UA127408C2

UA127408C2 - Сконструйовані пестицидні білки та способи контролю шкідників рослин

Info

Publication number: UA127408C2
Application number: UAA201907388A
Authority: UA
Inventors: Хюнсук С. Чае
Original assignee: Сінгента Партісіпейшнс Аг; Сингента Партисипейшнс Аг
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2023-08-16
Also published as: AU2017377976B2; CL2019001544A1; CO2019005956A2; US11535862B2; PH12019501303A1; BR112019011706A2; WO2018111553A1; MX2019006560A; EP3550961A1; RU2019120804A; ZA201903375B; CL2021000919A1; AR110506A1; US20230203529A1; RU2019120804A3; CL2021002744A1; AU2024203210A1; CN110062579A; AU2017377976A1; CN110062579B

Abstract

Винахід стосується нуклеїнової кислоти, поліпептидів, трансгенних рослин, композицій та способів надання пестицидної активності (наприклад, інсектицидної активності) бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам і насінню. Нуклеїнові кислоти, що кодують інсектицидні білки, можна застосовувати для трансформації прокаріотичних та еукаріотичних організмів із метою забезпечення експресії інсектицидних білків. Рекомбінантні організми або композиції, які містять рекомбінантні організми або інсектицидні білки, або в комбінації з придатним для сільського господарства носієм можна застосовувати для контролю комах-шкідників у різних типах навколишнього середовища.

Description

Даний винахід стосується сконструйованих пестицидних білків і молекул нуклеїнових кислот, які їх кодують, а також композицій і способів контролю шкідників рослин.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Васійиє (Пигіпдіепбіє (ВО є сгрампозитивною споротвірною грунтовою бактерією, що відрізняється своєю здатністю продукувати кристалічні включення, які особливо токсичні для певних рядів і видів шкідників рослин, у тому числі комах, але нешкідливі для рослин та інших нецільових організмів. Тому композиції, що містять штами Васійи5 ІПигіпдіепеі5 або їхні інсектицидні білки, можуть застосовуватися як прийнятні з погляду охорони навколишнього середовища інсектициди для контролю комах-шкідників, важливих із погляду сільського господарства, або комах-переносників багатьох захворювань людини або тварин.

Кристалічні (Стгу) білки з Васійи5 ІПигіпдіепзіє характеризуються сильною інсектицидною активністю щодо переважно лускокрилих, двокрилих і твердокрилих комах-шкідників. Ці білки також продемонстрували активність щодо шкідників із рядів Нутепоріега, Ноторіега,

РІпігарієга, МаПорпада та шкідників із рядів підкласу Асагі, а також інших груп безхребетних, таких як МетаїПпе!Ітіпіпез, РіагупеІтіпіпез ії Загсотавзіідогрпога (Рейеї5оп, у. 1993. Тпе Васійи5

Тпигіпдіепві5 Татіїу їгеє. В Адмапсейд Епдіпеегей Резіїсіде5. Магсе! ЮОеккКег", Іпс., Мем Моїк, М.М.).

Ці білки спочатку розділили на класи СтгуІ-СтумІ переважно на підставі їхньої інсектицидної активності. Основними класами були специфічні для І ерідорієга (І), специфічні для ГІ ерідорієга та Оірієга (Ії), специфічні для СоіІеоріега (І), специфічні для Оіріега (ІМ) і специфічні для нематод (М) та (МІ). Далі білки розділили на підродини; білкам із більш високим ступенем спорідненості в межах кожної родини надали порядкові літери, як, наприклад, СтуїА, СтуІВ,

Сту!С тощо. Білкам із ще вищим ступенем спорідненості в межах кожного порядку надали такі назви, як, наприклад, СтуІС(а), Сту!С(Б) тощо.

Вирази "токсин Стгу" і "дельта-ендотоксин" застосовувалися взаємозамінним чином із виразом "білок Стгу" Сучасна номенклатура білків і генів Сту базується на гомології амінокислотних послідовностей, а не на специфічності щодо цільових комах (СтісКктоге еї аї. (1998) Місгобіої. Мої. ВіоІ. Рем. 62:807-813). У цій більш поширеній класифікації кожному токсину надається унікальна назва, що включає первинний ранг (арабська цифра), вторинний ранг (велика літера), третинний ранг (мала літера) і четвертинний ранг (ще одна арабська цифра). У

Зо сучасній класифікації в первинному ранзі римські цифри були замінені на арабські цифри.

Наприклад, "СтгуІАс(а)" згідно зі старою номенклатурою на сьогодні має назву "СтуїАа" згідно із сучасною номенклатурою. Згідно з публікацією Ібгайіт еї аї. (2010, Віоепуд. Видв5, 1:31-50) токсини Стгу були розділені на шість основних класів згідно з їхньою вибірковістю ураження щодо комахи-хазяїна, та вони включають: групу 1 - лускокрилі (наприклад, Стут1, Сгу9 і Сгу15); групу 2 - лускокрилі та двокрилі (наприклад, Сгуг); групу З - твердокрилі (СтуЗ, Сгу/7 і Сгув); групу 4 - двокрилі (Сту4, Сту10, Сту!1, Стгу1б6, Сту17, Стгу19 і Сгу20); групу 5 - лускокрилі та твердокрилі (СгутІ) ії групу 6 - нематоди (Стгуб). Токсини СтутіІ, Сту2, СтуЗ3, Сту10 і Стгу11 (73-82 кДа) є унікальними, оскільки, ймовірно, вони є результатом природних усікань білків більшого розміру Сту!ї і Сту4 (130-140 кДа).

Білки Сту являють собою глобулярні білкові молекули, які накопичуються у вигляді протоксинів у кристалічній формі під час стадії споруляції Ві. Після поїдання шкідником кристали, як правило, розчиняються з вивільненням протоксинів, розмір яких може варіювати, наприклад, від 130-140 кДа у випадку білків Сгу, активних щодо багатьох лускокрилих, таких як

Стгу! і Сгу9, та 60-80 кДа у випадку білків СтуЗ, активних щодо твердокрилих, та білків Сгуг, активних щодо лускокрилих/двокрилих. Після розчинення кристалів в організмі сприйнятливої комахи вивільнені протоксини піддаються обробці протеазами у травному каналі комахи, наприклад трипсином і хімотрипсином, з утворенням протеазастійкої серцевини білкового токсину Сту. У даний протеолітичний процесинг залучається видалення амінокислот із різних ділянок різних протоксинів Сту. Наприклад, протоксини Сту розміром 130-140 кДа, як правило, активуються шляхом протеолітичного видалення М-кінцевого пептиду з 25-30 амінокислот і приблизно половини залишкового білка з С-кінця, результатом чого є утворення зрілого токсину

Стгу розміром приблизно 60-70 кДа. Протоксини розміром 60-80 кДа, наприклад Стгу2 і Сгуз, також піддаються процесингу, але не тією ж мірою, як протоксини більшого розміру. Протоксини меншого розміру, як правило, характеризуються тим, що з М-кінця видаляється така ж або більша кількість амінокислот, ніж у протоксинів більшого розміру, але на С-кінці видаляється менша кількість амінокислот. Наприклад, протеолітична активація представників родини Сгуг, як правило, залучає видалення приблизно 40-50 М-кінцевих амінокислот. Багато білків Сгу є досить токсичними для певних цільових комах, але багато мають вузькі спектри активності.

Частини токсину білків Сгу зазвичай містять п'ять блоків із консервативною послідовністю та бо три домени з консервативною структурою (див., наприклад, де Маада еї а. (2001) Тгепаз

Сепеїїсв 17:193-199). Перший домен із консервативною структурою, який називається домен |, як правило, складається із семи альфа-спіралей і залучений у вставлення в мембрану та утворення пор. Домен ЇЇ як правило, складається з трьох бета-складчастих шарів, розташованих у конфігурації типу грецький ключ, а домен ПІ, як правило, складається з двох антипаралельних бета-складчастих шарів у вигляді структури "ЧейПу-тої!!! (де Маада еї аї., 2001, вище). Домени ЇЇ та І залучені в розпізнавання та зв'язування рецепторів і тому вважаються детермінантами специфічності токсину.

П'ять блоків із консервативною послідовністю пронумеровані від СВІ до СВ5 з М-кінця до С- кінця білка Сгу (Нопе 8: М/пйеїу, 1989, Місгобіо!. Вем. 53:242-255). Консервативний блок 1 (СВ1) містить приблизно 29 амінокислот, консервативний блок 2 (СВ2) містить приблизно 67 амінокислот, консервативний блок З (СВ3З) містить приблизно 48 амінокислот, консервативний блок 4 (СВ4) містить приблизно 10 амінокислот, і консервативний блок 5 (СВ5) містить приблизно 12 амінокислот. Послідовності до та після цих п'яти консервативних блоків є високоваріабельними, і, таким чином, позначені як "варіабельні ділянки" М1-Уб6. Домен І дельта- ендотоксину ВІ зазвичай містить варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2 і 52 М-кінцеві амінокислоти консервативного блоку 2. Домен ЇЇ зазвичай містить приблизно 15 С-кінцевих амінокислот консервативного блоку 2, варіабельну ділянку З і приблизно 10 М-кінцевих амінокислот консервативного блоку 3. Домен ПШ зазвичай містить приблизно 38 С-кінцевих амінокислот консервативного блоку З, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5 і консервативний блок 5. Серед інших дельта- ендотоксинів активні щодо лускокрилих токсини Сту! мають варіабельну ділянку 6 з приблизно 1-3 амінокислотами, що лежать у домені ПП.

Численні комерційно цінні рослини, у тому числі широко поширені сільськогосподарські культури, є сприйнятливими до нападу шкідників рослин, у тому числі комах-шкідників і нематод-шкідників, що призводить до істотного зниження врожайності та якості сільськогосподарських культур. Наприклад, шкідники рослин є головним чинником втрати врожаю важливих світових сільськогосподарських культур. Через пошкодження, спричинені безхребетними шкідниками, у тому числі комахами, щорічні збитки в США становлять приблизно 8 мільярдів доларів. Комахи-шкідники також лягають тягарем на овочівників і плодівників, виробників декоративних квітів, а також власників присадибних господарств.

Комах-шкідників контролюють переважно шляхом інтенсивного застосування хімічних пестицидів, які діють шляхом пригнічення росту комах, перешкоджання живленню або розмноженню комах або спричиняють загибель. Засоби для біологічного контролю шкідників, наприклад, штами Васійи5 ІпПигіпдіепзіх, що експресують пестицидні токсини, такі як білки Сгу,

З5 також застосовувалися щодо культурних рослин із задовільними результатами, що є альтернативою або доповненням до хімічних пестицидів. Були виділені гени, які кодують деякі з цих білків Сгу, і було показано, що їхня експресія в гетерологічних хазяїнах, таких як трансгенні рослини, забезпечує інший інструмент для контролю економічно важливих комах-шкідників.

Таким чином, можна досягти гарного контролю комах, але тривале застосування певних способів хімічного та біологічного контролю підвищує ймовірність розвитку в комах-шкідників стійкості до таких заходів контролю. Це було частково послаблено за допомогою різних практик контролю стійкості, але залишилася необхідність у розробці нових і ефективних засобів для контролю шкідників. Особливо необхідними є засоби для контролю, які можуть цілеспрямовано діяти на ширший спектр економічно важливих комах-шкідників і/або які забезпечують ефективний контроль ліній комах, що можуть стати стійкими до наявних засобів для контролю комах або є такими. стислии опис

У даному винаході передбачені нуклеїнові кислоти, поліпептиди, композиції та способи надання пестицидної активності (наприклад, інсектицидної активності) бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам і насінню. Зокрема, у даному винаході передбачені нові химерні пестицидні білки (наприклад, химерні інсектицидні білки), необов'язково зі зміненою або підвищеною активністю порівняно з вихідною молекулою.

У варіантах здійснення химерні білки згідно з даним винаходом є токсичними для економічно важливих комах-шкідників (наприклад, шляхом пригнічення здатності комахи- шкідника виживати, рости та/або розмножуватися), особливо комах-шкідників, які уражають рослини. Наприклад, у варіантах здійснення химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом можна застосовувати для контролю одного або декількох економічно важливих шкідників, що належать до лускокрилих, у тому числі без обмеження таких, як совка-іпсилон (Адгоїї5 ірзіоп), кукурудзяний метелик (О5ггіпіа пибіїіаії5), совка трав'яна (б5родорієга идірегаа), бо американська кукурудзяна совка (Неїїсомегра 2еа), вогнівка цукрової тростини (Оіаїгаєа засспагаїї5), гусінь совки оксамитових бобів (Апіїсагзіа деттаїаїйв5), соєва совка (Спгузодвеїхів іпсіцде5), вогнівка кукурудзяна південно-західна (Оіаїгаєа агапайозеїІа), західна бобова совка (Віспіа аїБісоб5іа), тютюнова листокрутка (Неїйоїпіб мігезсепв), східний кукурудзяний метелик (Озійпіа Штасаїї5), бавовникова совка (Неїїсомегра аптідега), вогнівка жовта рисова (Спіо зирргеззаїї5), рожева стеблова совка (безатіа саїатівіів), вогнівка рисова (Спарпаїосгосів теаіпаїїв) тощо. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має активність щодо комахи-шкідника совки трав'яної, яка стійка до білка МірзА та/або білка СтуїЕ.

Відповідно в одному аспекті даного винаходу передбачений химерний інсектицидний білок, який є токсичним для комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, який містить у напрямку від М-кінця до С-кінця: (а) М-кінцеву ділянку першого білка Сту!, яка необов'язково являє собою

М-кінцеву ділянку білка ВТ-0029 під БЕО ІЮО МО:2 або амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична їй, злиту з (Б) С-кінцневою ділянкою іншого білка Сту!; де положення переходу між першим білком Сту! та іншим білком Сту! міститься в консервативному блоці 3. В ілюстративних варіантах здійснення інший білок Сгу! являє собою білок Стуї1Е (наприклад,

СтуїРа), Сту1б, Стуї! (наприклад, Стгуїїа або Сгуїтії такий як ВТ-0022), Сту1сС (наприклад,

Сту1Са) або СтуїК.

У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом має інсектицидну активність щодо комахи-шкідника бродоріега їгидірегда або популяції комах- шкідників зі стійкістю до білка МірзА та/або білка СгуїР.

У додатковому аспекті даного винаходу передбачена нуклеотидна послідовність, що кодує химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом, і касети експресії та вектори, що містять її.

У варіантах здійснення полінуклеотид є кодон-оптимізованим для експресії в рослині (наприклад, однодольній рослині, такій як маїс, або дводольній рослині, такій як соя).

У додатковому аспекті даного винаходу передбачена трансгенна клітина (наприклад, трансгенна рослинна клітина, така як клітина дводольної або клітина однодольної рослини, або трансгенна бактеріальна клітина), трансгенна частина рослини, трансгенна культура рослини й трансгенна насінина рослини, які містять нуклеотидну послідовність, касету експресії, вектор і/або химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

Ще один аспект даного винаходу охоплює трансгенні рослини, що містять рослинну клітину,

Зо частину рослини, нуклеотидну послідовність, касету експресії, вектор і/або химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

Додатковим аспектом є насіння, з якого одержують трансгенні рослини згідно з даним винаходом, і насіння, одержане за допомогою трансгенних рослин згідно з даним винаходом.

Також передбачені зібрані продукти, одержані з трансгенних рослин згідно з даним винаходом, де зібраний продукт необов'язково містить нуклеотидну послідовність, касету експресії, вектор і/або химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом. Додатково передбачені оброблені продукти, одержані із зібраних продуктів згідно з даним винаходом, де зібраний продукт необов'язково містить нуклеотидну послідовність, касету експресії, вектор і/або химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом. У варіантах здійснення зібраний продукт або оброблений продукт містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і характеризується підвищеною стійкістю до комахи-шкідника (наприклад, комахи- шкідника, що належить до лускокрилих).

У ще одному аспекті даного винаходу передбачена інсектицидна композиція, що містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і прийнятний із погляду сільського господарства носій.

Крім того, у додатковому аспекті даного винаходу передбачений спосіб одержання трансгенної рослини з підвищеною стійкістю до комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих). У варіантах здійснення спосіб включає введення в рослину полінуклеотиду, касети експресії або вектора згідно з даним винаходом, де химерний інсектицидний білок експресується в рослині з одержанням у такий спосіб рослини з підвищеною стійкістю до комахи-шкідника. Стадія введення необов'язково включає: (їі) трансформування рослинної клітини за допомогою полінуклеотиду, касети експресії або вектора та регенерування трансгенної рослини; або (її) схрещування першої рослини, що містить полінуклеотид, касету експресії або вектор, із другою рослиною. У варіантах здійснення спосіб додатково включає одержання насінини з трансгенної рослини. У варіантах здійснення спосіб додатково включає одержання рослини-потомка з трансгенної рослини, де рослина- потомок містить полінуклеотид, касету експресії або вектор, експресує химерний інсектицидний білок і характеризується підвищеною стійкістю до комахи-шкідника.

У ще одному аспекті даного винаходу передбачений спосіб одержання трансгенної рослини 60 з підвищеною стійкістю до комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих), при цьому спосіб включає: (а) висівання насінини, що містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом; і (Б) вирощування трансгенної рослини з насінини, де трансгенна рослина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор, і продукує химерний інсектицидний білок, і характеризується підвищеною стійкістю до комахи-шкідника. У варіантах здійснення спосіб додатково включає: (с) збирання насінини з трансгенної рослини зі стадії (Б), де зібрана насінина містить полінуклеотид, касету експресії, вектор і/або химерний інсектицидний білок. Необов'язково насінина характеризується підвищеною стійкістю до комахи- шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих).

Крім того, в іншому аспекті даного винаходу передбачений спосіб одержання насінини. У варіантах здійснення спосіб включає: (а) одержання трансгенної рослини, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом; і (б) збирання насінини з трансгенної рослини зі стадії (а), де зібрана насінина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і/або химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом. Необов'язково насінина характеризується підвищеною стійкістю до комахи-шкідника (наприклад, комахи- шкідника, що належить до лускокрилих).

У даному винаході додатково розглядається спосіб одержання гібридної насінини рослини.

В ілюстративних варіантах здійснення спосіб включає: (а) схрещування першої інбредної рослини, яка являє собою трансгенну рослину, що містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, з іншою інбредною рослиною, яка може містити або не містити полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом; і (б) забезпечення можливості утворення гібридної насінини. У варіантах здійснення гібридна насінина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і/або химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом. Необов'язково насінина характеризується підвищеною стійкістю до комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих).

В іншому аспекті даного винаходу передбачений спосіб контролю комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, такої як совка трав'яна), при цьому спосіб включає доставляння в організм комахи-шкідника або в середовище її існування композиції, що містить ефективну кількість химерного інсектицидного білка або інсектицидної композиції згідно з даним винаходом. У варіантах здійснення даний спосіб являє собою спосіб

Зо контролю комахи-шкідника, що належить до лускокрилих (наприклад, совки трав'яної), яка стійка до білка МірзА та/або білка Сгуї Р.

Відповідно в іншому аспекті даного винаходу передбачені способи зменшення розвитку стійкості до білка МірзА та/або білка СтуїЕ в популяції цільової комахи-шкідника, що належить до лускокрилих (наприклад, совки трав'яної). У варіантах здійснення спосіб включає доставку до цільової популяції або в середовище її існування трансгенної рослини, що містить (Її) полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом та (ії) полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок МірзА, та/або нуклеотидну послідовність, що кодує білок Стуїї; де химерний інсектицидний білок, і білок МірзЗА, та/або білок СтуїР продукуються в трансгенній рослині.

Даний винахід також спрямований на способи застосування полінуклеотидів згідно з даним винаходом, наприклад, у ДНК-конструкціях, або касетах експресії, або векторах для трансформації й експресії в організмах, у тому числі рослинах і мікроорганізмах, таких як бактерії. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть являти собою нативні або синтетичні послідовності, які були сконструйовані для експресії в організмі, такому як рослина або бактерії. Даний винахід додатково спрямований на способи одержання інсектицидних білків згідно з даним винаходом та способи застосування полінуклеотидних послідовностей та інсектицидних білків, наприклад, в мікроорганізмах, для контролю комах, або в трансгенних рослинах для забезпечення захисту від ушкодження комахами.

Інший аспект згідно 3 даним винаходом включає інсектицидні композиції та склади, що містять химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом, і способи застосування композицій або складів для контролю популяцій комах, наприклад, шляхом застосування композицій або складів щодо уражених комахами площ, або для профілактичної обробки сприйнятливих до комах площ або рослин для забезпечення захисту від комах-шкідників. Необов'язково композиції або склади згідно з даним винаходом можуть, на додаток до химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом, містити інші пестицидні засоби, такі як хімічні пестициди, інші пестицидні білки або а5ЕМА, наприклад, для збільшення або посилення здатності композиції або складу забезпечувати контроль комах і/або для контролю стійкості комах до пестицидів.

Композиції та способи згідно з даним винаходом є застосовними для контролю комах- бо шкідників, які вражають рослини, зокрема культурні рослини. Композиції згідно з даним винаходом також є застосовними для виявлення присутності химерного інсектицидного білка або нуклеїнової кислоти, що кодує його, у комерційних продуктах або трансгенних організмах.

У даному винаході також передбачені шляхи застосування химерних інсектицидних білків, нуклеїнових кислот, трансгенних рослин, частин рослин, насіння і інсектицидних композицій згідно з даним винаходом, наприклад, для контролю комахи-шкідника, такої як шкідник, що належить до лускокрилих.

У варіантах здійснення даного винаходу передбачений спосіб застосування полінуклеотиду, касети експресії, вектора або клітини-хазяїна згідно з даним винаходом для одержання інсектицидної композиції для контролю комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих).

У варіантах здійснення даного винаходу передбачений спосіб застосування полінуклеотиду, касети експресії або вектора згідно з даним винаходом для одержання трансгенної насінини, де з трансгенної насінини виростає трансгенна рослина з підвищеною стійкістю до комахи- шкідника.

В іншому аспекті даного винаходу також розглядається застосування трансгенної рослини згідно з даним винаходом для одержання трансгенної насінини, яка необов'язково являє собою гібридну насінину.

У варіантах здійснення даного винаходу передбачений спосіб застосування химерного інсектицидного білка, полінуклеотиду, касети експресії, вектора, трансгенної рослини або інсектицидної композиції згідно з даним винаходом для запобігання розвитку стійкості в популяції цільової комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, до білка МірзА та/або білка

Стук.

Ці та інші ознаки, аспекти та переваги даного винаходу стануть більш зрозумілими з посиланням на наступний докладний опис і формулу винаходу.

СТИСЛИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

На фігурах 1А і 18 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей повнорозмірного вт-0029 (5ЕО ІО МО: 2), ВТ-0022 (ЗЕО ІО МО: 1), СтуїРа (ЗЕО ІЮ МО: 8) і СтуїКа (ЗЕО ІЮ МО: 12). Вказані серцевина домену Ії ії консервативний блок З (СВ3). Ідентичні амінокислоти у вирівняних послідовностях заштриховані.

Зо На фігурах 2А і 28 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей повнорозмірного

ВТ-0029 (ЗЕО ІО МО: 2) з ілюстративними химерами ВТ-0029: Ві29-ВІ22 (5ЕО ІО МО: 3), ВІ29- 1га (ЗЕО ІО МО: 9) і ВІ29-1Ка (5ЕО І МО: 13). Вказані серцевина домену ПІ і консервативний блок З (СВ3З). Серцевина домену ЇЇ, вказана на фігурі, одержана з другого білка Сгу. Ідентичні амінокислоти у вирівняних послідовностях заштриховані.

На фігурах ЗА, 38, ЗС і 30 показана повнорозмірна химера ВІ29-ВІ22 (5ЕО І МО:3), вирівняна з серією химер ВІ29-ВІ22, ВіІ29-ВІ22Т (5ЕО І МО:20), ВІ29-ВІ22Тт2 (ЗЕО ІЮ МО:21),

ВІ29-ВІ22ТІЗ (5ЕО І МО:22), ВІ29-ВІ221т4 (5ЕО І МО 23), ВІ29-ВІ22Тт5 (ЗЕО ІЮ МО:24) і ВІ29-

ВІ22Тт6 (5ЕО ІЮ МО:25), з С-кінцевими усіканнями в межах хвоста протоксину ВТ-0029.

СТИСЛИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕО ІЮ МО: 1 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ-0022.

ЗЕО ІЮ МО: 2 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ-0029.

ЗЕО ІЮО МО: З являє собою амінокислотну послідовність химери Ві29-ВІ22. Послідовність ВтТ- 0022 являє собою амінокислоти 459-597.

ЗЕО ІЮ МО: 4 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує химеру ВІ29-ВІ22 під БЕО

ІО МО: 3.

ЗЕО ІЮО МО: 5 являє собою ілюстративну оптимізовану для маїсу послідовність, що кодує химеру ВІ29-ВІ22 під БЕО ІЮО МО: 3.

ЗЕО ІЮО МО: 6 являє собою ілюстративну оптимізовану для маїсу послідовність, що кодує химеру ВІ29-ВІ22 під БЕО ІЮО МО: 3.

ЗЕО ІЮО МО: 7 являє собою ілюстративну оптимізовану для маїсу послідовність, що кодує химеру ВІ29-ВІ22 під БЕО ІЮ МО: 3.

ЗЕО ІЮ МО: 8 являє собою амінокислотну послідовність повнорозмірного Стгуї1 Ра.

ЗЕО ІЮО МО: 9 являє собою амінокислотну послідовність химери ВІі29-ТРа. Послідовність

СтуїРа являє собою амінокислоти 459-597.

ЗЕО ІЮ МО: 10 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує химеру ВІ29-1Ра під БЕО

ІО МО: 9.

ЗЕО ІЮ МО: 11 являє собою ілюстративну оптимізовану для маїсу послідовність, що кодує химеру ВІ29-1ГРа під 5ЕО ІЮО МО: 9.

ЗЕО ІЮ МО: 12 являє собою амінокислотну послідовність повнорозмірного Сту! Ка. 60 ЗЕО ІЮО МО: 13 являє собою амінокислотну послідовність химери Ві29-1Ка. Послідовність

СтуїКа являє собою амінокислоти 459-597.

ЗЕО ІЮ МО: 14 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує химеру ВІі29-1Ка під БЕО

ІО МО: 13.

ЗЕО ІЮ МО: 15 являє собою амінокислотну послідовність химери ВІ29-1Кам2.

ЗЕО ІЮ МО: 16 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує химеру ВІі29-1Ка під БЕО

ІО МО: 15.

ЗЕО ІЮ МО: 17 являє собою амінокислотну послідовність повнорозмірного Сту! Са.

ЗЕО ІЮО МО: 18 являє собою амінокислотну послідовність химери ВІ29-1Са. Послідовність

СтуїСа являє собою амінокислоти 459-597.

ЗЕО ІЮ МО: 19 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує химеру ВІ29-1Са під БЕО

ІО МО: 18.

ЗЕО ІЮ МО: 20 являє собою амінокислотну послідовність білка ВІ29-ВІ22 ТІ.

ЗЕО ІО МО: 21 являє собою амінокислотну послідовність білка ВІ29-ВІ22Тт2.

ЗЕО ІЮ МО: 22 являє собою амінокислотну послідовність білка ВІ29-ВІ22ТІ3.

ЗЕО ІЮ МО: 23 являє собою амінокислотну послідовність білка ВІ29-ВІ22Тт4.

ЗЕО ІЮ МО: 24 являє собою амінокислотну послідовність білка ВІ29-ВІ22Тт5.

ЗЕО ІЮ МО: 25 являє собою амінокислотну послідовність білка ВІ29-ВІ22Тт6.

ЗЕО ІЮ МО: 26 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ29ВТ22-ТІ 22м1.

ЗЕО ІЮ МО: 27 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ29ВТ22-ТІ 22м2.

ЗЕО ІЮ МО: 28 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ29ВТ22-ТІ 22у3.

ЗЕО ІЮ МО: 29 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ29ВТ22-ТІ 22у4.

ЗЕО ІЮ МО: 30 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ29ВТ22-ТІ 225.

ЗЕО ІЮ МО: 31 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ298122-ТІ 22у6.

ЗЕО ІЮ МО: 32 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ291ГРатт1.

ЗЕО ІЮ МО: 33 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ291ГРатг2.

ЗЕО ІЮ МО: 34 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ291Раттз.

ЗЕО ІЮ МО: 35 являє собою амінокислотну послідовність білка ВТ291ГРаттга.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

Не передбачається, що даний опис являє собою докладний перелік усіх різних шляхів, за допомогою яких може бути реалізований даний винахід, або всіх ознак, які можна додати до даного винаходу. Наприклад, ознаки, проілюстровані щодо одного варіанта здійснення, можуть бути включені в інші варіанти здійснення, а ознаки, проілюстровані щодо конкретного варіанта здійснення, можуть бути видалені з даного варіанта здійснення. Таким чином, даним винаходом передбачається, що в деяких варіантах здійснення даного винаходу можна виключити або випустити будь-яку ознаку або комбінацію ознак, викладених у даному документі. Крім того, численні варіації та доповнення до різноманітних варіантів здійснення, які пропонуються в даному документі, будуть очевидними для фахівців у даній галузі техніки з огляду на дане розкриття, що не відходить від суті даного винаходу. Отже, наступні описи призначені для ілюстрації деяких конкретних варіантів здійснення за даним винаходом, а не для вичерпного визначення всіх їхніх перетворень, комбінацій і варіацій.

Якщо не визначено інше, то всі технічні та наукові терміни, які застосовуються у даному документі, мають таке значення, яке зазвичай є зрозумілим фахівцю в даній галузі техніки, до якої належить даний винахід. Термінологія, яка застосовується в даному документі в описі даного винаходу, застосовується лише для опису конкретних варіантів здійснення та не призначена для обмеження даного винаходу.

Усі публікації, заявки на патенти, патенти та інші посилання, що цитуються в даному документі, включені за допомогою посилання у всій своїй повноті для пояснення ідей, які стосуються речення та/або абзацу, в яких наведено дане посилання.

Нуклеотидні послідовності, забезпечувані в даному документі, представлені в напрямку 5'-3' зліва направо і представлені із застосуванням стандартного коду для представлення нуклеїнових основ, як викладено в розділі 37 СЕК, 551.821-1.825 і стандарті 51.25 Всесвітньої організації інтелектуальної власності (УМІРО), наприклад, аденін (А), цитозин (С), тимін (Т) і гуанін (5).

Аналогічним чином амінокислоти позначені із застосуванням стандарту 5Т.25 УМРО, наприклад, аланін (Айа; А), аргінін (Аго; К), аспарагін (Азп; М), аспарагінова кислота (Азр; 0), цистеїн (Суз; С), глутамін (Сп; С), глутамінова кислота (Сіи; Е), гліцин (Су; б), гістидин (Нів; Н), ізолейцин (Іе; 1), лейцин (Гени; І), лізин (Гув; К), метіонін (Мес М), фенілаланін (Ре; Е), пролін (Рго; Р), серин (зЗег; 5), треонін (ТНг; Т), триптофан (Тгр; УМ), тирозин (Туг; У) і валін (Маї; М).

Якщо контекст не вказує інше, зокрема передбачається, що різні ознаки даного винаходу, бо описані в даному документі, можуть застосовуватися в будь-якій комбінації. До того ж, у даному б винаході також передбачається, що в деяких варіантах здійснення даного винаходу будь-яку ознаку або комбінацію ознак, наведених у даному документі, можна виключити або пропустити.

Для ілюстрації, якщо в описі стверджується, що композиція містить компоненти А, В і С, то це зокрема передбачає, що будь-яке з А, В або С або їхньої комбінації можна пропустити та відхилити окремо або в будь-якій комбінації.

Визначення.

Як передбачається, застосовувані в описі даного винаходу і формулі винаходу, що додається, форми однини також включають форми множини, якщо контекст явно не вказує інше.

Застосовуваний у даному документі вираз "і/або" стосується будь-якої і всіх можливих комбінацій одного або декількох відповідних перелічених елементів та охоплює їх, а також відсутності комбінацій у разі інтерпретації як альтернативи ("або").

Вираз "приблизно", застосовуваний у даному документі в разі згадування вимірюваної величини, такої як дозування або період часу тощо, призначений для охоплення змін певної кількості на (20 Фо, (10 9, (5 о, (1 У, (0,5 95 або навіть (0,1 95. Застосовувані в даному документі фрази, такі як "від приблизно Х до У", означають "від приблизно Х до приблизно У", і фрази, такі як "від приблизно Х до У", означають "від приблизно Х до приблизно У".

