UA47410C2 - Спосіб стереоселективного відновлення за участю мікроорганізмів та штам мікробактерій - Google Patents

Спосіб стереоселективного відновлення за участю мікроорганізмів та штам мікробактерій Download PDF

Info

Publication number
UA47410C2
UA47410C2 UA97020723A UA97020723A UA47410C2 UA 47410 C2 UA47410 C2 UA 47410C2 UA 97020723 A UA97020723 A UA 97020723A UA 97020723 A UA97020723 A UA 97020723A UA 47410 C2 UA47410 C2 UA 47410C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
fact
hydrogen
nutrient medium
mishorasiegisht
mentioned
Prior art date
Application number
UA97020723A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Мішель М. Шартрен
Шіх-Шунг Том Чен
Джордж М. Герріті
Брайєн Хеймбуш
Крістофер Роберж
Алі Шафі
Original Assignee
Мерк Енд Ко., Інк.
Мерк Энд Ко., Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Енд Ко., Інк., Мерк Энд Ко., Инк. filed Critical Мерк Енд Ко., Інк.
Publication of UA47410C2 publication Critical patent/UA47410C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід відноситься до способу стереоселективного відновлення фенілалкілкетонів до відповідних ним (S)-гідроксисполук. Для здійснення хірального відновлення використовується мікроорганізм Microbacterium MB 5614. Винахід також відноситься до нового мікроорганізму Microbacterium, який депонований АТСС під інвентарним номером АТСС 55557.

Description

Опис винаходу
Лейкотриеньії составляют группу локально действующих гормонов, продуцируемьх в живьїх системах из 2 арахидоновой кислотьі!. Основньмми лейкотриенами являются лейкотриен В у (сокращенно І ТВ/), І ТС, 1 ТО и
ЇТЕл. Биосинтез зтих лейкотриенов начинается с воздействия фермента 5-липоксегиназьі на арахидоновую кислоту с продуцированием зпоксида, известного как лейкотриен А); (ІТА/), которьій последующими ферментативньми стадиями превращается в другие лейкотриень!. Детали биосинтеза, так же, как и метаболизм лейкотриенов, излагаются в книге І еиКоїгіепез апа І Ірохудепазез, ей. у). КоКкасі, ЕІземіег, Атзіегдат (1989). 710 Действиє лейкотриенов в живьх системах и их участие в различньїх болезненньїх состояниях также обсуждаются в книге под ред. У. КокКасп.
В патенте США 5270324 сообщается о классе антагонистов лейкотриенов хинолинового типа, подгруппой являются соединения, имеющие общую формулу (І)
СОо.н 15 Ї
Ге
АІК
20 й |Ї ве гЗ 4 ре г. ЖЕ
М ше ве й ра с щі 6) в которой КУ, В", в частности, представляют собой водород или галоген; и КЗ может представлять собой сов, СОЯ или с(ке-ОН: В может представлять собой водород или низший алкил, и КУ может представлять собой низший алкил; о 30 и АГ К представляет собой, например, циклопропил-1,1-(бис)-метилен, изопропил и т.п.
В опубликованной заявке на европейский патент 604114 также описьіваются антагонисть! лейкотриенов, к «- которьїм относятся соединения, имеющие общую формулу (ІЇ) « сон й 35 « ке « - ін е - с я ч 9
І» Кк ре в которой РУ ВВ, си АК имеют вьшеупомянутье значения, г» (5)-Гидроксисоединения. формульі (ІІ) (см. ниже) являются промежуточньми соединениями при синтезе -1 соединений формуль! (І) и формуль! (ІІ). Соединения формуль! (ЇЇ) могут бьіть полученьі из соответствующих кетонов формуль (ІМ) (см, ниже) при использований хирального восстановителя, такого как
Її диизопинокамфенилхлорборан. Химическое хиральное восстановлениєе, как правило, требует применения шу 50 Ддорогостоящих хиральньх восстановителей; следовательно, существует необходимость в альтернативном способе получения хиральньїх соединений формульї (Ії), которьій может бьіть более зкономичньїм и/или более «2 удобньїм, чем химический способ.
Настоящее изобретение относится к стереоселективному способу восстановления - фенилалкиолкетана до соответствующего (5)-гидроксипроизводного, которьй включает контактирование // упомянутого фенилалкилкетона с Місгорасіегішт МВ5614, депонированного как АТСС 55557 или с его мутантом или его о вариантом. Настоящее изобретение также относится к биологически чистой культуре Місгорасіегішт МВ 5614 (АТСС 55557), или его мутанта или его варианта. ко С одной сторонь), настоящее изобретение относится к стереоселективному способу восстановления фенилалкилкетона до соответствующего (5)-гидроксипроизводного, которьій включает приведение в контакт 60 упомянутого фенилалкилкетона с Місгорасіегішт МВ 5614, депонированного как АТСС 55557, или с его мутантом или его вариантом.
