UA127445C2

UA127445C2 - Комбінація для лікування або профілактики метаболічного синдрому

Info

Publication number: UA127445C2
Application number: UAA201800030A
Authority: UA
Inventors: Чун Кук Кім; Чун Кук Ким; Йон Чін Парк; Йон Чин Парк; Ін Йон Чхой; Ин Йон Чхой; Сун Йоуп Чун
Original assignee: Ханмі Фарм. Ко., Лтд.; Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2023-08-30
Also published as: EP3322437B1; EP3322437A1; AR105485A1; JP2023062043A; US20180186853A1; EP4324519A2; CA2991107A1; PE20180449A1; KR20190092343A; EA201890058A1; CL2023001911A1; AU2016287209B2; PL3322437T3; PH12017502393A1; JP2018526333A; MA49545B1; CN108025041A; MA41887A1; US11667688B2; IL256619A

Description

М

1 обдати в. ї . Он шо вх : ак о в пек ок еф

ЗЕ «ІЙ Є СЯ з т а Щ : оте ях

Е . | М Ше ї Б «Й ї ох ще шо - . з ше

У

0 З Б 9 12 Г:

Чає (днів!) тем вхоріет «Б юпочаспо ехепофіяні депчайуе (33 птоуке «ее Іпдгаєнто депуане ої ЗБОЮ МО 12 16 птоїлко) о Ізвазасіно делуанме ог 5016 МО; 12 13.3 поко) я. іюопочаснто бепуайне 07 56010 МО; 12 16,6 птоуко) «і вле-айио ехепдів-Я депчабує (3.3 пек)»

Іопдучаєнйу дейманме ої 5030 МО: 12 0.5 птомко) «а. Юпоуаскно ехепої-Я деймацов (33 піпоикої»

Голечаєйо депчацме ої 5Е910-М0: 39133 птоіко) «ам |опочайпо ехепоіпт-Я депмацхе 33 вто»

Ісввчасіво дейчаєє о ЗЕ 10 МО: 13 (6.6 піпоїйко) «ме Дайте Теедіво (о пуаснну демо? 5ЕО МОХ 12 133 птойко)) «ще. раїтей Тевдіпо (о Іспухесио ехепдів-Я бвпуайуе (33 под

Іспточастійо чейчанме ої 5010 МО 12 33 птвійкв)

Фр

Винахід стосується похідної глюкагону, кон'югату тривалої дії цієї похідної та їх застосуванню.

Завдяки сучасному економічному зростанню та зміненням особливостей харчування стрімко зростає частота виникнення хвороб, пов'язаних з метаболічним синдромом, включаючи такі різні захворювання, як-то ожиріння, гіперліпідемію, гіпертонію, артеріосклероз, гіперінсулінемію, цукровий діабет та захворювання печінки. Ці хвороби можуть виникати незалежно, але здебільшого вони виникають у тісному взаємозв'язку між собою та супроводжуються різними симптомами.

Зокрема, згідно за даними Всесвітньої організації охорони здоров'я (МУНО), більш ніж один мільярд дорослих осіб у світі має надмірну вагу, причому понад три мільйони осіб серед них страждають на ожиріння з клінічної точки зору. Також слід зазначити, що щороку біля 250000 осіб у Європі та більш, ніж 2,5 мільйона осіб у світі гине через хвороби, пов'язані з надлишковою вагою.

Надлишкова вага та ожиріння є причиною зростання кров'яного тиску та рівнів холестерину в крові та ці чинники призводять до виникнення або до погіршення перебігу різних хвороб, як-то серцеві захворювання, цукровий діабет, артрит тощо. Крім того, проблема ожиріння також стає основною причиною збільшення випадків атеросклерозу, гіпертонії, гіперліпідемії або серцевих захворювань у дітей, підлітків та дорослих.

Хоча ожиріння є важким станом, який, як зазначено вище, спричинює появу різних хвороб у світі, все ж вважається, що його можна подолати особистими зусиллями та також вважається, що пацієнти з ожирінням втрачають самоконтроль. Проте слід зазначити, що ожиріння важко лікувати, оскільки воно є складною хворобою, пов'язаною з механізмами контролю апетиту та енергетичного метаболізму. Згідно з цим, лікування ожиріння потребує не тільки зусиль пацієнтів, які на нього страждають, але й також вимагає способу лікування аномальних механізмів, пов'язаних з контролем апетиту та енергетичним метаболізмом. Отже були здійснені зусилля по розробці лікарських засобів для лікування цих аномальних механізмів.

В результаті цього було розроблено ряд лікарських засобів, як-то Вітопабапі? (Запоїї-

Ауепіїв), Біршгатіп? (Аррої), Сопігаме? (ТаКеда), Опівіаї? (Боспе) тощо, але вони мають недоліки у вигляді важких побічних дій або дуже слабко впливають на ожиріння. Наприклад, згідно за доповіддю, у препараті Бітопарапі? було виявлено побічну дію у вигляді розладу центральної нервової системи, у препаратів б5іршігатіпе? та Сопігаме? було виявлено побічні дії, які зачіпали серцево-судинну систему та вживання препарату Огіїєта(? протягом року призвело до втрати лише приблизно 4 кг загальної ваги. Відповідно ці засоби не можуть вважатися лікарськими засобами проти ожиріння, які може бути безпечно призначено пацієнтам з цією недугою.

Багато масштабних досліджень було зроблено для розробки нових лікарських засобів проти ожиріння, застосування яких може подолати проблеми, притаманні традиційним лікарським засобам проти ожиріння. Нещодавно з цієї мети багато уваги було надано похідним глюкагону.

Глюкагон є продуктом підшлункової залози та утворюється у разі падіння рівнів глюкози в крові внаслідок дії інших медичних засобів чи захворювань або внаслідок гормональних або ферментативних недостатностей. Глюкагон надсилає сигнал, який запускає розкладання глікогену у печінці та наступне вивільнення глюкози та відіграє певну роль у зростанні рівнів глюкози в крові до нормальної величини. На додачу до ефекту збільшення рівнів глюкози в крові, глюкагон також пригнічує апетит та активує чутливу до гормону ліпазу адипоцитів для сприяння ліполізу, тим самим виявляючи дію, яка спрямована проти ожиріння. Проте, слід зазначити, що застосування глюкагону, як лікарського засобу є обмеженим, оскільки він має низьку розчинність та випадає в осад при нейтральному рн.

Відповідно, завдяки його активним властивостям щодо розкладання жиру та бета-окислення в печінці сам по собі глюкагон з покращеними властивостями може бути ефективно застосовано для лікування важкої гіпоглікемії, неалкогольного стеатогепатиту (МАЗН), дисліпідемії тощо.

Одну з похідних глюкагону, яка має назву глюкагоноподібного пептиду-і! ((3ІЇ Р-1) зараз розробляють, як лікарський засіб для лікування гіперглікемії у пацієнтів з цукровим діабетом.

Функції СІ Р-1 полягають у стимулюванні синтезу та секреції інсуліну, пригніченні секреції глюкагону, сповільненні спорожнення шлунка, покращення засвоєння глюкози та пригнічення вживання їжі.

Також було повідомлено, що ексендин-4, отриманий з отрути ящірок та маючий приблизно 50 95 амінокислотну гомологію до СІ Р-1, мав здатність до активування рецептора СІ Р-1, що тим самим покращувало гіперглікемію у пацієнтів з цукровим діабетом () ВіоЇ Спет. 1992 Арг. 15; 267 (11): 7402 - 5). Проте слід зазначити, що було також повідомлено про наявність побічних дій (як-то блювота та нудота), притаманних спрямованим проти ожиріння лікарським засобам, які містили СІ Р-1.

Вважаючи ці обставини, велику увагу було зосереджено на оксинтомодуліні, який розглядали, як альтернативу СІ Р-1. Ця сполука може зв'язуватися з обома рецепторами двох пептидів, (І Р-1 та глюкагону. Оксинтомодулін є пептидом, отриманим з попередника глюкагону, який має назву пре-глюкагон та має функції пригнічення споживання їжі та підвищення ситості, як І Р-1, а також йому притаманна ліполітична активність подібно до глюкагону, що збільшує його ефективність у терапевтичному лікуванні ожиріння.

Проте слід зазначити, що оксинтомодулін або його похідні мають серйозний недолік через потрібність щоденного введення надлишкової кількості лікувального засобу, що обумовлено їх низькою ефективністю та коротким часом напівжиття іп мімо.

Додатково слід зауважити, що коли в одному пептиді наявні активні властивості СІ Р-1 та глюкагону, то відношення цих активностей стає незмінним, фіксованим, тобто стає важко застосувати подвійний агоніст з різними відношеннями. Відповідно, може бути більш ефективною комбінована терапія, внаслідок якої стає можливим застосування різних відношень активних властивостей шляхом коректування вмісту СІ Р-1 та глюкагону. Проте слід зазначити, що для такої комбінованої терапії потрібно покращити фізичні характеристики глюкагону, який утворює агрегати при нейтральному рН та осаджується з часом, тим самим виявляючи погану розчинність.

За цих обставин винахідники розробили похідні глюкагону з частковими модифікаціями амінокислотної послідовності глюкагону з метою покращення його лікувальної дії на гіпоглікемію та ожиріння за рахунок покращення фізичних властивостей цієї сполуки. Винахідники виявили, що ці похідні глюкагону, завдяки зміненим значенням рі, які відрізняються від подібних показників природного глюкагону, мають покращену розчинність та підвищену стійкість при нейтральному рН та довели, тим самим завершуючи винахід, що ці розроблені похідні глюкагону активують власні рецептори у дослідженні іп міїко.

Метою винаходу є отримання фармацевтичної композиції для лікування або профілактики метаболічного синдрому, яка містить похідну глюкагону та принаймні одну сполуку або матеріал, який має лікувальну активність для метаболічного синдрому.

Зо Іншою метою винаходу є отримання нової похідної глюкагону.

Іншою метою винаходу є отримання виділеного полінуклеотиду, кодуючого похідну глюкагону, вектора, який містить цей полінуклеотид та виділеної клітини, яка містить цей полінуклеотид або вектор.

Іншою метою винаходу є отримання виділеного кон'югату, в якому з'єднано похідну глюкагону та біосумісний матеріал, який є здатним до підвищення часу напівжиття іп мімо.

Іншою метою винаходу є отримання композиції, яка містить цю похідну глюкагону та виділений кон'югат.

Іншою метою винаходу є отримання фармацевтичної композиції для лікування або профілактики гіпоглікемії або метаболічного синдрому, яка містить цю похідну глюкагону або виділений кон'югат.

Іншою метою винаходу є отримання способу профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічного синдрому, який полягає у введенні вищезазначеної композиції пацієнту у разі потреби.

Іншою метою винаходу є застосування цієї похідної глюкагону або виділеного кон'югату або композиції для отримання лікарського засобу (або фармацевтичної композиції) для профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічного синдрому.

Для досягнення вищезазначених завдач, аспектом винаходу передбачено фармацевтичну композицію для лікування або профілактики метаболічного синдрому, яка містить похідну глюкагону та принаймні одну сполуку або матеріал з лікувальною активністю для метаболічного синдрому.

Більш докладно кажучи, аспектом винаходу передбачено фармацевтичну композицію для лікування або профілактики метаболічного синдрому, яка містить: ї) пептид, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 1 та і) принаймні одну сполуку або матеріал, який має лікувальну активність для метаболічного синдрому: х1-Х2-ОСТЕ-Х7-50-Х10-5-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-Е-Х23-Х2А-МІ-І-Х27- хХ28-Х29-Х30 (Загальна Формула 1, 5ЕО ІЮ Мо 45) в якій, в Загальній Формулі 1:

Х1 є гістидином, дезаміно-гістидилом, М-диметил-гістидилом, р-гідроксиімідазопропіонілом, 60 4-імідазоацетилом, рД-карбоксиімідазопропіонілом, триптофаном або тирозином або є відсутнім;

Х2 є а-метил-глутаміновою кислотою, аміноїзомасляною кислотою (АВ), ЮО-аланіном, гліцином, Заг(М-метилгліцином), серином або Ю-серином;

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою, аспарагіновою кислотою, серином, а-метил-глутаміновою кислотою або цистеїном або є відсутнім;

Х17 є аспарагіновою кислотою, глутаміном, глутаміновою кислотою, лізином, аргініном, серином, цистеїном або валіном або є відсутнім;

Х18 є аланіном, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, аргініном, валіном або цистеїном або є відсутнім;

Х19 є аланіном, аргініном, серином, валіном або цистеїном або є відсутнім;

Х20 є лізином, гістидином, глутаміном, аспарагіновою кислотою, лізином, аргініном, с-метил- глутаміновою кислотою або цистеїном або є відсутнім;

Х21 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, лейцином, валіном або цистеїном або є відсутнім;

Х23 є ізолейцином, валіном або аргініном або є відсутнім;

Х24 є валіном, аргініном, аланіном, цистеїном, глутаміновою кислотою, лізином, глутаміном, а-метил-глутаміновою кислотою або лейцином або є відсутнім;

Х27 є ізолейцином, валіном, аланіном, лізином, метіоніном, глутаміном або аргініном або є відсутнім;

Х28 є глутаміном, лізином, аспарагіном або аргініном або є відсутнім;

Х29 є лізином, аланіном, гліцином або треоніном або є відсутнім; та

ХО є цистеїном або є відсутнім;

Якщо амінокислотна послідовність за Загальною Формулою 1 є ідентичною послідовності

ЗЕО ІО Мо 1, то її виключено.

Зо У іншому особливому втіленні, у Загальній Формулі 1:

Х1 є гістидином, триптофаном або тирозином або є відсутнім;

Х2 є серином або аміноїзомасляною кислотою (АЇб);

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою, серином або цистеїном;

Х17 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, лізином, аргініном, серином, цистеїном або валіном;

Х18 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, аргініном або цистеїном;

Х19 є аланіном або цистеїном;

Х20 є глутаміном, аспарагіновою кислотою, лізином або цистеїном;

Х21 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, лейцином, валіном або цистеїном;

Х23 є ізолейцином, валіном або аргініном;

Х24 є валіном, аргініном, аланіном, глутаміновою кислотою, лізином, глутаміном або лейцином;

Х27 є ізолейцином, валіном, аланіном, метіоніном, глутаміном або аргініном;

Х28 є глутаміном, лізином, аспарагіном або аргініном;

Х29 є треоніном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім.

У іншому особливому втіленні, у Загальній Формулі 1:

Х2 є серином або аміноїзомасляною кислотою (АБ);

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном; 60 Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х19 є аланіном або цистеїном;

Х20 є глутаміном, аспарагіновою кислотою або лізином;

Х21 є аспарагіновою кислотою або глутаміновою кислотою;

Х23 є валіном;

Х24 є валіном або глутаміном;

Х27 є ізолейцином або метіоніном;

Х28 є аспарагіном або аргініном;

Х29 є треоніном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім.

Х1 є тирозином, Х2 є аміноізомасляною кислотою (АБ);

Х7 є треоніном;

Х10 є тирозином;

Х12 є лізином;

Х13 є тирозином;

Х14 є лейцином;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х17 є лізином або аргініном;

Х18 є аргініном;

Х19 є аланіном;

Х20 є глутаміном, цистеїном або лізином;

Х21 є аспарагіновою кислотою, цистеїном, валіном або глутаміновою кислотою;

Х23 є валіном;

Зо Х24 є валіном або аргініном;

Х27 є метіоніном;

Х28 є аспарагіном або аргініном;

Х29 є треоніном; та

ХЗ0О є відсутнім.

У іншому особливому втіленні, вищезазначений пептид відрізняється тим, що він є пептидом, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 2:

У-Аір-ФОС ТТ Е-Х7-50-Х10-5-Х12-Х-І-Х15-Х16-Х17-8-А-Х20-Х21-Е-М-Х24А-МІ-І -М-М-Т-Х30 (Загальна Формула 2, ЗЕО ІЮО Мо 46) в якій, в Загальній Формулі 2:

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою або серином;

Х17 є лізином або аргініном;

Х20 є глутаміном або лізином;

Х24 є валіном або глутаміном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім,

Причому слід зазначити, що з пептидів, які містять амінокислотну послідовність за

Загальною Формулою 2, може бути виключено пептиди, відповідні послідовностям 5ЕО ІЮ МоМо 14, 19, 20, 25, 27, 31 та 33.

У іншому особливому втіленні, пептид, який містить амінокислотну послідовність за

Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що він має значення рі, яке відрізняється від подібного значення природного глюкагону, наприклад, рі, яке складає 6,5 або менше або 7,0 або вище.

Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що принаймні одну амінокислотну пару з амінокислотних пар Х10 та Х14, Х12 та Х16, Х16 та Х20, Х17 та Х21, Х20 та Х24 та Х24 та Х28 у

Загальній Формулі 1 заміщено глутаміновою кислотою або лізином, здатним, відповідно, утворювати кільце.

Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що амінокислотну пару Х12 та Х16 або амінокислотну пару Х1І6 та Х20 відповідно заміщено глутаміновою кислотою або лізином, здатним, відповідно, утворювати кільце.

Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що принаймні одна амінокислотна пара серед амінокислотних пар Х10 та Х14, Х12 та Х16, Х16 та Х20, Х17 та Х21, Х20 та Х24 та Х24 та Х28 у

Загальній Формулі 1 утворює кільце (наприклад, лактамне кільце).

Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що його С-кінець є амідованим.

У іншому особливому втіленні, пептид, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що він є похідною глюкагону, здатною до активування глюкагонового рецептора.

У іншому особливому втіленні цей пептид відрізняється тим, що він містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 2 - 44.

У іншому особливому втіленні цей пептид відрізняється тим, що він містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 2 - 13, 15, 17, 20 - 24, 26 - 30 та 32 - 44.

У іншому особливому втіленні цей пептид відрізняється тим, що він містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Ме 12 або ЗЕО ІЮО Мо 20.

У іншому особливому втіленні, сполука або матеріал, який має лікувальну активність для метаболічного синдрому відрізняється тим, що її вибрано з групи, яка складається з інсулінотропного пептиду, агоніста рецептора глюкагоноподібного пептиду-1 (СІ Р-1), агоніста рецептора лептину, інгібітора дипептидилпептидази-ІМ (ОРР-ІМ), антагоніста рецептора У5, антагоніста рецептора меланінконцентруючого гормону (МСН), агоніста рецептора У2/4, агоніста рецептора меланокортину 3/4 (МС 3/4), інгібітора шлункової/підшлункової ліпази, агоніста 5-НТгс-рецептора 5-гідрокситриптаміну, агоніста рецептора ВЗА, агоніста рецептора

Зо аміліну, агоніста греліну, антагоніста рецептора греліну, агоніста альфа-рецептора, який активується проліфератором пероксисом (РРАКО), агоніста дельта-рецептора, який активується проліфератором пероксисом (РРАКб), агоніста фарнезоїдного рецептора Х (ЕХК), інгібітора ацетил-СоА карбоксилази, пептиду УУ, холецистокініну (ССК), ксеніну, гліцентину, обестатину, секретину, несфатину, інсуліну та глюкозозалежного інсулінотропного пептиду (СР).

У іншому особливому втіленні, інсулінотропний пептид відрізняється тим, що його вибрано з групи, яка складається з С Р-1, ексендину-3, ексендину-4, їх агоністів, похідних, фрагментів, варіантів та комбінацій.

У іншому особливому втіленні, інсулінотропний пептид відрізняється тим, що він є похідною інсулінотропного пептиду, в якій М-кінцевий гістидиновий залишок цього інсулінотропного пептиду заміщено іншим, вибраним з групи, яка складається з дезаміно-гістидилу, М-диметил- гістидилу, В-гідроксиімідазопропіонілу, 4-імідазоацетилу та ВД-карбоксиімідазопропіонілу.

У іншому особливому втіленні, інсулінотропний пептид відрізняється тим, що його вибрано з групи, яка складається з природного ексендину-4; похідної ексендину-4, в якій видалено М- кінцеву аміногрупу ексендину-4; похідної ексендину-4, в якій М-кінцеву аміногрупу ексендину-4 заміщено гідроксильною групою; похідної ексендину-4, в якій М-кінцеву аміногрупу ексендину-4 змінено на диметильну групу; похідної ексендину-4, в якій видалено са-карбон першої амінокислоти ексендину-4, яка є гістидином; похідної ексендину-4, в якій дванадцяту амінокислоту ексендину-4, яка є лізином, заміщено на серин та похідної ексендину-4, в якій дванадцяту амінокислоту ексендину-4, яка є лізином, заміщено на аргінін.

