UA77757C2 - Heterocyclic tripeptides as hepatitis c virus inhibitors - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до сполук, способів їхнього синтезу, до композицій та способів лікування 2 інфекції, яка викликається вірусом гепатиту С (НСМ). Зокрема, представлений винахід відноситься до нових пептидних аналогів, фармацевтичних композицій, які містять такі аналоги, та до способів застосування цих аналогів для лікування інфекції, яка викликається НСУ.

Вірус гепатиту С (НСМ) є основним збудником гепатиту, який не відноситься до А або В гепатиту, який передається при переливанні крові та який уражає людей в усьому світі. Встановлено, що понад 200 мільйонів 70 людей у світі уражено вірусом. Великий відсоток носіїв стають хронічно інфікованими та у багатьох пацієнтів це приводить до хронічного захворювання печінки, так званого хронічного гепатиту С. У свою чергу, ця група хворих має високий ризик захворювання такою серйозною хворобою печінки, як цироз печінки, печінково-клітинний рак та остання стадія хвороби печінки, яка приводить до смерті.

Механізм, за допомогою якого відбувається збереження вірусу НСМ в організмі та забезпечується високий коефіцієнт захворюваності хронічною хворобою печінки, поки недостатньо вивчений. Невідомо, як НСМ взаємодіє з імунною системою хазяїна та переборює її дію. Крім того, також ще не виявлені ролі клітинних та гуморальних імунних відповідей у захисті від НСМ-інфекції та при захворюванні гепатитом. Є дані про те, що для профілактики пов'язаного з переливанням крові вірусного гепатиту можна застосовувати імуноглобуліни, однак

Центр по контролю захворюваності на даний час не рекомендує для цієї мети застосовувати лікування з використанням імуноглобулінів. Відсутність ефективної захисної імунної відповіді ускладнює розробку вакцини або адекватних профілактичних заходів після контакту, тому найближчим часом надії в основному покладають на антивірусні засоби.

З метою виявлення фармацевтичних агентів, які володіють ефективністю відносно лікування НСУ-інфекції, були проведені різні клінічні дослідження за участю пацієнтів, які страждають хронічним гепатитом С. У цих с дослідженнях застосовували інтерферон-альфа індивідуально або у поєднанні з іншими антивірусними агентами. (3

Ці дослідження дозволили встановити, що в основної більшості учасників експерименту не було виявлено реакції на такі схеми лікування, а з тих учасників, які виявилися чутливими до лікування, у більшої частини після закінчення лікування відбувався рецидив.

Таким чином, до останнього часу терапія з використанням інтерферону (ІЕМ) залишалася єдиним доступним в методом лікування пацієнтів, які страждають хронічним гепатитом С, яка мала доведену в клінічних умовах ю ефективність. Однак ефективність такого лікування зберігається протягом нетривалого періоду часу, і, крім того, лікування інтерфероном викликає серйозні побічні дії (тобто ретинопатію, тиреоїдит, гострий панкреатит, в депресію), що знижує якість життя пацієнтів, яких піддають лікуванню. У цей час інтерферон у поєднанні з ча рібавірином запропонований для лікування пацієнтів, нечутливих до ІЕМ при його індивідуальному застосуванні. 325 Однак побічні дії, які викликаються ІЕМ, не зменшуються при такій спільній терапії. Встановлено, що - пегільовані форми інтерферонів, такі як РЕС-Іпігоп? та РедавзувУ, можуть частково знижувати зазначені шкідливі побічні дії, однак антивірусні лікарські препарати усе ще залишаються основним засобом для орального лікування НСУ. « дю Таким чином, існує необхідність у розробці ефективних антивірусних агентів для лікування НСУ-інфекції, З які були б позбавлені недоліків існуючих методів лікування, заснованих на застосуванні фармацевтичних засобів. с НОМ являє собою укладений в оболонку позитивний ланцюг РНК-ового вірусу сімейства Ріамімігідае. Геном 1» НСМ, представлений одноланковою РНК, складається приблизно з 9500 нуклеотидів та має одну відкриту рамку зчитування (ВРЗ), яка кодує один великий поліпротеїн, який складається приблизно з 3000 амінокислот. У заражених клітинах цей поліпротеїн розщеплюється в багатьох сайтах клітинними та вірусними протеазами з -1 395 утворенням структурних та неструктурних (М5) протеїнів. У випадку НСМ під дією двох вірусних протеаз утворюються зрілі неструктурні протеїни (М52, М5З, М54А, М54В, М5О5БА та М558). Перша із зазначених протеаз, - І яка поки ще недостатньо охарактеризована, розщеплює зв'язок М52-М53З (далі в контексті даного опису позначена -1 як МЗ2/3-протеаза; друга являє собою серинову протеазу, яка міститься в М-кінцевій області М53 (далі позначена як М5З3З-протеаза), та вона опосередковує всі наступні розщеплення, які відбуваються по ходу (9) 50 транскрипції М5З, як у цис-орієнтації в сайті розщеплення М53-М54А, так й у транс-орієнтації в інших сайтах «мч МЗ4АА-М54В, М54В-МББА, МЗ5БА-М55В. Протеїн МЗА4А, імовірно, має множинні функції, діючи в якості кофактора для МЗЗ-протеази та можливо сприяє мембранній локалізації МОЗ та інших компонентів вірусних репліказ.

Утворення комплексу протеази МЗЗ з М5ЗА4А, імовірно, необхідно для процесування, посилення протеолітичної ефективності у всіх сайтах. Протеїн МЗЗ володіє також нуклеозидтрифосфатазною активністю та РНК-геліказною 59 активністю. МЗ5В являє собою РНК-залежну РНК-полімеразу, яка приймає участь у реплікації НСУ. гФ) Загальна стратегія розробки антивірусних агентів передбачає інактивацію ферментів, які кодуються вірусом, 7 які відіграють основну роль у реплікації вірусу.

Нижче наведений перелік заявок на патенти, опублікованих протягом останніх декількох років, у яких описані пептидні аналоги, які є інгібіторами М5ЗЗ-протеази НСМ, які за будовою відрізняються від сполук, 60 запропонованих у даному винаході (ОВ, 2337262; ОР, 10298151; ОР, 11126861; ОР, 11292840; ОР, 2001-103993; 05, 6159938; 05, 6187905; УУО, 97/43310; УМО, 98/17679; УМО, 98/22496; МО, 98/46597; УМО, 98/46630; УМО, 99/38888;

МО, 99/50230; УМО, 99/64442; МО, 99/07733; МО, 99/07734; УМО, 00/09543; УМО, 00/09558; МО, 00/20400; УМО, 00/59929; УМО, 00/31129; УМО, 01/02424; МО, 01/07407; МО, 01/16357; УМО, 01/32691; УМО, 01/40262; МО, 01/58929;

МО, 01/64678; МО, 01/74768; УМО, 01/77113; МО, 01/81325; УУО, 02/08187; УМО, 02/08198; УМО, 02/08244; МО, бо 02/08251; УУО, 02/08256; УМО, 02/18369; УУО, 02/60926; УМО, 02/192341.

Однією з переваг даного винаходу є те, що в ньому заявлені трипептидні похідні, які володіють інгібувальною активністю по відношенню до М5З-протеази, ферменту, який відіграє важливу роль у реплікації вірусу гепатиту С.

Ще однією перевагою даного винаходу є той факт, що ці сполуки специфічно інгібують МЗЗ-протеазу та не проявляють помітної інгібувальної активності по відношенню до інших серинових протеаз, таких як еластаза лейкоцитів людини (НГ Е), еластаза панкреатичної залози свині (РРЕ) або бичачий хімотрипсин підшлункової залози, або по відношенню до цистеїнових протеаз, таких як катепсин В печінки людини (Саї В). Крім того, сполуки проявляють активність у дослідах на культурі клітин та володіють гарним фармакокінетичним профілем іп 7/0 Уїмо.

Ще однією перевагою даного винаходу є те, що сполуки, які заявляються, мають біологічну доступність для ссавців при оральному введенні.

Даний винахід відноситься до сполуки формули І: 2 н і-ї мех о шо ше й з Ки е З во вит сч н М в (о) ом

Го) а), ча де: ю

В! о - огідрокси або МНЗО»В'ЯМ, у якій ВОЛА позначає | С.-Свалкіл, Сз-Суциклоалкіл або

С.-Салкіл-С3-С,циклоалкіл, які всі необов'язково заміщені 1-3 замісниками, обраними з ряду, який включає - галоген, ціано, нітро, ОС4-Свалкіл, амідо, аміно або феніл, або ВА позначає Св- або С.рарил, необов'язково - заміщений 1-3 замісниками, обраними з ряду, який включає галоген, ціано, нітро, С 4-Свалкіл, ОС.-Свалкіл, їч- амідо, аміно або феніл;

В2 - трет-бутил, -«СНо-С(СНу)з або -СНо-циклопентил;

ВЗ - трет-бутип або циклогексил; «

В - циклобутил, циклопентил або циклогексил; або до його фармацевтично прийнятної солі.

Винахід відноситься також до фармацевтичної композиції, яка містить ефективну відносно вірусу гепатиту С - с кількість сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі в суміші з фармацевтично прийнятним середовищем носія або допоміжною речовиною. і» Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, додатково містить інтерферон (пегільований або непегільований) або рібавірин, або один або кілька інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСУ, або їхню будь-яку комбінацію. -і Ще одним важливим об'єктом винаходу є спосіб лікування інфекції, яка викликається вірусом гепатиту С у - ссавця, який полягає в тому, що ссавцеві вводять ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі, або описаної вище композиції, індивідуально або у поєднанні з -і одним або декількома наступними компонентами: інтерферон (пегільований або непегільований) або рібавірин, сл 50 або один або кілька інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСМ, які в кожному випадку вводять спільно або роздільно. що Наступним важливим об'єктом винаходу є спосіб попередження інфекції, яка викликається вірусом гепатиту С у ссавця, який полягає в тому, що ссавцеві вводять ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки формули І або її терапевтично прийнятної солі, або описаної вище композиції, індивідуально або у поєднанні з одним або декількома наступними компонентами: інтерферон (пегільований або непегільований) або рібавірин, або один або кілька інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСУ, які вводять спільно або о роздільно. іме) Даний винахід відноситься також до застосування описаної вище сполуки формули | для приготування лікувального засобу, призначеного для лікування або попередження інфекції, яка викликається вірусом гепатиту бо с.

Визначення

Якщо не зазначено інше, то в контексті даного опису поняття, які використовують, мають наступні значення:

У тих випадках, коли для позначення абсолютної конфігурації замісника або асиметричного центра сполуки формули І використовують дескриптори (К) або (5), то позначення відноситься до всієї сполуки, а не тільки до 65 замісника або асиметричного центра.