Конкретнее, настоящее изобретение относится к способу б5
Е й А (ф он вз свй - і (в) (З которьій включает реакцию соединения формульі (ІМ)
Е! - д || о в р
М Ш- р с Місгорасіегішт МВ 5614, имеющего определяющие признаки АТСС 55557, или с его мутантом или его вариантом; где А представляет собой -СН-АСН-5- или -«СНАСН-СНАСН; с
В и В, независимо, представляют собой водород или галоген;
ВЗ представляет собой СО2В9, СОБ5 или С(В 7)5-0-88; о 25 представляет собой водород или низший алкил;
В" представляет собой низший алкил; и
ЕЗ представляєт собой водород или группу, защищающую гидроксильную группу. о
В предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой -«СНАСН-СН-АСНЯ-, один из «ч-
В и В2 представляєт собой водород, а другой представляет собой галоген, и КЗ представляет собой СОН,
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой -«СНАСН-СН-АСН-, ч один из В! и 2 представляет собой СО2ОН». М.
С другой стороньі, настоящее изобретение относится к биологический чистой культуре микроорганизма «
Місгорасіегічт МВ 5614, имеющего определяющие признаки АТСС 55557, или его мутанта или его варианта.
Аббревиатурь! и определения
В настоящей заявке. если нет иньїх указаний, употребляются аббревиатурь! и определения, перечисленнье ниже. « 20 ЕАВ-М5 - масс-спектрометрия при бомбардировке бьістрьіми атомами; ш-в
ВЗЖХУХ (НРІ С) - вьісокозффективная (вьісокого давления) жидкостная хроматография; с МЕЗ - М-морфолинозтансульфоновая кислота; :з» МО - мононатрийглутамат;
ЯМР - ядерньй магнитньй резонанс;
ТХе - тонкослойная хроматография; їз УФ - ультрафиолет. "Алкил" обозначает линейньсе, разветвленнье и циклические структурь и их сочетания. - "Низший алкил" означает алкильнье группьї, содержащие 1-7 атомов углерода. Примерами низших їз алкильньїх групп являются метил, зтил, пропил, изопропил, бутил, втор- и трет-бутил, пентил, гексил, гептил, 5р /Чиклопропил, циклобутил, циклопентилметил, циклогексил и подобньсе группь. - "Галоген" включает фтор, хлор, бром и йод. о "Группа, задищающая гидроксильную группу" может представлять собой, например, простую зфирную группу, такую как метоксиметил, тетрагидропиранил, зтоксизтил, трихлорзтил, трет-бутил, аллил, бензил, триметилсилилатил, дифенилметил и трифенилметил; простую силильную зфирную группу, такую как вв Триметилсилил, диметилизопропилсилил, трет-бутилдиметилсилил и трет-бутилдифенилсилил; сложную зфирную группу, такую как формил, трихлорацетил, бензоил и трифторацетил; карбонатную группу, такую как (Ф. трихлорзтил, бензил и аллил. Другие группьі, подходящие для защить! гидроксильной группьі, можно найти в
ГІ известной литературе, например, в Ргоїесіїме Сгоцрз іп Огдапіс Зупіпезів, Сгееп апа МУУців, Едз., 1991, допп
УМіеу 5 5опв, Іпс, МУ, во Полезность
Соединения формуль! (Ії) являются промежуточньми соединениями при получении антагонистов лейкотриенов формул (І) и (І); получение таких антагонистов лейкотриенов с использованием таких промежуточньїх соединений описьіваєтся в патенте США 5270324 и в опубликованной заявке на европейский патент 604114, а также в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке в США с ди / Бегистрационньм номером 08/17493Ї. Соединения формул (І) и (ІІ) пригодньї в качестве противоастматических, противоаллергических, противовоспалительньїх и защитньїх для клеток лечебньх средств.
Получение субстрата
В способе настоящего изобретения для микробного хирального восстановления кетонов субстрать! для
Місгорасіегішт - соединения формульї (ІМ) - могут бьіть полученьі в соответствии со способами, известньіми в технике. Так, получение соединений формуль (ІМ), в которьх А представляєт собой -«СНАСН-СНАСН-і описьіваєется в патенте США 5270324; а получение соединений формульї (ІМ), в которьїх А представляет собой -8-СН-АСНУ-, описьівается в опубликованной заявке на европейский патент 604114.
Описание микроорганизма
Місгорасіегішт МВ 5614 вьіделяли из образцов почвьі), собранньх на поле в мемориальном парке 7/0 Санта-Роза, пров. Гуанакасте, Коста-Рика. Поле подвергалось огневой очистке за 48 часов до отбора образцов.
Образец культурь! депонирован, по Будапештскому соглашению, в Американской коллекции типовьїх культур,
Роквилл, Мзриленд, как АТСС 55557, и в коллекции культур ресурсов микроорганизмов. Мерк (Мегк Місгобіаї
Кезоцгсез Сийшге СоІесіоп), Капулау, Нью-Джерси, как МВ 5614.
