CN101372679A - 新的半乳糖寡糖组合物及其制备 - Google Patents
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Abstract
能够产生新的半乳糖苷酶酶活性的双歧杆菌新菌株，该酶活性将乳糖转化为半乳糖寡糖的新混合物。寡糖混合物可以掺入多种食品或动物饲料，通过促进肠中双歧杆菌的生长和抑制致病微生物菌群的生长而改善肠健康。
Description
本申请是申请日为2004年6月30日、发明名称为“新的半乳糖寡糖组合物及其制备”的中国发明专利申请No.200480010853.8的分案申请。
本发明涉及产生新的半乳糖苷酶酶活性的双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)新菌株，该酶活性能够将乳糖转化为半乳糖寡糖(galactooligosaccharides)的新混合物。半乳糖寡糖是不可消化的碳水化合物，它抵抗哺乳动物胃肠消化酶，但是通过特殊的结肠细菌发酵。本发明也涉及双歧杆菌菌株制备能够促进肠中双歧杆菌生长的新半乳糖寡糖组合物的用途。它也涉及半乳糖寡糖产物的新组合物。
人肠菌群包括致病的、良性的和有益的微生物属。前者占优势可以引起肠紊乱，可以是急性的(如胃肠炎)和慢性的(如炎性肠病、过敏性肠综合征和一些肠癌)。已经尝试向适当的食品载体添加一种或多种有益微生物菌株来影响肠菌群的平衡有利于有益的微生物，如双歧杆菌。这种活微生物饲料添加剂被称为是益生菌制剂。然而，很难保证活细菌在食品中以及消化后的存活。
饮食操作肠菌群的可选择方法是使用益生素，其定义为不可消化的食品成分，通过选择性刺激结肠中一种或有限数目的细菌的生长和/或活性，而有益地影响宿主，由此引起宿主健康改善。
人大肠的菌群在出生时获得。母乳喂养的婴儿具有双歧杆菌优势，容易地竞争超过其它属。这是因为人乳成分是刺激性的。相比之下，配方喂养的婴儿具有更复杂的菌群，它类似成年人肠，在于类杆菌、梭状芽孢杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、革兰氏阳性球菌、大肠杆菌和其它群全部表现出相当平等的比例。通常认为双歧杆菌在大肠感染方面是保护性的，这个差异可能解释了与以配方奶为食的婴儿相比，母乳喂养的婴儿感染发生率低得多。
肠菌群的某些成分和肠疾病的病因学有牵连。例如，分枝杆菌与节段性回肠炎有关，硫酸盐还原细菌可以触发溃疡性结肠炎和在肠癌发生中可能有细菌涉及。如果通过益生素的摄取可以助长固有有益肠细菌的选择性生长，显然将有益。这将具有致病菌群被抑制的进行性效果。
被分类为益生素的一组化合物是半乳糖寡糖，它是含半乳糖的寡糖，形式为Glc α1-4[β Gal 1-6]n，其中n＝2-5，是利用酶β-半乳糖苷酶的转半乳糖基酶活性，从乳糖糖浆制备的(Crittenden，(1999)Probiotics：A Critical Review.Tannock，G.(ed)HorizonScientific Press，Wymondham，pp.141-156)。当前市场上可买到三种产品，具有稍有不同的组成。这些中的第一个，转半乳糖基寡糖(TOS)是使用来自米曲霉的β-半乳糖苷酶制备的(Tanaka等人，(1983)Bifidobacteria Microflora，2，17-24)，由三、四、五和六-半乳糖-寡糖组成。第二个是Oligomate 55，它是使用来自米曲霉和嗜热链球菌的β-半乳糖苷酶制备的(Ito等人，(1990)，Microbial Ecologyin Health and Disease，3，285-292)，含有36％三、四、五和六-半乳糖-寡糖，16％二糖-半乳糖基葡萄糖和半乳糖基半乳糖，38％单糖和10％乳糖。最后，转半乳糖基二糖(TD)制剂是使用来自嗜热链球菌的β-半乳糖苷酶制备的(Ito等人，(1993)，J.Nutritional Science andVitaminolog39，279-288)。