Позначення "РІ, Р2 та РЗ" у контексті даного опису відноситься до положення амінокислотних залишків,

починаючи із С-кінця пептидних аналогів та простираючись до М-кінця (тобто Р1 позначає положення 1 щодо

С-кінця, Р2 позначає положення 2 щодо С-кінця та т.д. |Вегдег А., Зспеспіег І. // Тгапзасіопе ої Ше Коуаї

Зосієїу Гопадоп зегіез. - 1970. - В257. - Р. 249-264).

У контексті даного опису поняття "1, 25)-вініл-АЦКК" відноситься до сполуки формули: ! 5

ШЕ:

НМ в ї (8) тобто до (1К, 25)-1-аміно-2-етенілциклопропілкарбонової кислоти. т Поняття "С /-Свалкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим замісником, позначає ациклічні алкільні замісники із прямим або розгалуженим ланцюгом, які містять від 1 до 6 атомів вуглецю, та включає, наприклад, метил, етил, пропіл, бутил, 1-метилетил, 1-метилпропіл, 2-метилпропіл, 1,1-диметилетил та гексил. Аналогічно цьому поняття "С.--Свалкіл" позначає ациклічний алкіл із прямим або розгалуженим ланцюгом, який містить 1-8 атомів вуглецю, наприклад, октил.

Поняття "С 3-С7циклоалкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим замісником, позначає циклоалкільний замісник, який містить від З до 7 атомів вуглецю, та включає циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклогексил та циклогептил.

Поняття "С 4-Свалкіл-Сз-СУциклоалкіл" у контексті даного опису позначає циклоалкільний радикал, який містить від З до 7 атомів вуглецю, який безпосередньо пов'язаний з алкіленовим радикалом, який містить від 1 с до б атомів вуглецю; наприклад, циклопропілметил, циклопентилетил, циклогексилметил, циклогексилетил та (У циклогептилпропіл. Наприклад, коли КМ позначає С.-Свалкіл-С3-Свциклоалкіл, то ця група пов'язана з

ЗО, -трупою через С.4-Свалкіл (тобто алкіленовий фрагмент).

Поняття "С д- або С-рарил" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим радикалом, М зо позначає або ароматичну моноциклічну групу, яка містить б атомів вуглецю, або ароматичну біциклічну групу, яка містить 10 атомів вуглецю. Наприклад, арил являє собою феніл, 1-нафтил або 2-нафтил. о

Поняття "ОС 3-Свалкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим радикалом, М позначає радикал -0С.4-Свдалкіл, у якому алкіл, як зазначено вище, містить аж до 6 атомів вуглецю та включає метокси, етокси, пропокси, 1-метилетокси, бутокси та 1,1-диметилетокси. Останній радикал звичайно позначають - зв ЯК трет-бутокси. ча

Поняття "гало" у контексті даного опису позначає галогеновий замісник, обраний із групи, яка включає бром, хлор, фтор або йод.

Поняття "фармацевтично прийнятна сіль" позначає сіль сполуки формули І, яку з медичної точки зору можна використовувати в контакті із тканинами людини та нижчих тварин без ознак підвищеної токсичності, « роздратування, алергійної реакції та т.п., яка відповідає прийнятному співвідношенню користь/ризик й, як шв с правило, може розчинятися або диспергуватися у воді або олії та має ефективність при цільовому використанні.

Поняття включає фармацевтично прийнятні кислотно-адитивні солі та фармацевтично прийнятні солі приєднання )» основ. Перелік прийнятних солей наведений, наприклад, у (Вігде З.М. еї а. // У. Рпагт. Зсі. - 1977. - 66. -

Р. 1-19), що повністю включена в даний опис як посилання.

Поняття "фармацевтично прийнятна кислотно-адитивна сіль" позначає солі, які зберігають свою біологічну -І ефективність та властивості вільних основ та які не є небажаними з позицій біології або з інших причин, утворені з неорганічними кислотами, такими як соляна кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, ш- сульфамінова кислота, азотна кислота, фосфорна кислота та т.п., та з органічними кислотами, такими як оцтова -І кислота, трифтороцтова кислота, адипінова кислота, аскорбінова кислота, аспарагінова кислота, бензолсульфонова кислота, бензойна кислота, масляна кислота, камфорна кислота, камфорсульфонова кислота, о корична кислота, лимонна кислота, диглюконова кислота, етансульфонова кислота, глутамінова кислота, гліколева

І кислота, гліцерофосфорна кислота, напівсірчана кислота, капронова кислота, мурашина кислота, фумарова кислота, 2-гідроксіетансульфонова кислота (ізетіонова кислота), молочна кислота, гідроксималеїнова кислота, яблучна кислота, малонова кислота, мигдальна кислота, мезитиленсульфонова кислота, метансульфонова дв Кислота, нафталінсульфонова кислота, нікотинова кислота, 2-нафталінсульфонова кислота, щавлева кислота, памова кислота, пектинова кислота, фенілоцтова кислота, З-фенілпропіонова кислота, півалінова кислота,

Ф; пропіонова кислота, піровиноградна кислота, саліцилова кислота, стеаринова кислота, бурштинова кислота, ка сульфанілова кислота, винна кислота, пара-толуолсульфонова кислота, ундеканова кислота та т.п.

Поняття "фармацевтично прийнятна сіль приєднання основи" позначає солі, які зберігають свою біологічну бо ефективність та властивості вільних кислот та які не є небажаними з позицій біології або з інших причин, і які утворені з неорганічними основами, такими як аміак або гідроксид, карбонат або бікарбонат амонію, або катіонами металу, такого як натрій, калій, літій, кальцій, магній, залізо, цинк, мідь, марганець, алюміній та т.п. Найбільш кращими є солі амонію, калію, натрію, кальцію та магнію. Солі, отримані з фармацевтично прийнятних органічних нетоксичних основ, включають солі первинних, вторинних та третинних амінів, ве четвертинних амінових сполук, заміщених амінів, включаючи заміщені аміни, які зустрічаються в природних умовах, циклічні аміни та основні іонообмінні смоли, такі як метиламін, диметиламін, триметиламін, етиламін,

діетиламін, триетиламін, ізопропіламін, трипропіламін, діетаноламін, етаноламін, діетаноламін, 2-диметиламіноетанол, 2-діетиламіноетанол, дициклогексиламін, лізин, аргінін, гістидін, кофеїн, гідрабамін, холін, бетаїн, етилендіамін, глюкозамін, метилглюкамін, теобромін, пурини, піперазин, піперидин,

М-етиллшеридин, похідні тетраметиламонію, похідні тетраетиламонію, піридин, /М,М-диметиланілін,

М-метилпіперидин, М-метилморфолін, дициклогексиламін, дибензиламін, М,М-дибензилфенетиламін, 1-ефенамін,

М,М'-дибензшіетилендіамін, поліамінові смоли та т.п. Найбільш кращими органічними нетоксичними основами є ізопропіламін, діетиламін, етаноламін, триметиламін, дициклогексиламін, холін та кофеїн.

Поняття "антивірусний агент" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний /о агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації вірусу в організмі ссавця. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, необхідні для утворення та/або реплікації вірусу в організмі ссавця. Антивірусні агенти включають, наприклад, рібавірин, амантадин, МХ-497 (меримеподиб, фірма Мегпех РВагтасеціїсаів), МХ-498 (фірма Мепех

РНагтпасеціїса!з), левовірин, вірамідин, цеплен (максамін), ХТІ-001 та ХТІ -002 (фірма ХТІ. Віорпаптасеціїсаї!8).

Поняття "інший агент, який володіє активністю по відношенню до НСУ" у контексті даного опису позначає агенти, ефективні відносно зниження або попередження розвитку пов'язаних з гепатитом С симптомів хвороби.

Такі агенти вибирають з: антивірусних агентів, імуномодуляторів, інгібіторів М5З-протеази НСМУ, інгібіторів полімерази НСМУ або інгібіторів іншої мішені в життєвому циклі НСУ.

Поняття "імуномодулятор" у контексті даного опису позначає агенти (хімічні сполуки або біологічні 2о агенти), які мають ефективність відносно підвищення або потенціювання реакції імунної системи у ссавця.

Імуномодулятори включають, наприклад, інтерферони класу І (такі як о-, Д-, о- та о-інтерферони, г-інтерферони, консенсусні інтерферони та азіало-інтерферони), інтерферони класу ІІ (такі як у-інтерферони) та пегільовані інтерферони.

Поняття "М53З-протеази НСМ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний Ге агент), який має ефективність по відношенню до інгібування функції МЗЗ-протеази НСМ у ссавця. Інгібітори

МЗЗ-протеази НСМ включають, наприклад, сполуки, описані у (МО, 99/07733; УМО, 99/07734; МО, 00/09558; УМО, о, 00/09543; УУО, 00/59929; УУО, 02/060926), перспективну сполуку, розроблену фірмою Военпйгіпдег ІпдеіІНеїт, позначену як ВІЇМ 2061, яка вивчена в клінічному дослідженні, та перспективні сполуки, розроблені фірмою

Мепех/Еїї Ціу, позначені як МХ-950 або І М-570310, які ще не є остаточно дослідженими. Зокрема, сполуки Мо че 2, 3,5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 та 127, представлені в таблиці на стор. 224-226 МО, 02/060926), можна юю застосовувати у поєднанні зі сполуками, запропонованими в даному винаході. -

Поняття (інгібітор полімерази НСМ| у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування функції полімерази НСМ у ссавців. Воно - відноситься, наприклад, до інгібіторів М55В-полімерази НСМ. Інгібітори полімерази НСМ включають сполуки, які че не відносяться до нуклеозидів, наприклад, описані у: заявці фірми Воепгіпдег ІпдеІйейт на патент (5, 10/198680, 18.07.2002), яка відповідає |РСТ/СА, 02/01127, 18.07.2002; « заявці фірми Восенйгіпдег ІпдеІйеійт на патент (5, 10/198384, 18.07.2002 яка відповідає |РСТ/СА, 02/01128, 400 18.07.20021; - с заявці фірми Военгіпдег ІпдеІйеійт на патент (05, 10/198259, 18.07.2002, яка відповідає |РСТ/САО2/01129, 18.07.2002; )» заявкам фірми Зпіге (МО, 02/100846, А1; УУО, 02/100851, АЗІ; заявкам фірми О5К (МО, 01/85172, А1; УУО, 02/098424, А1|; заявкам фірми Мегсек (МО, 00/06529; УУО, 02/06246, А11; - І заявкам фірми дарап Торассо (МО, 01/47883; УМО, 03/0002541; заявці фірми Адоигоп (ЕР, 1256628, АЗІЇ. ї Крім того, інші інгібітори полімерази НСМ включають також нуклеозидні аналоги, наприклад, сполуки, описані у: - І заявці фірми Ідепіх (УМО, 01/90121, АЗІ; заявці фірми Віосгуві Рпагтасеціїса!з Іпс. МО, 02/069903, АЗІ;

Мн заявкам фірми Мегсек/Ізіз (МО, 02/057287, А2; МО, 02/057425, АД). "і Конкретними прикладами інгібіторів полімерази НСМ є )ТК-002, УТК-003 та ОТК-109 (фірма дарап Тобассо).