Застосовувані в даному документі фрази, такі як "від Х до У", слід інтерпретувати як такі, що включають Х і У, якщо контекст не вказує інше.

Під "активністю" інсектицидного білка згідно з даним винаходом мається на увазі, що інсектицидний білок функціонує як перорально активний засіб для контролю комах, має токсичну дію, наприклад, шляхом пригнічення здатності комахи-шкідника виживати, рости та/або розмножуватися (наприклад, викликаючи захворюваність і/або смертність), і/або здатний порушувати та/або обмежувати живлення комахи, що може викликати загибель комахи або не викликати її. Таким чином, коли інсектицидний білок згідно з даним винаходом доставлений в організм комахи, результатом, як правило, є захворюваність та/або смертність комахи та/або зменшення або припинення поїдання комахою джерела, яке забезпечує комаху інсектицидним білком.

У контексті даного винаходу "химерний" білок являє собою білок, створений шляхом злиття

Зо щонайменше двох різних білків у суцільному вигляді або їхньої частини. У варіантах здійснення даного винаходу химерний білок являє собою химерний білок Сгу, що містить два різних білки

Стгу у суцільному вигляді або їхню частину, злиті разом в один поліпептид. "Химерний інсектицидний білок" являє собою химерний білок, який має інсектицидну активність (як описано в даному документі). "Послідовність, що кодує" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибується в РНК, таку як тЕМА, геЕМА, їКМА, 5пЕМА, сенсова РНК або антисенсова РНК.

У варіантах здійснення РНК потім транслюється з одержанням білка.

Застосовуваний у даному документі вираз "кодон-оптимізована" нуклеотидна послідовність означає нуклеотидну послідовність рекомбінантного, трансгенного або синтетичного полінуклеотиду, в якому кодони вибрані так, щоб відображати схильність до певних кодонів, яка може спостерігатися в клітині - або організмі-хазяїні. Як правило, це виконується таким чином, щоб зберегти амінокислотну послідовність поліпептиду, що кодується кодон-оптимізованою нуклеотидною послідовністю. У певних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність є кодон- оптимізованою для клітини (наприклад, клітини тварини, рослини, гриба або бактерії), у якій конструкція буде експресуватись. Наприклад, у конструкції, яка буде експресуватись у рослинній клітині, можуть бути кодон-оптимізовані вся послідовність або її частини для експресії в рослині. Див., наприклад, патент США Мо 6121014. У варіантах здійснення полінуклеотиди згідно з даним винаходом є кодон-оптимізованими для експресії в рослинній клітині (наприклад, клітині дводольної або клітині однодольної рослини) або бактеріальній клітині. "Контроль" комахи-шкідника означає пригнічення за допомогою токсичної дії здатності комахи-шкідника виживати, рости, харчуватися та/або розмножуватися, та/або обмеження пов'язаного з комахами ушкодження або загибелі культурної рослини, спричинених комахою- шкідником, та/або захист максимального потенційного врожаю сільськогосподарської культури, спричиненого шкідником, у разі вирощування в присутності комахи-шкідника. "Контроль" комахи-шкідника може означати або може не означати знищення комахи, хоча у варіантах здійснення даного винаходу "контроль" комахи означає знищення комахи.

Вираз "містять", "містить" або "що містить" у разі застосування в даному описі вказує на присутність зазначених ознак, цілих чисел, стадій, операцій, елементів або компонентів, але не виключає присутності або додавання одного або декількох інших ознак, цілих чисел, стадій, бо операцій, елементів, компонентів і/або їхніх груп.

Застосовувана в даному документі перехідна фраза "по суті складається з" (та її граматичні варіанти) означає, що обсяг пункту формули винаходу слід інтерпретувати як такий, що охоплює вказані матеріали або стадії, перелічені в пункті формули винаходи, "їі такі, які суттєво не змінюють основну й нову характеристику (характеристики)" заявленого винаходу. Таким чином, вираз "що складається переважно з" у разі застосування у пункті формули даного винаходу не призначений для інтерпретації як еквіваленту виразу "що містить".

У контексті даного винаходу "відповідний" або "відповідає" означає, що коли амінокислотні послідовності модифікованих або гомологічних білків вирівнюють одна з одною, амінокислоти, які "відповідають" певним переліченим положенням у модифікованому або гомологічному білку,

Є такими, які вирівнюються з цими положеннями в еталонному білку, але не обов'язково знаходяться саме в цих числових положеннях щодо конкретної еталонної амінокислотної послідовності згідно з даним винаходом. Наприклад, якщо 5ЕО ІЮ МО: 2 (ВТ-0029) являє собою еталонну послідовність і є вирівняною з 5ЕО ІЮ МО: 1 (ВТ-0022), як на фігурі 1, послідовність

ТГЕАМТ, що йде відразу за доменом І в 5ЕО ІЮ МО: 1 (ВТ-0022), "відповідає" послідовності

ТЕЕАЕХ, що йде відразу за доменом ЇЇ в ХЕО ІЮ МО: 2 (ВТ-0029).

Застосовуваний у даному документі вираз "білок Сту" означає інсектицидний білок типу кристалічного дельта-ендотоксину з Васійи5 (пигіпдіепвіз. Вираз "білок Сгу" може стосуватися форми протоксину або будь-якого його інсектицидно активного фрагмента або токсину, в тому числі частково піддану процесингу форму й форму зрілого токсину (наприклад, без М-кінцевого пептидильного фрагмента та/або С-кінцевого хвоста протоксину).

Застосовуваний у даному документі вираз "доставка" або "доставляння" (і граматичні варіанти) композиції або інсектицидного білка означає, що композиція або інсектицидний білок вступає в контакт із комахою, що забезпечується поїданням композиції або інсектицидного білка із попаданням всередину організму, що призводить до токсичної дії та контролю комахи.

Композицію або інсектицидний білок можна доставляти багатьма відомими способами, у тому числі без обмеження за допомогою експресії у трансгенній рослині, складеної (складених) білкової (білкових) композиції (композицій), розпилювальної (розпилюваних) білкової (білкових) композиції (композицій), матриці з приманкою або за допомогою будь-якої іншої відомої в даній галузі техніки системи доставляння білка.

Зо Вираз "домен" стосується набору амінокислот, консервативних у певних положеннях за довжиною вирівнювання послідовностей еволюційно споріднених білків. Тоді як амінокислоти в інших положеннях гомологів можуть відрізнятися, амінокислоти, що є висококонсервативними в певних положеннях, указують на амінокислоти, які, ймовірно, є необхідними для структури, стабільності або функції білка. Ідентифіковані за їхнім високим ступенем консервативності у вирівняних послідовностях родини гомологів білків, вони можуть застосовуватися як ідентифікатори для визначення того, чи належить будь-який поліпептид, що розглядається, до раніше ідентифікованої групи поліпептидів. "Ефективна для контролю комах кількість" означає концентрацію інсектицидного білка, яка забезпечує пригнічення за допомогою токсичної дії здатності комах виживати, рости, харчуватись талабо розмножуватись або обмежує пов'язане з комахами пошкодження або втрату врожаю сільськогосподарської культури. Вираз "ефективна для контролю комах кількість" може означати або може не означати знищення комахи, хоча у варіантах здійснення він означає знищення комахи.

Застосовуваний у даному документі вираз "касета експресії" означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну керувати експресією щонайменше одного полінуклеотиду, який становить інтерес, такого як полінуклеотид, що кодує інсектицидний білок згідно з даним винаходом, у відповідній клітині-хазяїні, що містить промотор, функціонально пов'язаний із полінуклеотидом, який становить інтерес, що функціонально пов'язаний із сигналом термінації. "Касета експресії" також, як правило, містить додаткові полінуклеотиди для полегшення належної трансляції полінуклеотиду, що становить інтерес. Касета експресії також може містити інші полінуклеотиди, які не пов'язані з експресією полінуклеотиду, який становить інтерес, але які є присутніми завдяки відповідним сайтам рестрикції для вилучення касети з вектора експресії. У варіантах здійснення щонайменше один з компонентів у касеті експресії може бути гетерологічним (тобто чужорідним) щодо щонайменше одного з інших компонентів (наприклад, гетерологічний промотор, функціонально пов'язаний із полінуклеотидом, що становить інтерес).

Касета експресії може також являти собою послідовність, яка зустрічається в природі, але була одержана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Проте, як правило, касета експресії є гетерологічною щодо хазяїна, тобто касета експресії (або навіть полінуклеотид, який становить інтерес) не зустрічається в природі в клітині-хазяїні, а була бо введена в клітину-хазяїна або її клітину-попередника за допомогою способу трансформації або процесу схрещування. Експресія полінуклеотиду (полінуклеотидів), який (які) становить (становлять) інтерес, у касеті експресії зазвичай знаходиться під контролем промотора. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор може також бути специфічним або переважним щодо конкретної тканини, або органа, або стадії розвитку (як описано більш докладно в даному документі). Після трансформації в рослину касета експресії або її фрагмент також можуть називатися "вставленим полінуклеотидом" або "полінуклеотидом вставки". "Ген" визначається в даному документі як одиниця спадковості, що містить один або декілька полінуклеотидів, яка займає певне місце розташування на хромосомі або плазміді та яка містить генетичну інструкцію для певної характеристики або ознаки, властивих організму.

Застосовуваний у даному документі вираз "протеаза травного каналу" стосується протеази, яка зустрічається у травному тракті комахи в природі. Як правило, дана протеаза бере участь у перетравлюванні поглинених білків. Приклади протеаз травного каналу включають трипсин, який, як правило, розщеплює пептиди з С-кінцевої частини залишків лізину (К) або аргініну (К), і хімотрипсин, який, як правило, розщеплює пептиди з С-кінцевої частини фенілаланіну (Б), триптофану (М) або тирозину (У).

Застосовуваний у даному документі вираз "гетерологічний" означає чужорідний, екзогенний, ненативний і/або такий, що не зустрічається у природних умовах. У варіантах здійснення "гетерологічний" полінуклеотид або поліпептид являє собою полінуклеотид або поліпептид, у природних умовах не пов'язаний із клітиною-хазяїном, у яку його вводять, у тому числі велика кількість копій, що не зустрічаються в природних умовах, нуклеотидної послідовності або поліпептиду, що зустрічаються у природних умовах. У варіантах здійснення нуклеотидна послідовність є гетерологічною щодо іншої послідовності, з якою вона функціонально пов'язана, наприклад, промотор може бути гетерологічним (тобто чужорідним) щодо функціонально пов'язаної послідовності, що кодує.

Застосовуваний у даному документі вираз "гомологічний" означає нативний. Наприклад, гомологічна нуклеотидна послідовність або амінокислотна послідовність означає нуклеотидну послідовність або амінокислотну послідовність, які у природних умовах пов'язані з клітиною- хазяїном, у яку їх вводять, гомологічна промоторна послідовність являє собою промоторну послідовність, яка у природних умовах пов'язана з кодувальною послідовністю тощо.

Зо Вирази "збільшувати", "збільшення", "збільшений", "підвищувати", "підвищений", "підвищення" і "поліпшення" (та їхні граматичні варіанти) та аналогічні вирази, застосовувані в даному документі, описують підвищення контролю шкідника рослин, наприклад, шляхом приведення рослини в контакт із поліпептидом згідно з даним винаходом (як, наприклад, шляхом трансгенної експресії або способами місцевого застосування). Це збільшення контролю може застосовуватися щодо рівня контролю шкідника рослин за відсутності поліпептиду згідно з даним винаходом (наприклад, рослина, яка не експресує трансгенним чином поліпептид або не підлягає місцевій обробці за допомогою поліпептиду). Таким чином, у варіантах здійснення вирази "збільшувати", "збільшення", "збільшений", "підвищувати", "підвищений", "підвищення" і "поліпшення" (та їхні граматичні варіанти) і подібні вирази можуть указувати на підвищення на щонайменше приблизно 5 то, 10 то, 15 то, 20 то, 25 то, Зо то, 35 то, 40 то, 45 то, 50 Чо, 2О о, 60 то, 65 Уо, 70 У, 75 Уо, 80 Уо, 85 90, 90 Уо, 95 Уо, 100 95, 125 о, 150 У, 200 95, 300 У, 400 У, 500 95 або більше порівняно з придатним контролем (наприклад, рослиною, частиною рослини, рослинною клітиною, які не знаходяться в контакті з поліпептидом згідно з даним винаходом).

Вираз "інсектицидний", застосовуваний у даному документі, визначається як токсична біологічна активність, здатна забезпечувати контроль комахи-шкідника, необов'язково, але переважно шляхом її знищення.

Послідовність нуклеїнової кислоти є "ізокодонною" щодо еталонної послідовності нуклеїнової кислоти в тому випадку, коли послідовність нуклеїнової кислоти кодує поліпептид, який має таку ж амінокислотну послідовність, що й поліпептид, який кодується еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти.

В ілюстративних варіантах здійснення молекули нуклеїнових кислот, полінуклеотиди або поліпептиди згідно з даним винаходом є "виділеними". "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти, полінуклеотид або білок тощо являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, полінуклеотид або білок тощо, які більше не знаходяться у своєму природному середовицщі.

Виділена молекула нуклеїнової кислоти, полінуклеотид або білок за даним винаходом можуть знаходитися в очищеній формі або можуть знаходитися в рекомбінантному хазяїні, такому як трансгенна бактерія або трансгенна рослина. У варіантах здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти, нуклеотидна послідовність або поліпептид знаходяться в очищеній формі, тобто щонайменше частково відділені від щонайменше деяких інших компонентів організму або бо вірусу, що зустрічається у природних умовах, наприклад, структурних компонентів клітини або вірусу або інших поліпептидів або нуклеїнових кислот, що зазвичай виявляються зв'язаними з полінуклеотидом. В інших варіантах здійснення "виділена" молекула нуклеїнової кислоти, нуклеотидна послідовність або поліпептид можуть існувати в неприродному середовищі, наприклад, такому як рекомбінантна клітина-хазяїн. Таким чином, наприклад, щодо нуклеотидних послідовностей, вираз "виділена" може означати те, що нуклеотидна послідовність відділена від хромосоми та/або клітини, в якій вона зустрічається у природних умовах. Полінуклеотид також є виділеним, якщо він відділений від хромосоми та/або клітини, в якій він зустрічається у природних умовах, і потім введений у генетичне оточення, хромосому та/або клітину, у яких він у природних умовах не зустрічається (наприклад, іншу клітину-хазяїна, інші регуляторні послідовності талабо інше положення в геномі порівняно з такими, що виявляються в природі). Відповідно рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти, нуклеотидні послідовності та поліпептиди, що кодуються ними, є "виділеними" у тому розумінні, що завдяки втручання людини вони існують незалежно від свого природного середовища, а отже не є природними продуктами, однак у деяких варіантах здійснення вони можуть бути введені в рекомбінантну клітину-хазяїна та існувати в ній. В ілюстративних варіантах здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти, виділена нуклеотидна послідовність та/або виділений поліпептид є чистими на щонайменше приблизно 1 95, 5 95, 10 У, 20 95, 30 Зо, 40 Фо, 50 95, 60 о, 70 Фо, 80 95, 90 Фо, 95 95, або більше.

Вираз "мотив", або "консенсусна послідовність", або "сигнатура" стосується короткої консервативної ділянки в послідовності еволюційно споріднених білків. Мотиви часто є високо консервативними частинами доменів, але можуть також включати тільки частину домену або розташовуватися поза консервативним доменом (якщо всі амінокислоти мотиву виходять за межі певного домену). "Нативна" нуклеїнова кислота, нуклеотидна послідовність, поліпептид або амінокислотна послідовність або нуклеїнова кислота, нуклеотидна послідовність, поліпептид або амінокислотна послідовність "дикого типу" стосуються нуклеїнової кислоти, нуклеотидної послідовності, поліпептиду або амінокислотної послідовності, що зустрічається у природних умовах, або ендогенної нуклеїнової кислоти, нуклеотидної послідовності, поліпептиду або амінокислотної послідовності. Таким чином, наприклад, "тЕМА дикого типу" являє собою

Зо ТЕМА, яка зустрічається у природних умовах в організмі або є ендогенною щодо нього.

Вирази "нуклеїнова кислота", "молекула нуклеїнової кислоти", "нуклеотидна послідовність", "олігонуклеотид" і "полінуклеотид" застосовуються в даному документі взаємозамінним чином, якщо в контексті не вказано інше, і стосуються гетерополімеру з нуклеотидів. Ці вирази включають без обмеження молекули ДНК і РНК, у томі числі СОМА, геномну ДНК, синтетичну (наприклад, хімічно синтезовану) ДНК і РНК, плазмідну ДНК, ткМА, антисенсову РНК і гібриди

РНК/ДНК, будь-які з яких можуть бути лінійними або розгалуженими, однонитковими або двонитковими, або їхні комбінації. У випадку, якщо 45КМА одержують синтетичним шляхом, менш розповсюджені основи, такі як інозин, 5-метилцитозин, б-метиладенін, гіпоксантин та інші, також можна застосовувати для парування антисенсових послідовностей, 85КМА та рибозимів.

Наприклад, полінуклеотиди, які містять С-5-пропінові аналоги уридину та цитидину, як було показано, зв'язують РНК з високим ступенем спорідненості й являють собою сильні антисенсові інгібітори експресії генів. Також можна здійснювати інші модифікації, наприклад модифікацію фосфодіестерного остова або 2'-гідроксигрупи цукру рибози РНК. У варіантах здійснення вирази "нуклеїнова кислота", "молекула нуклеїнової кислоти", "нуклеотидна послідовність", "олігонуклеотид" або "полінуклеотид" стосуються ДНК.

Під застосовуваними в даному документі виразами "що має функціональний зв'язок" або "функціонально пов'язаний" розуміють, що вказані елементи є функціонально зв'язаними один з одним, а також зазвичай є фізично зв'язаними. Таким чином, застосовувані в даному документі вирази "що має функціональний зв'язок' або "функціонально пов'язаний" стосуються нуклеотидних послідовностей в одній молекулі нуклеїнової кислоти, які є функціонально пов'язаними. Таким чином, перша нуклеотидна послідовність, що має функціональний зв'язок з другою нуклеотидною послідовністю, означає ситуацію, коли перша нуклеотидна послідовність перебуває у функціональному взаємозв'язку з другою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний із нуклеотидною послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію вказаної нуклеотидної послідовності. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що регуляторні послідовності (наприклад, промотор) необов'язково мають бути суміжними з тією нуклеотидною послідовністю, з якою вони функціонально пов'язані, за умови, що регуляторні послідовності виконують функцію керування її експресією.

Таким чином, наприклад, між промотором і нуклеотидною послідовністю можуть бути присутні бо проміжні послідовності, які не здатні транслюватися, але при цьому здатні транскрибуватися, і промотор може усе ще вважатися таким "що має функціональний зв'язок" або "функціонально пов'язаним" з цією нуклеотидною послідовністю.

Застосовуваний у даному документі вираз "рослина" стосується будь-якої рослини на будь- якій стадії розвитку.

Будь-яку рослину (або групування рослин, наприклад, у рід або вищий порядок класифікації) можна застосовувати в здійсненні даного винаходу, у тому числі покритонасінні або голонасінні, однодольні або дводольні.

Типові рослини включають без обмеження кукурудзу (7еа тауз), канолу (Вгаззіса парив,

Вгаззіса гара 55р.), люцерну (Медісадо заїїма), рис (Огула заїїма, у тому числі без обмеження різновиди Іпдіса та/або даропіса), рапс (Вгаззіса парив), жито (5Зесаїе сегеаіє), сорго (Зогапит рісоїог, Зогапит мцЇдаге), соняшник (Неїїапіпи5 аппи5), пшеницю (Тгййсит аевіїмит), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місоїйапа їобасит), картоплю (Зоїапит їшрегозит), арахіс культурний (Агаспів

Ппуродаєа), бавовник (Ссо55урішт Пігеицішит), солодку картоплю (Іротоеа бБаїайшв5), маніоку (Мапіпої езсшепіа), кавове дерево (Соїва 5рр.), кокосову пальму (Сосо5 писіїега), ананас (Апапа5 сотозив5), цитрусові дерева (Сйги5 5рр.), дерево какао (Тпеобгота сасао), чайну рослину (Саптеїіа 5іпепві5), банан (Миза 5рр.), авокадо (Регзеа атегісапа), фігове дерево (Ріси5 сазіса), гуаву (Рзідішт диадзама), манго (Мапоіїгега іпаіса), оливу (ОІєа епгораєа), динне дерево (Сагіса рарауа), анакардію західну (Апасагаічт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа іпіедгітоїїа), мигдаль (Ргипи5 атудааї|н5), види цукрового буряку (Веїа миЇдагіх5), яблуню (Маїих ритіїа), ожину (Вивих), полуницю (Егадагіа), волоський горіх (дидіап5 гедіа), виноград (Мійі5 міпітега), абрикос (Ргипи5 агтепіаса), вишню (Ргипив5), персик (Ргипих регвіса), сливу (Ргипи5 дотезвіїса), грушеве дерево (Руги5 соттипів), кавун (СйгиПи5 миЇдагі5), ряску (Гетпа 5рр.), види вівса (Амепа заїїма), ячмінь (Ногаїшт мцідаге), овочі, декоративні рослини, хвойні, і види газонної трави (наприклад, для декоративних цілей, для зони відпочинку або для кормових цілей), і види трав, що утворюють біомасу (наприклад, просо лозоподібне та міскантус).

Овочі включають без обмеження види пасльонових (наприклад, томати; І усорегвісоп езсшепішт), салат-латук (наприклад, І асіиса займа), види моркви (Сацйсиб5 сагоїа), цвітну капусту (Вгаззіса оІегасеа), селеру (Арішт дгамеоіеп5), баклажан (Зоїапит теїіопдепа), спаржу (Азрагадих опйісіпаїїє), бамію (АбеІто5спи5 езсціепійи5), зелену квасолю (РпазеоїЇи5 миїЇдагів),

Зо лімську квасолю (РПпазеоїиз Ітпепвів), види гороху (І аїйугиз 5рр.), представників роду Сисигойа, таких як гарбуз Хаббарда (С. пиббага), гарбуз мускатний (С. то5спаїйа), гарбуз звичайний (С. реро), гарбуз-горлянка (С. сгооКпескК), С. агдугозрегта, С. агдугозрепта 55р 5огогіа, С. аідкага, С. есцчадогепвів, С. Ттоейіаі55зіта, С. Іюпаепапа і С. тапіпелії, і представників роду Сиситів, таких як огірок (Сиситів заїми5), канталуп (С. СапіаІшрепвів5) і диня мускусна (С. тео).

Декоративні рослини включають азалію (КПододепагоп 5рр.), гортензію (МасгорпуйПа пуагапдеа), гібіскус (Нірізси5 гозазапепвіб), види троянди (Коза 5рр.), види тюльпана (Тиїїра 5рр.), види нарциса (Магсіз5и5 5рр.), види петунії (Реїшпіа Пубгіда), гвоздику (Оіапіпйи5 сагуорпуПи5), пуансетію (Еирпогріа риЇспегіта) і хризантему.

Хвойні, які можна застосовувати в здійсненні даного винаходу, включають, наприклад, види сосни, такі як сосна ладанна (Ріпи5 (аєда), сосна Елліотта (Ріпив еїоїй), сосна жовта (Ріпи5 ропдегоза), сосна скручена широкохвойна (Ріпи5 сопіогіа) і сосна промениста (Ріпизх гаадіайа); псевдотсугу Мензіса (Рзецдоїзида тепллієвії); тсугу канадську (Т5ида сападепбвів); ялину сизу (Рісеа діаиса); секвою вічнозелену (Зедиоїа зетрегмігеп5); види ялиці, такі як ялиця миловидна (Аріеєз5 атайбії5) і ялиця бальзамічна (Абіє5 раізатеа); і види кедра, такі як туя (ТАціа ріїсаїа) і кипарис нутканський (Спатаєесурагів пооїКаїепвів).

Газонна трава включає без обмеження представників роду Зойсія, представників роду

Адговії5, види костриці, види тонконігу, представників роду 5іепоїарпгит, представників роду

Свинорою, види бізонової трави, види пажитниці та види грястиці збірної.

Також включають рослини, які слугують переважно як лабораторні моделі, наприклад,

Агарідорвів. "Рослинна клітина" являє собою структурну та фізіологічну одиницю рослини, що містить протопласт і клітинну стінку. Рослинна клітина може знаходитися у формі виділеної одиночної клітини, або культивованої клітини, або як частина більш високоорганізованої одиниці, такої як, наприклад, рослинна тканина, орган рослини або ціла рослина. "Культура рослинних клітин" означає культуру структурних одиниць рослини, таких як, наприклад, протопласти, клітини в клітинній культурі, клітини в рослинних тканинах, пилок, пилкові трубки, насіннєві зачатки, зародкові мішки, зиготи та зародки на різних стадіях розвитку. "Рослинний матеріал" стосується листя, стебел, коренів, квітів або частин квітів, плодів, пилку, яйцеклітин, зигот, насіння, живців, клітинних або тканинних культур, або будь-яких інших 60 частин або продуктів рослини.

"Орган рослини" являє собою окрему та візуально структуровану та диференційовану частину рослини, таку як корінь, стебло, листок, квіткова брунька або зародок.

Застосовуваний у даному документі вираз "частина рослини" включає без обмеження зародки, пилок, насіннєві зачатки, насіння, листки, квітки, гілки, плоди, стебла, коріння, кінчики коренів, пиляки та/або рослинні клітини, в тому числі ті рослинні клітини, які є інтактними в рослинах та/або частинах рослин, рослинні протопласти, рослинні тканини, культури рослинних тканин, рослинні калюси, скупчення рослинного матеріалу тощо.

Вираз "рослинна тканина", застосовуваний у даному документі, означає групу рослинних клітин, організованих у структурну та функціональну одиницю. Передбачається будь-яка тканина рослини іп ріапіа або в культурі. Цей вираз включає без обмеження цілі рослини, органи рослин, насіння рослин, тканинну культуру та будь-які групи рослинних клітин, організовані у структурні або функціональні одиниці. Застосування цього виразу разом із будь- яким конкретним типом рослинної тканини, наведеним вище або іншим чином охопленим цим визначенням, або без нього не призначене для виключення будь-якого іншого типу рослинної тканини. "Полінуклеотид, який становить інтерес" стосується будь-якого полінуклеотиду, який у разі перенесення в організм, наприклад, рослину, надає організму необхідну характеристику, таку як стійкість до комах, стійкість до хвороб, толерантність до гербіцидів, стійкість до антибіотиків, поліпшена харчова цінність, поліпшені показники у виробничому процесі, продукування комерційно цінних ферментів або метаболітів або змінена репродуктивна здатність тощо.

Під "частиною" або "фрагментом" поліпептиду згідно з даним винаходом слід розуміти амінокислотну послідовність зі зменшеною довжиною порівняно з еталонною амінокислотною послідовністю поліпептиду згідно з даним винаходом. Така частина або фрагмент згідно з даним винаходом можуть бути, у випадку коли це є придатним, включені в більший поліпептид, частиною якого вони є (наприклад, мічений або злитий білок). У варіантах здійснення "частина" або "фрагмент" по суті зберігає інсектицидну активність (наприклад, щонайменше 40 95, 50 95, бо бо, 70 95, 80 95, 8595, 90 95, 95 95 або навіть 100 95 активності повнорозмірного білка, або навіть має більшу інсектицидну активність, ніж повнорозмірний білок).

Вирази "білок", "пептид" і "поліпептид" застосовуються в даному документі взаємозамінним

Зо чином.

Вираз "промотор" стосується полінуклеотиду, як правило, розташованого вище (5) від кодувального полінуклеотиду, який здійснює контроль експресії кодувального полінуклеотиду із забезпеченням впізнавання РНК-полімеразою та іншими елементами транскрипційного апарата.

Застосовуваний у даному документі вираз "протопласт" стосується виділеної рослинної клітини без клітинної стінки або тільки з частинами клітинної стінки.

Вираз "рекомбінантний", застосовуваний у даному документі, стосується форми нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК або РНК) або білка, або організму, яка зазвичай не буде зустрічатися в природі та є такою, що створена шляхом втручання людини. Застосовуваний в даному документі вираз "молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти" (й аналогічні вирази) являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить комбінацію полінуклеотидів, які в природі не зустрічаються разом і є результатом втручання людини, наприклад, молекулу нуклеїнової кислоти, яка складається з комбінації щонайменше двох полінуклеотидів, гетерологічних щодо один одного, або молекулу нуклеїнової кислоти, яка штучно синтезована та містить полінуклеотид, який відрізняється від полінуклеотиду, який зазвичай буде існувати в природі, або молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить трансген, штучно введений у геномну ДНК клітини-хазяїна, та зв'язану фланкувальну ДНК геному клітини-хазяїна. Прикладом молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти є молекула ДНК, одержана в результаті вставки трансгена в геномну ДНК рослини, що зрештою може приводити до експресії молекули рекомбінантної РНК або білка в даному організмі. У варіантах здійснення "рекомбінантний" білок являє собою білок, який зазвичай не існує в природі або є присутнім в оточенні, що не зустрічається у природних умовах і експресується молекулою рекомбінантної нуклеїнової кислоти. Застосовуваний у даному документі вираз "рекомбінантна рослина" являє собою рослину, яка зазвичай не буде існувати в природі, і вона є результатом втручання людини та містить рекомбінантний полінуклеотид (наприклад, трансген або гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, введену в її геном). У результаті такої зміни геному рекомбінантна рослина явно відрізняється від спорідненої рослини дикого типу.

Вирази "знижувати", "знижений", "зниження", "скорочення", "зменшувати" і "пригнічувати" (та їхні граматичні варіанти) та аналогічні вирази, застосовувані в даному документі, стосуються 60 зменшення виживання, росту та/або розмноження шкідника рослин, наприклад, шляхом приведення рослини в контакт із поліпептидом згідно з даним винаходом (як, наприклад, шляхом трансгенної експресії або способами місцевого застосування). Це зменшення виживання, росту та/"або розмноження може застосовуватися щодо рівня, спостережуваного за відсутності поліпептиду згідно 3 даним винаходом (наприклад, у рослині, яка не експресує трансгенним чином поліпептид або не піддана місцевій обробці поліпептидом). Таким чином, у варіантах здійснення вирази "знижувати", "знижений", "зниження", "скорочення", "зменшувати" і "пригнічувати" (та їхні граматичні варіанти) та аналогічні вирази означають зменшення на щонайменше приблизно 5 то, 10 то, 15 то, 20 то, 25 то, Зо то, 35 то, 40 то, 45 то, 50 Чо, 2О о, 60 то, 65 ов, 70 9, 75 90, 80 95, 85 9, 90 95, 95 95 або більше порівняно з рослиною, яка не вступає в контакт із поліпептидом згідно з даним винаходом (наприклад, рослиною, яка не експресує трансгенним чином поліпептид або не піддана місцевій обробці поліпептидом). В ілюстративних варіантах здійснення зниження зумовлює відсутність виявлюваного виживання, росту та/або розмноження шкідника рослин або по суті їхню відсутність (тобто незначну кількість, наприклад, менше ніж приблизно 10 95, менше ніж приблизно 5 95 або навіть менше ніж приблизно 1 9б). "Регуляторний елемент" стосується нуклеотидної послідовності, залученої до контролю експресії полінуклеотиду. Приклади регуляторних елементів включають промотори, сигнали термінації та нуклеотидні послідовності, які забезпечують належну трансляцію полінуклеотиду.

Застосовуваний у даному документі вираз "селектовний маркер" означає нуклеотидну послідовність, яка в разі експресії надає відмінний фенотип рослині, частині рослини та/або рослинній клітині, що експресують маркер, і, таким чином, забезпечує можливість відрізняти такі трансформовані рослини, частини рослин і/або рослинні клітини від тих, які не мають маркера.

Така нуклеотидна послідовність може кодувати або селектовний маркер, або маркер, що піддається скринінгу, залежно від того, чи надає маркер ознаку, за якою можна провести відбір за допомогою хімічних засобів, таких як селективний засіб (наприклад, антибіотик, гербіцид тощо), або від того, чи є маркер просто ознакою, яку можна ідентифікувати шляхом спостереження або тестування, такого як скринінг (наприклад, ознакою, що визначається в К- локусі).