众所周知双歧杆菌成员产生涉及乳糖细菌代谢的β-半乳糖苷酶。Moller，P.L.等人在Appl.& Environ.Microbiol.，(2001)，62，(5)，2276-2283描述了来自双歧双歧杆菌菌株的三个β-半乳糖苷酶基因的分离和表征。
美国专利公开号US 2002/0086358描述了来自双歧双歧杆菌的新β-半乳糖苷酶，尤其是具有高转半乳糖基活性的酶的截短形式。虽然据说乳糖培养可以在0.5-60％乳糖存在下发生，但是转半乳糖基反应产生的半乳糖寡糖的最大示例产量是44％(每毫克添加的乳糖产生的毫克寡糖)。此外，根据该美国专利公开中的寡糖定义，显然该产品由至少三个连接的糖分子组成。
Dumortier等人在in Carbohydrate Research，201，(1990)，115-123描述了通过用双歧双歧杆菌DSM 20456进行乳糖水解过程中的转半乳糖基反应形成寡糖。其对产生的寡糖混合物的结构分析表明连键是β-(1→3)、β-(1→6)和β-(1→4)-D-半乳糖基键。Dumortier提示双歧双歧杆菌产生的化合物参与大肠中细菌的粘附。
现在发现双歧杆菌菌株不仅能够产生将乳糖转化为半乳糖寡糖混合物的半乳糖苷酶酶活性，而且能够产生含有多达35％二糖galabiose(Gal(α1-6)-Gal)的半乳糖寡糖混合物。已知后者(见Paton，J.C.&Paton，A.W.(1989)，Clin.Microbiol.Revs.，11，450-479；Carlsson，K.A.(1989)，Ann.Reviews Biochem.，58，309-350.)是抗粘着剂，能够阻止毒素如志贺毒素和病原体如大肠杆菌粘附于肠壁。
根据本发明，提供了能够产生半乳糖苷酶酶活性的双歧双歧杆菌菌株，该酶活性将乳糖转化为半乳糖寡糖混合物，包含至少一个二糖，至少一个三糖，至少一个四糖和至少一个戊糖。优选该混合物包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
关于本发明半乳糖苷酶酶活性中使用的术语“酶活性”是由至少一个半乳糖苷酶引起的活性。
一方面，已经发现半乳糖寡糖混合物包含二糖Gal-Gal、三糖Gal-Gal-Glc、四糖Gal-Gal-Gal-Glc和戊糖Gal-Gal-Gal-Gal-Glc，其中Gal表示半乳糖残基和Glc表示葡萄糖残基。
使用甲基化分析和酶水解，已经发现半乳糖寡糖混合物包含Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc四糖；Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc三糖；Gal(β1-3)-Glc、Gal(β1-3)-Gal、Gal(β1-6)-Gal和Gal(α1-6)-Gal二糖。
如上定义的能够产生将乳糖转化为半乳糖寡糖混合物的半乳糖苷酶酶活性的双歧双歧杆菌菌株已经于2003年3月31日保藏在亚伯丁国立工业和海洋微生物保藏有限公司，保藏号为NCIMB 41171。
这种保藏的双歧双歧杆菌菌株或其生物学功能等效物可用于制备如上定义的半乳糖寡糖混合物。半乳糖寡糖混合物可以形成通过促进肠中双歧杆菌的生长而改善肠健康的产品的一部分，特别是起源生产菌株。这种产品可以选自：乳制品(例如鲜奶、干奶粉如全脂奶粉、脱脂奶粉、换脂(fat-filled)奶粉、乳清粉、婴儿奶、冰淇淋、酸乳、乳酪、发酵乳制品)、饮料、婴儿食品、谷类、面包、饼干、糖果、蛋糕、食品添加剂、营养添加剂、动物饲料、家禽饲料或实际上任何其它食品或饮料。
寡糖混合物也可以用于预防病原体或病原体产生的毒素粘附于肠壁的药物的制备。混合物可以在抗生素治疗疗程后给予患者，抗生素治疗常常改变乃至破坏正常的健康肠菌群，或在肠手术后给予，为了在肠中“重新播种”或重建健康肠的正常菌群。半乳糖寡糖混合物可以与上面提及的双歧双歧杆菌菌株或生物学功能等效物组合使用。
短语“生物学功能等效物”被解释为指能够产生半乳糖苷酶酶活性的双歧双歧杆菌菌株，该酶活性将乳糖转化为如上定义的半乳糖寡糖混合物。
根据本发明的另一方面提供了促进双歧杆菌生长的半乳糖寡糖组合物，包含作为有效组分的至少一个二糖、至少一个三糖、至少一个四糖和至少一个戊糖。