Поняття "інгібітор іншої мішені в життєвому циклі НСМ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації НСМ у ссавців, яка відмінна від інгібування функції МЗЗ-протеази НСУ. Вони включають агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом НСМ механізми, необхідні для утворення та/або реплікації о НОМ в організмі ссавців. Інгібітори іншої мішені в життєвому циклі НСМ включають, наприклад, агенти, які ко інгібують мішень, обрану з ряду, який включає геліказу, М52/3-протеазу НСМ та внутрішній сайт входу в рибосому (ІКЕ5). Конкретним прикладом інгібіторів іншої мішені в життєвому циклі НСМ є 1І5І5-14803 (ІБІЗ 60 РНаптасеціїса|5).

Поняття "інгібітор ВІЛ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації ВІЛ в організмі ссавців. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, необхідні для утворення та/"або реплікації ВІЛ в організмі ссавців. Інгібітори ВІЛ включають, наприклад, нуклеозидні інгібітори, 65 ненуклеозидні інгібітори, інгібітори протеаз, інгібітори злиття та інгібітори інтегрази.

Поняття "інгібітор НАМ (вірус гепатиту А)" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації НАМ в організмі ссавців. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, необхідні для утворення та/або реплікації НАМ в організмі ссавця. Інгібітори НАМ включають вакцини, які

Містять вірус гепатиту А, наприклад, Намгіх"У (фірма СіахозтіїнКіїпе), МАОТА? (фірма Мегск) та Амахіт?У (фірма

Аумепіїз Равзіеинг).

Поняття "інгібітор НВМ (вірус гепатиту В)" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації НВ в організмі ссавців. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, 70 необхідні для утворення та/або реплікації НВ в організмі ссавців. Інгібітори НВМ включають, наприклад, агенти, які інгібують ДНК-полімеразу вірусу НВМ або вакцини на основі НВУ. Конкретними прикладами інгібіторів

НВМ є ламівудин (Ерімі-НВМУ), адефовірдипівоксил, ентекавір, ЕТС (Сомігасі?), ОАРО (0ХО), І-ЕМАШ (Сіємидіпе?), АМ365 (амрад), а (телбівудин), моновалентний- 4 (валторцитабін), АСН-126,443 (І-Еа4с) (ахіліон), МОСС478 (фірма Еїї І Шу), рацивір (КСМ), фтТОР-Ї- та -Ю-нуклеозиди, робустафлавон, ІСМ 2001-3 (ІСМ), Ват 205 (Момеїоз), ХТІ-001 (ХТ), іміноцукри (МопуІ-ОМУ) (фірма Зупегду), НерВгуте; імуномодулятори, такі як: інтерферон альфа 26, НЕ2000 (фірма Ноїйїз-Едеп), Тнегадідт (епімун), ЕНТВ899 (фірма Епго Віоспет), тимозин альфа-1 (7адахіп"), вакцину на основі ДНК НВМ (фірма Ром/дег)есі), вакцину на основі ДНК НВМ (фірма

Чейегоп Сепієг), антиген НВМ (фірма ОгасСеп), ВауНер ВУ (фірма Вауег), Мабі-НВУ (фірма Марбі) та антитіла до вірусу гепатиту В (фірма Сапдепе); та вакцини на основі НВУ, такі, наприклад, як: Епдегіх В, Кесотбімах НВ,

СепнНемас В, Нерасаге, Віо-Нер В, Тм/іпКіх, Сотмах, Нехамас.

Поняття "Інтерферон класу І" у контексті даного опису позначає інтерферон, обраний із групи інтерферонів, які всі зв'язуються з рецептором типу І. Воно включає як такі, що зустрічаються в природних умовах, так й ті, що отримані синтетичним шляхом інтерферони класу І. Приклади інтерферонів класу включають со, р-, о-інтерферони, г-інтерферони, консенсусні інтерферони, азіало-інтерферони. сч

Поняття "інтерферон класу ПП" у контексті даного опису позначає інтерферон, обраний із групи (Фо) інтерферонів, які всі зв'язуються з рецептором типу ІЇ. Приклади інтерферонів класу ІЇ включають у-інтерферони.

Нижче представлені конкретні кращі приклади деяких таких агентів:

Антивірусні агенти: рібавірин та амантадин; - 3о Імуномодулятори: інтерферони класу І, інтерферони класу І! та пегільовані інтерферони; Іо)

Інгібітор іншої мішені в життевому мішенню такого інгібітору є М5З3-геліказа, МЗ2/3-протеаза НСМ або внутрішній сайт входу в їм- циклі НСУ: рибосому (ІКЕ5);

Інгібітори ВІЛ: нуклеозидні інгібітори, ненуклеозидні інгібітори, інгібітори протеаз, інгібітори злиття та че інгібітори інтеграз; 3 Інгібітори НВУ: агенти, які інгібують вірусну ДНК-полімеразу НВУ, або вакцина на основі НВУ. в.

Як зазначено вище, спільна терапія передбачає спільне введення сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі щонайменше з одним додатковим агентом, обраним з наступного ряду: антивірусний агент, « імуномодулятор, інший інгібітор М5З-протеази НСМ, інгібітор полімерази НСМ, інгібітор іншої мішені в життєвому циклі НСМУ, інгібітор ВІЛ, інгібітор НАМ та інгібітор НВМ. Приклади таких агентів наведені вище. - с Зазначені додаткові агенти можна поєднувати зі сполуками, запропонованими у винаході, одержуючи лікарський засіб, який містить однократну фармацевтичну дозу. В іншому варіанті зазначені додаткові агенти можна вводити і» пацієнтові індивідуально у вигляді складової частини багатокомпонентного лікувального засобу, наприклад, з використанням набору. Зазначені додаткові агенти можна вводити пацієнтові до, одночасно або після введення сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі. -і У контексті даного опису поняття "лікування" позначає введення сполуки або композиції, запропонованих у - даному винаході, для полегшення або усунення симптомів гепатиту С та/або зниження вірусного титру у пацієнта.

У контексті даного опису поняття "попередження" позначає введення сполуки або композиції, запропонованих -і у даному винаході, після контакту індивідуума з вірусом, але до прояву симптомів хвороби та/або до виявлення сл 50 вірусу в крові.

Кращі варіанти здійснення винаходу "м Кращими є сполуки формули І, як вони визначені вище, у яких К позначає гідрокси, МНЗО»Ме,

МНЗО,-циклопропіл або МНЗО»РН. Більш переважно ВЕ! позначає МНЗО»Ме або гідрокси. Найбільше переважно

В! позначає гідрокси.

Кращими є сполуки формули І, як вони визначені вище, у яких В 2 позначає трет-бутил або СНо-С(СН3з)з. іФ, Більш переважно В2 позначає СНо-С(СН»З)з. ко Переважно ЕВ? позначає трет-бутил.

Кращими є сполуки формули І, як вони визначені вище, у яких Б 7 позначає циклопентил або циклогексил. 60 Більш переважно В" позначає циклопентил.

Більш кращою є сполука формули І, як вона визначена вище, у якій Б ! позначає гідрокси, БК? позначає

СН.-С(СНЗ)»з, ВЗ позначає трет-бутил та 7 позначає циклопентил.

Більш кращою є сполука формули І, у якій В! позначає гідрокси, В? та ЕЗ кожний позначає трет-бутил та В? б5 позначає циклопентил.

Більш кращою є сполука формули І, у якій В позначає гідрокси, В? позначає СНо-С(СН»)», ВЗ позначає циклогексил та В" позначає циклопентил.

Більш кращою є сполука формули І, у якій В! позначає гідрокси, В? позначає СнНо-«(СН»)»з та ВЗ їв кожний позначає циклогексил.

Більш кращою є сполука формули І, у якій В! позначає гідрокси, 22 позначає циклопентилметил, ВЗ позначає трет-бутип та Е7 позначає циклобутил.

Більш кращою є сполука формули І, у якій БК! позначає гідрокси, Б? позначає СНо-С(СНз)з, КЗ позначає трет-бутил та В" позначає циклобутил. 70 Більш кращою є сполука формули І, у якій В! позначає МНЗОо»Ме, В2 позначає СНо-ССН»)»з, ВЗ позначає трет-бутип та Е7 позначає циклопентил.

Більш кращою є сполука формули І, у якій КЕ позначає МНЗООРИ, 2 позначає СНо-С(СНуі)з, ВЗ позначає трет-бутил та В" позначає циклопентил.

Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному 75 винаході, може додатково містити інший агент, якій володіє активністю по відношенню до НСУ. Приклади інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСМ, включають, ф- (альфа), д- (бета), 5- (дельта), у (гама), «- (тау) або 5-(омега) інтерферон, рібавірин та амантадин.

Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може додатково містити інший інгібітор М53З-протеази НСУ.

Згідно ще одного варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може додатково містити інгібітор полімерази НСУ.

Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може додатково містити інгібітор інших мішеней життєвого циклу НСУ, включаючи (але не обмежуючись ними) геліказу, М5З2/3-протеазу або внутрішній сайт входу в рибосому (ІКЕ5). с

Фармацевтичну композицію, запропоновану в даному винаході, можна вводити орально, парентерально або за о допомогою пристрою для імплантації. Кращим є оральне введення або введення за допомогою ін'єкції.

Фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може містити будь-які загальноприйняті нетоксичні фармацевтично прийнятні носії, допоміжні речовини або наповнювачі. У деяких випадках значення рН композиції можна регулювати за допомогою фармацевтично прийнятних кислот, основ або буферів з метою підвищення - стабільності сполуки, включеної в композицію або у форму для її введення. У контексті даного опису поняття ю "парентеральний" включає підшкірний, внутрішньошкірний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньосуглобний, інтрасиновіальний, інтрастернальний, інтратекальний шлях введення, введення за - допомогою ін'єкції або інфузії, а також введення у область ушкодження. їм-

Фармацевтична композиція може мати форму стерильного препарату для ін'єкції, наприклад, стерильної

Зо водної суспензії, яку ін'єкують, або жиророзчинної суспензії. Цю суспензію можна одержувати за допомогою в. добре відомих методів з використанням диспергувальних або змочувальних агентів (таких, наприклад, як Твін 80) та суспендувальних агентів.

Фармацевтичну композицію, запропоновану в даному винаході, можна, вводити орально у вигляді будь-якої « прийнятної форми лікувального засобу, призначеної для орального введення, включаючи (але не обмежуючись ними) капсули, таблетки та водні суспензії та розчини. У випадку таблеток для орального введення носії, які но с звичайно застосовують, являють собою лактозу та кукурудзяний крохмаль. Як правило, додають також у» змащувальні агенти, такі як стеарат магнію. Для орального введення у формі капсул прийнятні розріджувачі являють собою лактозу та безводний кукурудзяний крохмаль. Коли оральним шляхом вводять водні суспензії, діючу речовину поєднують із емульгувальними та суспендувальними агентами. При необхідності можна додавати певні речовини, підсолоджувачі, та/або коригенти та/або барвники. - Інші придатні наповнювачі або носії для зазначених вище препаративних форм та композицій наведені у -І звичайних фармацевтичних довідниках, наприклад, у |(Кетіпдіоп'з РІаптасеціїса! Зсіепсе5. Те Зсіепсе та

Ргасіїсе ої Рпагтасу. 1917 Ед. - Еавіоп, Репп.: Маск Рибіїзпіпуд Сотрапу, 19951.

