UA75321C2 - Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-6/інтерлейкіну-6 (sil-6r/il-6), застосування даного злитого білка для одержання лікарського засобу для лікування раку, захворювань печінки, неврологічних захворювань, для стимуляції кровотворення, для поліпшення приживлюваності клітин кісткового мозку при його трансплантації та фармацевтична композиція, що його містить - Google Patents
Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-6/інтерлейкіну-6 (sil-6r/il-6), застосування даного злитого білка для одержання лікарського засобу для лікування раку, захворювань печінки, неврологічних захворювань, для стимуляції кровотворення, для поліпшення приживлюваності клітин кісткового мозку при його трансплантації та фармацевтична композиція, що його містить Download PDFInfo
- Publication number
- UA75321C2 UA75321C2 UA2000020719A UA2000020719A UA75321C2 UA 75321 C2 UA75321 C2 UA 75321C2 UA 2000020719 A UA2000020719 A UA 2000020719A UA 2000020719 A UA2000020719 A UA 2000020719A UA 75321 C2 UA75321 C2 UA 75321C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- chimeric protein
- cells
- protein
- specified
- 6cli
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 165
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 165
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 27
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 title claims description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 106
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 19
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 claims description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 12
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 10
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 claims description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 27
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 15
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical class [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 229950005499 carbon tetrachloride Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N mmai Chemical compound C1=C(C)C(OC)=CC2=C1CC(N)C2 JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002629 repopulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- AYNDKKQQUZPETC-NXVVXOECSA-N (z)-2,3-bis(2,4,5-trimethylthiophen-3-yl)but-2-enedinitrile Chemical compound CC1=C(C)SC(C)=C1\C(C#N)=C(\C#N)C1=C(C)SC(C)=C1C AYNDKKQQUZPETC-NXVVXOECSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- 101100262446 Arabidopsis thaliana UBA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100476202 Caenorhabditis elegans mog-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 244000102216 Crateva tapia Species 0.000 description 1
- 235000003495 Crateva tapia Nutrition 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 101150033052 MAS5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 101100310622 Mus musculus Soga1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100453651 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) URA6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100344462 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YDJ1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000289690 Xenarthra Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 150000001243 acetic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000005016 dendritic process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- -1 etc. Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002913 oxalic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical class [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Винахід належить до химерних білків, що одержують шляхом злиття природної форми розчинного рецептора IL-6 і IL-6, де обидві форми глікозильовані в такий спосіб, як і природні форми даних білків. Зазначені химерні білки можуть бути також злиті через молекулу пептидного лінкера. Винахід також належить до застосування даних білків для одержання лікарського засобу для лікування різних видів раку, хвороб печінки, неврологічних порушень, поліпшення приживлюваності клітин при трансплантації кісткового мозку та фармацевтичної композиції, що їх містить.
Description
Опис винаходу
Даний винахід належить до царини біологічної активності інтерлейкіну-б (1/-6), яка залежить від 2 агоністичної дії розчинного рецептора ІІ -6 (5іЇ -6К). Зокрема, даний винахід стосується нових химерних білків 8ІЇ/ -6КЛІ-6, сконструйованих шляхом злиття природних форм 51! -6К та ІІ -6, і їх біологічно активних аналогів, які дозволяють ефективно лікувати рак шляхом пригнічення росту ракових клітин, покращують приживлюваність трансплантата кісткового мозку, є корисними для лікування хвороб печінки та інших порушень, зумовлених ІІ -6.
Засновки винаходу і прототип 70 Інтерлейкін-б6 (1-6) є добре відомим цитокіном, біологічна активність якого опосередкована системою мембранних рецепторів, що включає два різні білки, один з яких визначається як рецептор 1-6 (1І/-6К або ор8вО), а інший - як др130 |огляд Нігапо еї аїЇ., 1994). Розчинні форми 1/-6К (з1/-6К), які відповідають позаклітинному домену древо, є природними продуктами організму людини, виявленими у вигляді глікопро-теїнів в крові та сечі (МоміскК еї аї., 1990, 19921). Відмітна особливість молекул 5іЇ-6ЄК полягає в тому, що вони є сильнодіючими агоністами 1-6 в багатьох типах клітин, включаючи клітини людини І(Тада еї аї., 1989; Моміск еї аІ., 1992). Це пов'язане з тим, що, навіть без інтрацитоплазматичного домену арво, в5іЇ-6К здатний стимулювати димеризацію ор130 під дією ІЇ/-б, який в свою Чергу опосередковує подальшу ІІ-б-специфічну трансдукцію сигналу і біологічні дії МигаКаті еї аї., 1993). Комплекс активних рецепторів І/-б6 фактично являє собою шестичленну структуру, утворену двома ланцюгами одр130, двома ІІ -6К і двома лігандами 1-6 (Мага еї аї., 1994;
Раопезза єї а!І., 19951, в якій 8іЇ-6К характеризується двома типами взаємодії з др130, обидва з яких мають важливе значення ІІ -б-специфічної біологічної активності ІНаїїті еї а!., 1995).
Обробка 5іІЇ-6К приводить до підсилення біологічної активності ІЇ/-б в багатьох типах клітин. Прикладом є пухлинні клітини, ріст яких пригнічується ІЇ/-6 значно більшою мірою при доданні 8іЇ-6К; такими клітинами, зокрема, є мієлолейкозні клітини М1 мишей (Тада еї аї., 1989), клітини Т47О0 карциноми молочної залози людини с
ІМоміск еї аїЇ., 1992) або недрібні клітини карциноми легені людини |Сапараїйі еї аї., 1996). І1/-6 справляє Ге) антиметастатичну дію іп мімо (Каї? еї а!., 1995), 8ІЇ/-6К також може посилювати іп мімо протипухлинну дію І1/-6
ІМасКіем'іс: еї аіЇ.,, 1995). Іншою дією ІЇ-6б, що посилюється доданням 5іІЇ/-6К, є стимуляція кровотворних стовбурових клітин з метою продукування змішаних колоній |Зиії еї аїІ., 1995). Крім того, автори даного винаходу встановили, що життєздатність первинних культур олігодендроцитів мозку підтримується лише -- комбінацією віЇ-6К та 1-6 (ОП, 1997), у той час як ІЇ/-6 окремо виявляє слабку активність в таких культурах с
І(Капп апа Ое Меїйїв, 1994). Це відкриття показує, що ІЇ/-б в поєднанні з 5І/-6ЄК може імітувати активність інших нейротропічних цитокінів, таких як війковий нейротропічний фактор (СМТЕ) або фактор пригнічення о лейкозу (ПІР), що також діє через др130, як це має місце для ІІ -11 і онкостатину М |Нігаго еї а/., 19941. ою
Було зроблено спробу одержати молекулу, яка могла б поєднувати вищезазначені функції ІІ -6 та 5іІІ/-6К, в 3о результаті якої було проголошено про продукування в рекомбінантних дріжджових клітинах злитого білка з в усіченого сегменту послідовності ІЇ/-6К людини та 1-6, зв'язаних лінкером з високим вмістом гліцину (Різспег еї а!.,, 1997). Цей злитий білок включає, по суті, лише М-домен рецептора цитокіну І/-6К і С-домен рецептора цитокіну; таким чином в ньому практично повністю відсутній імуноглобуліноподібний (19) домен І/-6К та « передмембранна область рецептора (область між С-доменом і трансмембранним доменом). В такому вигляді З зазначений білок являє собою усічену форму вІЇ/-6К, причому усічений 5І/-6ЄК в злитому білку зв'язаний с вищезазначеним лінкером з високим вмістом гліцину практично зі всією зрілою формою ІІ -6. Окрім відсутності
Із» деяких частин природного в8іЇ-6К, цей злитий білок, оскільки він одержаний в дріжджових клітинах, не має структури глікозилування, яка повинна була б бути у такого злитого білка, якщо б його було одержано в клітинах ссавця, наприклад в клітинах людини. Фактично цей продукований в дріжджах злитий білок має молекулярну масу, яка дорівнює приблизно 57кДа, на відміну від злитого продукту, що містить практично всі і амінокислотні залишки природного 5і/-6К та ІЇ/-б і повністю глікозилованого в клітинах ссавців (наприклад, 4! людини), що повинен мати передбачувану молекулярну масу близько 85кДа (див. наведений нижче приклад 2).
Узвичаєна практика конструювання рекомбінантних білків, які можна використовувати для лікування людей, о показує, що такі білки повинні якомога ближче відповідати природним формам білків, виявленим в організмі ка 20 людини, для запобігання стимуляції антитіл та іншим побічним ефектам, характерним для штучних рекомбінантних продуктів. З цієї причини для одержання глікозилованих білків бажано використовувати та рекомбінантні системи клітин ссавців, такі як інтерферон- Д або колонієстимулюючий фактор гранулоцитів
ІСПегпа|оузКу еї аї., 1984, НоПомжау, 1994), в хімічній формі, яка найбільшою мірою подібна до природного продукту людини. Бактерії або мікроорганізми, наприклад такі, як дріжджі, які не глікозилуються належним 99 чином, викликають також невірну укладку ланцюгів білка, що веде до виникнення імуногенних реакцій. Це
ГФ) особливо важливо для 1-6, який істотно модифікований посттрансляційно М- та О-глікозилуванням, а також т фосфорилуванням (огляд Кемеї, 19891, і для природного віЇ-6К з крові і сечі людини, що є глікопротеїном, в якому М- та С-кінцеві амінокислоти є постійними і їх значення встановлені |МоміскК еї а!., 1990 і патент США
Мо5216128, що належить обом авторам, та відповідний європейський патент МоЕР 413908 В11. 60 З викладеного вище випливає, що зазначений продукт злиття частини вії -6К і ІЇ-6 повинен мати цілий ряд недоліків, зокрема, з точки зору застосування для лікування людини, через відсутність у нього частини в1/-6К та продукування в дріжджах, що може стати причиною невірного глікозилування білка.
Досі не було описано злиту молекулу, що містить природний зі -6К, виявлений в рідинах організму людини, і природний ІІ! -6 і яку одержано в клітинах людини або інших ссавців. бо Тому метою даного винаходу є одержання такої злитої молекули, що містить природні 5ІЇ/-6К і 1/-6 (в будь-якому порядку), яку продуковано в клітинах ссавців.
Ще однією метою даного винаходу є застосування такого злитого білка (химера в1іІ-6КЛІ -6) для пригнічення росту сильно метастатичних меланомних клітин в дуже низьких концентраціях, оскільки ці клітини є стійкими до
Впливу І/-6 або 5іІІ-6К окремо.
Ще однією метою цього винаходу є застосування такого злитого білка (химера ві! -6КЛІ -6) для покращення приживлюваності іп мімо кровотворних стовбурних клітин при трансплантації кісткового мозку.
Ще однією метою даного винаходу є застосування такого злитого білка для лікування інших порушень, зумовлених ІІ -6, наприклад хвороб печінки чи неврологічних порушень. 70 Ще однією метою даного винаходу є фармацевтичні композиції, що містять вищезазначений злитий білок природних віЇ-6К-ІЇ/-б (химера в1І/-6КЛІ-б), для лікування раку, для застосування при трансплантації кісткового мозку і для лікування інших порушень, зумовлених ІІ -6, наприклад хвороб печінки та неврологічних порушень.
Інші цілі й об'єкти даного винаходу будуть розглянуті нижче або стануть очевидними з подальшого опису /5 цього винаходу.
Згідно з цим винаходом одержано кілька злитих білків (химер), що містять практично всі природні в81І-6К з рідин організму людини і практично всі зрілі форми природного ІІ-6 людини, які з'єднані короткими лінкерними пептидами завдовжки близько З амінокислотні залишки або більше, наприклад 13 амінокислотних залишків (див. нижче і приклади 1 та 2). Однак необхідно зазначити, що в цих злитих білках лінкерні пептиди можуть бути відсутні і частина 5І/-6К може бути приєднана безпосередньо до частини 1-6. Оскільки лінкери, які являють собою штучні амінокислотні послідовності, можуть бути імуногенними епітопами, що викликають утворення антитіл у суб'єктів, які потребують, бажано мати безпосередньо злиту химеру зіЇ-6КЛІ-6, яка має необхідну біологічну активність і в той же час максимально зменшує ймовірність індукування таких потенційно шкідливих антитіл при введенні такої химери. сч
Збереження всієї послідовності 5ІЇ-6К, включаючи Ід-подібний домен, виявлений в природній молекулі, а також необхідне глікозилування та інші посттрансляційні модифікації, що вносяться клітинами людини або і) ссавця при продукуванні вищезазначеної химери в таких клітинах, також має важливе значення для зменшення потенційної імуногенності химерного білкового продукту.
Однак, можна використовувати дуже короткий лінкер завдовжки близько три амінокислоти в точці з'єднання с п зо частин віІ-6К та 1-6 химерного білка. Такий короткий лінкер не повинен бути імуногенним епітопом. Крім того, можна використовувати більш довгі лінкери завдовжки приблизно до 30 амінокислот з метою поділу двох частин, с але в цьому випадку необхідно дотримуватися обережності і здійснити експериментальні дослідження со біологічної ефективності та безпеки одержаного продукту для гарантування того, що химерні молекули з такими лінкерами не є імуногенними. о
Насправді, при здійсненні даного винаходу було встановлено, що більш довгі лінкери не мають великого ї- значення для активності химерного білка; це свідчить про той, що для правильної укладки химери не вимагається більш довгого лінкеру, особливо тоді, коли практично всі природні послідовності частин 51! -6К і
І--6 входять до химерної молекули (див. приклад З і Фіг.5, що стосуються також порівняння химери віЇ-6КЛІ -6 з дуже коротким (З амінокислоти) лінкером і аналогічної химери з більш довгим лінкером з 30 амінокислот). «
Ці злиті білки або химери зіЇ/-6КЛІ-б6 ефективно продуковані згідно з цим винаходом в експресуючих -птв) с системах клітин ссавців, що дозволило одержати глікозиловані продукти, які справляють сильну дію на пухлинні . клітини, що звичайно не реагують окремо на 1/-6б або зв51/-6К, і які покращують приживлюваність и?» трансплантованих клітин кісткового мозку людини (див. нижче і приклади 1-4). В таких трансплантатах кісткового мозку химери взіЇ-6КЛІ-6 мають важливе значення для виживання і проліферації трансплантованих некомітованих поліпотентних кровотворних стовбурних клітин. Крім того, з наведених нижче результатів -І експериментів та інших аналізів випливає, що можна одержати різні аналоги химерного білка віІ-6КЛІ-6 відповідно до цього винаходу, які мають практично таку саму біологічну активність, що і химера зві! -6КЛІ -6, 1 причому зазначені аналоги є химерами віЇ-6КЛІ-6, в яких один чи кілька амінокислотних залишків, вилучені, 2) додані або замінені іншими, і єдиним обмеженням таких аналогів є те, що вони повинні зберігати більшу частину природної послідовності 5ІЇ/-6К і І/-6. Наприклад, амінокислотні додання в природні послідовності віІ-6К і де І--6 обмежені приблизно 20 амінокислотами, і ці додання бажано здійснити на ділянці з'єднання між 51І/-6К та шк І/-6, тобто в молекулі лінкера. В аналогічний спосіб, з послідовностей віЇ-6К і І/-6 можна вилучити не більше 20-30 амінокислот. Заміни амінокислотних залишків в послідовностях в5і/-6К і ІЇ/-6 іншими амінокислотними залишками більш прийнятно також обмежуються приблизно 20-30 амінокислотами. Всі вищезазначені делеції, в додання й заміни є прийнятними згідно з цим винаходом тільки тоді, коли при експресії в клітинах ссавців модифіковані таким чином аналоги зберігають біологічну активність химери в1іЇ/-6КЛІ-б, що складається в
Ф) основному з природних послідовностей, і таку ж структуру глікозилування цієї химери. ка Таким чином, даний винахід стосується химерного глікозилованого білка розчинного рецептора інтерлейкіну-б (51 -6К)-інтерлейкіну-6б(1І. -6)(5ІЇ. -6КЛІ-6) і його біологічно активних аналогів, що включають во злитий білковий продукт, одержаний шляхом злиття практично всієї природної форми зіЇ-6К і практично всієї природної форми 1-6, причому зазначений зіІ-6КЛІ -6 і його аналоги глікозиловані аналогічно глікозилуванню природних зві! -6К та ІІ -6.