半乳糖寡糖组合物优选包含如在上文中描述的半乳糖寡糖混合物。
优选半乳糖寡糖组合物包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
根据本发明的又一个方面提供了制备促进双歧杆菌生长的物质的方法，其特征在于用如上定义的双歧双歧杆菌菌株处理乳糖或含有乳糖的材料。
合适的含有乳糖的材料可以选自市场上可买到的乳糖、全脂奶、半脱脂乳、脱脂乳、乳清和换脂奶。这种乳品可以从母牛、水牛、绵羊或山羊获得。换脂奶定义为已经被脱脂而除去乳脂肪，随后添加植物油脂或油来替代的全脂奶。
使用补充除乳糖以外的碳水化合物底物的生长培养基，发现根据本发明的双歧双歧杆菌可以利用麦芽糖、棉子糖、木聚糖和果糖。在补充这些碳水化合物之一的培养基中培养细菌分别诱导α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、木糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶的表达并由此导致α-葡糖寡糖、α-半乳糖寡糖、木糖寡糖和果糖寡糖的产生。
在引出本发明的研究中，筛选能够产生半乳糖苷酶并由此具有产生半乳糖寡糖最高潜力的源自肠的细菌。结果，发现属于双歧杆菌属的某些细菌，尤其是双歧双歧杆菌，不仅能够产生半乳糖苷酶酶活性，而且该酶可以将乳糖转化为包含20至35％w/v的二糖、20至35％w/v的三糖、15至25％w/v的四糖、10至20％w/v的戊糖的半乳糖寡糖混合物。双歧双歧杆菌的具体实例于2003年3月31日保藏在亚伯丁NCIMB，保藏号为41171。
为了培养这些细菌，可以利用任何营养源，只要它可以被细菌同化。可以用例如碳水化合物如乳糖、蔗糖或葡萄糖；含氮无机或有机营养源如酵母抽提物、胰胨、肉浸汁(Lab Lemco)等等；无机营养源如磷酸盐、钾等等配制适当的培养基。对于培养，营养培养基的pH应该在6.0至8.0的范围内，优选7.0，和在35至40℃，优选37℃的温度范围下厌氧培养40至64小时，优选50小时。
可以用任何已知培养方法培养该菌株，如静置相培养、厌氧深层培养或振荡培养。离心或过滤收获细菌细胞并且该细胞可以就这样被用作反应催化剂，不用进一步处理。可选择地，该细胞可以通过适当固定操作以固定状态使用。
本发明的双歧双歧杆菌可以用来将乳糖本身或乳制品中包含的乳糖转化为本发明的新的半乳糖寡糖组合物。转化后，可以离心除去细菌细胞。可以采用例如与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养除去存在的任何单糖。随后该混合物可以受到离心和微量过滤。接着所得的GOS溶液可以被喷雾干燥制备粉剂。
含有用这种方法制备的本发明半乳糖寡糖组合物的奶可以直接给予儿童、成人或动物。或者，它可以用于制备产品如面包、糖果等等，酸性和高温条件下半乳糖寡糖的稳定性使其能够使用而不分解。或者可以将GOS粉剂添加到如上列出的产品中。
GOS粉剂可以给予罹患肠紊乱如炎性肠病和过敏性肠综合征的患者，在这样的情况下该患者可以摄取2至20g的日剂量，优选5至10g，最优选7g，以分开的两剂服用。
或者，本发明的半乳糖寡糖组合物可以与根据本发明的双歧双歧杆菌的培养物混合制备改善肠健康的混合物。这种混合物被分类为synbiotic，其定义为“通过改善活微生物营养添加剂在胃肠道的生存和植入而有益影响宿主的益生菌与益生素的混合物”(见Gibson andRoberfroid，1995，Dietary modulation of the human microbiota：introducing the concept of prebiotics.Journal of Nutrition125，1401-1412)。这种组合通过提供可利用的选择性底物来增强益生菌在结肠有害环境中的生存。细菌益生菌可被微囊包封在半乳糖寡糖益生素中来制备例如粉剂，接着该粉剂可以添加到乳制品如酸乳中，或用作营养添加剂。