Застосовуваний в даному документі вираз "специфічна активність" стосується кількості білка, необхідної для одержання інсектицидного ефекту. Отже, якщо перший білок має вищу

Зо специфічну активність, ніж другий білок, це означає, що для одержання інсектицидного ефекту щодо такої ж відсоткової частки комах необхідна менша кількість першого білка порівняно з кількістю другого білка.

Фраза "по суті ідентичний" у контексті двох нуклеїнових кислот або двох амінокислотних послідовностей стосується двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які характеризуються щонайменше приблизно 50 95 ідентичністю нуклеотидів або амінокислотних залишків у разі порівняння й вирівнювання для максимальної відповідності, що визначають за допомогою одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом візуального огляду. У певних варіантах здійснення по суті ідентичні послідовності характеризуються щонайменше приблизно 60 95, 6595, 70 95, 7590, 80 95, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 9, 86 9, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або більшою ідентичністю нуклеотидів або амінокислотних залишків. У певних варіантах здійснення значна ідентичність існує в межах ділянки послідовностей, довжина якої становить щонайменше приблизно 50 залишків, 100 залишків, 150 залишків, 200 залишків, 250 залишків, 300 залишків, 350 залишків, 400 залишків або більше. У додаткових варіантах здійснення послідовності є по суті ідентичними, якщо вони ідентичні вздовж усієї довжини кодувальних ділянок. "Ідентичність" або "відсоток ідентичності" стосується ступеня ідентичності між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислотними послідовностями. Під час порівняння послідовностей одна послідовність зазвичай виступає як еталонна послідовність, з якою порівнюють тестовані послідовності. У разі застосування алгоритму порівняння послідовностей тестовану та еталонну послідовності вводять у комп'ютер, за необхідності задають координати підпослідовності, та задають програмні параметри алгоритму порівняння послідовностей. Потім алгоритм порівняння послідовностей на підставі заданих програмних параметрів розраховує відсоток ідентичності послідовностей для тестованої (тестованих) послідовності (послідовностей) щодо еталонної послідовності.

Під час порівняння послідовностей одна послідовність зазвичай виступає як еталонна послідовність, з якою порівнюють тестовані послідовності. У разі застосування алгоритму порівняння послідовностей тестовану та еталонну послідовності вводять у комп'ютер, за необхідності задають координати підпослідовності, та задають програмні параметри алгоритму порівняння послідовностей. Потім алгоритм порівняння послідовностей на підставі заданих бо програмних параметрів розраховує відсоток ідентичності послідовностей для тестованої

(тестованих) послідовності (послідовностей) щодо еталонної послідовності.

Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння можна проводити, наприклад, за допомогою алгоритму пошуку локальної гомології згідно із 5тіїп 5 Умаїепгтап, Аду. Аррі. маїйй. 2: 482 (1981), за допомогою алгоритму гомологічного вирівнювання згідно з Меедіетап 5 Ууип5сп,

У. Мої. Віої. 48: 443 (1970), за допомогою способу пошуку схожості згідно з Реагзоп 8. І іртап,

Ргос. маг. Асад. сі. ОБА 85: 2444 (1988), за допомогою програмної реалізації цих алгоритмів (САР, ВЕ5ТРІТ, РГАЗТА і ТЕРАЗТА із пакета програмного забезпечення М/ізсопвзіп Сепеїїісв5,

Сепеїійс5 Сотриїег Сгопр, 575 Зсіепсе Ог., Медісон, Вісконсин, США) або за допомогою візуального огляду (див. загалом А!йзирбеї еї аїЇ. нижче).

Одним прикладом алгоритму, придатного для визначення відсотка ідентичності послідовностей і схожості послідовностей, є алгоритм ВІ А5Т, описаний в Аїйї5БспиЇ еї аї.,.. Мо).

ВіоІ. 215: 403-410 (1990). Програмне забезпечення для здійснення аналізів ВІ А5Т знаходиться у відкритому доступі завдяки Національному центру біотехнологічної інформації (пер:/Лумли.побі.піт.пій.дом/). Цей алгоритм передбачає спочатку ідентифікацію пар послідовностей із найбільшою схожістю (НОР) шляхом ідентифікації коротких "слів" довжиною

МУ у запитуваній послідовності, які або збігаються, або відповідають деякому позитивному граничному показнику Т під час вирівнювання зі "словом" такої самої довжини в послідовності з бази даних. Т називається граничним показником сусіднього "слова" (Ай5епиї еї аї., 1990). Ці первинні збіги сусідніх "слів" виступають як затравка для запуску пошуків для виявлення НОР більшої довжини, які їх містять. Збіги "слів" потім продовжуються в обох напрямках уздовж кожної послідовності настільки, наскільки може бути збільшений сукупний показник вирівнювання. У випадку нуклеотидних послідовностей сукупні показники розраховують із застосуванням параметрів М (бал-винагорода, що нараховується за пару залишків, які збігаються; завжди »0) і М (штрафний бал, що нараховується за залишки, які не збігаються; завжди «0). У випадку амінокислотних послідовностей для розрахунку сукупного показника застосовують матрицю замін. Продовження збігів "слів" у кожному напрямку припиняється, у разі якщо сукупний показник вирівнювання знижується на величину Х від його максимального досягнутого значення, при цьому сукупний показник падає до нуля або нижче внаслідок накопичення одного або декількох вирівнювань залишків із від'ємними показниками або у разі

Зо досягнення кінця однієї з послідовностей. Параметри алгоритму ВГА5Т МУ, Т і Х визначають чутливість і швидкість вирівнювання. У програмі ВІ А5ТМ (для нуклеотидних послідовностей) за замовчуванням застосовуються довжина "слова" (М/), що становить 11, очікуване значення (Е), що становить 10, граничне значення, що становить 100, М-5, М- -4, а також порівняння обох ниток. У випадку амінокислотних послідовностей у програмі ВГА5ТР за замовчуванням застосовуються довжина "слова" (М), що становить 3, очікуване значення (Е), що становить 10, а також матриця замін ВГОЗИМБ2 (див. Непікой 5. Непікоїї, Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 89: 10915 (1989)).

Додатково до розрахунку відсотка ідентичності послідовностей алгоритм ВІ АТ також виконує статистичний аналіз схожості між двома послідовностями (див., наприклад, Кагіїп 85

АйБспи!, Ргос. Маг. Асад. сі. ОБА 90: 5873-5787 (1993)). Однією мірою схожості, наданою алгоритмом ВІАБТ, є найменша сумарна ймовірність (Р(М)), яка передбачає показник імовірності, згідно з яким збіги між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями будуть спостерігатися випадковим чином. Наприклад, тестована послідовність нуклеїнової кислоти вважається подібною до еталонної послідовності, якщо найменша сумарна ймовірність у разі порівняння тестованої послідовності нуклеїнової кислоти з еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти становить менш ніж приблизно 0,1, більш переважно менш ніж приблизно 0,01 і найбільш переважно менш ніж приблизно 0,001.

Іншою широко застосовуваною й розповсюдженою комп'ютерною програмою для здійснення вирівнювань послідовностей є СГОБТАЇМУ м1.6 (Тпотрзоп, єї аї. Мис. Асіа5 Нев., 22: 4673-4680, 1994). Кількість основ або амінокислот, які збігаються, ділять на загальну кількість основ або амінокислот і перемножують на 100 з одержанням відсотка ідентичності. Наприклад, якби дві послідовності з 580 пар основ збігалися на 145 основ, тоді вони були б ідентичними на 25 відсотків. Якщо дві порівнювані послідовності мають різну довжину, тоді число збігів ділять на коротшу з двох довжин. Наприклад, якщо в білках із 200 і 400 амінокислот було 100 амінокислот, що збігаються, тоді вони ідентичні на 50 відсотків щодо коротшої послідовності.

Якщо довжина коротшої послідовності становить менше ніж 150 основ або 50 амінокислот, тоді число збігів ділять на 150 (у разі нуклеїнових основ) або 50 (у разі амінокислот) і перемножують на 100 з одержанням відсотка ідентичності.

Дві нуклеотидні послідовності також можуть вважатися по суті ідентичними, якщо дві бо послідовності гібридизуються одна з одною за жорстких умов. В ілюстративних варіантах здійснення дві нуклеотидні послідовності, які вважаються по суті ідентичними, гібридизуються одна з одною за дуже жорстких умов.

Вирази "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" включають посилання на умови, за яких нуклеїнова кислота буде селективно гібридизуватися з цільовою послідовністю на помітно вищому рівні, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в 2 рази вище порівняно з нецільовою послідовністю), і необов'язково можуть по суті виключати зв'язування з нецільовими послідовностями. Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть варіювати за різних обставин. За допомогою контролю жорсткості умов гібридизації та/або відмивання можна ідентифікувати цільові послідовності, які можуть бути до 100 95 комплементарними еталонній нуклеотидній послідовності. Альтернативно можна застосовувати умови помірної або навіть низької жорсткості для забезпечення деяких розбіжностей послідовностей для того, щоб визначати менші рівні схожості послідовностей. Наприклад, фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що для виконання функції праймера або зонда послідовність нуклеїнової кислоти повинна бути лише достатньо комплементарною цільовій послідовності, щоб, по суті, зв'язуватись з нею з утворенням таким чином стабільної двониткової структури в застосовуваних умовах. Таким чином, праймери або зонди можна застосовувати за умов високої, помірної або навіть низької жорсткості. Аналогічно умови низької або помірної жорсткості можуть бути переважними для виявлення гомологічних, ортологічних та/або паралогічних послідовностей, які характеризуються нижчими ступенями ідентичності послідовностей, ніж ті, що були б ідентифіковані за дуже жорстких умов.

Застосовувані в даному документі вирази "комплементарний" або "комплементарність" (їі подібні вирази) стосуються природного зв'язування полінуклеотидів за допустимих умов вмісту солей і температури шляхом спарювання основ. Наприклад, послідовність "А-(-Т" зв'язується з комплементарною послідовністю "Т-С-А". Комплементарність між двома одноланцюговими молекулами може бути частковою, за якої зв'язуються тільки деякі з нуклеотидів, або вона може бути повною, коли існує абсолютна комплементарність між одноланцюговими молекулами.

Ступінь комплементарності між нитками нуклеїнової кислоти значно впливає на ефективність і силу гібридизації між молекулами. Застосовуваний у даному документі вираз "по суті комплементарний" (і подібні вирази) означає, що дві послідовності нуклеїнової кислоти комплементарні на щонайменше приблизно 50 95, 60 Зо, 70 95, 75 90, 80 95, 85 95, 90 У, 95 9, 96 Фо, 97 Фо, 98 95, 99 95 або більше. Альтернативно вираз "по суті комплементарний" (і подібні вирази) може означати, що дві послідовності нуклеїнової кислоти можуть гібридизуватися разом в умовах високої жорсткості (як описано в даному документі).

Застосовуваний у даному документі вираз "специфічно" або "селективно" гібридизується (і подібні вирази) стосується зв'язування, утворення дуплекса або гібридизації молекули з конкретною цільовою послідовністю нуклегсової кислоти в жорстких умовах, коли ця послідовність наявна в складній суміші (наприклад, загальній клітинній ДНК або РНК) по суті з виключенням нецільових нуклеїнових кислот або навіть без виявлюваного зв'язування, утворення дуплекса або гібридизації з нецільовими послідовностями. Послідовності, що специфічно або селективно гібридизуються, зазвичай є на щонайменше приблизно 40 95 комплементарними й необов'язково по суті комплементарними або навіть повністю комплементарними (тобто ідентичними на 100 об).

Для гібридів ДНК-ДНК Тт можна приблизно обчислити з рівняння згідно з МеїпКоїй апа Умані,

Апаї. Віоспет., 138:267-84 (1984): Тт-81,5 "С--16,6 (09 М) ж 0,41 (96 С) - 0,61 (96 формаміду)- 500//; де М являє собою молярність моновалентних катіонів, 96 (С являє собою відсотковий вміст гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, 95 формаміду являє собою відсотковий вміст формаміду в розчині для гібридизації, і Ї являє собою довжину гібрида у парах основ. Тт являє собою температуру (за заданих значень іонної сили та рН), за якої 50 95 комплементарної цільової послідовності гібридизується із зондом, що абсолютно збігається. Ти зменшується на приблизно 1 С за кожний 1 95 розбіжності; таким чином, Тт, умови гібридизації та/або відмивання можна скоригувати для гібридизації з послідовностями з необхідним ступенем ідентичності. Наприклад, якщо шукають послідовності з ідентичністю 29095, Тт можна зменшити на 10 "С. Загалом жорсткі умови вибирають такими, щоб вони були на приблизно 5"С нижче, ніж температура плавлення (Тт) конкретної послідовності та її комплементарної послідовності за заданих значень іонної сили та рН. Однак за дуже жорстких умов гібридизація та/або відмивання можуть здійснюватися за температури плавлення (Тт) або за температури, яка на 1, 2, З або 4"С нижче температури плавлення (Тт); за умов помірної жорсткості гібридизація та/або відмивання можуть здійснюватися за температури, яка на 6, 7, 8, 9 або 10С нижче температури плавлення (Тт); за умов низької жорсткості гібридизація та/або 60 відмивання можуть здійснюватися за температури, яка на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 "С нижче температури плавлення (Тт). Якщо необхідний ступінь розбіжності обумовлює Тт нижче 457 (водний розчин) або 32 "С (розчин формаміду), тоді необов'язково концентрацію 550 можна підвищити для того, щоб можна було застосовувати вищу температуру. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в Тії55єеп, І арогаїогу Тесппіднев іп Віоспетівігу апа Моїесшіаг Віоіоду-Нубгіаігайноп м/йй Мисієїс Асій Ргобев, частина І, розділ 2, "Омегмієм/ ої рііпсірієв ої пубгідігайноп апа Ше з5ігаієду ої писієїс асіа ргобре аззаув" ЕІбвемівї, Мем Моїк (1993);

Ситепі Ргоїосоїв іп МоїІєсціаг Віоіоаду, розділ 2, А!зибеї, еї а!., єд5, Стеепе Рибіїзпіпу апа УмМіеу-

Іптеїзсіепсе, Мем/ Моїк (1995); і Сгеєп 5 Затьгоок в МоїІесшаг Сіопіпод, А І арогаїгу Мапиаї, 4

Еайноп, Соїа 5ргіпд Нагрог Ргезв, Соїа 5рііпа Натотг, М.У. (2012).

Зазвичай жорсткі умови є такими, за яких концентрація солі становить менше приблизно 1,5

М концентрації іонів Ма, зазвичай приблизно 0,01-1,0 М концентрації іонів Ма (або інших солей) за значень рН 7,0-8,3, і температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 "С для зондів із більшою довжиною (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов можна також досягти за допомогою додавання дестабілізувальних засобів, таких як формамід або розчин Денхардта (5 г фіколу, 5 г полівінілпіролідону, 5 г альбуміну бичачої сироватки в 500 мл води). Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію із застосуванням буферного розчину 30 95 - 35 95 формаміду, 1 М Масі, 1 95 505 (додецилсульфату натрію) за 37 "С і відмивання в 1Х-2Х

ЗО (2ОХ 550-3,0 М Масі/0,3 М тринатрійцитрату) за 50 "0-55 "С. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію в 40-4595 формаміді, 1 М Масі, 195 505 за 37 "С і відмивання в 0,5Х-1Х 550 за 55 70-60 "С. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50 95 формаміді, 1 М Масі, 1 905 505 за 37 "С і відмивання в 0,1Х 550 за 60 "С- 65 "С. Додатковий необмежувальний приклад умов високої жорсткості включає гібридизацію в 4Х 5560, 5Х розчині Денхардта, 0,1 мг/мл кип'яченої ДНК із молок лососевих та 25 мМ фосфату

Ма за 65 С і відмивання в 0,1Х 5550, 0,1 95 505 за 65 "С. Інший приклад умов гібридизації високої жорсткості включає гібридизацію в 795 505, 0,5 М МаРОз, 1 мМ ЕОТА за 502 з відмиванням в 2Х 5550, 0,1 96 505 за 50 "С, альтернативно з відмиванням в 1Х 555, 0,1 96 505 за 50 "С, альтернативно з відмиванням в 0,5Х 5550, 0,1 96 505 за 50 "С, або альтернативно з відмиванням в 0,1Х 550, 0,1 95 505 за 50 "С, або навіть з відмиванням в 0,1Х 55502, 0,1 96 505

Зо за 65 "С. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що специфічність зазвичай залежить від відмивань після гібридизації, при цьому важливими факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання.

Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною за жорстких умов, все ще є по суті ідентичними, якщо білки, які вони кодують, є по суті ідентичними (наприклад, внаслідок виродженості генетичного коду).

Додатковим показником того, що дві нуклеїнові кислоти або білки є по суті ідентичними, є те, що білок, який кодує перша нуклеїнова кислота, характеризується імунологічною перехресною реактивністю з білком, який кодує друга нуклеїнова кислота. Отже, білок зазвичай значною мірою ідентичний другому білку, наприклад, якщо два білки відрізняються лише консервативними замінами.

Як застосовується в даному документі, якщо модифікований поліпептид або фрагмент (тощо) "по суті, зберігає" інсектицидну активність, це означає, що модифікований поліпептид або фрагмент зберігає щонайменше приблизно 40 95, 50 95, 60 о, 70 95, 80 95, 85 о, 90 Уо, 95 90 або навіть 100 95 інсектицидної активності еталонного білка або характеризується ще більшою інсектицидною активністю. "Синтетичний" стосується нуклеотидної послідовності, що містить основи або структурну (структурні) ознаку (ознаки), відсутні в природній послідовності. Наприклад, синтетичною вважається штучна послідовність, що кодує білок згідно з даним винаходом, яка за вмістом СС і нормальним розподілом кодонів більше схожа на гени дводольних або однодольних рослин.

Як застосовується в даному документі, білок, який є "токсичним" для комахи-шкідника, являє собою перорально активний засіб для контролю комах, який забезпечує знищення комахи- шкідника, викликає зменшення росту та/"або розмноження комахи-шкідника та/або здатний порушувати або обмежувати живлення комахи, останні два з яких можуть викликати загибель комахи або не викликати її. Коли білок згідно з даним винаходом доставляється в організм комахи або комаха вступає в контакт із білком, результатом, як правило, є загибель комахи, сповільнення росту та/або розмноження комахи та/або зменшення або припинення поїдання комахою джерела, яке забезпечує комаху токсичним білком.

Вирази "токсиновий фрагмент" і "тгоксинова частина" застосовуються в даному документі взаємозамінним чином для позначення фрагмента або частини химерного інсектицидного білка 60 з більшою довжиною (наприклад, повнорозмірного) згідно з даним винаходом, де "токсиновий фрагмент" або "токсинова частина" зберігають інсектицидну активність. Наприклад, із рівня техніки відомо, що нативні білки Сту експресуються у вигляді протоксинів, які піддаються процесингу з М-кінця й С-кінця з одержанням зрілого токсину. У варіантах здійснення "гоксиновий фрагмент" або "токсинова частина" химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом є усіченими з М-кінця та/або С-кінця. У варіантах здійснення "токсиновий фрагмент" або "токсинова частина" є усіченими з М-кінця з видаленням частини або всього М-кінцевого пептидильного фрагмента й необов'язково містять щонайменше приблизно 400, 425, 450, 475, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580 або 590 суміжних амінокислот химерного інсектицидного білка, конкретно описаного в даному документі, або амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична йому. Таким чином, у варіантах здійснення "токсиновий фрагмент" або "токсинова частина" химерного інсектицидного білка є усіченими з М-кінця (наприклад, з виключенням частини або всього пептидильного фрагмента), наприклад, М- кінцеве усікання однієї амінокислоти або більше однієї амінокислоти, наприклад, до 2, 3,4,5,6, 7,8,9, 10,11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 або більше амінокислот. У варіантах здійснення "тгоксиновий фрагмент" або "токсинова частина" химерного інсектицидного білка є усіченими з С-кінця (наприклад, з виключенням частини або всього хвоста протоксину), наприклад, С-кінцеве усікання однієї амінокислоти або більше однієї амінокислоти, наприклад, до 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 560 або більше амінокислот. У варіантах здійснення "токсиновий фрагмент" або "токсинова частина" включають домени 1 і 2 іш серцевинний домен ПІ (наприклад, як показано на фігурі 2). У варіантах здійснення "токсиновий фрагмент" або "токсинова частина" являють собою зрілий (тобто підданий процесингу) токсин (наприклад, токсин Сгу). "Трансформація" являє собою спосіб уведення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину - або організм-хазяїн. У конкретних варіантах здійснення "трансформація" означає стабільну інтеграцію молекули ДНК у геном організму, що становить інтерес (наприклад, рослинну

Зо клітину).

Застосовувані в даному документі вирази ""рансформований" і ""рансгенний" стосуються організму-хазяїна, такого як бактерія або рослина, в який було введено гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти. Молекулу нуклеїнової кислоти можна стабільно інтегрувати в геном хазяїна, або ж молекула нуклеїнової кислоти також може бути наявною як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути такою, що аутореплікується. Мається на увазі, що "трансформовані" або "трансгенні" клітини, тканини або рослини охоплюють не тільки кінцевий продукт способу трансформації, але також і їхнє потомство, що містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти. "Нетрансформований" або "нетрансгенний" хазяїн стосується організму дикого типу, наприклад, бактерії або рослини, які не містять гетерологічної молекули нуклеїнової кислоти.

Вираз "вектор" стосується композиції для перенесення, доставляння або введення нуклеїнової кислоти (або нуклеїнових кислот) у клітину. Вектор містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну (нуклеотидні) послідовність (послідовності), що підлягає (підлягають) перенесенню, доставлянню або введенню.

Химерні інсектицидні білки

У даному винаході передбачені нові химерні інсектицидні білки, які містять щонайменше одну ділянку з першого білка Сту (наприклад, білка ВТ-0029 |ЗЕО ІЮ МО: 21 і його по суті ідентичних варіантів). У варіантах здійснення даного винаходу передбачений химерний інсектицидний білок, який містить ділянку з двох або більше різних білків Сгу. У варіантах здійснення одержаний химерний інсектицидний білок характеризується підвищеною активністю щодо однієї або декількох комах-шкідників (наприклад, посиленою активністю або активністю щодо нового цільового шкідника) та/або іншим механізмом дії щодо однієї або декількох комах- шкідників порівняно з одним або декількома (або навіть усіма) вихідними білками. В ілюстративних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок являє собою химеру, що містить ділянки з двох різних білків Стгу (наприклад, Сгу!), і химера характеризується підвищеною інсектицидною активністю щодо однієї або декількох комах-шкідників порівняно з обома вихідними білками.

У варіантах здійснення химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом можуть передбачати нові механізми дії щодо однієї або декількох цільових комах-шкідників. Наприклад, бо химерний інсектицидний білок може мати інсектицидну активність щодо комахи-шкідника або колонії, які зазвичай є стійкими до інсектицидної активності іншого засобу (наприклад, інсектицидного білка, у тому числі без обмеження білка Ві, такого як білок Стгу або білок Мір). У варіантах здійснення вихідні білки самі по собі не є інсектицидно активними або тільки слабкоактивні щодо стійкої комахи-шкідника або колонії, що може вказувати на те, що химера характеризується новим механізмом дії порівняно з вихідними білками. Наприклад, якщо вихідні білки є активними щодо цільової комахи-шкідника ("сприйнятливої"), але не щодо стійкого аналога, а химерний інсектицидний білок є активним щодо стійкої комахи-шкідника, це вказує на те, що химерний інсектицидний білок є токсичним щодо стійкого шкідника завдяки новому механізму дії.

Відповідно у варіантах здійснення даного винаходу передбачений химерний інсектицидний білок, який є токсичним для комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих), при цьому химерний інсектицидний білок містить ділянку з білка ВТ-0029 (ЗЕО 10

МО: 2) або поліпептид, який по суті ідентичний ділянці з білка ВТ-0029. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок містить М-кінцеву ділянку першого білка Стгу!, який необов'язково являє собою білок ВТ-0029 (5ЕБО ІО МО: 2), або поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична М-кінцевій ділянці білка ВТ-0029. У варіантах здійснення М- кінцева ділянка першого білка Сгу злита з С-кінцевою ділянкою з іншого білка Сгу (наприклад, іншого білка Сту!) з утворенням химерного інсектицидного білка (наприклад, химерного інсектицидного білка Стгу).

В ілюстративних варіантах здійснення С-кінцева ділянка з іншого білка Сгу може являти собою С-кінцеву ділянку з іншого білка Сту! або поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична С-кінцевій ділянці з іншого білка Сгу!1.

Таким чином, в ілюстративному варіанті здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить у напрямку від М-кінця до С-кінця: (а) М-кінцеву ділянку першого білка

Сту (наприклад, білка Сту!), яка необов'язково являє собою М-кінцеву ділянку білка ВТ-0029 або амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична М-кінцевій ділянці білка ВТ-0029, злиту з (Б)

С-кінцевою ділянкою іншого білка Сту (наприклад, іншого білка Стгу!), по суті складається з них або складається з них.

В ілюстративних варіантах здійснення інший білок Сгу (наприклад, білок Сту!) вибраний на підставі вирівнювання С-кінцевої ділянки з іншого білка Сгу і відповідної ділянки з першого білка

Сгу (наприклад, білка Сгу!), наприклад, див. ілюстративні вирівнювання на фігурах ТА і 18. У варіантах здійснення інший білок Стгу вибраний таким чином, що амінокислотна послідовність С- кінцевої ділянки іншого білка Сгу є по суті ідентичною відповідній ділянці першого білка Сгу. В ілюстративних варіантах здійснення амінокислотна послідовність С-кінцевої ділянки іншого білка Сту (наприклад, білка Сту!) на щонайменше приблизно 85 95, 86 95, 87 Ус, 88 о, 89 95, 9096, 9195, 9295, 9395, 94965, 9595, 960, 9795, 9895, 9995 або більше ідентична амінокислотній послідовності відповідної С-кінцевої ділянки з першого білка Сту. Способи вирівнювання та визначення ідентичності амінокислотних послідовностей у вирівняній ділянці добре відомі фахівцям у даній галузі техніки.

У варіантах здійснення інший білок Сгу! включає без обмеження білок Стуї1Е (наприклад, білок СтуїРа або білок Стуї1ЕРБ), білок Сту1їс (наприклад, білок СтуїСа, Сту1їср або Сгу1сс), білок СтутІ (наприклад, білок СтгуїПІа, білок СтутІб, білок Стус, білок Студ, білок СтутІе, білок

СтулІї або білок Сту1Ід), СтуїК (наприклад, білок СтуїКа) або Сту1сС (наприклад, білок Сгу1Са).

У варіантах здійснення інший білок Сту! являє собою білок Стутії, необов'язково білок ВТ-0022 (ЗЕО ІЮ МО: 1). У варіантах здійснення інший білок Сту! являє собою білок Сгтгу!Ра (5ЕО ІЮ МО: 8). У варіантах здійснення інший білок Сгу! являє собою білок Сгуїк (5ЕО ІЮО МО: 12). У варіантах здійснення інший білок Сгу! являє собою білок Сту1Са (5ЕО ІЮ МО: 17).

Вирази "М-кінцева ділянка" і "С-кінцева ділянка" не обов'язково вказують на те, що відповідно більшість М-кінцевих або С-кінцевих амінокислот (наприклад, М-кінець або С-кінець) повнорозмірного білка включені в ділянку. Наприклад, фахівцям у даній галузі техніки добре відомо, що протоксини Сту піддаються процесингу як з М-кінця, так і з С-кінця з одержанням зрілого (тобто підданого процесингу) токсину. Таким чином, у варіантах здійснення "М-кінцева ділянка" та/або "С-кінцева ділянка" виключає деякі або всі з підданих процесингу частин протоксину таким чином, що химерний інсектицидний білок містить зрілий білок токсину (наприклад, домени І, ПП ії ШІ білка Стгу) без частини або всього М-кінцевого пептидильного фрагмента та/або С-кінцевого хвоста протоксину, або поліпептид, який по суті ідентичний зрілому білку токсину. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок містить пептидильний фрагмент і/або хвіст протоксину. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок не містить пептидильного фрагмента або хвоста протоксину, тобто відповідає зрілому 60 підданому процесингу токсину.

У варіантах здійснення М-кінцева ділянка першого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, З8, 39 або 40 до приблизно положення 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, ААЗ, ААА, АА5, 446, 447, 448, 449, АБО, АБ1, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, А80, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500

ЗЕО ІЮ МО: 2 (повнорозмірного ВТ-0029) і будь-якій комбінації нижчих і вищих положень, якби кожна така комбінація була конкретно викладена в даному документі, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення М-кінцева ділянка першого білка Стгу! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 1 до приблизно положення 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, ААВ, 449, 450, 451, 452, А53, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, А71, А72, А73, 474, А75, А76, А77, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490 або 491 5ЕО ІО МО: 2, по суті складається з нього або складається з нього.

В ілюстративному варіанті здійснення М-кінцева ділянка першого білка Сгу! містить амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 1 до приблизно амінокислотного положення 458 ЗЕО ІЮ МО: 2, по суті складається з неї або складається з неї.

В ілюстративних варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сгу1! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 435, 436, 437, АЗ8, 439, 440, 441, 442, 443, ААА, А45, ААб, АА7, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, А58, 449, АБО, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, А70, 471, 472, А73, А74, А75, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500 до приблизно положення 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 587, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619 або 620 5ЕО ІЮО МО: 8 (повно розмірного Сту!Ра) і будь-якій комбінації нижчих і вищих

Зо положень, якби кожна така комбінація була конкретно викладена в даному документі, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 464 до приблизно положення 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 587, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619 або 620 5ЕО ІО МО: 8, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, ААЗ, ААА, 445, А4Аб, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 449, АБО, 451, 452, А53, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, А72, А73, А7ТА, 475, А76, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500 до приблизно положення 602 5ЕО ІО МО: 8, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 464 до приблизно положення 602 5ЕО ІО МО: 8, по суті складається з нього або складається з нього.

В ілюстративних варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сгу1! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 470, 471, 472, А73, АТА, А75, 476, 477, А78, 479, А80, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, або 535 до приблизно положення 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654 або 655 5ЕО ІЮО МО: 1 (повно розмірного ВТ- 0022) і будь-якій комбінації нижчих і вищих положень, якби кожна така комбінація була конкретно викладена в даному документі, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 498 до приблизно положення 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, бо 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654 або 655 5ЕО ІЮО МО: 1, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, А78, А79, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, або 535 до приблизно положення 636 5ЕО ІО МО: 1, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 498 до приблизно положення 636 5ЕО ІО МО: 1, по суті складається з нього або складається з нього.

В ілюстративних варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сгу1! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 472, 473, 474, А75, А76, А77, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536 або 537 до приблизно положення 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656 або 657 5ЕО І

МО: 12 (повнорозмірного СгуїКа) і будь-якій комбінації нижчих і вищих положень, якби кожна така комбінація була конкретно викладена в даному документі, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 500 до приблизно положення 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656 або 657 5ЕО ІЮ МО: 12, по суті складається з нього або

Зо складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, А79, АВ8О, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537 до приблизно положення 597 5ЕО ІЮО МО: 12, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, А79, АВ8О, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537 до приблизно положення 610 5ЕО ІЮО МО: 12, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 500 до приблизно положення 597 ЗЕО ІЮО МО: 12, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 500 до приблизно положення

БО 610 5ЕО ІО МО: 12, по суті складається з нього або складається з нього.

В ілюстративних варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сгу! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 435, 436, 437, А38, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466 або 467 до приблизно положення 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616 або 617 5ЕО ІЮ МО: 17 (повнорозмірного Стуї!Са) і будь-якій комбінації нижчих і вищих положень, якби кожна така комбінація була конкретно викладена в даному документі, по суті складається з нього або складається з нього. 60 У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 467 до приблизно положення 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616 або 617 5ЕО ІЮ

МО: 17, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, А53, 454, 455, 456, 457, 458, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466 або 467 до приблизно положення 617 ЗЕО ІЮО МО: 17, по суті складається з нього або складається з нього.

У варіантах здійснення С-кінцева ділянка другого білка Сту! містить поліпептид, який відповідає амінокислотній послідовності від приблизно положення 467 до приблизно положення 617 5ЕО ІО МО: 17, по суті складається з нього або складається з нього.

Як добре відомо з рівня техніки, білки Сгу з Ві мають 5 доменів з консервативною послідовністю (консервативні блоки СВІ 1-51), розділених більш варіабельними ділянками (Нопйе а М/пйеїу, 1989, МісторіоІ. Нем. 53:242-255), і три домени з консервативною структурою (домени І, ІІ ї ПІ) (дае Маада єї а!ї., 2001, Ттепав Сепеїїсв 17:193-199). На фігурах 1А і 18 показане вирівнювання білків Сту ВТ-0029, ВТ-0022, СтуїРа і СгуїКа із вказаними СВЗ і доменом І.