Вищезазначений химерний білок відповідно до цього винаходу має такі варіанти: (І) Химерний білок віІ-6КЛІ-6б і його біологічно активні аналоги, в яких зазначений 5І/-6К злитий з 1-6 65 за допомогою молекули пептидного лінкера. (І) Химерний білок віІ/-6К/ЛІ-б і його біологічно активні аналоги за пунктом (І), в яких зазначений лінкер є дуже коротким неімуногенним лінкером завдовжки близько 3-4 амінокислотні залишки. (НП) Химерний білок віІЇ/-6К/ЛІ-б і його біологічно активні аналоги за пунктом (Ії), в яких зазначений лінкер є трипептидом послідовності Е-Р-М (СіІш-Рпе-Мею. (ІМ) Химерний білок в5І/-6КЛІ/-6б і його біологічно активні аналоги за пунктом (І), в яких зазначений лінкер є пептидом, який складається з 13 амінокислотних залишків послідовності Е-Е-(3-А-0-Ї -М-| -(5-5-9-Е-М (Сіш-РПпе-СіІу-АІа-С1у-І еи-Ма!І- ен-сіу-сіу-СІп-Рпе-Мею (5ЕО ІЮ Мо1). (М) Химерний білок 51І -6КЛІ -6, що визначається як вії -6К Ма -6, з трипептидним лінкером послідовності
БЕ-Е-М між С-кінцевим залишком Ма1І-356 віІ -6К і М-кінцневим залишком Рго-29 І-6, причому зазначений химерний 70 білок має послідовність, показану на Фіг.3. (МІ) Химерний білок зіІ -6КЛІ -6, що визначається як зії -6К5Май Лі -6, пептидний лінкер, який складається з 13 амінокислот послідовності Е-Е-0-А-0-Ї -М-| -(5-5-9-Е-М між С-кінцевим залишком Ма!-356 в1ІІ -6К і М-кінцневим залишком Рго-29 ІЇ-6К, причому зазначений химерний білок має послідовність, показану на Фіг.3, де трипептид послідовності Е-Е-М в положеннях 357-359 на Фіг.З замінений зазначеною пептидною послідовністю, яка /5 бкладається з 13 амінокислот. (МІЇ) Химерний білок звіЇ/-6К/ЛІ/-б6, де зазначений білок продукований в клітинах ссавців у повністю процесованій формі . (МІ) Химерний білок віІ -6КЛІ -6, де зазначений білок продукований у клітинах людини. (ІХ) Химерний білок віІ -6КЛІ -6, де зазначений білок продукований у клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО). (Х) Химерний білок віІІ/-6КЛІ-6 і його біологічно активні аналоги, де зазначений химерний білок і аналоги здатні пригнічувати ріст високозлоякісних ракових клітин. (ХІ) Химерний білок віІІ/-6КЛІ-6 і його біологічно активні аналоги, де зазначений химерний білок і аналоги здатні пригнічувати ріст злоякісних меланомних клітин. сч (ХІЇ) Химерний білок в1І/-6К/ЛІ-б і його біологічно активні аналоги, де зазначений химерний білок і о аналоги здатні стимулювати іп мімо приживлюваність кровотворних клітин людини при трансплантації кісткового мозку. (Хі) Химерний білок вІ/-6К/ЛІ-6б і його біологічно активні аналоги, де зазначений химерний білок і аналоги здатні захистити печінку від гепатотоксичних речовин. «- зо Даний винахід стосується також послідовності ДНК, що кодує химерний білок віЇ-6КЛІ-6 і його біологічно активні аналоги відповідно до цього винаходу. с
Крім того, даний винахід стосується вектора ДНК, що включає послідовність ДНК, яка кодує химерний білок с 8І/-6КЛІ-6 і його біологічно активні аналоги відповідно до цього винаходу, причому зазначений вектор придатний для експресії зазначеного химерного білка в клітинах ссавців. о
Вектор ДНК відповідно до цього винаходу включає такі варіанти: ї- (І) Вектор ДНК, придатний для експресії зазначеного химерного білка в клітинах людини. (І) Вектор ДНК, де зазначений вектор експресований в клітинах ссавців або людини, експресований химерний білок має послідовність, що дозволяє повністю процесувати химерний білок клітиною ссавця або людини і секретувати повністю процесований химерний білок з клітин в культуральне середовище, де «
Вирощуються зазначені клітини. з с (ІП) Вищезазначений вектор ДНК, де зазначений вектор визначається як плазміда рсОМАЗзіЇ! -6КЛІ -6, яка включає вектор рсОМАЗ, що містить послідовність ДНК, яка кодує химерний білок зіІ-6КЛІ-6 під контролем ;» промотору цитомегаловірусу (СММ). (ІМ) Вищезазначений вектор ДНК, де зазначений вектор визначається як плазміда рсОМА вії -6КЛ ЛІ -6, яка
Включає вектор рсоОМАЗ, що містить послідовність ДНК, яка кодує химерний білок віІ-6КЛІ-6 під контролем -І промотору цитомегаловірусу (СММ), і в якому в зазначену послідовність ДНК, що кодує зазначений химерний білок зії -6ЄКЛІ -6 вставлено лінкерну послідовність, що кодує лінкерний пептид в сайті ЕсоКіІ, розташованому 1 між послідовністю, яка кодує частину вії -6К, і послідовністю, яка кодує частину ІІ -6 білка. 2) Аналогічним чином даний винахід стосується також трансформованих клітин ссавців, які містять вищезазначений вектор ДНК, що здатний експресувати послідовність химерного білка в51І/-6КЛІ-6б, що о переноситься зазначеним вектором, повністю процесувати експресований білок і секретувати його в
Кк культуральне середовище, де вирощуються зазначені клітини.
Одним варіантом цих трансформованих клітин є описані тут клітини нирки ембріона людини 293 (НЕК293), трансфековані вектором рсОМА зіЇ-6КЛІ -6, зазначені клітини здатні експресувати химерний білок віІ-6КЛІ -6, ов повністю процесувати і секретувати зазначений білок в культуральне середовище, де вирощуються зазначені клітини, у формі глікопротеїну з молекулярною масою близько 85кДа.
Ф) Іншим варіантом трансформованих клітин є описані тут клітини СНО (яєчника китайського хом'яка), ка трансфековані вектором рсОМА зіЇ-6КЛІ -6, зазначені клітини здатні експресувати химерний білок віІ-6КЛІ -6, повністю процесувати і секретувати зазначений білок в культуральне середовище, де вирощуються зазначені бо Клітини, у формі глікопротеїну з молекулярною масою близько 85кДа.
Даний винахід стосується також способу одержання химерного білка або його біологічно активних аналогів, який включає вирощування вищезазначених трансформованих клітин в умовах, прийнятних для експресії, процесування і секреції зазначеного білка або його аналогів в культуральне середовище, де вирощуються зазначені клітини; і очистку зазначеного білка або його аналогів від культурального середовища імуноафінною 65 хроматографією з використанням моноклональних антитіл, специфічних відносно до ві! -6К.
Химерний білок відповідно до цього винаходу має ряд застосувань, які включають:
(І) застосування химерного білка взі/-6К/ЛІ/-б6 або його аналогів, солей і сумішей в якості інгібіторів ракових клітин. (І) застосування аналогічно пункту (І) в якості інгібітору високо злоякісних меланомних клітин. (НП) застосування химерного білка 5іЇ/-6КЛІ-б або його аналогів, солей і сумішей в якості активного інгредієнта для покращення приживлюваності кровотворних клітин людини при трансплантації кісткового мозку. (ІМ) застосування химерного білка віЇ-6К/ЛІ-б або його аналогів, солей і сумішей в якості активного інгредієнта для підсилення гемопоезу, лікування хвороб печінки і неврологічних порушень та для інших цілей, пов'язаних з використанням ІІ -6 або вії! -6К. 70 Химерний білок відповідно до цього винаходу можна аналогічним чином застосовувати для одержання лікарських засобів для ряду медичних показань, зокрема химерний білок віЇ-6КЛІ-6б або його аналоги, солі і суміші можна застосовувати для одержання лікарських засобів, призначених для лікування різних видів раку шляхом пригнічення росту ракових клітин, або для одержання лікарського засобу для стимуляції приживлюваності кровотворних клітин при трансплантації кісткового мозку, або для одержання лікарського /5 засобу для підсилення гемопоезу, або для одержання лікарського засобу для лікування неврологічних порушень, або для одержання лікарського засобу для інших цілей, пов'язаних із застосуванням І! -6 або вії -6К.
Крім того, даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить в якості активного інгредієнта химерний білок ві! -6КЛІ -6 або його аналог і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач.
Фармацевтична композиція відповідно до цього винаходу включає такі варіанти: (І) Фармацевтична композиція для лікування різних видів раку ссавців. (ІЇ) Фармацевтична композиція для покращення приживлюваності клітин при трансплантації кісткового мозку. (ІП) Фармацевтична композиція для лікування хвороб печінки і неврологічних порушень або для підсилення гемопоезу, або для інших цілей, пов'язаних з використанням І! -6 або ві! -6К.
Даний винахід стосується також способу лікування різних видів раку у ссавців, або для покращення сч ов приживлюваності клітин при трансплантації кісткового мозку, або для лікування хвороб печінки і неврологічних порушень, або для підсилення гемопоезу, чи для інших цілей, пов'язаних застосуванням ІІ -6 або віІ/-6К, який (8) полягає в тому, що пацієнту вводять вищезазначену фармацевтичну композицію у вигляді прийнятної лікарської форми і згідно з прийнятним способом введення.
Для запобігання неясності слід зазначити, що даний винахід стосується химери між 1/-6 і в1ІІ/-6К, «- зо розташованим в будь-якому порядку, тобто М-кінцеву і С-кінцеву частини можна поміняти місцями, і тоді химера являтиме собою білок ІІ -6-5ІЇ -6К, хоча в цьому описі винаходу він визначається як білок ві! -6КЛІ -6. с
Інші цілі та варіанти здійснення даного винаходу розглянуті нижче або є очевидними з поданого нижче с докладного опису цього винаходу.
Стислий опис креслень о
На Фіг1 (А, В) подане схематичне зображення різних векторів, реагентів і стадій процесу, які ї- використовуються для конструювання химерної молекули ДНК, що кодує химерний білок, в якому збережена структура природної форми 5ІЇ/-6К, що закінчується у залишку Ма! 356, і послідовності природної, зрілої, процесованої форми І! -6, яка слідує за нею, як це докладно описано в прикладі 1.
На Фіг.2 (А, В) показані результати аналізу з ідентифікації химери віЇ-6бКУМаІЛІ-6 раб електрофорезом в « поліакрила-мідному гелі (А) і на основі профілю біологічної активності (В), при цьому на Фіг2А подане Ще с зображення гелю, забарвленого кумасі, на якому електрофорезом виявлені фракції, очищені імуносорбційним й методом та елюйовані з колонок для афінної хроматографії, заповнених зразком секретованого білка, «» одержаного з культур клітин, трансфекованих вектором, що кодує химерний білок; і на Фіг2В наведено репрезентативний графік біологічної активності (пригнічення росту меланомних клітин 10.9) всіх вищезазначених фракцій, елюйованих з колонок для афінної хроматографії, як це докладно описано в прикладах -І 213.
На Фіг.З показано амінокислотну послідовність (однобуквений код) химери віІ-6бК5Маї/І-6, в якій вказані іні різні домени молекули, у тому числі М-кінцевий сигнальний пептид (лінія поверх послідовності), г) імуноглобуліноподібний (Ід-подібний) домен, М-домен рецептора цитокіну (підкреслений), С-домен цитокіну (лінія поверх послідовності) і передмембранна область рецептора (область між С-доменом і трансмембранним де доменом), вся частина ві! -6К химери; а також зріла частина химери ІІ -6 (підкреслена знизу), як це описано в - прикладах 1 і 2.
На Фіг.4 (А, В) показані фотографії меланомних клітин Е10.9 в культурі, необроблені (А) і оброблені (В) химерним білком вії -6КЛІ-6 протягом 4 днів, при цьому на Фіг.48 видні морфологічні зміни, викликані химерою
ВІ -6КЛІ--6 в метастатичних меланомних клітинах (клітини Е10.9), як це описано в прикладі 3.
На Фіг.5 подане графічне зображення результатів, які показують пригнічення росту меланомних клітин Е10.9 іФ) химерним білком зі -6КЛІ-6, що використовується в різних концентраціях від близько 0,12нг/мл до близько ко 15Онг/мл, де химера І/-6КЛІ-6б, яка має лінкер завдовжки близько З амінокислоти, описана в прикладі 3, порівнюється з химерою, яка має лінкер завдовжки 13 амінокислот (ІІ -6КЛІ -6). во На Фіг.б6 подане графічне зображення результатів, які показують відсутність пригнічуючої ріст дії на меланомні клітини Е10.9 окремо виділеного 1-6 (верхня пунктирна крива з не заштрихованими квадратами) в концентраціях О-4Онг/мл 1-6 і окремо виділеного віЇ-6К (точка сходження всіх кривих на вертикальній осі, де концентрація ІЇ-б дорівнює нулю); а також дію, що спостерігається, пригнічення росту при спільному доданні
І/-6 їі 8І1/-6К в різних концентраціях, де І/-6 має концентрацію від ТОнг/мл до 4Онг/мл та 5І/-6К доданий в 65 трьох концентраціях, які дорівнюють 10Онг/мл, 20Онг/мл і 40Онг/мл, на кожну концентрацію 1І--6, як це показане трьома нижніми кривими (дві пунктирні криві з не заштрихованими трикутниками і колами та суцільна крива з заштрихованими квадратами), аналогічно прикладу 3.
На Фіг.7 зображено авторадіограму саузерн-блотинга, що показує вимоги, які висуваються до химерного білка вії -6КЛІ -6 для покращення приживлюваності кровотворних стовбурових клітин людини при трансплантації кісткового мозку мишам ЗСІЮО-МОЮ (дві розташовані праворуч смуги, що стосуються мишей, які одержували химерний білок віЇ-6К/ЛІ/-6 додатково до інших необхідних факторів, ЗСЕ, РІ Т-3, порівнюються з трьома розташованими ліворуч смугами, що стосуються мишей, які одержували лише ЗСЕ і РІ Т-3 та ЗСЕ, РІ Т-3, а також окремо виділені, тобто незлиті ІІ -6 і вії -6К), як це описується в прикладі 4.