摄入含有本发明半乳糖寡糖组合物的奶或其它产品的优点是它促进肠中有益双歧杆菌水平增加，以肠菌群中存在的其它不那么令人期望的细菌为代价，如梭状芽孢杆菌。因此，对个体健康可能具有有害作用的某些固有细菌减少。于是这将导致胃肠道感染减少。它有助于预防或治疗结肠炎，缩短腹泻事件和降低慢性肠疾病如溃疡性结肠炎和癌症的风险。它还可有助于减轻过敏性肠综合征的症状。
饲以补充例如粉剂形式的本发明的半乳糖寡糖组合物的饮食的农畜可显示出其饲料重量转化改善。
将参考下列实施例进一步描述本发明。
实施例1
含有10.0g/l胰胨、5.0g/l Lab-LEMCO(肉浸汁)、5.0g/l酵母抽提物、3.0g/l K HPO、0.05g/l半胱氨酸HCL、10g/l乳糖和1ml/l吐温80的1L培养基(pH7.0)在121℃灭菌15分钟。灭菌之后，培养基接种1.0％(v/v)新鲜双歧双歧杆菌NCIMB 41171培养物并在厌氧条件下37℃培养50小时。离心(30000g，20分钟)收获细菌细胞。磷酸盐缓冲液(0.02M，pH7.0)洗两次之后，细胞随时可用于寡糖合成反应。
细菌细胞(40单位的β-半乳糖苷酶活性)重悬于含有50g乳糖的100ml磷酸盐缓冲液(0.02M，pH7.0)中。允许反应在40℃进行，7小时后，混合物由35％(w/v)水解产物(葡萄糖、半乳糖)、37％(w/v)乳糖和18％(w/v)半乳糖寡糖组成，聚合度在2-5之间。离心(3000g，20分钟)除去细菌细胞之后，与酿酒酵母培养除去单糖(葡萄糖和半乳糖)。随后离心(10000g，10分钟)除去酵母，然后为了保证产物的微生物学质量，混合物通过0.1μm微量过滤器过滤。然后为了获得粉剂形式，喷雾干燥该糖溶液。通过高效液相色谱，使用配备有APEX碳水化合物柱(Jones Chromatography，Mid Glamorgan，UK)和Merck-Hitachi LaChrom RI检测器的Merck-Hitachi LaChrom系统(Merck，Poole，Dorset，UK)定量分析产物。在25℃70％(v/v)乙腈用作洗脱剂和流速是0.8ml/分钟。半乳糖寡糖混合物由25％ Gal-Gal、35％ Gal-Gal-Glc、24％ Gal-Gal-Gal-Glc和16％ Gal-Gal-Gal-Gal-Glc组成。
实施例2
根据实施例1制备双歧双歧杆菌NCIMB41171细胞并添加到搅拌箱中的500ml脱脂乳中，添加(300单位β-半乳糖苷酶活性)。允许乳糖转化在40℃进行。8小时后，半乳糖寡糖浓度是22％(w/v)和混合物包含28％ Gal-Gal、32％ Gal-Gal-Glc、21％ Gal-Gal-Gal-Glc和19％Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
实施例3
体外肠模型
在接种来自健康人志愿者的10％(w/v)粪便匀浆于不含和含根据实施例1制备的1％(w/v)GOS混合物的生长培养基的三级连续发酵罐(Macfarlane等人，1998，Microbial Ecology，35，180-187)中仿制结肠中的条件(表2)。该模型由三个容器V1、V2和V3组成，各自运行体积是270、300和300ml。温度设置在37℃，连同pH自动控制。三个容器中的培养物pH分别维持在5.5、6.2和6.8。磁力搅拌每个发酵罐并通过连续喷射无O2的N2(15ml/分钟)保持在厌氧条件下。生长培养基含有下列成分：淀粉8g/l、粘蛋白4g/l、酪蛋白3g/l、蛋白胨水5g/l、胰胨水5g/l、胆汁N°30.4g/l、酵母4.5g/l、FeSO40.005g/l、NaCl4.5g/l、KCl4.5g/l、KH2PO40.5g/l、MgSO4·7H2O1.25g/l、CaCl2.6H2O0.15g/l、NaHCO31.5g/l、吐温80 1ml、氯化血红素0.05g/l，半胱氨酸.HCl 0.8g/l。培养基通过蠕动泵送到V1，V1顺序地通过一系列管供应V2和V3。该系统以约36小时的保留时间运行。在接通培养基泵之前，肠模型放置平衡过夜，引入含有试验底物的培养基之前运行至少10天，然后进一步放置10天。在每个循环首尾取出样品。取出的样品体积是5ml，这个量用于细菌组计数。
荧光原位杂交(FISH)