Фахівці в даній галузі техніки можуть застосовувати широковідому інформацію про послідовність і структуру, доступну для білків Сгу, для створення химерного інсектицидного білка Сгу згідно з даним винаходом, наприклад, для вибору придатної (придатних) ділянки (ділянок) переходу між двома білками Сгу. У варіантах здійснення ділянка переходу розташована в консервативному блоці, наприклад, в СВ3. Вираз "у консервативному блоці" включає положення на кожному кінці консервативного блоку. Щоб проілюструвати це, вираз "в

СВЗ3" включає положення безпосередньо перед (наприклад, між метіоніновим та фенілаланіновим залишками в межах послідовності МРМЕЗУМ у послідовності ВТ-0029 на фігурі 2А) і безпосередньо після (наприклад, між треоніновим й аспарагіновим залишками в межах послідовності ККТММО у послідовності ВТ-0029 на фігурі 2А) консервативного блоку 3. На фігурах 2А і 2В показані ілюстративні химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом з ділянкою переходу в СВ3.

Зо З посиланням на фігуру 2А у варіантах здійснення перехід міститься в положенні, яке відповідає положенню безпосередньо перед амінокислотним залишком 1 або безпосередньо після амінокислотного залишку 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 або 51, або будь-якій їхній комбінації в СВ3. У варіантах здійснення перехід розташовується в межах ділянки (включаючи залишки на кожному кінці ділянки), яка відповідає ділянці від амінокислотного залишку 2 до амінокислотного залишку 7, 8, 9 або 10 СВ3З, в межах ділянки, яка відповідає ділянці від амінокислотного залишку 11 до амінокислотного залишку 14, 15, 16, 17 або 18 СВ3З, в межах ділянки, яка відповідає ділянці від амінокислотного залишку 19 до амінокислотного залишку 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 або 36 СВ3З, та/"або в межах ділянки, яка відповідає ділянці від амінокислотного залишку 37, 38 або 39 до амінокислотного залишку 51, і будь-якій комбінації таких ділянок. В ілюстративних варіантах здійснення перехід міститься в положенні в межах ділянки, яка відповідає ділянці від амінокислотного залишку 19 до амінокислотного залишку 51, від амінокислотного залишку 19 до амінокислотного залишку 33, від амінокислотного залишку 19 до амінокислотного залишку 28, від амінокислотного залишку 19 до амінокислотного залишку 27 або від амінокислотного залишку 19 до амінокислотного залишку 26 в СВЗ3. У варіантах здійснення положення переходу розташовується у конкретному сайті між амінокислотним залишком 18 і амінокислотним залишком 19 в СВЗ (наприклад, конкретно між валіном та ізолейцином у послідовності

ОРОМІТО в ВТ-0029, 5БЕО ІЮ МО: 2).

Химерні інсектицидні білки також можна визначити щодо структурних доменів, одержаних із кожної з вихідних молекул. Наприклад, у варіантах здійснення М-кінцева ділянка першого білка

Сгу містить домен І першого білка Сгу і весь або по суті весь домен ІІ. У варіантах здійснення С- кінцева ділянка іншого білка Стгу містить весь або по суті весь домен І іншого білка Сгу.

Фахівцям у даній галузі техніки зрозуміло, що існує деяке варіювання у визначенні точного місця розташування кінців структурних доменів білка Сгту і лінкерних ділянок між доменами, наприклад, місця розташування кінця лінкерної ділянки між доменами ІІ і ПІ ї початку домену ПІ, хоча серцевина домену ПІ легко ідентифікується фахівцями в даній галузі техніки (наприклад, відповідно до розташування серцевинного домену ЇЇ, як показано на фігурі ТА та фігурі 2А). У варіантах здійснення перехід між М-кінцевою ділянкою першого білка Сгу і С-кінцевою ділянкою, 60 одержаною з іншого білка Стгу, міститься в СВ3.

В ілюстративних варіантах здійснення С-кінцеву ділянку іншого білка Сту (наприклад, білка

Стгу!ї) вибирають на підставі вирівнювання домену ПІ (наприклад, серцевинного домену ЇЇ, як показано на фігурі 1А) з іншого білка Сгу і відповідної послідовності домену ПІ з першого білка

Сгу (наприклад, білка Сту!, такого як ВТ-0029), наприклад, див. ілюстративні вирівнювання на фігурах 1А і 18 з конкретно вказаним доменом І. У варіантах здійснення інший білок Стгу вибраний таким чином, що амінокислотна послідовність домену І іншого білка Сгу є по суті ідентичною відповідній ділянці домену ПП першого білка Сгту (наприклад, ВТ-0029). В ілюстративних варіантах здійснення амінокислотна послідовність ділянки домену ЇЇ іншого білка

Сту (наприклад, білка Сгу!ї) на щонайменше приблизно 85 95, 86 95, 87 Зо, 88 95, 89 95, 90 95, 91 965, 92 95, 93 95, 94 95, 9595, 96 90, 97 95, 98 95, 99 95 або більше ідентична амінокислотній послідовності відповідної ділянки домену ЇЇ з першого білка Сгу. Способи вирівнювання та визначення ідентичності амінокислотних послідовностей у вирівняній ділянці добре відомі фахівцям у даній галузі техніки.

У конкретних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить (а) амінокислотну послідовність з будь-якої з амінокислот 1-597 з БЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ

МО: 9 або 5ЕО ІО МО: 13, або амінокислот 1-610 з БЕО ІЮ МО: 15, або амінокислот 1-617 з БЕО

ІЮО МО: 18 або токсиновий фрагмент з будь-якої з 5ЕО ІЮО МО: 3, 9, 13, 15 або 18; або (Б) амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична амінокислотній послідовності з (а), по суті складається з них або складається з них.

У конкретних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить (а) амінокислотну послідовність з будь-якої з амінокислот 1-603 з БЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ

МО: 9 або ЗЕО ІЮ МО: 13 або амінокислот 1-615 з БЕО ІЮ МО:15 або 5ЕО ІЮ МО:18 або їхній токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична амінокислотній послідовності з (а), по суті складається з них або складається з них.

У конкретних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить (а) амінокислотну послідовність з будь-якої з амінокислот 1-607 з БЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ

МО: 9 або ЗЕО ІЮ МО: 13 або амінокислот 1-620 з БЕО ІО МО: 15 або 5ЕО ІО МО: 18 або їхній токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична амінокислотній послідовності з (а), по суті складається з них або складається з них.

У конкретних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить (а) амінокислотну послідовність з будь-якої з амінокислот 1-610 з БЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ

МО: 9 або 5ЕО ІЮ МО: 13 або амінокислот 1-620 з БЕО ІО МО: 15 або 5ЕО ІО МО: 18 або їхній токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична амінокислотній послідовності з (а), по суті складається з них або складається з них.

Як зрозуміло фахівцям у даній галузі техніки, нативні токсини Сгу експресуються у вигляді протоксинів, які піддаються процесингу з одержанням зрілого процесованого токсину шляхом розщеплення М-кінцевого пептидильного фрагмента та С-кінцевого хвоста протоксину. М- кінцевий пептидильний Фрагмент і/або С-кінцевий хвіст протоксину можуть функціонувати для підвищення стабільності та/або інсектицидної активності токсину Сгу. У варіантах здійснення даного винаходу химерний інсектицидний білок містить весь М-кінцевий пептидильний фрагмент і/або хвіст протоксину або їхню частину. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок не містить повного М-кінцевого пептидильного фрагмента та/або повного хвоста протоксину. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок не містить М-кінцевого пептидильного фрагмента та/або хвоста протоксину, тобто відповідає зрілому процесованому токсину.

У варіантах здійснення М-кінцевий пептидильний фрагмент одержаний з білка Сгу (наприклад, з першого білка Сгу, який необов'язково являє собою білок Сгу1). В інших варіантах здійснення М-кінцневий пептидильний фрагмент є гетерологічним щодо першого білка Сгу, наприклад, не одержаний з білка Сгу і/або є частково або повністю синтетичним. У варіантах здійснення пептидильний фрагмент містить щонайменше приблизно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 або більше амінокислот, необов'язково з першого білка Стгу, у тому числі без обмеження першого білка Сгу! (наприклад,

ВТ-0029, 5ЕО ІО МО: 2). У варіантах здійснення пептидильний фрагмент містить амінокислоти від приблизно амінокислоти 1 до приблизно амінокислоти 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 або 60 першого білка Сгу, наприклад, білка Стгу!, такого як ВТ-0029.

У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить на бо С-кінці ділянку хвоста протоксину білка Сту з Ві, у тому числі модифіковані форми хвостів протоксину нативного білка Сгу, які по суті ідентичні хвосту протоксину нативного білка Сгу. У варіантах здійснення хвіст протоксину одержаний з активного щодо лускокрилих білка Стгу. У варіантах здійснення хвіст протоксину не одержаний з білка Сгу і/або є частково або повністю синтетичним. У варіантах здійснення білок Сгу є гетерологічним щодо першого білка Сгу та/або іншого білка Сгу. У варіантах здійснення хвіст протоксину одержаний із білка Сту!, наприклад, вт-0029, ВТ-0022, СтуїЕ (наприклад, Сгуї!Ра), Стгуї! (наприклад, Стуїїа або СтутІ, Стук (наприклад, СтуїКа) або Сгу1С (наприклад, Сгуї1Са), або являє собою поліпептид, який по суті ідентичний хвосту протоксину (або його фрагменту) будь-якого з перелічених вище. Ділянка хвоста протоксину може містити цілий хвіст протоксину білка Сту або будь-яку його частину. У варіантах здійснення ділянка хвоста протоксину містить щонайменше приблизно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 38, 40, 45, 50 або більше суміжних амінокислот із хвоста протоксину білка Сту (наприклад, хвоста протоксину Сгуї, такого як ВТ-0029), наприклад, як показано для різних білків Сгу на фігурі 1А. У варіантах здійснення хвіст протоксину містить щонайменше приблизно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,20, 25, 30, 35, 38, 40, 45, 50 або більше суміжних амінокислот, починаючи з амінокислотного положення 598 з 5ЕО ІЮ МО: 2 (ВТ- 0029) або відповідної ділянки з іншого білка Сгу, такого як білок Сту! (наприклад, білок ВТ-0022,

СтутІ, Стуї1Е, СтуїК або Стгу1сС). У варіантах здійснення хвіст протоксину містить амінокислоти 598-1169, або 598-652, або 598-636, або 598-622, або 598-610, або 598-607, або 598-603, або 598-600 з 5ЕО ІЮО МО: 2 (ВТ-0029) або відповідну ділянку з іншого білка Сгу (див., наприклад, вирівнювання ВТ-0029 з ВТ-0022, СтуїРа і СгтуїКа на фігурах 1А і 18). У деяких варіантах здійснення химерний інсектицидний білок містить будь-яку з ЗЕО ІЮ МО:20-25 або 5ЕО ІЮ

МО:32-35. В інших варіантах здійснення хвіст протоксину містить амінокислоти 637-715, або 637-691, або 637-675, або 637-661, або 637-649, або 637-646, або 637-642 з БЕО ІО МО: 1 (ВТ- 0022). У ще одних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить будь-яку з БЕО ІЮ МО: 26-31, по суті складається з неї або складається з неї.

Відповідно у варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить (а) амінокислотну послідовність будь-якої з зФЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 9, 5ЕО ІО МО: 13,

ЗЕБЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІЮ МО:20-35 або їхній токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична амінокислотній послідовності з (а), по суті складається з них або складається з них. У необов'язкових варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом містить амінокислотну послідовність з будь-якої з амінокислот з БЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 9, 5ЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 18 або

ЗЕО ІЮ МО: 20-35, по суті складається з неї або складається з неї.

Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом можуть додатково містити інші функціональні домени та/або пептидні мітки, наприклад, пептидну мітку на М-кінці та/або С-кінці Наприклад, може бути корисно експресувати химерний інсектицидний білок з пептидною міткою, яка може розпізнаватися комерційно доступним антитілом (наприклад, мотив РАС), або з пептидною міткою, яка полегшує очищення (наприклад, шляхом додавання мітки полі-Ніє) і/або виявлення.

Альтернативно епітоп можна вводити в химерний білок для полегшення утворення антитіл, які специфічно розпізнають модифікований химерний білок, щоб відрізнити модифікований химерний білок від немодифікованої химери та/або вихідного (вихідних) білка (білків).

Наприклад, одну або декілька амінокислот можна замінити в антигенній петлі нативної послідовності зі створенням нового епітопу. В одному варіанті здійснення антигенна петля розташована в неконсервативній ділянці за межами домену І нативного білка Сгу. У варіантах здійснення антигенна петля не є петлею, залученою в розпізнавання рецептора в травному каналі комахи білком Сгу, і/або не залучена в активацію білка Сгу під дією протеази. В інших варіантах здійснення химерний білок можна модифікувати для підвищення його стабільності, наприклад, шляхом злиття білка, що зв'язує мальтозу (МВР), або глутатіон-5-трансферази з поліпептидом. Як інша альтернатива, злитий білок може містити репортерну молекулу.

Химерні інсектицидні білки, які модифіковані шляхом введення в придатне (придатні) положення сайту процесингу під дією протеази або їх видалення з них для забезпечення або усунення протеолітичного розщеплення протеазою комах, рослин і/або мікроорганізмів, також входять в обсяг даного винаходу. У варіантах здійснення модифікований химерний інсектицидний білок по суті зберігає інсектицидну активність. У варіантах здійснення стабільність та/або інсектицидна активність таких модифікованих химерних білків підвищується порівняно з химерним інсектицидним білком, який не містить такої модифікації із введенням/усуненням сайту розщеплення протеазою.

Таким чином, даний винахід охоплює поліпептиди, що мають амінокислотні послідовності, 60 які по суті ідентичні послідовностям, які конкретно розкриті в даному документі, та їхнім токсиновим фрагментам. Буде зрозуміло, що химерні інсектицидні білки, конкретно розкриті в даному документі, будуть, як правило, витримувати модифікації в амінокислотній послідовності й по суті зберігати біологічну активність (наприклад, інсектицидну активність). Такі модифікації включають вставки, делеції (у тому числі усікання на будь-якому кінці) і заміни однієї або декількох амінокислот, у тому числі до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 або більше амінокислотних замін, делецій і/або вставок.

Для ідентифікації поліпептидів, по суті ідентичних химерним інсектицидним білкам, конкретно розкритим у даному документі, амінокислотні заміни можуть базуватися на будь-якій характеристиці, відомій із рівня техніки, у тому числі на відносній подібності або відмінностях замісників бічних ланцюгів амінокислот, наприклад, їхніх гідрофобності, гідрофільності, заряді, розмірі тощо.

Наприклад, під час ідентифікації амінокислотних послідовностей, що кодують інсектицидні поліпептиди, відмінні від тих, які конкретно розкриті в даному документі, можна враховувати індекс гідрофобності амінокислот. Важливість індексу гідрофобності амінокислот у забезпеченні узгодженої біологічної функції білка загалом відома з рівня техніки (див. Куїе апа Рооїїше, (1982)

У. Мої. Віої. 157:105; включену в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті).

Передбачається, що відносний гідрофобний характер амінокислоти сприяє вторинній структурі одержуваного в результаті білка, що, зі свого боку, визначає взаємодію білка з іншими молекулами, наприклад, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, антигенами тощо.

Кожній амінокислоті був наданий індекс гідрофобності на підставі її характеристик гідрофобності та заряду (Куїе апа Рооїїше, Іа.), він являє собою наступний: ізолейцин (4,5); валін (144,2); лейцин (13,8); фенілаланін (12,8); цистеїн/цистин (2,5); метіонін (41,9); аланін (1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6);

Зо гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (-3,5); лізин (-3,9) та аргінін (-4,5).

Відповідно індекс гідрофобності амінокислоти (або амінокислотної послідовності) можна враховувати під час модифікації химерних поліпептидів, конкретно розкритих у даному документі.

Також з рівня техніки відомо, що заміну амінокислот можна виконувати на підставі гідрофільності. У патенті США Мо 4554101 вказано, що найбільша середня локальна гідрофільність білка, яка визначається гідрофільністю його суміжних кислот, корелює з біологічною властивістю білка.

Як докладно описано в патенті США Мо 4554101 наступні значення гідрофільності були надані амінокислотним залишкам: аргінін (43,0); лізин (ї-3,0); аспартат (-3,04-1); глутамат (4-3,0---1); серин (10,3); аспарагін (40,2); глутамін (10,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5--1); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (- 1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); триптофан (-3,4).

Таким чином, гідрофільність амінокислоти (або амінокислотної послідовності) можна враховувати під час ідентифікації додаткових інсектицидних поліпептидів крім тих, які конкретно розкриті в даному документі.

Химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом, у тому числі модифіковані форми й токсинові фрагменти химерного поліпептиду, конкретно розкриті в даному документі, можна одержувати будь-яким придатним способом, відомим із рівня техніки, зазвичай шляхом модифікації послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують. Способи маніпулювання та модифікування нуклеїнових кислот для досягнення бажаної модифікації є добре відомими з рівня техніки. Крім того, методики редагування генів також можна застосовувати для одержання химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом або для внесення в нього додаткових модифікацій.

Як інший підхід, поліпептид, який підлягає модифікуванню, можна експресувати в клітині- хазяїні, яка демонструє високий ступінь помилкового включення основ під час реплікації ДНК, такій як ХІ-1 Кеа (5ігаїадепе, Ла-Хойя, Каліфорнія). Після розмноження в таких штамах можна виділяти ДНК (наприклад, шляхом одержання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікації за допомогою ПЛР і клонування одержаного ПЛР-фрагмента у вектор), експресувати мутантні бо послідовності білка в штамі, що не приводить до утворення мутацій, та ідентифікувати мутовані гени з інсектицидною активністю, наприклад, шляхом здійснення аналізу для тестування інсектицидної активності. В ілюстративних способах білок змішують і застосовують в аналізах живлення. Див., наприклад, Маггопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс ЕпіотоЇоду 78:290-293. Такі аналізи можуть включати приведення рослин у контакт з одним або декількома шкідниками та визначення здатності рослин до виживання або здатності викликати загибель шкідників.

Приклади мутацій, які приводять до підвищення токсичності, можна знайти в ЗсПппері еї аї. (1998) Місгобріо!. Мої. Вісі. Нем. 62:775-806.

У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок (у тому числі по суті подібні поліпептиди та токсинові фрагменти) згідно з даним винаходом є виділеним. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок (у тому числі по суті подібні поліпептиди та токсинові фрагменти) згідно з даним винаходом є рекомбінантним білком.

Химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом характеризуються інсектицидною активністю щодо шкідника, що належить до лускокрилих. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок характеризується активністю щодо одного або декількох з наступних необмежувальних прикладів шкідника, що належить до лускокрилих: О5ігіпіа 5рр., такий як о. пибіїаій (кукурудзяний метелик) і/або 0. Гшгпасаїї5 (східний кукурудзяний метелик); Рішейа 5рр., такий як Р. хуїоєіеїЇІа (міль капустяна); З5родоріеєга 5рр., такий як 5. пидірегаа (совка трав'яна), 5.

ІЩЖогаїї5 (совка бавовнику єгипетського), 5. огпїподаїїй (совка смугаста жовта), 5. ргаеїйса (західна жовто-смугаста совка), 5. епдапіа (південна совка) і/або 5. ехідца (совка мала); Адгоїй5 5рр., такий як А. ірзіоп (совка-іпсилон), А. зедеїшт (озима совка звичайна), А. діадіагіа (озима совка роду Адгоїї5) і/або А. опподопіа (совка прямокутна); 5ігіасовіа 5рр., такий як 5. аіІрісовіа (західна бобова совка); Неїїсомегра 5рр., такий як Н. 7еа (совка кукурудзяна), Н. рипсіїдега (совка бавовникова австралійська) і/або Н. агтідега (совка бавовникова); Неїїоїпіх 5рр., такий як Н. мігезсеп5 (тютюнова листокрутка); Оіаггаєа 5рр., такий як 0. дгапаїозейПа (вогнівка кукурудзяна південно-західна) і/або ОЮ. засспагаїі5 (точильник стебел цукрової тростини); Тгіспоріивзіа 5рр., такий як Т. пі (совка капустяна); 5езатіа 5рр., такий як 5. попадгоїде5 (метелик кукурудзяний середземноморський) і/або 5. саіатівіі5 (рожева стеблова совка); Ресііпорпога 5рр., такий як Р. до55зуріеїа (рожевий коробковий хробак); Соспуїїє 5рр., такий як С. Ппозре5 (смугаста соняшникова міль); Мапдиса 5рр., такий як М. в5ехіа (тютюновий бражник) іабо М.

Зо диіїпдоетасціайа (бражник п'ятикрапковий); ЕІазтораїриз 5рр., такий як Е. ІдпозеПи5 (точильник стебел кукурудзи малий); Рхецйдорісивіа 5рр., такий як Р. іпсіцдепз5 (соєва совка); Апіїсагвіа 5рр., такий як А. деттаїаїї5 (совка оксамитових бобів); Ріаїйурепа 5рр., такий як Р. 5сабга (совка конюшинова); Рієгі5 5рр., такий як Р. Бгаззісає (білянка капустяна), Рараірета 5рр., такий як Р. пергіз (точильник Рараїрета пебгіб5); Рзецйда|ейца 5рр., такий як Р. ипірипсіа (совка лугова звичайна); Регідгота 5рр., такий як Р. заисіа (совка стокроткова); Кеїегіа 5рр., такий як К.

Іусорег:зісеПа (томатна гостриця); Аподеїа 5рр., такий як А. гарає (білянка ріпна); Ріїпогітаєа 5рр., такий як Р. орегсцеїа (картопляна міль); Спгузодеїхі5 5рр., такий як С. іпсіцае5 (соєва совка); БешШа 5рр., такий як ЕР. щдисеп5 (гусінь совки Реша |асийШега); Спйо 5рр., такий як с. зирргеззаїї5 (вогнівка жовта рисова), Спарпаї|осгосів 5рр., такий як С. теаіпаїї5 (вогнівка рисова), або будь-якої комбінації вищевказаних.

Необов'язково химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо одного або декількох шкідників, що належать до лускокрилих, порівняно з однією або декількома вихідними молекулами (наприклад, першим білком Сгу і іншим білком Сгу). У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо одного або декількох шкідників, що належать до лускокрилих, порівняно з ВТ-0029. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо одного або декількох шкідників, що належать до лускокрилих, порівняно з ВТ-0022, СтгуїРа, СтутІа, Стгутії, СтуїКа або Сгу1с.

У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо совки трав'яної (5родоріега їидірегда) порівняно з однією або декількома вихідними молекулами (наприклад, першим білком Сгу й іншим білком Сгу). У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо совки трав'яної порівняно з ВТ-0029. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо совки трав'яної порівняно з ВТ-0022, СтгуїРа, СтгуїІа, Стутії, СтуїКа та/або СтуїСа. Відповідно до вищевказаних варіантів здійснення химерний інсектицидний білок може необов'язково мати інсектицидну активність щодо комахи-шкідника, яка являє собою совку трав'яну, або її колонії, які характеризуються стійкістю до іншого інсектицидного засобу, у тому числі іншого інсектицидного білка (такого як, наприклад, білок із ВО. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо колонії совки трав'яної, яка стійка до білка мірзА (наприклад, МірзлАа, у тому числі без обмеження трансформанта маїсу МІК162) або білка бо СтуїЕ (наприклад, СтгуїБа, у тому числі без обмеження трансформанта маїсу ТС1507).. У варіантах здійснення химерний інсектицидний білок має підвищену активність щодо стійкої колонії совки трав'яної порівняно з однією або декількома вихідними молекулами, наприклад, вт-0029, ВТ-0022, СтуїРа, СтгутІа, СтулІї, СтуїКа та/або Стуї1Са.

Даний винахід також охоплює антитіла, які специфічно зв'язуються з химерним інсектицидним білком згідно з даним винаходом. Антитіло необов'язково може бути моноклональним антитілом або поліклональною антисироваткою. У варіантах здійснення антитіло є селективним щодо химерного білка та не зв'язується з однією або декількома вихідними молекулами (наприклад, ВТ-0029, ВТ-0022, Стуїба тощо), і його можна застосовувати для розрізнення химерного білка та вихідного білка. Такі антитіла можуть бути одержані із застосуванням стандартних імунологічних методик одержання поліклональної антисироватки та за необхідності імморталізації клітин, що продукують антитіла, імунізованого організму-хазяїна для одержання джерел моноклональних антитіл. Методики одержання антитіл до будь-якої речовини, що становить інтерес, є добре відомими, наприклад, як описано в Напому апа Гапе (1988. Апіїродієз а Іарогаюгу тапиаї. с. 726. Соїд Зргіпу Нагбог І арогайогу) і в

Содіпд (Мопосіопа! Апіїродієв: Ргіпсірієє 4 ргасіісе.1986. Асадетіс Ргевзв, Іпс., ОпПапао, ЕІ).

Даний винахід також охоплює інсектицидний білок, який перехресно реагує з антитілом, зокрема моноклональним антитілом, що виробляється проти одного або декількох химерних інсектицидних білків згідно з даним винаходом.

Антитіла згідно з даним винаходом застосовні, наприклад, в імунологічних аналізах для визначення кількості або присутності химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом або антигенно спорідненого поліпептиду, наприклад, у біологічному зразку. Такі аналізи також застосовні в одержанні композицій, які містять один або декілька химерних інсектицидних білків згідно з даним винаходом або антигенно споріднений поліпептид, із забезпеченням контролю якості. Крім того, антитіла можна застосовувати для оцінки ефективності рекомбінантного одержання одного або декількох химерних інсектицидних білків згідно з даним винаходом або антигенно спорідненого поліпептиду, а також для скринінгу бібліотек експресії на предмет наявності нуклеотидної послідовності, що кодує один або декілька химерних інсектицидних білків згідно з даним винаходом або антигенно споріднений поліпептид. Антитіла додатково знаходять застосування як афінні ліганди для очищення або виділення будь-якого одного або декількох білків згідно з даним винаходом або антигенно спорідненого поліпептиду.

Нуклеїнові кислоти, касети експресії та вектори

У додатковому аспекті даного винаходу передбачені нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди згідно з даним винаходом, у тому числі модифіковані поліпептиди та токсинові фрагменти, описані в даному документі.

Згідно з деякими варіантами здійснення даного винаходу передбачена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка містить: (а) нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО І

МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5БО ІЮО МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 20-35 або її токсиновий фрагмент; (Б) нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична амінокислотній послідовності з (а); (с) нуклеотидну послідовність, яка гібридизується за жорстких умов гібридизації з нуклеотидною послідовністю з (а) або (Б); або (4) нуклеотидну послідовність, яка відрізняється від нуклеотидних послідовностей з (а), (б) або (с) внаслідок виродженості генетичного коду, по суті складається з них або складається з них.

У варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка містить: (а) нуклеотидну послідовність під БЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО

ІО МО: 7, ЗЕО ІЮО МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІО МО: 16 або її фрагмент, що кодує токсин; (б) нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична нуклеотидній послідовності з (а); (с) нуклеотидну послідовність, яка гібридизується за жорстких умов гібридизації з нуклеотидною послідовністю з (а) або (Б); або (4) нуклеотидну послідовність, яка відрізняється від нуклеотидних послідовностей з (а), (Б) або (с) внаслідок виродженості генетичного коду, по суті складається з них або складається з них. Необов'язково нуклеотидна послідовність містить нуклеотидну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, БЕО ІЮ МО: 6, 5БЕО ІЮО МО: 7, ЗЕО ІЮ

МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 14 або 5ЕО ІЮО МО: 16, по суті складається з неї або складається з неї.

У варіантах здійснення нуклеотидна послідовність є частково або повністю синтетичною послідовністю, наприклад, яка була кодон-оптимізована для експресії в організмі-хазяїні, наприклад, у бактерії-хазяїні або рослині-хазяїні (наприклад, трансгенній однодольній рослині- хазяїні або трансгенній дводольній рослині-хазяїні). Необмежувальні приклади нуклеотидних послідовностей, які кодон-оптимізовані для експресії в рослині маїсу, включають ЗЕО ІЮО МО: 5, бо ЗЕО ПО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 7 і 5ЕО ІЮ МО: 11.

В ілюстративних варіантах здійснення для експресії в трансгенних рослинах нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом модифікують та/або оптимізують. Наприклад, хоча в багатьох випадках гени мікроорганізмів можуть експресуватись у рослинах на високих рівнях без модифікації, низький рівень експресії в трансгенних рослинах може бути обумовлений нуклеотидними послідовностями мікроорганізмів, що мають кодони, які не є переважними для рослин. Із рівня техніки відомо, що для живих організмів характерні певні переваги щодо частоти застосування кодонів, і тому кодони нуклеотидних послідовностей, описані в даному винаході, можуть бути змінені згідно з характерними для рослин перевагами зі збереженням при цьому амінокислот, які кодуються ними. Крім того, із рівня техніки відомо, що високого рівня експресії в рослинах, наприклад, рослинах кукурудзи, можна досягнути із застосуванням кодувальних послідовностей, які характеризуються вмістом С, що становить щонайменше приблизно 35 95, або щонайменше приблизно 45 95, або щонайменше приблизно 50 95, або щонайменше приблизно 60 95. Нуклеотидні послідовності мікроорганізмів, які мають низький вміст С, можуть погано експресуватись у рослинах. Хоча певні нуклеотидні послідовності можуть належним чином експресуватись як у видах однодольних, так і дводольних рослин, послідовності можна модифікувати з урахуванням переваг щодо кодонів і переваг щодо вмісту

ОСС для однодольних рослин або дводольних рослин, оскільки було показано, що ці переваги відрізняються (Миїтау єї аї. Мисі. Асід5 Нев. 17:47 7-498 (1989)). Крім того, у варіантах здійснення нуклеотидну послідовність модифікують із видаленням неправильних сайтів сплайсингу, які можуть викликати усікання транскрипту. Такі модифікації нуклеотидних послідовностей можна виконати із застосуванням добре відомих методик сайт-спрямованого мутагенезу, ПЛР і конструювання синтетичних генів за допомогою способів, описаних, наприклад, у патентах США

МоМо 5625136; 5500365 і 6013523.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу передбачені синтетичні кодувальні послідовності або полінуклеотид, одержані згідно з процедурою, розкритою в патенті США Мо 5625136. У цій процедурі застосовують переважні для маїсу кодони, тобто один кодон, який найчастіше кодує дану амінокислоту в маїсі. Переважний для маїсу кодон, що кодує конкретну амінокислоту, може бути визначений, наприклад, на підставі відомих послідовностей генів маїсу. Наприклад, дані про частоту застосування кодонів у маїсу для 28 генів рослин маїсу знаходяться в Мигтау еї аїЇ., Мисівїс Асідбє Везєатгси 17:477-498 (1989). Відомо, що кодони, оптимізовані для експресії в рослині одного виду, також будуть виявляти свою функцію в рослинах інших видів, але, ймовірно, не тією ж мірою, як у виді рослини, для якої кодони були оптимізовані. Таким чином нуклеотидні послідовності можуть бути оптимізовані для експресії в будь-якій рослині. Слід розуміти, що вся нуклеотидна послідовність або будь-яка її частина можуть бути оптимізованими або синтетичними. Тобто полінуклеотид може містити нуклеотидну послідовність, яка частково є нативною послідовністю та частково є послідовністю з оптимізованими кодонами.

В ілюстративних варіантах здійснення полінуклеотид згідно з даним винаходом являє собою виділений полінуклеотид. У варіантах здійснення полінуклеотид згідно з даним винаходом являє собою рекомбінантний полінуклеотид.

У варіантах здійснення даного винаходу додатково передбачена молекула нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, функціонально пов'язаний із промотором (наприклад, гетерологічним промотором). Промотори можуть включати, наприклад, конститутивні, індуцибельні, регульовані в часі, регульовані в процесі розвитку, хімічно регульовані, тканинопереважні та/або тканиноспецифічні промотори. У конкретних аспектах промотор, застосовний у даному винаході, являє собою промотор, здатний ініціювати транскрипцію нуклеотидної послідовності в рослинній клітині, наприклад, у клітині однодольної (наприклад, маїс або рис) або дводольної (наприклад, соя, бавовник) рослини.

