CN103037877A - 用于在大肠中增加双歧杆菌和抑制双歧杆菌减少的试剂 - Google Patents

用于在大肠中增加双歧杆菌和抑制双歧杆菌减少的试剂 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于在肠中有效增加双歧乳杆菌的方法和手段。具体地，公开了一种在肠中控制双歧乳杆菌增加和/或减少的试剂，所述试剂包含孢子形态的枯草芽孢杆菌；以及在保持孢子形态的同时将所述孢子形态输送至受试者肠的手段。

Description

用于在大肠中增加双歧杆菌和抑制双歧杆菌减少的试剂
技术领域
本发明涉及一种在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的试剂和方法。更具体地，本发明涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子用于在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的用途。
背景技术
迄今为止，在成人肠中已报道了以下四种优势双歧杆菌菌株：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)(Matsuki,T.等，Appl.Environ.Microbiol.70(1):167-173,2004)。已证实双歧杆菌不仅对肠调节有效，而且还对免疫调节和血脂水平的改善等有效。因此，已进行了增加肠中的双歧杆菌的尝试。已知包括口服摄入耐胃酸的双歧杆菌作为益生菌(probiotics)的方法和包括摄入寡糖作为益生元(prebiotics)的方法为增加肠内双歧杆菌的方法。
目前，摄取乳酸菌和上述双歧杆菌作为益生菌已变得普遍(JP专利公布2007-091704A)。然而，由于个体间有很大的差异，并且摄取菌株的定殖率(colonization rate)在个体间也是变化的，因此益生菌在所有人中不总是产生类似的结果(Kagaku toSerbutsu 47(2):78-80,2009)。
摄取双歧杆菌的生长因子(如，寡糖)作为益生元也变得普遍。已发现此类益生元对于青春双歧杆菌的生长是有效的；然而，并未证实它们对肠中的长双歧杆菌的生长有效(Asano等，Nippon Nogeikagaku Kaishi,75(10):1077-1083,2001)。
另外，已报道将双歧杆菌制剂与双歧杆菌的生长促进剂组合给药的组合物作为益生菌和益生元的组合制剂(JP专利公布2009-296910A)。
有报道称枯草芽孢杆菌对于促进肠细菌如双歧杆菌的生长是有用的(JP专利公布2009-296910A；和Ushijima，Medicine andBiology,128(1):9-14,1994)。据报导，枯草芽孢杆菌的萌发细胞(germinated cell)对于双歧杆菌的生长是有效的(Ushijima,1994 supra)，而枯草芽孢杆菌的孢子在小肠中萌发，以致萌发细胞促进肠细菌的生长(JP专利公布7-170975(1995)A)。
之前本申请人还报道了通过将孢子直接经口服途径向家畜(如猪和鸡)给药证实枯草芽孢杆菌的孢子具有肠调节作用(参见JP专利2528055B)。
发明内容
如上所述，本领域仍需要增加构建小型生物群(microbiota)的双歧杆菌，特别是增加作为小型生物群中主要菌株的长双歧杆菌的方法和手段(mean)。
本发明的目的为提供用于有效增加大肠中双歧杆菌的手段和方法。
作为为了实现上述目的而深入研究的结果，本发明人证实某些枯草芽孢杆菌的孢子在经过消化道时萌发。本发明人还发现枯草芽孢杆菌的孢子具有促进大肠中双歧杆菌生长的效果，而枯草芽孢杆菌的孢子，特别是与枯草芽孢杆菌(某些为萌发的)相比明显具有更显著的增加长双歧杆菌并抑制长双歧杆菌的减少的效果。基于这些发现完成了本发明。
具体地，将本发明描述如下。
[1]一种用于在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌的减少的试剂，其包括枯草芽孢杆菌的孢子，和在保持所述枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将所述孢子输送至受试者大肠的手段。
[2]根据[1]所述的试剂，其基本上无枯草芽孢杆菌的萌发细胞。
[3]根据[1]或[2]所述的试剂，其中枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌C-3102(FERM BP-1096)或其突变株或衍生株。
[4]根据[1]至[3]任一项所述的试剂，其中所述双歧杆菌为长双歧杆菌。
[5]根据[1]至[4]任一项所述的试剂，其用于口服给药和/或肠道内给药。
[6]根据[1]至[5]任一项所述的试剂，其用于饮食品、饲料或药品。
[7]根据[1]至[6]任一项所述的试剂，其用作整肠剂(intestinal regulatory agent)、抗变态反应剂或血脂水平改善剂。
[8]一种用于生产功能性饮食品的方法，其包括：