通过使用FISH，用设计对准16S rRNA诊断区域的寡核苷酸探针估计细菌群体的差异。商业合成这些探针并用荧光染料Cy3(由Eurogentec UK Ltd提供)标记。表1给出所利用的分子探针。对于总细菌计数，使用核酸染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。从发酵容器获得的样品稀释于4％(w/v)仲甲醛并在4℃固定过夜。然后细胞以1500xg离心5分钟，用磷酸缓冲盐水(PBS；0.1M，pH7.0)洗涤两次，重悬于PBS/99％乙醇(1:1w/v)的混合物中并在-20℃保存至少1小时。然后向杂交混合物中添加细胞悬液并留置在每个探针适当的温度下杂交过夜。使用0.2μm Isopore膜滤器(Millipore Corporation，Herts，UK)真空过滤杂交混合物。取出滤器，置于带有SlowFade(Molecular Probes，Eugan，OR，USA)的玻片上并在荧光显微镜(NiconEclipse，E400)下检查。在紫外线灯下检查DAPI染色的细胞并使用DM510滤光片观察杂交的细胞。对于每个玻片，计数至少15个不同的视野。
表1.使用FISH用于表征肠菌群的寡核苷酸探针
| 探针 | 序列 | 目标属 | 温度 | 参考文献 |
| Bac303 | 5′-CCAATGTGGGGGACCTT-3′ | 类杆菌属 | 45℃ | Langendijk等人(1995) |
| Bif164 | 5′-CATCCGGCATTACCACCC-3′ | 双歧杆菌属 | 50℃ | Manz等人(1996) |
| Chis150 | 5′-AAAGGAAGAUUAAUACCGCAUA-3′ | 溶组织梭状芽孢杆菌组 | 50℃ | Franks等人(1998) |
| Lab158 | 5′-GGTATTAGCA(T/C)CTGTTTCCA-3′ | 乳杆菌/肠球菌属 | 45℃ | Harmsen等人(1999) |
结果
表2.当商品化GOS(Vivinal(RTM))用作底物，每天7g时，FISH测定的体外肠模型中的细菌群。
表3.当本发明的合成GOS用作底物，每天7g时，FISH测定的体外肠模型中的细菌群。
结论
从表3可见本发明的GOS混合物显示出更好的益生素性能(即与商品化的GOS等同物相比，双歧杆菌增加较高，以及类杆菌减少)(见表2)。容器1(V1)和2(V2)中益生素效果更强，这可由本发明GOS由低分子量寡糖组成的事实来解释。
实施例4
甲基化分析
在以每分钟3ml用水洗脱的Biogel P2(Pharmacia)柱上凝胶过滤来纯化根据实施例1制备的半乳糖寡糖合成产物。
甲基化分析测定各个半乳糖寡糖制剂的连键位置。用氩冲洗后，冷冻干燥样品(5-6mg)在20℃分散于无水二甲基亚砜(DMSO)中16小时。通过顺序添加粉末氢氧化钠(0.5g)和碘代甲烷(4ml)(Ciucanu和Kerek，1984；MacCormick等人，1993)对它们进行甲基化。在C18键合柱(Sep-Pak，Waters，Watford，UK)上洗脱提取之后，干燥甲基化碳水化合物，提取入CHCl3/CH3OH(1:1，v:v)并蒸干。使用三氟乙酸(Blakeney等人，1983)水解样品，并通过NaBD4还原作用和用乙酸酐和N-甲基咪唑乙酰化而转化为部分甲基化的糖醇醋酸酯(PMAAs)(Alberscheim等人，1967)。
通过GC在交联的50％氰基丙基甲基-50％苯基甲基聚硅氧烷柱(Thames Chromatrography，Maidenhead，UK)上，使用火焰电离检测器和温度程序：55℃(2分钟)，+45℃分钟-1(1.9分钟)，140℃(2分钟)，+2℃分钟-1(35分钟)，210℃(40分钟)，分析PMAAs。通过测量它们相对于肌醇六乙酸盐的保留时间并将相对保留时间与外部标准比较而鉴定PMAAs。通过甲基糖苷的慎重甲基化制备对于每种糖的标准的混合物(Doares等人，1991)。峰面积代表使用有效碳响应因子的相对摩尔量(Sweet等人，1975)。