На Фіг.8 зображено графік Скетчарда, який показує характеристики спорідненості химери в51І-6КЛІ-6 7/0 порівняно сумішшю 1-6 і вІЇ-6К, де значення химери зображені заштрихованими квадратами і значення суміші показані заштрихованими ромбами, при цьому відношення нахилів кривої становить 41.
На Фіг.9 зображений графік більш високої активності химери 5І/-6К/ЛІ-6 відносно до меланомних клітин
Е10.9, порівняно з активністю суміші ві -6КНІ -6 або ві! -6К (без ІІ -6).
На Фіг.10 показані результати захисту, який забезпечується химерою звіЇ-6КЛІ-6 проти токсикозу печінки, /5 де цифрові величини представляють середнє значення 4 експериментів, заштриховані квадрати стосуються
І/-6--мишам, заштриховані ромби належать І1І/-6-/-мишам, які одержували 1/-6б, і заштриховані зірочки відповідають ІІ -6-/-мишам, які одержували химеру.
На Фіг.11 зображена амінокислотна послідовність (однобуквений код) химери Зе ІІ -6-8іІЇ -6К5Маї, в якій підкреслено лінкер.
На Фіг.12 зображений графік біологічної активності, що виявляється відносно до меланомних клітин, зображених на Фіг.9, химерою Зе (темні заштриховані зірочки), порівняно з химерою вії -6КЛІ -6 (заштриховані квадрати) і двома мутантами (Миїй 39 (НО) - заштриховані ромби) і (Ми МНО - світлі заштриховані зірочки), як це описується в прикладі 9.
Даний винахід стосується химерного білка 5І/-6К/ЛІ-6б і його біологічно активних аналогів, які містять с практично всі природні форми в1іЇ/-6К і практично всі природні форми ІІ-6б, злиті одна з одною, в яких сайт злиття може бути лінкерним пептидом завдовжки З амінокислоти, при цьому химерний білок віЇ-6КЛІ-6 і його о аналоги мають таку саму величину і структуру глікозилування, що і природні ві! -6К і 1-6. Встановлено, що химерний білок зіЇ-6КЛІ -6, одержаний згідно з цим винаходом в клітинах ссавців, зокрема в клітинах людини (див. наведені нижче приклади 1-4) або в клітинах СНО (див. наведений нижче приклад б), ефективно -(южее
Зо експресується в таких клітинах, добре глікозилується і справляє сильну дію на пухлинні клітини, які зовсім не реагують на застосовувані окремо ІІ -6 або ві! -6К. с
Зокрема, згідно з цим винаходом виявлено (див. наведені нижче приклади 1-3), що вищезазначений со химерний білок вії -6КЛІ--6 відповідно до цього винаходу пригнічує ріст надзвичайно злоякісних клітин ссавців, таких як меланомні клітини Е10.9, в більш низьких концентраціях порівняно з тими, які необхідні при о
Використанні суміші незлитих 51ІЇ-6К і 1-6. Це особливо важливо з урахуванням того, що меланомні клітини ї-
Е10.9 продовжують рости без зміни після їх обробки окремо 1-6 або ві! -6К, і їх ріст припиняється лише під впливом відносно високих доз суміші незлитих І/-6 і 8І/-6К. Химерний білок в51іІІ/-6КЛІ-6 відповідно до цього винаходу є значно більш сильнодіючим інгібітором високозлоякісних меланомних клітин, ніж суміш його окремих частин, тобто суміш незлитих І -6 і вії -6К. Таким чином, химерний білок відповідно до цього винаходу особливо «
Корисний в якості активного інгредієнта для лікування різних видів раку. шщ с Вважається, що більш висока активність химерного білка віЇ-6К/ЛІ-б пов'язана з його більш високою й спорідненістю до др130 порівняно з сумішшю незлитих ІІ -6 і ві! -6К (приклад 7). и? Крім того, встановлено, що (див. наведений нижче приклад 4) химерна молекула зі! -6КЛІ -6 відповідно до цього винаходу є особливо корисною для підсилення приживлюваності клітин при трансплантації кісткового
Мозку. Дійсно, при виконанні відомої методики трансплантації клітин кісткового мозку людини мишам з важким -і комбінованим імунодефіцитом (ЗСІЮ), у яких фактор стовбурових клітин (ЗСЕ) і РІЇЗ-ліганд використані для стимуляції виживання і проліферації самих простих поліпотентних кровотворних стовбурових клітин, здатних і-й протягом тривалого часу зберігати життєздатність в кістковому мозку реципієнта, встановлено, що ці два
Ге) фактори, ЗСЕ і РІЇЗ-ліганд, є недостатньо активними, щоб стимулювати приживлюваність клітин людини в 5о Кістковому мозку миші-реципіента, і що трансплантація виявляється успішною лише при додатковому де використанні химерного білка в5іІ/-6К/ЛІ-6. Це відкриття показує, що химерний білок можна ефективно - М використовувати при здійсненні такої трансплантації. Використання в тих самих експериментах незлитих І -6 і 8І/-6К при роздільному доданні не дозволяє успішно стимулювати трансплантацію кісткового мозку і при спільному доданні вони виявляються значно менш активними, ніж химерний білок віІ/-6КЛІ-6, тобто при ефективній концентрації, що дорівнює 10Онг/мл, химерний білок віІЇ-6КЛІ--6 ефективно стимулює трансплантацію кісткового мозку, у той час як два окремі незлиті 51 -6К та ІЇ/-6, що додаються разом навіть в більш високих іФ) концентраціях (5І/-6К в концентрації 125-125Онг/мл, ІЇ/-6 в концентрації 50-20Онг/мл), значно менш активно ко стимулюють таку трансплантацію.
Вищезазначений химерний білок віЇ -6КЛІ -6 відповідно до цього винаходу більш прийнятно є рекомбінантною бо глікозилованою химерою звіЇ/-6КЛІ-6б, продукованою в клітинах людини або в будь-якій прийнятній експресувальній системі клітин ссавців, такій як клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), що здатна глікозилувати білки аналогічно клітинам людини і вносити такі самі посттрансляційні модифікації, що і клітини людини. Важливою особливістю є те, що одержаний таким чином химерний глікопротеїн процесований і модифікований так само, як природні батьківські молекули 5іІ/-6К і І/-б6, виявлені в організмі людини, без б5 Зрізання і додання чужорідних, що не трапляються не в природі, поліпептидних послідовностей, за винятком дуже короткого трипептиду або більш довгого лінкерного пептиду, який вводиться між частинами в51І-6К і 1/-6 химерного білка.
Щоб одержати вищезазначений більш прийнятний химерний білок відповідно до цього винаходу, необхідно врахувати такі особливості природних вії -6К і ІІ -6. Відомо, що ІЇ-6К, наявний в клітинних мембранах людини, продукується КДНК, що кодує 468 амінокислот, які утворюють сигнальний пептид, імуноглобуліноподібний (Ід) домен, домен зв'язування цитокіну, трансмембранну область і цитоплазматичний домен (Матавзвакі еї аї., 19881.
Розчинна форма 5і/-6К виявлена в рідинах організму і подібно зрілому ІЇ/-6К, виділеному з мембран, має
М-кінець, що відповідає залишку І еш-20 |Моміск еї аіІ., 1990), ії С-кінець, що відповідає залишку Маї!-356, безпосередньо перед трансмембранною областю ІІ/-6К |див. спільний патент США Мо5216128 і європейський /о патент Мо413908 ВІ). Щоб злити послідовність 5ІЇ/-6К з І/-6, після МаІ-3456 вводять сайт рестрикції Есокі.
Послідовність зрілого ІЇ/-б, яка починається у залишку Рго-29 кДНК 1-6 і закінчується у залишку Меї-212
І(ЛІрег-вівїп еї аї., 1986; Нігапо еї аї., 1986), вводять слідом за сайтом ЕсоКІ. В сайт ЕсоКі! можна, хоча і необов'язково, ввести лінкерний пептид необхідної довжини, щоб відділити частини 51! -6К і 1-6 одна від одної в химерному білку. Як описано нижче, в якості можливих прикладів таких химерних білків одержані два різні химерні білки, в сайт ЕсоКІ одного з яких введений трипептидний лінкер, а в інший введений лінкер, який складається з 13 амінокислотних залишків, при цьому обидва химерні білки характеризуються практично однаковою біологічною активністю.
Даний винахід стосується також аналогів вищезазначеного химерного білка віЇ-6КЛІ-6 відповідно до цього винаходу, де аналоги мають практично таку саму біологічну активність химерного білка, оскільки містять лише природні послідовності віІ/ -6К і ІЇ/-6. Такі аналоги є білками, в яких може бути вилучено, додано або замінено до 30 амінокислотних залишків в частинах вії! -6К і/або ІІ -6 химерного білка з урахуванням того, що модифікації такого типу не повинні істотно змінювати біологічну активність аналогу химерного білка відносно до самого химерного білка, при цьому частина зіЇ-6К таких аналогів практично повністю зберігає природну структуру (до процесування - див. Фіг.3) сигнального пептиду, Ід-подібного домену, М-домену рецептора цитокіну, С-домену сч ов рецептора цитокіну і передмембранного домену рецептора. Аналогічно, такі аналоги химерного білка повинні практично повністю зберігати природну зрілу форму частини 1-6. Різні аналоги можуть істотно відрізнятися і) один від одного і від основної молекули химерного білка (що містить лише природні послідовності в81І-6К і
І/-6) в сайті лінкерного пептиду, який з'єднує частини 5іІ/-6К і І/-б6 в химерному білку. Такий лінкер може мати довжину до 30 амінокислот і служить для відділення частин в51/-6К і 1-6 одна від одної в химерному «- зо білку. Що стосується такого лінкера, треба дуже уважно вибирати його послідовність (і потім виконати біологічні випробування кожного такого аналогу прийнятними стандартними методами), щоб помилковий вибір с не став причиною невірної укладки ланцюгів в химерному білку, в результаті чого він може втратити активність, с або не призвів до одержання аналогу химерного білка, проти якого імуногенний білок почне виробляти антитіла в організмі пацієнта, внаслідок чого такий аналог виявиться неефективним, принаймні, в якості лікарського о засобу середнього або тривалого лікування. ча
Що стосується вищезазначених аналогів химерного білка відповідно до цього винаходу, цими аналогами є білки, в яких від одного до близько 30 амінокислотних залишків основного химерного білка відповідно до цього винаходу замінені іншими амінокислотними залишками або вилучені, або один чи кілька амінокислотних залишків додані до первісної послідовності химерного білка відповідно до цього винаходу (яка містить лише « природні послідовності в1І-6К і 11--6) без істотної зміни активності одержаних продуктів порівняно з основним з с химерним білком відповідно до цього винаходу. Ці аналоги одержують відомими методами синтезу і/або сайтспрямованого мутагенезу або будь-яким іншим відомим методом, придатним для цієї мети. з Будь-який такий аналог більш прийнятно має послідовність амінокислот, яка достатньо точно відповідає амінокислотній послідовності основної химери вії -6КЛІ--6, що надає йому практично таку саму активність. Таким чином, визначити у даного аналогу наявність такої ж активності, що і у основного химерного білка відповідно -І до цього винаходу, можна звичайним експериментуванням, згідно з яким аналог випробовують на активність згідно з наведеними нижче прикладами 2-4. о Аналоги химерного білка, які можна використовувати при здійсненні даного винаходу, або нуклеїнові 2) кислоти, що їх кодують, включають обмежену сукупність відповідних послідовностей в якості замінних пептидів або полінуклеотидів, які можуть бути одержані фахівцем у цій галузі без зайвого експериментування на основі де положень і вказівок, наведених в цьому описі винаходу. Для більш докладного ознайомлення з хімією і як структурою білків зверніться до наукових робіт Зспціл, (.Е. еї аї., Ргіпсіріев ої Ргоївіп ЗігисіШге,
Зргіпдег-Мегіад, Мем/ Могк, 1978; і Стеідпюп, Т.Е., Ргоївіпе: Зігисішге апа МоїІесціаг Ргорегієв, МУ.Н. Егеетап 85
Со., Зап Егапсізсо, 1983), що включені в цей опис винаходу в якості посилання. Заміни в нуклеотидній ов послідовності, такі як більш прийнятні кодони, описані в (наукових роботах А!йЄзиреї еї аї., зирга, 55 А... 1-А. 1.24 і ЗатргооК еї аЇ., Ситепі РгоїосоЇїв іп Моїесціаг Віоіоду, Іпіегесіепсе М.М, 55 6.3 і 6.4 (1987, (Ф) 1992))|, в додатках СІ 0. ка Більш прийнятні зміни, що вносяться в аналоги відповідно до цього винаходу, відомі як "консервативні" заміни. Консервативні заміни амінокислот в химерному білку, що складається в основному з природних во послідовностей в8І/-6К і 1-6, можуть включати тотожні амінокислоти, що входять до групи зі схожими фізико-хімічними властивостями, завдяки чому при заміні членів цієї групи зберігаються біологічні функції молекули |Огапіпат, Зсіепсе, Мої. 185, рр. 862-864 (1974)). Очевидно, що інсерції і делеції амінокислот можуть також здійснюватись в вищезазначених послідовностях без зміни їх функції, особливо якщо ці інсерції або делеції включають лише кілька амінокислот, наприклад менше тридцяти, більш прийнятно менше десяти, і 65 не призводять до вилучення або зміни положення амінокислот, що мають важливе значення для функціональної конформації, наприклад залишків цистеїну (Апіїпвеп, "Ргіпсіріевг Тйаї Сомегп Те Роїдіпд ої Ргоївіп. Спаїпв",
Зсіепсе, Мої. 181, рр. 223-230 (1973)). Аналоги, одержані в результаті таких делецій і/або инсерцій, входять до обсягу даного винаходу.
Більш прийнятні групи тотожних амінокислот подані в таблиці Її. Ще більш прийнятні групи тотожних амінокислот наведені в таблиці ІІ ії найбільш прийнятні групи тотожних амінокислот подані в таблиці ПІ.
Таблиця І
Більш прийнятні групи тотожних амінокислот
Амінокислота Тотожна група зег Зег, Тиг, СІу, Авп
Ага Ага, Сіп, Гув, СІМ, Нів ей Іе, Рпе, Туг, Меї, Ма), Геи
Рго СУ, Ага, Тпг, Рго
ТАг Рго, Зег, АІа, Су, Ні, Сіп, ТАг
Ада Су, Тнг, Рго, Аїа маї Меї, Туг, Ре, Пе, Гени, Ма! су Аа, Тиг, Рго, Зег, СІу
Пе Меї, Туг, Рпе, Маї, Ген, Не
Рпе Тгр, Меї, Туг, Пе, Маї, Гени, Рпе
Туг Тгр, Меї, Рне, Пе, Маї, Геи, Туг
Сув Зег, ТНг, Сув
Нів січ, Гув, Сіп, ТАг, Ага, Нів се
Сіп сін, Гув, Авп, Нів, Тиг, Агу, Сіп о
Авп Сіп, Ар, Зег, Авп
Гуз СІМ, Сіп, Ніз, Аго, Гув
Авр СІМ, Авп, Ар сІШ Авр, Гув, Авп, Сіп, Нів, Агу, СІШ ьо
Меї Рне, Те, Маї, Гей, Меї сч
Тр Тр со
Таблиця І! о в.