Ше Для монотерапії з метою попередження та лікування опосередкованої НСМ хвороби можна застосовувати дози с 20 в діапазоні від приблизно 0,01 до приблизно 10Омг/(кг ваги тіла) на день, переважно від приблизно 0,1 до приблизно БОмг/(кг ваги тіла) на день запропонованої сполуки, яка є інгібітором протеази. Як правило,

Що фармацевтичну композицію, запропоновану у винаході, можна вводити від приблизно 1 до приблизно 5 разів на день або в іншому варіанті шляхом безперервної інфузії. Таке введення можна застосовувати як для тривалого, так й для екстреного лікування. Кількість діючої речовини, яку можна поєднувати з носіями для одержання однократної дози лікувального засобу, повинна варіюватися залежно від хазяїна, який підлягає лікуванню, та

ГФ) конкретного шляху введення. Звичайна композиція може містити від приблизно 5 до приблизно 95905 діючої речовини (мас. 95). Переважно такі композиції містять від приблизно 2095 до приблизно 8095 діючої речовини. о Як повинно бути очевидно фахівцеві в даній галузі, можна застосовувати й більш низькі або більш високі дози в порівнянні із зазначеними вище. Конкретні дози та схеми лікування будь-якого конкретного пацієнта бо можуть залежати від різних факторів, включаючи активність конкретної сполуки, яку застосовують, віку, ваги тіла, загального стану здоров'я, статі, раціону, часу введення, швидкості виведення, поєднання лікарських засобів, серйозності та особливостей розвитку хвороби, схильності пацієнта до інфекції, та їх визначає лікар.

Як правило, лікування починають із невеликих доз, істотно більш низьких, чим оптимальна доза пептиду. Потім дозу підвищують невеликими порціями до досягнення оптимальної дії в конкретних умовах. Як правило, найбільш бо переважно вводити сполуку в такому діапазоні концентрацій, які в цілому забезпечують антивірусну активність,

але не мають які-небудь шкідливі або небезпечні побічні дії.

Коли композицію, запропоновану в даному винаході, включають у комбінацію, яка містить сполуку формули та один або кілька додаткових терапевтичних або профілактичних агентів, то сполука та додатковий агент повинні бути присутніми у дозі, яка становить приблизно від 10 до 10095 та більш переважно приблизно від 10 до 8095 від дози, яку звичайно застосовують в режимі монотерапії.

Коли ці сполуки або їх фармацевтично прийнятні солі поєднують у препаративній формі з фармацевтично прийнятним носієм, то отриману композицію можна вводити іп мімо ссавцеві, такому як людина, для інгібування

М5З-протеази НСМ або для лікування або попередження інфекції, яка викликається вірусом НСМ. Таке лікування /0 можна здійснювати також при використанні сполуки, запропонованої у винаході, у поєднанні з агентами, які включають (але не обмежуються ними): о-, Ве бе Фо або у-інтерферон, рібавірин, амантадин; інші інгібітори

МЗЗ-протеази НСУ; інгібітори полімерази НСУ; інгібітори інших мішеней життєвого циклу НСУ, які включають (але не обмежуються ними) геліказу, М52/3-протеазу або внутрішній сайт входу в рибосому (ІКЕ5); або їхні комбінації. Зі сполуками, запропонованими в даному винаході, можна поєднувати інші агенти, одержуючи 75 однократну дозу лікувального засобу.

В іншому варіанті ці додаткові агенти можна вводити ссавцеві окремо у вигляді складової частини багатокомпонентного лікувального засобу.

Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб інгібування М5ЗЗ-протеазної активності НСМ у ссавця, який полягає у введенні сполуки формули |.

Відповідно до кращого варіанта здійснення винаходу цей спосіб призначений для зниження М5З-протеазної активності у зараженого вірусом гепатиту С ссавця.

Якщо фармацевтична композиція містить як діючу речовину тільки сполуку, яка запропонована в даному винаході, то такий спосіб може додатково передбачати введення зазначеному ссавцеві агента, обраного з ряду, який включає імуномодулятор, антивірусний агент, інгібітор МЗЗ-протеази НСУ, інгібітор полімерази НСМ або с інгібітор інших мішеней життєвого циклу НСУ, таких як геліказа, МЗ2/3-протеаза або ІКЕ5. Такий додатковий агент можна вводити ссавцеві до, одночасно або після введення композиції, запропонованої в даному винаході. о

Сполуку формули І, запропоновану в даному винаході, можна застосовувати також як лабораторний реагент.

Сполуку, запропоновану в даному винаході, можна застосовувати також для усунення або попередження вірусного забруднення матеріалів, знижуючи тим самим ризик зараження вірусом персоналу лабораторій або - медичних установ або пацієнтів, які мають контакт із такими матеріалами (наприклад, кров'ю, тканинами, хірургічними інструментами та предметами одягу, лабораторними інструментами та предметами одягу, приладами о та матеріалами для збору крові). ча

Сполуку формули І, запропоновану в даному винаході, можна застосовувати також як реагент для досліджень.

Сполуку формули | можна використовувати як позитивний контроль для обгрунтування модельних аналізів на - Клітинах або аналізів іп міго або іп мімо реплікації вірусів. ча

Нижче винахід проілюстрований на прикладах, які не обмежують його об'єм, який заявляється в наведеній нижче формулі винаходу.

Приклади

Температури наведені в градусах Цельсія. Відсотки для розчинів являють собою мас. 95, а співвідношення в « розчинах являють собою співвідношення об'ємів, якщо не зазначено інше. Спектри ядерного магнітного резонансу ш

Гані (ЯМР) реєстрували за допомогою спектрометра фірми ВгисКег при частоті 40ОМГЦц, хімічні зсуви (5) виражені у част./млн. Експрес-хроматографію проводили на силікагелі (512) відповідно до методу експрес-хроматографії і» Стіла (5 М.С. еї аї. // 9). Огд. Спет. - 1978. - 43. - Р. 29231).

У прикладах використовували наступні скорочення: -І ДБУ: 1,8-діазабіцикло|5.4.Ф)ундец-7-ен; дхм: дихлорметан; ш- ДІЕА: дізоетиламін; -І ДІПЕА: діїізопропілетиламін; дме: М,М-диметилформамід; і-й ДМАП: 4-(диметиламіно)піридин; "І ЕОАс: етилацетат;

ГАТУ: гексафторфосфат(0-7-азабензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію;

РХВД: рідинна хроматографія високого дозволу;

Мо: мас-спектрометрія; о МАГОІ-ТОЕ: Маїгіх Авзвівівйд І азег Оівогріїоп Іопігайоп-Тіте ої Рідне

ЕАВ: бомбардування швидкими атомами; іме) Ме: метил; меон: метанол; 60 РИ: феніл;

Кт кімнатна температура, 18-22С;

Трет-бутил або т-бутил: 1,1-диметилетил; тва: трет-бутилгліцин: трет-лейцин; тФк.: трифтороцтова кислота; бо ТІФ: тетрагідрофуран.

Синтез сполук формули

У цілому, сполуки формули | та їхні проміжні продукти одержують за допомогою відомих методів з використанням реакційних умов, для яких відомо, що вони є придатними для реактантів. Деякі такі методи описані у (МО, 00/09543; УУО, 00/09558; 05, 6323180), які включені в даний опис як посилання.

Одержання тіосечовин

Одержання тіосечовини 2а 5 о нен, Й ак -О- А 70 шо (га)

Тіосечовину (5,0г, ббммолів) розчиняли у толуолі (бОмл) та додавали трет-бутилацетилхлорид (8,88Гг, ббммолів). Суміш витримували при температурі дефлегмації протягом 14год., одержуючи розчин жовтого кольору.

Суміш концентрували досуха та залишок розподіляли між Е(ЮАс та насиченим МанНсСоО»з. Органічну фазу жовтого 7/5 Кольору сушили над МазО»5, фільтрували та концентрували, одержуючи тверду речовину жовтого кольору. Тверду речовину розчиняли у мінімальній кількості Е(ОАс та розтирали з гексаном, одержуючи сполуку 2а у вигляді твердої речовини білого кольору (8,52г; 7590).

МС (електроспрей): 173(М-Н)- 175(МаН)к. Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК;

СНЗСМ: Н2О) - 99965.

Одержання тіосечовини 25 н а нм. МН, НА М го 7-го св

За допомогою описаного вище процесу та з використанням циклопентилацетилхлориду, який поступає у Ге! продаж, замість отрет-бутилацетилхлориду, одержували тіосечовину 25. о

Синтез проміжних продуктів З

Одержання карбамату За о 9 з я; я ве --- од у (За) юю

Тетрагідрофуран (З5Омл) додавали в колбу, яка містить 2,5-діоксопіролідин-1-іловий ефір циклопентилового м ефіру вугільної кислоти (9,00г, 39,бммоля) та трет-лейцин (6,24г, 47,5ммоля), одержуючи суспензію. При інтенсивному перемішуванні додавали дистильовану воду (100мл). Невелика кількість твердої речовини (Її залишалася нерозчинною. Потім додавали триетиламін (16,бмл, 119ммолів), одержуючи гомогенний розчин, який , й м. перемішували при К.Т. Через 2,5год. ТГФ випарювали та водний залишок розбавляли водою (1О0Омл) та збільшували лужність реакційної суміши, додаючи Тн Маон (25мл - кінцеве значення рН»10). Розчин промивали

ЕЮАс (2х200мл) та потім водну фазу підкисляли за допомогою ін НСІ (приблизно 7Омл - кінцеве значення рНе2). Мутний розчин екстрагували ЕЮАс (200-15О0мл). Екстракт сушили (М950)) та упарювали, одержуючи « 20 сполуку За у вигляді твердої речовини білого кольору (8,68Г). шо!

Одержання карбаматів ЗБ, Зс та За с За допомогою описаного вище процесу та використовуючи відповідні комбінації трет-бутилгліцину або 1» циклогексилгліцину та 2,5-діоксо-піролідин-1-іловий ефір циклобутилового, циклопентилового або циклогексилового ефіру вугільної кислоти, одержували наступні карбамати: - І п сл од н о н о н о - зь Зс за -і Одержання проміжного продукту 5 сл 50 Одержання проміжного продукту зва: мео Ме Ве ме. М СК 4 слой тло

Ще В ши шк Р туда жо я в

ГФ! о-Бромкетон 4 (3,61г, 5,71ммоля) поєднували з тіосечовиною 2а (1,09г, 6,28ммоля) у ізопропанолі (14Омл) кю та розчин жовтого кольору поміщали в попередньо нагріту масляну баню з температурою 702С та витримували протягом 1,5год. Розчин охолоджували до К.Т. та упарювали досуха. Залишок розчиняли у ЕЮАс. Е(Ас-розчин бр промивали насиченим Мансоз (2), водою (52) та соляним розчином (Х1), сушили (М95О)) та упарювали, одержуючи продукт у вигляді піни помаранчево-коричневого кольору. За допомогою /колонкової експрес-хроматографії з використанням гексану:Е(ОдАс як 7:3, видаляли менш полярні домішки, а з використанням гексану:ЕОАс як 6:4, одержували чистий продукт у вигляді твердої речовини світло-жовтого кольору (3,05г, 7690).