通过它们的电子电离质谱(Carpita和Shia，1989)证实PMAAs的身份。在连接Fisons Analytical Trio 1S质谱仪的相同GC上，使用200℃的源温度和70eV的电离电位进行GC-MS分析。
为了测定合成产物的端基异构构型，用α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶(Melibiase；Sigma)在建议的最佳条件下处理寡糖30分钟。HPLC分析反应产物。
结果
从上面的分析估计寡糖结构是四糖部分Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、三糖部分Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc；Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc和二糖部分Gal(β1-4)-Glc(乳糖底物)；Gal(β1-3)-Glc；Gal(β1-3)-Gal；Gal(β1-6)-Gal；Gal(α1-6)-Gal(galabiose)。
Gal：半乳糖，Glc：葡萄糖
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实施例5
材料和方法
HT29细胞系从欧洲应用微生物学和研究细胞培养保藏中心获得。细胞原种在37℃潮湿5％CO2下，补充5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100mM青霉素、0.1M链霉素、非必需氨基酸(NEAA x100)和200mM α-谷氨酰胺的含高葡萄糖标准培养基Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)中培养。每48小时再次喂饲细胞并在达到融合前传代。
寡糖敏感性测定
补充不同浓度寡糖(0.01、0.1、1、10、100mM)的血清标准培养基(1％v/v)用于根据Olano-Martin等人2003的寡糖敏感性试验。每日给细胞再喂饲实验培养基(含有感兴趣的寡糖)，通过除去实验培养基并用无钙磷酸盐缓冲盐水(pH7，9.6gL-1)洗去细胞而进行粘附细胞的测定。胰蛋白酶消化粘附细胞并用等体积血清标准培养基中和。细胞悬液稀释于Isoton II中，并在Coulter Counter中对细胞计数。如下计算细胞存活百分比(图1)
生存％＝(处理的细胞的平均吸光度/对照的平均吸光度)x 100
粘附试验
HT29细胞在12孔组织培养平板中生长至>90％融合，使用标准培养基。对于进行试验前的最后一次细胞喂饲，使用无抗生素的培养基。
病原体厌氧生长在无抗生素的细胞培养基中至少三次继代培养。试验当天，新鲜预还原组织培养基中接种10％过夜病原体培养物并在试验前培养4小时。
测试寡糖的原液制备成磷酸盐缓冲盐水中5M的浓度并过滤除菌。
在PBS中制备1/1000稀释的4小时病原体培养物并通过平板计数来计数。从组织培养平板中吸出培养基，细胞在PBS(1ml)中洗一次。
对于每个试验寡糖，向三个孔中添加0.5ml寡糖(5M)溶液。无任何寡糖的磷酸盐缓冲盐水(PBS)包括在内作为对照。向所有孔中添加0.5ml培养悬液，摇动混合平板并在37℃有氧培养2小时。
吸出培养物，所有孔在无菌PBS(每孔1ml)中洗涤三次。最后一次洗涤之后，吸出PBS并向每孔添加70μl胰蛋白酶/EDTA溶液，混合并在37℃静置5分钟。
每孔添加1ml PBS并用吸管混合以保证所有细胞从孔底部移除并打碎凝块。
用吸管将1ml细胞悬液吸入通用的MRD(最大回收稀释)瓶并酌情进一步稀释。稀释液在平板计数琼脂(PCA)上铺开，并在37℃培养24小时。
培养后，对菌落计数并以样品中存在的细菌(c.f.uml-1)与对照(PBS)的比率计算粘附抑制(图2)。
结论
图2中显示的结果表明在二糖部分存在下，对大肠杆菌EPEC和鼠伤寒沙门氏菌粘附的强烈抑制，在GOS混合物中也存在这种抑制。在混合物中高于三糖(>三)部分的存在下，对抗鼠伤寒沙门氏菌的抗粘附作用较低。
进行寡糖敏感性试验以保证寡糖混合物对HT29细胞没有毒性(图1)。
参考文献