В следующем далее описаний наблюдения за ростом и основньіми признаками культур осуществлялись так, /5 Как описано в Сиге и Кеддаїє, 1969, Меїйодзв Рог Могрпоіодіса! Ехатіпайоп ої Аегоріс Согупегогт Васіегіа, в
Воага апа ІомеїосКк (едіюгв), Затріїпа-Місгоріоіодіса! Мопйогіпд ої Епумігоптепів, Асадетіс Ргезв, Іопаоп, рр. 123 - 135. Утилизацию источников углерода проводят в соответствии с описанием Катадаїйа и Зигикі, 1986, в
Зпеафй, Р.Н., М.5. Маїп, М.Е. 5пагре, апа 9.0. Ноїї (едйогв), Вегдеуз Мапиаі! ої Зузіетаїйіс Васіегіоіоду,
М.І, рр. 1314. Другие физиологические испьтания проводят так, как описано в допев5, 1375, А Митегіса! 2о Тахопотіс Зішау ої Согупетгт апа Кеїа(ей Васіегіа, у. Сеп. Місгоріоі. 87: 52 - 96. Анализ клеточньїх стенок осуществляют, используя методь І еспемаїйег и І еспемаїіег, 1980, Тне Спетоїахопоту ої Асііпотісей(ез, в Оівї?,
А.,, апа О.МУ. Тпауег (еййогв), Асііпотусевз Тахопоту, Зосіеїу ог Іпдисігіаї Місгоріоіоду, Агіпдіоп, МА. рр. 225 - 291; и Оспіда и Аїда, 1984, Ап Ітргомей Меїйод Рог Те Сіусоїаїе Теві Рог бітріеє Ідепійісайоп ої Асу)
Туре ої Васіегіаї Се! УМаїЇїв, У. Сеп, Аррі. Місгоріо!ї 30: 131 - 134. Анализ менахинонов проводят по методу сч Нігаївпі ей а), 1992, Карій Ргойіпу ої Васіепа! Оціпопез Ву Тмо-Оітіпвіопа! Тпіп-Гауег Спготаїйоадгарпу,
Ї енег іп Аррі. Місгобіо!ї. 14: 170 - 173. Анализ жирньїх кислот осуществляют по методу МіМПег и Вегдег, 1985, і)
Немес-Раскага Арріїсайоп Моїе, рр. 228 - 241, Неміей-РаскКага Со., Раю А, СА.
Морфология клетки. Неподвижная, грамположительная, плеоморфная "палочка" (1,14 х 0,38мМкмМ) с булавовидной морфологией. Первичное ветвление происходит во время цикла роста, но без продуцирования о Ммицелиев. Не происходит четкого цикла развития палочка-кокк. Зндоспорьії не продуцируются.
Культуральнье и физиологическиє признаки. Мезофильньй, причем рост происходит при 289С и 3790. (57
Термоустойчивьй, вьживающий после нагревания в течение 30 минут при 6б0"С. Строгий азроб, «І каталазоположительньй, оксидазоотрицательньй. Метаболизм, главньім образом, газовьй; хотя он может бьіть также ферментативньм. Кислота продуцируется на целлобиозь!і, фруктозь!ї, галактозьі, ЮО-глюкозь!і, глицерина, т маннозьі, мальтозьі), Ю-рибозьі, сахарозьі, трегалозьі и О-ксилозьі, но не из Ю-арабинозьі, инозита, лактозьії, «Ж мелибиозьі, Ю-рафинозьі, рамнозьії, растворимого крахмала, Ю-сорбита, І -сорбозьі или І-ксилозьі. Желатин гидролизуется в малой степени, но хитин, крахмал, казеин, мочевина или целлюлоза не гидролизуются.
Питание комплексное, причем рост происходит на средах на основе пептона. На средах на основе пептона « колоний составляют 1 - Змм в диаметре, желтье по цвету, прозрачнье, растут и имеют неповрежденньй край.
Поверхность блестит, а текстура мукоидная. Пигментьї, способнье диффундировать, не продуцируются. - с Химия клеточньїх стенок. Диаминокислотой в клеточной стенке является лизин. Также присутствуют глицин, ц аланин и глутаминовая кислота. Тип клеточньїх стенок более всего подобен Ва. Основньм сахаром клеточньйх "» стенок является рамноза, наряду с маннозой, рибозой и не идентифицированньїм сахаром (Галактоза - 0,75), которье все присутствуют в более низких концентрациях. Основньмми менахинонами являются МК1О и МК11.