Загальною Формулою 1 відрізняється тим, що він знаходиться у формі кон'югату тривалої дії, до якого приєднано біосумісний матеріал, здатний до збільшення часу напівжиття цього пептиду іп мімо; та інсулінотропний пептид знаходиться у формі кон'югату тривалої дії, до якого приєднано біосумісний матеріал, здатний до збільшення часу напівжиття цього інсулінотропного пептиду іп мімо;.

У іншому особливому втіленні, цей біосумісний матеріал відрізняється тим, що його вибрано з групи, яка складається з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та його фрагменту, альбумін-зв'язуючого матеріалу, полімеру з повторюючихся одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагмента антитіла, ЕсКп-зв'язуючого матеріалу,

сполучної (іп мімо) тканини або її похідної, нуклеотиду, фібронектину, трансферину, сахариду та полімеру.

Загальною Формулою 1 та інсулінотропний пептид відрізняються тим, що вони є відповідно з'єднаними з біосумісним матеріалом з допомогою лінкера, вибраного з групи, яка складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІ А) та полілактид-ко- гліколіду (РІ ОСА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти, жирної кислоти, полімеру, сполуки з низькою молекулярною масою, нуклеотиду та їх комбінацій.

У іншому особливому втіленні, біосумісний матеріал відрізняється тим, що він є ЕсКп- зв'язуючим матеріалом та пептид, який містить амінокислотну послідовність за Загальною

Формулою 1 та інсулінотропний пептид є відповідно з'єднаними з біосумісним матеріалом з допомогою пептидильного або непептидильного лінкера, вибраного з групи, яка складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, полівінілового етилового етеру, декстрану, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІ А) та полілактид-ко- гліколіду (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти та їх комбінацій.

У іншому особливому втіленні, ЕсЕп-зв'язуючий матеріал відрізняється тим, що він є поліпептидом, який включає Ес-ділянку імуноглобуліну.

У іншому особливому втіленні, ця Ес-ділянка імуноглобуліну відрізняється тим, що вона є аглікозилованою.

У іншому особливому втіленні, ця Ес-ділянка імуноглобуліну відрізняється тим, що вона є вибраною з групи, яка складається з: (а) домену СНІ, домену СНО, домену СНЗ та домену СНА; (Б) домену СНІ та домену СН2; (с) домену СНІ та домену СНЗ; (4) домену СНаО та домену СНЗ; (є) комбінації доменів, вибраних з одного, двох або більше доменів, включаючи домен СНІ,

Зо домен СН2, домен СНЗ та домен СН4А та шарнірну ділянку імуноглобуліну або частину цієї шарнірної ділянки; та () димеру між кожним доменом важколанцюгової сталої ділянки та легколанцюгової сталої ділянки.

У іншому особливому втіленні, поліпептид, який містить Ес-ділянку імуноглобуліну знаходиться у формі димеру.

У іншому особливому втіленні, Ес-ділянка імуноглобуліну відрізняється тим, що вона є похідною природної Ес-ділянки, в якій видалено ділянку, здатну утворювати дисульфідний зв'язок, похідною природної Ес-ділянки, в який видалено частину амінокислоти (амінокислот) на

М-кінці, похідною природної Ес-ділянки, в якій до М-кінця приєднано метіонін, похідною природної Ес-ділянки, в якій видалено комплемент-зв'язуючу ділянку або похідною природної

Ес-ділянки, в якій видалено ділянку залежної від антитіл клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АОСС).

У іншому особливому втіленні, Ес-ділянка імуноглобуліну відрізняється тим, що вона є Ес- ділянкою, яка походить від імуноглобуліну, вибраного з групи, яка складається з Ідс, ІдА, ІдО,

ІЧЕ та І9М.

У іншому особливому втіленні, ця Ес-ділянка імуноглобуліну відрізняється тим, що вона є

Ес-ділянкою Ідсі.

У іншому особливому втіленні, ця Ес-ділянка імуноглобуліну відрізняється тим, що вона є аглікозилованою Ес -ділянкою, яка походить від людського імуноглобуліну досі.

У іншому особливому втіленні, непептидильний лінкер відрізняється тим, що він є з'єднаним з цистеїновим залишком пептиду, який містить амінокислотну послідовність за Загальною

Формулою 1.

У іншому особливому втіленні, непептидильний лінкер відрізняється тим, що його обидва кінці є відповідно з'єднаними з аміногрупою або тіоловою групою пептиду, яка містить амінокислотну послідовність за Загальною Формулою 1 або інсулінотропний пептид та біосумісний матеріал.

У іншому особливому втіленні, метаболічний синдром відрізняється тим, що його вибрано з групи, яка складається з порушення механізму засвоєння глюкози, гіперхолестеринемії, дисліпідемії, ожиріння, цукрового діабету, гіпертонії, неалкогольного стеатогепатиту (МАБН),

атеросклерозу, спричиненого дисліпідемією, атеросклерозу, артеріосклерозу, ішемічної хвороби серця та інсульту.

В іншому аспекті, винахід стосується нової похідної глюкагону.

У особливому втіленні, ця похідна глюкагону відрізняється тим, що вона є виділеним пептидом, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 2:

У-Аір-ОСТЕ-Х7-50-Х10-5-Х12-У-І-Х15-Х16-Х17-8-А-Х20-Х21-Е-М-Х24-М1-І -М-М-Т-Х30 (Загальна Формула 2, ЗЕО ІЮО Мо 46) в якій, в Загальній Формулі 2:

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою або серином;

Х17 є лізином або аргініном;

Х20 є глутаміном або лізином;

Х24 є валіном або глутаміном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім,

Причому, з пептидів, які містять амінокислотну послідовність за Загальною Формулою 2, може бути виключено пептиди, відповідні послідовностям ЗЕО ІЮ МоМо 14, 19, 20, 25, 27, 31 та 33.

Загальною Формулою 2 відрізняється заміщенням амінокислотної пари Х1б6 та Х20 на глутамінову кислоту або лізин, які є здатними утворювати кільце.

Загальною Формулою 2 має амідований С-кінець.

У іншому особливому втіленні цей пептид відрізняється тим, що він є похідною глюкагону, здатною до активування глюкагонового рецептора.

У іншому особливому втіленні цей пептид відрізняється тим, що він містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 12, 13, 15 та 36 - 44.

У іншому особливому втіленні цей пептид відрізняється тим, що він містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо 12.

У іншому аспекті, винахід стосується виділеного полінуклеотиду, кодуючого похідну глюкагону, вектора, який містить цей полінуклеотид та виділеної клітини, яка містить цей полінуклеотид або цей вектор.

У іншому аспекті, винахід стосується виділеного кон'югату, в якому є з'єднаними похідна глюкагону та біосумісний матеріал, здатний збільшувати час напівжиття іп мімо.

У особливому втіленні цей біосумісний матеріал відрізняється тим, що його вибрано з групи, яка складається з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та його фрагменту, альбумін-зв'язуючого матеріалу, полімеру з повторюючихся одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагмента антитіла, ЕсКп-зв'язуючого матеріалу, сполучної (іп мімо) тканини або її похідної, нуклеотиду, фібронектину, трансферину, сахариду та полімеру.

У особливому втіленні, виділений пептид відрізняється тим, що його з'єднано з біосумісним матеріалом з допомогою лінкера, вибраного з групи, яка складається з полієтиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІ А) та полілактид-ко-гліколіду (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти, жирної кислоти, полімеру, сполуки з низькою молекулярною масою, нуклеотиду та їх комбінацій.

У особливому втіленні, біосумісний матеріал відрізняється тим, що він є ЕсКп-зв'язуючим матеріалом, та виділений пептид та інсулінотропний пептид є відповідно з'єднаними з біосумісним матеріалом з допомогою пептидильного або непептидильного лінкера, вибраного з групи, яка складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, полівінілового етилового етеру, декстрану, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІА) або полілактид-ко-гліколіду (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти та їх комбінацій.

У особливому втіленні, ЕсКп-зв'язуючий матеріал відрізняється тим, що він є поліпептидом, який містить Ес-ділянку імуноглобуліну.

У іншому аспекті, винахід стосується композиції, яка містить похідну глюкагону або виділений кон'югат.

У особливому втіленні, ця композиція відрізняється тим, що вона є фармацевтичною композицією для лікування або профілактики гіпоглікемії або метаболічного синдрому.

У іншому аспекті, винахід стосується способу профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічного синдрому, який полягає у введенні композиції пацієнту у разі потреби.

У іншому аспекті, винахід стосується застосування похідної глюкагону або виділеного кон'югату або композиції для отримання лікарського засобу (або фармацевтичної композиції) для профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічного синдрому.

Похідні глюкагону за винаходом мають покращені фізичні властивості порівняно до фізичних властивостей природного глюкагону, отже їх може бути ефективно застосовано, як лікарський засіб для лікування гіпоглікемії шляхом покращення дотримання пацієнтами терапевтичних рекомендацій. Додатково слід зауважити, що похідні глюкагону за винаходом може бути ефективно застосовано для профілактики та лікування гіпоглікемії та метаболічного синдрому, як-то ожиріння, цукрового діабету та неалкогольного стеатогепатиту (МАН).

Опис фігур.

На Фіг. 1 зображено графік, який ілюструє змінення маси тіла тваринних моделей з ожирінням (щурів), отриманих із застосуванням раціону з великим вмістом жирів та яке відбувається протягом одиночного або комбінованого введення кон'югату інсулінотропного пептиду тривалої дії (який позначено, як похідна ексендину-4 тривалої дії) та кон'югату похідної глюкагону тривалої дії (який позначено, як похідна 5ЕО ІЮО Мо 12 тривалої дії) зі скоригованою для щурів дозою та триденними інтервалами протягом 15 днів.

На Фіг. 2 наведено результат, який ілюструє рівень оточного жиру тваринних моделей з ожирінням (щурів), отриманих із застосуванням раціону з великим вмістом жирів, який було виміряно після одиночного або комбінованого введення кон'югату інсулінотропного пептиду тривалої дії (який позначено, як похідна ексендину-4 тривалої дії) та кон'югату похідної глюкагону тривалої дії (який позначено, як похідна 5ЕО ІЮО Мо 12 тривалої дії) зі скоригованою

Зо для щурів дозою протягом 15 днів (р«0,05, ""р«0,01 у порівнянні з носієм із застосуванням тесту АМОМА).

На Фіг. З наведено результат, який ілюструє різницю у масі печінки тваринних моделей з ожирінням (щурів), отриманих із застосуванням раціону з великим вмістом жирів, який було виміряно після одиночного або комбінованого введення кон'югату інсулінотропного пептиду тривалої дії (який позначено, як похідна ексендину-4 тривалої дії) та кон'югату похідної глюкагону тривалої дії (який позначено, як похідна 5ЕО ІЮО Мо 12 тривалої дії) зі скоригованою для щурів дозою протягом 15 днів ("р«к0,01, "ра«0,001 у порівнянні з носієм із застосуванням тесту АМОМА).

На фіг. 4 зображено графік, який ілюструє змінення маси тіла (ВУМ) тваринних моделей з ожирінням (щурів), отриманих із застосуванням раціону з великим вмістом жирів, яке було виміряно після одиночного або комбінованого введення кон'югату інсулінотропного пептиду тривалої дії (який позначено, як похідна ексендину-4 тривалої дії)та кон'югату похідної глюкагону тривалої дії (який позначено, як похідна 5ЕО ІЮО Мо 20 тривалої дії) зі скоригованою для щурів дозою протягом 22 днів.

На Фіг. 5 наведено результат, який ілюструє змінення вмісту холестерину в крові тваринних моделей з ожирінням (щурів), отриманих із застосуванням раціону з великим вмістом жирів, яке було виміряно після одиночного або комбінованого введення кон'югату інсулінотропного пептиду тривалої дії (який позначено, як похідна ексендину-4 тривалої дії)та кон'югату похідної глюкагону тривалої дії (який позначено, як похідна 5ЕО ІЮО Мо 20 тривалої дії) зі скоригованою для щурів дозою протягом 22 днів.

Певні деталі винаходу можна пояснити, як наведено нижче. Зокрема, розкриті у винаході пояснення та втілення може бути застосовано, відповідно, й до інших пояснень та втілень.

Тобто, всі комбінації різних елементів, розкриті в цьому винаході належать до його обсягу.

Додатково слід зауважити, що обсяг цього винаходу не повинен бути обмеженим описаними нижче особливими описами.

Під час розкриття цього винаходу було застосовано не тільки загальноприйнятні існуючі в природі однолітерні коди та трьохлітерні коди для амінокислот, але й також було вжито трьохлітерні коди, які звичайно застосовують для позначення інших амінокислот, як-то АЇїбр (а- аміноїзомасляна кислота) чи заг (М-метилгліцин). Додатково слід зауважити, що опис амінокислот, зазначених в цій роботі у вигляді скорочень наведено згідно за номенклатурою

ІОРАС-ІШВ. аланін А аргінін Кк аспарагін М аспарагінова кислота Ю цистеїн С глутамінова кислота Е глутамін О гліцин б гістидин Н ізолейцин лейцин ЇЇ. лізин Кк метіонін М фенілаланін Е пролін Р серин 5 треонін Т триптофан М/ тирозин У валін М

Аспект винаходу стосується композиції, яка містить похідну глюкагону та принаймні одну сполуку або матеріал, який має лікувальну активність для метаболічного синдрому та більш докладно кажучи, він стосується фармацевтичної композиції для лікування або профілактики метаболічного синдрому, яка містить похідну глюкагону та принаймні одну сполуку або матеріал, який має лікувальну активність до цієї хвороби.

Похідна глюкагону за винаходом містить пептид, який має принаймні одну відмінність від природного глюкагону у складі амінокислотної послідовності, пептид, в якому послідовність природного глюкагону змінено шляхом модифікації природного глюкагону та міметик природного глюкагону, який може активувати глюкагонові рецептори, як і природний глюкагон.

Така похідна глюкагону може бути похідною, яка має покращені фізичні властивості шляхом отримання зміненого, порівняно до природного глюкагону, показника рі. Додатково слід зауважити, але без обмеження цим, що ця похідна глюкагону може бути похідною з покращеною розчинністю та одночасним збереженням власної активності щодо активування глюкагонових рецепторів.

Також слід зазначити, що ця похідна глюкагону може бути й глюкагоном штучного походження.

Зокрема, природний глюкагон може мати наступну амінокислотну послідовність:

Нібз-Зег-С1п-Сту- Гпіи-Рпе-Тиг-5ег-Авр-Туг-5еї-І уб-Туі-І еи-Авр-5ег-Агу-Ага-АІа-СИп-Авр-РНе-

Ма!І-сіп- Ттр-І еи-Меї-Авп-ТАг (ЗЕО ІЮ Ме 1)

Як тут застосовано, термін "рі" або "ізоелектирична точка" стосується значення рнН, при якому макромолекула, як-то поліпептид, не має сумарного заряду (0). У випадку поліпептиду, який має функціональні групи з різними зарядами, сумарний заряд загального поліпептиду є нульовим у точці, в якій значення рН дорівнює значенню рі. Сумарний заряд поліпептиду з показником рН, який перевищує рі буде від'ємним, тоді як сумарний заряд поліпептиду з показником рН, нижчим за рі буде додатнім.

Значення рі може бути визначено із застосуванням гелю з фіксованим градієнтом рН, який складається з поліакриламіду, крохмалю або агарози шляхом ізоелектричного електрофорезу або його може бути оцінено, наприклад, з амінокислотної послідовності із застосуванням інструменту обчислення рі/МмУУ (пер:/ехразу.огоЛоої5/рі гоої.піті; Сабхіеїдег еї аїЇ., 2003) на сервері ЕХРА5ЗУ.

Як тут застосовано, термін "змінений рі" стосується значення рі, яке відрізняється від рі природного глюкагону завдяки заміщенню частини амінокислотної послідовності природного глюкагону амінокислотним залишком, який має від'ємний або додатній заряд, тобто це буде зменшене або збільшене значення рі. Пептид з таким зміненим рі може виявляти покращену розчинність та високу стійкість при нейтральному рн, як похідна глюкагону.

Докладно кажучи, ця похідна глюкагону може мати змінене значення рі, яке відрізняється від значення рі (6,8) природного глюкагону, яке переважно буде меншим за 6,8, більш переважно за 6,7 або менше, точніше кажучи складати 6,5 або менше та додатково слід зазначити, що до обсягу цього винаходу також належать й значення рі, які перевищують 6,8 чи 7 або вище, точніше кажучи, 7,5 або вище, але без обмеження, а також будь-які значення рі, які відрізняються від відповідного значення природного глюкагону. Зокрема, якщо значення рі відрізняються від відповідного значення природного глюкагону та через те виявляють покращену розчинність при нейтральному рН порівняно з відповідною розчинністю природного глюкагону, виявляючи тим самим низький рівень агрегації вони зокрема також будуть охоплюватися обсягом цього винаходу.

Більш переважно, похідна глюкагону може мати значення рі в межах 4 - 6,5 та/або 7 - 9,5, особливо 7,5 - 9,5 та особливо 8,0 - 9,3, але без обмеження. В цьому разі, завдяки зниженому бо або збільшеному значенню рі порівняно до подібного значення природного глюкагону, може бути виявлено покращену розчинність та підвищену стійкість (порівняно до відповідних характеристик природного глюкагону) цієї сполуки при нейтральному рн.

Докладно кажучи, похідну природного глюкагону може бути змінено із застосуванням будь- якого способу заміщення, додавання, видалення та модифікації або комбінації цих способів стосовно амінокислоти природного глюкагону.

Приклади цих похідних глюкагону, які було отримано з допомогою комбінації вищезазначених способів включали, але без обмеження, пептид, який відрізнявся принаймні одним амінокислотним залишком власної амінокислотної послідовності від відповідної послідовності природного глюкагону, мав деамінований М-кінцевий амінокислотний залишок та який мав, але без обмеження цим, функцію активування глюкагонового рецептора. Ці похідні природного глюкагону може бути отримано із застосуванням комбінації різних способів їх отримання.

Додатково слід зауважити, що така модифікація для отримання похідних природного глюкагону може охоплювати всі модифікації із застосуванням амінокислот І - або ЮО-типу, та/або амінокислот неприродного походження; та/або модифікації природних послідовностей, наприклад, модифікації функціональної групи, внутрішньомолекулярних ковалентних зв'язків (наприклад, утворення кільця між бічними ланцюгами), метилування, ацилювання, убіквитинування, фосфорилювання, аміногексанування, біотинилювання тощо.

Додатково слід зауважити, що ця модифікація може також включати всі модифікації, в яких одну або більше амінокислот додають до М- та/або С-кінця природного глюкагону.

Під час цього заміщення або додавання амінокислот може бути застосовано не тільки ті 20 амінокислот, які звичайно знаходять у білках людини, але й також атипові амінокислоти або амінокислоти неприродного походження. Джерела придбання цих атипових амінокислот можуть включати відомі компанії Зідта-Аїагісй, СпетРер Іпс. та сСеплуте РПпагтасеціїсаІ5. Пептиди, які містять ці амінокислоти та атипові пептидні послідовності також може бути синтезовано та придбано від торгівельних постачальників, наприклад, від компаній Атегісап Реріїде Сотрапу,

Васпет (США) або Апудеп (Південна Корея).

Оскільки глюкагон має рН приблизно 7, він є нерозчинним у розчині, який має фізіологічний рН рН 4 - 8) та має схильність до преципітації при нейтральному рН. У водному розчині з рН, який дорівнює З або нижче, глюкагон розчиняється вже на початковій стадії, але потім протягом однієї години він випадає в осад, утворюючи гель. Цей гелеподібний глюкагон здебільшого складається з фібрил, які мають бета-листову структуру та введення такого глюкагонового преципітату з допомогою голки для ін'єкцій або шляхом внутрішньовенної ін'єкції буде блокувати кровоносні судини, отже ця сполука є неприйнятною для застосування, як ін'єкційний засіб. Для затримання процесу преципітації звичайно застосовують кислотні (рН 2 - 4) композиції та таким чином глюкагон може зберігатися у відносно не агрегованому стані протягом короткого періоду часу. Проте слід зазначити, що глюкагон може дуже швидко утворювати фібрили при низькому рН, отже ці кислотні композиції треба вводити після його отримання.