МС (електроспрей): 706,3(М-Н)- 708,4(М.АН). Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК; бе СНЗСМ: Н2О) - 99965.

Одержання проміжного продукту 55

За допомогою описаного вище процесу та використовуючи тіосечовину 26 замість тіосечовини 2а, одержували відповідний проміжний продукт 5Б: то ес у «ин ї 5 о. им. 8В- НН о. М. хх з Тор що об (4) (ББ)

Одержання проміжного продукту 5с то За допомогою описаного вище процесу та використовуючи тіосечовину, яка поступає у продаж, замість тіосечовини 2а, одержували відповідний проміжний продукт 5с: тс мео сот 75 І пив, ї 0. М. --ЙЩШЩШШИВУ-ШЦШЦННТНТНТНТННШНН 7 торс» ря Ук є (Бе)

Приклад 1

Синтез сполуки 100 мМео. Мо 5 мео м гУя ей 3. ОА он о где 1419 ло г ее (а) ооо дл Ге! вві Й ва о

Стадія 1. Одержання проміжного продукту ба

Захищений за допомогою Вос дипептид 5а (3,05г, 4,31ммоля) розчиняли у суміші 4н НСі/діоксан (22мл). Після перемішування при К.Т. протягом ЗОхв. осаджувався гідрохлорид. Для розчинення осаду додавали Меон (2мл).

Через 2год. реакційну суміш упарювали досуха. Гідрохлорид, який утворився, розчиняли у ДХМ (22мл) та ДІЕА - (З, Омл, 17,24 ммоля); додавали карбамат За (1,15г, 4,47ммоля) та ГАТУ (1,72г, 4,51бммоля). Розчин ю перемішували при К.Т. протягом бгод. Потім суміш розбавляли ЕОАс та розчин промивали насиченим мансо» (2), водою (52) та соляним розчином (1), сушили (М950)), фільтрували та упарювали, одержуючи - сполуку ба у вигляді твердої речовини жовтого кольору. За допомогою колончатої експрес-хроматографії, ї- здійснюючи спочатку елюювання гексаном:'ЕЮАс (7:3), а потім цією же сумішшю у співвідношенні 6:4, одержували о 1, МИ | м. чистий метиловий ефір ба у вигляді піни білого кольору (3,25г, 90905).

МС (електроспрей): 831,4(М-Н)- 833,4(М--Н)- 855,4(М.Ма) кю. Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК; СНЗСМ : Н2О) - 9896.

Стадія 2. Гідроліз складного ефіру « мот Її б я і ге у | - - 9 ; ло ті р

І» о у Богу от о у буде ба й Сполука 100

Складний метиловий ефір ба (3,24мг, 3,89ммоля) розчиняли у ТГФ (40мл) та Месон (20мл) та додавали водний -і розчин ПОН (1,63мг, 38,9ммоля у 25мл). Реакційну суміш жовтого кольору перемішували протягом 5,5год. та - потім концентрували, одержуючи білувату суспензію. Суспензію розчиняли у Е(ОАс та соляному розчині, приготовленому на деїіонізованій воді. Значення рН отриманого розчину доводили до 6, додаючи 1н НСІ. Шари - розділяли та водний шар додатково екстрагували ЕЮАс (2). Об'єднані ЕЮАс-екстракти промивали деіонізованою с 20 водою (Х2), приготовленим на деіонізованій воді соляним розчином ( Х1), сушили (Мо95О)5), фільтрували та упарювали, одержуючи сполуку 100 у вигляді твердої речовини жовто-білого кольору (3,02г, вихід 9590). "М Перетворення на Ма-сіль

Нейтральну сполуку 100 (1,22г, 1,49ммоля) розчиняли у МеонН (ЗОмл) та додавали 1 еквівалент 0,0їн Ммаон (14,85мл) - при цьому не відбувалося осадження продукту. Прозорий розчин жовтого кольору концентрували, 22 розбавляли деіонізованою водою, заморожували та ліофілізували, одержуючи продукт (Ма-сіль) у вигляді

ГФ) аморфної твердої речовини жовто-білого кольору (1,24г, вихід 99905).

Ма-сіль: ММ - 84,98; С.»НевзМеО5зМма. де МС (електроспрей): 817,3(М-Н)- 819,4(М.-Н)- 841,4(М-Ма)к. Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК; СНЗСМ : Н2О) - 9896. 60 7Н-ЯМР (400МГу, ДМСО-ав): суміш ротамерів, співвідношення приблизно 6:1; 5-8,11-7,65 (т, 4Н), 7,33 (рев, 1Н), 7,18-6,97 (т, 2Н), 6,36-6,08 (т, 1Н), 5,55-5,33 (т, 1), 4,98 (а,

У-18,0ГЦ, 1Н), 4,85 (р5, 1Н), 4,80 (а, 9-104ГуЦ, 1Н), 4,50-4,41 (т, 1Н), 4,22-4,02 (т, 2Н), 3,92 (в, ЗН), 2,712-2,4А5 (т, 1Н), 2,50 (при реєстрації у ДМСО, в, 2Н), 2,40-2,26 (т, 1Н), 1,89-1,43 (т, 9Н), 1,37-1,30 (т, ве 1Н), 1,30-1,12 (т, 1Н), 1,03 та 0,90 (2Хв, 9Н), 0,98 та 0,94 (2Хв, 9Н).

Приклад 2

Синтез сполуки 101 мео. не Го- мео.- ме ст р не - ол и ди пл пли (вв) (бе) 70 За допомогою процесу, описаного на першій стадії приклада 1 та використовуючи Вос-дипептид 5с замість 5а, одержували сполуку 6б.

Сполуку 65 (7Омг, 0,095ммоля) розчиняли у 2мл ДХМ та послідовно обробляли ДІЕА (0,045мл, 0,2бммоля) та півалоїлхлоридом (0,015мл, 0,12ммоля). Після перемішування протягом 1год. при 402 вносили додаткову порцію півалоїлхлориду (0,015мл, 0,12ммоля) та перемішування продовжували протягом ще 2год. Після концентрування 75 розчину залишок розчиняли у Е(ОАс. Розчин промивали насиченим розчином Мансо з та соляним розчином, сушили (М950)4) та концентрували, одержуючи 8мг неочищеної сполуки бс, яку використовували без додаткового очищення. Похідну сполуку бс, яка являла собою складний метиловий ефір, гідролізовали відповідно до процесу, описаного на стадії 2 приклада 1, та очищали за допомогою препаративної РХВД, використовуючи колонку УМО

Сотрбрі-Ргер. 005-АО, 50х20мм, ІС, 5 - 5мкм, 120А та програму лінійного градієнта від 2 до 10095 АсСМ/вода (0,0695 ТФК).

Фракції аналізували за допомогою аналітичної РХВД та чисті фракції поєднували, концентрували, заморожували та ліофілізували, одержуючи сполуку 101 у вигляді трифторацетату:

Її ШИ сч у мео М ПИ я о ги б о

З Го) Ї ка ї- ши п и ! о В Я он й о о н Шо рч- о їм

Сполука 101 м. 7Н-ЯМР (400МГЦц, ДМСО-дв): суміш ротамерів, співвідношення приблизно 85:15.

Опис основного ізомеру: 5-8,56 (в, 1Н), 8,40-8,22 (т, 1), 8,17 (а, 9-8,9ГЦ, 7), 7,67 (рев, 1Н), 7,52 (рев, 1Н), 7,24-7,15 (т, « 1), 7,03 (а, 9-8,3ГЦ, 1Н), 5,78-5,67 (т, 1Н), 5,61-5,53 (т, 1Н), 5,19 (ад, 9-17,2, 1,6Гц, 1Н), 5,09-5,03 (т, 1Н), 4,63-4,55 (т, 1Н), 4,49-4,39 (т, 2Н), 4,11-3,92 (т, 2Н), 3,95 (в, ЗН), 2,62-2,53 (т, 1Н), 2,33-2,25 (т, З с 1Н), 2,06-1,98 (т, 1Н), 1,72-1,25 (т, 10ОН), 1,30 (в, 9Н), 0,97 (в, 9Н). у» МС (електроспрей): 803,3(М-Н)- 805,3(М'4Н)к. Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК;

СНЗСМ: Н2О) - 97965.

Приклад З

Одержання сполуки 102 -і За допомогою процесу, описаного в прикладі 1, та використовуючи карбамат За замість За та описану в -1 прикладі 2 препаративну РХВД для очищення кінцевої сполуки, одержували сполуку 102 у вигляді трифторацетату: -І в. і-й Мео мі М. - "І | | | о А і Ї І о ка о 5 1 МОЇ ми и миши ни ми и

ІФ, о о М ті де Сполука 102 бо 7Н-ЯМР (400МГЦц, ДМСО-дв): суміш ротамерів, співвідношення приблизно 90:10.

Опис основного ізомеру: 5-12,37 (в, 1Н), 8,54 (в, 1Н), 8,40-8,06 (т, 2Н), 7,67-7,40 (т, 2Н), 7,26 (а, 9У-8,0 Гц, 1), 7,26-7,13 (т, 1), 5,77-5,65 (т, 1Н), 5,62-5,49 (т, 1Н), 5,23-5,16 (т, 1Н), 5,10-5,03 (т, 1Н), 4,57-4,37 (т, ЗН), 4,03-3,88 (т, 2Н), 3,94 (в, ЗН), 2,64-2,54 (т, 1Н), 2,41 (в, 2Н), 2,37-2,22 (т, 1Н), 2,04-1,95 (т, 1Н), 62 1,79-1,21 (т, 16Н), 1,17-0,85 (т, 5Н), 1,04 (в, 9Н).

МС (електроспрей): 843,5(М-Н)- 845,4(М.Н). Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК;

СНЗСМ: Н2О) - 99965.

Приклад 4

Одержання сполуки 103

За допомогою процесу, описаного в прикладі 1, та використовуючи карбамат Зс замість За та описану в прикладі 2 препаративну РХВД для очищення кінцевої сполуки, одержували сполуку 103 у вигляді трифторацетату:

З нн

Щі мео ЛО у 71 6 А-

Що

Го

Щ о ох пошти р що ВІ що о он

Га й о З їі о

Сполука 103 7Н-ЯМР (400МГЦц, ДМСО-дв): суміш ротамерів, співвідношення приблизно 85:15.