Основньми жирньіми кислотами являются 15:0антеизо, 17:Оантеизо и 16:0изо, ьч Хемотаксономические исследования показьшвают, что МВ 5614 принадлежит к роду Місгорасіегіит; однако, сравнение признаков роста и типов углеводного брожения не дает совпадения с шестью признанньми на - сегодняшний день видами зтого рода (табл.1). На оснований зтого предполагается зтот штамм расположить как ьч новьій вид Місгорасіегіцт сатродцетавдоепзвів. - о
Продуцированив лютих 00 з пиши: не нн нн Я о С важ юю 111100 брибонуювеопгі///// 1111117 неолоу нин не нн т нн Я во нини зни я ПО ПО: б5 С юаі1104103
І-сорбозь - - - -
Сом, 01 вою, 111101 тео юн
С меливюю 00310; еот вн
С рав така 3 вою 11111050 лес варю ю пиши не Не По ПО: пд 00000000 явна 1 вою; в 11043 ав ет, і жала! 31ю1111ю111111гизму мою 0300 чес. есе, овен, 6111
Продуцированивкислотьиз сч 0 мові 00000010; о пиши: нн нин НЯ
С офюю00000005413 нини нн НИ З НА о зо вн - - м нн нн НИ З А з 1111111 вою з нин нн НИ З НА « о З с- 111100омелибиояні////юнеоі///- :» С вмюм0000111013000воюх
С рт какая 1111110 жест й щ дю
В г я. - ж 1174 о пиши нн нин Я манною
С вис 1. Даннье взять из МЖоКоїа еї а). 1993, Ргорозаі ої їмо пем/ зресіез ої Ше депиз Місгорасіегіит:
Ф) Місгорасіегішт дехігапоїуїйсит зр. пом. апа Місгорасіегіцт ацгит звр. пом. Іпі 3. Буві. ВасіегіоЇї. 43(3): 549 ка - 554; и из Соїїпз апа Кедаїє 1986, в Зпеайфй, Р.Н., М.5. Наїг, М.Е. Зпагре апа 9.0. Ної (едіюгв), Вегдеу 5
Мапцчааї! ої Зувіетаїйіс Васіегіоіоду, М.І, рр. 1320 - 1322. во 2. Данньсе взять из Мокоїа еї аї. 3. Положительньсе даннье у Соїпз апа Кедаїєе
Не опр. - не определялось
Изм. - изменчивне результать.
Описание способа 65 Штамм Місгорасіегішт может бьіть вьіращен в обьічной среде, содержащей известнье источники питания для роста бактерий, т.е. усвояемье источники углерода и азота, с добавлением необязательньх неорганических солей и других известньїх факторов роста. Культуру виіращивают, предпочтительно, в азробньх условиях при погружении; однако, для культивирования в небольших масштабах можно также использовать поверхностнье культурь! и микробиологические матрасьі. Обьічнье процедурьі, применяемьсе для виіращивания других бактерий, применимь! в настоящем изобретении.
Питательная среда, используемая для культивирования Місгорасіегійт, должна содержать соответствующий усвояемьй источник углерода, такой как глюкоза, фруктоза, сахароза и целлюлоза. В качестве источника азота могут использоваться хлорид аммония, сульфат аммония, мочевина, нитрат аммония, нитрат натрия, глутамат натрия и т.п., либо по отдельности, либо в сочетаниий с органическими источниками /о азота, такими как пептон, мясной зкстракт, дрожжевой зкстракт, кукурузньй зкстракт, соевая мука, хлопковое масло и т.п. При необходимости также могут добавляться питательнье неорганические соли, чтобьі обеспечить источники натрия, калия, кальция, аммония, фосфата, сульфата, хлорида, бромида, карбоната, цинка, магния, марганца, кобальта, железа и подобньїх составляющих.
Місгорасіегіцт можно вьіращивать при любой температуре, подходящей для удовлетворительного роста, /5 например, при 25 - 40'С, и найболее удобно осуществлять процесс при температуре 27 - 32"С. Если ферментация должна осуществляться в бродильньх чанах, желательно использовать растительньй инокулят в питательном бульоне из культурь! на косячке агара или лиофилизованной культурьі. После получения активного инокулята таким способом, его стерильно переносят в сбраживаемую среду в бродильньй чан. Возбуждение в бродильном чане обеспечивается перемешиванием, а азрация может бьіть осуществлена путем подачи воздуха
Мли кислорода в перемешиваемую смесь.
В одном из вариантов осуществления настоящего способа кетонньій субстрат (ІМ) приводят в контакт с
Місгорасіегішт вьращиваеємьм в водной питательной среде. Кетон может бьть добавлен к культуре
Місгорасіегіпт в любое время; но, предпочтительно, субстрат добавляют, когда образуется достаточная биомасса микроорганизма. Концентрацию биомассь! можно легко контролировать, например, путем измерения с г поглощения света образцом культурь, при 6бОнм с использованием спектрофотометра. Как правило, максимум биомассь! достигается Через З 5 суток после инокуляции. Процесс биоконверсий можно проконтролировать і) обьічньми способами, такими как ВЗЖХ, с последующим контролем спектров. Уровень стереоселективного восстановления продукта достигает максимального значения через З - 4 суток после добавления субстрата.