Olano-Martin E.，Williams M.R.，Gibson G.R，RastallRA.2003.Pectins and pecticoligosaccharides inhibit Escherichiacoli0157：H7 Shiga toxin as directed towards the human coloniccell line HT29.FEMS Microbiol Letters 218(1)：101-105
图1.添加不同寡糖浓度(0.01-100mM)培养24和48小时后影响的细胞存活率。
图2.寡糖混合物(ALL)和混合物的不同部分对大肠杆菌EPEC、大肠杆菌VTEC和鼠伤寒沙门氏菌与HT29细胞粘附的作用。
实施例6
如前所述(实施例1)制备该试验中使用的GOS产物，菊粉从Orafti(比利时)获得。
四十头断奶未去势猪购自JSR Genetics Ltd，Southburn，Driffield，Yorkshire.Y025 9ED
到达Reading University时，将猪以每组十头猪的四组分组圈养七天的时间以允许猪在运送后定居下来和适应单元和饮食。交货时猪的平均体重是14.70公斤。
七天适应期后，将猪转入单独的圈栏，相同单元内。单独圈栏时猪的平均体重是17.46公斤。
通过独特的耳刺花辨认猪，也使用防水stock记号笔对它们进行单独编号。用与用于标记每头猪的相同标识号对每个单圈栏进行编号。
给十头猪分配四种饮食之一：对照饮食(NEG)、向对照饮食补充根据实施例1制备的1.6％(w/w)GOS的饮食、向对照饮食补充4％(w/w)GOS的饮食或向对照饮食补充1.6％(w/w)菊粉的饮食。
贯穿该研究，猪睡在锯屑上，也提供稻草丰富环境以及提供玩具以帮助减轻厌倦。
贯穿该研究，猪接受Deltawean 15 NGP pellets(ABN，ABN House，PO Box 250，Oundle Rd，Woodston，Peterborough.PE 9QF)，这是一种随意喂给生长中的猪的完全饲料。
Deltawean 15 NGP的营养物/矿物质组成
| 营养物 | 含量 |
| 油 | 3.3％ |
| 蛋白 | 19.2％ |
| 纤维 | 2.8％ |
| 灰 | 4.8％ |
| 水分 | 13.8％ |
| 维生素A | 9500i.u./kg |
| 维生素E，α生育酚 | 100i.u./kg |
| 维生素D3 | 1850i.u./kg |
| 硒、亚硒酸钠 | 0.30mg/kg |
| 赖氨酸 | 1.32％ |
| 铜、硫酸铜 | 170mg/kg |
猪食也含有允许的抗氧化剂、丁化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)和乙氧喹。
将猪随机分配进行处理，但相同饮食处理的二或三头猪单独圈养在相同组圈栏区域。如果猪逃离各自的圈栏，用这种方法对猪进行分组可以避免处理混淆，即其仅仅能够偷取含有对该特定猪的正确饮食处理的食物。单独圈养的猪，以每组两头或三头，接受相同处理，贯穿整个单元都随机分配。
喂养试验饮食开始和四周后，从每头猪收集粪便样品，并使用如前所述(实施例3)的FISH确定粪便微生物群(表4)。在实验结尾，屠杀猪获得近端和远端结肠内容物样品。测定近端和远端结肠内容物的pH值(表5)、短链脂肪酸(SCFA)(表6)和微生物群(表7)。数据显示为均值±标准偏差。用Student′st检验分析差异。P<0.05认为差异显著。
表4开始和四周实验期后，益生素处理和饮食对猪粪便中微生物群的作用
cfu log10/g粪便；每个值是均值±SD，*n＝40，+n＝10；Student′s t检验分析差异。行中具有上标的均值与aNEG、bGOS1.6％、00时间有显著差异(P<0.05)。
表5 益生素处理和饮食对近端和远端结肠样品pH的作用。
| NEG | 1.6％GOS | 4％GOS | 菊粉 | |
| 近端结肠 | 5.71±0.16 | 5.65±0.11 | 5.49±0.14a，b，c | 5.90±0.27 |