Опис основного ізомеру: 5-12,35 (8, 1Н), 8,52 (т, 1Н), 8,43-8,06 (т, 2Н), 7,67-7,41 (т, 2Н), 7,26 (й, 9-7,8Гц, 1Н), 7,24-7,11 (т, 1Н), 5,77-5,65 (т, 1Н), 5,62-5,48 (т, 1Н), 5,23-5,15 (т, 1Н), 5,10-5,03 (т, 1Н), 4,52-4,38 (т, 2Н), 4,15-4,05. ИСМ (т, 1Н), 4,03-3,89 (т, 2Н), 3,94 (в, ЗН), 2,63-2,52 (т, 1Н), 2,41 (в, 2Н), 2,35-2,23 (т, 1Н), 2,05-1,96 (т, Ге) 1Н), 1,81-1,41 (т, 11Н), 1,38-0,86 (т, 12Н), 1,04 (в, 9Н).

МС (електроспей): 857,5(М-Н)- 859,4(М'їН) Кк. Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,069 ТФК;

СНЗСМ: Н2О) - 99965.

Приклад 5 в.

Одержання сполуки 104 ю

За допомогою процесу, описаного в прикладі 1, та використовуючи карбамат ЗЬ замість За та Вос-дипептид бЬ замість 5а та описану в прикладі 2 препаративну РХВД для очищення кінцевої сполуки, одержували сполуку 104 у - вигляді трифторацетату: ча 3о Ії 5-й в мео м" ях в 9 їй - о у -- є МІУ, з с бору ит о | Я он

І» о ні

Сполука 104 -1 175 7Н-ЯМР (400МГуц, ДМСО-дв): суміш ротамерів, співвідношення приблизно 3:1. 5-8,02 (8, 1Н) , 7,90 (в, 1), 7,84 (а, 9-7,0ГЦ, 71), 7,70 (в, 71Н), 7,33 (а, 9- 2,2ГцЦ, МН), 7,14 (ад, - -2,5, 8,2Гц, 1), 7,09 (аа, 0-22, 92ГЦ, 1Н), 6,29-6,08 (т, 1Н), 5,54-5,32 (т, 1Н), 4,99 (а, 92-15,9ГцЦ, 1Н), -1 4,80 (а, 9-10,0Гц, МН), 4,76-4,64 (т, 1Н), 4,46 (ай, 9-6,7, 13,9ГЦ, 1Н), 4,19-4,08 (т, ЗН), 3,92 (в, ЗН), 5о270-2,61 (т, 2Н), 2,37-2,09 (т, 4Н), 2,03-1,82 (т, 1Н), 1,85 (р8, 2Н), 1,77-1,44 (т, 8Н), 1,35-1,29 (т, 1Н), і-й 1,29-1,15 (т, 4Н), 0,98 та 0,90 (2Хв, 9Н). "І МС (електроспрей): 815,3(М-Н)- 817, 3(М'Н). Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК;

СНЗСМ: Но) - 98965.

Приклад 6

Одержання сполуки 105

За допомогою процесу, описаного в прикладі 1, та використовуючи карбамат ЗЬ замість За та описану в іФ) прикладі 2 препаративну РХВД для очищення кінцевої сполуки, одержували сполуку 105 у вигляді ко трифторацетату: 60 б5

З мо-К

Ме М 5 -ді й-к во0х-

І ! | 7 о ни ще шк ск бу он й 8)

Сполука 105 1Н-ЯМР (400МГЦц, ДМСоО-ав): суміш ротамерів, співвідношення приблизно 7:1. 5-8,58 (85, 71Н), 8,19 (а, 9-8,0ГЦ, 1), 7,76-7,50 (т, 2Н), 7,35-7,20 (т, 1), 7,19 (а, 9-8,0Гц, МН), 5,78-5,67 (т, 1Н), 5,65-5,50 (т, 1Н), 5,19 (а, 2-17,0ГЦ, 1), 5,07 (а, 9-10,2ГЦ, МН), 4,51-4,42 (т, 2Н), 4,42-4,31 (т, 71), 4,02 (а, 9-7,4ГЦ, 1Н), 4,02-3,93 (т, 71Н), 3,97 (в, ЗН), 2,63-2,52 (т, 1Н), 2,42 (в, 2Н), 2,35-2,25 (т, 1Н), 2,07-1,95 (т, ЗН), 1,90-1,76 (т, 1Н), 1,70-1,41 (т, ЗН), 1,30-1,23 (т, 1Н), 1,04 (в, 9Н), 0,96 та 0,87 (2Х5, 9Н),

МС (електроспрей): 803,4(М-Н)- 805,4(М.4Н) Кк. Гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ТФК;

СНЗСМ: Но) - 98965.

Приклад 7

Одержання сполуки 106 мео н І о-ї м н І --ї с пи яд иа ння о т й ЩІ о сої, Й Сон п і ПИ ск о си "о нудй,

Сполука 106 ч-

Сполуку 100, описану в прикладі 1 (29,вмг, О,0Збммоля), поєднували з ГАТУ (1,2 екв., 19,7мг, 0,052ммоля) ою та розчиняли в безводному ДМФ (4мл). Розчин перемішували при К.Т. та по краплях протягом приблизно хв. додавали ДІПЕА (5 екв., 31,4мкл, 0,18ммоля). Суміш перемішували протягом 20 хв. при К.Т. та аналізували за ї- допомогою аналітичної РХВД, оцінюючи утворення активованого складного ефіру. Додавали розчин м метансульфонаміду (5,8 екв., 19,7мг, 0,207ммоля), ДМАП (5,4 екв., 23,5мг, О,193ммоля) та ДБУ (4,8 екв., 25,8мМкКл, 0,172ммоля) у ДМФ (мл). Реакційну суміш перемішували протягом 16 год. при К.Т., потім концентрували /-Їч« у вакуумі. Залишок відновлювали в ДМСО та очищали за допомогою препаративної РХВД. Після ліофілізації одержували кінцевий продукт (2Змг, 71,395) у вигляді аморфної твердої речовини білуватого кольору. "Н-ЯМР (400МГц, ДМСО-йдв): 5-12,35 (в, 1Н), 10,53 (в, 1Н), 8,87 (в, 1Н), 8,40-8,20 (т, 1), 8,17 (а, «

У-8,8ГЦ, 71Н), 7,61 (р85, 1Н), 7,51 (р5, 1Н), 5,67-5,55 (т, 2Н), 5,23-5,18 (т, 1), 5,10 (а, 9-12Гц, МН), 4,68-4,57 (т, 1Н), 4,50 (Ба, 0-12Гц, 1Н), 4,46-4,537 (т, 1Н), 4,07 (а, 9-8,0Гц, 1Н), 3,95 (в, ЗН), 3,17 (в, - с ЗН), 2,78-2,58 (т, 1Н), 2,42 (в, 2Н), 2,29-2,19 (т, 1Н), 2,19-2,09 (т, 1Н), 1,71 (аа, 0-78, 7,6ГцЦ, 1), у» 1,67-1,55 (т, 4Н), 1,55-1,37 (т, 4Н), 1,04 (зв, 9Н), 0,98 (в, 9Н), 0,97-0.87 (т, 2Н).

МС (електроспрей): 896,5(М--Н) та 894,5(М-Н)-. ОФ-РХВД: -6, 7хв. (гомогенність - 10090).

Приклад 8

Одержання сполуки 107 -І

В. г-й мео м п -І е ! ; ! М гля | А с | І ч Га) " - о г А ї | І | М ) т й м І 5 "ШИ бо вив

М ооо

Ф) з Сполука 107

За допомогою процесу, описаного в прикладі 7, та використовуючи бензолсульфонамід замість 60 метилсульфонаміду, одержували сполуку 107 у вигляді аморфної твердої речовини світло-жовтого кольору, вихід - 5490.

ТН-ЯМР (ДМСО-йв): 5-12,39 (в, 1Н), 10,89 (з, 71Н), 8,83 (в, 1Н), 8,40-8,22 (т, 1Н), 8,18 (а-8,4Гу, 1Н), 7,90 (в, 1Н), 7,88 (в, 1Н), 7,67-7,63 (т, 1Н), 7,63-7,54 (т, ЗН), 7,54- 7,45 (т, 1Н), 7,30-7,15 (т, 1Н),

То (а, 0-7,8ГЦ, 1Н), 5,62-5,51 (т, 1Н), 5,38-5,26 (т, 1Н), 5,16-5008 (т, 71Н), 4,93 (а, 9-104Гц, 1), бо 4,70-4,58 (т, 1Н), 4,57-4,49 (т, 1Н), 4,48-4,39 (т, 1Н), 4,09 (а, 9-7,8ГЦ, 1), 3,95 (в, ЗН), 2,69-2,59 (т, 1Н), 2,41 (в, 2Н), 2,28-2,16 (т, 1Н), 2,14-2,04 (т, 1Н), 1,72-1,52 (т, 4Н), 1,51-1,37 (т, 4Н), 1,29-1,22 (т,

1Н), 1,03 (8, 9Н), 1,00 (з, 9Н), 0,99-0,92 (т, 1Н).

МС (електроспрей): 958,5(М--Н) та 956,5 (М-Н)-. ОФ-РХВД: К-7,2хв. (гомогенність - 95905).

Приклад 9. Аналіз М53-МЗ4А-протеази

Ферментативний аналіз, який застосовували для оцінки сполук, запропонованих у даному винаході, описаний у

ГМО, 00/09543; УМО, 00/59929).

Приклад 10. Аналіз реплікації РНК НСМУ на культурі клітин

Культура клітин

Клітини лінії Ний7, які стабільно підтримують субгеномний реплікон НСМ, створювали відповідно до 7/0 описаного раніше методу (боптап еї аї. // Зсіепсе. 1999. - 285. - Р. 110-113) та позначали їх як клітинна лінія 522.3 (МО, 02/052015). Клітини лінії 522.3 підтримували в модифікованому за методу Дульбеко середовищі

Ігла (ОМЕМ), доповненого 1095 ФБС та мг/мл неоміцину (стандартне середовище). У процесі аналізу використовували середовище ЮОМЕМ, доповнене 1095 ФБС, яке містить 0,595 ДМСО та не містить неоміцин (середовище для аналізу). За 16бгод. до внесення сполуки клітини лінії 522.3 обробляли трипсином та розбавляли 7/5 до 50000 клітин/мл стандартним середовищем. По 200мкл (10000 клітин) вносили в кожну лунку 96-лункового планшета. Потім планшет інкубували при 372С у атмосфері з 595 СО» до наступного дня. При цьому використовували реагенти та матеріали, наведені у табл. 1. сч зв о в 3о ю

Підготовка сполуки, яку тестують, до аналізу - 1Омкл сполуки, яку тестують, (в 10095 ДМСО) додавали до 2мл середовища для аналізу до кінцевої їч- концентрації ДМСО 0,595 та розчин обробляли ультразвуком протягом 15хв. та фільтрували через фільтр типу МіШроге з розміром отворів 0,22мкм. 90Омкл вносили в ряд А титраційного планшета з поліпропілену із - глибокими лунками. Ряди Б-3 містили аліквоти по 400мкм середовища для аналізу (яке містить 0,590 ДМСО) та їх застосовували для приготування серійних розведень (1/2) шляхом переносу по 40Омкл із ряду в ряд (у ряд З не вносили ніякої сполуки). «

Внесення сполуки, яку тестують, у культуру клітин

Середовище для культури клітин аспірирували з 9б-лункового планшета, який містить клітини лінії 522.3. По но с 175мкл середовища для аналізу з відповідним чином розведеною сполукою, яку тестують, переносили з кожної у» лунки планшета, яка містить сполуку, у відповідну лунку планшета, яка містить культуру клітин (ряд З застосовували у якості "контролю без інгібітору"). Планшет з культурою клітин інкубували при 372С у атмосфері з

Бу СО» протягом 72год.