Биоконверсия кетонного субстрата до соответствующего (5)-гидроксисоединения может бьіть осуществлена о зо непрерьвно, например, в течение периода до 500 часов, при периодическом добавлений кетона. Полученное таким образом нужное (5)-гидроксисоединение может бьіть извлечено из ферментативного бульона любьм (87 способом, подходящим для такого извлечения и отделения; примерами такого способа являются зкстракция, «Е преципитания, хроматография и другие известньсе в технике традиционнье методь.
В другом варианте осуществления настоящего способа кетонньй субстрат приводят в контакт с ї- Місгорасіегішт на стадии покоя. Стадия покоя здесь означает, что микроорганизм не растет активно, но «г способен к нужному функционированию в буферном растворе в отсутствиий факторов, поддерживающих рост.
Покоящиеся клетки Місгорасіегішт получают, собирая растущие клетки Місгорасіегішт, например, путем центрифугирования; собраннье клетки также могут бьіть лиофилизованьі и затем сохраненьі при -80"С для будущего применения. Покоящиеся клетки используют в виде клеточной суспензиий в соответствующем « буферном растворе, таком как фосфатньй буферньй раствор или трис-буфер (рН б - 8). Кетон добавляют к.0/7-) с клеточной суспензии, и смесь инкубируют при температуре от 207 до 40"С, чтобьї осуществить восстановление.
К клеточной суспензии, необязательно, можно добавлять глюкозу, чтобьі улучшить зффективность ;» биоконверсии. Клетки, иммобилизованнье на подложке физической адсорбцией или захватом, также могут использоваться для способа хирального восстановления. Иммобилизации клеток можно достичь, используя обьічнье способьі, например, способ, описанньій в Кагзіеп, ., апа Зітоп, Н., Аррі. Місгор. Віоїесппої!., 1993, їх 38:441 - 446, и способьі, описаннье в цитированньх здесь ссьілках.
Следует иметь в виду, что для осуществления биотрансформации настоящее изобретение не ш- ограничивается конкретньім микроорганизмом, упомянуть!м вьіше, но включает использование его вариантов и ї5» мутантов, которье сохраняют способность восстанавливать кетоньі. Такие варианть! и мутанть! могут бьїть продуцированьі из родительского штамма с помощью различньїх средств, таких как рентгеновское излучение, - УФ-облучение, и химические мутанть, такие как М-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидин. о Приведеннье ниже примерь! даются, для более полной иллюстрации настоящего изобретения, и не должнь! рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом обьем настоящего изобретения.
Пример 1
Посевная культура Місгобасієгішт МВ 5614
Дают возможность 1,5-мл ампуле с замороженньім Місгорасіегішт МВ 5614 в среде 5О (состав приводится (Ф, ниже в примере 4) оттайвать при комнатной температуре, и затем переносят в колбу Зрленмейера емкостью ка 25Омл, содержащуюбо мл средь КЕ, содержащей (на литр средь!) 10г декстрина, во 5г ардамина рН,
Ббгамина МА типа Е,
Зг дрожжевого зкстракта, 1г декстрозьі, 0,37г КоНРО,, 65 0,05г Мао, 7Н2О, деионизованную воду, а.У., до 1л,
Маон до рН 71,
О,5г СасСо»,
Колбу инкубируют при 28"С в течение 24 час на круговой качалке при 220об/мин. Аликвоту культурь! из колбьі в 1,0мл затем используют для инокулирования 2-л колбьї Зрленмейера, содержащей 500мл средь! КЕ.
Колбу емкостью 2л инкубируют в течение 24 час при 28"С на круговой качалке при 220об/мин.
Пример 2
Биоконверсия метил-2-(3-(3-(2-(7-хлор-2-хинолинил)зтенил)фенил)-3-оксопропил)бензоата (далее назьваемого кетозфиром) до 70 метил-2-(3-(3-(2-(7-хлор-2-хинолинил)зтенил)фенил)-3(5)-гидроксипропил)бензоата (далее назьваемого гидроксизфиром) (способ А)
Аликвоту в 2мл посевной культурь примера 71 переносят в колбу с перегородками емкостью 250мл, содержащую 50мл биоконверсионной средь, в состав которой входят (на литр средь)): 20г глюкозь, бг соевой муки, 5г дрожжевого зкстракта,
Ббг масі, 9,в8г М-морфолинозтансульфоновой кислоть! (МЕ5), деионизованная вода, а.У., до Тл; рН доводят до 7,0.