Тому винахідники розробили похідні глюкагону з розширеними профілями дії шляхом модифікації рі природного глюкагону із застосуванням заміщення амінокислотних залишків з від'ємними та додатніми зарядами. Похідні глюкагону за винаходом, які мають змінений рі у порівнянні з природним глюкагоном відрізняються від нього підвищеною розчинністю та/або високою стійкістю при нейтральному рівні рН.

У особливому втіленні винаходу похідною глюкагону може бути пептид, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 1: х1-Х2-ОСТЕ-Х7-50-Х10-5-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-Е-Х23-Х2А-МІ-І-Х27- хХ28-Х29-Х30 (Загальна Формула 1, 5ЕО ІЮ Мо 45) в якій:

Х1 є гістидином, дезаміно-гістидилом, М-диметил-гістидилом, р-гідроксиімідазопропіонілом, 4-імідазоацетилом, ВД-карбоксиімідазопропіонілом, триптофаном або тирозином або є відсутнім;

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном; "273Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

ХЗ0 є цистеїном або є відсутнім;

ЗЕО ІО Мо 1, то її виключено.

Якщо у вищезазначеному амінокислотна послідовність за Загальною Формулою 1 є ідентичною будь-якій амінокислотній послідовності, яку вибрано з групи, яка складається з послідовностей 5ЕБО ІЮ МоМо 12, 13, 15 та 36 - 44 та зокрема, будь-якій з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 13, 15, 36 та 38 - 43, то може бути можливим, що цей пептид може бути виключено з обсягу пептидів, які включають амінокислотну послідовність за Загальною

Формулою 1, але без обмеження. Вищеописане також може бути застосовано й до інших певних втілень та аспектів, але без обмеження.

Докладно кажучи, у Загальній Формулі 1:

Зо Х1 є гістидином, триптофаном або тирозином або є відсутнім;

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х19 є аланіном або цистеїном;

Х23 є ізолейцином, валіном або аргініном;

Х29 є треоніном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім

ЗЕО ІО Мо 1, то її виключено.

Наприклад, цей пептид може бути пептидом, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІО МоМо 2 - 44 та переважніше пептидом, який по суті складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 2 - 44, але без обмеження.

Додатково слід зазначити, що, хоча в цьому винаході є вираз "пептид, який складається з певної послідовності 5ЕОО ІЮ Мо", цей вираз також не виключає наявності мутації в цьому 60 пептиді, яка може виникати внаслідок додавання позбавленої сенсу послідовності вище або нижче відповідної амінокислотної послідовності ФЕО ІЮО Ме або наявності там мутації природного походження чи нейтральної ("мовчазної") мутації допоки пептид, який має цю мутацію буде зберігати ту ж саме активність, як і відповідна активність зазначеного пептиду, який складається з відповідної амінокислотної послідовності ЗЕО І Мо. Навіть за наявністю додавання послідовності або мутації він також буде охоплюватися цим винаходом.

На відміну від цього, в іншому аспекті, якщо амінокислотна послідовність за Загальною

Формулою 1 є ідентичною до амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з послідовностей ЗЕБЕО ІЮ МоМо 12, 13, 15 та 36 - 44 та зокрема є ідентичною до будь-якої з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІО МоМо 13, 15, 36 та 38 - 43, то цей пептид можливо може бути виключено із загального обсягу пептидів, які містять амінокислотну послідовність за

Загальною Формулою 1, але без обмеження. Описане вище також може бути застосовано, але без обмеження, й до інших певних втілень або аспектів.

Докладно кажучи, у Загальній Формулі 1:

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х19 є аланіном або цистеїном; "332Х20 є глутаміном, аспарагіновою кислотою або лізином;

Х23 є валіном;

Зо Х24 є валіном або глутаміном;

Х27 є ізолейцином або метіоніном;

Х28 є аспарагіном або аргініном;

Х29 є треоніном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім

ЗЕО ІО Мо 1, то її виключено.

Наприклад, цей пептид може бути пептидом, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 2 - 13, 15, 17, 20 - 24, 26 - 30 та 32 - 44 та особливо, який по суті складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМео 2 - 13, 15, 17, 20 - 24, 26 - 30 та 32 - 44, але без обмеження.

Докладно кажучи, у Загальній Формулі 1:

Х1 є тирозином;

Х2 є аміноїзомасляною кислотою;

Х7 є треоніном;

Х10 є тирозином;

Х12 є лізином; "349Х13 є тирозином;

Х14 є лейцином;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х17 є лізином або аргініном;

Х18 є аргініном;

Х19 є аланіном;

Х20 є глутаміном, цистеїном або лізином;

Х23 є валіном;

Х24 є валіном або аргініном;

Х27 є метіоніном; 60 Х28 є аспарагіном або аргініном;

Х29 є треоніном; та

ХЗ0О є відсутнім.

Наприклад, цей пептид може бути пептидом, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЕС ІЮ МоМо 14, 16, 18, 19, 25 та 31 та особливо, який по суті складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМео 14, 16, 18, 19, 25 та 31, але без обмеження.

Докладно кажучи, цей пептид може бути пептидом, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 2:

У-Аір-ФОС ТТ Е-Х7-50-Х10-5-Х12-Х-І-Х15-Х16-Х17-8-А-Х20-Х21-Е-М-Х24А-МІ-І -М-М-Т-Х30 (Загальна Формула 2, 5ЕО ІО Мо 46) в якій, в Загальній Формулі 2:

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою або серином;

Х17 є лізином або аргініном;

Х20 є глутаміном або лізином;

Х24 є валіном або глутаміном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім,

Якщо амінокислотна послідовність за Загальною Формулою 2 є ідентичною будь-якої з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 14, 19, 20, 25, 27, 31 та 33, її може бути виключено, але без обмеження цим.

Наприклад, цей пептид може бути пептидом, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮО МоМо 12, 13, 15 та 36 - 44 та, особливо, який по суті складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 12, 13, 15 та 36 - 44, але без обмеження. Докладно кажучи, цей пептид може бути пептидом, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо 12 або 5ЕО ІО Мо 20 або по суті складається з відповідної амінокислотної послідовності, але не обмежуючись нею.

Додатково слід зауважити, що пептид, який містить амінокислотну послідовність за

Загальною Формулою 1 або за Загальною Формулою 2 може бути таким, в якому принаймні одну амінокислотну пару серед амінокислотних пар Х10 та Х14, Х12 та Х16, Х16 та Х20, Х17 та

Х21, Х20 та Х24 та Х24 та Х28 у Загальній Формулі 1 або у Загальній Формулі 2 може бути заміщено глутаміновою кислотою або лізином, здатним, відповідно, утворювати кільце, але без обмеження.

Докладно кажучи, пептид, який містить амінокислотну послідовність за Загальною

Формулою 1 або Загальною Формулою 2 може бути таким, в якому амінокислотну пару Х12 та

Х16 або амінокислотну пару Х16 та Х20 є відповідно заміщено глутаміновою кислотою або лізином, здатним, відповідно, утворювати кільце.

Докладно кажучи, принаймні одна амінокислотна пара серед амінокислотних пар Х10 та

Х14, Х12 та Х16, Х16 та Х20, Х17 та Х21, Х20 та Х24 та Х24 та Х28 може бути такою, яка утворює кільце (наприклад, лактамне кільце), але без обмеження.

Зокрема аміно- або карбокси- кінець цього пептиду може бути модифіковано або його може бути захищено із застосуванням різних органічних груп, які захищають пептид від ферментів, які розщеплюють білки іп мімо з одночасним збільшенням його стійкості, наприклад, може бути застосовано амідування С-кінця цього пептиду.

Також слід зазначити, що пептид за винаходом може бути синтезовано із застосуванням добре відомого в цій галузі способу відповідно до його довжини, наприклад, із застосуванням автоматичного пептидного синтезатора та його може бути отримано із застосуванням генно- інженерної технології.

Пептид за винаходом переважно може бути отримано із застосуванням стандартного способу синтезу, системи рекомбінантної експресії або з допомогою будь-якого іншого відомого в цій галузі способу. Відповідно, похідну глюкагону за винаходом може бути синтезовано із застосуванням різних способів, включаючи, наприклад, описані нижче способи: (а) спосіб синтезу пептиду із покроковим застосуванням твердофазного чи рідкофазного способу або із застосуванням фрагментної збірки з наступним виділенням та очищенням кінцевого пептидного продукту; або

(Б) спосіб експресії конструкції нуклеїнової кислоти, яка кодує пептид у клітині-хазяїні та відновлення продукту цієї експресії з культури клітин-хазяїв; або (с) спосіб отримання безклітинної експресії іп міго конструкції нуклеїнової кислоти, яка кодує пептид та відновлення з середовища продукту цієї експресії; або спосіб отримання фрагментів пептиду із застосуванням будь-якої комбінації способів (а), (Б) та (с) та отримання пептиду шляхом зшивання цих пептидних фрагментів з наступним відновленням цього пептиду.

У особливому прикладі, бажану похідну глюкагону може бути отримано із застосуванням генетичної маніпуляції, яка полягає у отриманні злитого (гібридного) гена, кодуючого злитий білок, який містить злиту молекулу партнера та похідної глюкагону, у трансформації клітини - хазяїна отриманою конструкцією та у отриманні експресії злитого білка з наступним відщепленням похідної глюкагону від цього злитого білка із застосуванням протеази або сполуки, здатної до білкового розщеплення з наступним її відокремленням. З цією метою, наприклад, послідовність ДНК, яка кодує амінокислотний залишок може бути розрізано із застосуванням протеази, як-то протеази Расіог Ха або ентерокінази. Між партнером злиття та полінуклеотидом, кодуючим похідну глюкагону може бути вставлено СМВг або іншу сполуку, як- то гідроксиламін.

У особливому втіленні винаходу було підтверджено, що пептид за винаходом має значення рі, яке відрізняється від рі природного глюкагону (див. Таблицю 1). В результаті пептид за винаходом має покращену розчинність та підвищену стійкість при нейтральному рн. Відповідно, у разі застосування пептиду за винаходом, як гіпоглікемічного засобу, це може призвести до підвищення дотримання пацієнтом режиму лікування та він також є прийнятним для його комбінованого введення з іншими засобами лікування ожиріння, отже його може бути ефективно застосовано для профілактики та лікування гіпоглікемії та ожиріння.

У зв'язку з цим пептид за винаходом може забезпечити привабливий терапевтичний вибір у галузі лікування гіпоглікемії, ожиріння або пов'язаних з ним захворювань.

Наприклад, пептид за винаходом є головним гормоном регулювання інсулінової відповіді та його може бути ефективно застосовано для лікування важкої гіпоглікемії у пацієнтів з цукровим діабетом.

Також слід зазначити, що пептид за винаходом може бути застосовано, як фармацевтичний лікарський засіб не тільки для профілактики збільшення ваги тіла, сприяння зменшенню ваги тіла, зменшенню надмірної ваги та ожиріння, в тому числі хворобливого ожиріння (наприклад, шляхом контролю апетиту, прийому їжі, споживання їжі, споживання калорій та/або споживання енергії); але й також, але без обмеження, для лікування пов'язаного з ожирінням запалення, викликаної ожирінням хвороби жовчного міхура та апное сну. Також його може бути застосовано для лікування супутніх хвороб або їх хворобливих станів.

Також пептид за винаходом може бути застосовано для лікування іншого, ніж ожиріння, метаболічного синдрому, тобто хвороб, пов'язаних з ожирінням, як-то порушення механізму засвоєння глюкози, гіперхолестеринемії, дисліпідемії, ожиріння, цукрового діабету, гіпертонії, неалкогольного стеатогепатиту (неалкогольний стеатогепатит, МАН), спричиненого дисліпідемією атеросклерозу, атеросклерозу, артеріосклерозу, ішемічної хвороби серця, інсульту, гіпоглікемії тощо. Проте слід зазначити, що дії пептиду за винаходом може бути цілком або частково опосередковано описаними вище ефектами, пов'язаними з вагою тіла або вони можуть бути незалежними від них.

Приклади сполуки або матеріалу з лікувальною активністю до метаболічного синдрому для включення у комбіноване введення або для включення до складу композиції за винаходом можуть включати, але без обмеження, інсулінотропний пептид, агоніст рецептора глюкагоноподібного пептиду-1 (а Р-1), агоніст рецептора лептину, інгібітор дипептидилпептидази-ІМ (ОРР-ІМ), антагоніст рецептора У5, антагоніст рецептора меланінконцентруючого гормону (МСН), оагоніст рецептора У2/4, агоніст рецептора меланокортину 3/4 (МС 3/4), інгібітор шлункової/підшлункової ліпази, агоніст 5-НТ2О-рецептора

Б-гідрокситриптаміну, агоніст рецептора ВЗА, агоніст рецептора аміліну, агоніст греліну, антагоніст рецептора греліну, агоніст альфа-рецептора, який активується проліфератором пероксисом (РРАКО), агоніст дельта-рецептора, який активується проліфератором пероксисом (РРАКб), агоніст фарнезоїдного рецептора Х (ЕХК), інгібітор ацетил-СоА карбоксилази, пептид

У, холецистокінін, (ССК), ксенин, гліцентин, обестатин, секретин, несфатин, інсулін та глюкозозалежний інсулінотропний пептид (СІР). Додатково слід зауважити, що також у цей перелік може бути включено всі лікарські засоби, які є ефективними для лікування ожиріння та лікарські засоби, здатні пригнічувати печінкове запалення та фіброз.

Переважно цей інсулінотропний пептид може бути вибрано з групи, яка складається з СІ Р- 1, ексендину-3, ексендину-4, їх агоніста, похідної, фрагменту, варіанту та їх комбінацій.

Докладно кажучи, цей інсулінотропний пептид може бути похідною інсулінотропного пептиду, в якій його М-кінцевий гістидин заміщено іншою сполукою, вибраною з групи, яка складається, але без обмеження, з дезаміно-гістидилу, М-диметил-гістидилу, |Д- гідроксиімідазопропіонілу, 4-імідазоацетилу та ВД-карбоксиімідазопропіонілу.

Особливо цей інсулінотропний пептид може бути вибрано з групи, яка складається, але без обмеження, з природного ексендину-4; похідної ексендину-4, в якій видалено М-кінцеву аміногрупу ексендину-4; похідної ексендину-4, в якій М-кінцеву аміногрупу ексендину-4 заміщено гідроксильною групою; похідної ексендину-4, в якій М-кінцеву аміногрупу ексендину-4 змінено на диметильну групу; похідної ексендину-4, в якій з гістидину, першої амінокислоти ексендину-4, видалено а-карбон; похідної ексендину-4, в якій дванадцяту амінокислоту ексендину-4, лізин, заміщено на серин та похідної ексендину-4, в якій дванадцяту амінокислоту ексендину-4, лізин, заміщено на аргінін.

Слід зазначити, що прикладом цього інсулінотропного пептиду або його кон'югату тривалої дії є сполука, наведена у Публікації Патентної Заявки США Мо 2010-0105877, повний вміст якої охоплюється цим винаходом у вигляді посилання.

У особливому втіленні, похідна глюкагону, наприклад, пептид, який містить амінокислотну послідовність за Загальною Формулою 1 або Загальною Формулою 2, може існувати у формі кон'югату тривалої дії, до якого приєднано, але без обмеження, біосумісний матеріал, здатний збільшувати час напівжиття іп мімо. Цей біосумісний матеріал може бути взаємозамінно застосовано з носієм.

Додатково слід зауважити, що інсулінотропний пептид також може існувати у вигляді кон'югату тривалої дії, до якого приєднано, але без обмеження, біосумісний матеріал, здатний збільшувати час напівжиття іп мімо.

У особливому втіленні винаходу, тривалість ефективності вищезазначеного кон'югату зростає у порівнянні з природним глюкагоном або з похідною такого глюкагону, до якої не приєднано носій. Білковий кон'югат за винаходом має назву "кон'югату тривалої дії".

Приклади зазначеного біосумісного матеріалу можуть включати, але без обмеження,

Зо поліетиленгліколь, жирну кислоту, холестерин, альбумін та його фрагмент, альбумін-зв'язуючий матеріал, полімер з повторюючихся одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагменти антитіл, РсКп-зв'язуючий матеріал, зв'язуючу (іп мімо) тканину або її похідну, нуклеотид, фібронектин, трансферин, сахариди та полімери. Наприклад, принаймні один бічний амінокислотний ланцюг у складі пептиду за винаходом може бути прикріплено до цього біосумісного матеріалу з метою покращення його розчинності іп мімо та/або збільшення часу напівжиття та/або покращення його біодоступності. Відомо, що ці модифікації зменшують виведення цих лікувальних білків та пептидів.

Для такого біосумісного полімеру доречним є застосування розчинних (амфіпатичних або гідрофільних), нетоксичних та фармацевтично інертних полімерів та, наприклад, вони можуть включати, але без обмеження, ПЕГ, гомополімери або кополімери ПЕГ, монометил-заміщені полімери (мПЕГ) та поліамінокислоти, як-то полілізин, поліаспарагінову та поліглутамінову кислоти.

Фахівцеві в цій галузі добре відомо, що модифікована таким чином похідна глюкагону матиме набагато кращу, ніж природний глюкагон, лікувальну дію. Відповідно, варіанти похідної глюкагону, як описано вище, також належать до сфери застосування даного винаходу.

У особливому втіленні, похідну глюкагону, наприклад, пептид, який містить амінокислотну послідовність за Загальною Формулою 1 або Загальною Формулою 2 та зазначений інсулінотропний пептид може бути відповідним чином з'єднано з біосумісним матеріалом з допомогою лінкера, вибраного з групи, яка складається, але без обмеження, з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІ А) та полілактид-ко- гліколіду (РІГ ОА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти,) жирної кислоти, полімеру, сполуки з низькою молекулярною масою, нуклеотиду та їх комбінацій.

У більш особливому втіленні, біосумісний матеріал може бути ЕсКп-зв'язуючим матеріалом та похідну глюкагону, наприклад, пептид, який містить амінокислотну послідовність за

Загальною Формулою 1 або за Загальною Формулою 2 та цей інсулінотропний пептид може бути відповідно з'єднано з біосумісним матеріалом із застосуванням, але без обмеження, пептидильного або непептидильного лінкера.

Як окремий приклад, ЕсКп-зв'язуючий матеріал може бути поліпептидом, який включає Ес- ділянку імуноглобуліну.

Як тут застосовано, "непептидильний лінкер"- включає біосумісний полімер, до якого приєднано принаймні дві одиниці, які повторюються. Ті одиниці, які Повторюються є з'єднаними між собою із застосуванням вибіркового ковалентного зв'язку замість пептидного зв'язку.

Непептидильний лінкер може мати такий склад, який утворює фрагмент кон'югату тривалої дії за винаходом.

Як тут застосовано, термін "непептидильний лінкер" може бути застосовано взаємозамінно з "непептидильним полімером".

Додатково слід зауважити, що у певному втіленні цей кон'югат може бути таким, в якому білковий лікарський засіб є ковалентно зв'язаним з Ес-ділянкою імуноглобуліну із застосуванням непептидильного лінкера, який містить хімічно активну групу, яку може бути приєднано до цієї

Ес-ділянки імуноглобуліну та білковий лікарський засіб на обох кінцях кон'югату.

Хоча й не існує особливого обмеження, слід зазначити, що цей непептидильний лінкер може бути вибрано з групи, яка складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РГА) та полілактид-ко-гліколіду (РІГОА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти, полісахариду та їх комбінацій. У більш специфічному втіленні, цей непептидильний полімер може бути, але без обмеження, поліетиленгліколем. Додатково слід зауважити, що до сфери застосування цього винаходу належать як вже відомі в цій галузі похідні, так і ті похідні, які може бути легко отримано згідно до технологічного рівня цієї галузі.

Призначений для застосування за винаходом непептидильний лінкер може бути, але без обмеження, будь-яким полімером, який має стійкість до протеаз іп мімо. Молекулярна маса цього непептидильного полімеру може бути в межах 1 - 100 кДа та переважно, але без обмеження, вона складає 1 - 20 кДа. Додатково слід зауважити, що непептидильний лінкер за винаходом, який є з'єднаним з поліпептидом, який містить Ес - ділянку імуноглобуліну, може містити не тільки один вид полімеру, але й також бути комбінацією різних видів полімерів.

У особливому втіленні, обидва кінці непептидильного лінкера може бути відповідно

Зо приєднано до аміногрупи або до тіолової групи пептиду, яка містить амінокислотну послідовність за Загальною Формулою 1 або інсулінотропний пептид та біосумісний матеріал.