| 远端结肠 | 7.16±0.04 | 7.16±0.03 | 7.16±0.04 | 7.12±0.02 |
每个值是均值±SD，n＝10。Student′s t检验分析差异。具有上标的行中的均值与aNEG，bGOS 1.6％，c菊粉有显著差异(P<0.05)。
结论
表5：GOS(1.6％和特别是4％)存在下近端结肠pH有下降，其结合SCFA数据(表6)提示GOS产物到达近端结肠(发酵产物增加)。
表7：GOS(4％)存在显示近端结肠中有益细菌(双歧杆菌、乳杆菌)的种群数量显著增加。远端部分和粪便样品中种群数量的这种增加较低，GOS产物似乎主要在近端结肠发酵的事实可以解释该结果。1.6％GOS处理显示类似的趋势。
在近端结肠中可以看到双歧杆菌种群数量增加，以及乙酸(双歧杆菌的主要发酵产物)产生增加。这提示GOS产物对双歧杆菌物种非常有选择性。
实施例7 病例研究
病例研究1-炎性肠病(IBD)
引用诊断为溃疡性结肠炎(2种主要形式IBD中之一)的一名43岁女性患者作为病例研究根据实施例1制备的GOS产物的作用。
该患者罹患溃疡性结肠炎5年并在测试期前和期间未进行药物治疗。以前使用过抗炎剂柳氮磺胺吡啶，但是没有阳性效果。患者消化食物有困难，接受标准饮食，有恶心、腹泻和腹痛。后者是左侧大肠，与基于结肠炎的降结肠炎症的诊断有关。
每日摄取GOS 7g/天的总剂量(分开的2剂)。摄入4天内，症状开始改善。患者能更好消化她的饮食，肠痛开始减弱和恶心减轻。虽然没有内窥镜检查的临床分析，但是患者的健康感觉明显改善。饮食的唯一改变是GOS的添加。六周以后，这种作用得以维持。
虽然不是设安慰剂对照的多患者研究，但是这个病例研究为益生素GOS在一种主要形式IBD中的积极效果提供了轶事证据。
病例研究2-过敏性肠综合征(IBS)
已罹患IBS3年的27岁男性摄取7g/天根据实施例1制备的GOS(以分开的两剂)3周。这个时期之前，他经历了肿胀、便秘、肠痛和疲乏。这些是与IBS有关的经典症状。该患者6个月未曾摄取抗生素并接受小麦/面筋和无糖饮食。
摄取益生素后，3天内这些症状明显减轻并得以维持住。该受试者报道了总体健康和肠健康的戏剧性改善，即“我现在准备跑马拉松”。他能够无困难地摄取正常饮食。
这个报告不是有对照的试验，但是确实充当了表明GOS可改善IBS病情和使患病者恢复较好生活质量的轶事证据。
Claims (9)
1.一种能够产生半乳糖苷酶酶活性的双歧双歧杆菌菌株，该酶活性将乳糖转化为半乳糖寡糖混合物，所述半乳糖寡糖混合物包含至少一个二糖，至少一个三糖，至少一个四糖和至少一个戊糖。
2.根据权利要求1的菌株，其中在半乳糖寡糖混合物中，二糖是Gal-Gal，三糖是Gal-Gal-Glc，四糖是Gal-Gal-Gal-Glc和戊糖是Gal-Gal-Gal-Gal-Glc，其中Gal表示半乳糖残基和Glc表示葡萄糖残基。
3.根据权利要求1或权利要求2的菌株，其中半乳糖寡糖混合物包含Gal(α1-6)-Gal、Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc、Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc。
4.根据权利要求1至3任一项的菌株，其中半乳糖寡糖混合物包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
5.根据权利要求1至4任一项的菌株或其生物学功能等效物，该菌株于2003年3月31日保藏在英国亚伯丁国立工业和海洋微生物保藏有限公司，保藏号为NCIMB 41171。
6.一种制备促进双歧杆菌生长的物质的方法，其特征在于用根据权利要求1至5任一项的双歧双歧杆菌菌株处理乳糖或含有乳糖的材料。
7.根据权利要求6的方法，其中含有乳糖的材料选自市场上可买到的乳糖、全脂奶、半脱脂奶、脱脂乳、乳清和换脂奶组成的组。
8.根据权利要求7的方法，其中奶从牛、水牛、绵羊或山羊获得。
9.根据权利要求6至8任一项的方法，其中除去双歧双歧杆菌细胞后，喷雾干燥该物质而制备粉剂。
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