Екстракція загальної клітинної РНК - Після 72год. періоду інкубації екстрагували загальну клітинну РНК із клітин лінії 522.3, які містилися у -І 96-лунковому планшеті, з використанням набору типу ЕМеазу 96 (СіадепУ, ЕМеазу Напабоок, 1999). У цілому, метод полягає в наступному: середовище для аналізу повністю видаляли із клітин та у кожну лунку 96-лункового -і Я Я 8 нище планшета з культурою клітин додавали по 100мкл КІ-Т-буфера (Оіадеп"), який містить 143мМ р-меркаптоетанол. 1 50 Мікропланшет обережно струшували протягом 20с. Потім у кожну лунку мікропланшета додавали по 100мкл 7090 -Ч етанолу та перемішували піпетуванням. Лізат видаляли та вносили в лунки планшета, який містить КМеазу 96 (Сіадеп?), який поміщали у верхню частину блоку із квадратними лунками (Оіадеп? Здиаге-Уеї! Віоск). Планшет з КМеазу 96 запечатували скотчем та пристрій Здцаге-УеїЇ ВіосК з планшетом, який містить КМеазу 96, поміщали дв У тримач та вносили в роторний резервуар центрифуги 4К15С. Зразок центрифугували при 60Обоб./хв. (-5600х9) протягом 4хв. при кімнатній температурі. Скотч видаляли із планшета та у кожну лунку планшета з КМеазу 96 і) вносили по 0,8мл ВМУУ1-буфера (Сіадеп" набір ЕМеаву 96). Планшет, який містить ВМеавзу 96, запечатували новим ко шматком скотча та центрифугували при 6бО00Обоб./хв. протягом 4хв. при кімнатній температурі. Планшет, який містить КМеагзу 96, поміщали у верхню частину іншого чистого блоку із квадратними лунками (типу Здиаге-УМеї 60 Віоск), скотч видаляли та у кожну лунку планшета, який містить КМеазу 96, вносили по О,вмл КРЕ-буфера (Сіадеп? набір ЕМеазу 96). Планшет, який містить ЕМеазу 96, запечатували новим шматком скотча та центрифугували при 6000боб./хв. протягом 4хв. при кімнатній температурі. Скотч видаляли та у кожну лунку планшета, який містить КМеазу 96, вносили ще по 0,вмл КРЕ-буфера (Оіадеп? набір КМеазу). Планшет, який містить КМеазу 96, запечатували новим шматком скотча та центрифугували при 600О0об./хв. протягом 1Охв. при 65 кімнатній температурі. Скотч видаляли, планшет, який містить КМеазу 96, поміщали у верхню частину адаптора, який містить призначені для збору зразків мікроцентрифужні пробірки об'ємом 1,2мл. РНК елюювали, додаючи в кожну лунку по 50мкл вільної від РНК-ази води, запечатуючи планшет новим шматком скотча та інкубували протягом їхв. при кімнатній температурі. Планшет потім центрифугували при 6б000об./хв. протягом 4хв. при кімнатній температурі. Стадію елюювання повторювали, використовуючи другий об'єм рівний 5Омкл вільної від

РНК-ази води. Мікроцентрифужні пробірки із загальною клітинною РНК зберігали при -70260.

Кількісна оцінка загальної клітинної РНК

РНК оцінювали кількісно за допомогою системи ЗТОВМ? (Моіесціаг ОупатісвУ), з використанням набору для кількісної оцінки РНК типу ВіроСтгеєп? (Моїесціаг РгобевУ). У цілому, метод полягає в наступному: реагент

КіробСгееп розбавляли в 200 разів ТЕ (10мМ Трис-НСІ рН-7,5, їМмМ ЕДТК). Як правило, 5Омкл реагенту 70 розбавляли 10мл ТЕ. Зразки рибосомальної РНК для побудови стандартної кривої розбавляли в ТЕ до 2мкл/мл та потім попередньо певні кількості (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 та Омкл) розчину рибосомальної РНК переносили в новий 96б-лунковий планшет (СОЗТАК Мо3997) та об'єм доводили до 10О0мкл за допомогою ТЕ. Як правило, колонку 1 96-лункового планшета використовували для побудови стандартної кривої, а інші лунки використовували для кількісної оцінки зразків РНК. По 1Омкл кожного зразка РНК, який підлягає кількісній оцінці, переносили у 75 відповідну лунку 96-лункового планшета та додавали по 9Омкл ТЕ. У кожну лунку 96-лункового планшета вносили по одному об'єму (100мкл) розведеного реагенту Кіробгееп та інкубували протягом 2-бхв. при кімнатній температурі, захищаючи від світла (1Омкл зразка РНК в 200мкл кінцевого об'єму, тобто 20-кратне розведення).

Інтенсивність флуоресценції кожної лунки оцінювали за допомогою системи ЗТОВМ? (Моїесшаг Оупатісв У.

Стандартні криві одержували на основі відомих кількостей рибосомальної РНК та відповідної їм інтенсивності 20 флуоресценції. Концентрацію РНК в експериментальних зразках визначали, виходячи зі стандартної кривої, та корегували з урахуванням 20-кратного розведення. Реагенти та матеріали, що використовували для кількісної оцінки загальної клітинної РНК, наведені у табл. 2. сч 25 о т зо ю ін м 35 і -

ОТ-ПЛР, проведена в реальному часі

ОТ-ПЛР у реальному часі здійснювали за допомогою системи для аналізу послідовності АВІ Ргізт 7700 з використанням набору ТадМап Е7 В.Т.-РСВ (фірми Регкіп-ЕІтег Арріїєд Віозувіетв). ОТ-ПЛР оптимізувалидля «К кількісної оцінки 5-ІКЕЗ РНК НСМ за допомогою технології Тадтап (фірма Коспе Моїіесцшіаг Оіадповіїсв Зувіетв), шо що аналогічна методу, описаному раніше у ІМапеїй ек аї. // 9. Сійй. Місгобіої. - 1999. - 37. - Р. 327-332). с Система заснована на 5-53! нуклеолітичній активності ДНК-полімерази АтріїТад. У цілому, метод полягає в 1» наступному: для його здійснення використовували фторогенний зонд, який гібридизується, із подвійною міткою (РОТА-зонд), який специфічно ренатурує матрицю між ПЛР-праймерами (праймери 8125 та 7028). 5і-кінець зонда містить флуоресцентний репортер (б-карбоксифлуоресцин |(БАМІ), а 3'-кінець містить гаситель флуоресценції - 15 (б-карбокситетраметилродамін |(ТАМКАЇ). Спектр випромінювання репортера ГАМ пригнічували гасителем на неушкодженому зонді, який гібридизується. Розщеплення зонда, який гібридизується, вивільняв репортер, що -і приводило до підвищення випромінювання флуоресценції. За допомогою аналізатора послідовності типу АВІ - Ргізт 7700 безупинно здійснювали визначення підвищення випромінювання флуоресценції в процесі

ПЛР-ампліфікації, при цьому кількість ампліфікованого продукту прямо пропорційна сигналу. Залежність 1 20 ампліфікації від часу аналізували на ранній стадії реакції, у момент часу, який відповідає логарифмічній фазі -ч нагромадження продукту. Точку, яка представляє собою певний поріг виявлення підвищення сигналу флуоресценції, пов'язаного з експонентним збільшенням кількості ПЛР-продукта для аналізатора послідовності, позначали як поріг циклу (С т). Значення С т обернено пропорційні кількості введеної РНК НСМ; тобто при однакових умовах ПЛР чим більше вихідна концентрація РНК НСУ, тим нижче значення С т.. Стандартну криву будували автоматично за допомогою системи виявлення АВІ Ргізт 7700 шляхом побудови графіка залежності Ст

Ф) від кожного стандартного розведення з відомою концентрацією РНК НСМУ. ка У кожен планшет для здійснення ОТ-ПЛР вносили еталонні зразки для стандартної кривої. РНК реплікон НСМ синтезували (за допомогою транскрипції Т7) іп міо, очищали та кількісно оцінювали по величині ОГово. З бр урахуванням того, що в мкг цієї РНК міститься 2,15Х10 ПТ копій РНК, здійснювали такі розведення, щоб одержувати 109, 107, 106, 105, 107, 103 або 102 копій геномної РНК/5мкл. У кожне розведення включали також загальну клітинну РНК лінії Ний-7 (5Онг/бмкл). мкл кожного еталонного зразка (РНК реплікон - РНК Ний-7) поєднували з 45мкл реагенту Міх та застосовували в проведеній у реальному часі ОТ-ПЛР.

Проведену в реальному часі ОТ-ПЛР здійснювали також з використанням експериментальних зразків, які 65 очищали в лунках планшета, які містили КМеазу 96, поєднуючи 5мкл кожного зразка загальної клітинної РНК із 45мкл реагенту Міх. Реагенти та матеріали, що використовували для ОТ-ПЛР у реальному часі, наведені у табл.

3, а компоненти для приготування реагенту Міх - у табл. 4. ; концентрація 15 Влезавіденкамтеда 00001656

Ммчодбвфвмму 68811111 ю

Прямий праймерсомму 0118 2юм зворотний праймерсомім) Г|00000101881111111111111111001 ом с 25 о

Загальний обєм 00014610 ча зо Послідовність "прямого" праймера (5ЕО ІО МО. 1): - АСО САС ДАА СО ТСТ АОС САТ СОС СТ АСТ - З о

Послідовність "зворотного" праймера (5ЕО ІО МО. 2): їм 5-ТСС Со ОС АСТ СОС ДАО САС ССТ АТС АОО - 3

Примітка: Ці праймери забезпечують ампліфікацію області, яка складається з 256 нуклеотидів, яка є в. зв присутньою у 5Б'-четрансльованій області НСУ. їм-

Послідовність РОТА-зонда (5ЕО ІЮ МО. 3): б6ЕАМ - ТОО ТСТ СО САА ССО СТО АСТ АСА СС - ТАМВА

Контролі, які не містять матриці (КНМ)

На кожному планшеті по 4 лунки використовували в якості "КНМ". Для одержання таких контролів у кожну « 40. лунку замість РНК вносили 5мкл води. о

Гані Умови проведення реакції у термокомірці наведені у табл. 5.