Переважно непептидильний полімер може містити хімічно активну групу на обох кінцях, які, відповідно, може бути з'єднано з Ес - фрагментом імуноглобуліну та похідною глюкагону або інсулінотропного пептиду; та переважно цю хімічно активну групу може бути з'єднано з аміногрупою М-кінця або лізином або з тіоловою групою цистеїну цієї похідної глюкагону або інсулінотропного пептиду або Ес - фрагменту імуноглобуліну.

Додатково слід зауважити, що хімічно активну групу цього непептидильного полімеру, яку може бути з'єднано з Ес - ділянкою імуноглобуліну, похідною глюкагону та зазначеним інсулінотропним пептидом може бути вибрано з групи, яка складається, але без обмеження, з альдегідної групи, малеїімідної групи та сукцинімідної похідної.

У вищезазначеному, приклади альдегідних груп можуть включати, але без обмеження, пропіональдегідну групу або бутиральдегідну групу.

У вищезазначеному, в якості сукцинімідної похідної може бути застосовано, але без обмеження, сукцинімідилвалерат, сукцинімідилметилбутаноат, сукцинімідил- метилпропіонат, сукцинімідилбутаноат, сукцинімідилпропіонат, М-гідроксисукцинімід, гідроксисукцинімідил, сукцинімідилкарбоксиметил або сукцинімідилкарбонат.

Додатково слід зауважити, що кінцевий продукт, отриманий шляхом відновного алкілування через альдегідний зв'язок є більш стійким, ніж подібний продукт, який з'єднано із застосуванням амідного зв'язку. В умовах низького рН альдегідна реакційна група вибірково реагує з М-кінцем, тоді як при високому рН, наприклад, рН 9,0, вона може утворювати ковалентний зв'язок з лізиновим залишком.

Реакційні групи на обох кінцях непептидильного лінкера можуть бути однаковими або різними, наприклад, малеімідну реакційну групу може бути розміщено на одному кінці та альдегідну, пропіональдегідну або бутиральдегідну групу - на іншому. Проте слід зазначити, що у разі, якщо Ес-ділянку імуноглобуліну та похідну глюкагону або інсулінотропний пептид може бути кон'юговано до кожного кінця непептидильного лінкера, то він не є особливо обмеженим.

Наприклад, непептидильний полімер може містити малеіїмідну групу на одному кінці та альдегідну, пропіональдегідну або бутиральдегідну групу на іншому кінці.

У разі, якщо поліетиленгліколь з реакційною гідроксигрупою на обох кінцях цієї сполуки бо застосовано, як непептидильний полімер, то цю гідроксигрупу може бути активовано різними реакційними групами із застосуванням відомих хімічних реакцій або для отримання білкового кон'югату тривалої дії за винаходом може бути застосовано поліетиленгліколь з наявною в продажу модифікованою реакційною групою.

У особливому втіленні непептидильний полімер може бути таким, якого може бути приєднано до цистеїнового залишку похідної глюкагону, особливо, але без обмеження, до -5Н групи цистеїну.

У особливому втіленні цей кон'югат може бути таким, в якому пептид, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО І Мо 12 або 5ЕБО 0 Мо 20 є приєднаним до Ес-ділянки імуноглобуліну із застосуванням непептидильного полімеру та зокрема, цей непептидильний полімер може бути полімером, якого з'єднано, але без обмеження, з цистеїновим залишком, розташованим у положенні 30 амінокислотної послідовності 562 ІЮО Мо 12 або з цистеїновим залишком, розташованим у положенні 17 амінокислотної послідовності зХЕО ІЮО Мо 20.

Якщо застосовано малеїмід-ПЕГ-альдегід, то малеімідну групу може бути з'єднано з -5Н групою похідної глюкагону із застосуванням тіоефірного зв'язку та альдегідну групу може бути з'єднано з -МНг групою Ес-ділянки імуноглобуліну шляхом відновного алкілування (але без обмеження) та все вищезазначене є лише втіленням. "Ес - ділянка імуноглобуліну" за винаходом є ділянкою, яка містить сталу ділянку важкого ланцюга 2 (СН2) та/або сталу ділянку важкого ланцюга З (СНЗ), виключаючи змінні легко- та важколанцюгові ділянки імуноглобуліну. Ес-ділянка імуноглобуліну може бути такою структурою, яка визначає функціональну групу білкового кон'югату за винаходом.

Ця Ес-ділянка імуноглобуліну може містити, але без обмеження, шарнірну ділянку у складі важколанцюгової сталої ділянки. Додатково слід зауважити, що Ес-ділянка імуноглобуліну за винаходом може бути подовженою Ес-ділянкою та включати частину або повну важксоланцюгову сталу ділянку 1 (СНІ) та/або легколанцюгову сталу ділянку 1 (СІ), виключаючи важколанцюгову та легколанцюгову змінні ділянки імуноглобуліну, допоки вона буде зберігати суттєво таку ж саме або кращу дію, ніж природний тип цієї ділянки. Додатково слід зауважити, що ця Ес-ділянка імуноглобуліну за винаходом може бути ділянкою, в якій вилучено досить велику частину амінокислотної послідовності, яка відповідна ділянці СН2 та/або СНЗ.

Наприклад, Ес-ділянка імуноглобуліну за винаходом може бути, але без обмеження, 1) доменом СНІ, доменом СН2, доменом СНЗ та доменом СНЯА; 2) доменом СНІ та доменом СН2;

З) доменом СНІ та доменом СНЗ; 4) доменом СНО та доменом СНЗ; 5) поєднанням одного або двох або більше доменів, вибраних з домену СНІ, домену СН2, домену СНЗ та домену СНА та шарнірної ділянки імуноглобуліну (або частини цієї шарнірної ділянки); та б) димером між кожним доменом важколанцюгової сталої ділянки та легколанцюгової сталої ділянки.

Додатково слід зауважити, що у певному втіленні ця Ес-ділянка імуноглобуліну може знаходитися в химерній формі та одну молекулу похідної глюкагону або інсулінотропного пептиду може бути ковалентно з'єднано з Ес-ділянкою в химерній формі та зокрема, Ес-ділянку імуноглобуліну та похідну глюкагону або інсулінотропний пептид може бути з'єднано між собою з допомогою непептидильного полімеру. Крім того, є можливість того, щоб дві молекули цієї похідної глюкагону або інсулінотропного пептиду було кон'юговано симетричним чином з одиничною Ес-ділянкою в димерній формі. Зокрема, але без обмеження описаними вище втіленнями, Ес-ділянку імуноглобуліну та похідну глюкагону або інсулінотропний пептид може бути з'єднано між собою із застосуванням непептидильного лінкера.

Додатково слід зауважити, що Ес-ділянка імуноглобуліну за винаходом містить не тільки природну амінокислотну послідовність, але й також послідовність, яка є її похідною. Похідна амінокислотної послідовності є амінокислотною послідовністю, яка відрізняється від батьківської принаймні одним амінокислотним залишком внаслідок видалення, вставки, неконсервативного або консервативного заміщення або комбінації цих операцій.

Наприклад, як прийнятні місця для модифікації може бути застосовано амінокислотні залишки у положеннях 214 - 238, 297 - 299, 318 - 322 та 327 - 331, які, як відомо, є залученими у зв'язуванні Ес-ділянки імуноглобуліну.

Додатково слід зауважити, що можливо й застосування різних інших похідних, включаючи похідних, в яких видалено ділянку, здатну утворювати дисульфідний зв'язок або видалено деякі амінокислотні залишки на М-кінці природної Ес-ділянки імуноглобуліну або до складу яких додано метіоніновий залишок на М-кінці природної Ес-ділянки імуноглобуліну. Додатково, з метою усунення ефекторних дій може бути здійснено видалення у комплемент-зв'язуючій ділянці, як-то у ділянці зв'язування Сід та у ділянці залежної від антитіл клітинно- опосередкованої цитотоксичності (АЮСС). Способи отримання таких похідних послідовності Ес- ділянки імуноглобуліну висвітлено в Міжнародних Патентних Публікаціях МоМео УМО 97/34631, 60 УМО 96/32478 тощо.

В цій галузі досить відомі амінокислотні заміщення у складі білків та пептидів, які загальним чином не змінюють їх активності (Н. Мешгаїй, Н. Г. НіЇїЇї, Те Ргоїевіпз ("Білки"), Асадетіс Ргевв,

Мем ХогК, 1979). Найбільш часто розповсюдженими заміщеннями є заміщення АїЇа/5ег, мМаїІЛіе,

Азр/Ссім, Тиг/Зег, АІа/Сту, АІа/Тнг, Зег/Азп, АІа/Маї, Зег/сіу, Тпу/РНе, Аїа/Рго, Гув/Аго, Авр/Авп,

ГешлЛІєе, Геши//аїЇ, Аіа/сІШ та Авр/сІу, які можна здійснювати в обох напрямках. Додатково за необхідністю Ес-ділянку може бути змінено шляхом фосфорилювання, сульфатування, акрилування, глікозилювання, метилування, фарнесілювання, ацетилювання, амідування тощо.

У вищезазначених описаних похідних Ес-ділянки імуноглобуліну було виявлено біологічну активність, ідентичну активності Ес-ділянки за винаходом та покращену структурну стійкість проти нагрівання, рН тощо.

Ес-ділянку імуноглобуліну також може бути отримано з природних форм, виділених іп мімо з тварин, як-то корів, кіз, свиней, мишей, кролів, хом'яків, щурів, морських свинок тощо або людини або ці послідовності можуть бути рекомбінантами або їх похідними, отриманими з трансформованих клітин тварин або мікроорганізмів. Зазначену тут Ес-ділянку може бути отримано від природного імуноглобуліну шляхом виділення цілого імуноглобуліну з живого організму людини або тварини з наступною обробкою цього виділеного імуноглобуліну протеазою. У разі обробки цільного імуноглобуліну папаїном він розщеплюється на ділянки Гар та Ес, тоді як у разі обробки цільного імуноглобуліну пепсином він розщеплюється на фрагменти рЕс та БЕ(ар)». Фрагменти Ес або рЕс може бути виділено з допомогою ексклюзійної хроматографії тощо. У особливому втіленні Ес-ділянка людського походження є отриманою з мікроорганізму рекомбінантною Ес-ділянкою імуноглобуліну.

Додатково Ес-ділянка імуноглобуліну може мати природні глікани, збільшені або зменшені у порівнянні з природним типом або знаходитися у деглікозилованій формі. Таке збільшення, зменшення або вилучення гліканів імуноглобуліну Ес може бути здійснено із застосуванням загальноприйнятних способів, як-то хімічний спосіб, ферментативний спосіб та генно- інженерний спосіб із застосуванням мікроорганізму. Ес-ділянка імуноглобуліну, яку було отримано шляхом вилучення гліканів з Ес-ділянки виявила значне зменшення зв'язуючої афінності до частини С1д та зменшення або втрату залежної від антитіл або комплемент - залежної цитотоксичності, отже вона не викликає небажаних імунних відповідей іп мімо. В зв'язку

Зо з цим, Ес-ділянка імуноглобуліну в деглікозилованій або аглікозилованій Ес-ділянці імуноглобуліну, як носій лікарського засобу може бути більш прийнятною формою для задоволення головної мети винаходу.

Як тут застосовано, термін "деглікозилування" стосується ферментативного вилучення цукрових груп від Ес-ділянки та термін "аглікозилування" стосується отриманих з прокаріот, переважно з Е. соїї., неглікозилованих Ес-ділянок.

Серед іншого Ес-ділянка імуноглобуліну може мати тваринне походження, тобто походити від людини або інших тварин, як-то корів, кіз, свиней, мишей, кролів, хом'яків, щурів, морських свинок тощо. У більш специфічному втіленні вона має людське походження.

Додатково Ес-ділянку (Ід) імуноглобуліну може бути отримано з імуноглобулінів типу да,

ІЧА, дО, І9ЗЕ, ІдМ або з їх комбінацій або гібридів. У більш специфічному втіленні вона походить від імуноглобулінів Ід або ІдМ, які є одними з найбільш поширених білків людської крові. У більш специфічному втіленні вона походить від імуноглобуліну дос, який, як відомо, збільшує час напівжиття ліганд-зв'язуючих білків. У більш специфічному втіленні ця Ес-ділянка імуноглобуліну є Ес-ділянкою Ідс4 та у найбільш переважному втіленні, але без обмеження, Ес- ділянка Ідс4 є аглікозилованою Ес-ділянкою, яка походить від людського імуноглобуліну Ід.

Як тут застосовано, під терміном "комбінація" мається на увазі, що поліпептиди, які кодують одноланцюгові Ес-ділянки імуноглобуліну однакового походження є оприєднаними до одноланцюгового поліпептиду іншого походження з утворенням димеру або мультимеру. Отже, димер або мультимер може бути утворено з двох або більше фрагментів, вибраних з групи, яка складається з фрагментів Есо-ділянок дО Ес, ІдА Ес, ЗМ Ес, дО Ес та ІЧЗЕ Ес.

Композицію за винаходом може бути застосовано для профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічних синдромів.

Як тут застосовано, термін "профілактика" стосується всіх видів дій, пов'язаних з пригніченням або затриманням виникнення гіпоглікемії або метаболічного синдрому із застосуванням введення цього пептиду або композиції. Термін "лікування" стосується всіх видів дій, пов'язаних з покращенням або з впровадженням бажаних змінень симптомів гіпоглікемії або метаболічного синдрому із застосуванням введення цього пептиду або композиції.

Як тут застосовано, термін "введення" стосується введення пацієнту окремого матеріалу із застосуванням відповідного способу. Композицію може бути введено із застосуванням бо загального шляху, який забезпечує доставляння цієї композиції у потрібну тканину іп мімо,

наприклад, але без особливого обмеження, шляхом внутрішньочеревинного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, внутрішньошкірного, перорального, місцевого, інтраназального, внутрішньолегеневого та внутрішньоректального введення.

Як тут застосовано, термін "метаболічний синдром" стосується симптому одиничного або комплексного виникнення різних хвороб, викликаних хронічним метаболічним розладом.

Зокрема приклади метаболічного синдрому можуть включати, але без обмеження, порушення механізму засвоєння глюкози, гіперхолестеринемію, дисліпідемію, ожиріння, цукровий діабет, гіпертонію, неалкогольний стеатогепатит (МАН), атеросклероз, спричинений дисліпідемією, атеросклероз, артеріосклероз, ішемічну хворобу серця, інсульт тощо.

Як тут застосовано, термін "ожиріння" стосується медичного стану з надлишковою масою жиру в організмі та діагноз "ожиріння" надається особі з індексом маси тіла (ВМІ; тобто величиною маси тіла (кг), розділеною на висоту тіла у квадраті (м)), який складає 25 або вище.

Ожиріння здебільшого виникає завдяки довготривалому енергетичному дисбалансу, в якому надходження енергії перевищує її витрати. Ожиріння є метаболічною хворобою, яка уражає весь організм та призводить до збільшення ризику виникнення цукрового діабету, гіперліпідемії, статевих розладів, артриту, серцево-судинних захворювань та у певних випадках його також пов'язують з виникненням онкологічних хвороб.

Цукровий діабет також може бути "гіпоглікемією" у вигляді гострого симптому.

Як тут застосовано, термін "гіпоглікемія" стосується гострого симптому цукрового діабету, в якому рівні глюкози в крові є нижчими, ніж рівні глюкози в крові здорової людини та головним чином він стосується стану, коли рівні глюкози в крові складають 50 мг/дл або менше.

Гіпоглікемія частіше виникає, коли особа, яка вживає пероральний гіпоглікемічний засіб або інсулін вживає їжі менше, ніж звичайно або більш, ніж звичайно здійснює активну діяльність або вправи. Також гіпоглікемія може відбуватися внаслідок застосування лікарських засобів, які зменшують рівень глюкози в крові, може бути викликаною важкою фізичною хворобою, нестачею певних гормонів, адренокортикальних гормонів та глюкагону, наявністю пухлини у підшлунковій залозі, яка виробляє інсулін, автоїмунним інсуліновим синдромом чи виникати у пацієнтів з гастроектомією або спадковим розладом вуглеводного обміну тощо.

Симптоми гіпоглікемії включають слабкість, тремтіння, блідість шкіри, холодне потіння,

Зо запаморочення, збудження, тривогу, стукіт серця, відчуття порожнього шлунку, головний біль, втому тощо. У випадку стійкої гіпоглікемії, це може призвести до конвульсії або пароксизму, а також може спричинити шок та, таким чином, непритомність.

Фармацевтична композиція за винаходом може містити фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розріджувач. Як тут застосовано, термін "фармацевтично прийнятний" стосується властивостей, які полягають у наявності достатнього рівня для виявлення лікувальної дії та не викликають побічних ефектів та які може бути легко визначено досвідченим фахівцем в цій галузі на основі факторів, які є добре відомими в медицині, як-то тип хвороби, вік, маса тіла, стан здоров'я, стать та чутливість пацієнта до ліків, шлях та частота введення, тривалість лікування, лікарський препарат, який потрібно змішувати або вводити одночасно в комбінації тощо.

Фармацевтична композиція за винаходом, яка містить пептид за винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний носій, який для перорального введення може включати зв'язувач, глідант, розпушувач, наповнювач, солюбілізатор, диспергатор, суспендуючий засіб, барвник, ароматизатор тощо. Для ін'єкційного введення цей носій може включати буферизуючий засіб, консервант, анальгетик, солюбілізатор, ізотонічний засіб, стабілізатор тощо, які може бути поєднано для застосування; та для місцевого введення цей носій може включати, але без обмеження, основу, наповнювач, мастило, консервант тощо.

Препарат типу композиції за винаходом може бути отримано по-різному, поєднуючи його з фармацевтично прийнятним носієм, як описано вище. Наприклад, для перорального введення, цю композицію може бути отримано у вигляді таблеток, драже, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток тощо. Для ін'єкцій її може бути отримано у вигляді ампул з одноразовою дозою або багатодозових контейнерів. Цю композицію також може бути отримано у вигляді розчинів, суспензій, таблеток, капсул та композицій з уповільненим вивільненням.

В той же час приклади прийнятних носіїв, наповнювачів та розріджувачів можуть включати лактозу, декстрозу, цукрозу, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит, мальтит, крохмаль, акацієвий каучук, альгінат, желатин, фосфат кальцію, силікат кальцію, целюлозу, метилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, воду, метилгідроксибензоат, пропілгідроксибензоат, тальк, стеарат магнію, мінеральну оливу тощо. Крім того, композиція може додатково містити наповнювач, антикоагулянт, мастило, зволожувач, ароматизатор, бо консервант тощо.

Додатково слід зазначити, що фармацевтичну композицію за винаходом може бути отримано у вигляді препарату будь-якого типу, вибраного з групи, яка складається з таблеток, пігулок, порошків, гранул, капсул, суспензій, рідких лікарських засобів для внутрішнього застосування, емульсій, сиропів, стерильних ін'єкційних розчинів, неводних розчинників, ліофілізованих композицій та супозиторіїв.

Додатково слід зазначити, що цю композицію може бути отримано у вигляді одиничної дозованої лікарської форми, прийнятної для організму пацієнта та переважно у вигляді препарату, корисного для пептидних лікарських засобів згідно за застосованим у фармацевтичної галузі типовим способом виробництва пептидних лікарських засобів та призначено для введення пероральним або парентеральним шляхом, як-то, але без обмеження, для введення через шкіру або шляхом внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньоартеріального, внутрішньомедулярного, інтратекаль- ного, інтравентрикулярного, легеневого, трансдермального, підшкірного, внутрішньо- черевного, інтраназального, внутрішньошлункового, місцевого, сублінгвального, вагінального або ректального введення.

Додатково слід зауважити, що цей пептид може бути застосовано шляхом змішування з різними фармацевтично прийнятними носіями, як-то фізіологічний розчин або органічні розчинники. З метою покращення стійкості або поглинальної здатності також може бути застосовано вуглеводи, як-то глюкозу, цукрозу або декстрани; антіоксиданти, як-то аскорбінову кислоту або глутатіон; хелатні засоби; низькомолекулярні білки або інші стабілізатори.

Дозу введення та частоту фармацевтичної композиції за винаходом визначають в залежності від типу активного інгредієнту (інгредієнтів) та інших різних факторів, як-то хвороби, яку треба лікувати та її тяжкості, шляху введення та маси тіла та статі пацієнта.