制备根据[1]至[7]任一项所述的试剂，和
将所述试剂引入饮食品中。
[9]一种功能性饮食品，其包含引入其中的根据[1]至[7]任一项所述的试剂。
[10]一种用于在受试者大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的方法，其包括：
在保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将有效量的枯草芽孢杆菌孢子输送至受试者大肠，或
直接将所述孢子给药至受试者大肠。
[11]根据[10]所述的方法，其中所述受试者为人类或非人类动物。
[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌C-3102(FERM BP-1096)或其突变株或衍生株。
[13]根据[10]至[12]任一项所述的方法，其中所述双歧杆菌为长双歧杆菌。
[14]根据[10]至[13]任一项所述的方法，其中所述孢子经口服给药和/或肠内给药向受试者给药。
[15]一种用于在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的试剂，其包括枯草芽孢杆菌的孢子，和在保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将所述孢子输送至受试者大肠的手段。
本发明提供具有增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的优良效果的试剂。本发明的试剂使大肠中的双歧杆菌增加和/或抑制其减少，从而有助于促进宿主健康并预防多种疾病。另外，本发明的试剂即使在高温处理后也能够保持增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌的减少。因此，本发明的试剂可优选用于功能性饮食品以及饲料。
附图说明
图1为示出在向大肠模型添加枯草芽孢杆菌的孢子和萌发细胞后通过微阵列分析确定的双歧杆菌菌株增加的图。
图2为示出在向大肠模型添加枯草芽孢杆菌的孢子后通过微阵列分析确定的双歧杆菌菌株增加的图。
图3为示出在向大肠模型添加枯草芽孢杆菌的孢子后通过实时PCR确定的长双歧杆菌减少的图。
具体实施方式
以下详细描述本发明。本申请要求对2010年3月12日提交的日本专利申请2010-055816的优先权，将其说明书和/或附图中所记载的部分或全部内容引入于此以作参考。
本发明涉及枯草芽孢杆菌的孢子用于在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的用途。如下述实施例2所示，证实当将枯草芽孢杆菌的孢子经口服途径直接给药时，某些细胞在经过胃肠道时萌发。此外，如下述实施例3所示，发现与枯草芽孢杆菌的孢子和萌发细胞的混合物不同，枯草芽孢杆菌的孢子具有显著地增加长双歧杆菌的效果。因此，本发明意于在保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将枯草芽孢杆菌的孢子输送至受试者的大肠，从而在大肠中使双歧杆菌、特别是长双歧杆菌增加和/或抑制其减少。
本发明提供用于在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的试剂，所述试剂包括枯草芽孢杆菌的孢子，和在保持所述枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将所述孢子输送至受试者大肠的手段。本发明还提供用于在受试者大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的方法，所述方法包括：在保持所述枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将有效量的枯草芽孢杆菌孢子输送至受试者大肠，或者直接将所述孢子给药至受试者大肠。
本领域已知的任何常规枯草芽孢杆菌菌株均可用于本发明，只要保持枯草芽孢杆菌的孢子形态，并且枯草芽孢杆菌的孢子具有期望的增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的效果即可。另外，鉴于对动物给药/由动物摄取，优选此类菌株为已证实对动物安全的菌株。此类枯草芽孢杆菌菌株的具体实例包括枯草芽孢杆菌C-3102(FERM BP-1096)、枯草芽孢杆菌BN菌株以及保藏在RIKEN生物资源中心的菌株(JCM2499、JCM 11003、JCM20014、JCM20035、JCM20036、JCM20038、JCM20057、JCM20073、JCM20083、JCM20085、JCM20086、JCM20094、JCM20095、JCM20096、JCM20105、JCM20108、JCM20118、JCM20127、JCM20132、JCM20333、JCM20336、JCM20352、JCM20353、JCM20354、JCM20520和JCM21228)。