Добавляют к среде раствор кетозфира (5мг) в ацетоне (0,5мл), и колбу инкубируют при 272С на качалке при 220об/мин, в темноте. Биоконверсию контролируют следующим образом. Отбирают из колбьї в различное время образцьі по їмл и смешивают с їмл изопропанола. Получающуюся в результате смесь после интенсивного перемешивания центрифугируют, и аликвоту супернатанта проверяют ВЗЖХ (аналитическая колонка 0О05-3, с МПаїтап Рапізії 10: злюент - линейньй градиент ацетонитрила в воде (5590 - 9590 за 30 минут); скорость потока 1мл/мин; температура колонки 457С), о
Пример З
Вьіделение и исследование гидроксизфира
После инкубации в течение 48 часов соединяют бульон от биотрансформации из 4 колб (всего 200мл), и Га») зо доводят рН до 6,0. Бульон центрифугируют (20мин при З3700об/мин), и извлекают супернатант. Осадок затем суспендируют в 150мл метанола, и перемешивают в течениє 30 мин в темноте. Полученную таким образом (387 суспензию центрифугируют, как упоминалось вьіше, и снова извлекают супернатант. Осадок зкстрагируют еще «ф раз, и супернатант присоединяют к супернатантам, извлеченньїм ранее.
Обьединенньй зкстракт смешивают ос оравньм ообьемом метиленхлорида, и, после знергичного в Встряхивания, извлекают метиленхлоридную фазу и сушат при пониженном давлении. Вьсушенньй остаток « наносят на полупрепаративную силикагелевую пластину, и пластину проявляют в системе растворителя - метиленхлориде. Проявленную ТХОС-пластину проверяют под УФ-светом, и сосредотачиваются на основной полосе УФ-поглощения с величиной Кі ниже, чем у субстрата. Соскребают силикагель с зтой площади, и тщательно зкстрагируют метиленхлоридом. Зкстракт концентрируют при пониженном давлений и фильтруют. «
Фильтрованньй зкстракт затем очищают несколькими впрьіскиваниями в полупрепаративную колонку ОО5-3 пт) с (94мм х 25см), МУпаїтап Рагіїзії 10. Зту колонку проявляют, используя обьічнье условия для аналитической ц колонки, за исключением того, что скорость потока составляет Змл/мин (см. пример 2), Обьединяют очищеннье "» ВОЗЖХ фракции, и тщательно зкстрагируют их метиленхлоридом. Метиленхлоридньй зкстракт сушат над
Ма»5зО); и концентрируют досуха в атмосфере азота, получают З,5мг сухого конечного продукта (прямое Количественное определение ВЗЖХ субстрата и продукта показьівает конверсию в 30-4095 по отношению ко ьч времени сбора культурьї). ЯМР и спектральньійй анализ РЕАВ-М5 показьвают, что продукт представляет собой метил-2-(3(5)-(2-(7-хлор-2-хинолинил)зтенил)фенил)-3-гидрокси)пропил)-бензоат, и хиральная хроматография - фракции, очищенной ВОЗЖХ, на колонке СпПігаїсе! ОО (злюент 9095 гексана/изопропанол; скорость потока ьч 2мл/мин; время удержания 17,9мин для (5)-гидроксизфира, 19,8мин для К-гидроксизфира) показьіваєт избьток шу 20 знантиомера в 9595.
Пример 4 с Биоконверсия кетозфира в гидроксизфир (способ Б)
Используют 10-мл аликвоту посевной культурьї примера 1 для инокуляции колбьї Зрленмейера емкостью 2,0л, содержащей 500мл производственной питательной средь! (среда 50), в состав которой входят (на литр средь)) о О,5г Ресі»з, 6НоО0,
Зог декстрозь, ко 20г мононатрий глутамата (МО), 9,8г МЕ5, во 5г дрожжевого зкстракта,
Ббг масі, деионизованная вода, д.у., до Тл (рн 7,0, маон)
Колбу инкубируют при 28"С на круговой качалке при 200об/мин.
После инкубации производственной культурь! в течение 5 суток добавляют кетозфир (250г, в виде раствора 65 25мг/мл в диметилсульфоксиде). На 8 и 9 сутки после инокуляциийи добавляют дополнительнье порции кетозфира (каждая по 250мг). Биоконверсия до гидроксизфира контролируют, проверяя концентрации кетозфира и гидроксизфира в культуре. Коротко, аликвоту культурального бульона зкстрагируют двумя обьемами зтилацетата. Затем зкстракт сушат в атмосфере азота и ресуспендируют в ацетонитриле, и раствора хроматографируют на ВЗЖХ-колонке 7ограх КХ-С8 (подвижная фаза - ацетонитрил в воде 10 - 9095, обе Пподкислень 0,12 НзЗРО,; скорость потока 1,5мл/мин). Время удержания (кетозфир) - 5мин; время удержания (гидроксизфир) - 12мин. Биоконверсия при зтих условиях продуцирует приблизительно 500мг/л гидроксизфира на 10 сутки после инокуляции, при скорости во время реакции приблизительно 100мг/(1 сутки).
Пример 5
Биоконверсия кетозфира до гидроксизфира с помощью покоящихся клеток Місгорасіегішт МВ 5614 70 Культуру Місгорасіегішт МВ 5614 вьтращивают по методике, описанной в примерах 1 и 2. Культуру в среде для биоконверсии инкубируют в течение 44 час при 282С на круговой качалке при 220об/мин, клетки собирают центрифугированием при 15000об/мин в течение 120мин. Получающийся в результате осадок промьівают три раза 0,1М фосфатньїм буфером, рН 7,2, лиофилизуют и хранят при -807С.