Загальну ефективну дозу композиції за винаходом може бути введено пацієнту у вигляді одиночної дози або її може бути введено у багатьох дозах протягом тривалого періоду часу згідно за схемою фракціонованого лікування. Вміст активного інгредієнта (інгредієнтів) у фармацевтичній композиції за винаходом може змінюватися в залежності від тяжкості захворювання. Докладно кажучи, бажана загальна щоденна доза пептиду за винаходом може складати приблизно 0,0001 мкг - 500 мг/1 кг маси тіла пацієнта. Проте слід зазначити, що ефективну дозу цього пептиду визначають, розглядаючи різні фактори, включаючи вік та масу тіла пацієнта, його стан здоров'я та стать, тяжкість захворювання, раціон та швидкість виведення на додачу до шляху введення та частоти лікування із застосуванням цієї фармацевтичної композиції. В зв'язку з цим досвідчений в цій галузі фахівець може легко визначити ефективну дозу, яка буде прийнятною для певного застосування фармацевтичної композиції за винаходом. Фармацевтична композиція за винаходом не є специфічно обмеженою препаратом та шляхом та способом введення допоки вона буде виявляти потрібну дію за винаходом.

Фармацевтична композиція за винаходом виявила відмінні тривалість ефективності та титр іп мімо, отже кількість та частоту введення фармацевтичного препарату за винаходом може бути значно зменшено.

Зокрема, оскільки фармацевтична композиція за винаходом як активний інгредієнт містить похідну глюкагону зі зміненим рі, який відрізняються від рі природного глюкагону, вона виявила покращену розчинність та високу стійкість згідно за показником рН вибраного розчину, отже фармацевтичну композицію за винаходом може бути ефективно застосовано для отримання стійкого глюкагонового препарату для лікування гіпоглікемії або ожиріння.

В іншому аспекті, винахід стосується нової похідної глюкагону, яка є такою, як зазначено вище.

Докладно кажучи, ця похідна відрізняється тим, що вона є виділеним пептидом, який містить амінокислотну послідовність за наступною Загальною Формулою 2.

У-Аір-ОСТЕ-Х7-50-Х10-5-Х12-У-І-Х15-Х16-Х17-8-А-Х20-Х21-Е-М-Х24-М1-І -М-М-Т-Х30 (Загальна Формула 2, ЗЕО ІЮО Мо 46) в якій:

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою або серином;

Х17 є лізином або аргініном;

Х20 є глутаміном або лізином;

Х21 є аспарагіновою кислотою або глутаміновою кислотою; 60 Х24 є валіном або глутаміном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім,

Якщо амінокислотна послідовність за Загальною Формулою 2 є ідентичною будь-якої з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 14, 19, 20, 25, 27, 31 та 33, її може бути виключено.

Докладно кажучи, амінокислотну пару Х16 та Х20 за Загальною Формулою 2 може бути заміщено, відповідно, глутаміновою кислотою або лізином, здатним утворювати кільце, тим самим утворюючи кільце (наприклад, лактамне кільце) із застосуванням амінокислотної пари

Х16 та Х20, але без обмеження.

Додатково слід зазначити, що може бути амідовано, але без обмеження, С-кінець пептиду, який містить амінокислотну послідовність за Загальною Формулою 2.

Додатково слід вказати, що зазначений пептид може бути похідною глюкагону, здатною до активування глюкагонового рецептора, але без обмеження.

Докладно кажучи, цей пептид може містити амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається, але без обмеження, з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМое 12, 13, 15 та 36 - 44.

У іншому аспекті, винахід стосується виділеного полінуклеотиду, кодуючого похідну глюкагону, вектора, який містить цей полінуклеотид та виділеної клітини, яка містить цей полінуклеотид або вектор.

Зазначена похідна глюкагону є такою саме, як зазначено вище.

Також слід зауважити, що виділений полінуклеотид, кодуючий похідну глюкагону за винаходом містить полінуклеотидну послідовність, гомологія якої до відповідної послідовності складає 75 95 або вище, особливо 85 95 або вище, переважно 90 95 або вище та більш переважно 95 95 або вище.

Як тут застосовано, термін "гомологія" вказує на подібність послідовності до амінокислотної або нуклеотидної послідовності дикого типу та порівняння цієї гомології може бути здійснено неозброєним оком або з допомогою наявної у продажу програми для порівняння, з допомогою якої гомологію між двома або більше послідовностями може бути виражено у відсотковому (95) вигляді та також може бути обчислено відсоткову гомологію між суміжними послідовностями.

Як тут застосовано, термін "рекомбінантний вектор" стосується конструкції ДНК, яка містить полінуклеотидну послідовність, яка кодує потрібний пептид, наприклад, похідну глюкагону, та яку функціонально з'єднано з відповідною регуляторною послідовністю для можливої експресії цього пептиду, наприклад, похідної глюкагону, у клітині-хазятїні.

Ця регуляторна послідовність містить здатний до ініціації транскрипції промотор, будь-яку послідовність-оператор для регулювання транскрипції, послідовність, яка кодує відповідний домен рибосомального зв'язування РНК та послідовність, яка регулює закінчення транскрипції та трансляції. Після трансформації у прийнятну клітину-хазяїна цього рекомбінантного вектора може бути здійснено його реплікацію або він може функціонувати незалежно від генома -хазяїна або його може бути інтегровано в цей геном.

Застосований у винаході рекомбінантний вектор може не бути особливо обмеженим допоки він є здатним до реплікації у клітині-хазяїні та його може бути побудовано із застосуванням будь-якого відомого в цій галузі вектора. Приклади звичайно застосованих векторів можуть включати природні або рекомбінантні плазміди, косміди, віруси та бактеріофаги. Вектори для застосування у винаході може бути вибрано з будь-якого відомого в цій галузі вектора експресії.

Рекомбінантний вектор застосовують для трансформації клітини-хазяїна для отримання похідних глюкагону за винаходом. Додатково слід зауважити, що ці трансформовані клітини, як частина винаходу, може бути застосовано для ампліфікації фрагментів нуклеїнових кислот та векторів або вони можуть бути культивованими клітинами або клітинними лініями, застосованими для рекомбінантного вироблення похідних глюкагону за винаходом.

Як тут застосовано, термін "трансформація" стосується процесу введення у клітину-хазяїн рекомбінантного вектора, який містить полінуклеотид, який кодує потрібний білок, що тим самим робить можливим експресію в цій клітині білка, який він кодує. Для трансформованого полінуклеотиду немає значення, чи буде його вставлено в хромосому клітини-хазяїна та розташовано в цій хромосомі, чи його буде розташовано поза нею допоки буде зберігатися можливість його експресії, отже винахід стосується обох цих варіантів.

Додатково цей полінуклеотид містить ДНК та РНК, які кодують бажаний білок. Цей полінуклеотид може бути вставлено у будь-якій формі, яку може бути введено у клітину-хазяїна та досягнуто там її експресію. Наприклад, полінуклеотид може бути введено у клітину-хазяїна у вигляді касети експресії, яка є генетичною конструкцією та містить всі необхідні потрібні для самостійної експресії елементи. Звичайно така касета може містити промотор, функціонально приєднаний до цього полінуклеотиду, сигнал термінації транскрипції, домен, який зв'язується з рибосомою та сигнал термінації трансляції. Ця касета експресії також може знаходитися у 60 вигляді здатного до самостійної реплікації вектора експресії. Додатково слід зауважити, що зазначений полінуклеотид може бути введено у клітину-хазяїна, але без обмеження, у такому стані, як він є та функціонально з'єднаним з послідовністю, необхідною для його експресії у клітині-хазяїні.

Слід зазначити, що, як тут застосовано, термін "функціонально з'єднаний" стосується функціонального зв'язку між промоторною послідовністю, яка розпочинає та опосередковує транскрипцію полінуклеотиду, кодуючого бажаний пептид за винаходом та вищезазначену генну послідовність.

Прийнятний для застосування у винаході хазяїн не може бути певним чином обмеженим допоки він може бути здатним до експресії полінуклеотиду за винаходом. Приклади відповідних хазяїв можуть включати бактерії, які належать до роду ЕвзсПегісніа, як-то Е. сої; бактерії, які належать до роду ВасіїІш5, як-то Васіи5 взибійв; бактерії, які належать до роду Рзейдотопав, як- то Реєцдотопаз риййда; дріжджі, як-то Рісніа рабвіогіх, Засспаготусе5 сегемізіає та

Зепіговзасспаготусез ротбре; клітини комах, як-то Бродорієга Пидірегда (519) та тваринні клітини, як-то СНО, СО5 та В5С.

У іншому аспекті, винахід стосується виділеного кон'югату, в якому з'єднано похідну глюкагону та біосумісний матеріал, здатний збільшувати час напівжиття іп мімо. Цей кон'югат може бути кон'югатом тривалої дії.

Стосовно похідною глюкагону, то було застосовано все з наведеного вище відносно біосумісного матеріалу та будови кон'югату.

Особливо біосумісний матеріал може бути вибрано з групи, яка складається, але без обмеження, з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та його фрагменту, альбумін-зв'язуючого матеріалу, полімеру з повторюючихся одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагмента антитіла, ЕсКп-зв'язуючого матеріалу, сполучної (іп мімо) тканини або її похідної, нуклеотиду, фібронектину, трансферину, сахариду та полімеру.

Додатково виділений пептид може бути з'єднано з біосумісним матеріалом з допомогою лінкера, вибраного з групи, яка складається, але без обмеження, з полієтиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІ А) та полілактид-ко-гліколіду (РІ СА),

Зо ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти, жирної кислоти, полімеру, сполуки з низькою молекулярною масою, нуклеотиду та їх комбінацій.

Також біосумісний матеріал може бути ЕРсКп-зв'язуючим матеріалом та виділений пептид може бути з'єднано з біосумісним матеріалом з допомогою пептидильного або непептидильного лінкера, вибраного з групи, яка складається, але без обмеження, з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксиетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, як-то полімолочної кислоти (РІ А) та полілактид-ко-гліколіду (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти та їх комбінацій.

Також ЕсКп-зв'язуючий матеріал може бути поліпептидом, який містить, але без обмеження,

Ес-ділянку імуноглобуліну.

Ця похідна глюкагону та виділений кон'югат є такими, як зазначено вище.

Ця композиція переважно може бути, але без обмеження, фармацевтичною композицією для лікування або профілактики гіпоглікемії або метаболічного синдрому. Ця фармацевтична композиція є такою, як зазначено вище.

Додатково слід зауважити, що ця композиція може бути композицією, яка містить пептид амінокислотної послідовності за наступною Загальною Формулою 2.

Х7 є треоніном, валіном або цистеїном;

Х10 є тирозином або цистеїном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою або серином;

Х17 є лізином або аргініном;

Х20 є глутаміном або лізином;

Хаг1 є аспарагіновою кислотою або глутаміновою кислотою; 60 Х24 є валіном або глутаміном; та

ХО є цистеїном або є відсутнім.

У іншому аспекті, винахід стосується способу профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічного синдрому, який полягає у введенні пацієнту вищезазначеної композиції.

Ця композиція, гіпоглікемія, метаболічний синдром, їх профілактика та лікування є такими, як зазначено вище.

Термін "пацієнт" за винаходом стосується суб'єктів, щодо яких є підозра, що вони мають гіпоглікемію або метаболічний синдром та охоплює ссавців, включаючи людину, мишей та домашню худобу, які мають гіпоглікемію або метаболічний синдром або які мають ризик виникнення гіпоглікемії або метаболічного синдрому. Проте слід зазначити, що до цієї групи включено без обмеження будь-який суб'єкт, якій підлягає лікуванню із застосуванням похідної глюкагону за винаходом або композиції, яка її містить. Також слід зазначити, що пацієнт, який має підозру на гіпоглісемію або ожиріння може бути ефективно підданим лікуванню із застосуванням введення фармацевтичної композиції, яка містить похідну глюкагону за винаходом. Вказані гіпоглікемія та ожиріння є такими ж, як зазначено вище.

Спосіб за винаходом може полягати у введенні фармацевтичної композиції, яка містить зазначений пептид у фармацевтично ефективній кількості. Загальна щоденна доза повинна бути визначеною лікарем в межах відповідного лікарського розсуду та введеною одноразово або за кілька разів у вигляді розділених доз. Щодо об'єктів за винаходом, то певну терапевтично ефективну дозу для будь-якого окремого пацієнта може бути переважно застосовано по- різному, в залежності від різних добре відомих в медичній галузі факторів, включаючи вид та ступінь відповіді, якої треба досягти, специфічні композиції, включаючи наявність чи відсутність інших інколи застосованих при цьому засобів, вік пацієнта, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать та раціон, час та шлях введення, швидкість виведення композиції, тривалість лікування, інші лікарські засоби, які було застосовано у поєднанні або одночасно з композицією за винаходом та добре відомі в медичній галузі подібні фактори.

У іншому аспекті, винахід стосується застосування зазначеної похідної глюкагону або виділеного кон'югату або композиції у отриманні лікарського засобу (або фармацевтичної

Зо композиції) для профілактики або лікування гіпоглікемії або метаболічного синдрому.

Ця похідна глюкагону, виділений кон'югат, композиція, гіпоглікемія та метаболічний синдром є такими, як зазначено вище.

Тут та надалі винахід буде більш детально описано з посиланням на наведені нижче приклади та експериментальні приклади. Тим не менш, наведені нижче приклади та експериментальні приклади надано лише з ілюстративною метою та не повинні будь-яким чином обмежувати суть цього винаходу.

Приклад 1: Отримання клітинної лінії, яка виявляє ЦАМФ - відповідь до глюкагону.

Ділянку, яка відповідала відкритій рамці зчитування (ОКЕ) кКДНК (Огісепе Тесппоподіев, Іпс.,

О5А) людського гена глюкагонового рецептора було застосовано, для здійснення ПЛР-реакції, як матрицю разом з наступними прямим та зворотнім праймерами (відповідно, послідовності,

ЗЕО ІЮ МоМо 47 та 48), які містили кожен з сайтів рестрикції ЕсоОВіІ та ХНОоЇ.

Зокрема загалом було здійснено 30 циклів ПЛР в наступних умовах: б60-секундна денатурація при 95 "С, 60-секундний відпал при 55 "С та 30-секундна полімеризація при 68 "С.

Потім було здійснено 1,0 95 агарозний гель-електрофорез отриманих ампліфікованих продуктів

ПЛР та шляхом елюювання отримано смужку розміром 450 кб.

Прямий праймер (ЗЕО ІО Мо 47): 5-сдаСспАСАсСсаАсСатооССССатАСТТААС,ИСО-3'

Зворотній праймер (ЗЕО ІО Мо 48): 5-СТААССсАСстТо теааапААсАСстадастоаоо-3"

Продукт ПЛР було піддано клонуванню у відомому векторі експресії для тваринних клітин хост з отриманням рекомбінантного вектора хосС/зСоОг.

Клітинну лінію СНО 0044 було культивовано у середовищі ОМЕМ/Е12 (10 95 фосфатно- сольового буферу (ЕВ5)) та здійснено трансфекцію рекомбінантним вектором хоосС/ЗСОкК із застосуванням препарату І іроїесіатіпе?, після чого культивування тривало у селективному середовищі, яке містило генетицин (5418 (1 мг/мл) та метотрексат (10 нМ). Відбір з цього середовища одиночних клональних клітинних ліній було здійснено із застосуванням способу граничного розведення, після чого з них зрештою було відібрано клітинні лінії, які виявили відмінну ЦАМФ - відповідь на глюкагон залежним від концентрації чином.

Приклад 2: Синтез похідної глюкагону.

Для отримання похідних глюкагону з покращеними фізичними властивостями амінокислотну послідовність природного глюкагону ЗЕО ІЮ Мо 1 було заміщено амінокислотними залишками, які мали додатні та від'ємні заряди та тим самим було синтезовано похідні глюкагону, наведені нижче у Таблиці 1. Описані нижче відносні активні властивості іп міто було виміряно із застосуванням способу, описаного у Прикладі 4.

Таблиця 1

Амінокислотні послідовності природного глюкагону та похідні глюкагону

ЗЕО ІЮ Мо Пептидна послідовність Утворення Активність іп міго кільця (відносна активність послідовності ЗЕС

ІЮ Мо 1, 95)

ЗЕ ІЮ НЗОСТЕТ5ОУЗКМІ ОБВВАОВСЕМОМІ ММТ поли ли

Мо 1

ЗЕ ІЮ НЗОСТЕТ5ОУЗКМУІ ОСОВАОВЕМОМІ ММТ в

Мо 2

ЗЕ ІЮ НЗОСТЕТ5ОУЗКМУІ ОСЕВАОВСЕМОМІ ММТ поли сл

Мо З

ЗЕ ІЮ НЗОСТЕТ5ОУЗКМІ ОБСВАОСЕМОМІ ММТ р

Мо 4

ЗЕ ІЮ НЗОСТЕТ5ОУЗКМІ ОБСЕАДОВЕМОМЛ ММТ поли си ел

Мо 5

ЗЕ ІЮ НЗОСТЕТ5ОУЗКМІ ОЗСЕАООЕМОМІ ММТ р

Мо 6

ЗЕ ІЮ УБОСТЕТ5ОУЗКМІ ОБСЕАООЕМОМІ ММТ пол ше сх

Мо 7

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5ОРУЗКМІ ОБСОАОВЕМОУМИМТ поли ше сх

Мо 8

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5ОРУЗКМІ ОБСОАОВЕММУМИМТ пол ие

Мо 9 5ЕОЇІЮ | УХОСТЕТЗОУ5КУЇ ОБСОАООЕМУУЛИІМТ поли ше сх

Мо 10 5ЕОІЮ | УХОСТЕТЗОУ5КУЇ ОБКСАКЕЕМОМІ ММТ поли ел

Мо 11

ЗЕОІЮ | УХОТЕТ50УЗКМУІ ОЕКВАКЕРМОМІ ММТС | кільце 6,20 56,3

Мо 12 утворено

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5рУВЗСХУЇ ОБАВАОВЕМОМІ ММТ поли си ен

Мо 13

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5РУЗКМІ ОСКВАКЕЄЕМОУМІ ММТ похо ха

Мо 14

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5РУЗКУІ СЕКВАОВЕМУУМІ ММТ и

Мо 15

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5рУЗКМІ ОСВВАОМЕМОМІ МАТ похо хе

Мо 16

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5рУЗКМІ ОСУВАОВЕМОМІ МАТ я

Мо 17

ЗЕ ІЮ УХОСТЕТ5рУЗКМІ ОБВВАСОЕВІГ МІ ММТ р

Мо 18 5ЕОІЮ | УХОСТЕТ5ОУЗКУ! СЕКВАКЕРМОМІ ММ | кільце 8,12 121

Мо 19 утворено 5ЕОІЮ | УХОСТЕТ5ОУЗКУ СЕСВАКЕРМОМІ ММ | кільце 4,78 299,7

Мо 20 утворено 5ЕОІЮ | УХОСТЕТ5ОУЗКУ СЕКСАКЕРМОМІ ММ | кільце 4,78 57,8

Мо 21 утворено 5ЕОІЮ | УХОСТЕТ5ОУЗКУ СЕКВСКЕРМОМІ ММ | кільце 6,20 147,8

Мо 22 утворено

Таблиця 1

Мо 23 утворено

Мо 24 утворено

Мо 25 утворено

Мо 26 утворено

Мо 27 утворено

Мо 28 утворено

Мо 29 ворено

Мо 30 ворено

Мо 31 утворено

Мо 32 утворено оо (твою

Мо 33

Мо 34 утворено

Мо 35 утворено

ЕКО Бійка ЧИЯ НИ

Мо 36 утворено

Мо 37 утворено

Мо 38 утворено

Мо 39 утворено

Мо 40 утворено

Мо 41 утворено по (отюсютенканянни в

Мо 42 жо (тео Ов

Мо 43 ло Готово 1

Мо 44

Літерою Х у складі описаних у Таблиці 1 амінокислотних послідовностей позначено амінокислоту неприродного походження, аміноїзомасляну кислоту (АЇБ), підкреслені амінокислотні залишки залучено до утворення кільця та позначка "-" у цих амінокислотних послідовностях вказує про відсутність амінокислотного залишку у відповідному положенні.

Приклад 3: Вимірювання рі похідних глюкагону.

Для вимірювання покращених фізичних властивостей синтезованих у Прикладі 2 похідних глюкагону було здійснено обчислення показників рі на основі амінокислотних послідовностей із застосуванням інструменту обчислення рі/мму (пер://ехразу.огоаЛооїв/рі То0ї.пІті; Савієїдег еї аї., 2003) на сервері ЕХРА5БУ.