根据本发明，“增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的效果”的表述是指增加存在于大肠中的双歧杆菌菌株的细胞数和/或抑制存在于大肠中的双歧杆菌菌株的细胞数减少的能力。作为促进增加或抑制减少对像的双歧杆菌菌株不特别限定，只要它们属于双歧杆菌属即可。其实例包括长双歧杆菌、青春双歧杆菌、链状双歧杆菌、角双歧杆菌(B.angulatum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、齿双歧杆菌(B.dentium)、没食子双歧杆菌(B.gallicum)、球双歧杆菌(B.globosum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、细长双歧杆菌(B.subtile)、星状双歧杆菌(B.asteroids)、牛双歧杆菌(B.boum)、小猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、家兔双歧杆菌(B.cuniculi)、鸡双歧杆菌(B.gallinarum)、印度双歧杆菌(B.indicum)、大双歧杆菌(B.magnum)、瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、最小双歧杆菌(B.minimum)、嗜冷双歧杆菌(B.psychraerophilum)、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、斯卡都威双歧杆菌(B.scardovii)、嗜酸嗜热双歧杆菌猪亚种(B.thermacidophilum subsp.porcinum)和嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)。特别地，根据本发明，上述效果为使作为肠内菌丛中主要细菌的长双歧杆菌增加和/或抑制其减少的效果。此类效果可通过例如以下来证实：在与大肠环境条件相类似的条件下将枯草芽孢杆菌的孢子与一种或多种双歧杆菌菌株温育，并评价双歧杆菌菌株细胞数的增加或减少。用于确定使双歧杆菌增加和/或抑制其减少的具体方法可包括下述实施例3中所述的使用微阵列或实时PCR的方法。
任何枯草芽孢杆菌均可用于本发明，只要通过上述方法等将其评价为具有使双歧杆菌增加和/或抑制其减少的效果即可。具有此类期望效果的枯草芽孢杆菌的实例为枯草芽孢杆菌C-3102(FERM BP-1096)。在下述实施例中，已证实该菌株显著地使双歧杆菌、特别是长双歧杆菌增加和抑制其减少。该菌株已由本申请人根据布达佩斯条约自1985年12月25日起保藏在独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofTechnology and Evaluation(NITE))(旧称为通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(Fermentation Research Institute,theAgency of Industrial Science and Technology,the Ministry ofInternational Trade and Industry))国际专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)Tsukuba Central 6,1-1-1 Higashi,Tsukuba,Ibaraki,305-8566,Japan)，登录号为FERM BP-1096。该菌株可在所述中心获得。已报道枯草芽孢杆菌C-3102可通过利用其小型生物群改善作用、肉质改善作用和整肠作用以及其他作用而在动物中使用(如，JP专利公布04-024022(1992)B和Suzuki等，Chounai saikingaku zassi,vol.18,no.2,pp.93-99(2004))。因此，已证实枯草芽孢杆菌C-3102在包括人类在内的动物中是安全的。
另外，上述任一种具体菌株的突变株或衍生株可用于本发明，只要其具有使双歧杆菌增加和/或抑制其减少的效果即可。
将枯草芽孢杆菌的孢子用于本发明。术语“孢子”是指产孢细菌(spore-forming bacteria)。孢子具有对温度和化学物质的抗性。孢子在适于细菌生长的条件下萌发，并生长为营养细胞(萌发细胞)。可基于菌株的耐热性，通过在高温处理后检测存活或死亡的细菌细胞来证实给定的枯草芽孢杆菌菌株是否为产孢细菌。根据本发明，要使用的枯草芽孢杆菌包含总细胞的优选70%以上、更优选80%以上和特别优选90%以上的孢子，和优选小于总细胞的30%、更优选小于20%和特别优选小于10%的营养细胞。