У варіантах здійснення гетерологічний промотор є промотором, що забезпечує експресію в рослині (наприклад, експресується в однодольній рослині або експресується у дводольній рослині). Наприклад, без обмеження промотор, що забезпечує експресію в рослині, можна вибрати із наступних промоторів: промотора гена убіквітину, вірусу жовтої кучерявості листя цеструму, ТгтрА кукурудзи, О5МАЮ5 6, гістону НЗ маїсу, 5-ТК гена 9 бактеріофага Т3, сахарозосинтетази 1 кукурудзи, алкогольдегідрогенази 1 кукурудзи, світлозбирального комплексу кукурудзи, білка теплового шоку кукурудзи, ті! маїсу, малої субодиниці КивВрР- карбоксилази гороху, актину рису, циклофіліну рису, манопінсинтази Ті-плазміди, нопалінсинтази Ті-плазміди, халконізомерази петунії, багатого гліцином білка 1 бобів, пататину картоплі, лектину, 355 Саму і малої субодиниці 5-Е9 ВивВР-карбоксилази.

Хоча, як було показано, багато промоторів із дводольних рослин функціонують в 60 однодольних рослинах і навпаки, у варіантах здійснення для експресії у дводольних рослинах вибирають промотори дводольних, а для експресії в однодольних рослинах вибирають промотори однодольних. Однак не існує будь-яких обмежень щодо походження вибраних промоторів, достатньо того, що вони є функціональними в керуванні експресією нуклеотидних послідовностей у потрібній клітині.

Вибір промотора може змінюватися залежно від часових і просторових вимог для експресії, а також залежно від клітини-хазяїна, що підлягає трансформації. Таким чином, наприклад, експресія нуклеотидних послідовностей згідно з даним винаходом може здійснюватися в будь- якій рослині та/або частині рослини, (наприклад, у листках, у квітконіжках або стеблах, у колоссі, у суцвіттях (наприклад, колосках, волотях, качанах тощо), у коренях, насінні та/або паростках тощо). Наприклад, якщо необхідною є експресія в конкретній тканині або органі, можна застосовувати тканиноспецифічний або тканинопереважний промотор (наприклад, промотор, специфічний/переважний для кореня). Навпаки, якщо необхідною є експресія у відповідь на стимул, можна застосовувати промотор, який індукується стимулами або хімічними речовинами.

Якщо необхідною є безперервна експресія на порівняно постійному рівні у всіх клітинах рослини, може бути вибраний конститутивний промотор.

Промотори, застосовні в даному винаході, включають без обмеження промотори, які керують експресією нуклеотидної послідовності конститутивно, промотори, які керують експресією в разі індукції, та промотори, які керують експресією тканиноспецифічно або специфічно щодо стадії розвитку. Ці різні типи промоторів відомі з рівня техніки.

Придатні конститутивні промотори включають, наприклад, промотор 355 Саму (савїї еї аї.,

Маїште 313:810-812, 1985); промотор Аїб669 Агарідорзі5 (див. публікацію згідно з РСТ Мо УМО 04081173А2); промотор ОШБі 1 маїсу (Спгізіепзеп еї аї., Ріапі Мої. Віої. 18:675-689, 1992); актину рису (МеЕїЇгоу еї аї!., Ріапі Сеї! 2:163-171, 1990); РЕМ! (І аві єї а!., Тиеог. Аррі. Сепеї. 81:581-588, 1991); 195 Саму (Міївзоп еї аї., Рнузіої!. Ріапі 100:456-462, 1997); 4052 (де Раїег евї аї!., Ріапі У

Мометьег"; 2(6):837-44, 1992); убіквітину (СНгівієпзеп еї аї., Ріапі Мої. Віої. 18: 675-689, 1992); циклофіліну рису (Виспої2 еї аї!., Ріапі Мої Віої. 25(5):837-43, 1994); гістону НЗ маїсу (І ереїй еї аї.,

Мої. (беп. Сепеї. 231: 276-285, 1992); актину 2 (Ап еї аї., Ріапі 9. 10(1);107-121, 1996), конститутивний у кінчиках коренів промотор СТ2 (ЗЕО ІЮО МО:1535; див. також заявку згідно з

РСТ Ме 1/2005/000627) і синтетичний Зирег МА5 (МІ еї а!., Те Ріапі доштпаї 7: 661-76, 1995).

Інші конститутивні промотори включають такі з патентів США МоМо 5659026, 5608149; 5608144; 5604121; 5569597: 5466785; 5399680; 5268463 і 5608142.

Тканиноспецифічні або тканинопереважні промотори, застосовні для експресії поліпептидів згідно з даним винаходом у рослинах, необов'язково в маїсі, включають ті, які керують експресією в корені, паренхімі, листку або пилку. Придатні тканиноспецифічні промотори включають без обмеження специфічні для листків промотори (такі як описані, наприклад, у

Уататою егїаї., Ріапі 9. 12:255-265, 1997; Кмоп еї аї!., Ріапі Рпузіо!. 105:357-67, 1994; Мататоїо еї аї., Ріапі СеїЇ Рпузіої!. 35:773-778, 1994; Сз010г вї аї., Ріапі У. 3:509-18, 1993; Огосо еї аї., Ріапі

МОЇ. ВіоІ. 23:1129-1138, 1993; та МаїзцокКа еї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90:9586-9590, 1993), переважні для насіння промотори (наприклад, із специфічних для насіння генів; бітоп, еї аї.,

Ріапі Мої. Віої. 5. 191, 1985; бсоївєїй, єї аї!., у. Віої. Снет. 262: 12202, 1987; Ва52с7упхекі, вї аї.,

Ріапі Мої. Віої. 14: 633, 1990), промотори альбуміну із бразильського горіха (Реагзоп еї аї!., Ріапі

МОЇ. Віої. 18: 235-245, 1992), легуміну (БЕПів, єї а. Ріапі Мої. Віої. 10: 203-214, 1988), глютеліну (Такаїма, єї аї!., Мої. Сеп. Счепеї. 208: 15-22, 1986; ТаКаїма, єї а!., РЕВ5 І ейв5. 221: 43-47, 1987), зеїну (МаїгкКе еї аї., Ріапі Мої! Віої, 143).323-32 1990), парА (5іаїІрего, евї а!., Ріапіа 199: 515-519, 1996), 5РА пшениці (АїІрапієїа!, Ріапі СеїІ, 9: 171-184, 1997), олеозину соняшнику (Ситртіпв5, єї а!., Ріапі Мої. Віої. 19: 873-876, 1992)|, специфічні для ендосперму промотори (наприклад, І ММУ і

НММУ/ пшениці, глютеніну-ї (МоЇ Сеп Сепеї 216:81-90, 1989; МАВ 17:461-2), гладиніва, б і 9 пшениці (ЕМВОЗ:1409-15, 1984), промотор ШІ ячменю, гордеїну ВІ, С, О ячменю (ТНеєог Аррі Сеп 98:1253-62, 1999; Ріапі у 4:343-55, 1993; Мої Сеп Сепеї 250:750-60, 1996), ОК ячменю (Мепа еї 5о аї., Пе Ріапі Уошигпаї, 116(1): 53-62, 1998), Віг2 (ЕР99106056.7), синтетичний промотор (Місепів-

Сагбаіоза еї аї., Ріапі У. 13: 629-640, 1998), промотор проламіну МАРЗЗ рису, глобуліну С1Б-1 рису (УУи еї аї., Ріапі Сеїї Рпузіоїоду 39(8) 885-889, 1998), альфа-глобуліну ВЕВ/ОНР-1 рису (МаКазе еї аї. Ріапі Мої. ВіоІ. 33: 513-522, 1997), РР АОЮР-глюкози рису (Ттап5 Нез 6:157-68, 1997), промотор гена родини Е5В маїсу (Ріапі У 12:235-46, 1997), гамма-кафірину сорго (Ріапі

МОЇ. Віо! 32:1029-35, 1996)), специфічні для зародка промотори (наприклад, О5НІ рису; За еї а!., Ргос. Маїї. Асай. сі. ОБА, 93: 8117-8122), КМОХ (Ровіта-Наагєта ої аї, Ріапі Мої. Віо)|. 39:257-71, 1999), олеозину рису (УУи еї аї, 9У. Віоспет., 123:386, 1998)), специфічні для квіток промотори, наприклад, АЇРАРА, халконсинтази (сп5А) (Мап дег Меетг, еї а!., Ріапі Мо). Віо!. 15, 95- 109, 1990), ГАТ52 (Тмеї! еї аЇ., МоІЇ. Сеп Сепеї. 217:240-245; 1989), ареїаіа-3, і промотори, бо специфічні для репродуктивних тканин рослин (наприклад, промотори О5МАЮ5; публікація патенту США 2007/0006344).

Приклади промоторів, придатних для переважної експресії в зеленій тканині, включають безліч промоторів, які здійснюють регуляцію генів, що беруть участь у фотосинтезі, і багато з них були клоновані як з однодольних, так і з дводольних рослин. Одним із таких промоторів є промотор РЕРС маїсу з гена фосфоенолкарбоксилази (Ниадзреїй 8 Сгша, Ріапі Моїес. Віої. 12:579-589 (1989)). Іншим промотором для специфічної для кореня експресії є промотор, описаний де Егатопа (РЕВЗ 290:103-106 (1991) або в патенті США Мо 5466785). Інший промотор, застосовний у даному винаході, являє собою специфічний для стебла промотор, описаний у патенті США Мо 5625136, який у природних умовах керує експресією гена їгрА маїсу.

Окрім того, можна застосовувати промотори, що функціонують у пластидах.

Необмежувальні приклади таких промоторів включають промотор 5'-0ТЕ. гена 9 бактеріофага

ТЗ й інші промотори, розкриті в патенті США Мо 7579516. Інші промотори, застосовні у даному винаході, включають без обмеження промотор малої субодиниці 5-Е9 ВиВР-карбоксилази і промотор гена інгібітора трипсину Кунітца (КІЇїЗ).

У деяких варіантах здійснення даного винаходу можуть застосовуватися індуцибельні промотори. Таким чином, наприклад, промотори, які регулюються хімічними речовинами, можна застосовувати для модуляції експресії гена в рослині шляхом застосування екзогенного хімічного регулятора. Регуляція експресії нуклеотидних послідовностей згідно з даним винаходом за допомогою промоторів, які регулюються хімічними речовинами, забезпечує синтез поліпептидів згідно з даним винаходом тільки тоді, коли культурні рослини обробляють індукувальними хімічними речовинами. Залежно від мети промотор може являти собою промотор, який індукується хімічною речовиною, де застосування хімічної речовини індукує експресію гена, або промотор, який пригнічується хімічною речовиною, де застосування хімічної речовини пригнічує експресію гена. Приклади такої технології хімічної індукції експресії генів докладно описані в опублікованій заявці ЕР 0332104 і патенті США Мо 5614395.

Промотори, які індукуються хімічними речовинами, відомі з рівня техніки та включають без обмеження промотор 1/п2-2 »маїсу, який активується антидотами бензолсульфонамідних гербіцидів, промотор О5Т маїсу, який активується гідрофобними електрофільними сполуками, застосовуваними як досходові гербіциди, і промотор РК-їа тютюну, який активується

Зо саліциловою кислотою (наприклад, системи РКта), стероїд-залежні промотори (див., наприклад, промотор, який індукується глюкокортикоїдами, в Зспепа еї аї. (1991) Ргос. Ма.

Асад. сі. ОБА 88, 10421-10425 і Мспеїїї5 еї аїЇ. (1998) Ріапі 9. 14, 247-257) і промотори, які індукуються тетрациклінами, і промоторі, які пригнічуються тетрациклінами, (див., наприклад,

Саї; єї аІ. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 227, 229-237, і патенти США МоМо 5814618 і 5789156), промотори ІГас-репрессорної системи, промотори системи, що індукується міддю, промотори системи, що індукується саліцилатом (наприклад, системи РК1а), промотори, що індукуються глюкокортикоїдами (Аоуата еї аїЇ. (1997) Ріапі 9. 11:605-612), і промотори системи, що індукується екдизоном.

Інші необмежувальні приклади індуцибельних промоторів включають промотори, що індукуються АВА і тургорним тиском, промотор гена білка, що зв'язується з ауксином (5спуУгобБ еї а!. (1993) Ріапі 9. 4:423-432), промотор ООР-глюкозофлавоноїдглікозилтрансферази (Каївіоп еї а!. (1988) Сепеїісв 119:185-197), промотор інгібітора протеїнази МРІ (Согаего еї аї!. (1994) Ріапі .. 6:141-150) і промотор гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (КопПіег еї аї. (1995) Ріапі Мої. Віо!. 29:1293-1298; Мапіпе? еї аї. (1989) У. Мої. ВіоІ. 208:551-565 і Оцідієу еї аІ. (1989) 9). Мої. Емої. 29:412-421). Також включені промотори систем, що індукуються бензолсульфонамідом (патент

США Мо 5364780) і що індукуються спиртом (публікації Міжнародних патентних заявок МоМе УМО 97/06269 і УМО 97/06268), і промотори глутатіон-5-трансферази. Аналогічно можна застосовувати будь-який з індуцибельних промоторів, описаних у Саї (1996) Ситепі Оріпіоп

Віотесппої. 7:168-172 і Саї» (1997) Аппи. Кем. Ріапі Рпузіої. Ріапі Мої. Віої. 48:89-108. Інші промотори, що індукуються хімічними речовинами, застосовні для керування експресією нуклеотидних послідовностей згідно з даним винаходом у рослинах, розкриті в патенті США 5614395. Хімічна індукція експресії генів також докладно описана в ЕР 0332104 (Сіра-Ссеїду) і патенті США 5614395.

Інша категорія промоторів, застосовних у даному винаході, являє собою промотори, що індукуються пораненням. Були описані численні промотори, які експресуються в ділянках поранення, а також у ділянках інфікування фітопатогеном. В ідеальному випадку такий промотор повинен активуватися тільки локально в ділянках інвазії комах, і таким чином інсектицидні білюи накопичуються лише в клітинах, де необхідний синтез інсектицидних білків для знищення комахи-шкідника, що нападає. Приклади промоторів цього типу включають бо описані у Зіапіога еї аІ. Мої. Сеп. Сепеї. 215:200-208 (1989), Хи єї аї. Ріапі Моїес. Віої. 22:573-

588 (1993), І одетапп еї аї. Ріапі Сеї! 1:151-158 (1989), ВоНптеїієг 8 І епіє, Ріапі Моїес. Віо). 22:183-792 (1993), Рікек єї аї. Ріапі Моїес. Віої. 22:129-142 (1993) і М/атег єї аї. Ріапі У. 3:191-201 (1993).

У варіантах здійснення нуклеїновая кислота згідно з даним винаходом може містити касету експресії, по суті складатися з неї або складатися з неї, або може міститися в касеті експресії.

Касета експресії, яка містить полінуклеотид, що становить інтерес, може бути химерною, а це означає те, що щонайменше один з її компонентів є гетерологічним щодо щонайменше одного іншого з інших її компонентів. Касета експресії також може являти собою послідовність, що зустрічається в природі, але яка була одержана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Як правило, касета експресії є гетерологічною щодо хазяїна, тобто конкретна послідовність нуклеїнової кислоти в касеті експресії не зустрічається в клітині-хазяїні в природі, та її необхідно було ввести в клітину-хазяїна або предка клітини-хазяїна за допомогою події трансформації.

На додаток до промоторів, функціонально пов'язаних із нуклеотидними послідовностями згідно з даним винаходом, касета експресії згідно з даним винаходом може також містити інші регуляторні елементи. Регуляторні елементи включають без обмеження енхансери, інтрони, лідерні послідовності, що регулюють трансляцію, сигнали термінації та сигнальні послідовності поліаденілювання. Приклади придатних сигналів термінації транскрипції доступні й відомі з рівня техніки (наприклад, ті з Саму, ЕЗ їПот гро5). У контексті даного винаходу можна застосовувати будь-який доступний термінатор, який, як відомо, функціонує в рослинах.

У касети експресії, описані в даному винаході, можна вводити багато інших послідовностей.

Вони включають послідовності, які, як показано, підсилюють експресію, як наприклад, інтронні послідовності (наприклад, з АСПІ ї Бгоп7еї) і вірусні лідерні послідовності (наприклад, з ТММ,

МСМУ і АММ).

Для більш ефективної ініціації трансляції можна модифікувати послідовності, суміжні з ініціювальним метіоніном. Наприклад, їх можна модифікувати шляхом включення послідовностей, які, як відомо, є ефективними в рослинах. до5Ппі запропонував придатну консенсусну послідовність для рослин (МАК 15:6643-6653 (1987), а СіопеФесп пропонує додаткову консенсусну послідовність, що є ініціатором трансляції (каталог 1993/1994, с. 210). Ці консенсусні послідовності є придатними для застосування з нуклеотидними послідовностями згідно з даним винаходом. Послідовності вводять у конструкції, що містять нуклеотидні послідовності, вище та включно АТО (при цьому друга амінокислота залишається не модифікованою), або альтернативно вище та включно СТС, що розташовується після АТО (із можливістю модифікування другої амінокислоти трансгена).

У варіантах здійснення переважною може бути спрямована експресія поліпептидів згідно з даним винаходом у конкретному клітинному місці розташування в рослинній клітині. У деяких випадках може бути бажаною локалізація в цитозолі, тоді як в інших варіантах здійснення переважною може бути локалізація у певній субклітинній органелі. Для здійснення даного винаходу на практиці можна використовувати будь-який механізм націлювання продуктів генів, наприклад, у рослинах, і, як відомо, такі механізми існують у рослинах, і послідовності, що регулюють функціонування таких механізмів, були описані доволі докладно. Були охарактеризовані послідовності, які забезпечують націлювання продуктів генів в інші компартменти клітини. Наприклад, амінокінцеві послідовності можуть обумовлювати націлювання білка, що становить інтерес, у такий компартмент клітини, як вакуоля, мітохондрія, пероксисома, білкові тільця, ендоплазматичний ретикулум, хлоропласт, крохмальне зерно, амілопласт, апопласт або клітинна стінка рослинної клітини (наприклад, Опдег еї. а). Ріапі Мо!ес.

Віої!. 13: 411-418 (1989); Водегз евї. аі. (1985) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 82: 6512-651; патент США

Мо 7102057; УМО 2005/096704. Необов'язково сигнальна послідовність може являти собою М- кінцеву сигнальну послідовність із улаху, М-кінцеву сигнальну послідовність із гамма-зеїну, домен, що зв'язує крохмаль, С-кінцевий домен, який зв'язує крохмаль, послідовність, що націлює в хлоропласт, яка забезпечує доставляння зрілого білка в хлоропласт (Сопаї еї. аї. (1988) У. ВіоІ. Спет. 263: 15104-15109; мап деп Вгоеск, еї. а. (1985) Маїиге 313: 358-363; патент

США Мо 5639949), або сигнальну послідовність секреції з клітин алейронового шару (Коепіег 5

Но, Ріапі Сей 2: 769-783 (1990)). Крім того, амінокінцеві послідовності разом з карбоксикінцневими послідовностями обумовлюють націлювання продуктів генів у вакуолю і можуть застосовуватися в даному винаході (ЗпіпзпПі еї. аїЇ. (1990) Ріапі Моїес. Віої. 14: 357-368).

В одному варіанті здійснення вибрана сигнальна послідовність включає відомий сайт розщеплення, і під час конструювання злиття враховуються будь-які амінокислоти після сайту(- ів) розщеплення, необхідні для розщеплення. У деяких випадках ця вимога може бути виконана бо шляхом додавання невеликої кількості амінокислот між сайтом розщеплення та АТО трансгена

Зо або, як альтернатива, шляхом заміщення деяких амінокислот у межах послідовності трансгена.

Такі методики конструювання добре відомі з рівня техніки й однаково застосовні до будь-якого клітинного компартмента.

Буде зрозуміло, що описані вище механізми націлювання в клітині можна застосовувати не тільки в поєднанні з когнатними для них промоторами, але також у поєднанні з гетерологічними промоторами, так що специфічне завдання націлювання в клітині здійснюється під транскрипційним контролем промотора, що характеризується патерном експресії, відмінним від такого для промотора, з якого одержаний націлювальний сигнал.

Касета експресії згідно з даним винаходом також може включати нуклеотидну послідовність, що кодує селектовний маркер, який можна застосовувати для відбору трансформованої рослини, частини рослини та/або рослинної клітини. Багато прикладів придатних селектовних маркерів відомі з рівня техніки та можуть застосовуватися в касетах експресії, описаних у даному документі.

Приклади селектовних маркерів включають без обмежень нуклеотидну послідовність, що кодує пео або прі, які надають стійкості до канаміцину, 5418 тощо (Роїгуких еї а. (1985) Мої.

Сеп. Сепеї. 199:183-188); нуклеотидну послідовність, яка кодує Баг, що надає стійкості до фосфінотрицину; нуклеотидну послідовність, яка кодує змінену 5-енолпірувілшикімат-3- фосфатсинтазу (ЕРБ5Р), що надає стійкості до гліфосату (Ніпспее еї аї. (1988) Віоїесп. 6:915- 922); нуклеотидну послідовність, яка кодує нітрилазу, таку як рхп із КіерзіеПа о7аепає, що надає стійкості до бромоксинілу (-аїКег еї а!. (1988) Зсіепсе 242:419-423); нуклеотидну послідовність, яка кодує змінену ацетолактатсинтазу (АЇ/5), що надає стійкості до імідазолінону, сульфонілсечовини або інших хімічних речовин, що інгібують АЇ 5 (заявка на європейський патент ЕР Мо 154204); нуклеотидну послідовність, яка кодує стійку до метотрексату дигідрофолатредуктазу (ОНЕК) (ТпШеї еї а). (1988) У. Віої. Спет. 263:12500-12508); нуклеотидну послідовність, що кодує далапондегалогеназу, яка надає стійкості до далапону; нуклеотидну послідовність, що кодує манозо-6-фосфатізомеразу (яка також називається фосфоманозоізомеразою (РМІ)), що надає здатності до метаболізму манози (патенти США МоМо 5767378 і 5994629); нуклеотидну послідовність, яка кодує змінену антранілатсинтазу, що надає стійкості до 5-метилтриптофану; або нуклеотидну послідовність, яка кодує при, що надає

Зо стійкості до гігроміцину. Фахівець у даній галузі техніки здатний вибрати придатний селектовний маркер для застосування в касеті експресії згідно з даним винаходом.

Додаткові селектовні маркери включають без обмеження нуклеотидну послідовність, яка кодує В-глюкуронідазу або цідА (505), що кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати; нуклеотидну послідовність К-локусу, що кодує продукт, який регулює продукування антоціанінових пігментів (червоного кольору) у рослинних тканинах (ОеїПІарогіа еї аї., "МоїІесшіаг сіопіпуд ої Ше таї?е В-п| аПеїе Бу мапзрозоп-іаддіпуд мій Ас", 263-282, у Спготозоте БігисішШге апа Еипсійоп: Ітрасі ої Мем Сопсерів, 181 біадієї Сепеїйсз Зутровішт (Сс1ивіаївзоп 4. Арреї5 єав.,

Ріепит Ргезз 1988)); нуклеотидну послідовність, яка кодує р-лактамазу, фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати (наприклад, РАБАС, хромогенний цефалоспорин) (Змйісійе (1978) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 75:3737-3741); нуклеотидну послідовність, яка кодує хуЇЕ, що кодує катехолдіоксигеназу (2иКому5Ку еї аЇ. (1983) Ргос. Майї). Асай. сі. ОБА 80:1101-1105); нуклеотидну послідовність, яка кодує тирозиназу, фермент, здатний окиснювати тирозин до роРА та допахінону, який, зі свого боку, конденсується з утворенням меланіну (Каї? еї а!. (1983)

У. Сп. МісгоріоІ. 129:2703-2714); нуклеотидну послідовність, яка кодує Д-галактозидазу, фермент, для якого існують хромогенні субстрати; нуклеотидну послідовність, яка кодує люциферазу (Ішх), що забезпечує виявлення за допомогою біолюмінесценції (Ом/ еї аї. (1986)

Зсієпсе 234:856-859); нуклеотидну послідовність, яка кодує екворин, який може бути застосований у виявленні чутливої до кальцію біолюмінесценції (РгазНег єї а!. (1985) Віоснет.

Віорпуб. Нев5. Сотт. 126:1259-1268); або нуклеотидну послідовність, яка кодує зелений флуоресцентний білок (Мівєа? еї аї. (1995) Ріапі СеїІ Керогі5 14:403-406). Фахівець у даній галузі техніки може вибрати придатний селектовний маркер для застосування в касеті експресії згідно з даним винаходом.

У деяких варіантах здійснення касета експресії згідно з даним винаходом також може містити полінуклеотиди, які кодують інші необхідні ознаки на додаток до химерних інсектицидних білків згідно з даним винаходом. Приклади таких інших полінуклеотидів включать полінуклеотиди, які кодують поліпептид або а5КМА для іншої необхідної (необхідних) ознаки (ознак), що становить (становлять) інтерес. Такі касети експресії, що містять "пакетовані" ознаки, можна застосовувати, наприклад, для одержання рослин, частин рослин або рослинних клітин, що мають необхідний фенотип з пакетованими ознаками (тобто молекулярне бо пакетування). Такі пакетовані комбінації в рослинах також можна створювати за допомогою інших способів, у тому числі без обмеження кросбридингу рослин за допомогою будь-якої традиційної методики (тобто селекційний пакет). У разі "пакетування" шляхом генетичної трансформації рослин нуклеотидні послідовності, що становлять інтерес, можна комбінувати в будь-який момент часу та в будь-якому порядку. Наприклад, трансгенну рослину, що містить одну або декілька необхідних ознак, можна застосовувати як мішень для введення додаткових ознак шляхом наступної трансформації. Додаткові нуклеотидні послідовності можна вводити за протоколом котрансформації одночасно з нуклеотидною послідовністю, молекулою нуклеїнової кислоти, конструкцією нуклеїнової кислоти або композицією за даним винаходом, що забезпечуються будь-якою комбінацією касет експресії. Наприклад, якщо будуть вводити дві нуклеотидні послідовності, то їх можна вбудувати в окремі касети (транс), або їх можна вбудувати в одну касету (цис). Експресія полінуклеотидів може керуватися тим самим промотором або різними промоторами. Крім того, відомо, що полінуклеотиди можна "пакетувати" в потрібному місці розташування в геномі за допомогою системи сайт-специфічної рекомбінації. Див., наприклад, публікації міжнародних заявок на патенти МоМо УМО 99/25821, УМО 99/25854, МО 99/25840, УМО 99/25855 і МО 99/25853.

В ілюстративних варіантах здійснення касета експресії також може містити додаткову послідовність, що кодує один або декілька поліпептидів або молекул двониткової РНК (й5КМА), що становлять інтерес для агрономічної ознаки (наприклад, агрономічної ознаки, яка переважно приносить користь компанії-виробникові насіння, сільгоспвиробникові або переробникові зерна).

Поліпептид, який становить інтерес, може бути будь-яким поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, яка становить інтерес. Необмежувальні приклади поліпептидів, що становлять інтерес, які є придатними для продукування в рослинах, включають такі, що зумовлюють виникнення агрономічно важливих ознак, таких як стійкість до гербіцидів (що іноді називається також "толерантністю до гербіцидів"), стійкість до вірусів, стійкість до патогенних бактерій, стійкість до комах, стійкість до нематод або стійкість до грибів. Див., наприклад, патенти США МоМо 5569823; 5304730; 5495071; 6329504 і 6337431. У варіантах здійснення поліпептид, що становить інтерес, також може являти собою поліпептид, який забезпечує збільшення потужності або врожайності рослин (у тому числі ознаки, які дають можливість рослині рости за різних значень температур, грунтових умов і рівнях сонячного освітлення й атмосферних опадів), або поліпептид, який дає можливість ідентифікувати рослину, яка проявляє ознаку, що становить інтерес (наприклад, селектовний маркер, колір насінної оболонки тощо). Різноманітні поліпептиди, що становлять інтерес, а також способи введення цих поліпептидів у рослину описані, наприклад, у патентах США МоМо 4761373; 4769061; 4810648; 4940835; 4975374; 5013659; 5162602; 5276268; 5304730; 5495071; 5554798; 5561236; 5569823; 5767366; 5879903, 5928937; 6084155; 6329504 та 6337431; а також у публікації заявки на патент США Мо 2001/0016956. Див. також у всесвітній мережі Інтернет за адресою

Іезсі.вивзех.ас.ик/поте/Меї! СтісКтоге/Ву.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу також можуть застосовуватися полінуклеотиди, які надають стійкості/тголерантності до гербіциду, що інгібує конус наростання або меристему, такого як імідазолінон або сульфонілсечовина. Ілюстративні полінуклеотиди з цієї категорії кодують мутантні ферменти АГ 5 та АНА5Б, як описано, наприклад, у патентах США

МоМо 5767366 і 5928937. Патенти США МоМо 4761373 і 5013659 стосуються рослин, стійких до різних імідазолінонових або сульфонамідних гербіцидів. Патент США Мо 4975374 стосується рослинних клітин і рослин, які містять нуклеїнову кислоту, що кодує мутантну глутамінсинтетазу (5), стійку до інгібування гербіцидами, які, як відомо, інгібують (5, наприклад, фосфінотрицином і метіонінсульфоксиміном. У патенті США Ме 5162602 розкриті рослини, стійкі до інгібування гербіцидами на основі циклогександіону та арилоксифеноксипропанової кислоти.

Стійкості надає змінена ацетил-коензим А-карбоксилаза (АСсСаза).

Поліпептиди, які кодуються нуклеотидними послідовностями, що надають стійкості до гліфосату, також є придатними для даного винаходу. Див., наприклад, патент США Мо 4940835 і патент США Мо 4769061. У патенті США Мо 5554798 розкриті трансгенні рослини магїсу, стійкі до гліфосату, стійкості яким надає ген зміненої 5-енолпірувіл-3-фосфошикіматсинтази (ЕРЗР).

Також є придатними полінуклеотиди, що кодують стійкість до фосфонових сполук, таких як глюфосинат амонію або фосфінотрицин, а також піридинокси- або феноксипропіонових кислот і циклогексанонів. Див. заявку на європейський патент Мо 0242246. Див. також патенти США МоМо 5879903, 5276268 і 5561236.

Інші придатні полінуклеотиди включають полінуклеотиди, що кодують стійкість до гербіцидів, що пригнічують фотосинтез, таких як триазин і бензонітрил (ген нітрилази). Див. патент США Мо 4810648. Додаткові придатні полінуклеотиди, які кодують стійкість до гербіцидів, включають такі, 60 що кодують стійкість до 2,2-дихлорпропіонової кислоти, сетоксидиму, галоксифопу,

імідазолінонових гербіцидів, сульфонілсечовинних гербіцидів, триазолопіримідинових гербіцидів, 5-триазинових гербіцидів і бромоксинілу. Також придатними є полінуклеотиди, що надають стійкості до інгібіторів ферменту протокс або які забезпечують підвищену стійкість до захворювань рослин; підвищену толерантність до несприятливих умов навколишнього середовища (видів абіотичного стресу), у тому числі без обмеження до засухи, надмірного охолодження, надмірного нагрівання, або надмірної засоленості грунту, або екстремальної кислотності або лужності; а також зміни будови або розвитку рослин, у тому числі зміни строків розвитку. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США Мо 2001/0016956 і патент США Мо 6084155.

Додаткові придатні полінуклеотиди включають такі, що кодують пестицидні (наприклад, інсектицидні) поліпептиди. Ці поліпептиди можуть бути одержані в кількостях, достатніх для контролю, наприклад, комах-шкідників (тобто в кількостях, що забезпечують контроль комах). У варіантах здійснення поліпептид являє собою поліпептид, активний щодо лускокрилих, активний щодо твердокрилих, активний щодо напівтвердокрилих і/або активний щодо двокрилих, або будь-яку їхню комбінацію. Вважається, що необхідна для контролю комах або інших шкідників кількість пестицидного поліпептиду, який продукується в рослині, може варіювати залежно від сорту, типу шкідника, факторів навколишнього середовища тощо.