Як показано вище у Таблиці 1, в той час, як природний глюкагон з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо 1 має рі 6,8, деякі похідні глюкагону за винаходом виявили значення рі в межах приблизно 4 - 6.

Оскільки похідні глюкагону за винаходом мають значення рі, які є меншими або перевищують цей показник для природного глюкагону, вони можуть виявити покращену розчинність та більшу стійкість в умовах нейтрального рН порівняно до природного глюкагону.

Відповідно, у разі застосування похідних глюкагону за винаходом, як лікарських засобів для лікування гіпоглікемії, вони можуть покращити дотримання пацієнтом режиму лікування та також є прийнятними для введення у комбінації з іншими засобами для лікування ожиріння або засобами для лікування цукрового діабету, отже похідні глюкагону за винаходом може бути ефективно застосовано, як лікарські засоби для лікування гіпоглікемії та метаболічних синдромів, включаючи ожиріння, цукровий діабет, неалкогольний стеатогепатит (МАБН), дисліпідемію та ішемічну хворобу серця.

Приклад 4: Вимірювання цАМФ - активності похідних глюкагону.

Активні властивості синтезованих у Прикладі 2 похідних глюкагону було виміряно у клітинних лініях, які мали отримані у Прикладі 1 глюкагонові рецептори людини. Докладно кажучи, трансфіковану клітинну лінію пересівали 3 - 4 рази на тиждень та аліквоти зразків нанесли на 384-лунковий планшет у кількості бх103 клітин на лунку та культивували протягом 24 год. Природний глюкагон та похідні глюкагону суспендували у буфері збалансованого сольового розчину Хенкса (НВ55), який містив 0,5 мМ 3-ізобутил-1-метилксантину (ІВМХ), 0,1 95 бичачий сироватковий альбумін (ВЗА) та 5 мМ 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазинетансульфонову кислоту (НЕРЕЗ5) з культуральними клітинами з концентраціями, які, відповідно, складали 200 нМ та 1600 нМ, після чого їх десять разів піддали безперервному 4-разовому розведенню та застосували для набору цАМФ (1АМСЕ сАМР 384 Кії, РегкіпЕІтег) із додаванням до культивованих клітин та вимірюванням значення їх флюоресценції. В момент вимірювання найвищий показник флюоресценції було вибрано, як 100 95 та потім на цій основі було обчислено значення ЕСобхо похідної глюкагону та порівняно їх з подібними значеннями відповідно для природного глюкагону. Результати наведено вище у Таблиці 1.

Приклад 5: Отримання кон'югату, який містить похідну глюкагону та Ес-ділянку імуноглобуліну (кон'югату послідовності БЕО ІЮ МоМо 12 або 20 з Ес-ділянкою імуноглобуліну).

Для ПЕГілування 10 кДа ділянкою ПЕГ, яка мала на обох кінцях, відповідно, малеїмідну та альдегідну групи (та мала назву "малеїмід-ПЕГ-альдегід", 10 кДА, МОРЕ, дарап) в цистеїновому залишку похідної глюкагону (ЗЕО ІЮ МоМо 12 та 20) було здійснено 1-3 годинну реакцію між похідними глюкагону та малеїмід-ПЕГ-альдегідом у молярному відношенні 1: 1 - 5, з концентрацією білка, яка складала З - 10 мг/мл при низькій температурі. Зокрема цю реакцію було здійснено в середовищі з додаванням 20 - 60 95 ізопропанолу. Після закінчення реакції отримані продукти було нанесено на катіонообмінник ЗР ЗерпагозеФ Нідп Регіоппапсе (СЕ

Ппеайпсаге, О5А) для очищення монопегілованих на цистеїні похідних глюкагону.

Потім було здійснено реакцію між очищеними моно-ПЕГілованими похідними глюкагону та

Ес-фрагментом імуноглобуліну з молярним відношенням 1 : 2 - 10, концентрацією білка 10 - 50 мг/мл при температурі 4 - 8 "С та протягом 12 - 18 год. Ця реакція відбувалася в середовищі, в якому до 100 мМ кальцій-фосфатного буферу (рН 6,0) було додано ціаноборгідрид натрію (МмасмМмВНз) та 10 - 20 95 ізопропанол. Після закінчення реакції, отримані продукти було нанесено на колонку з бутил-сефарозою Равхі Ріом/ (ЗЕ пеайпсаге, О5А) та на колонку Зошигсе

ІЗО (СЕ Ппеайсаге, ОБА) для очищення кон'югату, який містить похідні глюкагону та Ес- фрагмент імуноглобуліну.

Аналіз чистоти отриманого продукту, здійснений з допомогою хроматографії із зворотною фазою, ексклюзійної хроматографії та іонообмінної хроматографії виявив чистоту, яка складала 95 95 або вище.

Зокрема, кон'югат, в якому похідну глюкагону 5БЕО ІЮ Мо 12 та Ес-фрагмент імуноглобуліну було з'єднано із застосуванням ПЕГ, отримав назву "кон'югату, який містив похідну глюкагону

ЗЕО ІЮО Мо 12 та Ес-фрагмент імуноглобуліну" або "похідної «ЕО ІЮ Мо 12 тривалої дії" та ці назви може бути взаємозамінно застосовано у винаході.

Зокрема, кон'югат, в якому похідну глюкагону 5БЕО ІЮ Мо 20 та Ес-фрагмент імуноглобуліну було з'єднано із застосуванням ПЕГ, отримав назву "кон'югату, який містив похідну глюкагону

ЗЕО ІЮ Мо 20 та Ес-фрагменту імуноглобуліну" або "похідної «ЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії" та ці назви також може бути взаємозамінно застосовано у винаході.

Приклад б: Отримання кон'югату, який містить похідну ексендину-4 та Рс-фрагмент імуноглобуліну.

Було здійснено реакцію між ПЕГ масою 3,4 кДа з пропіональдегідною групою на обох кінцях бо (тобто 3,4К пропіональдегід (2) ПЕГ) та лізином СА-ексендину-4 із застосуванням імідазо-

ацетил-ексендину-4 з видаленим альфа-карбоном М-кінцевого гістидину (СА ексендин-4 (АР,

О5А)), внаслідок чого виникло зв'язування на основі ізомерного піку в задній частині (І уз27) між двома піками лізину, які Є досить реакційно активними та чітко відрізняються від М-кінцевого ізомеру. 20-годинну реакцію між пептидом та Ес-фрагментом імуноглобуліну було здійснено з молярним відношенням 1 : 8, загальною концентрацією білка, яка складала 60 мг/мл та при температурі 4 - 8 "С. В цій реакції було застосовано 100 мМ калій-фосфатний буфер (рН 6,0) та як відновник було додано 20 мМ ціаноборгідрид натрію (528). Очищення отриманих продуктів зв'язування було здійснено шляхом їх пропускання крізь дві очисні колонці. Спочатку з допомогою колонки БОШЕСЕ О (ХК-16 мл, Атегепат Віозсіепсе5) було відокремлено велику кількість Ес-фрагментів імуноглобуліну, яка не приймала участь у реакції зв'язування. В результаті сольового градієнту із застосуванням 1 М Масі та 20 мМ Ттгіз (рН 7,5) було отримано негайне елюювання Ес-фрагментів імуноглобуліну, які мали відносно слабку зв'язуючу афінність та за цим елююванням одразу відбулося елюювання кон'югату ексендину-4 з Ес-фрагментом імуноглобуліну. Хоча цей Ес-фрагмент імуноглобуліну було певною мірою відокремлено внаслідок первинного очищення, однак повного відокремлення на іонообмінній колонці досягти не вдалося через маленьку різницю між зв'язуючою афінністю Ес-фрагменту імуноглобуліну та кон'югату ексендину-4 з Ес-фрагментом імуноглобуліну. Відповідне вторинне очищення було здійснено із застосуванням гідрофобних властивостей цих двох різних матеріалів. Отриманий після операції первинного очищення зразок було нанесено на колонку БХОШЕСЕ ІЗО (НКІ16 мл,

Атегзпат Віоб5сіепсе5) із застосуванням 20 мМ Ттгі5 (рН 7,5) та 1,5 М сульфату амонію з наступним елююванням продукту під час поступового зменшення концентрації сульфату амонію. В результаті спочатку було елюйовано Ес-фрагменти імуноглобуліну, які мали слабку зв'язуючу афінність для НІС-колонки (колонки для хроматографії з гідрофобною взаємодією), а потім, в кінцевій фракції, було елюйовано зразок кон'югату ексендину-4 з Ес-фрагментом імуноглобуліну з сильною зв'язуючою афінністю. Завдяки суттєвій різниці в гідрофобності це відокремлення було більш легко здійснено, ніж відокремлення з допомогою іонообмінної колонки.

Колонка: БОШКСЕ О (ХК 16 мл, Атегепат Віозсіепсев)

Швидкість потоку: 2,0 мл/хв.

Градієнт: АО -»25 95 70 хв. В (А: 20 мМ Ттгі5, рН 7,5, В: Аж 1 М масі)

Колонка: ФОШКСЕ ІЗО (НЕ 16 мл, Атегепат Віозсіепсев5)

Швидкість потоку: 7,0 мл/хв.

Градієнт: В 100 -» 095 60 хв. В ГА: 20 мМ Ттгіз (рН 7,5), В. А ж 1,5 М сульфату амонію (МНл)25О))

Отриманий таким чином кон'югат, в якому похідну ексендину-4 та Ес-ділянку імуноглобуліну було з'єднано із застосуванням ПЕГ отримав назву "похідної ексендину-4 тривалої дії". Цей термін у винаході також може бути взаємозамінно застосовано з терміном "похідна ексендину тривалої дії".

Експериментальний приклад 1: Ефект зменшення маси тіла у щурів з ожирінням, викликаним вживанням раціону з високим вмістом жиру.

В цьому експерименті було застосовано щурів з ожирінням, викликаним вживанням раціону з високим вмістом жиру, яких широко застосовують, як тваринні моделі. Маса тіла цих тварин перед введенням складала приблизно 600 г. Під час експерименту тварин тримали по окремості з необмеженим доступом до води та відсутністю світла в період часу від 6:00 - 18:00.

Досліджувані групи тварин, яких годували їжею з великим вмістом жиру включали тварин контрольної групи 1, яким вводили лише наповнювач (ін'єкція кожні З доби); тварин групи 2, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу б з концентрацією 3,3 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби); тварин групи 3, яким вводили похідну ЗЕО ІЮО Мо 12 тривалої дії з концентрацією 1,6 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби); тварин групи 4, яким вводили похідну ЗЕО ІЮ Мо 12 тривалої дії з концентрацією 3,3 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби); тварин групи 5, яким вводили похідну ЗЕО ІЮ

Мо 12 тривалої дії з концентрацією 6,6 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби); тварин групи 6, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 3,3 нМ/кг ї- похідну 5ЕО ІЮ Мо 12 тривалої дії з концентрацією 1,6 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби, відповідно); тварин групи 7, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 3,3 нМ/кг я похідну ЗЕО ІЮ

Мо 12 тривалої дії з концентрацією 3,3 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби, відповідно); тварин групи 8, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 3,3 нМ/кг ї- похідну

ЗЕО ІО Мо 12 тривалої дії з концентрацією 6,6 нМ/кг (ін'єкція кожні З доби, відповідно); тварин бо групи 9, яких лікували так само, як і тварин в групі 4 (група парного введення); та тварин групи

10, яких лікували так само, як і тварин в групі 7 (група парного введення). Експеримент було закінчено через 15 днів та вимірювання змінень маси тіла тварин в кожній групі здійснювали впродовж експерименту з триденними інтервалами. Після закінчення експерименту було здійснено розтин тварин та виміряно їх рівень оточного жиру та масу печінки. Для порівняння даних, отриманих від тварин контрольної групи, яким вводили наповнювач та тестових груп було здійснено статистичний однофакторний дисперсійний аналіз.

Як можна побачити на Фіг. 1, в результаті вимірювання змінень маси тіла, в групах тварин, яким вводили або похідну ексендину тривалої дії або одну лише похідну ЗЕО ІЮО Мо 12 тривалої дії було виявлено зменшення маси тіла на -8 95 та -7- -22 95, порівняно до маси тіла перед введенням, тоді як в групах тварин з комбінованим введенням похідної ексендину тривалої дії та похідної 5ЕО ІЮ Мо 12 тривалої дії було виявлено додаткове зменшення маси тіла на -22 - -35 95.

Додатково слід зауважити, що у разі порівняння ефекту зменшення маси тіла тварин у групі з введенням однієї лише похідної зБЕО ІЮ Мо 12 тривалої дії та у групі з введенням комбінації похідної ексендину тривалої дії та похідної зБЕО ІЮ Мо 12 тривалої дії з результатами відповідних груп парного введення було виявлено різницю, яка складала, відповідно, приблизно -11 95 та приблизно -17 95, отже таким чином було підтверджено наявність ефекту зменшення маси тіла у разі введення однієї лише похідної глюкагону або у разі комбінованого введення, із застосуванням дій, відмінних від вживання дієтичного харчування.

Отже, було підтверджено, що похідні глюкагону тривалої дії за винаходом можуть відігравати додаткову роль у зменшенні маси тіла на додаток до ефекту анорексії.

Додатково слід зауважити, що в результаті вимірювання рівня оточного жиру та маси печінки, як було підтверджено на Фіг. 2 та 3, комбіноване введення похідної ексендину тривалої дії та похідної БЕО ІЮО Мо 12 тривалої дії призвело до значного зменшення маси тіла, а також до зменшення маси печінки порівняно з групою тварин, яким вводили наповнювач. Зокрема збільшення/зменшення маси печінки є здебільшого спричиненим збільшенням/узменшенням кількості жиру в печінці та вищезазначений ефект зменшення маси печінки відповідно свідчить про зменшення печінкового жиру. Відповідно, зменшення цього печінкового жиру може бути виміряно та застосовано як спосіб вимірювання лікувальної дії у разі метаболічного синдрому,

Зо як-то ожиріння, цукрового діабету, неалкогольного стеатогепатиту тощо.

Експериментальний приклад 2: Ефект зменшення маси тіла у мишей з ожирінням, викликаним вживанням раціону з високим вмістом жиру.

В цьому експерименті було застосовано мишей з ожирінням, викликаним вживанням раціону з високим вмістом жиру, яких широко застосовують, як тваринні моделі. Маса тіла цих тварин перед введенням складала приблизно 55 г. Під час експерименту тварин тримали по окремості з необмеженим доступом до води та відсутністю світла в період часу від 6:00 - 18:00.

Досліджувані групи тварин, яких годували їжею з великим вмістом жиру включали тварин контрольної групи 1, яким вводили лише наповнювач (ін'єкція кожні 2 доби); тварин групи 2, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 4,3 нМ/кг (ін'єкція кожні 2 доби); тварин групи 3, яким вводили похідну ЗЕО ІЮО Мо 20 тривалої дії з концентрацією 4,4 нМ/кг (ін'єкція кожні 2 доби); тварин групи 4, яким вводили похідну ЗЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії з концентрацією 8,8 нМ/кг (ін'єкція кожні 2 доби); тварин групи 5, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 4,3 нМ/кг ї похідну ЗЕО ІО Мо 20 тривалої дії з концентрацією 4,4 нМ/кг (ін'єкція кожні 2 доби); тварин групи б, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 2,1 нМ/кг - похідну БЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії з концентрацією 6,6 нМ/кг (ін'єкція кожні 2 доби); та тварин групи 7, яким вводили похідну ексендину тривалої дії Прикладу 6 з концентрацією 0,8 нМ/кг ї похідну ЗЕО ІО Мо 20 тривалої дії з концентрацією 8,0 нМ/кг (ін'єкція кожні 2 доби). Експеримент було закінчено через 22 дні та вимірювання змінень маси тіла тварин в кожній групі здійснювали впродовж експерименту з дводенними інтервалами. Після закінчення експерименту було здійснено розтин тварин та виміряно масу печінки.

В результаті вимірювання змінень маси тіла, як може бути підтверджено на Фіг. 4, в кожній з груп тварин, яким було введено одну лише похідну 5ЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії (8,8 нМ/кг, ін'єкція кожні 2 доби) було виявлено зменшення маси тіла порівняно до маси тіла перед введенням, відповідно, на -25 95 та -29 95. Додатково було виявлено зростання цього ефекту зменшення маси тіла у разі введення у поєднанні з похідною ексендину тривалої дії. Також було підтверджено, що комбіноване введення похідної ексендину тривалої дії та похідної ФЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії з відношенням, яке складало 1:1, 1:3 та 1:10 призводить до додаткового збільшення ефекту зменшення маси на -50 95 або вище. Додатково слід зазначити, що 60 залежність ефекту зменшення маси тіла до відношення між похідною ексендину тривалої дії та похідної ЗЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії була незначною, однак спостерігалося покращення ефекту анорексії разом із збільшенням відсотка похідної ексендину тривалої дії, що підтверджує, що похідна глюкагону тривалої дії за винаходом може відігравати додаткову роль у зниженні маси тіла окрім ефекту анорексії.

Додатково слід зазначити, що в результаті вимірювання загального холестерину в крові, що може бути підтверджено на Фіг. 5, для кожної з груп тварин, яким було введено похідну ексендину тривалої дії (4,4 нМ/кг, ін'єкція кожні 2 доби) та похідну ЗЕО ІЮ Мо 20 тривалої дії (8,8

НМ/кг, ін'єкція кожні 2 доби) було виявлено зменшення холестерину, відповідно, на -35 95 та -71 до. Вищезазначені результати підтверджують, що похідна глюкагону тривалої дії за винаходом може відігравати додаткову роль у зменшенні холестерину у крові на додачу до ефекту анорексії. Для порівняння даних, отриманих від тварин контрольної групи, яким вводили наповнювач та тестових груп було здійснено статистичний однофакторний дисперсійний аналіз.

Фахівцю в цій галузі буде зрозуміло, що винахід може бути втілено й в інших специфічних формах, не відхиляючись від його духу чи сутнісних характеристик. Описані втілення повинні бути розглянутими у всіх аспектах лише як ілюстративні, а не обмежувальні. Таким чином, сфера застосування даного винаходу є зазначеною скоріше з допомогою доданої Формули

Винаходу, ніж з допомогою вищенаведеного опису. Усі зміни, які належать до значення та діапазону еквівалентності Формули Винаходу повинні знаходитися в межах даного винаходу.