枯草芽孢杆菌的孢子可通过使用常规用于微生物培养的培养基在适当的条件下培养来制备。天然培养基、合成培养基、液体培养基或固体培养基可用作培养基，只要其包含碳源、氮源、矿物盐和其他组分，并能够有效培养枯草芽孢杆菌即可。本领域熟练技术人员可适当地选择适用于要使用的细菌菌株的已知培养基。可使用的碳源的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和赤糖糊(blackstrap molasses)。可使用的氮源的实例包括有机含氮物质如蛋白胨、酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物和大豆蛋白水解物。可使用的矿物盐的实例包括磷酸盐、钠盐、钾盐和镁盐。适于培养枯草芽孢杆菌的培养基的实例包括TS(胰胨豆胨)琼脂培养基和HI(心浸液)琼脂培养基。
枯草芽孢杆菌可在好氧条件下在20℃至50℃、优选30℃至45℃并特别优选约37℃下培养。可使用恒温浴、包覆式加热器(mantle heater)或夹套等调节温度条件。培养形式包括静置培养、振荡培养和罐式培养。另外，培养时间可定为12小时至7天，优选2天至3天。优选在培养开始将培养基的pH保持在5至9，优选6至8。
培养后，所获得的枯草芽孢杆菌的培养产物可直接使用，或可根据需要将其进一步经离心等进行灭菌和粗提纯和/或经过滤等进行固液分离。另外，用于本发明试剂的枯草芽孢杆菌可优选为包括湿菌细胞和干菌细胞的活菌细胞的形式；然而，其也可为死菌细胞的形式。
枯草芽孢杆菌可根据需要进一步进行处理以获得枯草芽孢杆菌的处理产物。以下描述此类处理的实例。
可通过在适当溶剂中悬浮或稀释而将枯草芽孢杆菌制备为悬浮液或稀释液的形式。可使用的溶剂的实例包括水、生理盐水和磷酸盐缓冲液(PBS)。
可通过热处理枯草芽孢杆菌制备加热产物。为了制备此类加热产物，使枯草芽孢杆菌进行高温处理(例如，在60℃至100℃下)一段时间，例如约10分钟至1小时(如，约10至30分钟)。由于将枯草芽孢杆菌的孢子用于本发明，所以即使在高温处理后孢子也是有活力的，并保持期望的效果。
可通过枯草芽孢杆菌的灭菌处理来制备灭菌产物。为了使枯草芽孢杆菌进行灭菌处理，可使用例如已知的灭菌处理技术如过滤灭菌、放射性消毒、过热消毒或加压消毒。
可经干燥将枯草芽孢杆菌加工成粉状产物或粒状产物的形式。干燥方法包括，但不限于喷雾干燥、转鼓干燥、真空干燥和冻干法，其可单独或组合使用。在干燥时，可根据需要添加常规使用的赋形剂。
上述处理的实例可在适当情况下单独或组合使用。根据本发明，此类处理的枯草芽孢杆菌可用于使大肠中的双歧杆菌增加和/或抑制其减少。
当将包含单独或与其他成分组合的上述所获得的枯草芽孢杆菌的、用于在大肠中使双歧杆菌增加和/或抑制其减少的试剂与摄取用饮食品、饲料或药品混合时，可预期大肠中双歧杆菌的增加和/或抑制其减少以及所伴随的整肠作用、抗变态反应作用或血脂改善作用。
本发明的用于增加大肠杆菌和/或抑制大肠杆菌减少的试剂(下文中有时称作“本发明的试剂”)包括作为活性成分的上述枯草芽孢杆菌。其可包括一种枯草芽孢杆菌菌株或多种不同的枯草芽孢杆菌菌株。另外，其可包括以不同方式处理的枯草芽孢杆菌的组合。
根据本发明，必须在保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将枯草芽孢杆菌的孢子输送至受试者的大肠。为此，将枯草芽孢杆菌的孢子与下述手段组合来用于给药或摄取：在保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将孢子输送至受试者大肠，或者直接给药至大肠。
本文所使用的“输送至大肠的手段”的表述是指例如在防止孢子在胃和小肠中萌发的同时使枯草芽孢杆菌的孢子输送至大肠(包括结肠和直肠)的手段。此类手段的实例为在通过防止孢子在胃和小肠中的高营养环境和/或低pH环境中萌发来保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时，使枯草芽孢杆菌的孢子经过胃和小肠的手段。此类输送手段是本领域公知的，并不特别限定。其实例包括肠溶衣、肠溶胶囊、肠溶片和脂质体。肠溶衣以使得制剂不在胃和小肠中溶解或崩解、且结构特性方面未修饰的方式，由涂布制剂用组合物或组合物的组合所形成。此类肠溶衣的实例包括聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、纤维素酯衍生物(如乙酸邻苯二甲酸纤维素或羧甲基纤维素)、纤维素醚、藻酸、丙烯酸甲酯共聚物和
Figure BDA00002390873300101
L/S。肠溶片可通过用肠溶衣涂布片剂来获得。另外，肠溶胶囊可通过用肠溶衣涂布胶囊，或者通过由用于肠溶衣的材料制备胶囊并在胶囊内包封枯草芽孢杆菌的孢子和适当的载体来获得。此类输送手段记载于，例如WO2005/117921A、WO2002/091833A、WO2004/014403A、JP专利公布11-199494(1999)A和WO2008/114889A。本领域熟练技术人员可容易理解输送手段的类型、制备输送手段的方法和将输送手段用于枯草芽孢杆菌的孢子。
将枯草芽孢杆菌的孢子输送至大肠的手段可依据给药或摄取孢子的受试者的种类或年龄以及剂型而适当地选择，并设计为输送的有利方式。