Полінуклеотиди, що застосовуються для надання додаткової стійкості до комах або шкідників, включають, наприклад, полінуклеотиди, що кодують токсини, ідентифіковані в організмах роду

Васіїйй5. Полінуклеотиди, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують білки Сту Васійив5

ІШигіпдіепвіз (ВО із декількох підвидів, були клоновані, і було виявлено, що рекомбінантні клони токсичні для личинок лускокрилих, двокрилих і твердокрилих комах. Приклади таких інсектицидних білків Ві включають білки Сгу, такі як СтуїАа, СтгутАб, СтуїтАс, Стгу1В, Сгуї1с,

Сту1О, СтуїЕа, СгуїРа, СтузА, СтуЗА, Сту9В, Сту9С тощо, а також вегетативні інсектицидні білки, такі як Мір!, Мір2, Мір3 тощо, і будь-які комбінації вищевказаних інсектицидних білків Ві.

Повний список одержаних із Ві білків знаходиться у мережі Інтернет у номенклатурній базі даних токсинів Васійи5 ((игіпдіепоі5, підтримуваній університетом Сассекса (див. також

СтісКтоге еї а!. (1998) Містобіої!. Мої. Віої. Нем. 62:807-813).

У варіантах здійснення додатковий поліпептид являє собою інсектицидний поліпептид, одержаний із джерела, відмінного від Ві, у тому числі без обмеження альфа-амілазу, пероксидазу, холестериноксидазу, пататин, протеазу, інгібітор протеази, уреазу, інгібітор альфа-амілази, пороутворювальний білок, хітиназу, лектин, сконструйоване антитіло або фрагмент антитіла, інсектицидний білок Васіїйи5 сегец5, інсектицидний білок Хепогнардив в5рр. (такого як Х. петаїйорпійа або Х. Бомієпії), інсектицидний білок Рпоїогпаради» 5рр. (такого як Р.

Імтіпезсеп5 або Р. авзуторБбіоїіса), інсектицидний білок Вгемібасійш5 рр. (такого як В.

Іатегозрогоц5), інсектицидний білок Гувзіпірасійи5 5рр. (такого як Ї. 5рпеагісив5), інсектицидний білок Спготобасіегішт 5рр. (такого як С. з,йБібзидає або С. різсіпає), інсектицидний білок Уегзіпіа 5рр. (такого як У. епіоторіада), інсектицидний білок Раєпібасійн5 5рр. (такого як Р. ргоруїаєа), інсектицидний білок Сіовігідішт 5рр. (такого як С. Бітеппепіапо5), Рхзхендотопазв 5рр. (такого як Р.

Пиогезсепв) і лігнін.

Поліпептиди, придатні для продукування в рослинах, додатково включають такі, що поліпшують перетворення зібраних рослин або частин рослин на комерційно застосовний продукт або інакше сприяють йому, у тому числі, наприклад, такі, що забезпечують підвищений або змінений уміст або розподіл вуглеводів, поліпшені властивості зброджуваності, підвищений уміст олії, підвищений уміст білка, поліпшену засвоюваність та підвищений уміст нутрицевтиків, наприклад, підвищений уміст фітостеролу, підвищений уміст токоферолу, підвищений уміст станолу або підвищений уміст вітамінів. Поліпептиди, що становлять інтерес, також включають, наприклад, такі, що зумовлюють зниження вмісту небажаного компонента в зібраному врожаї, наприклад, фітинової кислоти або ферментів, які розщеплюють цукри, або сприяють цьому. Під "таким, що зумовлює" або "таким, що сприяє" розуміють, що поліпептид, який становить інтерес, може прямо або опосередковано сприяти наявності ознаки, що становить інтерес (наприклад, шляхом збільшення розщеплення целюлози за допомогою гетерологічного ферменту целюлази).

У деяких варіантах здійснення поліпептид сприяє поліпшенню засвоюваності їжі або корму.

Ксиланази являють собою ферменти, що розщеплюють геміцелюлозу, які поліпшують руйнування клітинних стінок рослин, що зумовлює краще засвоювання твариною поживних речовин рослини. Це приводить до збільшення темпів росту та конверсії корму. Також можна знижувати в'язкість кормів, що містять ксилан. Гетерологічне продукування ксиланаз у рослинних клітинах також може сприяти перетворенню лігноцелюлози на зброджувані цукри під 60 час промислового перероблення.

Були ідентифіковані та охарактеризовані численні ксиланази з грибкових і бактеріальних мікроорганізмів (див., наприклад, патент США Мо 5437992; Соцопіїп еї аІ. (1993) "Ргосеєєдіпов ої

Ше Зесопа ТАІСЕЇ Зутровзішт оп Тісподепта геезеї Сеїшазе5 апа ОїНег Нуагоїазев" Е5роо;

Зоцтіпеп апа ВеїпіКкаіпеп, едз5. (1993) Роипааїйоп їтог Віоїесппіса! апа Іпдивіпа! Рептепіайоп

Везвєагсй 8:125-135; публікацію заявки на патент США Мо 2005/0208178 і публікацію згідно з РСТ

Мо УМО 03/16654). Зокрема, у Т. геєзєї були ідентифіковані три специфічні ксиланази (ХХІ -Ї,

ХМІ-П ї ХМІ-І) (ТепКапеп сеї аї. (1992) Епгуте Містоб. Тесппої. 14:566; Тотопеп еї аї. (1992)

Віо/ТесппоІоду 10:1461 та Хи еї а. (1998) Аррі. Містобіо!ї. Віотесппо!. 49:718).

В інших варіантах здійснення поліпептид, застосовний у даному винаходу, може являти собою фермент, що розщеплює полісахариди. Рослини згідно з даним винаходом, що продукують такий фермент, можуть бути застосовними для одержання, наприклад, зброджуваної сировини для біологічної переробки. У деяких варіантах здійснення ферменти, застосовні для способу зброджування, включають альфа-амілази, протеази, пулуланази, ізоамілази, целюлази, геміцелюлази, ксиланази, циклодекстринглікозилтрансферази, ліпази, фітази, лакази, оксидази, естерази, кутинази, фермент, що гідролізує гранульований крохмаль, та інші глюкоамілази.

Ферменти, які розщеплюють полісахариди, включають ферменти, що розщеплюють крохмаль, такі як альфа-амілази (ЕС 3.2.1.1), глюкуронідази (Е.С. 3.2.1.131); екзо-1,4-альфа-0- глюканази, такі як амілоглюкозидази та глюкоамілаза (ЕС 3.2.1.3), бета-амілази (ЕС 3.2.1.2), альфа-глюкозидази (ЕС 3.2.1.20) й інші екзо-амілази; ферменти, що розщеплюють крохмаль у точках галуження, такі як а) ізоамілаза (ЕС 3.2.1.68), пулуланаза (ЕС 3.2.1.41) тощо; Б) целюлази, такі як екзо-1,4-3-целобіогідролаза (ЕС 3.2.1.91), екзо-1,3-бета-ЮО-глюканаза (ЕС 3.2.1.39), бета-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21); с) І -арабінази, такі як ендо-1,5-альфа-і -арабіназа (ЕС 3.2.1.99), альфа-арабінозидази (ЕС 3.2.1.553 тощо; а) галактанази, такі як ендо-1,4-бета-О- галактаназа (ЕС 3.2.1.89), ендо-1,3-бета-О-галактаназа (ЕС 3.2.1.90), альфа-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22), бета-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) тощо; є) мананази, такі як ендо-1,4-бета-О-мананаза (ЕС 3.2.1.78), бета-манозидаза (ЕС 3.2.1.253, альфа-манозидаза (ЕС 3.2.1.24) тощо; й ксиланази, такі як ендо-1,4-бета-ксиланаза (ЕС 3.2.1.8), бета-Ю-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37), 1,3- бета-О-ксиланаза тощо; й 9) інші ферменти, такі як альфа-І -фукозидаза (ЕС 3.2.1.51), альфа-Ї -

Зо рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40), леваназа (ЕС 3.2.1.65), інуланаза (ЕС 3.2.1.7) тощо. В одному варіанті здійснення альфа-амілаза являє собою синтетичну альфа-амілазу, Ату797Е, описану в патенті США Мо 8093453.

Додаткові ферменти, які можна застосовувати згідно з даним винаходом, включають протеази, такі як протеази грибів і бактерій. Протеази грибів включають без обмежень такі, одержані з Азрегойив5, Тгісподегта, Мисог і Кпігори»5, таких як А. підег, А. ауатогі, А. огу/ає і М. тіепеї. У деяких варіантах здійснення поліпептиди за даним винаходом можуть являти собою ферменти целобіогідролази (СВН) (ЕС 3.2.1.91). В одному варіанті здійснення фермент целобіогідролаза може являти собою СВНІ або СВНІ2.

Інші ферменти, застосовні у даному винаході, включають без обмеження геміцелюлази, такі як манази та арабінофуранозидази (ЕС 3.2.1.55); лігнінази; ліпази (наприклад, Е.С. 3.1.1.3), глюкозооксидази, пектинази, ксиланази, трансглюкозидази, альфа-1,6-глюкозидази (наприклад,

Е.С. 3.2.1.20); оестерази, такі як естераза ферулової кислоти (ЕС 3.1.1.73) й ацетилксиланестерази (ЕС 3.1.1.72); і кутинази (наприклад, Е.С. 3.1.1.74).

Молекули двониткової РНК (й5КМА), застосовні в даному винаході, включають без обмеження такі, які пригнічують експресію генів у цільового шкідника (наприклад, комахи). У варіантах здійснення а85КМА націлюється на ген комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, твердокрилих, напівтвердокрилих або двокрилих або будь-якої комбінації вищевказаного.

Передбачається, що застосовуване в даному документі словосполучення "супресія гена" у сукупності стосується будь-яких добре відомих способів зниження рівнів білка, що продукується в результаті транскрипції гена в тЕКМА та подальшої трансляції тТКМА. Також мається на увазі, що супресія гена означає зниження експресії білка геном або кодувальною послідовністю, у тому числі посттранскрипційну супресію гена та транскрипційну супресію. Посттранскрипційна супресія гена опосередкована гомологією всієї або частини тЕМА, що транскрибується з гена або кодувальної послідовності, які є мішенями для супресії, та відповідної двониткової РНК, що використовується для супресії, та означає значуще та вимірюване зниження кількості доступної

ТЕМА, наявної в клітині для зв'язування рибосомами. РНК, що транскрибується, може знаходитися в сенсовій орієнтації для забезпечення ефекту, що називається косупресією, в антисенсовій орієнтації для забезпечення ефекту, що називається антисенсовою супресією, або в обох орієнтаціях з одержанням а52ЕМА для забезпечення ефекту, що називається РНК- бо інтерференцією (КМАЇї). Транскрипційна супресія опосередкована наявністю в клітині а5КМА,

засобу, що забезпечує супресію гена, яка демонструє значну ідентичність послідовності з промоторною послідовністю ДНК або комплементарною їй ниткою, для забезпечення ефекту, що називається супресією промотора в трансо-положенні. Супресія гена може бути ефективною щодо нативного гена рослини, асоційованого з ознакою, наприклад, для забезпечення в рослинах знижених рівнів білка, що кодується нативним геном, або підвищеними або зниженими рівнями зміненого метаболіту. Супресія гена також може бути ефективною щодо генів-мішеней у шкідниках рослин, які можуть ковтати або контактувати з рослинним матеріалом, що містить засоби для забезпечення супресії гена, спеціально сконструйованого для пригнічення або супресії експресії однієї або декількох гомологічних або комплементарних послідовностей у клітинах шкідника. Такі гени-мішені для супресії можуть кодувати незамінний білок, основна функція якого вибрана з групи, що складається з формування м'язів, утворення ювенільного гормону, регуляції ювенільного гормону, регуляції та транспорту іонів, синтезу травних ферментів, підтримання мембранного потенціалу клітини, біосинтезу амінокислот, деградації амінокислот, утворення сперми, синтезу феромонів, сприйняття феромонів, формування антен, формування крил, формування кінцівок, розвитку та диференціації, формування яєць, дозрівання личинок, утворення травних ферментів, синтезу гемолімфи, підтримання постійності складу гемолімфи, передавання нервових імпульсів, клітинного поділу, енергетичного обміну, дихання та апоптозу.

У варіантах здійснення нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом можуть додатково містити вектор, по суті складатися з нього або складатися з нього. У варіантах здійснення полінуклеотиди та касети експресії згідно з даним винаходом містяться у векторі. Вектори для застосування в трансформації рослин й інших організмів добре відомі з рівня техніки.

Необмежувальні приклади загальних класів векторів включають плазміду, фаговий вектор, фагмідний вектор, космідний вектор, фосміду, бактеріофаг, штучну хромосому або вірусний вектор. У варіантах здійснення вектор являє собою рослинний вектор, наприклад, для застосування у разі трансформації рослин. У варіантах здійснення вектор являє собою бактеріальний вектор, наприклад, для застосування у разі трансформації бактерій. Придатні вектори для рослин, бактерій та інших організмів відомі з рівня техніки.

Трансгенні рослини, частини рослин, рослинні клітини, насінина

Даний винахід також охоплює трансгенну клітину-хазяїна, відмінну від клітини людини, яка містить полінуклеотид, молекулу нуклеїнової кислоти, касету експресії, вектор або поліпептид згідно з даним винаходом. Трансгенна клітина-хазяїн, відмінна від клітини людини, може включати без обмеження рослинну клітину (у тому числі клітину однодольної рослини та/або клітину дводольної рослини), дріжджову клітину, бактеріальну клітину або клітину комахи.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення даний винахід передбачає бактеріальну клітину, вибрану з родів Васійи5, Вгемірасійи5, Сіовігідішт, Хепогпарди5, РІпоїогпарацв5, Равіецигпіа,

ЕзсПегісніа, Реейдотопав, Егміпіа, 5еїтайа, Кіерзівеа, ЗаітопейЇа, Равівєшеїйа, Хапіпотопав, зЗіеріотусев5, ВПї2гобішт, АПодорзейдотопав5, Меїпуіорпіїйи5, Адгобасіегішт, Асеїобасієг,

І асюбасіййи5, Агіпгобасіег, А20їобасівг, І еисоповіос або АїЇсаїіїдепе5. Таким чином, наприклад, як засоби для біологічного контролю комах можна одержувати химерні інсектицидні білки згідно з даним винаходом шляхом експресії полінуклеотиду, що кодує їх, у бактеріальній клітині.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення передбачена клітина Васійн5 (пПигіпдіепві5, яка містить полінуклеотид, що кодує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

У варіантах здійснення трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини або клітину дводольної рослини. У додаткових варіантах здійснення клітина дводольної рослини являє собою клітину сої, клітину соняшнику, клітину томата, клітину культурного різновиду капусти, клітину бавовнику, клітину цукрового буряку та клітину тютюну. У додаткових варіантах здійснення клітина однодольної рослини являє собою клітину ячменю, клітину маїсу, клітину вівса, клітину рису, клітину сорго, клітину цукрової тростини або клітину пшениці. У варіантах здійснення даного винаходу передбачена сукупність клітин дводольних рослин або клітин однодольних рослин, що містять полінуклеотид, який експресує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом. У варіантах здійснення сукупність клітин об'єднують з утворенням апопласта, і їх вирощують в умовах природного сонячного світла. У варіантах здійснення трансгенна рослинна клітина не може регенеруватися в цілу рослину.

У варіантах здійснення даного винаходу інсектицидний білок згідно з даним винаходом експресується у вищому організмі, наприклад, рослині. У даному випадку трансгенні рослини, експресуючи ефективні кількості інсектицидного білка, захищають себе від шкідників рослин, таких як комахи-шкідники. Коли комаха починає поїдати таку трансгенну рослину, вона поглинає інсектицидний білок, що експресується. Це може утримувати комаху від подальшого вгризання бо в рослинну тканину або навіть може завдавати шкоди комасі або знищувати її. У варіантах здійснення полінуклеотид згідно з даним винаходом вставляють у касету експресії, яка потім стабільно інтегрується в геном рослини. В інших варіантах здійснення полінуклеотид включений у непатогенний вірус, що самореплікується.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу трансгенна рослинна клітина, що містить молекулу нуклеїнової кислоти або поліпептид згідно з даним винаходом, являє собою клітину частини рослини, органа рослини або культури рослини (кожна описана в даному документі), у тому числі без обмеження кореня, листка, насінини, квітки, плоду, клітину пилку, органа або культури рослини тощо, або калюсну клітину або культуру.

Трансгенна рослина або рослинна клітина згідно з даним винаходом може являти собою однодольну або дводольну рослину або рослинну клітину й включає без обмеження кукурудзу (маїс), сою, рис, пшеницю, ячмінь, жито, овес, сорго, просо, соняшник, сафлор, цукровий буряк, бавовник, цукрову тростину, олійний рапс, люцерну, тютюн, арахіс, овочеві культури (у тому числі батат, квасолю, горох, цикорій, латук, кочанну капусту, цвітну капусту, броколі, ріпу, моркву, баклажан, огірок, редьку, шпинат, картоплю, томат, спаржу, цибулю, часник, диню, перець, селеру, гарбуз великоплідний, гарбуз мускатний, гарбуз звичайний тощо), плодову культуру (у тому числі яблуню, грушу, айву, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, суницю, виноград, малину, ожину, ананас, авокадо, папаю, манго, банан тощо), спеціалізовану рослину або рослинну клітину (як, наприклад, Агарідорзі5) або деревну рослину або рослинну клітину (як, наприклад, хвойні та/або листяні дерева). У варіантах здійснення рослина або рослинна клітина згідно з даним винаходом являє собою культурну рослину або рослинну клітину, як, наприклад, рослину або рослинну клітину маїсу, сорго, пшениці, соняшнику, томата, хрестоцвіту, перцю, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряку, цукрової тростини, тютюну, ячменю, олійного рапсу тощо.

У даному винаході додатково передбачена частина трансгенної рослини згідно з даним винаходом. Необов'язково частина рослини містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом та/або нуклеїнову кислоту, що кодує його.

У даному винаході додатково передбачена насінина трансгенної рослини згідно з даним винаходом або насінина, з якої одержують трансгенну рослину згідно з даним винаходом.

Необов'язково насінина містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і/або

Зо нуклеїнову кислоту, що кодує його.

Додаткові варіанти здійснення даного винаходу включають зібрані продукти, одержані із трансгенних рослин, частин рослин або насінини згідно з даним винаходом, а також перероблений продукт, одержаний із зібраного продукту. Зібраний продукт може являти собою цілу рослину або будь-яку частину рослини, як розкрито в даному документі. Таким чином, у деяких варіантах здійснення необмежувальні приклади зібраного продукту включають насінину, плід, квітку або її частину (наприклад, пиляк, приймочку тощо), листок, стебло тощо. В інших варіантах здійснення перероблений продукт включає без обмеження борошно, борошно грубого помелу, олію, крохмаль, зерно тощо, одержані із зібраної насінини або іншої частини рослини згідно з даним винаходом. Необов'язково зібраний продукт або перероблений продукт містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і/або нуклеїнову кислоту, що кодує його.

В інших варіантах здійснення даного винаходу передбачений екстракт із трансгенної рослини або частини рослини згідно з даним винаходом, де необов'язково екстракт містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і/або нуклеїнову кислоту, що кодує його. Екстракти з рослин або частин рослин можна одержати згідно з процедурами, добре відомими з рівня техніки (див. де Іа Тогте еї аї., Роса, Адгіс. Епмігоп. 2(1):84-89 (2004); Ссишіаеї,

Мисівїс Асіаз Нев. 22(9): 1772-1773 (1994); Прюп еї аї!., Роса Адгіс. Іттип. 12:153-164 (2000)).

Химерний інсектицидний білок може функціонувати в частині рослини, рослинній клітині, органі рослини, насінині, зібраному продукті, переробленому продукті або екстракті тощо як засіб для контролю комах. Інакше кажучи, химерний інсектицидний білок може продовжувати виконувати інсектицидну функцію, яку він мав у трансгенній рослині. Нуклеїнова кислота може функціонувати із забезпеченням експресії химерного інсектицидного білка. Як альтернатива кодуванню інсектицидного білка згідно з даним винаходом, функцією нуклеїнової кислоти може бути ідентифікація трансгенної частини рослини, рослинної клітини, органа рослини, насінини, зіораного продукту, переробленого продукту або екстракту згідно з даним винаходом.

У варіантах здійснення трансгенні рослина, частина рослини, рослинна клітина, орган рослини або насінина згідно з даним винаходом є гемізиготними щодо полінуклеотиду або касети експресії згідно з даним винаходом. У варіантах здійснення трансгенні рослина, частина рослини, рослинна клітина, орган рослини або насінина згідно з даним винаходом є 60 гомозиготними щодо полінуклеотиду або касети експресії згідно з даним винаходом.

У варіантах здійснення трансгенні рослина, частина рослини, рослинна клітина, орган рослини, насінина, зібраний продукт, перероблений продукт або екстракт характеризуються підвищеною стійкістю до однієї або декількох комах-шкідників (наприклад, шкідника, що належить до лускокрилих, такого як совка трав'яна) порівняно з придатним контролем, який не містить нуклеїнової кислоти, що кодує інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

Трансформація рослин

Процедури здійснення трансформації рослин є добре відомими та загальноприйнятими у рівні техніки й описані в літературі з усіх поглядів. Необмежувальні приклади способів трансформації рослин включають трансформацію за допомогою доставляння нуклеїнових кислот, опосередкованого бактеріями (наприклад, за допомогою Адгобасіегішт), доставляння нуклеятнових кислот, опосередковане вірусами, доставляння нуклеїнових кислот, опосередковане карбідом кремнію або мікроголками з нуклеїновими кислотами, доставляння нуклеїнових кислот, опосередковане ліпосомами, мікроін'єкцію, бомбардування мікрочастинками, трансформацію, опосередковану фосфатом кальцію, трансформацію, опосередковану циклодекстрином, електропорацію, трансформацію, опосередковану наночастинками, обробку ультразвуком, інфільтрацію, поглинання нуклеїнових кислот, опосередковане РЕС, а також будь-який інший електричний, хімічний, фізичний (механічний) або біологічний механізм, який забезпечує введення нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, у тому числі будь-яку їхню комбінацію. Загальні посібники з різноманітними способами трансформації рослин, відомими з рівня техніки, включають МіКі еї аїЇ. ("Ргоседиге5 ог

Іпігодисіпд Рогеідп ОМА іпо Ріапіє" в Меїйпоавз іп Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду апа Віотесппо!оду, СІЇсСК,

В. А. апа Тнотрзоп, у). Е., Едз. (САС Ргезв, Іпс., Воса Наюп, 1993), с. 67-88) і Какожослу-

ТгодапомузКа (Сеїї. Мої. Віої. І ей. 7:849-858 (2002)).

Для трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт, зазвичай придатними є бінарні вектори або вектори, які несуть щонайменше одну граничну послідовність Т-ДНК, тоді як для прямого переносу генів (наприклад, за допомогою бомбардування частинками тощо) придатним є будь- який вектор, і при цьому можна використовувати лінійну ДНК, що містить тільки конструкцію, яка становить інтерес. У випадку прямого переносу генів можна застосовувати трансформацію за допомогою одного виду ДНК або котрансформацію (Зспоспег еї аї., ВіотесппоЇоду 4:1093-1096

Зо (1986)). У випадку як прямого переносу генів, так і переносу, опосередкованого Адгобасіегічт, трансформацію зазвичай (але не обов'язково) виконують із селектовним маркером, який може являти собою засіб для позитивного відбору (наприклад, фосфоманозоізомеразу), що забезпечує стійкість до антибіотика (наприклад, канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або гербіциду (наприклад, гліфосату або глюфосинату). Проте вибір селектовного маркера не є критично важливим для даного винаходу.

Трансформація, опосередкована Адгорасіегішт, є широко застосовуваним способом трансформації рослин внаслідок його високої ефективності трансформації та внаслідок його широкого застосування щодо багатьох різних видів. Як правило, трансформація, опосередкована Адгобасіегішт, передбачає перенесення бінарного вектора, що несе чужорідну

ДНК, яка становить інтерес, у відповідний штам Адгобасіегійт, що може залежати від набору мії-генів штаму-хазяїна Адгорасіегішт, розташованого або на корезидентній Ті-плазміді, або у хромосомі (ОКпев еї аї. (1993) Ріапі СеїЇ 5:159-169). Перенесення рекомбінантного бінарного вектора в Адгорасіегішт можна виконувати за допомогою методики трибатьківського схрещування із застосуванням Езспегіспіа соїї, що несе рекомбінантний бінарний вектор, хелперного штаму Е. соїї, що несе плазміду, яка здатна мобілізувати рекомбінантний бінарний вектор у цільовому штамі Адгобасіегшт. Як альтернатива, рекомбінантний бінарний вектор можна переносити в Адгорасіегішт шляхом трансформації нуклеїновою кислотою (Нобїдеп 5

ММ тії2ег (1988) Мисівїс Асіа5 Нев. 16:9877).

Дводольні рослини, а також однодольні рослини можна трансформувати із застосуванням

Адгорасіегічт. Способи для опосередкованої Адгобасіегішт трансформації рису включають добре відомі способи для трансформації рису, такі як описані в будь-чому з наступного: заявка на європейський патент ЕР 1198985 А1, АІдетйа апа Ноддез (Ріапіа 199: 612-617, 1996); Снап еї а. (Ріапі Мої Віої! 22 (3): 491-506, 1993), Нівї евї а). (Ріапі У 6 (2): 271-282, 1994), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання, як якби вони були повністю викладені. У випадку трансформації кукурудзи переважним способом є описаний або в Ізпіда еї аї. (Маї.

Віоїеснпої 14(6): 745-50, 1996), або у Егате еї аї. (Ріапі Рпузіої 129(1): 13-22, 2002), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання, як якби вони були повністю викладені. Указані способи також описані як приклад у В. дУепез еї аї., Тесппіднев Тог Сепе

Тгапетег, у Тгапздепіс Ріапіб5, МоїЇ. 1, Епдіпеегіпдо апа (й2ацноп, ей5. 5. ОЮО. Кипод апа Кк. Уми, бо Асадетіс Ргезз (1993) 128-143 і в Роїгуки5 Аппи. Кему. Ріапі Рпузіої!. Ріапі Моїес. Вісі. 42 (1991)

205-225). Нуклеїнові кислоти або конструкт, що підлягають експресії, переважно клонують у вектор, який є придатним для трансформації Адгобасіегічйт Іштегасіеп5, наприклад рВіп19 (Вемап еї аї., Мисі. Асід5 Кев. 12 (1984) 8711). Адгорасієгіа, трансформовані таким вектором, потім можна застосовувати відомим способом для трансформації рослин, таких як рослини, застосовувані як моделі, такі як Агарідорвіх, або сільськогосподарські культури, такі як, наприклад, рослини тютюну, наприклад, за допомогою занурення подрібнених листків або нарубаних листків у розчин з Адгобасіегпа і потім їх культивування у придатному середовищі.

Трансформація рослин за допомогою Адгобасіегішт іштегасіеп5 описана, наприклад, Надеп апа

УМІтігег у Мисі. Асіа Кев. (1988) 16, 9877, або відома, зокрема, із РЕ. Є. УМпйе, Месіог5 Тог Сепе

Тгапетег іп Нідпег Ріапів5; у Тгапздепіс Ріапі5, Мої. 1, Епдіпеегіпд апа і2аноп, еав5. 5. О. Кипд апа В. Ми, Асадетіс Ргезз, 1993, рр. 15-38.

Трансформація рослини за допомогою рекомбінантного Адгобасіегішт зазвичай включає спільне культивування Адгобасіегішт з експлантатами рослини та проводиться відповідно до способів, добре відомих із рівня техніки. Трансформовану тканину регенерують на селективному середовищі, що містить маркер стійкості до антибіотиків або гербіцидів між граничними послідовностями Т-ОМА бінарної плазміди.

Як обговорювалося вище, інший спосіб здійснення трансформації рослин, частин рослин і рослинних клітин включає впровадження інертних або біологічно активних частинок у рослинні тканини та клітини. Див., наприклад, патенти США МоМо 4945050; 5036006 і 5100792. Загалом цей спосіб включає впровадження в рослинні клітини інертних або біологічно активних частинок в умовах, ефективних для проникнення крізь зовнішню поверхню клітини та можливості включення в її внутрішню частину. У разі застосування інертних частинок вектор можна вводити в клітину шляхом покривання частинок вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка становить інтерес. Альтернативно клітина або клітини можуть бути оточені вектором таким чином, щоб вектор переносився у клітину слідом за частинкою. Біологічно активні частинки (наприклад, висушену дріжджову клітину, висушену бактерію або бактеріофаг, кожен(кожна) з яких містить(- ять) одну або декілька нуклеїнових кислот, які підлягають введенню) також можна впроваджувати в рослинну тканину.

В інших варіантах здійснення полінуклеотид за даним винаходом можна безпосередньо

Зо вводити в геном пластид шляхом трансформації. Основна перевага трансформації пластид полягає в тому, що пластиди, як правило, здатні експресувати бактеріальні гени без істотної модифікації, причому пластиди здатні експресувати декілька відкритих рамок зчитування під контролем одного промотора. Технологія трансформації пластид докладно описана в патентах

США МоМо 5451513, 5545817 і 5545818, у заявці згідно з РСТ Мо УМО 95/16783 та в МеВгіає еї аї. (1994) Ргос. Маїї. Асад. сі. ОБА 91, 7301-7305. Основна методика трансформації хлоропластів включає введення ділянок клонованої пластидної ДНК, що фланкують селектовний маркер, разом із геном, що становить інтерес, у придатну цільову тканину, наприклад, із застосуванням біолістики або трансформації протопластів (наприклад, трансформації, опосередкованої хлоридом кальцію або РЕС). Фланкувальні ділянки розміром 1-1,5 т. 0о., які називаються націлювальними послідовностями, сприяють гомологічній рекомбінації з геномом пластид і таким чином забезпечують заміщення або модифікацію специфічних ділянок пластому.

Спочатку як селектовний маркер для трансформації можна застосовувати точкові мутації в 165

ГЕМА і генах гр512 хлоропластів, що надають стійкості до спектиноміцину або стрептоміцину (ема, 2., На)дикКіем/сг, Р., апа Маїїда, Р. (1990) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 87, 8526-8530; єїацйб,

У. М., апа Маїїда, Р. (1992) Ріапі Сеї! 4, 39-45). Наявність сайтів клонування між даними маркерами дає змогу створювати вектор, націлений на пластиди, для введення чужорідних генів (еїацйбр, 9У.М., апа Маїїда, Р. (1993) ЕМВО .. 12, 601-606). Суттєве підвищення частоти трансформації можна одержати шляхом заміщення рецесивних генів ГКМА або г-білка, що забезпечують стійкість до антибіотиків, на домінантний селектовний маркер, бактеріальний ген аадА, що кодує фермент аміноглікозид-3'-аденілтрансферазу, що знешкоджує спектиноміцин (бЗмабр, 7., апа Маїїда, Р. (1993) Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 90, 913-917). Раніше цей маркер із успіхом застосовували для трансформації геному пластид зеленої водорості Спі(іатудотопав геіппагайії з високою частотою (Соїд5зсптідіСІептиопі, М. (1991) Мисі. Асіа5 Вев. 19:4083-4089).

Інші селектовні маркери, які застосовують для трансформації пластид, відомі з рівня техніки, і вони включені в обсяг даного винаходу. Як правило, для досягнення стану, за якого всі пластиди є ідентичними, необхідно близько 15-20 циклів поділу клітин після трансформації. Під час експресії в пластидах, за якої гени вставлені за допомогою гомологічної рекомбінації у всі декілька тисяч копій кільцевого пластидного геному, наявного в кожній рослинній клітині, застосовують перевагу великої кількості копій порівняно з генами, що експресуються в ядрі, що бо допускає рівні експресії, які легко можуть перевищувати 10 95 загальної кількості розчинних рослинних білків. В одному варіанті здійснення полінуклеотид за даним винаходом може бути вставлений у вектор, націлений на пластиди, і введений у геном пластид потрібної рослини- хазяїна шляхом трансформації. Таким чином, можна одержати рослини, гомопластичні щодо геномів пластид, які містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом, здатні експресувати полінуклеотид на високому рівні.

Способи відбору трансформованих трансгенних рослин, рослинних клітин або культур рослинних тканин є звичайними в рівні техніки та можуть застосовуватися в способах даного винаходу, передбачених у даному документі. Наприклад, рекомбінантний вектор згідно з даним винаходом також може включати касету експресії, що містить нуклеотидну послідовність селектовного маркера, який можна застосовувати для відбору трансформованої рослини, частини рослини або рослинної клітини.