Ще більш прийнятні групи тотожних амінокислот
Амінокислота Тотожна група « зег зег
Ага Нів, Гуз, Ага - с Ї еи І ем, Пе, Рпе, Меї т Рго Аїйа, Ро ,» ТАг ТАг
Ада Рго, Аіа
Уа! Ммаї, Мей, Пе - су су «сл Пе Пе, Меї, РНе, маї, Гей
Рпе Меї, Туг, Пе, Ген, Рне і Туг Рпе, Туг ка 20 Сув Сув, Зег
Ні Нів, Сіп, Ага ть сп сім, Сіп, Нів
Авп Авр, Ап
Гуз Гуз, Ага 29 Авр Авр, Ап
ГФ) Ге сін, Сіп з Меї Меї, Рне, Пе, мМаї, Гей
Тр Тр 60
Таблиця ПЇ
Найбільш прийнятні групи тотожних амінокислот бо Амінокислота Тотожна група зег зег
Ага Ага ей Ї ем, Пе, Меї
Рго Рго
Тиг Тиг
Аа Аа мУаї мУаї су су
Пе Пе, Меї, Геи
Рпе Рпе
Туг Туг
Сув Сув, Зег
Ні Ні сп сп
Авп Авп
Гуз Гуз
Авр Авр
СІМ СІМ
Меї Мей, Пе, І еи
Ттр Меї
Приклади виконання замін амінокислот в білках, які можна використовувати для одержання аналогів химерного білка відповідно до цього винаходу, включають будь-які відомі методи, зокрема описані в (патентах см
США МоМоКЕ 33653, 4959314, 4588585 і 4737462, виданих Марку та ін.; Мо5116943, виданому Котсу та ін., (5)
Мо4965195, виданому Намену та ін., Мо4879111, виданому Чонгу та ін., і Мо5017691, виданому Лі та ін.; і білки з заміненим лізином, описані в патенті США Мо4904584 (Зпам еї а/.)|.
Згідно з іншим більш прийнятним варіантом здійснення даного винаходу будь-який аналог химерного білка відповідно до цього винаходу має амінокислотну послідовність, яка практично відповідає амінокислотній ч- послідовності вищезазначеного основного химерного білка. Термін "практично відповідає" означає аналоги з незначними змінами послідовності основного химерного білка, що не впливають на його основні характеристики, см зокрема на його здатність пригнічувати проліферацію ракових клітин або стимулювати приживлюваність клітин с при трансплантації кісткового мозку. Зміни, які звичайно входять у визначення "практично відповідає", одержують в результаті виконання звичайних методів мутагенезу ДНК, що кодує химерний білок відповідно до ю цього винаходу, які дозволяють одержати кілька незначних модифікацій, і тестування одержаних аналогів з - метою виявлення необхідної активності, як це описувалося вище.
Аналоги відповідно до цього винаходу включають білки, закодовані нуклеїновою кислотою, такою як ДНК або
РНК, що гібридизує з ДНК або РНК в суворих умовах і кодує химерний білок відповідно до цього винаходу, який « складається практично повністю з природних послідовностей, які кодують 5І/-6К і І/-6. Наприклад, така гібридизуюча ДНК або РНК може кодувати той самий білок відповідно до цього винаходу, що має, наприклад, - с послідовність, показану на Фіг.З, але відрізняється своєю нуклеотидною послідовністю від природної и нуклеотидної послідовності внаслідок виродженості генетичного коду, тобто дещо відмінна послідовність ,» нуклеїнових кислот може як і раніше кодувати ту ж амінокислотну послідовність з урахуванням зазначеної виродженості. Крім того, як вказувалося вище, число змін амінокислот (делеції, додання, заміни) обмежена, приблизно, 30 амінокислотами, тому навіть при максимальному числі, замін аналоги відповідно до цього -і винаходу все ж зберігають лідерну послідовність (до процесування), Ід-подібний домен, М- і С-кінцеві домени сл рецептора цитокіну і передмембранну область рецептора (область між С-кінцевим доменом і трансмембранним доменом) в частині ві -6К і практично всю частину 1-6. Така нуклеїнова кислота буде кандидатом номер один (95) для визначення, чи кодує вона поліпептид, який зберігає функціональну активність химерного білка відповідно 7 50 до цього винаходу. Термін "суворі умови" означає умови гібридизації і подальшого промивання, які фахівці в цій галузі звичайно визначають як "суворі". Див. (А!изибреї еї аїЇ., Сипепі РгоїокКоЇз іп Моїіесшіаг Віоіоду, -. й зирга, Іпіегесіепсе, М.М., рага. 6.3 агій 6.4 (1987, 1992) і ЗатбргооК еї аї., зиргаї Приклади суворих умов без будь-яких обмежень включають умови промивання при температурі на 12-20 «С нижчій від розрахованої температури досліджуваного гібриду, наприклад 2 х 55С і 0,595 ЗОЗ протягом 5 хвилин, 2 х 55С і 0,195 505 протягом 15 хвилин; 0,1 х 555 і 0,595 505 при 372 протягом 30-60 хвилин і потім 0,1 х 55С і 0,595 505 при 6820
ГФ! протягом 30-60 хвилин. Фахівцям у цій галузі повинно бути зрозуміло, що суворість умов залежить також від довжини послідовностей ДНК, олігонуклеотиних зондів (10-40 основ) або змішаних олігонуклеотидних зондів. У о випадку змішаних зондів бажано використовувати хлорид тетраметиламонію (ТМАС) замість розчину хлориду і цитрату натрію (55:Х). Див. (А!,зивеїЇ, вище. бо Термін "солі" означає як солі карбоксильних груп, так і солі з приєднанням кислоти по аміногрупі химерного білка відповідно до цього винаходу або його аналогів. Солі карбоксильної групи можуть бути одержані відомими методами і включають неорганічні солі, наприклад солі натрію, кальцію, амонію, заліза або цинку тощо, і солі з органічними основами, одержані, наприклад, при взаємодії з амінами, такими як триетаноламін, аргінін або лізин, піперидин, прокаїн тощо. б5 Солі з приєднанням кислоти включають, наприклад, солі з мінеральними кислотами, такими як хлористоводнева або сірчана кислоти, і солі з органічними кислотами, такими як оцтова або щавлева кислоти.
Всі ці солі повинні, звичайно, мати таку саму активність, що і химерний білок відповідно до цього винаходу або його аналоги.
Даний винахід стосується також послідовностей ДНК, які кодують вищезазначений химерний білок відповідно до цього винаходу і його аналоги, а також векторів ДНК, що несуть такі послідовності ДНК для експресії в клітинах підхожих ссавців, більш прийнятно людини. Одним з варіантів вектора відповідно до цього винаходу є плазміда рсОМА 51 -6К/ЛІ-6, яка включає вектор рсОМАЗ (Іпмйгодеп), що містить злиті послідовності 8 -6КЛІ--6, одержані під контролем промотору цитомегаловірусу (СММ).
Даний винахід стосується також трансформованих клітин ссавців, більш прийнятно людини, клітин, здатних 7/0 експресувати вищезазначені білки відповідно до цього винаходу. Одним з варіантів таких трансформованих клітин є клітини нирки ембріона людини 293 (НЕК 293, АТСС СКІ 1573), трансфековані рсОМА вії -6КЛІ-6, що секретують злиту химеру вії -6КЛІ -6 у вигляді глікопротеїну з молекулярною масою 85кДа.
Ще один варіант здійснення винаходу включає плазміду рсОМА віІ/-6К/ЛЛІ-6, яка відрізняється від вищезазначеної рсОМА ві -6К/ЛІ-6 вставкою в сайт ЕсоМК! коротких лінкерів, що кодують 10 додаткових амінокислот. Можна ввести цілий ряд послідовностей різної довжини, щоб оптимізувати відстань між в1І-6К і
І/-6.
До винаходу входить також химерний білок, в якому частина ІІ -6 передує віЇ -6К (як це показане на Фіг.11).
Даний винахід далі стосується способу одержання і очистки химерного білка відповідно до цього винаходу або його аналогів, який включає вирощування вищезазначених трансформованих клітин в умовах, прийнятних 2о для експресії та секреції химерного білкового продукту в культуральне середовище і подальшу очистку секретованого білка імуноафінною хроматографією з використанням моноклональних антитіл 34.4 проти віІ-6К, як це описане в наведених нижче прикладах 2 і 5.
Винахід стосується також фармацевтичної композиції, що містить в якості активного інгредієнта химеру 8ІЇ/ -6КЛІ -6, її аналоги, суміші або солі і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Одним сч ов З варіантів фармацевтичної композиції відповідно до цього винаходу є фармацевтична композиція для підсилення дії ІЇ/-б, для лікування різних видів раку, для стимуляції приживлюваності клітин при і) трансплантації кісткового мозку, для підсилення гемопоезу, зокрема тромбоцитопоезу, для лікування неврологічних порушень і хвороб печінки, та для інших цілей, пов'язаних з використанням ІІ -6 або споріднених цитокінів. «- зо Фармацевтичні композиції відповідно до цього винаходу одержують у вигляді лікарських форм, змішуючи химерний білок або його аналоги з фізіологічно прийнятними носіями і/або стабілізаторами і/або наповнювачами, с і одержують дозовану форму, наприклад за допомогою ліофілізації в дозуючих пробірках. Способом введення с може бути будь-який відомий спосіб введення, прийнятний для аналогічних засобів і залежить від стану захворювання, яке треба лікувати, наприклад внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно, шляхом місцевої о ін'єкції, місцевого застосування або безперервного вливання тощо. Кількість активної сполуки, що вводиться, ї- залежить від способу введення, захворювання і стану пацієнта. Місцеві ін'єкції, наприклад, вимагають меншої кількості білка в розрахунку на масу тіла, ніж внутрішньовенне вливання.
Даний винахід стосується також застосування химерного білка відповідно до цього винаходу, його аналогів або сумішей для лікування різних видів раку, для стимуляції приживлюваності клітин при трансплантації « Кісткового мозку, для підсилення гемопоезу, особливо тромбоцитопоезу, для лікування неврологічних порушень, в с для захисту тканин печінки у суб'єктів, які страждають на некрози, що викликаються хімічними речовинами (наприклад, тетрахлорметаном, алкоголем, парацетамолом) або іншими причинами (наприклад, вірусною ;» інфекцією, хірургічним втручанням) і для інших цілей, пов'язаних з використанням ІЇ/-6 або споріднених цитокінів. Аналогічно даний винахід стосується також химерного білка, його аналогів або сумішей, що
Застосовуються для одержання лікарських засобів, призначених для лікування вищезазначених порушень або -І згідно з розглянутими вище показаннями.
Окрім вищезазначених способів лікування химеру і/або ДНК, що її кодує, можна також використовувати для о виконання процедур ех-мімо і генотерапії. оо Даний винахід далі більш докладно описується в наведених нижче прикладах, які не обмежують його обсяг, та на кресленнях, що додаються. ю Приклад 1: Конструювання експресуючого вектора химери зі! -6К5МаїЛі -6 як На Фіг.1 зображений схематичний графік послідовності технологічних операцій, що виконуються для конструювання експресуючого вектора, який несе послідовність, що кодує химерний білок віЇ-6Кк5маї-лі -6, включаючи всі початкові і проміжні вектори, різні реагенти та стадії реакції. Ця методика конструювання ов Включає методи, добре відомі в галузі конструювання вибраних експресуючих векторів |див., наприклад, затргоок еї а!., 1989). Суть цієї методики можна коротко описати так.
Ф) Бібліотеку кКДНК, одержану з клітин Т47О0 карциноми молочної залози людини, клонують в бактеріофагу ка лямбда (75) 90 і тестують олігонуклеотидними зондами, виділеними з послідовності ІЇ-6К, за методом Ямасакі та ін. (Матавзакі еї а!., 1988). Виділяють один клон кКДНК дай, який має повну послідовність, що кодує 1І/-6К бо людини. Вставку вирізають з Х9йІ за допомогою Есокі і клонують в сайті множинного клонування (МО5) фагіміду
Е. соїї Віце З5сгірі рВБ/5К (|Зігаїадепе Сіопіпд бувіетв, І адойа, Саїйогпіаї Плазміду рВ5/5К-ІІ-6К (Фіг.1) розрізають ЕсокіІІ, дефосфолірують і знову розрізають ЕсокКУМ, щоб виділити 5'-фрагмент ІІ -6К, який складається з 959 пар основ (п.о.) і закінчується в сайті ЕсоМ рецептора І/-6К (координата 1203). Цей фрагмент, екстрагований електрофорезом в агарозному гелі, клонують в новому векторі рВ5/5К, відкритому в ЕсокМ сайта 65 МОЗ (рвз/5К-81Ї -6Б-ЕМ на Фіг.1).
Вищезазначену, раніше одержану ДНК рвВЗ/5К-1ІІ -6К піддають полімеразній реакції синтезу ланцюга (РСК),
щоб ампліфікувати фрагмент завдовжки 36б8п.о. між верхньою затравкою 1137-1156 і нижньою затравкою 1505-1488. Нижню затравку синтезують за допомогою сайта ЕсокіІ, який розташований відразу ж після кодона валіну-356 ІІ/-6К (див. Фіг.1), оскільки раніше було встановлено, що цей залишок валіну є амінокислотою з карбоксильним кінцем природної форми розчинного в1іІ-6К, що виділяється в сечі людини |Моміск еї а!., 1990; Оп еї аІ., 1996; патент США Мо5216128, що належить обом авторам, і європейський патент МОЕР 413908 В11.
Продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга розрізають ЕсокМ і ЕсокКіІ та лігують в рВБ/5К-8іІЇ -6К-КМ між сайтом ЕсокМ 1/-6К і сайтом Есок! МО5 (Фіг.1). Одержану плазміду рВ5-5іІЇ -6К-5МаІ-КІ укорочують, щоб вилучити 5-кінцеві нетрансльовані послідовності шляхом лігування сайта Ніпапй Мо з сайтом Мсо!Ї у пари 7/0 основ 410 І/-6К (обидва сайти спочатку дефосфолірують), що дозволяє одержати рВз-віЇ-6К- 5Ма1-КІ-Мсої (Фіг.1).
Послідовність ІЇ-6 виділяють з плазміди рКК(2-7, що була сконструйована аналогічно описаному способу
ІСпеп еї аїІ.,, 1988| шляхом вставки кКДНК ІРЕМ-(2/І-6, вирізаної ВвіМіІ, |7Ірегвієвїп еї а!., 1986)| в сайт Есокі експресуючого вектора рКК223-2 Е.соїї (|РНпагтасіа, ОМррзаїа, Зуледеп) використовуючи синтетичний 75 олігонуклеотид з сайтом ЕсокКіІ, за яким слідує кодон метіоніну і кодон проліну-29 ІЇ/-б6, що закінчується в сайті ВвіМІ (ЕсокіІЇ). кКДНК-вставка рКК(2-7 1-6 закінчується через 7 пар основ після термінуючого кодона в сайті Міаїм, за яким через 11 пар основ розміщений сайт Ніпай! вектора рКК-223-3 (Фіг.1). ДНК сККв2-7 розрізають Ніпа, дефосфолірують і знову розрізають ЕсокКіІ, після чого кДНК 1/-6 вставляють в раЗ-вІЇ -6К-6Ма!І-КІ-МсоЇ для злиття зрілої послідовності ІЇ/-6 (яка починається у проліну-29) з І/-6К відразу ж після валіну-35б6, при цьому вони розділені всього З кодонами (Сій-РПе-Ме). Одержану плазміду рВБ/ЗК-8іІ -6КЛІ -6 (Фіг.1) знову розрізають в сайтах Заїї та Моїї МОС5 і цю вставку клонують в сайті ЕсоїМ рсОМАЗ (пмуйгодеп Согрогаййоп, Зап Оіедо, Саїйогпіа). Одержана плазміда рРСОМАЗ-віІ -6КЛІ-6 (Фіг.1) містить вставку внизу від сильного промотору цитомегаловірусу (СММ), за якою слідує сайт поліаденілування, який забезпечує ефективну транскрипцію химери в51І/-6К5Маї/Лі-6. Збереження 5'-кінця 8іЇ-6К в химері гарантує, що Ге при експресії в клітинах ссавців функція сигнального пептиду і процесування М-кінця химерного білка будуть (5) такими самими, як у природного віЇ -6К.