另外，直接将枯草芽孢杆菌的孢子给药至大肠的方法在本领域是已知的。例如，可采用肠内给药或直肠内注射等。
此外，除了用作活性成分的枯草芽孢杆菌的孢子和输送其的手段以外，如果不抑制所期望的效果，可将下述添加剂、枯草芽孢杆菌或双歧杆菌的生长促进剂、已知的整肠剂和其他成分单独或以其组合添加到本发明的试剂。
本发明的试剂的剂型包括，但不限于，口服制剂如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂(dust formulations)、糖浆剂、干糖浆剂、溶液剂、悬浮剂和吸入剂；经肠制剂；和注射剂。这些中，本发明的试剂优选为口服制剂的形式。另外，液体制剂如溶液剂或悬浮剂可为使剂型在使用前可立即溶解或悬浮于水或不同的适当介质中的形式。当将本发明的试剂成形为片剂或颗粒剂时，可通过已知方法进行涂布。另外，可使用本领域已知的技术将本发明的试剂制备为控释制剂如缓释型制剂、延释型制剂(delayed-release formulation)或速释型制剂。
可通过将常规使用的添加剂如赋形剂、崩解剂、粘结剂、湿润剂、稳定剂、缓冲剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、甜味剂、增味剂、芳香剂、酸化剂和着色剂根据剂型配制到上述成分，根据常规方法制备上述剂型的试剂。例如，在其中将本发明的试剂制备成药物组合物的情况下，可将药物学可接受载体或添加剂引入本发明的试剂中。此类药物学可接受载体和添加剂的实例包括水、药物学可接受有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、可接受作为药物学添加剂的表面活性剂和人造细胞结构如脂质体。
当本发明的试剂包含上述添加剂和其他试剂如枯草芽孢杆菌或双歧杆菌的生长促进剂和其他整肠剂时，用作活性成分的枯草芽孢杆菌孢子的含量可取决于其剂型。例如，所述含量通常为0.01质量%至99质量%、优选0.1质量%至80质量%、更优选0.1质量%至75质量%。为了实现摄取期望量的活性成分，可期望以管理每日剂量(daily dose)的剂型制备本发明的试剂。另外，本发明的试剂中所包含的枯草芽孢杆菌的孢子数为，例如约104个细胞/g至1011个细胞/g。
另外，本发明的试剂可进一步包含多种用于生产药品、饮食品、饲料和其他各种物质的添加剂。此类物质和添加剂的实例包括多种油脂(如，植物油如大豆油、玉米油、红花油和橄榄油，和动物油脂如牛脂或沙丁鱼油)、草药(如，蜂王浆和人参(ginseng))、氨基酸(如，谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸和精胺酸)、多元醇(如，乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和糖醇如山梨糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇和甘露醇)、天然聚合物(如，阿拉伯胶、琼脂、水溶性玉米纤维、明胶、黄原胶、酪蛋白、谷蛋白或谷蛋白水解物、卵磷脂、淀粉和糊精)、维生素(如，维生素C和维生素B族)、矿物质(如，钙、镁、锌和铁)、膳食纤维(如，甘露聚糖、果胶和半纤维素)、表面活性剂(如，脂肪酸的甘油酯和脂肪酸的山梨醇酯)、纯水、赋形剂(如，葡萄糖、玉米淀粉、乳糖和糊精)、稳定剂、pH调节剂、抗氧化剂、甜味剂、增味剂、酸化剂、着色剂和芳香剂。例如，可选择有效促进用作活性成分的枯草芽孢杆菌或要增加的双歧杆菌的生长的物质。此类生长促进剂的实例包括枯草芽孢杆菌或双歧杆菌的生长培养基、寡糖和乳蛋白。
另外，除了上述活性成分以外，可将功能性成分或添加剂引入本发明的试剂中。其实例包括牛磺酸、谷胱甘肽、肉毒碱、肌酸、辅酶Q、葡糖醛酸、葡糖醛酸内酯、辣椒提取物、姜提取物、可可提取物、瓜拉那提取物、藤黄属植物提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸、辣椒素、辣椒素酯(capsiate)、各种有机酸、类黄酮、多酚、儿茶素、黄嘌呤衍生物、难消化的寡糖如果寡糖(fructooligosaccharide)和聚乙烯吡咯烷酮。
此类添加剂的量可依据添加剂的类型和所期望的量而适当地确定。添加剂的含量通常为本发明试剂总质量的0.01质量%至90质量%、优选0.1质量%至50质量%。
给药或摄取本发明的试剂的受试者可为脊椎动物。其具体实例包括哺乳动物如人类、灵长类(如，猴子和黑猩猩)、家畜(如，牛、马、猪和羊)、宠物(如，狗和猫)和实验动物(如，小鼠和大鼠)。另外，此类受试者可为爬行动物和鸟类。特别优选需要增加大肠中双歧杆菌的人类。
给药或摄取本发明试剂的剂量(有效剂量)可取决于受试者的年龄和体重、给药/摄取途径和给药/摄取剂量的次数，并可由本领域熟练技术人员自由裁量广泛变化以实现期望的效果。例如，对于口服给药或摄取，给药/摄取包含在本发明试剂中的枯草芽孢杆菌孢子的剂量通常约为104个细胞/天至1011个细胞/天。枯草芽孢杆菌的含量不特别限定，并可根据例如易于生产的程度和优选的每日剂量而适当地调节。本发明的试剂是安全的，因而还可进一步增加摄入量。摄取的每日剂量可为一次剂量，或可将其分为多次剂量。另外，给药或摄取的频率不特别限定，可依据各种条件如给药/摄取途径、受试者的年龄和体重以及期望的效果(如，治疗或预防效果)而适当地选择。