Додатково, як добре відомо з рівня техніки, цілі трансгенні рослини можна регенерувати із трансформованих рослинних клітин, культур рослинних тканин або культивованих протопластів за допомогою будь-якої із багатьох відомих методик. Регенерація рослин із рослинних клітин, культури рослинної тканини або культивованих протопластів описана, наприклад, в Емапз еї аї. (Напабосок ої Ріапі СеїЇ СиКигев5, Мої. 1, Масміїап Рибіїзпіпд Со. Мем ХогКк (1983)) і Мавії І. К. (ейд.) (Сеїї Сийите апа ботаїййс СеїЇ Сепеїйсв ої Ріапіб5, Асад. Рге55, Опападо, Мої. І (1984), апа Мої. Ії (1986)).

Крім того, вищеописані властивості генів, забезпечені за допомогою методів генної інженерії у трансгенному насінні та рослинах, частинах рослини або рослинних клітинах за даним винаходом, можуть передаватися шляхом статевого розмноження або вегетативного росту та, відповідно, можуть підтримуватися та спадково передаватися рослинам-потомкам. Як правило, під час підтримування та спадкового передавання застосовують відомі сільськогосподарські способи, розроблені для відповідності конкретним цілям, таким як збір урожаю, сівба або обробка.

Відповідно, полінуклеотид можна вводити в рослину, частину рослини або рослинну клітину за допомогою будь-якого з кількох способів, добре відомих із рівня техніки, як описано вище.

Відповідно, не додержуються будь-якого конкретного способу введення одного або декількох полінуклеотидів у рослину, а, навпаки, можна застосовувати будь-який спосіб, що забезпечує

Зо стабільну інтеграцію одного або декількох полінуклеотидів у геном рослини. Якщо потрібно ввести більш ніж один полінуклеотид, то відповідні полінуклеотиди можна зібрати як частину однієї молекули нуклеїнової кислоти або як окремі молекули нуклеїнових кислот і можна розташувати в межах тієї самої або різних молекул нуклеїнових кислот. Відповідно, введення полінуклеотидів у клітину, що становить інтерес, можна здійснювати під час однієї події трансформації, під час окремих подій трансформації або, наприклад, у рослини у вигляді частини протоколу схрещування.

Після того як потрібний полінуклеотид був введений у конкретний вид рослини шляхом трансформації, за допомогою традиційних методик розмноження він може передаватися в межах даного виду або переходити в інші різновиди того самого виду, зокрема такі, що включають комерційні різновиди.

Інсектицидні композиції

У деяких варіантах здійснення даного винаходу передбачена інсектицидна композиція, що містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом в прийнятному з погляду сільського господарства носієві. Застосовуваний у даному документі вираз "прийнятний із погляду сільського господарства носій" може включати природний або синтетичний, органічний або неорганічний матеріал, який об'єднують з активним білком для полегшення його застосування щодо рослини або її частини або в них. Приклади прийнятних із погляду сільського господарства носіїв включають без обмеження порошки, дусти, пелети, гранули, аерозолі, емульсії, колоїди та розчини. Прийнятні з погляду сільського господарства носії додатково включають без обмеження інертні компоненти, диспергувальні засоби, поверхнево- активні речовини, допоміжні засоби, речовини для підвищення клейкості, клейкі речовини, зв'язувальні речовини або їхні комбінації, які можна застосовувати у складах, що застосовують у сільському господарстві. Такі композиції можна застосовувати будь-яким способом, за допомогою якого пестицидні білки або інші засоби для контролю шкідників приводять у контакт із шкідниками. Відповідно, композиції можна наносити на поверхні рослин або частини рослин, у тому числі на насіння, листя, квіти, стебла, бульби, коріння тощо. В інших варіантах здійснення рослина, що продукує інсектицидний білок згідно з даним винаходом іп ріапіа, являє собою прийнятний із погляду сільського господарства носій для інсектицидного білка, що експресується. У варіантах здійснення композиції та прийнятні з погляду сільського 60 господарства носії згідно з даним винаходом виключають трансгенні рослини.

У додаткових варіантах здійснення інсектицидна композиція містить бактеріальну клітину або трансгенну бактеріальну клітину згідно з даним винаходом, де бактеріальна клітина або трансгенна бактеріальна клітина продукують інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

Таку інсектицидну композицію можна одержати шляхом висушування, ліофілізації, гомогенізації, екстрагування, фільтрування, центрифугування, осадження або концентрування культури

ВасішШив І(ВПигіпдіепбоіз (ВО, у тому числі трансгенної культури Ві. У варіантах здійснення композиція згідно з даним винаходом може містити щонайменше приблизно 1 9565, щонайменше приблизно 5956, щонайменше приблизно 1095, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 25 95, щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 35 95, щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 50 9565, щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше приблизно 95 9565, щонайменше приблизно 97 956 або щонайменше 99 95 за вагою поліпептиду згідно з даним винаходом. У додаткових варіантах здійснення композиція містить від приблизно 1 95 до приблизно 99 95 за вагою інсектицидного білка згідно з даним винаходом.

Інсектицидні білки згідно з даним винаходом можна застосовувати в комбінації з іншими засобами для контролю шкідників для розширення спектра цільових шкідників і/або для запобігання стійкості комах або керування нею. Крім того, застосування інсектицидних білків згідно з даним винаходом у комбінації з інсектицидним засобом, який характеризується відмінним механізмом дії або цілеспрямовано діє на інший рецептор у кишківнику комахи, характеризується особливою корисністю для запобігання стійкості у комах і/або керування нею.

Отже, у деяких варіантах здійснення даного винаходу передбачена композиція, яка забезпечує контроль одного або декількох шкідників рослин (наприклад, комахи-шкідника, такої як комаха-шкідник, що належить до лускокрилих, комаха-шкідник, що належить до твердокрилих, комаха-шкідник, що належить до напівтвердокрилих, і/або комаха-шкідник, що належить до двокрилих), де композиція містить перший засіб для контролю шкідників, який являє собою химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, і щонайменше другий засіб для контролю шкідників, який відрізняється від першого засобу для контролю шкідників. В інших варіантах здійснення композиція являє собою склад для місцевого нанесення на рослину.

У ще одних варіантах здійснення композиція являє собою трансгенну рослину. У додаткових

Зо варіантах здійснення композиція являє собою комбінацію, що передбачає склад і трансгенну рослину, на яку він наноситься. У деяких варіантах здійснення склад містить перший засіб для контролю шкідників, який являє собою химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, якщо трансгенна рослина містить другий засіб для контролю шкідників. В інших варіантах здійснення склад містить другий засіб для контролю шкідників, якщо трансгенна рослина містить перший засіб для контролю шкідників, який являє собою химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

У деяких варіантах здійснення другий засіб для контролю шкідників може являти собою одне або декілька з хімічного пестициду, такого як інсектицид, інсектицидного білка Васійи5

ІШигіпдіепоіє (ВО і/або пестицидного засобу із джерела, відмінного від Ві, у тому числі без обмеження інсектицидного білка Хепогпардих, інсектицидного білка РПобогпараив, інсектицидного білка Вгемібасійй5 Іаїегозроги5, інсектицидного білка Васійи5 з5рпаеєгісив, інгібітора протеаз (як серинових, так і цистеїнових типів), лектину, альфа-амілази, пероксидази, холестериноксидази або молекули двониткової РНК (й5КМА).

В інших варіантах здійснення другий засіб для контролю шкідників являє собою один або декілька хімічних пестицидів, які необов'язково являють собою покриття для насіння.

Необмежувальні приклади хімічних пестицидів включають піретроїди, карбамати, неонікотиноїди, блокатори нейрональних натрієвих каналів, інсектицидні макроциклічні лактони, антагоністи гамма-аміномасляної кислоти (САВА), інсектицидні різновиди сечовини й імітатори ювенільних гормонів. В інших варіантах здійснення хімічний пестицид являє собою одне або декілька з абамектину, ацефату, ацетаміприду, амідофлумету (5-1955), авермектину, азадирахтину, азинфосметилу, біфентрину, бінфеназату, бупрофезину, карбофурану, хлорфенапіру, хлорфлуазурону, хлорпірифосу, хлорпірифосметилу, хромафенозиду, клотіанідину, цифлутрину, бета-цифлутрину, цигалотрину, лямбда-цигалотрину, циперметрину, циромазину, дельтаметрину, діафентіурону, діазинону, дифлубензурону, диметоату, діофенолану, емамектину, ендосульфану, есфенвалерату, етипролу, фенотикарбу, феноксикарбу, фенпропатрину, фенпроксимату, фенвалерату, фіпронілу, флонікаміду, флуцитринату, тау-флювалінату, флуфенериму (ШК-50701), флуфеноксурону, фонофосу, галофенозиду, гексафлумурону, імідаклоприду, індоксакарбу, ізофенфосу, луфенурону, малатіону, метальдегіду, метамідофосу, метидатіону, метомілу, метопрену, метоксихлору, бо монокротофосу, метоксифенозиду, нітіазину, новалурону, новіфлумурону (ХОЕ-007), оксамілу,

паратіону, паратіонметилу, перметрину, форату, фозалону, фосмету, фосфамідону, піримікарбу, профенофосу, піметрозину, піридалілу, пірипроксифену, ротенону, спіносаду, спіромезифену (В5М 2060), сульпрофосу, тебуфенозиду, тефлубензурону, тефлутрину, тербуфосу, тетрахлорвінфосу, тіаклоприду, тіаметоксаму, тіодикарбу, тіосултап натрію, тралометрину, трихлорфону та трифлумурону, алдикарбу, оксамілу, фенаміфосу, амітразу, хінометіонату, хлоробензилату, цигексатину, дикофолу, дієнохлору, етоксазолу, феназаквіну, оксиду фенбутатину, фенпропатрину, фенпіроксимату, гекситіазоксу, пропаргіту, піридабену та тебуфенпіраду. У ще одних варіантах здійснення хімічний пестицид вибраний із одного або декількох із циперметрину, цигалотрину, цифлутрину та бета-цифлутрину, есфенвалерату, фенвалерату, тралометрину, фенотикарбу, метомілу, оксамілу, тіодикарбу, клотіанідину, імідаклоприду, тіаклоприду, індоксакарбу, спіносаду, абамектину, авермектину, емамектину, ендосульфану, етипролу, фіпронілу, флуфеноксурону, трифлумурону, діофенолану, пірипроксифену, піметрозину й амітразу.

У додаткових варіантах здійснення другий засіб для контролю шкідників може являти собою один або декілька із будь-якого числа інсектицидних білків Васійи5 ІПигіпдіепві5, у тому числі без обмеження білок Сгу, вегетативний інсектицидний білок (МІР) та інсектицидні химерні варіанти будь-якого з вищеперелічених інсектицидних білків. В інших варіантах здійснення другий засіб для контролю шкідників являє собою білок Сгу, вибраний з СтуїАа, СтутАбБ, СтутАс, Стут Аа,

СтутАеє, СтутАї, Сту1А9д, СтутАН, СтутАї, СтутАЇ, Сту!Ва, Сту! ВЬ, Сту!Вс, Сту1Ва, СтуїВе, Сту1 Ві,

СтуїВа, СтуїВи, СтуїВі, СтуїСа, Сту!СЬ, СтуїСа, Стут1оОр, СтуїОс, Стуїра, СтуїЕа, СтутЕБ,

СтуїРа, СтутЕр, СтуїсСса, Стутср, Стутсс, СтуїНа, Стуї Не, СтуїНс, СтутІа, СУТЬ, СтутіІс, Стутіа,

Стуте, СтулІї СтутІід, Стуїда, СтутоВ, Стутус, Стутда, СтуїКа, СтуїГ а, Сту!Ма, СтуїМа, Стуїт М,

СтугАа, СтугАБЬ, СтугАс, Стуглй, СтугАеє, СтугАї, СтугА9д, Сту2Ан, СтугАї, СтугАЇ, СтугАК, СтугАЇ,

СтугВа, СтуЗзЗАа, СтуЗВа, СтуЗзвВЬ, СтуЗСа, Студ4Аа, СтудВа, СтудСа, Сту4СЬ, Студбс, СтубАа,

СтубБАБ, СтубАс, СтубБАй, СтубВа, СтубСа, СтубОра, СтубЕа, СтубАа, СтубВа, Сту/Аа, Сту7АБ,

Сту7Ас, Сту/Ва, Сту7ВЬ, Сту/Са, Сту7/СЬ, Сту7Ора, Сту7/Еа, Сту/Ра, Сту/Бгр, Сту/Са, Сту7 сь,

Сту7/Ссс, Сту/са, Сту7На, Сту/а, Сту/Уа, Сту/7Ка, Сту/КЬ, Сту/Га, СтувАа, СтувАБ, СтувАс,

Стувда, СтувВа, СтуввВЬ, СтувВс, СтувСа, Стувра, СтуврЬ, СтувЕа, СтувРа, СтувСа, СтувНа,

Стувіа, Стувір, Стувуа, СтувКа, СтувкКЬ, Стувіа, СтувМа, СтувМа, СтувРа, СтувОа, СтувВа,

СтувбЗа, СтувТа, СтудАа, СтубВа, Сту9вВр, СтудСа, Студора, Сту9ОрЬ, СтубдОс, СтуЗдЕа, СтузЕб,

СтуЗЕс, Сту9Ей, Сту9Еє, СтудРа, Студса, СтутбОАа, Сту!тАа, Сту!1Ва, Стуї1ВЬ, Сту12Аа,

Стуї1ЗАа, Сту14Аа, Сту14АБр, Сту15Аа, Сту1бАа, Сту17Аа, Сту18Аа, Сту18Ва, Сту!вСа, Сту19Аа,

Сту19Ва, Сту19Са, СтугодАа, СтугоВа, СтугіАа, СтугіВа, СтугіСа, Стугіра, СтугіЕа, СтудігГа,

СтугісСа, СтугіНа, Стуг2Аа, Стуг2АбВ, Стуг2Ва, Стуг2врЬ, Стуг3Аа, СтугіАа, Стуг4Ва, Стуг4іСа,

Стуг5Аа, Стуг2бАа, Стуг2г7Аа, СтугвАа, СтугоАа, Сту2оВа, СтузоАа, СтузоВа, СтузоСа, Стузоба,

СтузорЬь, СтузоЕа, СтузоРа, СтузосСа, СтуЗзіАа, СтуЗзтАБ, СтуЗз1тАс, Стузі ла, СтуЗзгАа, Стуз2 АБ,

Стуз2гВа, СтуЗз2гСа, СтуЗз2СЬ, СтуЗзгра, СтуЗз2Еа, СтуЗ2ЕБВ, СтуЗз2Ра, Стуз2гсза, СтуЗз2На, СтузаНЬ,

СтуЗагіІа, СтуЗзгоа, СтуЗз2Ка, СтуЗ2І а, Стуз2Ма, СтуЗз2МЬ, СтуЗза2аМа, СтузгОа, СтуЗз2гРа, СтуЗзгоОа,

Стуз2Ва, СтуЗз2гза, СтуЗз2гТа, Стуз2гОа, СтузЗзАа, СтуЗзаАа, СтуЗза Ар, СтуЗз4 Ас, СтуЗзаВа, СтузЗбАа,

СтуЗБАБ, СтузбБАс, СтуЗзоВа, СтуЗзбАа, СтуЗ7Аа, СтузвАа, СтуЗзУАа, СтудоАа, СтудоВа, СтудосСа,

Студ4оба, Студ Аа, Студт АБ, Студ1Ва, Студ2Аа, СтудЗАа, СтудЗВа, СтудЗСа, Сту43СЬ, Сту4ЗСс,

Сту44Аа, Студ5Аа, Сту4бАа Сту4бАБ, Сту47Аа, Сту4вАа, Сту4вАБ, Сту49Аа, Сту49АБ, Стубода,

СтубоВа, СтубіАа, Стуб2Аа, Стуб2Ва, СтубзЗАа, СтубзЗАБ, Стуба4Аа, Стуб4 Ар, СтубаВа, СтубблАа,

СтуббАа, Стуб7Аа, Стуб57АБЬ, Стуб5вАа, Стуб9Аа, Стубз9Ва, СтубоАа, СтубоВа, СтубіАа, СтубгАа,

СтубЗАа, Стуб4Аа, СтуббАа, СтуббАа, Стуб7Аа, СтубвАа, СтубоАа, Стуб9АБ, Сту7/0Аа, Сту7ОВа,

Сту7овЬ, Сту/1Аа, Сту7/2Аа, Стгу/ЗАа, або будь-якої комбінації вищевказаного. У варіантах здійснення білок Сгу являє собою Сгуї1Ра, наприклад, як представлено в трансформанті маїсу

ТО1507.

У додаткових варіантах здійснення другий засіб для контролю шкідників являє собою один

БО або декілька вегетативних інсектицидних білків Мір3, вибраних з МірзАа1, МірзАаг, мірзАаз,

МірзАа4, МірзАаб5, МірзАаб, МірзЗАа7, МірзАав, МірзАа9, МірзАа1!0, МірзАа!!, МірзАа12,

МірзАа13, МірзАа14, МірзАа15, МірзАа16, МірзАа17, МірзАа18, МірзАа19, МірзАаг0о, МірзАа?д 1,

МірзАа22, МірзАа2, МірзАа24, МірзАа25, МірзАа26б, МірзАа27, МірзАа28, МірзАаг29, МірзАазо,

МірзАаз1, МірзАаз2, МірзАа33, МірзАа34, МірзАаз35, МірзАазб, МірзАа37, МірзАа38, МірзАаз39,

МірзАа40, МірзАа4!, МірзАа42, МірзАа43, МірзАа44, МірзАБІ, МірзАБ2, МірзАс1і, Мірзда!,

Мірздаг, МірзАєї, МірзАй, МірзАтТ2, МірзАт, МірзАа1! МірзАд2,МірзАдЗ НМ117633, МірзАа4,

МірзАд5, мМірзАй!, МмірзВа!, МірзВа2, мірзвЬ1, мірзвЬ2, мМірзвр3, або будь-якої комбінації вищевказаного. У варіантах здійснення білок Мір3 являє собою МірзАа (патент США Мо 6137033), наприклад, як представлено в трансформанті кукурудзи МІК162 (патент США Мо 60 8232456; патент США Мо 8455720 і патент США Мо 8618272).

У варіантах здійснення другий засіб для контролю шкідників може бути одержаний із джерел, відмінних від В. (Пигіпдіеп5і5. Наприклад, другий засіб для контролю шкідників може являти собою альфа-амілазу, пероксидазу, холестериноксидазу, пататин, протеазу, інгібітор протеази, уреазу, інгібітор альфа-амілази, пороутворювальний білок, хітиназу, лектин, сконструйоване антитіло або фрагмент антитіла, інсектицидний білок ВасішШи5 сегецв5, інсектицидний білок Хепогпарадиз» 5рр. (такий як Х. петаїйорпйа або Х. ромієпії), інсектицидний білок Рпоїогпардиє 5рр. (такий як Р. Іштіпезсеп5 або Р. азуторбіоїіса), інсектицидний білок

Вгемірасійи5 5рр. (такий як В. Іа(его5рогоц5), інсектицидний білок І узіпібасійн5 5рр. (такий як Ї. 5рпеагіси5), інсектицидний білок Спготобасіегішт 5рр. (такий як С. 5,ирізхидає або С. різсіпає), інсектицидний білок Уегвіпіа 5рр. (такий як У. епіоторпада), інсектицидний білок Раєпірасіи5 5рр. (такий як Р. ргоруїаєа), інсектицидний білок Сіовігідічшт 5рр. (такий як С. Бітегтепіапв),

Рзейдотопазх 5рр. (такий як Р. Пиогезсепв) і лігнін. В інших варіантах здійснення другий засіб може являти собою щонайменше один інсектицидний білок, одержаний з інсектицидного токсинового комплексу (Тс) з Рпоїогпавради», Хепогпарив, Зеїтайа або МУегзіпіа. В інших варіантах здійснення інсектицидний білок може являти собою АЮР-рибозилтрансферазу, одержану з інсектицидних бактерій, таких як Рпоїогпарадиз» 55р. В інших варіантах здійснення інсектицидний білок може являти собою білок МІР, такий як МІР1 та/або МІРІ з В. сегеи5. У ще одних варіантах здійснення інсектицидний білок може являти собою бінарний токсин, одержаний з інсектицидних бактерій, такий як ІРА і І5РІА з В. Іагегозрогоци5 або ВіпА і ВіпВ з Г. 5рпаєгіси5. У ще одних варіантах здійснення інсектицидний білок може бути сконструйованим або може бути гібридом або химерою на основі будь-яких з попередніх інсектицидних білків.

У деяких варіантах здійснення другий пестицидний засіб може бути небілковим, наприклад, молекула інтерферувальної РНК, така як а5КМА, яка може експресуватися трансгенно або застосовуватися як частина композиції (наприклад, із застосуванням способів місцевого нанесення). Як правило, інтерферувальна РНК містить щонайменше фрагмент РНК, що відповідає цільовому гену, спейсерну послідовність і другий фрагмент РНК, який є комплементарним першому, завдяки чому може утворюватись двониткова структура РНК. РНК- інтерференція (ЕМАЇї) відбувається, коли організм розпізнає молекули двониткової РНК (й5КМА) і гідролізує їх. Одержані продукти гідролізу являють собою невеликі фрагменти РНК довжиною

Зо приблизно 19-24 нуклеотиди, які називаються малими інтерферувальними РНК (5ікМА). Потім 5ікМА поширюються або розносяться по всьому організму, зокрема через клітинні мембрани, де вони гібридизуються з теЕМА (або іншими РНК) і викликають гідроліз РНК. Інтерферувальні РНК розпізнаються комплексом сайленсингу РНК-інтерференції (КІЗС), в який уводиться ефекторна нитка (або "напрямна нитка") РНК. Ця напрямна нитка слугує матрицею для розпізнавання й руйнування послідовностей дуплекса. Цей процес повторюється щоразу, коли 5зікМА гібридизується з комплементарною їй цільовою РНК, що ефективно попереджає трансляцію таких теМА, й у такий спосіб забезпечує "сайленсинг" експресії конкретних генів, з яких були транскрибовані теМА. Із рівня техніки відомо, що інтерферувальні РНК є застосовними для контролю комах (див., наприклад, публікацію УМО 2013/192256, включену в даний документ за допомогою посилання). Інтерферувальна РНК, призначена для застосування у контролі комах, забезпечує одержання двониткової РНК, що не існує в природі, яка користується нативними шляхами КМАї у комахи для запускання пригнічення експресії цільових генів, що може зумовлювати припинення живлення та/або росту та може зумовлювати загибель комахи- шкідника. Молекула інтерферувальної РНК може надавати стійкості до комах щодо того самого цільового шкідника, що і білок за даним винаходом, або може цілеспрямовано впливати на іншого шкідника. Цільова комаха-шкідник рослини може живитися шляхом жування, смоктання або пронизування. Із рівня техніки відомо, що інтерферувальні РНК є застосовними для контролю комах. У варіантах здійснення а5КМА, застосовна для контролю комах, описана в попередніх заявках на патент США МоМо 62/371259, 62/371261 або 62/371262, поданих 5 серпня 2016 р. У варіантах здійснення а5КМА, застосовна для контролю комах, описана в патентах

США МоМо 92388223, 9340797 або 8946510. У варіантах здійснення а5КМА, застосовна для контролю комах, описана в заявках на патент США МоМо 12/868994, 13/831230, 14/207313 або 14/207318. В інших варіантах здійснення інтерферувальна РНК може надавати стійкості до шкідника рослин, відмінного від комахи, такого як нематода-шкідник або вірус-шкідник.

У ще додаткових варіантах здійснення перший засіб для контролю комах, який являє собою химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, і другий засіб для контролю шкідників коекспресуються в трансгенній рослині. Такої коекспресії більш ніж одного пестицидного компонента у тій самій трансгенній рослині можна досягти шляхом одержання рослини, що містить і експресує послідовності нуклеїнових кислот, що кодують засоби для контролю комах, 60 за допомогою способів генної інженерії. Наприклад, коекспресії більш ніж одного пестицидного засобу в тій самій трансгенній рослині можна досягти шляхом одержання одинарного рекомбінантного вектора, що містить послідовності, що кодують більш ніж один пестицидний засіб, в "молекулярному пакеті", та одержання рослини, що містить і експресує всі ці пестицидні засоби в трансгенній рослині, за допомогою способів генної інженерії. Такі молекулярні пакети також можна одержати із застосуванням мініхромосом, які описані, наприклад, у патенті США Мо 7235716. Як альтернатива, батьківська рослина 1 може бути одержана за допомогою способів генної інженерії для експресії химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом. Друга батьківська рослина 2 може бути одержана за допомогою способів генної інженерії для експресії другого засобу для контролю шкідників. Шляхом схрещування батьківської форми 1 з батьківською формою 2 одержують рослини-потомки, які експресують обидва засоби для контролю комах від батьківських форм 1 і2.

В інших варіантах здійснення даного винаходу передбачена трансгенна рослина з пакетованими ознаками, стійка до ураження шкідниками рослин, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК), що кодує а5КМА для супресії істотно важливого гена в організмі цільового шкідника, та послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК), що кодує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, що проявляє інсектицидну активність щодо цільового шкідника. Було повідомлено, що азКМА є неефективними проти певних лускокрилих шкідників (Ваіадорої єї а). 2002. 9. Віої. Спет. 277:468-494), ймовірно, через високий показник рН у середній кишці, що дестабілізує 45ЕМА. Отже, у деяких варіантах здійснення, у яких цільовий шкідник є шкідником, що належить до лускокрилих, химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом діє для тимчасового зниження показника рН у середній кишці, який забезпечує стабілізацію, що одночасно поглинається азКМА, роблячи а5КМА ефективною в сайленсингу генів-мішеней.

Трансгенні рослини або насінину, що містять і/або що експресують інсектицидний білок згідно з даним винаходом, також можна обробити інсектицидом або інсектицидним покриттям для насіння, як описано в патентах США МоМо 5849320 і 5876739. У варіантах здійснення, якщо як інсектицид або інсектицидне покриття для насіння, так і трансгенна рослина або насінина згідно з даним винаходом є активними щодо тієї самої цільової комахи, наприклад, шкідника, що належить до лускокрилих (наприклад, совки трав'яної), то комбінація є застосовною (ії) у способі додаткового посилення активності композиції згідно з даним винаходом щодо цільової комахи та/або (ії) у способі запобігання розвитку стійкості до композиції згідно з даним винаходом шляхом забезпечення ще одного механізму дії щодо цільової комахи. Таким чином, у варіантах здійснення даного винаходу передбачений спосіб підвищення контролю популяції комах, що належать до лускокрилих, що включає одержання трансгенної рослини або насінини згідно з даним винаходом і застосування щодо рослини або насінини інсектициду або інсектицидного покриття для насіння щодо трансгенної рослини або насінини згідно з даним винаходом.

Навіть у випадку, якщо інсектицид або інсектицидне покриття для насіння є активними щодо іншої комахи, інсектицид або інсектицидне покриття для насіння є придатними для розширення діапазону контролю комах, наприклад, за допомогою додавання інсектициду або інсектицидного покриття для насіння, які характеризуються активністю щодо комах, що належать до твердокрилих, до трансгенної насінини згідно з даним винаходом, яка в деяких варіантах здійснення характеризується активністю щодо комах, що належать до лускокрилих, при цьому одержане покрите трансгенне насіння забезпечує контроль комах-шкідників, що належать як до лускокрилих, так і до твердокрилих.

Способи одержання та застосування химерних інсектицидних білків, нуклеїнових кислот і трансгенних рослин

Даний винахід також охоплює способи одержання трансгенної рослини, стійкої до комах (наприклад, стійкої до комах, що належать до лускокрилих). В ілюстративних варіантах здійснення спосіб включає введення в рослину полінуклеотиду, касети експресії або вектора згідно з даним винаходом, що містять нуклеотидну послідовність, яка кодує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом (у тому числі токсинові фрагменти й модифіковані форми, які по суті є ідентичними до поліпептидів, конкретно розкритих у даному документі), де нуклеотидна послідовність експресується в рослині з одержанням химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом, завдяки чому забезпечується стійкість рослини до комахи-шкідника й одержання стійкої до комах трансгенної рослини (наприклад, порівняно з придатною контрольною рослиною, такою як рослина, яка не містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом і/або не експресує поліпептид згідно з даним винаходом).

У варіантах здійснення спосіб уведення полінуклеотиду, касети експресії або вектора згідно 60 з даним винаходом в рослину включає спочатку трансформування рослинної клітини за допомогою полінуклеотиду, касети експресії або вектора та регенерування трансгенної рослини з неї, де трансгенна рослина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і експресує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

Альтернативно або додатково стадія введення може включати схрещування першої рослини, що містить полінуклеотид, касету експресії або вектор, із другою рослиною (наприклад, рослиною, відмінною від першої рослини, наприклад, рослиною, яка не містить полінуклеотиду, касети експресії або вектора) і необов'язково одержання рослини-потомка, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і експресує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, з одержанням у результаті підвищеної стійкості до щонайменше однієї комахи-шкідника. Таким чином, трансгенна рослина згідно з даним винаходом охоплює рослину, яка є безпосереднім результатом події трансформації, та її потомка (будь-якого покоління), що містять полінуклеотид, касету експресії або вектор і необов'язково експресують химерний інсектицидний білок, що зумовлює підвищену стійкість до щонайменше однієї комахи- шкідника.

У даному винаході додатково передбачений спосіб ідентифікації трансгенної рослини згідно з даним винаходом, який включає виявлення наявності полінуклеотиду, касети експресії, вектора або химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом в рослині (або рослинній клітині, частині рослини тощо, одержаних з неї), й ідентифікацію у такий спосіб рослини як трансгенної рослини згідно з даним винаходом на підставі наявності полінуклеотиду, касети експресії, вектора або химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом.

У даному винаході додатково передбачений спосіб одержання трансгенної рослини з підвищеною стійкістю щодо щонайменше однієї комахи-шкідника (наприклад, щонайменше одного шкідника, що належить до лускокрилих), при цьому спосіб включає висівання насінини, що містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, і вирощування трансгенної рослини з насінини, де трансгенна рослина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і продукує химерний інсектицидний білок.

У варіантах здійснення трансгенні рослини, одержані за допомогою способів згідно з даним винаходом, містять полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом. У варіантах здійснення трансгенна рослина, одержана за допомогою способів згідно з даним винаходом, містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і необов'язково характеризується підвищеною стійкістю щодо щонайменше однієї комахи-шкідника.

Способи одержання трансгенної рослини, описані в даному документі, необов'язково включають додаткову стадію збирання насінини від трансгенної рослини, де насінина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і продукує химерний інсектицидний білок.

Необов'язково з насінини одержують додаткову трансгенну рослину, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і продукує химерний інсектицидний білок і, таким чином, характеризується підвищеною стійкістю щодо щонайменше однієї комахи-шкідника.

У даному винаході додатково передбачені частини рослини, рослинні клітини, органи рослини, рослинні культури, насінина, рослинні екстракти, зібрані продукти та перероблені продукти трансгенних рослин, одержаних за допомогою способів згідно з даним винаходом.

У додатковому аспекті даного винаходу також передбачений спосіб одержання насінини, при цьому спосіб включає одержання трансгенної рослини, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, і збирання насінини від трансгенної рослини, де насінина містить полінуклеотид, касету експресії, вектор і продукує химерний інсектицидний білок. Необов'язково з насінини одержують додаткову трансгенну рослину, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор і продукує химерний інсектицидний білок і, таким чином, характеризується підвищеною стійкістю щодо щонайменше однієї комахи-шкідника. В ілюстративних варіантах здійснення стадія одержання трансгенної рослини включає висівання насінини, з якої одержують трансгенну рослину.

У даному винаході додатково передбачений спосіб одержання гібридної насінини рослини, при цьому спосіб включає схрещування першої інбредної рослини, яка являє собою трансгенну рослину, що містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом і необов'язково експресує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, з іншою інбредною рослиною (наприклад, інбредною рослиною, яка не містить полінуклеотиду, касети експресії або вектора згідно з даним винаходом) і забезпечення можливості утворення гібридної насінини. Необов'язково спосіб додатково включає збирання гібридної насінини. У варіантах здійснення гібридна насінина містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, та у варіантах здійснення може додатково містити химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і мати підвищену стійкість до комахи-шкідника. У варіантах здійснення бо з гібридної насінини одержують трансгенну рослину, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, експресує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і характеризується підвищеною стійкістю до щонайменше однієї комахи-шкідника.