Як вказувалося вище, перевагою конструкції ві! -6К5МаїІ/ЛІ-6 є те, що вона одержана в результаті злиття природних форм зії -6К і ІІ! -6 у тому вигляді, як вони існують в організмі людини, без використання чужорідних поліпептидних послідовностей. Однак збереження сайта ЕсокіІ в конструкції 8ІЇ/-6К 5МаІЛі-6 (Фіг.1) дозволяє - легко ввести сегменти лінкерного поліпептиду між частинами з51І-6К і 1-6. Крім того, була сконструйована ще сч одна конструкція з лінкерною послідовністю завдовжки 13 амінокислот
СіІш-Рпе-СІу-АїІа-С1у-І еи-Уа!-І еи-С1у-СіІу-СІп-Рпе-Меї, введеною між Ма!-356 зіІ-6В і Рго-29 ІІ -6 (в. -6е5МайЛі-6). «о
Приклад 2: Експресія химери ві! -6К5Маї/ЛіІ --6 в клітинах людини ю
Здійснюючи стандартні методи культивування клітин ссавців, трансфекції клітин і аналізу трансфекованих
Зо клітин щодо експресії нововведеної послідовності ДНК, призначеної для експресії (для ознайомлення з цими о методами див., хнаприклад, ЗатбргооК еї аї., 1989ї), вищезазначену плазмідну конструкцію (Приклад 1) використовують для трансфекції клітин людини і оцінюють міру її експресії. Коротко говорячи, використовують такі методики. «
Клітини НЕК 293 людини (АТСС СКІ 1573, трансформовані первинні клітини нирки ембріона людини) трансфекують ДНК плазмідної конструкції рСОМАЗ-8іІЇ -БЕЛІ-6 (описаної у наведеному вище Прикладі 1). о) с Культури НЕК 293, що перебувають в логарифмічній фазі росту, обробляють трипсином і висівають в Усм чашки "» Нунка (2,5Х1059 клітин/чашку). У наступний день здійснюють трансфекцію 10мкг ДНК рРСОМАЗ-віЇ -6БЛІ -6 у спосіб " осадження СаРо у |Затьгоок еї аї., 1989), через 1 годину середовище замінюють середовищем ОМЕМ, що містить 1095 фетальну телячу сироватку (ЕС5), і продовжують культивування протягом ще 16 годин. Після 42 заміни цього середовища середовищем ОМЕМ, що містить 295 ЕС5, секретовані білки збирають протягом двох
Ше подальших періодів по 48 годин. Клітинний дебріс вилучають центрифугуванням зі швидкістю с 100бобертів/хвилину протягом 10 хвилин і супернатант аналізують за методом ЕЇІЗА для зві/-6К, використовуючи поліклонільні антитіла кролика проти в8І/-6К і миші МсАВ 17.6 |Моміск еї аї., 19911. о Встановлено, що концентрація, яка дорівнює 1,2мкг/мл еквівалентів 5І/-6ЄК, є показником дуже ефективної ка 20 експресії химерного білка віІ -6КЛІ -6 в трансфекованих клітинах людини.
Імуносорбційну очистку секретованого химерного білка (в8іЇ-6КЛІ-6) здійснюють моноклональним антитілом ть 34.4, специфічним відносно епітопу в позаклітинному домені 5ІЇ/-6К людини (|МоміскК еї аї., 1991; Наїті еї аї., 1995). Клітини гібридоми 34.4 вирощують в черевній порожнині мишей та імуноглобулінову (19) фракцію одержують з асцитної рідини осадженням сульфатом амонію. Для іммобілізації МсАВ 34.4 використовують 29 АтйідеІ-10 |Віо-Кай Гарв, Кісптопа, Саїйогпіа) (15мг Ід, зв'язаного з ї!мл АйЙідеІ-10). Супернатанти, що (ФІ містять білки, секретовані з клітин НЕК 293, трансфекованих рСОМАЗ-1Ї -6КЛІ -6, адсорбують на колонках МсАВ 34.4 (О0,Змл колонка для 15мл супернатанта). Після промивання фізіологічним розчином з фосфатним буфером о (РВ5) зв'язані білюи елююють 25мм лимонної кислоти, рН 2,5, відразу ж нейтралізують 1М розчином буферу на основі НЕРЕФ5, рН 8,5 і діалізують протягом ночі (приблизно 8-12 годин) проти РВ5. бо Аналіз підданого імуносорбційній очистці білка електрофорезом в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію показує наявність характерної смути білка, забарвленої кумасі блакитним (Фіг.2).
Молекулярна маса цього білка дорівнює 85 кілодальтонам, як це і передбачалось в результаті злиття глікозилованих форм віЇ-6К5Ма! (бОкДа за визначенням ОП еї аї., 1996) і глікозилованого 1ІІ/-6 (23-26бкДа за визначенням АіІрегзіеїп еї аі., 1986). Амінокислотна послідовність віЇ-6КЛІ-б складається з 543 амінокислот, бо які після процесування сигнальних пептидів дають змогу завбачити білок завдовжки 524 амінокислоти або з молекулярною масою близько 58кДа (Фіг.3). Значно більший розмір химери зв1І/-6КЛІ-6б, одержаний з рекомбінантної ДНК в клітинах людини, свідчить про те, що глікозилування охоплює значну частину молекули.
Приклад 3: Пригнічення химерою вії! -6КЛІ -6 росту і диференціації метастатичних меланомних клітин
Клон Е10.9, виділений з меланомних клітин В1б6, утворює надзвичайно метастатичні пухлини у мишей
С57Віаск/6б, які викликають загибель тварин від легеневих метастазів протягом 2-3 місяців (Каї» еї аї., 1995).
Додання химерного білка віЇ-6КЛІ-6б в культуру клітин Е10.9 викликає істотну морфологічну зміну в клітинах і пригнічує їх ріст (Фіг.4). Клітини Е10.9, оброблені цієї химерою, витягуються, у них з'являються дендритні вирости, що виступають, які нагадують веретеноподібну диференцировку меланоцитів або гліальних клітин /о ембріона.
Ріст клітин визначають в кількісному відношенні через 4 дні після посіву З х 103 клітин в лунки 96-лункового мікро-планшета в О,2мл середовища КРМІ 1640, що містить 1095 ЕС. Клітини витримують в 12,590 глутаровому альдегіді протягом 30 хвилин, промивають у воді та забарвлюють 0,195 кристалічним фіолетовим протягом 30 хвилин. Після ретельного промивання і сушки барвник екстрагують 1095 оцтовою кислотою і визначають оптичну 75 щільність при 540нм. Ця химера пригнічує ріст клітин залежно від дози до повного пригнічення їх росту навіть при такій низькій концентрації, як ЛОнг/мл химерного білка (р8е5) (Фіг.5) Обидва химерні білки ві, -6к5Маілі--6 і ві. -6кК5Май ЛіІ-6 (химера з більш довгим лінкером між частинами з1І-6К і 1/-6, див. Приклад 1) мають однакову активність. Цей результат також показує, що довжина лінкерного пептиду між частинами 8ІЇ/ -6К і 1-6 в цій химері не справляє впливу на активність химери, оскільки химера зі! -6К 5МаІ/ЛІ/-6 має дуже короткий лінкер завдовжки З амінокислоти, а химера в5іІ/-6К5Май/ЛІ-б має більш довгий лінкер, який складається з 13 амінокислот, але обидві ці химери мають практично однакову активність пригнічення росту метастатичних клітин. На відміну від цього, ані ІЇ--6, ані вії -6К5Маї окремо не пригнічують ріст меланомних клітин (Фіг.6), що свідчить про унікальну активність химерного білка 5ІЇ/-6К/ЛІ-6 (ре5). Щоб одержати аналогічний ефект, необхідно використовувати суміш 200-40Онг/мл 1-6 і 125нг/мл ві/-6К5Ма! (Фігб). При обчисленні в. СМ мМолярній концентрації для максимального пригнічення росту клітин Е10.9 необхідно 7,5 пМ 1-6 і 2 пмМ о ві! -6К5Маї порівняно всього з 0,12 пМ химери вії -6КЛІ -6.
Активність химерного білка 51 -6КЛІ-6 р85 з пригнічення росту клітин досліджують під час імуносорбційної очистки на колонках МсАВ 34.4 (див. Приклад 2). Характер активності відповідає інтенсивності смуги раб, що спостерігається в різних фракціях, одержаних при виконанні електрофорезу в поліакриламідному гелі з - додецилсульфатом натрію, результати якого наведені на Фіг.2. с
Приклад 4: Роль химери в1І -6КЛІ -6 в приживлюваності трансплантованих клітин кісткового мозку
Приживлюваність кровотворних стовбурових клітин з кісткового мозку людини можна досліджувати після їх о трансплантації мишам з важким комбінованим імунодефіцитом (ЗСІО) (Могтоог еї аі., 1994). Мишей ЗСІО-МОО (з піддають опроміненню сублетальними дозами та ін'єкують в хвостову вену З х 107 клітин СОЗ4" кісткового мозку людини. До ін'єкування очищені клітини СО34" витримують протягом З днів в рідких культурах з різними - комбінаціями цитокінів. Через один місяць мишей умертвляють і видаляють у них кістки для одержання клітин кісткового мозку. Приживлюваність клітин людини у мишей-реципієнтів ЗСІО-МОЮО визначають за методом гібридизації саузерн-блотингом з ДНК людини, що повторюється. « дю Встановлено, що фактор стовбурових клітин (ЗСЕ, зіееі-фактор або скКії-ліганд) і РІІЗ-ліганд (ліганд з рецептора тирозинкінази ЛІЗЛІК2) мають важливе значення для виживання і проліферації більшості первинних с поліпотентних кровотворних стовбурових клітин, здатних протягом тривалодіючому приживленню в кістковому :з» мозку реципієнта МеКеппа еї аї., 1995). Як показано на Фіг.7, ці два фактори самі по собі є недостатніми для стимуляції приживлюваності клітин людини в кістковому мозку мишей-реципієнтів 5СІО-МОЮ. Щоб виявити приживлюваність клітин на значущих рівнях, необхідно додати химерний білок віІ/-6КЛІ-6. Химера зі! -6КЛІ -6, - 75 що додається в кількості 10Онг/мл, є значно більш активною, ніж виділені окремо 1-6 (50-20Онг/мл) і 8І/-6К (125-125Онг/мл) (Фіг.7). Необхідність використання химери віЇ-6КЛІ-6 вказує на те, що цей білок має важливе 1 значення для виживання і проліферації некомітованих поліпотентних кровотворних стовбурових клітин, які о приживаються в кістковому мозку Ї створюють в ньому нову популяцію клітин, з чого випливає, що цей білок може бути корисним у випадку клінічних операцій з трансплантації кісткового мозку. ко 20 Вперше продемонстровано, що химера ві! -6КЛІ -6 має принаймні два нещодавно виявлені види активності: ще (І) При доданні разом з факторами 5СЕ і РІЇЗ-лігандом в кровотворні первинні недиференційовані клітини людини ця химера стимулює їх виживання і проліферацію; та (ІЇ) Ця химера є активною (і очевидно основною) в моделі іп мімо трансплантації кісткового мозку людини мишам з імунодефіцитом.
Приклад 5: Химера зіІЇ/-6К/ЛІ/-6 активна на максимально очищених первинних кровотворних стовбурових
ГФ) клітинах 7 Мононуклеарні кров'яні клітини з пуповини людини фракціонують, відділялючи мононуклеарні клітини низької щільності (ММС) в апараті РісоїІ-Радне (Рпагтасіа Віоїесп, Оррзаїа, Зул"едеп), та обробляють мінінабором МАС5 во (Мійлеу Віоїес, Вегдізспи СІадбаси, Сегтапу) для одержання популяції клітин СО34 "7 8095 чистоти. Ці клітини пасують на іммобілізованому моноклональному антитілі проти СОЗ8 або сортують за методом сортування активованих флуоресценцією клітин, в результаті чого одержують популяцію СОЗ34 "СО38, що відповідає приблизно 0,195 вихідних клітин. Ці очищені стовбурові клітини (20000 клітин) приміщують в суспензійні культури в О,бмл середовища КРМІ, що містить 1095 фетальну телячу сироватку (ЕС5), 1956 бичачий 65 сироватковий альбумін з БбБОнг/мл фактора стовбурових клітин (ЗСЕ) і 1ООнг/мл ЯЗ-ліганду (РІ) (обидві речовини надані фірмою КО Зузіетв, Міппеароїїг, ММ) . В половину культур додають 1ООнг/мл химери
8ІС-6КЛІ-6, решту культур вирощують без цієї химери. Культури інкубують при 372С в 59565 СО» протягом 6 днів.
Кількість репопулюючих клітин кісткового мозку визначають шляхом ін'єкування (внутрішньовенно) всіх клітин з культур іп міго мишам МОЮО-5СІЮ, підданим опроміненню сублетальними дозами. Мишей тримають в стерильних умовах. Через б тижнів мишей умертвляють і видаляють кістковий мозок з довгих кісток. Клітини кісткового мозку (ВМ) культивують на пластинах з напівтвердої 0,996 метилцелюлози, що містять ЗО95 ЕС5, 5ОКМ р-меркапто-етанолу, 5Онг/мл ЗСЕ, 5нг/мл 1-3, 5нг/мл ЗМ-СЗЕ, бмк/мл еритропоетину (всі речовини надані фірмою МКЯ ОО Бузвіетв). Культури містять також сироватку людину, яка запобігає росту колоній мишей.
Результати (Таблиця ІМ) показують, що додання химери віЇ/-6КЛІ-б6 до суспензійних культур викликає 70 30-50-кратне збільшення колонієутворюючих клітин (СРО) людини у трансплантованих мишей порівняно з ЗСЕ і
ЕМ, які використовуються окремо. Це вказує на велике збільшення кількості ЗСІО-репопулюючих стовбурових клітин, присутніх в суспензійних культурах на 6-й день порівняно з 0-м днем. За відсутності химери 8ІЇ/-6КЛІ-6, ЗСЕ і РІ. не викликають збільшення кількості стовбурових клітин при знаходженні в суспензійній культурі протягом б днів. ДНК клітин кісткового мозку, виділену у трансплантованих мишей МОБ/ЗСІЮ, 75 аналізують за методом саузерн-блотинга, як це описано в прикладі 4. Кількість виділеної ДНК людини в 10 раз більша у мишей, яким були введені клітини, культивовані з химерою, порівняно з мишами, яким були введені клітини без химери.