本发明试剂的给药/摄取途径不特别限定，并包括口服给药/摄取和非经口给药(如，肠内给药或直肠内给药)。特别优选地，本发明的试剂为口服给药或摄取。
本发明的试剂使宿主大肠中对宿主有用的肠细菌增加和/或抑制其减少，其具体地使双歧杆菌、特别是长双歧杆菌增加和/或抑制其减少，从而促进宿主健康并预防多种疾病。另外，本发明的试剂是高度安全的，因而其摄取可容易长时间持续。因此，本发明的试剂还可用于饮食品以及饲料。
本发明的试剂可与另外的药品或另外的处理或预防方法组合使用。可将另外的药品和本发明的试剂配制成单一制剂。可选地，可将它们配制成单独的制剂以同时或间隔给药。
另外，在使用本发明的试剂时，枯草芽孢杆菌的孢子可与常规方法组合使用，除非该方法影响本发明的效果。此外，期望通过将本发明的试剂与常规方法组合使用，将会实现比单独使用该试剂所实现的甚至更显著的效果。
如上所述，本发明的试剂具有在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的效果，并包括常规使用的枯草芽孢杆菌。其高度安全，因而无须担心副反应。所述试剂中所包含的作为活性成分的枯草芽孢杆菌的孢子具有对高温和化学物质的抗性，使其在生产饮食品的过程中所使用的各种形式的物理或化学处理期间稳定。另外，它们具有优异的防腐性。另外，当将本发明的试剂添加到多种饮食品中时，所述试剂甚至不破坏饮食品的原始风味。因此，本发明的试剂可添加到多种饮食品用于其持续摄取。
本发明的饮食品含有上述本发明的试剂。含有本发明的试剂的饮食品的实例包括可引入本发明试剂的所有饮食品，例如，饮食品如具有增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的效果以促进健康的保健饮食品、功能性饮食品和特殊保健用途的食品和饮品。
功能性饮食品特别优选作为含有本发明的试剂的饮食品。根据本发明，“功能性饮食品”是指对生物体具有预定功能的饮食品，并包括，例如所谓的一般保健饮食品(该一般保健饮食品如，包括特殊保健用途的食品(包括合格的FOSHU[特殊保健用途食品])的具有健康声明的饮食品和具有营养功能声明的饮食品)、特殊膳食用途的饮食品、营养增补剂、健康增补剂、增补剂(如，具有多种剂型如片剂、包衣片剂、糖衣片剂、胶囊和液剂的那些)和美容饮食品(如，减肥饮食品)。本发明的功能性饮食品还包括采用基于Codex(FAO/WHO联合食品标准计划)食品标准的健康声明的保健饮食品。
饮食品的具体实例包括剂型为例如流质饮食(如，管肠内营养增补剂)、片剂糖果、片剂、咀嚼片、粉剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂和滋补饮料等的保健饮食品和营养增补剂；茶饮料如绿茶、乌龙茶和红茶；饮品(drinks)或饮料(beverages)如软饮料、果冻饮料、等渗饮料、乳饮料、碳酸饮料、蔬菜饮料、果汁饮料、发酵蔬菜饮料、发酵果汁饮料、发酵乳饮料(如，酸奶)、乳酸菌饮料、乳饮料(如咖啡奶和果奶)、含有饮料粉末的饮料、可可饮料、乳和纯水；涂抹调味品(spreads)如黄油、果酱、干调味品和人造黄油；蛋黄酱；起酥油；奶油冻；敷料剂；面包；米饭；面条；意大利面；味噌汤；豆腐；酸乳；汤或酱油；和甜食(如，饼干和曲奇、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖和糖片)。
可通过添加除本发明试剂以外的用于生产上述饮食品的其他食材、各种营养物、各种维生素、矿物质、膳食纤维和各种添加剂(如，呈味成分(taste components)、甜味剂、酸化剂如有机酸、稳定剂和增味剂)，根据常规方法生产本发明的饮食品。
对于本发明的饮食品，本领域熟练技术人员可鉴于饮食品的形式和所需的味道或食感适当地确定本发明的试剂或所配制的枯草芽孢杆菌孢子的量。通常，本发明试剂的合适的量通常为要添加的本发明的试剂中枯草芽孢杆菌孢子总量的0.001至100质量%、优选0.01至80质量%、更优选0.01至50质量%。本发明的试剂是安全的，因而其在饮食品中的量可进一步增加。为了实现摄入期望量的本发明试剂，可期望以管理每日剂量的剂型制备本发明的试剂。如上所述，本发明的饮食品可以以管理本发明的试剂的期望量的形式消耗。因此，可提供使用饮食品在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的方法。
可通过本领域熟练技术人员可得的适当方法将本发明的试剂引入饮食品中。例如，本发明的试剂可以以液体、凝胶、固体、粉末或颗粒形式制备，然后将其引入饮食品中。可选地，本发明的试剂可直接混合或溶解在饮食品的原料中。本发明的试剂可涂覆至、涂布至、浸入或喷涂至饮食品。本发明的试剂可均匀分散或不均匀分布在饮食品中。可制备含有本发明的试剂的胶囊。可将可食用膜或食品涂布剂包裹在本发明试剂的周围。任选地，可在添加适当的赋形剂等后将本发明的试剂制备成如片剂等的形式。可进一步加工包括本发明的试剂的饮食品。此类加工产物也包含在本发明的范围内。