Клетки оттайвают, суспендируют в буфере, 4:5, г/обьем, и к клеточной суспензимй добавляют кетозфир 75 (5мг/0,бмл ДМСО). Смесь инкубируют при 117С. Биоконверсию проверяют так, как описано вьше. После инкубации в течение 40 часов наблюдают конверсию более 5095 (при определениий ВЗЖУ).
Добавление глюкозь (0,1М) к клеточной суспензии дает в результате конверсию приблизительно 6095 после 40-часовой инкубации.

Claims (9)

  1. Формула винаходу Способ получения соединения формульїі (ЇЇ) ве й (8) 7 с вн й 7 вх ЩІ У ІФ їй « ї- (й) Е М оту чающийся тем, что осуществляют реакцию соединений формуль (ІМ) « з ші с " ДА ! -й ї «У -І щ» - 50 - о (їх) с Місгорасіегіцт МВ 5614, депонированньім как АТОС 55557, или с его мутантом, где А представляет собой -«СНАСН-5- или -«СНАСН-СН-АСН-; В и В, независимо, представляют собой водород или галоген; і) ВЗ представляет собой СО2В9, СОБ5 или С(В 7)5-0-88; їмо) 25 представляет собой водород или низший алкил; В" представляет собой низший алкил; и 60 ЕЗ представляєт собой водород или группу, защищающую гидроксильную группу.
  2. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что А представляет собой -СНАСН-СН-АСН-; один из В! и 2 представляет собой водород, а другой представляєт собой галоген, и В? представляєт собой сов,
  3. З. Способ по п. 1, отличающийся тем, что А представляет собой -СН-СН-СНАСН-; один из 65 В! и 82 представляет собой водород, а другой представляєт собой хлор, и 2? представляет собой СОоСН».
  4. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутьй Місгорасіегішт культивируют в водной питательной среде, содержащей способнье к ассимиляции источники углерода и азота.
  5. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутьй Місгобрасіегічт находится в состояний покоя.
  6. 6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что упомянутая питательная среда дополнительно содержит Ресі».
  7. 7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что упомянутая питательная среда дополнительно содержит мононатрийглутамат.
  8. 8. Способ по п. 4, отгличающийся тем, что упомянутая питательная среда дополнительно содержит БеСіз и мононатрийглутамат.
  9. 9. Штамм Місгорасіегішт МВ 5614, депонированньй как АТСС 55557, или его мутанти.
    0. й й й 0. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2002, М 7, 15.07.2002. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. се що о (ав) «- «І ча «І -
    с . а т» -І т» - 70 «2 ко бо б5
UA97020723A 1994-07-20 1995-07-14 Спосіб стереоселективного відновлення за участю мікроорганізмів та штам мікробактерій UA47410C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/277,728 US5491077A (en) 1994-07-20 1994-07-20 Microbial method
PCT/US1995/008921 WO1996002657A1 (en) 1994-07-20 1995-07-14 Microbial method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA47410C2 true UA47410C2 (uk) 2002-07-15

Family

ID=23062121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA97020723A UA47410C2 (uk) 1994-07-20 1995-07-14 Спосіб стереоселективного відновлення за участю мікроорганізмів та штам мікробактерій

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5491077A (uk)
CN (1) CN1078249C (uk)
AU (1) AU3582595A (uk)
BR (1) BR9508320A (uk)
CZ (1) CZ16997A3 (uk)
FI (1) FI970183A (uk)
RO (1) RO119235B1 (uk)
RU (1) RU2188867C2 (uk)
SK (1) SK282257B6 (uk)
UA (1) UA47410C2 (uk)
WO (1) WO1996002657A1 (uk)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534422A (en) * 1995-05-19 1996-07-09 Merck & Co., Inc. Bioconversion of beta keto-ester to (R) hydroxyester
US5846791A (en) * 1996-07-22 1998-12-08 Merck & Co., Inc. N-(R)-(2-hydroxy-2-pyridine-3-yl-ethyl)-2-(4-nitro-phenyl)-acetamide
AR007739A1 (es) * 1996-07-22 1999-11-10 Merck & Co Inc Un proceso para la preparacion de n-(r)-(2-hidroxi-2-piridina-3-il-etil) -2-(4-nitro-fenil)-acetamida
US6898164B2 (en) * 2001-01-25 2005-05-24 Dphi Acquisitions, Inc. Close tracking algorithm in a digital tracking servo system
PL1818057T3 (pl) * 2006-02-09 2010-09-30 Teva Pharma Trwałe preparaty farmaceutyczne montelukastu sodu
CN101528917B (zh) 2006-10-02 2015-07-29 科德克希思公司 用于制备立体异构纯的他汀类及其合成中间体的组合物和方法