Колонієутворюючі клітини-попередники з кісткового мозку мишей МОБ/ЗСІО, як показано в Таблиці ІМ, збільшують кількість кровотворних клітин різних мієлоїдних ліній (макрофаг і гранулоцит), а також еритроїдних і лімфоїдних ліній (наприклад, СО19", СО567), тільки тоді, коли кров'яні клітини людини були культивовані з химерою вії! -6КЛІ -6 до трансплантації. нний сч о нн людини з пуповинної крові культивування кісткового мозку, трансплантованого мишам МО0Б/ЗСІЮ нн нишииииии - зо вн 01010115 всеяоееєвися 177716 11111111111111Боюю с со
В додаткових експериментах проводять порівняння впливу віЇ-6КЛІ-6 на популяцію клітин СО34 "СО387 пуповинної крові і на добре очищені стовбурові клітини СО34" СОЗ38 Розмноження іп мйго під дією ю 8іЇ-6ЕЛІ-6 добре очищених клітин відбувається значно інтенсивніше, ніж менш очищених клітин (Таблиця М). Це ї- свідчить про те, що більш прийнятною мішенню для розмноження віЇ-6КЛІ-6 є передусім первинні стовбурові клітини. ч ж з с з» нн : 5 т сл о з 50 щк Збереження іп міго репопулюючої активності кісткового мозку вимірюють по збільшенню довжини суспензії культур добре очищених стовбурових клітин СО34"СОЗ38: до ін'єкування мишам МО0/5ЗСІО. Приживлюваність клітин оцінюють на основі відносного вмісту ДНК людини в кістковому мозку мишей-реципієнтів через 6 тижнів після внутрішньовенного введення культивованих клітин. При доданні вії -6КЛІ -6 до 5СЕ і РІ. в культури клітин висока приживлюваність (2195 ДНК людини) спостерігається навіть через два тижні культивування, причому
ГФ) приживлюваність є вищою, ніж в некультивованих клітинах. На відміну від цього, експерименти з культурами, що
ГФ містять ЗСЕ, РІ, ОМ-С5Е, 1-3, показують, що ЗСІЮО-репопулюючі клітини не зберігаються через один тиждень культивування |Впайа, М. еї а!., У. Ехр. Меа. 186, 619-624, 1997).
Ці результати свідчать про те, що віЇ-6КЛІ -6 стимулює розмноження і збереження первинних стовбурових бо клітин людини, здатних приживатись в кістковому мозку реципієнта. Стовбурові клітини, розмножуючись, залишаються активними в недиференційованому стані. Химера в8іЇ-6КЛІ-б6 є новим засобом культивування кровотворних клітин, що приживаються. Досить ймовірно, що ця химера дозволить використовувати ретровірусні вектори для введення генів у стовбурові клітини, що приживаються, згідно з схемою генотерапії. До цього часу така обробка стовбурових клітин людини була неможливою, оскільки ці первинні клітини не зберігалися іп мйго 65 у фазі клітинного циклу, як це необхідно для інтеграції ретровірусної ДНК. Химера зіІ/-6КЛІ-6 дозволяє вирішити цю проблему.
Приклад 6: Одержання химери ІІ -6КЛІ -6 в клітинах СНО
ДНК плазміди рсоМАЗ ЇЇ -6КЛІ-6, показану на Фіг.1, котрансфекують в клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) разом з ДНК плазміди рОНЕК за методом |Могу еї аі,, ДНК 5, 181-193, 1986). Разом з іншими трансфектантами, що вирощуються в 5ОНМ метотрексату, виділяють клон 1 12-( -6КЛІ--6). Встановлено, що цей клон залишається стійким протягом кількох пасувань, тому напівконфлюєнтні культури звичайно секретують в культуральне середовище 2,5мкг/мл химери ІІ -6КЛІ -6.
Для очистки химери І/-6КЛІ-6 3,25 літри середовища з культур клону /12 в 295 бичачої сироватки 7/0 Концентрують до 200мл. Одержану речовину адсорбують на 18мл колонці з моноклональним антитілом 34.4 проти 5ІЇ/-6К людини, зв'язаного з гранулами Айіде! 10, та елюють у відомий спосіб |(Моміск еї а!., Нубгідота, 10, 137-146, 1991). Елюат, що містить 25мм лимонної кислоти, відразу ж нейтралізують буфером на основі
НЕРЕЗ 1, рН 8,6. Білки концентрують на мембрані Атісоп для вирізання фрагменту з молекулярною масою 10кДа до кінцевої концентрації мг/мл. В результаті виконання електрофорезу в поліакриламідному гелі з 7/5 додецилсульфатом натрію виявлено одну смуту з молекулярною масою 85кДа, що відповідає химері 1І--6КЛІ--6.
Глікозилування підтверджене зменшенням розміру після обробки глікозидазою (Воепгіпдег, Мапппеїт).
Встановлено, що біологічна активність СНО-продукованої химери ІІ -6КЛІ-6 залишається стабільною протягом принаймні 5 місяців при 42С. Як правило, химеру зберігають при -7090.
Приклад 7: Спорідненість химери ІІ -6КЛІ -6 до др130
СНоО-продуковану химеру ІІ -6КЛІ -6 і суміш 1-6 і 8ІЇ-6К людини порівнюють щодо зв'язування з розчинною формою ор130 (зор 130), яка є другим ланцюгом системи рецепторів для 1//-6. 9б-лунковий титраційний мікропланшет (Мипс) покривають моноклональним антитілом проти 90130 людини і додають 5Онг/мл зарізо (обидві речовини надані фірмою К ОО БЗувіетв, Міппеароїїз). Химеру ІІ/-6К/ЛІ/-6 промивають в фізіологічному розчині з фосфатним буфером і вводять в різні лунки в різних концентраціях від 0,1 до 5Онг/мл. В окремі лунки с додають гії! -6 (Агез-5егопо, Сепема) в кількості 50Онг/мл разом з віЇ-6КоМа! людини в концентраціях від 2 до
Б5ООнг/мл. Культури інкубують протягом ночі при 42С і додають поліклональне антитіло кролика проти 1І-6К (Оп і) еї аї.,, СуїоКіпе, 8, 401-409, 1996), а потім Ід кози проти кролика, кон'югований з пероксидазою хріну, яку виявляють кольоровою реакцією (Зідта, 5. І оців). На Фіг.8 показаний графік Скетчарда одержаних результатів.
Встановлено, що спорідненість химери 1І/-6КЛІ-б до др130 в 4 рази вища, ніж у двох частин молекули, що ж: додаються окремо (6,3 х 1071М порівняно з 2,6 х 10719 М). Цей результат відповідає очікуваному і пояснює сч більш високу активність химери відносно до меланомних і кровотворних клітин порівняно з комбінацією
І. -бвіІІ -6К (Фіг.9 та Приклад 4). со
Приклад 8: Химера ІІ -6/ІІ -6 захищає від гепатотоксичності ю
Ін'єкування мишам тетрахлорметану (ССІ4) викликає широкий некроз печінки, що призводить до загибелі тварин |Зіайег Т.Р. еї аЇ.,, Рпйов, Тгапв. К. бос. ВіоЇ. Зеї., 311, 633-645, 1985). Коли мишам з генетичним - дефіцитом 1-6 (71-67) вводять відносно низькі дози ССІ (2-Змл/кг маси тіла) у вигляді внутрішньочеревної ін'єкції, смертність Через 24 години становить приблизно 7095 (Фіг.10). Ін'єкування СНО-продукованої химери
І--6КЛІ-6 за одну годину до введення ССІ, і через 4 години після введення ССІ у захищає тварин, і через 24 « години не спостерігається жодного випадку загибелі тварин. На відміну від цього, ін'єкування вільного гц! -6 не справляє ніякої дії (Фіг.10). Химера І/-ЄБЛІ-б6 є ефективною в дозах, що складають 2-Змкг/ін'єкцію, що в в) с молярному відношенні в 10 разів менше, ніж неефективна доза 1-6. При більш високих дозах ССІ,) (наприклад, "» З,5мл/кг на Фіг.10) ця химера також справляє захисну дію, причому смертність в цьому випадку нижча, ніж при " введенні ІІ -6 або без введення цитокіну. Відмінність між показниками смертності у мишей, яким була введена ця химера і яким вона не була введена, при однаковому впливі ССіІ, є значущою при р«е0,01. Гістологічне дослідження зрізів печінки, забарвлених гематоксилінеозином, підтверджує, що ССІ) спричинив некроз тканин і - що химера ІІ -6К/І -6 захищає гепатоцити від токсичної дії цієї хімічної речовини (не показане). с Химеру 1І--6КЛІ-6 можна використовувати для захисту тканин печінки у пацієнтів, які страждають на некроз внаслідок впливу хімічних речовин (наприклад, алкоголю, парацетамолу) або з інших причин (наприклад, і вірусний гепатит).
ГІ 20 Приклад 9: Конструювання і активність химери ІІ -6/8І!-6К5Маї
Сконструювали химерну молекулу, в якій частина ІЇ/-6 розташована в М-кінцевій області і частина в8і/-6К ть знаходиться в С-кінцевій області. Плазміду рВ5-8іЇ. -6К 5МаІ вирізають в сайті ЗаиЗа (1086бп.0.) і в сайті
Ніпапй слідом за термінуючим кодоном після МаІ-356 (див. приклад 1). Лінкер, що містить три сайти рестрикції: Зреї, Зтаї і Ватні, синтезовано так:
Зреї Зтаї Ватні
ГФ) 5 ст АСТ ооо ССС ооо ото осо оо
А ССС ССС САС СОС ССС ТАС 5 (5ЕО ІЮ Мог2) іме) Сай Й й й Я - Я . айт ЗацйзЗа в1І/Ї-6К лігують з Ватні лінкера і клонують в сайті множинного клонування плазміди Вішйевзсгірі рВЗ ЗК. Послідовність 1-6 ампліфікують полімеразною реакцією синтезу ланцюга з ДНК рКккКдра2-7, 60 використовуючи затравки (ініціюючий кодон підкреслено): зЗреї
Верхня 5 СА СТА СТА ОСТ АТО ААС ТСС ТТС ТС (5ЕО І Мо3)
Наєеі!
Нижня 5 Ас БОС САТ ТТО ССО ААС АОС С (ЕС ІЮ Мо4) бо Продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга, вирізаний Зреї та НаєеїІ, вводять між сайтом 5реї та Зтаї вищезазначеного лінкера. Інший лінкер ВатнНі-Мсої з внутрішнім сайтом Зтаї синтезують так: зЗтаї
З АТ ССО оС оС ооо ОбА со оо ССС ооо СрІМсої)
ІВатНнІ С ССО ССО ССС ссСТсСсТСсСсСооОсСсССоОСТАСУ (ЗЕОІОМО:3)
Цю послідовність клонують між Ватні попереднього лінкера і Мсо! 1464 послідовності ІІ -6К. Фрагмент ІІ -6К від Зтаї 867 до Мсої 1464 вводять між Зтаї другого лінкера та Мсої І.-6К. Одержану химерну ДНК секвенують і знову клонують в РСОМАЗ для експресії в клітинах НЕК 293 людини. Амінокислотна послідовність цієї химери Зе 7/0 11-6-1-6К показана на Фіг.11 (лінкер підкреслено) Химеру Зе очищають афінною хроматографією на моноклональному антитілі проти ІЇ/-6б (за методом МоміскК еї аї., Нубгідота 8, 561-567, 1989). Електрофорез в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію дозволяє виявити смугу, що відповідає молекулярній масі 75кКДа.
Біологічна активність химери Зе 1ІІ/-6-І-6ЄК, спрямована на пригнічення росту меланомних клітин Е10.9, /5 показана на Фіг.12. Ця химера має виражену активність при порівнянні з химерою 1І--6КЛІ--6 (препарат 1-3), яке виконують при здійсненні того ж експерименту, хоча для 5095 пригнічення росту її необхідно використовувати в більшій кількості.
Було одержано два мутанти І/-6КЛІ-б, в яких амінокислоти Ніз-280 і Авр-281 частини ІЇ-6К химери
І/-6КЛІ -6 (Фіг.3) замінені відповідно Зег і Ма шляхом мутагенезу за методом РСК (мутант 39 або НО) або.
Авп-230 додатково замінена Азр (мутант МНО). Як показано на Фіг.12, ці два мутанти майже не мають активності при порівнянні з химерами ІІ -6КЛІ-6 ії 1І/-6-ІЇ-6К. Оскільки в ІІ/-6К ці амінокислоти взаємодіють з др130, як показують результати моделювання молекули |Наїїті еї аіІ., 1995), з цього випливає, що химера віЇ-6КЛІ -6 зберігає цей важливий сайт взаємодії.
У химери Зе 1І/-6-І.-6К відсутній імуноглобуліноподібний домен 1І/-6К, який є в 1/-6КЛІ-6. Однак, с ов Вилучення Ід-домену з ІІ-6КЛІ-6б не зменшує біологічну активність цієї химери відносно до клітин Е10.9.
Зв'язування химери Зе 1І/-6-І./-6К з дрізО складає приблизно 3095 від аналогічного показника іншої химери і)
І. -6АКЛІ -6 (не показано). Таке більш низьке зв'язування відповідає слабкішому впливу на ріст меланомних клітин.
Ці результати показують, що блокування карбоксильного кінця ІЇ-6 шляхом злиття через лінкер з віІІ/-6К зберігає добру біологічну активність в цих нових химерах. «- зо Посилання:
Спеп Її, Могу М, регевієїп А апа Кеме! М. Сгомій іппірйоп ої Ппитап ргеазі сагсіпота апа с
ІеикетіаЛутрнота сеї! Іпез Бу гесотбіпапі іпїепегоп-рейа 2/І -6. Ргос. Маї). Асад.5сі. ОА, 85: 8037-8041, 1988. с
Спета|оузКу М, Могу М, Спеп |, Магке 7, Моміск О, Кибіпзвівєїп М апа Кеме! М. Еййсіепі сопзійшіме ргодисіоп ої питап Пргобіаві іпіепегоп Бу патзгіег сеїІв (гапаїогтей мйй (Ше ІРМ-ДІ депе Тизей ю ап 5М40 еапу о зв рготоїег. ОМА, 3: 297-308,1984. ї-
ЕРівспег М, Соідзсптій 9, Резспе! С, ВгаКеппой РО, Каїїеп К-), УМоїІтег А, Огоїгіпдег У апа Козе-дойпп 5.
А Біоасіїме девзідпег суїоКіпе бог Питап Петаїйороієїс ргодепіог сей ехрапзіоп. Майте Віобгесппоіоду 13:142-145, 1997.
Сапараїйі МК, УУеїгег АК, ВогзейПйпо 5, Виком5Кі КМ, Сапараїйі 5, Кісе Т, Сазеу б апа Кажматига К. « Кевівіапсе іо ІпіегпеиКіп-б іп Нпитап Моп-втаї|! сей по сагсіпота сеї! Ппев: Коїе ої гесеріог сотропепів. с СеїЇ Стомій апа ОіПегепііадцоп, 7: 923-929, 1996. й Наїїті Н, Еїівепвієїп М, Ой у), КемеІ М апа Сперайй 9. Еріре реріідез їот іпіегеиКіп-б6 гесеріог міс «» іппірії (пе дгомй ої питап туеїота сеїЇв. ЕЄиг. СуюКіпе Мейу., 6:133-143, 1995.