І» й - лю єю

З шк ших «ЦО - з яю

ФО шк шик яр т м в

Після завершення ОТ-ПЛР для аналізу даних необхідно визначати поріг виявлення сигналу флуоресценції для

ПЛР-планшета та для цього одержували стандартну криву шляхом побудови графіка залежності значення С, від кількості копій РНК, які застосовували у кожній еталонній реакції. Значення С ,, отримані для зразків, які (Ф, аналізували, використовували для визначення шляхом інтерполяції кількості копій РНК на основі стандартної ко кривої.

І, нарешті, кількість копій РНК стандартизували (на основі кількісної оцінки РНК, яку екстрагували з бо лунки із клітинною культурою, за допомогою набору КіросСгееп КМА) та виражали у вигляді відношення геномних еквівалентів до мкг загальної РНК (г.е./мкг).

Кількість копій РНК (г.е./мкг) для кожної лунки планшета з культурою клітин приймали за міру кількості

РНК НСМ, яка реплікується, у присутності різних концентрацій інгібітору. Інгібування у 95 розраховували за допомогою наступного рівняння: 65 лод- Те АМКОне 10

Сов. МКГ контр.

Для обробки даних залежності інгібування від концентрації застосовували засновану на моделі Хіла апроксимацію нелінійної кривої, та значення концентрації, яка забезпечує 5095 ефективність (5095 інгібування) (ЕСво), розраховували за допомогою програмного забезпечення ЗАЗ (Зіайвіїса! Зоймаге Зувіет; ЗАЗ Іпзійціе, пс. Кери, шт. Північна Кароліна).

При оцінці сполук, запропонованих у даному винаході, за допомогою описаних вище ферментативних аналізів та аналізів на клітинних культурах, виявлена їхня висока активність. Більш конкретно, встановлено, що значення ІС5о сполук становили менше 0,1мкМ при аналізі М53-М54А-протеази, а значення ЕСв5о становили менше

О,5мкМ при аналізі реплікації РНК НСУ на культурі клітин. 76 Приклад 11. Аналізи специфічності

Аналізи специфічності, які застосовували для оцінки вибірковості дії зазначеної сполуки, відповідають описаним у (МО, 00/095431.

Коли сполуки оцінювали в дослідах по визначенню специфічності, то було встановлено, що сполуки формули мали селективність, тобто вони не викликали істотного інгібування еластази лейкоцитів людини та катепсина В.

Приклад 12. Фармакокінетичні властивості

Сполуки, запропоновані в даному винаході, мають також задовільні фармакокінетичні властивості, такі як значні рівні в плазмі пацюків через 1 та 2год. після орального введення дози 4 або Бмг/кг.

Більш конкретно, для оцінки рівнів у плазмі пацюків сполук, які тестують, після орального введення застосовували наступний аналіз, заснований на оцінці іп мімо абсорбції після орального введення:

Матеріали та методи: 1. Метод, який застосовують для угрупування сполук (відбір за допомогою "касет")

Відбір сполук, призначених для об'єднання в "касету, був заснований на їхній структурній подібності та фізикохімичних властивостях. Був розроблений метод твердофазної екстракції, який застосовують для всіх відібраних сполук. Дані початкового тестування, при якому кожну сполуку вводили в плазму пацюків та за сч ов допомогою РХВД або РХВД-МС аналізували кожну сполуку, взяту в концентрації 0,5мкм, з визначенням часу утримання, іонної маси та можливості розділення сполук за допомогою РХВД та/або РХВД/МС, використовували і) для об'єднання 3-4 сполук в одну "касету". 2. Підготовка носія та сполуки для орального введення

Кожна "касета" містила 3-4 сполуки, кожна в концентрації 5 або 4мг/кг. Касету приготовляли у вигляді ч- зо суспензії для орального введення, яка містить 0,595 водної метилцелюлози та 0,395 поліоксіетилен(20)сорбітанмоноолеату (Твін-80). Об'єм дози, яку вводили, становив 1Омл/кг та її вводили через юю оральний шлунковий зонд. ч- 3. Дози, які застосовували, та відбір зразків плазми

Самців пацюків Зргадое ЮОаулЛеу утримували в індивідуальних клітках протягом ночі, і тварини мали доступ до -

Зз5 водної 1095 декстрози. Кожну "касету. вводили 2 пацюкам. Зразки плазми (х1Тмл) одержували через 1 та 2год. В. після обробки в кожного із двох пацюків та поєднували для екстракції та аналізу. 4. Екстракція та аналіз сполук

Для кожної "касети" зразки плазми, отримані через 1 та 2год., зразки контрольної плазми, зразки контрольної плазми, у яку вводили всі сполуки, кожну в концентрації О,5мкм, екстрагували за допомогою методу « твердофазної екстракції. Для порівняння зразки аналізували за допомогою РХВД та РХВД/МС. Концентрації в ш

Гаші плазмі визначали на основі однієї концентрації стандарту, яка становить 0,5мкм.

Результати )» При оцінці запропонованих у даному винаході сполук, описаних у прикладах 1-8, за допомогою зазначеного вище методу відбору виявлені їхні високі рівні в плазмі через 1 та 2год. після орального введення, при цьому усереднені рівні в плазмі крові становили 0,8Змкм та 0,75мкм відповідно. -І Ці результати демонструють, що запропоновані в даному винаході трипептидні сполуки володіють таким рівнем абсорбції іп мімо після орального введення в порівнянні з низьким рівнем абсорбції після орального - введення, характерним у цілому для цього класу пептидів, який представляє інтерес. Здатність до абсорбції -і після орального введення робить зазначені сполуки перспективними для лікування інфекції, яка викликається 5о НОМ. о Перелік послідовностей "І «110» Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ ГмбХ «120» Гетероциклічні трипептиди як інгібітори вірусу гепатиту С «130» 13/107 «150» 2,369,970 «151» 2002-02-01

Ф, «1605 З ка «170» РазізЕО для версії УУіпдомуз 4.0 «210» 1 во «211» 30 «212» ДНК «213» штучна послідовність «220» «223» прямий праймер 65 «400» 1 асдсадааад сдісіадсса додсонаді 30

«211» 30 «212» ДНК «213» штучна послідовність «220» «223» зворотний праймер «40022 іІсссддддса сісдсададса сссіаісадд 30 70 «210» 3 «211» 26 «212» ДНК «213» штучна послідовність «220» «223» РОТ АК-зонД «400» З ддісдсоод аассддщдад (асасс 26

Claims (23)

Формула винаходу

1. Сполука формули (1): в2,() - с » м - о (о) Ме я ІЧ пед З тв о ц І а ів)

« . й а її 3 і - 8) МО жк Но у якій В / означає гідрокси або МНОЮ, де Я означає С.і-Свалкіл, Сз-Суциклоалкіл або « 20 С.-Салкіл-С3-С,циклоалкіл, які всі необов'язково заміщені 1-3 замісниками, вибраними з ряду, який включає шв с галоген, ціано, нітро, ОС.--Свалкіл, амідо, аміно або феніл, або ВА означає Св- або С.ірарил, необов'язково заміщений 1-3 замісниками, вибраними з ряду, який включає галоген, ціано, нітро, С 1-Свалкіл, ОС.-Свалкіл, )» амідо, аміно або феніл; ВК? означає трет-бутил, -СНо-С(СНуз)з, або -СНо-циклопентил; В? означає трет-бутил або циклогексил та В7 означає циклобутил, циклопентил або циклогексил; або її фармацевтично прийнятна сіль.

2. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що В означає гідрокси, МНЗО»Ме, МНЗО»-циклопропіл і або МНЗО2РИ. -І

3. Сполука формули (І) за п. 2, яка відрізняється тим, що В! означає МНЗО»Ме або гідрокси.

-

4. Сполука формули (І) за п. 3, яка відрізняється тим, що В! означає гідрокси.

5. Сполука формули (І) за будь-яким одним з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що Б? означає трет-бутил або о СН.-С(СНЗ)»з. "І

6. Сполука формули (І) за п. 5, яка відрізняється тим, що Ко означає СНо-С(СНЗ)з.

7. Сполука формули (І) за будь-яким одним з пп. 1-6, яка відрізняється тим, що ВЗ означає трет-бутил.

8. Сполука формули (І) за будь-яким одним з пп. 1-7, яка відрізняється тим, що В" означає циклопентил або Цциклогексил. о

9, Сполука формули (І) за п. 8, яка відрізняється тим, що В" означає циклопентил.

10. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що КЕ! означає гідрокси, ВК? означає СНо-С(СНа)з, ВЗ о означає трет-бутил та В" означає циклопентил. во

11. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що В означає гідрокси, КБ? та КЗ кожний означає трет-бутил та В" означає циклопентил.

12. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що КЕ! означає гідрокси, ВК? означає СНо-С(СНа)з, ВЗ означає циклогексил та В? означає циклопентил.

13. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що В означає гідрокси, В? означає СНо-С(СНа)з та ВЗ 65 та В" кожний означає циклогексил.

14. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що К' означає гідрокси, БК? означає циклопентилметил, ВЗ означає трет-бутил та В" означає циклобутил.

15. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що КЕ! означає гідрокси, ВК? означає СНо-С(СНа)з, ВЗ означає трет-бутил та В? означає циклобутил.

16. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що В! означає МНЗО»Ме, В? означає СНо-С(СНу)з КЗ означає трет-бутил та В" означає циклопентил.

17. Сполука формули (І) за п. 1, яка відрізняється тим, що ВК! означає МНЗО2РИ, В? означає СНо-С(СНу)з, ВЗ 7/0 означає трет-бутил та В" означає циклопентил.

18. Фармацевтична композиція, яка містить ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки формули (І) за будь-яким одним з пп. 1-17 або її фармацевтично прийнятної солі в суміші з фармацевтично прийнятним середовищем носія або допоміжною речовиною.

19. Фармацевтична композиція за п. 18, яка відрізняється тим, що додатково містить терапевтично ефективну кількість одного або декількох інших агентів, які мають активність по відношенню до НСУ.

20. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що інший агент, який є активним по відношенню до НСУ, вибирають з: 9-- інтерферону або пегильованого 2: - інтерферону.

21. Фармацевтична композиція за п. 19 або 20, яка відрізняється тим, що інший агент, який є активним по відношенню до НСУ, являє собою рибавірин.

22. Фармацевтична композиція за п. 19, 20 або 21, яка відрізняється тим, що інший агент, який є активним по відношенню до НСМ, вибирають з інгібіторів: гелікази, М52/3-протеази та внутрішнього сайту входу в рибосому (ІКЕ5).

23. Фармацевтична композиція за п. 19, 20 або 21, яка відрізняється тим, що інший агент, який є активним по відношенню до НСУ, являє собою інгібітор НСМ-полімерази. сч

0. й й й 0. о Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2007, М 1, 15.01.2007. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. ча ІФ) ча ча м. - с і» -І -І -І 1 що Ф) іме) 60 б5