«1305 ХАН ФАРМ. КО. ЛТД. «120» Пехдна глюкагону та компочиців, вка містить й ков 'ютат тривалої дя «МБюЮх БРАТ ЦЮ хі» КА ЗО еОдаЗ 5 хін» 2О1505-5О «150» 4 кі» КоРаентцю 50 «ах хів З «ій» БЛОК

Флі3» людина ото заріюих «щи

Нє Заг бів Сну Тк бе Тит Зег Ако Ту Баг бух Тук ЦО Ар ет ї Кк о 15

Атр Аг лів а Ар Ре Уа ва ТУ ки Ме Ав Те «вій «ії 28 «12» білюк «АїЯ» виручна поглідевнивх

«вх «29535 похідна с яююнону «хе й ніх ет ОЗ у Те РвВе ін баг Ар Тут Зегіує Тут бвоа АБО Кук ї 5 18 15

АзрА ВАВ і АО Вне УВА тр во Ме Аа ТА

КВ 25 «вх З «дії» 23 «Ви» ФІдоК «Киї» мштузна послідояноть «ух «Ії» похідна тглюванону «Хм З

Нв бег бій СУ ТВ РВЕ Тве Зег Аз Туг аегіув Тугіви Ахрв Сух

Її х 13 15

СІ Атге Аа дів Ази РВе Ма ів ТУ Це Ме Аа Ту 85 «а а

«іі» 55 «125 бівок с«иі15» зутузна порлідовність «АЮ «ай» похідна глюнагону «ен» й

Мі 5ву Ді Оу ТВ Ре Ту бег Ахр Туєбетгіуї тугі Ар ет 1 З 16 15

СУух Ако АБС Аа Ра уві с тріо Ме Ак ТАг 5хО З кам» 5 хаїх В каїйх біле «аїй» штучна поспідовність «АЯОх «225» похідна глюватону «ех 5

Нів мер іму Те ве Тв Бек АЮ Туг баг іує Тугіви Ар Зах 3 5 10 15

Су и АВ СН Ар Ева Уа и Тер зем Ме Аза Те

23 25 «Мі в «Вії» лок «3313 виучна послідовність ха» хІййх похіднатлюкатонку кі» й

Ніз Бег бів ЛУ ТВг Ве ТТН баг Ар Тут Бек іує Туг зем Азр Бе 1 5 18 і5

Су ОЬ Аз Авіа Ави Ре ма СВ Тир і Ме Азо ТВ з 25 «аз У «а10з білок «ЛІ3» втучна послідавність ках «883» похідна глюватону «Хв У

Туга ціп іх Те Ре ТВг баг Азр тус бек у Тугіво Аврооег 1 5 1 15

Сук в Аз Ар акр РБе маі Сів Тгр ки Мет Аа ТАНЕ хо 5 «еще В «7315 25 ках Відом «13» штучна посліданність «ЗАМ» кайї» похідна глюкагону

Ка «иї2» інцнособливаєті «ВІЙ (В каша» Хавжеамнемаємасляною кислою АВ «Нюх й

Туг'хая Зів Му Тиг Рне ТВЕ вт Ахр Тук бегіук Прут іо Ар бе 1 х 10 15

Сує АБО Аа Б Ав Рне я мов то бен Не Ах ТЕ 5 хан З «віх 8 «йійх пілок хеїй» шлтузна послідовність «ОО хейЯх похідна сокагону «ах «айї2 інші поабливоси «Ва і «иа» Хва є амінсізомаєтвою кислотою АВ «хз

Туг ха ов му Твен тн Зет АЮ Гує Баг у Туг ем А

Гує« бер Ав св Ахр вне Ма! Ма! тр без Не Аж Ти о 35 «аю 40 «дії хЗ «15» зитучна послідовність «ай «ди» похідна твюдкагову

«йх «ИВЇх інвресобливості кода» «ийЗ» Хзакх аміноїзомаєляною кислотне (А) «ДО о

Тукхва ВІВ 'У Ту рве Тит ет Або Туєбегіуз тугі Ар Баг 1 5 10 15

Сук ар лів Ар Аз ене уві Уві Тгрівм йе Аба ТНе т 25 «05 «і» 38 «йї2» білок киїїх штучна послідсанить «ВІ «АЖ» похіднатлюкагону «ик «йД3з інші особливості хадав «23» Хва є аміноїзомасляною кислютою АЮ)

«Оз 1

Тут Хв біп Оу ПЧ КВе Ту Зег Ар Тук бег 1у5 Тут Кен Аве бів 1 5 10 15

Гуз Су ав у и Рае уві ів Тереи Ме Аа ТВ каійх 35 каїїх каїЯз білок «15» вучна послідовність ках «аа» похіднатлюкатону «ех каві інші особливості «ай (І «223» Хва є амінсізомаєляною кислотою (ДІВ

Кая» «вві іншннобливості «уйаз (БІО

КеІЯх вміновислоти у положеннях 15 та Мтутворюють кільце

«Ой 43

ТугХза бік ЗБ, Те вве ТНе ЗР Ар Тук бег ух Тубіви йею бін ї х КІВ 15 ух Аге Ав іув ів Не ма ів Тр ви Ме Аби ТВ Кух я 5 БІ «Щйх 33 «2115 8 «ій» Білок «іх циучна послідовність «дах к«еай» тюхідна глюкагону

Б: хай» іншеасобливен кава» 19 ха» Хав'є амінвізомаслянов кислотою (АВ «300» 33

Туг Ка іп Ну Тут Бе тв зе Або Туг бог ух Туг цем Ар баг

Її 5 юЮ їх

Ат АР АВ ОНИ АО ри УВО Тер цен Ме АЗИ ТЕ 2 Т5

Зв

«ЩІ 18 «клі 2 бій білок каї35 штучна послдовнеть «ХО «ах похідна міокагону «ях «и2ії» інцшесобливосі кайй» 8 ейвЯх Хаве аміновомасляною кислотою ТА «цКх Її

Тут Хва Сп У Те Ве ТВу бек Або Туг дет ух Туга Ав СуХ

З з 30 15 ух АТ АВ і» ОВ Ре ма і го еи МНЕ Ав ТВг 80 25 «02 15 «іх 959 «15» білок хі» штучна послідовнть «АЖОх

«25» прхідна глюкагону «Ух «ай Вивіособливаст «вай» Її «бЯйх Хан зміномвомасляною кислетно (АВ) «НМ: 15

Тує Ха Зі у Те Ве Ті ЗР Ар тує дегіук Ту во Су СИ 1 5 зо 15 гук Ага Ав й ляр Ве УВЕ УВІ Турів Ме АЗА ТВ «ефе 165 киїіх 28 «12» Кідох «21» питучна пЕСНДО ВН «ие «вий похідна тлюнагону ай» «Ей знай особливі «ай ії «833 Хва є амінеззомасляною кислотон: ТАДИ

«хх ів

Тут Хаз ОБ СНУ Ті Ре Тнт зег Або туг бегіуз Туг ви бер Сух

Аге Ат Ав біз Уа не уві Зі То ес Ме Аг ТА

ХО 25 «ВХ ТУ «1і5 98 «іх (вок кій штучна послідовнить «жи» «ей» похідна глюкагону «дадх «8412 іні особливості «вх «Яй3» Хва є амінеівомасяяною кислотою (АВ «00 17

Тує Хва п У ТВ РНе твг ак Ар Тук Заг і Тугіво бер Су і 5 10 15

УВІ АгЕ Ав сп Ахр Ве ман сін Тр во Ме Ага ТНг ді о Уа кам 4 «їі «йЩйз білок «іх штучна посльшвність каЯ» хаКйх похідна слюкатану «Я» «й8ї» нин особдиВОосТ «айв «83» Каз є зміноїмомасляною кислотні (АБ

Нюх» 38

Тує Ха оіпноу Ті Рве Тнгжег АзроТує бек фує Ту іа Ар ет

Ага АгВ Лів Суз Ах РН АгЕ зви то ев Ме А Тег о їх «а 16 «хіїз 55 кам білок кі» штучна послідовність хиайх хкеЗУ поЖхіднаглювагону «ееейУ «ЗА інфнинеейнивості «Зах «223» Хаве амімоізомаєланою кислотою (АВ «ЗУ «ії» інцшгособливості хай (АЖ «483з вмінокислети у палеженнях 35 та 20 утворюють кільце «Я 16

ТукХаз бій СУ Пре Рпе тк Зо Аср Ту З бух Туг ін Сує і; і 5 3 15

Гук Ате АІЗ Ту СТи РНе УВС Трієн Ме Аква ТАг ще КУ «ах 20 «їі» 85 «жїйя ФІЛО киї13х штузна послідовнить

Ах «гам тохідна сват вну «Ох «аї» інш особливості «ЗІ» ЇВ «УЗ» Хав'є вмінаізомаслянок: кисвечкне. (АБ) «Це «Уі2 іншіособливе хара» ПІБ ЗОЇ «323 амінокислоти ух положеннях 16 та 20 утворююте кільце «ах 2

ТубХаа бій Оу Пт Бе Твеаег Акр Ту баг у Ту зви Ав 1 5 13 15

Сух Ат Аа уз бін вве ма п 1тріви Ме Афа ТК «ЗО і «їх 5 «ак лок «Ей штучна поєлідеянить «аоце

«йЕ» похідна тляхагону ках «щі» інші особливе сла А «523» Хв г амінсзомасланою кислотою АВ «Ох «ТХїх інші особливу «ШІ СІЗО

Хей» веенокислоть у положеннях 35 та Об утворкоть кільце «Ве ЗІ

Туг Ха сну ТВ ББе Тв ет Аза Ту Заг іде Тут із Авр ме 4 М зо 15 зуб Сує дів сук СТУ Ре ВЕ сів Тр ес Ме Аз Ту зо ак кам ЗУ «іх «вій» філок «аії» штузна погрлідовність «ик кокіз похідна глюваону ких «дві» інвиенобливті «ай» 8 «233 Хва є аміноізомаєіяною кислотою АВ ке «йщів інця особливості «вжив БАМИ хляЗ» вміноКислоти положеннях та 2О утворюють кільце «НК» 35

ТУбХав с у Те Ре Те Заг Ар Тує ет ух Гуг без Ар СНИ 1 5 КК із

Ух Ат Сухі ук ОТО РВе Ма СИ Трріво Ме Аза ТВ

О 5 ки й квіїх 38 «Бійх білок «ях штучна послідовність ках каа3» похіднаглююцону ки» «3» івшніжеблявня «аз (І «зі» Хав є аміновомасляною кислотне ІД «ве «аїх інші особливості «вай 11620 «ЗАЗ» вмінокислоте у положеннях 16 та 20 утворюють кільце «Не 85

Тек Хаа бів У Тве вва ТОР Хаг Ав Тує ет бух Тут Су Аве оц і 5 13 15

Гу Ат АВ іує о Ре уві дів трів Ме Аа ТВг

КІ 25 «ій га «ії» 95 «ай» бідок «213» штучна послідовнить «ах «ее 3» похідна глюкагону

«ад» «ВИї» інши особливеості «дах (З «ЗІ3з Хавя аміноізомаєліНОЮю кислотою ТАТІ «ВД «391» іншіособливості хІйа» ПАБ «23» амінокислоти у пезнюовеннях б тв 30 утворкзоть кільце «х«адйх 25

Тут Хаа бів у Те Аве ТвВг бе Або Туг бог ук Сух Цен АВ ТИ ї 5 їй 15

Цу5 Ате Аа Сук Він Бе Уа Тріо Ме АБИ ТВ «й и «вії» 28 «вій» ВілоК кій штучна послідовнють ках кам пеідна глюкагону ках

«ВЕБ в особлуННЯ «323» Хва є аміноізамасланою кислотоми ЗА «ДО» «ВО інціасобливект кий (ІБК «ем амінокислоти у положеннях 15 тв ХО утворкноть вільце «Щх 25

Ту Ха бів МУ Твебіе ТНе ет Азов Ту дет іух Туг іо Аве ії ту 135 15

ЩуУБ АтЕ АВ Куз Сух Ре УВІ ТВ Тер Мет Ах ТВ «ее 25 «11» 88 «Ії Вівак ек ту - хек дах ее Ук цітучна послідовне» «ДЕ «Ебі5 пнокЖідна глюзкатону «ле фі пед «ві «ийї» інфі схобливасті

«Ва (ЦІ «ийЗ» Хаз є аміноізомасявною кислотою АВ са» «ай інфіоссойплявоєті «323» (8) 20 едй3» дмінокнслети у положеннях 14 тв б утворкзють кільце «ЩЮз З6

Трав бій 5 Те Во Тну бек Аби тує Хек фує Туг во зо у

Її 5 НК 15 суб Ат АВ ут АЗИ РВе ма З Тр іеи Ме Абп Ту за ках 77 «їз 28 «13 Вілен «13» штучна послідовність хейе «З» похідна глюкатову «Ох «ийух вин осойливості «ЯйЯх

«223» Хва г амінопомасляною кислотою (АВ «Его «Й» інші всвбливасті «аа» БО) «ой3» вмінОхислоти у положеннях 15 та 30 утворноють кільце «ах 25

Тут Хва СН СУ ТВЕ ве УФ Бе дер тує б БУ Тут кам АБр Св 1 5 їі 15

Сук Атк Дів ух Ар Бе Уві бір тую бе Ме дер ТА о 25 «яв яя «її 5 «8197» бізах «13 внучма послідовністю «да «ай» похідна глюкагону «КОХ «айі» інниоєабливості «ди» (З «вай Хза є амінвізовмасланан кисломно (АВ

«аа «ії» інші особанвося «вах Пе «вах амінокислоти у положеннях 153 зб утворюють кідьце

Тез ха бів Оу Твг вве Узі бвт Дхр Тут вет фу Туга Авр о ї 5 10 ї5

Суб Ат Аа уз Або ре ма ОА рр ем Ме Або ТЕ во 85 «Я 99 «І 29 хз Щілек хиі3» штучна послідвяність і: «Ка» покідна глюкагону кап кийіз нний есоблинасті кидав киаі» Хва є аміно емаслянон кислотою І1АЇВІ

С хааї венеогобливост «ах (Б «З83х вмінокислатн У положеннях 15 та 20 утво виють кілюьще «ДО 5

Тут Хва Фе ФУ Те Ве Тк Зег Ар Туг Бек був Суб іо А5р Зі і 5 о 15

Ата Ага ДІВ УЗ Аз Ре Ма бій Тр его Ме дев Те «а «В «Ми ЗО чкії» 25 хИ1й» білов каї3» Вихчна послідовність «ад «ай похідна гяюкаОону «Ов «ЕХ інші особливості ка33» Хв 'є аміноїзомаслянсю кислотою ТАЙЯ

«айух квїї» інші особливості «й БО «333» вмінокислоти у положеннях 16 та 20 утворюють кільце «Ще 30

Ттр Хна Бі Ну ТВт БвВе ТЕ бек Ав) Тут ат іме Суз ЦО АОС ї 5 юю 15

Ате Ах АВ Був Аз рве ма ОЙ Тр а Ме Аєв ГНЕ т «яз З «ій білок «КІ» зпузна послідовність «ех ке похідна тлюкатану «ЕДх «й9їх інші особливості «ї23х Хаа є зАнновомаєваною кислотою (АВ «ТО

«21 інішісобливВост «дай (ЧИ «ди ЗМмінеинеястТи У ПО НенняХ 13 ча ЯЗ утрат віль «що

ТукХва бів у Темне Тит ее Авр Туг ЗВГ ух ТУ ін Азр Сух 1 5 15 15 іх Аг АВ ТУує ВИ Ре ун бій Тр бо Ме Аха ТЕ кі» 33 ка білок «135 штучна послізонність «Я «аа» пехідна гаюнатону «ВІ «ейї» індя особливості «23 МУЗ хІйИЙх вміненислоти У положеннях 35 та 15 утеорюючта кільце «щи баг сій Оу ТВЕР ТВ Бе Або Туг бек іє Туківя Ази бів Сух

1 В 13 ІЗ

Ат віз ув бів вне Уві сіл Ттріво Ме ах ТВг я 85 «ЩО» 33 «їх 55 «аійх білок хаі3» вияучна послідовність их ках похідна тлюкатону кий кі іншнособливост каййх (І хуй ав аміноізсвваснянею кислотою (АВ «ах 33

ТубКна Бій Лу Те вве Те 5аг Ар тує баг іх Туківи Або ет

Аг аАчи лів бів Ахр РНе УЗ В Ттрівц Ме АБ Ту «8» м київ «ЖІ бив «МІЗУ зутучна послідовність «аа «03» покідна глюкюатану «ех «ям інші особливості «жах і «аа» Хавяаміноївовмасляноюкискунуєю (АВ) ча» «яйїх інші особливості киййх ВКА хаййх амінокислоти у аелаженнях Зб та м утворюють кільце хай» ля

Тех сом ТВ вве Твгбек Авр Буг бе ув Тут Сух Або Си ї 5 за ї5

АТ Аг АВ Су Ми Ре ві сі Тко дез Ме Аза ТЕ «і а «з З «11 955

«ТЯ Білок «ах втучна песлідевмть «ДВО «83» чокідна глюкагону «Ж «ЯМ інші зсеоливаст хеййх Хав'є змінсізомаєланою кислютаю (АНІ «ИЯЦе «із іншгособлиності «ай СНМ,А2О «ей» вмінокислоти у положеннях 1 тя 20 утворинеть кіявце «ЖЕ 5

Тусхаа іп су Те ве Тв бе Дер Туг зер ух Туг Суз Азр с

АтЕ Атв Ав ух Сів Ве Уа ки Тер ев Ме Ав Те 23 25 «А ЗВ «аіїх «й3их ФідОоК ках зутучна послнкУвність ке «йо3» похідна лювагану «ай «їз іншіскеобливості хЕййх кІаїх Хав'є амімазомасєланою винною 1АНО

БО

«вії» інн особливася «ей МОБ «зай» амінокислоти у полюженнях 35 та ХО утноркнють кільце ках 35

ТУбХав бі у ТВ вве ТВ Бе Ар Сух дег і ух Тугіви Аз 5 1 5 а 15

Атй Аг лів ук Об Рене уві бів трів Мей Ахлй ТВ

МК 75 «ах 39 хеїїх ЗО «З1Ух білок «Її» штучна послідовність

«аг «Ва» вохіднатлюдаиону «аж» «Ву інші особливоєті «аа ІЙ «З» Ххає вмінзівамаслянаю кислотою ГА ке» калі» ніші особливості «айв ЯВНІ «3» аміншиноюти У положеннях 15 та Зб утво рияоть кільце «НЮв 37

ТугХва Бій Сі Те вне ТНе бег Ав Тук Хек Був Тук ви Дер ї 5 10 15

Агк Ат АВ і ув їв КВе уві ів тр іви Ме Ак Те сСує ях Зо кеії» 59 «їй» Щлок «ак знтучна послідовність бо

«вх кай3» похідна єпанагтану

БУ

«айї» ін особливості «аа «03» Хва є аміноїзетваслямою кислотою ТАЙ хейх кад інші особляві «их АТО «МЕ3» амінокислоти у положеннях 15 та 20 утворюють нільце «о ЗЕ

Те Хан На У ТВ Кне бух ет Акр Туг беєіуе Ту ви Аа и

Її 5 їв 15

Аг Ат АВ і СНІ Ве уві бій Ттріди Ме Авп ТВг ву 25 «М ЗВ кіз 8 «К1ах бідок «Ах зутучзна послідовність «ех

«хи32 похідна тгаювагону «еВ «ВЕУ ніші осовливоєт «аа Б хі» Хав'є зміноівомасляною кишнуУю. ТАТІ

Ох «ай» інввособляВОок «Хай» (Б «ех амінекислотв у положеннях 16 та ЗО утворюють кійвце «ЩНух За

Тут хана су Ті ера ма чек Аве бух ек бу Ту іо Ав Не ї 5 10 15

АгЕ Агр АВ ух Аа Ре Уві сп То ам МЕС АТ ках 40 «ідо (ДОК «Я» зитузна песліданність «ах «Ва» похідна глюжатону

«а «их інші осабливості «йй3» Хаає аміно омасияною кислатену (АВ «ВМО» «йї» нин особливості «вай ЗІБ «Вей» амінокнєлети у положеннях 165 та 20 утвеуювють кільце «а 4 тТукХаа бій Оу ТЕ РНне Узі ек Ахо Тут Хек ув Туг ви Або Вів 1 5 зо 15

АтВ Аг Ав Бу Або Бе УЗ ОН візи Ме: Ах Пе Су

З 25 30 «Оз 4 «їх а «каїй» Бідок «Жайг зеучна послід внить кад «Зх похідна глювмагону

«ак» «ві» інші осзйпливості «з Її «323» Хває аміноіїземасляною кисленю (АЮ «Ох «ваїх інцяЯ особливасті «ййаз ТБКІЗОЇ ке» амінавнеолоети у положеннях 16 та 50 утворюють кільце «АЮ 81 тУгбХаа цій Су ТП РНе Сук Зет Або Гут 584 Муз Ту ви Акту 1 5 10 15

АгтВАВ АВ Аза ве Уа Зів їтрієв МеєаАви НЕ 2 25 «105 42 «8115 29 «ій білок «43» зитучна послідовність «ве? «Ей» пехіднатленному

АФ» «ик інші особливості «ий 1 «223» Хва є азхіноіїземасляноюкнолотою (АВ «Нюх 45

ТУ Хва С цу Ти Ве бух Заг Ар Тух Жак у Ту фео Аме 1 з Ю 15

Аг Ат Ар п Аа Ре Уві бів тр іви Ме Ав ТНу 23 ях «0» 83 «11» 29 «ВІ білок «13У втучна послідовність «ТАК жу зе жі її вд сх «ай» похідна глюканну «ЯК» інци особливості «Яйа хм» Хеав є амінсізомасляноно кислотою ТАЙ «Ох 4 тує Хва бів Су Тр бле Тви Хе Авр Сух хег бух Гуті Ащо Бе 13 5 ее 15 те Аг Дів іп Аза Ре Уві дій Тер во Ме Ава Те -5 жо» 48 «гії» 30 «ії» Вілох «13» штучна песліднвнить «Хм

КК ж сесігкух хезул , кий похідна гліювагону кеВ» сліз інф особанмаєті «ай ІІ «Ії» ЖХаа є амінозомасянніно кисла ГА «хв ай