Нігапо Т, МазиКажша К, Нагада Н, Тада Т, УУаїапаре М, Маївида Т, Казпітига 5, МаКазїта К, Коуата К, матаїви К, Твипазама 5, заКіуата Р, Маївиї Н, ТаКанага У, Тапідиснпі Ф апа Ківпітою Т. Сотріетепіагу ОМА ог -і а помеї іпіегпецикіп (В5Е-2) (паї іпаисез В Іутрпосуїез Юю ргодисе іттиподіобиїїпв. Майиге, 234: 73-76, 1986.
Нігапо Т, Маївида Ф апа МакКаїта К. Зідпа! (гапздисіоп (пгоцдіп орізо (йаг ів зпагей атопд (пе гесеріоге о Тог (Пе іпіегіецкКіп 6 геіагейд суїоКіпе зибтатіу. (ет сеїІв, 12:262-277, 1994.
Ге) Ноїожау Су. Арріїсайопе ої гесотріпапі ОМА іесппоїоду іп (Ше ргодисіоп ої діусовуїаїей гесотріпапі питап дгапціосуве соіопу зійтиайпо Тасіог. Ешг. У. Сапсег, 30: 2-6, 1994. де Капп МА апа ЮОе Меїйз у. Кедшайоп ої ап оїїдодепагосуїе ргодепіюг сеї Ппе бу (Ше іпіепеикКіп-6 - Тату ої суюкКіпев. Са, 12: 87-98,1994.
Каї; А, Зп!ціІтап І М, Рогоадог А, Кемеї М, Реідтап М апа Еїізепрасі І.Абгодайоп ої В16 теіапота тегавзіазев ру Іопа-(егт Іом/-дозе Іпіегпецйкіп-6 (Пегару. У). ІттипоїПег. 13:98-109,1993.
МаскКіеміс» А, Муігпегомііс» М, Коеб Е, Можак 4), Рамжм/іомузКкі Т, Ваштапп Н, Неїпгісп Р апа Козе-)опп 5.
ІпіегпіеиКіп-б-їуре суюКіпез апа іПпеїг гесеріоге ог депе (Шегару ої теіапота. Апп. Мем МогкК Асай. Зеї., 762: о 361-374, 1995. ко МсКеппа НУ, де Мгіеєв Р, Вгазе! К, Гутап ЗО апа Умійате ОЕ. ЕПесі ої НІЗ Іїдапа оп (Пе ех мімо ехрапвіоп ої пПитап СОЗАж петайороїеїйіс ргодепіюг сеїІв. Віоса 86: 3413-3420,1993. во МигаКкаті М, Нірі М, МаКкадамжа М, Мадакамжа Т, ХазиКкамжа К, Хатапігвпі К, Тада Т апа Кізпітоїйо Т. ІІ -6 іпдисей потодіптегігайоп ої дрізо апа аззосіаєей асіїмайоп ої а (уговіпе Кіпазе. Зсіепсе, 260: 1808-1810, 1993.
Моміск ОО, Епдіетапп Н, УМаїйаспи О, Іейпег О, КемеІ М апа Кибіпзівїп М. Ригійсайоп ої зоЇШбіе суюкКіпе гесеріогг їтот погтаї шигіпе Бу Ідапа-айіпну апа іттипоайтйу спготайоадгарну. У. Спготайоаг., 510: 331-337, 1990.
Моміск О, Епдеітапп Н, Кеме! М, Іейпег О апа Кибіпвівїй М. Мопосіопа! апібодіев о (Ше зоїЇШшбіе 1-6 б5 тесеріог: апйіпну ригіїсайоп, ЕГІЗА апа іппірйоп ої Ідапа Біпаїпо. Нубгідота, 10: 137-146, 1991.
Моміск ОО, Зпйцітап ІМ, Спеп Ї апа Кеме! М. Еппапсетепі ої іпіегіеиКіп-б суовіайс епйесі оп питап Бгеаві сагсіпота сеїЇз ру зоїЇшбіе ІІ -6 гесеріог їтот игіпе апа гемегвіоп Бу топосіопаї! апіїродіеєв. СуюкКіпе, 4: 6-11, 1992.
Оп О-МУ, Кеме! М апа Спебраїйй у). А зоїцбіе іпіегіеиКіп-б6 гесеріог ізоїаїей їот сопайіопей теадіит ої питап
Бгеаві сапсег сеїЇз із епсодеа Бу а аіїегепійіану зріїсеа тКМА. СуокКіпе, 8:401-409, 1996.
Оп 0О-МУ. Ехргезвіоп ої гесотбріпапі зоЇїШбіе питап іпіегеиКіп-Є гесеріогв апа апаїувів ої (Неїг Тпсіопв.
Р.О. Тпевзіз МУеігтапп Іпвійше ої Зсіепсе (Кемеї М, зирегмівог), 1997.
Раопезза С, Огаліапі К, Оезегіо А, Заміпо К, Сіарропі Ї, Гайтт А, Заїмаїї АЇ, Топіаці С апа Сійрегпо о.
Тмжмо дізііпсі апа іпдерепаепі вісез оп ІІ -6 (гіддег дріЗО аітег Тогтацйоп апа зідпаїїїпд. ЕМВО 3., 14:1942-1951, 1995.
Кеме! М. Нові аєїтепзе адаїпві іп'есіопз апа іппйаттайопв: Коїе ої Ше тиййипсіопа! І -6ЛЕМ-р2 суюкКіпе. 70 Ехрепепіа 45: 549-557, 1989. затргоок .), Егіїзсі ЕЕ апа Мапіаїйіз Т. МоїІесціаг сіопіпд: А Іарогагу тапиа!. Соїа Зргіпд Нагрог Ргезз, 1989. зиі Х, Твції К, ТапаКа К, Тата 5, МигаоКа К, Еріпага У, Ікериспі К, Мазикама К, Тада Т, Кізпітоїю Т апа
МаКапйаєса ТТ. срізО апа с-кК відпайпуз вупегділе їог ех хмімо ехрапвіоп ої питап ргітййме Петороіеїйіс ргодепіюг сеїЇв. Ргос. Маїй). Асад. беї. ОЮОБА 92:2859-2863,1995.
Тада Т, Нірі М, Нігаїа М, Матазакі К, Мазикажша К, Маївида Т, Нігапо Т апа Ківпітою Т. ІпіегіеиКкіп-б ігіддеге (Пе" азвосіайоп ої їїз гесеріог м/йй а розвібіе зідпа! (гапздисег дрізоО. СеїЇ, 58: 573-581, 1989.
Могтоог У, ІГарідої Т, Рішитіо ЕЕ, Кіздоп б, РацЦеггоп В, Вгохтеуег НЕ апа біск ХЕ. СІЮ тісе ав ап іп мімо тодеї ої пПитап сога ріоса Нетайороіевів. Віоса сеїІв 20:316-320,1994.
УУага ГО, Номек су, Оівсою С, МазиКкажша К, Наттаспег А, Могі: Кі апа бітрзоп К.. Нідп айіпну іпФепеикіп-6 гесеріог ів а Пехатегіс сотріех сопвівіпо ої био тоїесцез еасп ої іпіепецкіп-6, іпєепецкіп-6 гесеріог апа оріЗоО. 9. Віої. Спет., 269: 23286-23289, 1994.
Уатазакі К, Тада Т, Нігага М, Мамжайа Н, Кауапізпі Х, беей В, Тапідиспі Т, Нігапо Т апа Кізпітоїо Т.
Сіопіпд апа ехргезвіоп ої (пе пПитап Іпіегіеикіп-6 (ВБЕ-2/ Іпіепегоп реїа-2) гесеріог. Зсіепсе, 241: 823-828,1988. гІрегвієїп А, Киддієгі К, Когпп НУ апа Кеме! М. Зігисійге апа ехргезвіоп ої ої СОМА апа депез г питап су іпіепегоп-рейа-2, а дівііпсі зресієз іпдисіріе Бу дгоулн-зійтиіаюгу суюкКіпез. ЕМВО 3., 5:2529-2537,1986.
Список послідовностей і) (І) Загальна інформація (І) Заявник (А) Назва: Хеда Кезеагсі апа Оемеіортепі Со. | (4. «-- (В) Вулиця: У/еідтапп Іпвійше ої Зсіепсе, Р.О.В. 95 (С) Місто: Кепомої с (Е) Країна: Ізгаеї! (Ізраїль) со (Р) Поштовий індекс: 76100 (б) Телефон: 972-8-9344093 о (Н) Телефакс: 972-8-9470739 ї- (А) Ім'я: КЕМЕЇ,, Міснеї! (В) Вулиця: Веї Вга?ії 5, М/еі2тапп Іпвійше ої Зсіепсе (С) Місто: Кепомої (Е) Країна: Ізгаеї! (Ізраїль) « (Р) Поштовий індекс: 76100 шщ с (А) Ім'я: СНЕВАТН, цай й (В) Вулиця: Кепом МіМег 13 «» (С) Місто: Кепомої (Е) Країна: Ізгаеї! (Ізраїль) (Р) Поштовий індекс: 76284 -і (А) Ім'я: АРІООТ, Твуєе (В) Вулиця: Кепом Вохег 6 іні (С) Місто: Мезв-2опа
Ге) (Е) Країна: Ізгаеї! (Ізраїль) (Р) Поштовий індекс: 74046 о (А) Ім'я: КОГГ ЕТ, Огії - М (В) Вулиця: Кепйом Катаї Спеп 14 (С) Місто: Катаї Сап (Е) Країна: Ізгаеї! (Ізраїль) (Р) Поштовий індекс: 52232 (І) Назва винаходу: Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-б/ліганду, його аналоги та способи іФ) застосування ко (ПОКількість послідовностей: 8 (ІМ) Комп'ютерні дані: во (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: ІВМ-сумісний персональний комп'ютер (С) Операційна система: РО-ЮОБ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: програма Раїепійп, випуск 1.0, версія 1.30 (ЕРО) (МІ) Дані попередньої заявки: 65 (А) Номер заявки: І. 121284 (В) Дата подачі: 10 липня 1997р
(МІ) Дані попередньої заявки: (А) Номер заявки: І. 122818 (В) Дата подачі: ЗО грудня 1997р. (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо1: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 13 амінокислот (В) Тип: амінокислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова 70 (ОБ) Топологія: лінійна (ІЇ) Тип молекули: пептид (ХІ) Опис послідовності: 5ЕО ІЮ Мо1 бі Рбе б1у А1їа сіу Пец Уа! Гей б1іу 51у біп Ре Меє 1 ? 10 (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Мо2: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 44 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (ІЇ) Тип молекули: кДНК дв (ХІ) Опис послідовності: хЕО ІЮ Мо2 с стАОтТооосСо СобооТосоо осАсОосоаос сссАССосос сто 44 о (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Моз: (І) Характеристики послідовності: «-- (А) Довжина: 25 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота с (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова со (ОБ) Топологія: лінійна (ІЇ) Тип молекули: к днк о (ХІ) Опис послідовності: ЗЕО ІЮО МоЗ ча
САСТАСТАОС ТАТОААСТОС ТІСТО 25 (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Мо4: « (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 21 пара основ - с (В) Тип: нуклеїнова кислота "з (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова " (ОБ) Топологія: лінійна (ІЇ) Тип молекули: кДНК (ХІ) Опис послідовності: 5ЕО ІЮ Мо4 -І
АСООСсСАТТТ ОСССААОдОоС с 21 1 (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Моб: і (І) Характеристики послідовності: ма 70 (А) Довжина: 62 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота "-ь (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (ІЇ) Тип молекули: кДНК (ХІ) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Моб (Ф. оАТСССОЮСв сСОососоАОос обозосСооо сСосоСосСсос ссосстостТос Сбабсссост 60 о Ас 62 во (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Моб: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 14 амінокислот (В) Тип: амінокислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова 65 (ОБ) Топологія: лінійна (ІЇ) Тип молекули: пептид
(ХІ) Опис послідовності: 5ЕО ІЮ Моб сіу б1іу с0іу бі1у Азр Рго біу 01у б1у б01у п03у б1у Рго 51у 1 5 10 (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Мо7: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 543 амінокислоти (В) Тип: амінокислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (І) Тип молекули: пептид (ХІ) Опис послідовності: 5ЕО ІЮ. Мо7 " Мес печ діа Маї б1іу Суз діа їй еп А1а Аза Се Пеб Ата АТа Рго 1 5 10 15 біу дія Аза Цей дія Рго Ах Агу Суз Рго А1а біп бій Уаї АБа Аг4
Сіу Маї Пе ТЕ бе Геч Рто біу Ар бек Ма1ї ТНЕ Пес ТЕ о Суз Рего 35 40 45 с біу Чаї сій Рго бій Азр Абп діа Так оУаї Ніє Тер Узі цез Ага Буз 5) 50 25 о
Ето А1а Атїа Сіу беїх Ніз Рко бек Ард ТЕр А1а б1у Меє біу Агд АІЧ - зо 65 79 75 во сч
Іез Се; це Ага бек Уві біп респ Ні Авр бек Сіу Аза Тут Бех Суз о 85 90 35 во ч-
Тук Агу діа б1у Атху рко Аа О1у Тпг о Уа)з Ніз Те Бей Ма) Азр Уаї 100 105 110 « тго Рго піц бій Рго біп Цей бЗет Сує Ре Аа Пуб бек Рго Пеп беї о) с 115 120 125 з
Азп Чаї Уаї Су бій Тгр б1у Рго АгЯ баг Тр орто бек Ше ТЕ Тпг 130 135 140 -І с Гуз діа Уаї цец їйва Чаї Агу уз Ре біп Ази Бег Рго Аїа біц Авр о 145 150 155 160 т Ре біп бій Рго Суз біп Тур 5Зеї біп біб Баг біп Буз Рпе бек Суз та 165 175 Ут5
Ф) іме) 60 б5
Сіп цес Аза Уаї Рго бі Сіу Азр Зег бек Рпе Тук І1е Ма! бег Меї 180 185: 180 2 Сув Маї Аїа бЗег 5Зег Уаї б3у бег Туз Ре бег Туз Тпг біп Тпг Рпе 195 200 205
Сіп б1у Суз біу Т1еє цес біп Рго Аб5р Рго Рго Аза Ап І1е Тпг Хаї 70 210 215: 220
ТВЕ Аїа Уаї діа Агу Абп о Рко Агд Тгтр тво бек Уаії ТпЕ Тер біп Ар 225 230 235 240 75 Рко Ніз бек Ткр Азп бек Зех Рре Тух Акд Пец Акуд Ре бій Гей Акд 245 - 250 255
Тут Агу Аза бій Ахо бег Гуз Тптх Рпе ТАг ТІ Ттхр Мес Уаї Гуз Азр 250 265 270
Без біп піз нія Суз Уаї І1їе Ні А5р АЗїа Тгр бех 01у Пес Агу Ні 275 280 285 ов Маї Маї біп Пес Аку Аза біп бій б1ц Рбе Сіу біп с1у 611 Ткр 5ег с 290 295 300 і) біз Тер бек Рго 013 Аза Мес б1у Тбг оРго їгр Тпг бі Бек Ага Зег 305, 310 315 320 «-
Рко Рго А1а біб Азп бі Уа) бес ТБк о Рко Меє біп Діаз Бец тах ТЕ см 325 330 335 со
А5п оБуз Азр о Авр о Азр о Азп 112 Гей Рре Агуд Азр бек А1а Авп Аіа Трг во 340 000348. 350 т бек Гей Рто Уа! б1Ч Рбе Мес Рго Уа1і Рко Рго біу б1й1 Авзр бЗег Буз 355 360 365 е «
Ар Уаї Аіїа діа Рхо Ніз Дкд Сб1іп Рго Гей ТЬг Зед бек 01) Агу 116 т с Зо 375 380
Б Ар Ццуз б1п І1е Ах Тук І1е Пец Авзробіу ІТТ бек Аза Із Дку Був 385 390 395 400 і Сі ТВптг Суз Азп уз бек Азп Мес Суз бій бег бег Пуз біц діа Пец сл 405 410 415 о й Аїа біц Азп Авпойец Азп оцей Ро уз Мес Аза біз Гуз Азр о біу Суз
Ге) 420 425 430 -
Рпе біп бек с1у Рпе Азп о біц біш Так оСув Без Уа) Гуз І1е Ізїе ТПг 435 440 445 о Сіу ес Тео біш Рпе 011 Маї Тухт Ге бій Тут Пе біп Азп Ак Рпе 450 455 460 ко
СЬи Зех бек біш бій біп Аза Агу Атїа Уаї біб Меб Бех Тпх Пуз Уаї 60 4165 І а70 475 480 їйем І16є біп Рпе цей біп Пуз Пуз А1іа Буз Азп о беч Азр Аза Іїе Торг - 485 490 495 б5
ТВ Рко АБр Рго Тих Тс Ап одДіа бек пес цес Тйх Буб5 Гей біп Аза
Й 500 505 510 біп Азп біл Тер оБей біп Ар Мес ТК тат Ні Геч ТЗе Ге АБ беї 515 520 525 7 Рпе Був біс Ре Пец 51п бек бех Пец Аго А1а Гей Ако біп Меє 530 535 540 (2) Інформація для ЗЕО ІЮО Мов: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 471 амінокислота (В) Тип: амінокислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (І) Тип молекули: пептид (ХІ) Опис послідовності: 5ЕО ІЮ Мов
Claims (1)
