдп. РЕ ЗОРЕ), повнораціонний комбікорм, яким годували ад-ірнит для зростання поросят.

Поживний/мінеральний склад Пенахезп 15 МОР

Поживна речовина Включення

Масло Й І 3,390

Білок 19,25

Волокно 2,890

Зола 4,890

Волога 13,80

Вітамін А 9500 МО/кг

Вітамін Е, альфа токоферол 100 Мо/кг

Вітамін ОЗ 1850 Мо/кг

Селен, селеніт натрію 0,30 мг/кг

Лізин 1,3295

Мідь, сірнокисла мідь 170 мг/кг

Їжа поросят також містила дозволені антиоксиданти, бутильований гідроксіанізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ) і етоксихін.

Поросят розміщували довільно для обробки, хоча двох або трьох поросят, що піддаються однаковій харчовій обробці, індивідуально вміщували на один і той же майданчик групової загороди. Поросят групували таким шляхом, щоб уникнути змішування обробок, на випадок, якщо вони вибігали з індивідуальної загороди, тобто могли їсти тільки їжу, призначену для відповідної харчової обробки такого окремого поросятка.

Індивідуально вміщених поросят, в групах з двох або трьох, при однаковій обробці, розміщували довільно по всьому відсіку.

Фекальні зразки збирали від кожного поросятка на початку дієти і після чотирьох тижнів утримання на випробуваній дієті, і фекальні мікробні популяції визначали методом РІЗН (таблиця 4), як описано раніше (приклад 3). У кінці експерименту поросят забивали для отримання зразків вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки. Величини рН (таблиця 5), коротколанцюжкові жирні кислоти (ЗСЕА) (таблиця 6) і мікробні популяції (таблиця 7) визначали у вмісті проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки. Дані представлені як середні значення ж стандартне відхилення (50). Відмінності аналізували за допомогою 1- критерію Стьюдента. Відмінності вважали значними при Р«е0,05.

І Таблиця 4

Вплив обробки пребіотиками і дієти на міхробну популяцію в фекаліях поросят на початку і після чотирьох тижнів експериментального періоду

Час 05 Час 4 тижні тваА ТО топа а СО Талія 000

МЕС 169505 495005 Тнулін

Усього бактерій 8,75-0,22 8,97-0,24 8,99-0,23 8,9720,28 8,955-0,28

Війдобасієгійт 5рр. 6,48-0,29 6,910,252 7,070,237 7,34--0,2179 7,45н0 аю

Гасіобасіййе рр. 6,33--0,25 6,55-0,23 6,93-0,162 7,1750,249ч9 б,о4н0об

Васіегоїідев 5рр. 7,27-0,23 7,7550,249 7,84ь0,272 7,85-0,222 8 0дьО0 187

СіІозіпдіт 7,43-0,33 8,040,242 8,1450,252 83350282 82250237 візою уйсит (група)

КУО Іордуо/г фекалій; кожна величина є середньою ж 50), ж п-йО, ! п-10; відмінності аналізували за допомогою г-критерію Стьюдента.

Середні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Р-0,05) 7 від

МЕС," відСО5 1,695, 7 від часу 0.

Таблиця 5

Вплив обробки пребіотиками і дієти на рН зразків вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки

МЕС 169005 45605 інулін ---5-И5.УИИШВШ ТТН ДАТА а Б АНЯ

Проксим. сегмент товстої кишки 5,71--0,16 5,65530,11 5,9-0,14772 5,9050,27

Дистал. сегмент товстої кишки 7,163-0,04 7,16-50,03 7,16550,04 7,1250,02

Кожна величина являє собою середнє значення ж 50), п-10, Відмінності аналізували за допомогою (-критерію Стьюдента. Середні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Р«0,05) " від МЕС, " від 505 1,695, 7 від інуліну.

Й Таблиця 5

Вплив обробки пребіотиками і дієти на концентрації" ЗСЕА в зразках вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки

Пр оксимальний сегмент товстої кишки. но 1 Дистальний сегмент товстої кишки

МБО 0000 БббО5 49605 інулін ГоОоМЕо робо 00605 Інулін

Молочна кислота 2,62-0,73 6бокі,б7а дано золі Ма Мо че МО

Онтова кислота 4143653 444581 515768 44585331 31,015,50 30,6822,32 33,5752,21 ЗВ, 5аЖЗоВе

Пропіонова кислота. 35,58ж5,1 27,522,87 32.9948,39. 3063361 |15,365346 15275192 16754388 1736516

Масляна киснота 10,515:1,42 10,5751,56 1195324 1,563 бо | ія я 051309 ка

Кожна величина являє собою середнє значення ЖІ), и10. Відмінкості аналізували за допомогою. ї«критерію Стеюдента,

Сереяні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Р«0505)" від МЕС, є від 605 1,65, від інуліну. МІХ не визначали;" мкмоль/г в розрахунку на вологий матерів; І

Таблиця 7

Впилив обробки пребіотиками і дієти на мікробну популяцію в зразках вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кнІнКи І

Проксимальний сегмент товстої киткно 00000000 дистальний сегмент товстої кишки 33

МБ 166005 Жо0О5 0 інулін (00 МБО 01666085 46605 інулін

Усвого бактерій: 5бінвоЯ 85685022, 8еюві ооо 1 83028 0 БОДІ 880-025 855020,29

Війбобасістіштовро. 70133025 7308026 77026 7ать)3о 0 7035095 т0О5206 Тато 75ВЕОДо

Тастобасіа5 рр. 64023 77026 738,4" 7194024 ) 66003 боб 7Иибио35" 7055030

КУСМор /гз урахуванням вологи: кожна величина є серединою 5, пе 10; відмінності аналізували за допомогою критерію

Стеюдента. Середні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Ре 0053" від МЕС, 5 від 6О5 1,655, с від інуліву.