Тутгхаз іп іх ТРК Ре ТВ Заг Аяю Тук бе ує Туг іо Ав Зет

Ії 5 16 15

Ат Аге Аа бів Або Ка У А Тр во Мега Те Сух

Ка в о

«510» 45 «11» З «ВІЙ іди «йі52 штучна пвсліувуаність «ВО» «йо3» пихідна кюкагну «ще «йо імп ресойливості «й С «діа» Хай йпстпдиного, ве заміносіствдалам, Мета чістизаном, бетачіовкеи му проевзніпом, 4 мідазовцетилом, ветпькарйонсихімідвзопропізнійою, триптофеном зболирозином або я відсутнім «ад» «1 Ванни особлавості «аа (З «ла» Хдва є злива метитлутаміновою кислотою, дміноцемасланокикислогом АВ, бузлавінам, гайданом; ве (М метвлеліциномі, серяном або їсерином «МЕ «ХІїМ іншбосойливості «ак (Д «ллї Хваєтреоннем, ватіном або цисуєівом кЕОЗ «іі» іншгособйлиноєт

«Май» 5 «У3» Хаз є тивозвнаом або цистазнам і і «ІМ «ва» інші особливості хай» 5 «23: Кава єлізвніма зво дистейном «вах «ЛУ» ВавиугособляВесті «вий» З «ЇйІз Хваетидозинок або цвстеннм «и» хідїх вуці ссзбливості кайй» 44 ках ЖХаз є ланцином збо цистаномМ «ТАЦЕ «ййї» інн особинності «ай» са» Хав в асперчіновою кислотю, тут аміновою вом ою Во цУктемоОМм кави» каві» інші зговливості кава» ГБ

«аїЯх Хва є глутамівовою кислотою, зспараиіновою кислот, серино, альфа метил слутуаановсю кислютеаю бо мистчвоМм ак відсУТиОЮ;

«ав»

«Вів інкЯ особливості

«332» Й ка3» Хзва к аспарагіновню кислотою, глутамінок, глутаміновою внслотою, лізином, вринінем, перином; цистатвом або валіном або відсутньою:

«ВО»

«еМі12 Вниві всобвивосі

«жа В

«Іа Хаз є ваавіном, зопарайновою кислотою, глутвщмінаною кислотою, зрініном, залом, або мествном вену є відеутиьс;

«ДОЩ

«й іні ссоблявоюті

«Жйв 9)

ка» Хваєвланіном, гргініном, бевином, валіном або цистеїном ябр'я відсутньою;

«ах каші» інші осабливості

«332» ПОЇ са» Кава елізином. пстидином, глумнУйнм, ВсгренНовою квслютю, ВІВиНОМ, риніном, альфа метил-тлутщдіновою кислетою, або цисуєіном або є відсутньою

«Яд «й ЗВ ВСОБЛИВОСТ «Вр» ПИ «3335 Хваєвспарагізовою кислотою, глутаміваннимо квслотокьлейцином, валінем зба чисуеном айссє відсутньсю «ОХ «ЗК» звуй ссоблявості «вах «383» Хаайєйолейцином, валін збо зргінаом збо евідсутньоки «ЗО» «Ва іпеособлявеєсті «вай (ЗА

ЯйЯ» Хзає залінем ри ніном, зланіном, цистетном, глутаміновою кислотена, лізином, глугаміном, занфасвовтнлтлутаміваваю кислотою або лейцвном абз є відсутнвоку; «Ох «ках інншеособунаок «аа» 7 «ааіУ Хзаєізалейцином, валіном вламіновм, лізином,; матіюмніном, тлутаміном або аргніном або є відсутньою «МІУ кІЛїх виБіосовля всі «За3» (В)

«ТЗ» Хаз є глутаміном, лізином, всезванном або іно або є відсутньоке

КЕ

«їх інш особлявоєті «дао» 28) «3» Хай клізином аазмінам ліциновм або треоніном або є відсутньою; «Ве «ДАЕ» інші особливості «яаяз (ЩВ каЯх ва вцисенномМм зо є Відсжтнвою: «ду Я

Хаа Хаз НСНУ ТЕ ВНе Хаз Зег Ахр Хаа Бе Ха Хаз Хва Хаз Хав 3 а 30 15

Хва ква Хаз Хва Хва пе хХва Хаз ріки каз Хва Хв Кай о 25 За «ві» «б «125 філо «БІ» виучна песлдовиеть «ее» кий похіднатлюкатону

«вах «їх Баарособливасті «ПИ (5 «ВЗ» Хавє аміноіїзомаєляною кислотою ТА «рах «айїз іншіоссойпливи «ме3» Хваєтивоніном, йаліном, або цестчном хи» «аа3х ім есоебляВаст «до» НО «83» Хваєтирозиномавбо цестеїном ха «ії іннногойливОості ейдах А «3» Хважклізином зб нистеїном ке «икіх іміні ВсСОблиВОсті кий» ТІ «ее Живе сповнене кислотою о цист

«Ух хів нншосебливеті «айви В «23» Кай х глутаміновою кислотою збо серином у

ЕВ

«У» інші особливі ках 1 е«2Жї» Хває лізнном або вогні ках «віз інн особлявост кадиа ГО «ка83х Хза в слутаміном або лізином «ах «айії» Іншн особливості «каві ЗХ «3» Хав'єаспарангіновою кислотне збо глутаміновно кислотою «Цех кЕ215 інця особливаєт «айва 8 кий» Хває валіном яко глутаміном

«ВАХ «і» інші особливості «ВИХ ІЗ «885» Хваєцвстеівом або є відсутньсю аз Ме

ТугХаз СПИНУ Ти Ве Ха Заг Ар Ха бе хай Тут іви Хза хаа 1 5 10 15

Хва Аме дів Хна Хва пе УВІ Каа Тр іем МЕТ Аза ТК Хав зи 25 ЗО хе Я? «йіїхм 34 «ай» ДиК «АЇ3» штучна посвідовність ках «ааїх прямий праймер «КК» 4 савсквсвис вассвєсть ссвіве ва вес КУ «ех В «ії 35 кіз: ДНК «213 штучна Кн ндевність «ве «283» зворотній враймев «Оз Я ствассвасі сісереназо встанов се За

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Комбінація для лікування або профілактики метаболічного синдрому, що містить: ї) пептид, що складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 37, 38 та 44, та ії) принаймні одну сполуку або матеріал, що має терапевтичну активність при метаболічному синдромі, де сполука або матеріал, що має терапевтичну активність при метаболічному синдромі, є інсулінотропним пептидом, де метаболічний синдром вибраний з групи, що складається з порушення толерантності до глюкози, гіперхолестеринемії, дисліпідемії, ожиріння, гіпертонії, неалкогольного стеатогепатиту (МАН), атеросклерозу, спричиненого дисліпідемією, атеросклерозу, артеріосклерозу, ішемічної хвороби серця та інсульту, де пептид має величину ізоелектричної точки (рі), яка менша від ізоелектричної точки природного глюкагону (6,8), та де інсулінотропний пептид вибрано з групи, яка складається з СІ Р-1, ексендину-3, ексендину-4, їх агоніста, похідного, фрагмента, варіанта та їх комбінацій.

2. Комбінація за п. 1, в якій у пептиді амінокислотна пара в положеннях Х16 та Х20 формує кільце.

3. Комбінація за п. 1, в якій пептид є похідним глюкагону, здатним до активування глюкагонового рецептора.

4. Комбінація за п. 1, в якій інсулінотропний пептид є похідним інсулінотропного пептиду, в якому М-кінцевий гістидиновий залишок заміщено іншим, вибраним з групи, яка складається з дезаміно-гістидилу, М-диметил-гістидилу, рД-гідроксіїмідазопропіонілу, 4-імідазоацетилу та рД- карбоксімідазопропіонілу.

5. Комбінація за п. 1, в якій інсулінотропний пептид вибрано з групи, яка складається з природного ексендину-4, похідного ексендину-4, в якій видалено М-кінцеву аміногрупу ексендину-4; похідного ексендину-4, в якому М-кінцеву аміногрупу ексендину-4 заміщено гідроксильною групою; похідного ексендину-4, в якому М-кінцеву аміногрупу ексендину-4 змінено Зо з диметильною групою; похідного ексендину-4, в якому видалено а-карбон першої амінокислоти ексендину-4, яка є гістидином; похідного ексендину-4, в якому дванадцяту амінокислоту ексендину-4, яка є лізином, заміщено на серин; та похідного ексендину-4, в якому дванадцяту амінокислоту ексендину-4, яка є лізином, заміщено на аргінін.

6. Комбінація за п. 1, в якій пептид є у формі кон'югата тривалої дії, до якого приєднано біосумісний матеріал, здатний до збільшення часу напівжиття цього пептиду іп мімо; та інсулінотропний пептид є у формі кон'югата тривалої дії, до якого приєднано біосумісний матеріал, здатний збільшувати час напівжиття іп мімо цього інсулінотропного пептиду, де біосумісний матеріал вибрано з групи, що складається з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та його фрагмента, альбумінзв'язуючого матеріалу, полімеру з повторюваних одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагмента антитіла,

ЕсАп-зв'язуючого матеріалу, сполучної (іп мімо) тканини або її похідного, нуклеотиду, фібронектину, трансферину, сахариду та полімеру.

7. Комбінація за п. б, в якій пептид та інсулінотропний пептид є відповідно з'єднаними з біосумісним матеріалом за допомогою лінкера, вибраного з групи, що складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксіетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, включаючи полімолочну кислоту (РІА) або полілактид-ко-гліколід (РІ БА), ліпідний полімер, хітин, гіалуронову кислоту, жирну кислоту, полімер, сполуки з низькою молекулярною масою, нуклеотиди та їх комбінації.

8. Комбінація за п. 6, в якій біосумісний матеріал є ЕсКп-зв'язуючим матеріалом, та пептид та інсулінотропний пептид є відповідно з'єднаними з біосумісним матеріалом за допомогою пептидильного або непептидильного лінкера, вибраного з групи, що складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксіетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, включаючи полімолочну кислоту (РІА) або полілактид-ко-гліколід (РІ. СА), ліпідний полімер, хітин, гіалуронову кислоту та їх комбінації.

9. Комбінація за п. 8, в якій ЕсКп-зв'язуючий матеріал є поліпептидом, що містить Ес-фрагмент імуноглобуліну.

10. Комбінація за п. 9, в якій Ес-ділянка імуноглобуліну є аглікозильованою.

11. Комбінація за п. 9, в якій Ес-ділянку імуноглобуліну вибрано з групи, що складається з: (а) домену СНІ, домену СН2, домену СНЗ та домену СНЯА; (Б) домену СНІ та домену СН2; (с) домену СНІ та домену СНЗ; (4) домену СНаО та домену СНЗ; (є) комбінації з одним або принаймні з двома доменами, вибраними з домену СНІ, домену СН2, домену СНЗ та домену СНЯА, та шарнірною ділянкою імуноглобуліну або частиною цієї шарнірної ділянки; та () димеру між кожним доменом константної ділянки важкого ланцюга та константної ділянки легкого ланцюга. Зо

12. Комбінація за п. 9, в якій поліпептид, що містить Ес-ділянку імуноглобуліну, знаходиться у формі димеру.

13. Комбінація за п. 9, в якій Ес-ділянка імуноглобуліну є похідним природної Ес-ділянки, в якому видалено ділянку, здатну утворювати дисульфідний зв'язок, похідним природної Ес-ділянки, в якому вилучено частину амінокислоти (амінокислот) на М-кінці, похідним природної Ес-ділянки, до М-кінця якого додано метіонін, похідним природної Ес-ділянки, в якому видалено комплементзв'язуючу ділянку, або похідним природної Ес-ділянки, в якому вилучено ділянку залежної від антитіл клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АДЮОСС).

14. Комбінація за п. 9, в якій Ес-ділянка імуноглобуліну походить від імуноглобуліну, вибраного з групи, що складається з Ідс, ІдА, дО, ЧЕ та ДМ.

15. Комбінація за п. 14, в якій Ес-ділянкою імуноглобуліну є Ес-ділянка Ідсі.

16. Комбінація за п. 9, в якій Ес-ділянка імуноглобуліну є аглікозильованою Ес-ділянкою, що походить від імуноглобуліну Іде4-людини.

17. Комбінація за п. 8, в якій непептидильний лінкер з'єднано з цистеїновим залишком пептиду.

18. Комбінація за п. 8, в якій обидва кінці непептидильного лінкера є відповідно з'єднаними з аміногрупою або з тіоловою групою пептиду або інсулінотропним пептидом та біосумісним матеріалом.

19. Виділений пептид, що складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮО МО: 37, 38 та 44, де пептид є похідним глюкагону, здатним активувати рецептор глюкагону, та де пептид має величину ізоелектричної точки (рі), яка менша від ізоелектричної точки природного глюкагону (6,8).

20. Пептид за п. 19, де в пептиді амінокислотна пара в положеннях Х16 та Х20 утворює кільце.

21. Пептид за п. 19, в якому амідовано С-кінець.

22. Виділений полінуклеотид, що кодує виділений пептид за будь-яким з пп. 19-21.

23. Вектор, що містить виділений полінуклеотид за п. 22.

24. Виділений кон'югат, в якому з'єднано виділений пептид за п. 19 та біосумісний матеріал, здатний збільшувати час напівжиття іп мімо, де кон'югат здатний активувати рецептор глюкагону, де біосумісний матеріал вибрано з групи, що складається з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та його фрагмента, альбумінзв'язуючого матеріалу, полімеру з 60 повторюваних одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагмента антитіла,

25. Виділений кон'югат за п. 24, в якому пептид з'єднано з біосумісним матеріалом за допомогою лінкера, вибраного з групи, що складається з полієтиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксіетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, включаючи полімолочну кислоту (РІ А) або полілактид-ко-гліколід (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти, жирної кислоти, полімеру, сполуки з низькою молекулярною масою, нуклеотиду та їх комбінації.

26. Виділений кон'югат за п. 24, в якому біосумісний матеріал є ЕсКп-зв'язуючим матеріалом та виділений пептид з'єднаний з біосумісним матеріалом за допомогою пептидильного або непептидильного лінкера, вибраного з групи, що складається 3 поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, кополімеру етилен- та пропіленгліколю, поліоксіетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілового етилового етеру, біорозкладаного полімеру, включаючи полімолочну кислоту (РІГ А) або полілактид-ко-гліколід (РІ СА), ліпідного полімеру, хітину, гіалуронової кислоти та їх комбінації.

27. Виділений кон'югат за п. 26, в якому ЕсКп-зв'язуючий матеріал є поліпептидом, що містить Ес-ділянку імуноглобуліну.

28. Композиція, що містить виділений пептид за п. 19 або виділений кон'югат за п. 24, для лікування або профілактики гіпоглікемії або метаболічного синдрому, де метаболічний синдром вибраний із групи, що складається з порушення толерантності до глюкози, гіперхолестеринемії, дисліпідемії, ожиріння, гіпертонії, неалкогольного стеатогепатиту (МАН), атеросклерозу, спричиненого дисліпідемією, атеросклерозу, артеріосклерозу, ішемічної хвороби серця та інсульту.

М ЗЕ СО НО нні о ше - 4 ЧК Оу п, е Е З : я пон й г о БЕ Ох ве в «В ні енер нн рення о 3 6 З 12 Не Час (днів) «бан весіріелі

«в». Ідпеаціпо ехевоїт-Я допмабує (33 втоко) «у пд аано бебмаймє ої ЗБОЮ МО; 19 1.6 ато)

жк. дпа-ааіпо дейманмє ої 5ЕО 10 МО: 12 153 поки чо» Івидчасіпу белезіме ої БО 0 МО: 2 (0.6 птоілю) зей Іюпочасбло еколабіньЯ дейуайое (3 пт Іспочаснво депмаєує о 5ЕО ТО МО: 12 0.6 птої/ко)

«ав. Іопдчасійо ехепоївна депмайхе (33 поко) Івлечаснійо дейманне ої 5Е01О МО: 1953 пиломко) тан: опочасісу ехепоіюча фегімайме (3 птоико)я Іопочасілю делкаєме ог БОЮ МО: 15 46.5 песо)

м. райо едіну (о іхмучатійх фебуземе ої 50 9 МО: 15 (34 поко)

«як. рвітей Теедіпо йо Іопучасіву ехепоїачЯ делуанме (33 путоікд)» Іопочастіп депмануе об ЗО 1 МО: 19 (33 поко) Фк

ЕІ : ЗВО р що т яку ш ше и БО.

Ох і 0 1 ет п нн Демо бниннннінн С З нан м и ехоріев ГО опочаснпо ехевоїння дейуате 93 пока) почато денуайує ої 5БО1О МО: 12 (6 поко) ЩО юлюо-асітю дей ої ЗБОЮ МО: (33 пейко) ТІ ібпочаєіпю депабке ОЕ5ЕО ТО МО: 19 16.6 пивом С Ююпочаснто ехепоіпні делузнме (33 птеико)є Мопечаснйо бейманюв ої 569 10 МО: 12 (6 пезвілер ЩО Попочаснпо ехепоін»Я депмайче (33 поко Ююпочаєєто дейайме ої ЗБОЮ МО: 79 13.3 поко) Іспечасіво ехепоїннЯ дейуабує (83 піпоуко)» Ююпочаснпо бепкабує ої 5БО 0 МОХ 12 165 пітон) рзітей Тведінд Чо Юпочаснно депанув ОР 52010 МО; 12 133 вто раїтео Теедіпо бо Іопозаснпо ехепфін-Я деймайме (33 вто Іврачаснмо бепмаююв ої БО В МО. 333 поко) Фі

Ї - г пЯаА.

Й ях и /й ОН І ше. пе ен, м А І ше В теееН В 5 й І ШЕ. ко І . й ехаріє С песто ехепдій-Я депманує (33 пттойко) Ібпечаснво бейманов ог БО ТО МОХ 12 1.6 півоко) КО Іопозасіпо депуанує ої 5ЕО 1 МКК 19 133 птеуко) Іопочаснпе дейаєе ої ЗО 10 МО: 19 (6,6 полку) Гі Юпо-асцво ехендіня депуание (3.3 птоко)я Мюпочаснво дептанне ої ЗЕМНЕНМОХ 12 1.6 лзоіуко) КО Тойочасбво ехепдіннЯ депмевуе (33 птеукоїя Іопечасюле деймайме ої ЗБОЮ МОЗ вто) КОМ посів ехепоїтня дейуацуе 33 птоикан Іопечасківо дентабев о ЗЕО 10 МО» 15 46.6 леооілко) раї тебіва ВО Юювочаснво дейманує о 5КО В МО: 39 5.3 воикоє ДЯ роігеє Тевдійю бо олочаснно ехепдїия деймайме (33 птеикун Юовочаснво сейчанме ої 520 10 МО: 12 (33 пипоіико) «Фіг.

З

1 й ків в

: . з ! ве оче - я ах І! ї - | і З Ши ши що Є 1-03 ше її оо От Тер ретро рн реттретттрестреря б 2 4 6 Я ЛЮ Час дві «в» ежсіріені "ВЕ Тепд-аснмо ехеваїв-Я дейчаме (43 піпоіке) «ве Іону-аснно дейуайхе 97580 10 МО: 20 144 втомко) «І Івлозасбпо бейманув ої ХО 10 МО: 20 (58. ливою) ча Юолачасбпо ехепоі бепмавне (43 пло Мовдчасвло дейкавує 7560 1 МОХ 20 (Я пвтпоуко) зе Зопечасвив ехелоїт. дейуаеме (24. помко. Іопо-асцпо белизоме ОХ 10 МО; 20 16.6 поко) че Звлочасіно ехепдіп дейманее (05 птомедю Іввочаєнпв деймайме ої 550 ЦО МО 205.0 втейку) фіг 4 Ві

; Зо 7 ше ше ЕН ши пи а иа ехкіріеві Івпочасвло ехепоійні дебмайме (43 птоко) В Топочаснио дейханне ої ЗЕО ТО МО: 20 144 птеуко) Іопочаєбио бепуайме ві ХО 10 МОХ 20 158 пітоуко) БУ Іопочасбпо ехепфіл делімайме (4.3 віток. Ібпочаснво бебуанме 952010 МО: 2 Я пулюко) Іопочаснио ехепсій бепчацне (2. втокан. Іопо-аєблю дейманме о БО 10 МО: 20 (6.6 поко) неї Тороасвид ехепдій депхаєме (98 вто Гепочасіпао депмацуе ої КО 10 МО: 20180 поко)

Фіг. 5