CN101627116B (zh) * 2007-02-08 2013-07-10 科德克希思公司 酮还原酶及其用途
CN101784669B (zh) 2007-08-24 2015-02-18 科德克希思公司 用于(r)-3-羟基四氢噻吩的立体选择性制备的改善的酮还原酶多肽
WO2009036404A2 (en) 2007-09-13 2009-03-19 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the reduction of acetophenones
ATE547513T1 (de) * 2007-09-28 2012-03-15 Codexis Inc Ketoreduktase-polypeptide und verwendungen davon
JP5646328B2 (ja) 2007-10-01 2014-12-24 コデクシス， インコーポレイテッド アゼチジノンの生産のためのケトレダクターゼポリペプチド
EP2329013B1 (en) * 2008-08-27 2015-10-28 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
WO2010025287A2 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
SG10201404330VA (en) 2008-08-29 2014-10-30 Codexis Inc Ketoreductase Polypeptides For The Stereoselective Production Of (4S)-3[(5S)-5(4-Fluorophenyl)-5-Hydroxypentanoyl]-4-Phenyl-1,3-Oxazolidin-2-One
EP2467473B1 (en) 2009-08-19 2016-03-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine
CN101899406B (zh) * 2010-04-27 2012-02-22 北京大学 一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用
US9040262B2 (en) 2010-05-04 2015-05-26 Codexis, Inc. Biocatalysts for ezetimibe synthesis
UA118331C2 (uk) 2011-07-25 2019-01-10 Монсанто Текнолоджи, Ллс Композиція та спосіб для боротьби з фузаріозом

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4943528A (en) * 1988-11-22 1990-07-24 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the production of optically active (R)-(-)-3-halo-1,2-propanediol
US5270324A (en) * 1992-04-10 1993-12-14 Merck Frosst Canada, Inc. Fluorinated hydroxyalkylquinoline acids as leukotriene antagonists
CA2111372C (en) * 1992-12-22 2007-01-16 Robert N. Young Diaryl 5,6-fusedheterocyclic acids as leukotriene antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
CN1153534A (zh) 1997-07-02
AU3582595A (en) 1996-02-16
BR9508320A (pt) 1998-01-06
RO119235B1 (ro) 2004-06-30
FI970183A0 (fi) 1997-01-16
US5491077A (en) 1996-02-13
SK282257B6 (sk) 2001-12-03
SK6697A3 (en) 1997-08-06
FI970183A (fi) 1997-01-16
CN1078249C (zh) 2002-01-23
CZ16997A3 (en) 1997-06-11
RU2188867C2 (ru) 2002-09-10
WO1996002657A1 (en) 1996-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA47410C2 (uk) Спосіб стереоселективного відновлення за участю мікроорганізмів та штам мікробактерій
KR940005654B1 (ko) L-2-아미노-4-(히드록시메틸 포스피닐)-부티르산의 제조방법
US5427933A (en) Reduction of phenylalkyl ketones to the corresponding (S)-hydroxy derivatives using mucor hiemalis IFO 5834
IL34956A (en) Production of lipase
JPS6121097A (ja) ７−アミノセフアロスポラン酸及びその誘導体の製造法
DK165191B (da) L-carnitin-producerende mikroorganismer samt fremgangsmaade til fremstilling af l-carnitin under anvendelse af mikroorganismerne
DK165124B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af en 5-hydroxy-s541-macrolidforbindelse
US7078223B2 (en) Process for the preparation of pseudomonic acid a antibiotic by microbiological method
US5407826A (en) Isolated cultures of microorganisms of Clonostachys Cylindrospora, Gliocladium and Nectria Gliocladioides
GB2031896A (en) A process for the optical resolution of D,L-2-amino-4- methylphosphinobutyric acid
US4973552A (en) Staurosporine fermentation process
US5108914A (en) Process for the synthesis of l-alpha-amino acids
US3884762A (en) Fermentation process for the preparation of ergot alkaloids
Kim et al. Taxonomy, fermentation, isolation and characterization of a herbicidal compound, 3D5
JP4439079B2 (ja) プラバスタチンの製造方法
JPS60114187A (ja) 新規微生物
DK144855B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af det antibiotiske stof sisomicin eller terapeutisk acceptable salte deraf
US5177007A (en) Process for producing optically active r-(+)-2,3-dichloro-1-propanol using microorganism
JPS6322799B2 (uk)
SU1705347A1 (ru) Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, предназначенный дл получени 2Ъ-дезоксиаденозина
AU620595B2 (en) Process for the preparation of macrolide compounds
JP3327982B2 (ja) 新規な抗生物質ｍｉ４８１−４２ｆ４−ａ関連物質
US4316957A (en) Process for the production of 7-deazaadenosine and 7-deazainosine
CA2051872A1 (en) Directed biosynthesis process for prolyl-immunomycin
MASUMA et al. Site of regulation of nanaomycin biosynthesis by inorganic phosphate