Висновок

Таблиця 5: спостерігається зниження рН в проксимальних сегментах кишки в присутності СО5 (для 1,695 і особливо для 490), що в поєднанні з даними 5СЕА (таблиця 6) свідчить про те, що продукт 5О5 досягає проксимальних частин кишки (продукти бродіння підвищені).

Таблиця 7: в присутності СО5 (4905) спостерігається значне збільшення в числі популяцій благотворних бактерій (біфідобактерії, молочнокислі бактерії) в проксимальних частинах кишки. Вказане збільшення числа популяцій нижче в дистальній частині і в фекальних зразках що можна пояснити тим фактом, що продукт бО5, мабуть, зазнає бродіння, головним чином, в проксимальній частині кишки. Результати обробки 1,695 бО5 показали подібну тенденцію.

У проксимальних сегментах кишки збільшення числа популяції біфідобактерій можна спостерігати, а також збільшення продукції оцтової кислоти (головний продукт бродіння біфідобактерій). На основі отриманих даних вважають, що продукт 5О5 є вельми виборчим відносно видів біфідобактерій.

Приклад 7

Вивчення окремих випадків

Вивчення випадку 1 - Запальне кишкове захворювання (ІВО)

Наводиться випадок з 43-річною хворою жінкою з діагнозом виразковий коліт (одна з основних форм ІВО), яка піддавалася лікуванню продуктом 505, приготованим за способом прикладу 1.

Хвора страждала від виразкового коліту протягом 5 років і не приймала лікування до і протягом періоду досліджень. Протизапальний засіб сульфасалазин використовували раніше, але без позитивного ефекту.

Хвора мала ускладнення в травленні їжі, була на стандартній дієті, страждала від нудоти, діареї і болів в животі. Біль був в лівому боці товстої кишки, що корелювало з діагнозом коліт на основі запалення низхідної ободової кишки.

Загальна добова доза СО5 7г/день (в 2 роздільні дози) була вжита. Протягом 4 днів прийому симптоми почали слабшати. Хвора могла краще перетравлювати їжу, кишкові болі почали відступати, і нудота поменшала. Клінічного аналізу за допомогою ендоскопії зроблено не було, але, проте, хвора переживала відчуття поліпшення здоров'я. Єдиною зміною в дієті було додання 505. Через шість тижнів цей ефект зберігався.

Хоч багаторазове дослідження на хворих не контролювали з плацебо, даний конкретний випадок представив окремий доказ позитивного ефекту пребіотика СО5 для однієї основної форми ІВО.

Вивчення випадку 2 - Синдром подразненої кишки (ІВ5)

Чоловік 27 років, який страждав від ІВ5 протягом З років, протягом З тижнів приймав 7г/день СО5, приготованого за способом прикладу 1, у вигляді двох роздільних доз. До цього періоду він відчував здуття живота, запор, кишковий біль і млявість. Спостерігалися класичні симптоми, асоційовані з ІВ5. Хворий не приймав антибіотики протягом 6 місяців і був на дієті без пшениці/глютену і цукру.

Після прийому пребіотиків спостерігали значне послаблення симптомів протягом З днів, і ефект зберігався. Суб'єкт говорить про помітне поліпшення загального стану і стану кишки, а саме: «Я тепер готовий пробігти марафон», Він приймає нормальну їжу без труднощів.

Дане повідомлення не контролювалося дослідженням, але було окремим прикладом, який показує, що 6О5 можуть поліпшувати стан ІВ5 і якість життя хворого.

Аналіз чутливості до олігосахаридів вот - п дтрк тире от овес ти и тр тес вин Пи и ен Овна: ря Е кю вк А р кт ЕЕ и Ми и у ти НК

ДЯ: де реє ре 0 Нв т | ГУДЯ що атиоріюй ОО БлСЯНІНЯ ситі 00 еконо ва що й пеня Бі евка ійети 0 онов юки к х-НВІ М есе ря вин евро ШІ є оре. чес кока ва БЕ вх їні жо ун ведення жи 0 Пежо ек Ви о» т ТА л Я й в У ек

В в. но на на че роя шо зіхие ся БеЯ Енея поем пев ех

Е- Каг.: з, теекльеої р жвет ГЕеюити розі у фе 8 85 ше ще у Не ся тій веде еф сот ПВС саме ння ше

Нет; Ей Берн ГЕДевен дЕБелис МН СНІ а ше сш ще и Кия ак Бо ення НЕ Де ЩІК КЕР зн ШИН віз юь ва в: 1 о чо

Олігосахарид, мМ Фіг

Вплив фракцій олігосахаридів на адгезію бактерій

БВ й в деп КК Я в и ДА т "в | ЕЕ ежлН й ев ВН в пн НЯ

Гм Мол тв в ек ЕН

Е ПД ун св м ен ши но а в - Сн си в В ЕН а ан

З рр с ПО ВВ етивиют щ То я оч ква МЕТО ен Бан зорі (ЗЕ со ЕРЕС. ц «Яке пив и В М ве ощ Мештикен в оо КДВЯИІ в еКе ИеК (оз з й ск Кене АН мА пот ве т Мавки в зем а ан и І Ева ше ШЕ о шо

Ю сиг ве І ее ма ке т

РОБ коні рюпь соб Де три зіех

Фракція олігосахаридів фіг