在本发明的饮食品的生产中，可采用多种常规用于饮食品的添加剂。添加剂的实例包括，但不限于，发色剂(如，亚硝酸钠)、着色剂(如，栀子色素和Red 102)、香料(如，橙味香料)、甜味剂(如，甜叶菊和阿斯巴甜)、防腐剂(如，乙酸钠和山梨酸)、乳化剂(如，软骨素硫酸钠和脂肪酸丙二醇酯)、抗氧化剂(如，EDTA二钠和维生素C)、pH调节剂(如，柠檬酸)、化学调味料(如，肌苷酸钠)、增稠剂(如，黄原胶)、膨润剂(如，碳酸钙)、消泡剂(如，磷酸钙)、粘合剂(如，多聚磷酸钠)、营养强化剂(nutrition-enriching agent)(如，钙强化剂和维生素A)和赋形剂(如，水溶性糊精)。可进一步添加功能性原料如人参(Panaxginseng)提取物、刺五加(Acanthopanax senticosus Harms)提取物、桉树提取物或杜仲茶提取物。
另外，本发明的试剂不仅可制成人类用饮食品，还可制成动物如家畜(如，猪和鸡)、赛马和宠物用饲料。饲料除了给予非人类受试者以外基本上相当于饮食品。因此，饮食品的以上描述可稍做变更适用于饲料。
参考以下实施例详细描述本发明，尽管本发明不限于这些实施例。
[实施例1]孢子的制备
在固体培养基中培养枯草芽孢杆菌C-3102(FERMBP-1096)。简略地说，使用通过将“胰胨豆胨肉汤(Trypticase SoyBroth)”(产品名，来自BBl)(30g/L)与2%琼脂混合制备的T S琼脂培养基将枯草芽孢杆菌C-3102在37℃下培养2至3天，从而获得孢子。
[实施例2]使用人造人肠模型对枯草芽孢杆菌萌发率的测定
将胃和小肠的复制模型(reproduced model，由TNO(荷兰)研发的人造肠模型，TNO肠模型：TIM)(TIM-1系统)用于测定枯草芽孢杆菌孢子的萌发率。
简略地说，将各试验组的样品引入TNO研发的作为胃和小肠的人造模型的TIM-1中。使样品经6小时通过该系统，每小时收集一次流出物，随后测定流出样品的萌发率。此处所使用的TIM-1模型详细记载于Havenaar,R.和Minekus，M.,DairyIndustries International 61:17-23,1996和Marteau,P.等，J DairySci 80:1031-1037,1996。
将均质化标准欧洲欧式早餐(蛋白质含量：12%；脂肪含量：32%；和碳水化合物含量：56%)用作膳食组分，同时添加如实施例1所述制备的枯草芽孢杆菌C-3102的孢子(总计1×1010CFU)。进行实验(n=2)。
将利用孢子的耐热性质在65℃下加热30分钟的细菌细胞计数定为“孢子”，未加热的细菌细胞定为“孢子+萌发细胞(营养细胞)”。通过下式计算萌发率来评价：未加热的细菌细胞数/添加的细菌细胞数×100(%)-加热的细菌细胞数/添加的细菌细胞数×100(%)。细菌细胞数由平板法测定。
对于通过采样获得的样品，将加热的细菌细胞的百分比与未加热的细菌细胞进行比较。计算累积的存活率(给定时间点的细菌细胞数/添加的细菌细胞数×100%)用于比较在给定时间点所获得的结果。结果示于表1。
表1
基于表1所示的结果，对6小时后收集的样品和消化残余物的混合物测定了细菌细胞的以下萌发率(%)：99/100×100-85/100×100=14%。这揭示了总枯草芽孢杆菌孢子的约14%在经过胃和小肠后萌发。
[实施例3]使用人造人大肠模型的肠内菌丛的变化
(1)通过微阵列分析检测肠内菌丛细菌
如在实施例2的情况下，将由TNO(荷兰)研发的人造肠模型(TNO肠模型：TIM)TIM-1(胃和小肠的复制模型)和TIM-2模型(大肠的复制模型)用于评价人类小型生物群的变化。简要地说，通过微阵列法将由TNO研发为人造大肠模型的TIM-2用于评价小型生物群中的变化。TIM-2详细记载于Venema,K等，Nutrition24(12):558-564,2000。另外，此处所用的微阵列为IChip，其为TNO研发的用于肠内菌丛分析的微阵列，并含有存在于人类肠的360种菌株的探针(Maathuis,A.等，FASEB J.22(会议摘要补充):1089.7,2008)。
以下定为试验组：使用经6小时通过TIM-1模型的实施例2中收集的样品的组(#1)和单独使用膳食组分的对照组(#2)；使用实施例1中制备的枯草芽孢杆菌的孢子(总计1×1010CFU)的组(#3)和未使用枯草芽孢杆菌孢子的对照组(#4)。即，样品#1包含膳食组分(营养物)、孢子和萌发细胞的消化产物，样品#2包含膳食组分的消化产物，样品#3包含培养基和孢子，样品#4仅包含培养基。此处所使用的培养基包含以下组分：果胶(0.6g/天)、木聚糖(0.6g/天)、阿拉伯半乳聚糖(0.6g/天)、支链淀粉(0.6g/天)、支链淀粉(0.6g/天)、酪蛋白(3.0g/天)、淀粉(5.0g/天)、吐温80(2.16g/天)、细菌用胰蛋白胨(3.0g/天)和胆汁(0.05g/天)。