- Формула винаходу с о1. Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-б (ві! -6К) - інтерлейкіну-б (1-6) (8ІЇ/-6КЛІ-6), що включає злитий білковий продукт, отриманий шляхом злиття природної форми зі! -6К і природної форми 1! -6, де обидві форми глікозильовані в такий спосіб, як і природні форми зі! -6К і 1-6.2. Химерний білок в8іЇ-6КЛІ-б за п. 1, який відрізняється тим, що вказаний 5іЇ/-6К злито з 1ІІ/-6 через «- молекулу пептидного лінкера. счЗ. Химерний білок 5І/-6КЛІ-б за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний лінкер є дуже коротким неімуногенним лінкером, який складається приблизно з З амінокислотних залишків. о4. Химерний білок 5іІ/-6КЛІ-б за п. З, який відрізняється тим, що вказаний лінкер є трипептидом ю послідовності Е-Р-М (СІш-Рпе-Мед.5. Химерний білок ві! -6КЛІ-б за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний лінкер є пептидом, який - складається Кк! 13 амінокислотних залишків послідовності Е-Е-0-А-(0-Ї -М-| -(5-(3--Е-М (Сіш-РПпе-СІу-АЇІа-С1у-І еи-Ма!І-Ї ен-СіІу-стіу-СІп-Рпе-Мею.б. Химерний білок віІ/-6К/ЛІ-б6 за будь-яким з пп. 1-4, позначений тут як 8І/-6К 5МаЛІ-6б, що включає « трипептидний лінкер послідовності Е-Р-М між С-кінцевим МаІ-356 в 8І/-6К і М-кінцевим Рго-29 в ІІ/-6К, де вказаний химерний білок має послідовність, показану на фіг. 3. в)с 7. Химерний білок віЇ-6КЛІ-6б за будь-яким з пп. 1, 2 і 5, позначений тут як 5ІЇ/-6К 5Май/-б, що містить "» пептидний лінкер, що складається з 13 амінокислот послідовності Е-Б-5-А-0-Ї -М-| -(5-(3-0-Е-М, між С-кінцевим " Ма!І-356 у ві! -6К і М-кінцевим Рго-29 в ІІ-6К, де вказаний химерний білок має послідовність, показану на фіг. З, де трипептид послідовності Е-Р-М у положеннях 357-359 на фіг. З замінений вказаною пептидною послідовністю, яка складається з 13 амінокислот.це. 8. Химерний білок 5іІ/-6КЛІ-б за п. 1, позначений тут як ІІ -6/51Ї-6К, що включає повну послідовність «сл І/-6, що передує послідовності 85і/-6К, і пептидний лінкер, що складається з 14 амінокислот послідовності б-05-5-5-0-Р-(3-05-(5-(05-0-(3-Р-5 (5ЕО ІЮ Мо 6), між С-кінцевим Меї-212 в 1І -6 і МаІ-112 в ві! -6К, де химерний білок о має послідовність, показану на фіг. 11. ко 20 9. Химерний білок в5іІЇ/-6КЛІ-б за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що вказаний білок продукують в клітинах ссавців у повністю процесованій формі. ть 10. Химерний білок віІ-6КЛІ -6 за п. 9, який відрізняється тим, що вказаний білок продукують в клітинах людини.11. Химерний білок віІ-6КЛІ -6 за п. 9, який відрізняється тим, що вказаний білок продукують в клітинах 22 яєчника китайського хом'яка (СНО). ГФ) 12. Химерний білок віЇ-6КЛІ-б за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що вказаний химерний білок має здатність інгібувати ріст надзвичайно злоякісних ракових клітин. о 13. Химерний білок вії -6КЛІ -6 за п. 12, який відрізняється тим, що вказаний химерний білок має здатність інгібувати ріст надзвичайно злоякісних меланомних клітин. 60 14. Химерний білок віІЇ/-6К/ЛІ-б за пп. 1-11, який відрізняється тим, що вказаний химерний білок має здатність стимулювати іп мімо приживлюваність клітин кісткового мозку людини при трансплантації кісткового мозку.15. Химерний білок віЇ-6КЛІ-б за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що вказаний химерний білок має здатність захищати печінку від гепатотоксичних речовин. бо 16. Послідовність ДНК, що кодує химерний білок зі! -6КЛІ -6 за будь-яким з пп. 1-11.17. Вектор ДНК, який містить послідовність ДНК, що кодує химерний білок 5іІ/-6КЛІ-6 за будь-яким з пп. 1-11, де вказаний вектор може використовуватися для експресії вказаного химерного білка в клітинах ссавців.18. Вектор ДНК за п. 17, який відрізняється тим, що вказаний вектор може використовуватися для експресії зазначеного химерного білка в клітинах людини.19. Вектор ДНК за п. 17, який відрізняється тим, що вказаний вектор може використовуватися для експресії вказаного химерного білка в клітинах СНО.20. Вектор ДНК за пп. 17-19, який відрізняється тим, що, коли вказаний вектор експресований в клітинах ссавців або людини, експресований химерний білок має послідовність, яка дозволяє повністю процесувати 7/0 химерний білок клітинами ссавця або людини і секретувати повністю процесований химерний білок з клітин в культуральне середовище, в якому вирощуються вказані клітини.21. Вектор ДНК за будь-яким з пп. 17-20, який відрізняється тим, що зазначений вектор є плазмідою, що позначається тут як рсОМАвіІ -6КЛІ-6, яка включає вектор рсОМАЗ, що містить послідовність ДНК, що кодує химерний білок зіЇ -6КЛІ -6 під контролем промотору цитомегаловірусу (СММ).22. Вектор ДНК за будь-яким з пп. 17-20, який відрізняється тим, що вказаний вектор є плазмідою, позначеною тут як рсОМАЗ віЇ-6КЛІ-6, яка включає вектор рсОМАЗ з послідовністю ДНК, що кодує химерний білок віІІ -6КЛІ -6 під контролем промотору цитомегаловірусу (СММУ), і де у вказану послідовність ДНК, що кодує вказаний химерний білок зіІ-6КЛІ -6, введена лінкерна послідовність, що кодує пептидний лінкер в сайті Есокі, розташованому між послідовністю, яка кодує частину ві! -6К, і послідовністю, яка кодує частину ІІ -6 білка.23. Трансформовані клітини ссавців, що містять вектор ДНК за будь-яким з пп. 17-22, які здатні експресувати послідовність химерного білка віІ-6КЛІ-6, носієм якої є вказаний вектор, повністю процесувати експресований білок і секретувати його в культуральне середовище, в якому вирощуються вказані клітини.24. Трансформовані клітини за п. 23, які відрізняються тим, що вказані клітини є вищеописаними клітинами нирки ембріона людини 293 (НЕК293), трансфекованими вектором рсОМА зії -6КЛІ -6, де вказані клітини здатні сч об експресувати химерний білок зіІ-6КЛІ-6, повністю процесувати вказаний білок і секретувати вказаний білок у культуральне середовище, у якому ростуть вказані клітини, у вигляді глікопротеїну з молекулярною масою біля і) 85 кДа.25. Спосіб одержання химерного білка за будь-яким з пп. 1-14, що передбачає вирощування трансформованих клітин за п. 23 або 24 в умовах, придатних для експресії, процесування і секреції вказаного «- білка або його аналогів в культуральне середовище, у якому ростуть вказані клітини, ії очищення вказаного білка від вказаного культурального середовища. с26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що очищення здійснюють імуноафінною хроматографією, с використовуючи моноклональні антитіла, специфічні відносно вії -6К.27. Застосування химерного білка взіЇ -6КЛІ -6 за будь-яким з пп. 1-11 для одержання лікарського засобу для о лікування раку шляхом інгібування ракових клітин ссавців. ї-28. Застосування химерного білка за будь-яким з пп. 1-11 для одержання лікарського засобу для поліпшення приживлюваності клітин при трансплантації клітин кісткового мозку шляхом стимуляції приживлюваності клітин кісткового мозку людини.29. Застосування химерного білка взіЇ -6КЛІ -6 за будь-яким з пп. 1-11 для одержання лікарського засобу для « стимуляції кровотворення. з с 30. Застосування химерного білка віЇ -6КЛІ -6 за будь-яким з пп. 1-11 для одержання лікарського засобу для лікування захворювань печінки. ;» 31. Застосування химерного білка віЇ -6КЛІ -6 за будь-яким з пп. 1-11 для одержання лікарського засобу для лікування неврологічних захворювань.32. Фармацевтична композиція, що містить як активний інгредієнт химерний білок зіЇІ -6КЛІ -6 за будь-яким з -І пп. 1-11 і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач.33. Фармацевтична композиція за п. 32 для лікування різних видів раку. о 34. Фармацевтична композиція за п. 32 для поліпшення приживлюваності клітин при трансплантації оо кісткового мозку.35. Фармацевтична композиція за п. 32 для лікування хвороб печінки. ю 36. Фармацевтична композиція за п. 32 для лікування неврологічних порушень. як 37. Фармацевтична композиція за п. 32 для поліпшення кровотворення. Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL12128497A IL121284A0 (en) | 1997-07-10 | 1997-07-10 | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
| PCT/IL1998/000321 WO1999002552A2 (en) | 1997-07-10 | 1998-07-09 | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA75321C2 true UA75321C2 (uk) | 2006-04-17 |
Family
ID=11070372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2000020719A UA75321C2 (uk) | 1997-07-10 | 1998-09-07 | Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-6/інтерлейкіну-6 (sil-6r/il-6), застосування даного злитого білка для одержання лікарського засобу для лікування раку, захворювань печінки, неврологічних захворювань, для стимуляції кровотворення, для поліпшення приживлюваності клітин кісткового мозку при його трансплантації та фармацевтична композиція, що його містить |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| IL (1) | IL121284A0 (uk) |
| UA (1) | UA75321C2 (uk) |
| ZA (1) | ZA986145B (uk) |
-
1997
- 1997-07-10 IL IL12128497A patent/IL121284A0/xx unknown
-
1998
- 1998-07-10 ZA ZA986145A patent/ZA986145B/xx unknown
- 1998-09-07 UA UA2000020719A patent/UA75321C2/uk unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL121284A0 (en) | 1998-01-04 |
| ZA986145B (en) | 1999-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7087047B2 (ja) | 改変されたインターロイキン－７タンパク質およびその使用 | |
| EA004793B1 (ru) | Химерный белок растворимого рецептора интерлейкина-6/лиганда, его аналоги и способы применения | |
| JP5590788B2 (ja) | α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療 | |
| JP5558213B2 (ja) | 貧血の予防および治療用の方法および組成物 | |
| CN100467488C (zh) | Il-7融合蛋白 | |
| ES2281704T3 (es) | Procedimientos y compuestos para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas. | |
| US7304150B1 (en) | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia | |
| US20110200562A1 (en) | Chimeric Cytokine of IL-7 and Beta Chain of HGF and Methods of Use | |
| PT95524B (pt) | Novos factores poliptidicos com actividade estimuladora de celulas indiferenciadas, processo para a sua preparacao e para a preparacao de composicoes farmaceuticas que os contem | |
| BRPI0814465B1 (pt) | Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica | |
| JP2003530874A (ja) | 貧血の予防及び治療用の方法及び組成物 | |
| CN102816242A (zh) | 在体内具有延长的半衰期和增强的红细胞生成活性的重组人EPO-Fc融合蛋白 | |
| CA2311681A1 (en) | Human interferon-epsilon: a type i interferon | |
| RO117110B1 (ro) | POLIPEPTIDA LIGAND mpl, ACID NUCLEIC, CARE O CODIFICA, VECTOR DE EXPRESIE, PROCEDEU PENTRU PRODUCEREA POLIPEPTIDEI LIGAND, SI COMPOZITIE FARMACEUTICA CU ACEASTA | |
| JPH04501421A (ja) | 血小板産生刺激薬剤のためのｉｌ―７の使用 | |
| CA2149763A1 (en) | Progenitor b cell stimulating factor | |
| CN106397569B (zh) | 一种治疗代谢疾病的突变细胞因子融合蛋白 | |
| DE69524093T2 (de) | Kombination von prokoagulans und cytokin oder induktor seiner produktion für die behandlung von tumoren | |
| JP4280444B2 (ja) | 腫瘍性細胞成長阻害のための組成物及び方法 | |
| UA75321C2 (uk) | Химерний білок розчинного рецептора інтерлейкіну-6/інтерлейкіну-6 (sil-6r/il-6), застосування даного злитого білка для одержання лікарського засобу для лікування раку, захворювань печінки, неврологічних захворювань, для стимуляції кровотворення, для поліпшення приживлюваності клітин кісткового мозку при його трансплантації та фармацевтична композиція, що його містить | |
| RU2186783C2 (ru) | Кроличья антисыворотка, ингибирующая транспорт катионных аминокислот, и содержащая ее фармацевтическая композиция | |
| JP3646927B2 (ja) | 生体内血小板増殖効能が向上した新規なヒトトロンボポイエチン誘導体 | |
| CN100460015C (zh) | 免疫调节剂及其应用 | |
| CN112724263B (zh) | 改造抗cd20单克隆抗体以提高其药物疗效的方法及其应用 | |
| JP2002529516A (ja) | ＣＤ６６ａを用いて新脈管形成に影響を及ぼす方法 |