将健康受试者(荷兰人)的人类小型生物群接种至TIM-2中，随后预培养16小时以适应。将试验组(#1和#2，或者#3和#4)的样品分别添加到TIM-2，并使其在TIM-2上作用72小时以实验(各试验组n=2)。
在实验前后从人造肠的内容物中提取RNA，并通过微阵列法使用IChip比较。具体地，基于各试验组的荧光强度的增加或降低比较实验前(0小时)和实验后(72小时)构成小型生物群的双歧杆菌菌株的细胞数。比较对照组(#2或#4)和枯草芽孢杆菌给药组(#1或#3)之间的增加/降低。对于双歧杆菌菌株，在其中证实试验组与对照组的荧光强度比至少为两倍增加或降低的情况下，将此类菌株评价为已经历了细胞数的增加或降低。结果示于图1(#1/#2)和图2(#3/#4)。
如图1和2所示，在样品含有孢子和萌发细胞二者的试验组#1的情况中，证实以下细菌的细胞数增加：青春双歧杆菌、角双歧杆菌、长双歧杆菌、印度双歧杆菌和嗜热双歧杆菌(图1)。相反，在将孢子直接给药至大肠模型的试验组#3的情况中，仅长双歧杆菌的细胞数增加。试验组#3所证实的增加显著大于其样品包含孢子和萌发细胞二者的试验组#1所证实的增加(图2)。
上述结果揭示出，当使枯草芽孢杆菌的孢子(而不是萌发细胞)到达大肠时，所述孢子比约14%的在经过胃肠道后萌发的枯草芽孢杆菌更有效地使双歧杆菌菌株，特别是长双歧杆菌增加。
(2)通过实时PCR检测肠内菌丛细菌
通过酚氯仿法从上述(1)的实验前后所获得的各试验组的人造肠的内容物中提取DNA。为了证实长双歧杆菌的增加或减少，根据对长双歧杆菌的16S rDNA序列特异的引物序列，通过实时PCR测定16S核糖体DNA的拷贝数(参见Malinen,E.等，Microbiology 149:269-277,2003)。
结果示于表2和图3(#3/#4)。
表2
Figure BDA00002390873300201
表2和图3所示的结果表明枯草芽孢杆菌的孢子抑制长双歧杆菌细胞数的减少。在对照组的情况中，长双歧杆菌细胞的减少数可能由在其中仅给药培养基组分因而未实现最优营养状态的实验条件下进行的评价而造成。然而，这些结果示出枯草芽孢杆菌的孢子可显著地抑制长双歧杆菌细胞数的减少。另外，期望长双歧杆菌的细胞数可以在保持细胞数的条件下增加。
上述(1)和(2)中获得的结果揭示了枯草芽孢杆菌的孢子(而不是萌发细胞)可在大肠中增加双歧杆菌，并抑制双歧杆菌、特别是长双歧杆菌的减少。
另外，期望枯草芽孢杆菌的孢子在改变实验条件下也可增加不同双歧杆菌菌株的细胞数。
将本文所引用的所有出版物、专利和专利公布的全部内容引入于此以作参考。
产业上的可利用性
本发明提供具有优异的增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的效果的试剂。本发明的试剂可通过使大肠中的双歧杆菌增加和/或抑制其减少来促进宿主的健康，从而有助于预防各种疾病。另外，甚至在高温处理后，该试剂也能够持续地增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌的减少。因此，本发明的试剂可优选用于功能性饮食品以及饲料。

Claims (11)

1.一种用于在大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的试剂，其包括枯草芽孢杆菌的孢子，和在保持所述枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将所述孢子输送至受试者大肠的手段。
2.根据权利要求1所述的试剂，其基本上无枯草芽孢杆菌的萌发细胞。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌C-3102(FERM BP-1096)或其突变株或衍生株。
4.根据权利要求1至3任一项所述的试剂，其中所述双歧杆菌为长双歧杆菌。
5.根据权利要求1至4任一项所述的试剂，其用于口服给药和/或肠内给药。
6.根据权利要求1至5任一项所述的试剂，其用于饮食品、饲料或药品。
7.根据权利要求1至6任一项所述的试剂，其用作整肠剂、抗变态反应剂或血脂水平改善剂。
8.一种用于生产功能性饮食品的方法，其包括：
制备根据权利要求1至7任一项所述的试剂；和
将所述试剂引入饮食品中。
9.一种用于在受试者大肠中增加双歧杆菌和/或抑制双歧杆菌减少的方法，其包括：
在保持枯草芽孢杆菌的孢子形态的同时将有效量的枯草芽孢杆菌孢子输送至受试者大肠，或
直接将所述孢子给药至受试者大肠。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌C-3102(FERM BP-1096)或其突变株或衍生株。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述双歧杆菌为长双歧杆菌。
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