У деяких варіантах здійснення трансгенна рослина згідно з даним винаходом є стійкою до щонайменше однієї комахи-шкідника, що належить до лускокрилих (як описано в даному документі). У варіантах здійснення трансгенна рослина забезпечує контроль комахи-шкідника, яка являє собою совку трав'яну, або її колонії, стійких до білка МірзА (наприклад, білка МірзАа, наприклад, який експресується у трансформанті маїсу МІК162) та/або білка СтуїЕ (наприклад, білка СтуїРа, наприклад, який експресується у трансформанті маїсу ТС1507).

У додаткових варіантах здійснення спосіб контролю щонайменше однієї комахи-шкідника (наприклад, щонайменше однієї комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, такої як совка трав'яна) включає забезпечення химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом. У варіантах здійснення спосіб включає доставляння (наприклад, доставляння через ротову порожнину) в організм комахи-шкідника або в середовище її існування ефективної кількості химерного інсектицидного білка згідно з даним винаходом. Зазвичай із метою ефективності поліпептид поглинається комахою через ротову порожнину. Однак химерний інсектицидний білок можна доставляти в організм комахи за допомогою багатьох відомих способів. Способи доставляння білка в організм комахи через ротову порожнину включають без обмеження забезпечення білка (1) у трансгенній рослині, при цьому комаха з'їдає (поглинає) одну або декілька частин трансгенної рослини, поглинаючи таким чином поліпептид, який експресується в трансгенній рослині; (2) у складеній білковій композиції (композиціях), яку (які) можна застосовувати, наприклад, щодо середовища зростання комахи або включати в його склад; (3) у білковій композиції (композиціях), яку (які) можна застосовувати щодо поверхні, наприклад, шляхом обприскування поверхні частини рослини, яка (які) потім поглинаються комахою внаслідок того, що комаха з'їдає одну або декілька підданих обприскуванню частин рослини; (4) у матриці приманки або (5) за допомогою будь-якої іншої відомої з рівня техніки системи доставляння білків. Таким чином, для доставляння токсичних білків згідно з даним винаходом можна застосовувати будь-який спосіб доставляння через ротову порожнину в організм комахи.

У деяких конкретних варіантах здійснення химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом доставляється в організм комахи через ротову порожнину, наприклад, коли комаха поїдає одну або декілька частин трансгенної рослини згідно з даним винаходом.

В інших варіантах здійснення інсектицидний білок згідно з даним винаходом доставляється в організм комахи через ротову порожнину, при цьому комаха поїдає одну або декілька частин рослини, підданих обприскуванню композицією, що містить інсектицидний білок згідно з даним винаходом. Доставляння композиції згідно з даним винаходом на поверхню рослини можна здійснювати за допомогою будь-якого способу нанесення сполук, композицій, складів тощо на поверхні рослин, відомого фахівцям у даній галузі техніки. Деякі необмежувальні приклади доставляння на рослину або її частину або приведення в контакт із ними включають обприскування, обпилювання, посипання, розпилювання, зрошення туманом, дрібнодисперсне розприскування, розкидання, просочування, вприскування в грунт, введення в грунт, змочування (наприклад, оброблення коренів, грунту), заглиблення, поливання, нанесення покриття, вбирання в листя або стебла, внесення в міжряддя або оброблення насіння тощо та їхні комбінації. Ці й інші процедури приведення рослини або її частини в контакт зі сполукою (сполуками), композицією (композиціями) або складом (складами) добре відомі фахівцям у даній галузі техніки.

У додаткових варіантах здійснення даного винаходу передбачений спосіб контролю комахи- шкідника, що належить до лускокрилих, яка стійка до білка МірзА (наприклад, білка МірзлАа, наприклад, який експресується трансформантом маїсу МІК162) та/або білка СтуїЕ (наприклад, білка СтгуїРа, наприклад, який експресується трансформантом маїсу ТС1507), що включає доставляння в організм комахи, що належить до лускокрилих, або в середовище її існування ефективної кількості химерного інсектицидного білка або композиції згідно 3 даним винаходом.

В ілюстративних варіантах здійснення стійка комаха-шкідник являє собою стійку комаху- шкідника, яка являє собою совку трав'яну, або її колонію.

В інших варіантах здійснення даного винаходу передбачений спосіб запобігання розвитку стійкості в популяції цільової комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, до білка МірзА (наприклад, білка МірзАа, наприклад, який експресується трансформантом маїсу МІК162) та/або білка СтуїЕ (наприклад, білка Сгу!Ра, наприклад, який експресується трансформантом маїсу ТС1507), які експресуються у трансгенній рослині, при цьому спосіб включає доставляння в цільову популяцію трансгенної рослини, що містить полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок МірзА, та/або нуклеотидну послідовність, що кодує білок СтгуїЕ; і бо полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, що експресують химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом. У деяких варіантах здійснення цільова комаха-шкідник, що належить до лускокрилих, являє собою совку трав'яну. Згідно з вищезгаданими варіантами здійснення трансгенна рослина може містити селекційний пакет із двох або більше інсектицидних ознак, молекулярний пакет із двох або більше інсектицидних ознак або їхню комбінацію.

У деяких варіантах здійснення даний винахід охоплює спосіб надання фермеру засобів для контролю комахи-шкідника (наприклад, комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, такої як совка трав'яна), при цьому спосіб включає постачання або продаж фермеру рослинного матеріалу, такого як насінина, при цьому рослинний матеріал містить полінуклеотид, касету експресії, вектор, здатні експресувати химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом.

У варіантах здійснення рослинний матеріал містить химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і необов'язково характеризується підвищеною стійкістю до щонайменше однієї комахи-шкідника. У варіантах здійснення рослинний матеріал являє собою насінину, і рослина, вирощена з насінини, містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, експресує химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом і характеризується підвищеною стійкістю до щонайменше однієї комахи-шкідника.

Крім забезпечення композицій, у даному винаході передбачені способи продукування химерного інсектицидного білка, токсичного для шкідника, що належить до лускокрилих. Такий спосіб включає культивування трансгенної клітини-хазяїна, відмінної від клітини людини, яка містить полінуклеотид, касету експресії або вектор згідно з даним винаходом, які експресують химерний інсектицидний білок згідно з даним винаходом, в умовах, за яких клітина-хазяїн продукує химерний інсектицидний білок, токсичний для шкідника, що належить до лускокрилих.

У деяких варіантах здійснення трансгенна клітина-хазяїн, відмінна від клітини людини, являє собою рослинну клітину. У деяких інших варіантах здійснення рослинна клітина являє собою клітину маїсу. В інших варіантах здійснення умови, за яких вирощують рослинну клітину або клітину маїсу, включають природне сонячне світло. В інших варіантах здійснення трансгенна клітина-хазяїн, відмінна від клітини людини, являє собою бактеріальну клітину. У ще одних варіантах здійснення трансгенна клітина-хазяїн, відмінна від клітини людини, являє собою дріжджову клітину.

У деяких варіантах здійснення способи згідно з даним винаходом забезпечують контроль щонайменше однієї комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, у тому числі без обмеження однієї або декількох з наступного: О5ігіпіа 5рр., такий як 0. пибіїаіїї5 (кукурудзяний метелик) і/або

О. Тигпасаїїз (східний кукурудзяний метелик); Рішеїа 5рр., такий як Р. хуїозієїЇІа (міль капустяна);

Зродорієга 5рр., такий як 5. їтидірегда (совка трав'яна), 5. ІШогаїйє (совка бавовнику єгипетського), 5. огпйподаїййї (совка смугаста жовта), 5. ргаеїййса (західна совка смугаста жовта), 5. егідапіа (південна совка) і/або 5. ехідча (совка мала); Адгоїї5 5рр., такий як А. ірзіоп (совка- іпсилон), А. зедешт (озима совка звичайна), А. діадіагіа (озима совка роду Адгоїїі5) і/або А. огпподопіа (совка прямокутна); Зігіасобіа 5рр., такий як 5. аїрісобіа (західна бобова совка);

Неїїсомегра в5рр., такий як Н. леа (совка кукурудзяна), Н. рипсіїдега (совка бавовникова австралійська) і/або Н. аптідега (совка бавовникова); Неїїоїпіз 5рр., такий як Н. міге5сеп5 (тютюнова листокрутка); Оіаїгаєа 5рр., такий як 0. дгапаїозейПа (вогнівка кукурудзяна південно- західна) і/або 0. засспагаїї5 (точильник стебел цукрової тростини); Тгіспоріивіа 5рр., такий як Т. пі (совка капустяна); бЗезатіа 5рр., такий як 5. попадгоїде5 (метелик кукурудзяний середземноморський) і/або 5. саіатівіі5 (рожева стеблова совка); Ресііпорпога 5рр., такий як Р. доб55уріейа (рожевий коробковий хробак); Соспуїїє в5рр., такий як С. Ппозре5 (смугаста соняшникова міль); Мапдиса 5рр., такий як М. в5ехіа (тютюновий бражник) іабо М. диїпдиетасшиіава (бражник п'ятикрапковий); ЕіІаз:тораїризх 5рр., такий як Е. ІдпозеПи5 (точильник стебел кукурудзи малий); Рхецдорісивіа 5рр., такий як Р. іпсісдепз (соєва совка); Апіісагвіа 5рр., такий як А. деттаїаїї5 (совка оксамитових бобів); Ріаїйурепа 5рр., такий як Р. 5сабга (совка конюшинова); Ріегі5 5рр., такий як Р. Бгаз5зісає (білянка капустяна), Рараірета 5рр., такий як Р. пергіз (точильник Рараїрета пебгіб5); Рзецйда|ейца 5рр., такий як Р. ипірипсіа (совка лугова звичайна); Регідгота 5рр., такий як Р. заисіа (совка стокроткова); Кеїїегіа 5рр., такий як К.

ІусорегзісеМа (томатна гостриця); Аподеїа 5рр., такий як А. гарає (білянка ріпна); Рінпогітаєа 5рр., такий як Р. орегсцеїа (картопляна міль); Спгузодеїхі5 5рр., такий як С. іпсіцае5 (соєва совка); Рейа 5рр., такий як Р. дисеп5 (гусінь совки Рейіа |асційега); Спо з5рр., такий як с. зирргеззаїї5 (вогнівка жовта рисова), Спарпа|осгосів 5рр., такий як С. теаіпаїї5 (вогнівка рисова), або будь-якої комбінації вищевказаних. У варіантах здійснення способи згідно з даним винаходом забезпечують контроль комахи-шкідника, яка являє собою совку трав'яну, або її колонії, які є стійкими до білка МірзА (наприклад, білка МірзАа, наприклад, який експресується 60 трансформантом маїсу МІК162) та/або білка СтгуїЕ (наприклад, білка СтуїРа, наприклад, який експресується трансформантом маїсу ТС1507).

У даному винаході також передбачені шляхи застосування химерних інсектицидних білків, нуклеїнових кислот, трансгенних рослин, частин рослин, насінини й інсектицидних композицій згідно з даним винаходом, наприклад, для контролю комахи-шкідника, такої як шкідник, що належить до лускокрилих (описаний у даному документі).

СтутїЕ (кожний є описаним у даному документі).

Положення згідно з даним винаходом включають без обмеження наступне. 1. Химерний інсектицидний білок, який є токсичним для комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, який містить у напрямку від М-кінця до С-кінця: (а) М-кінцеву ділянку першого білка

Сту!, яка являє собою М-кінцеву ділянку білка ВТ-0029 під БЕО ІЮ МО:2 або амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 90 95 ідентична їй, злиту з (б) С-кінцевою ділянкою іншого білка Сгу!; де положення переходу між першим білком Сгу! та іншим білком Сгу!1 міститься в консервативному блоці 3. 2. Химерний інсектицидний білок згідно з положенням 1, де інший білок Сту! являє собою

Зо білок СтгуїЕ, Сту1б, СтутІ або СтуїК. 3. Химерний інсектицидний білок згідно з положенням 1, де інший білок Сгу! являє собою білок СгуїРа. 4. Химерний інсектицидний білок згідно з положенням 1, де інший білок Сгу! являє собою білок СтгуїІа або Стгутіг. 5. Химерний інсектицидний білок згідно з положенням 1, де інший білок Сгу! являє собою білок ВТ-0022 під ЗЕО ІЮО МО: 1. 6. Химерний інсектицидний білок згідно з положенням 1, де С-кінцева ділянка іншого білка

Сту!ї містить амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності від положення 464 до 602 5ЕО ІО МО: 8 або амінокислотній послідовності, яка на щонайменше 80 95 ідентична їй. 7. Химерний інсектицидний білок згідно з положенням 1, де С-кінцева ділянка іншого білка

Сту!ї містить амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності від положення 498 до 636 5ЕО ІЮО МО: 1 або амінокислотній послідовності, яка на щонайменше 80 95 ідентична їй. 8. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-7, де М-кінцева ділянка першого білка Стгу! містить амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності від положення 1 до 458 5ЕО ІЮО МО: 2 або амінокислотній послідовності, яка на щонайменше 90 95 ідентична їй. 9. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-8, де химерний інсектицидний білок додатково містить на М-кінці пептидильний фрагмент, який відщдеплюється від протоксину після поглинання комахою-шкідником, що належить до лускокрилих. 10. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-9, де химерний інсектицидний білок додатково містить на С-кінці хвіст протоксину з білка Сгу, який відщеплюється від протоксину після поглинання комахою-шкідником, що належить до лускокрилих. 11. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-10, де химерний інсектицидний білок містить: (а) амінокислотну послідовність від положення 1 до 597 ЗЕО ІЮ

МО: З або її токсиновий фрагмент, або (Б) амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 95 ідентична амінокислотній послідовності з (а). 60 12. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-11, де химерний інсектицидний білок містить: (а) амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮО МО: З або її токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 8095 ідентична амінокислотній послідовності з (а). 13. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-10, де химерний інсектицидний білок містить: (а) амінокислотну послідовність від положення 1 до 597 5ЕО ІЮ

МО: 9 або її токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 95 ідентична амінокислотній послідовності з (а). 14. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-10 або 13, де химерний інсектицидний білок містить: (а) амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 9 або її токсиновий фрагмент; або (Б) амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 8095 ідентична амінокислотній послідовності з (а). 15. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-14, де химерний інсектицидний білок містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: З або 5ЕО ІЮО МО: 9. 16. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-15, де химерний інсектицидний білок характеризується інсектицидною активністю щодо одного або декількох із зродорієега Ігидірегда (совка трав'яна), Спгузодеїхі5 іпсіцдев5 (совка соєва), Оіаїгаєа засспагаїїв5 (точильник стебел цукрової тростини), Оіаїгаєа дгапаїозеїйа (вогнівка кукурудзяна південно- західна) і Адгоїі5 ірхйоп (совка-іпсилон). 17. Химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-16, де химерний інсектицидний білок характеризується інсектицидною активністю щодо комахи-шкідника або колонії 5родоріега Ігидірегаа зі стійкістю до білка МірзА та/або білка СтуїР. 18. Полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-17. 19. Полінуклеотид згідно з положенням 18, де полінуклеотид є кодон-оптимізованим для експресії в рослині. 20. Полінуклеотид згідно з положенням 18 або положенням 19, де полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка містить: (а) нуклеотидну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІЮ

МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮО МО: 11 або 5ЕО ІЮ МО: 14 або її фрагмент, що кодує токсин; (Б) нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична нуклеотидній

Зо послідовності з (а); або (с) нуклеотидну послідовність, яка гібридизується за жорстких умов гібридизації з нуклеотидною послідовністю з (а) або (Б); або (4) нуклеотидну послідовність, яка відрізняється від нуклеотидних послідовностей з (а), (Б) або (с) внаслідок виродженості генетичного коду. 21. Полінуклеотид згідно з положенням 18 або положенням 19, де нуклеотидна послідовність містить нуклеотидну послідовність під зЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5, БЕО ІЮ МО: 6,

ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 10, ЗЕО ІО МО: 11 або 5ЕО ІО МО: 14. 22. Молекула нуклеїнової кислоти, яка містить полінуклеотид згідно з будь-яким із положень 18-21, функціонально пов'язаний із гетерологічним промотором. 23. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22, де гетерологічний промотор являє собою промотор, що забезпечує експресію в рослині. 24. Вектор, який містить полінуклеотид згідно з будь-яким із пунктів 18-21 або молекулу нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23. 25. Трансгенна клітина, яка містить полінуклеотид згідно з будь-яким із положень 18-21, молекулу нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23 або вектор згідно з положенням 24. 26. Трансгенна клітина згідно з положенням 25, де клітина являє собою трансгенну бактеріальну клітину. 27. Трансгенна клітина згідно з положенням 25, де клітина являє собою трансгенну рослинну клітину. 28. Трансгенна рослинна клітина згідно з положенням 27, де рослинна клітина являє собою () клітину однодольної рослини, необов'язково клітину ячменю, клітину маїсу, клітину вівса, клітину рису, клітину сорго, клітину цукрової тростини або клітину пшениці; або (її) клітину дводольної рослини, необов'язково клітину сої, клітину соняшнику, клітину томата, клітину культурного різновиду капусти, клітину бавовнику, клітину цукрового буряку або клітину тютюну. 29. Трансгенна рослина, яка містить трансгенну рослинну клітину згідно з положенням 27 або положенням 28. 30. Трансгенна рослина згідно з положенням 29, де рослина являє собою (ї) однодольну рослину, необов'язково рослину ячменю, рослину маїсу, рослину вівса, рослину рису, рослину сорго, рослину цукрової тростини або рослину пшениці; або (її) дводольну рослину, 60 необов'язково рослину сої, рослину соняшнику, рослину томата, рослину культурного різновиду капусти, рослину бавовнику, рослину цукрового буряку або рослину тютюну.

31. Трансгенна рослина згідно з положенням 28 або положенням 29, де трансгенна рослина містить додаткову нуклеотидну послідовність, що кодує другий засіб для контролю комах.

32. Трансгенна частина рослини з трансгенної рослини згідно з будь-яким із положень 29-31,

де трансгенна частина рослини містить химерний інсектицидний білок.

33. Трансгенна насінина трансгенної рослини згідно з будь-яким із положень 29-31.

34. Зібраний продукт, одержаний із трансгенної рослини згідно з будь-яким із положень 29- 31, трансгенної частини рослини згідно з положенням 32 або трансгенної насінини згідно з положенням 33, де зібраний продукт містить химерний інсектицидний білок.

35. Перероблений продукт, одержаний із зібраного продукту згідно з положенням 34, де перероблений продукт являє собою борошно, борошно грубого помелу, олію, крохмаль або продукт, одержаний з будь-чого з переліченого вище.

36. Інсектицидна композиція, яка містить химерний інсектицидний білок згідно з будь-яким із положень 1-17 і прийнятний із погляду сільського господарства носій.

37. Інсектицидна композиція згідно з положенням 36, де прийнятний із погляду сільського господарства носій являє собою порошок, дуст, пелету, гранулу, аерозоль, емульсію, колоїд або розчин.

38. Інсектицидна композиція згідно з положенням 36 або положенням 37, де композиція являє собою висушену, ліофілізовану, гомогенізовану, екстраговану, фільтровану,

центрифуговану та/або осаджену композицію та/або являє собою концентрат бактеріальної культури.

39. Інсектицидна композиція згідно з будь-яким із положень 36-38, де композиція містить трансгенну бактеріальну клітину, яка продукує химерний інсектицидний білок.

40. Інсектицидна композиція згідно з будь-яким із положень 36-39, де композиція містить від приблизно 1 95 до приблизно 99 95 за вагою химерного інсектицидного білка.

41. Інсектицидна композиція згідно з будь-яким із положень 36-40, де композиція містить другий засіб для контролю комах.

42. Спосіб одержання трансгенної рослини з підвищеною стійкістю до комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, при цьому спосіб включає введення в рослину полінуклеотиду згідно з будь-яким із положень 18-21, молекули нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23 або вектора згідно з положенням 24, де химерний інсектицидний білок експресується в рослині, з одержанням таким чином трансгенної рослини з підвищеною стійкістю до комахи-шкідника.

43. Спосіб згідно з положенням 42, де стадія введення включає (ї) трансформування рослинної клітини за допомогою полінуклеотиду, молекули нуклеїнової кислоти або вектора та регенерування трансгенної рослини; або (ії) схрещування першої рослини, що містить полінуклеотид, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор, із другою рослиною.

44. Спосіб згідно з положенням 42 або положенням 43, де спосіб додатково включає одержання рослини-потомка від трансгенної рослини, де рослина-потомок містить полінуклеотид, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор і характеризується підвищеною стійкістю до комахи-шкідника.

45. Спосіб одержання трансгенної рослини з підвищеною стійкістю до комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, при цьому спосіб включає: (а) висівання насінини, що містить полінуклеотид згідно з будь-яким із положень 18-21, молекулу нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23 або вектор згідно з положенням 24; і (Б) вирощування трансгенної рослини з насінини, де трансгенна рослина містить полінуклеотид, молекулу нуклеїнової кислоти або вектор і продукує химерний інсектицидний білок.

46. Спосіб згідно з положенням 45, де спосіб додатково включає: (с) збирання насінини від трансгенної рослини з (Б), де зібрана насінина містить химерний інсектицидний білок.

47. Спосіб одержання насінини, при цьому спосіб включає: (а) одержання трансгенної рослини, яка містить полінуклеотид згідно з будь-яким із положень 18-21, молекулу нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23 або вектор згідно з положенням 24; і (Б) збирання насінини від трансгенної рослини з (а), де зібрана насінина містить химерний інсектицидний білок.

48. Спосіб одержання гібридної насінини рослини, при цьому спосіб включає: (а) схрещування першої інбредної рослини, яка являє собою трансгенну рослину, що містить полінуклеотид згідно з будь-яким із положень 18-21, молекулу нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23 або вектор згідно з положенням 24, з іншою інбредною рослиною та (р) забезпечення можливості утворення гібридної насінини.

бо 49. Спосіб контролю комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, при цьому спосіб включає доставляння в організм комахи-шкідника або в середовище її існування композиції, яка містить ефективну кількість химерного інсектицидного білка згідно з будь-яким із положень 1-17 або інсектицидної композиції згідно з будь-яким із положень 36-41. 50. Спосіб контролю комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, стійкої до білка МірзА та/або білка СтуїЕ, при цьому спосіб включає доставляння в організм стійкої комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, або в середовище її існування інсектицидного білка згідно з будь- яким із положень 1-17 або інсектицидної композиції згідно з будь-яким із положень 36-41. 51. Спосіб зменшення розвитку стійкості до білка МірзА та/або білка СтуїЕ в популяції цільової комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, при цьому спосіб включає доставляння в цільову популяцію або в середовище її існування трансгенної рослини, що містить: (Її) полінуклеотид згідно з будь-яким із положень 18-21, молекулу нуклеїнової кислоти згідно з положенням 22 або положенням 23 або вектор згідно з положенням 24 та (ії) полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок МірзА, та/або нуклеотидну послідовність, що кодує білок Стуїї; де химерний інсектицидний білок і білок МірзА та/або білок Стгуї продукуються в трансгенній рослині. 52. Спосіб згідно з будь-яким із положень 42-51, де комаха-шкідник, що належить до лускокрилих, включає одну або декілька з 5родоріега ігидірегда (совка трав'яна), Спгузодеїхів іпсішдеб5 (совка соєва), Оіаїйгаєа 5асспага|йє (точильник стебел цукрової тростини), Оіайгаєа дгапаїіозеїІа (вогнівка кукурудзяна південно-західна) і Адгоїі5 ірзіоп (совка-іпсилон). 53. Спосіб згідно з будь-яким із положень 42-52, де комаха-шкідник, що належить до лускокрилих, включає 5родоріега ігидірегаа (совка трав'яна), яка є стійкою до білка МірзА та/або білка СтгуїР. 54. Спосіб згідно з будь-яким із положень 42-53, де рослина являє собою (ї) однодольну рослину, необов'язково рослину ячменю, рослину маїсу, рослину вівса, рослина рису, рослину сорго, рослину цукрової тростини або рослину пшениці; або (ії) дводольну рослину, необов'язково рослину сої, рослину соняшнику, рослину томата, рослину культурного різновиду капусти, рослину бавовнику, рослину цукрового буряку або рослину тютюну. 55. Спосіб згідно з будь-яким із положень 42-54, де рослина являє собою рослину маїсу.

Далі даний винахід буде описаний із посиланням на наступні приклади. Фахівцям у даній

Зо галузі техніки буде зрозуміло, що ці приклади не обмежують обсяг формули даного винаходу, а скоріше призначені бути ілюстративними для деяких варіантів здійснення. Інші варіанти здійснення даного винаходу можуть бути здійснені на практиці без відхилення від суті й обсягу даного винаходу, обсяг якого визначається даним розкриттям і доданою формулою винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Виявлення химерного білка ВТ-0029, ВІ29-ВІ22, з інсектицидною активністю щодо совки трав'яної

Два активних щодо лускокрилих білка з Васійи5 ІПигіпдіеєпвів (ВО), ВТ-0022 (5ЕО ІО МО: 1; найближчий відомий представник родини Сту-Стуї!) і ВТ-0029 (5ЕО ІО МО:2; найближчий відомий представник родини Сту-Сту1с5), були розкриті в РСТ/О516/038947.

Як показано в таблиці 1 нижче, дані щодо спектра комах для ВТ-0022 і ВТ-0029 вказують на те, що ВТ-0022 не має активності щодо совки трав'яної (ГАМУ, 5родорієега гидірегаа), а ВТ-0029 має тільки слабку активність щодо ГАМУ. Іншими протестованими комахами-шкідниками, що належать до лускокрилих, були наступні: кукурудзяний метелик (ЕСВ; Ов5ігіпіа пибііаїйв), совка- іпсилон (ВСМУ; Аагоїїв ірвзіоп), совка кукурудзяна (СЕМУ; Неїїсомегра 7єа), точильник стебел цукрової тростини (5СВ; Оіаїгаєа 5ассНагаїй5), вогнівка кукурудзяна південно-західна (5М/СВ; ріаїаєа дгапайозеПа), західна бобова совка (МУВСМУ; 5іпасовіа аїБісовзіа), соєва совка (ЗВІ;

Рзецйдоріивзіа іпсіндеп5), совка оксамитових бобів (МВС; Апіїсагзіа деттаїйаїй5) і тютюнова листокрутка (ТВМУ; Неїоїтів мігезсепв).

Таблиця 1

Інсектицидна активність ВТ-0022 і ВТ-0029 щодо різних комах, що належать до лускокрилих

ЗМУСВ | МУВСМу вт-0022| 100 | 100 / 0 |200мМ)у| 92 | 100 | 0 / лоо | о | 42(5) вт0029| 0 | 25 | 25 | 8 | з3 | 17 | мо | п00 | ч00 | мо

М - личинки середнього розміру

З - личинки малого розміру

МО - не визначено

Застосовували підхід білкової інженерії у спробі підвищити активність ВТ-0029 щодо ГАМУ. Із застосуванням ВТ-0029 як матриці створили шість сконструйованих білків шляхом заміни домену ПП (ОСІ) з ВТ-0029 доменом ПІ з іншого білка Сгу. У таблиці 2 проілюстровано шість химерних білків з інформацією щодо їхнього доменного складу. У таблиці З надана інформація про послідовність повнорозмірних білків.

Таблиця 2

Сконструйовані шляхом заміни доменів білки ВТ-0029

Назва | Домен! | Домен! | Домен | Хвіст протоксину

ВІ29-1ТАБ вт-0029 вт-0029 СтутАр вт-0029

Ві29-ВІі22 вт-0029 вт-0029 вт-0022 вт-0029

ВІ29-ВІ67 вт-0029 вт-0029 вт-0067 вт-0029

ВІ29-ВІБ1 вт-0029 вт-0029 вт-0051 вт-0029 вВі29-80 вт-0029 вт-0029 вт-0029

ВІ29-ЗА вт-0029 вт-0029 вт-0029

Таблиця З

Інформація про послідовність повнорозмірних білків

Назва (Найближчийпредставникродини Су Послідовність./-/:/ З. вт-0029 Суть ЗЕОІЮ МО: 2

СтутАь Номер доступу в Сепрапк ААА22330. 1 вт-0022 Ст ЗЕОЮО МО: 1

ВІ-0067 СтуЗЕБ МО 2016/094165

ВІ-0051 УО 2016/094159

Номер доступу в Сепрапк ВАР93483.1

Номер доступу в Сепрапк АДА22336.1

Номер доступу в Сепрапк АР362020. 1

СОМА, які кодують сконструйовані білки, синтезували в Сепем/і?7 (Саут-Плейнфілд, Нью-

Джерсі) і клонували у вектор експресії Васіїйи5 ІПигіпдіеп5і5 (ВО, що містить промотор СтуТАс і не містить термінатора. Плазмідні ДНК вводили в штам ВІ АВ227 за допомогою опосередкованої електропорацією процедури трансформації. Усі шість сконструйованих білків одержували у вигляді кристалічних білків в Ві. Кристалічні білки очищали від культур і розчиняли в буфері, що містить 50 мМ Ма»бОз, рН 11,0, 2 мМ ОТТ. Потім кожний розчинний білок оцінювали в біологічному аналізі із застосуванням комах.

Коротко кажучи, інсектицидну активність химерних білків досліджували за допомогою біологічного аналізу із застосуванням комах, що базувався на використанні штучного поживного середовища, в якому розчинені кристалічні білои наносили на поверхню штучного поживного середовища для комах у кінцевій концентрації 2-3,2 мкг/сме. Буфер (50 мМ МагСО», рН 11,0, 2

ММ ОТ), застосовуваний для розчинення кристалічних білків із Ві, слугував як негативний контроль. Повнорозмірний білок СтгуїРа (5ЕО ІО МО: 8) застосовували як позитивний контроль активності щодо РАМУ. Кожний химерний білок тестували у двох повторностях. Смертність комах оцінювали на 7-й день.

Результати показані в таблиці 4. Коли химерні білки тестували в біологічному аналізі із застосуванням комах, химера ВІ29-ВІ22 (5ЕО ІО МО: 3) продемонструвала сильну інсектицидну активність щодо ЕАМ/У, тоді як два інших химерних білка (ВІ29-ВІ67 і ВІ29-3А) показали лише незначну активність щодо шкідника. Химера Ві29-1АБ не продемонструвала будь-якої виявлюваної активності щодо ГАМУ.

У цьому тесті було одержано недостатньо білка химер ВІ29-ВІ51 і ВІ29-80 для оцінки інсектицидної активності.

Таблиця 4

Інсектицидна активність щодо совки трав'яної 5 -

Буфер(негативнийконтроль)ї 1 8 0 |В29-ВІЄЇ | -( 17 щ Ж КФ« контроль)

ВФУ-ВД2 7777777777777771111111711111111183 0 |вееЛАЮ | /77/0сСсС

ВФУ-ВІЄЇ /-//7777777777711111111111111111118 11 |веетАю | 77/07 (вФе-ВІівЇ 77777711

Приклад 2 Інсектицидна активність химерних білків ВТ-0029 щодо різних шкідників, що належать до лускокрилих

Чотири химерних білка, описаних у прикладі 1 (ВІ29-ЗА, ВІ29-ВІ22, ВІ29-1АБ і ВІ29-ВІ67), досліджували щодо їхніх видів інсектицидної активності щодо перелічених нижче шкідників, що належать до лускокрилих, із застосуванням відомих із рівня техніки способів біологічного аналізу з використанням штучного поживного середовища: точильник стебел цукрової тростини (ЗОВ; Оіаггаєа засспагії5), вогнівка кукурудзяна південно-західна (5МУСВ; Оіаїгаєа дгапаїйозейа), соєва совка (ЗВІ:; Рзецйдоріизіа іпсіцаепв), совка кукурудзяна (СЕМУ; Неїїсомегра 7єеа), тютюнова листокрутка (ТВМУУ; Неїїйоїщтів мігезсеп5), совка-іпсилон (ВСМУ; Адгоїїз ірзпйоп) і кукурудзяний метелик (ЕСВ; Оз5ігіпіа пибійаїїв).

Як показано в таблиці 5, усі чотири протестованих химерних білка зберігали сильну активність нативного ВТ-0029 щодо ЗВІ. ВІ29-ВІ22 і ВІ29-ВІ67 мали слабку активність щодо

ЗСВ порівняно з нативним ВТ-0029, тоді як ВІ29-ЗА і ВІ29-1АБ по суті втрачали всю активність щодо 5СВ. Дещо підвищену активність щодо 5УУСВ спостерігали в ВІ29-ВІб67 порівняно з повнорозмірним ВТ-0029. Узгоджуючись в достатній мірі з результатами в таблиці 1 для нативного ВТ-0029, тільки слабка активність щодо ВСМУМ спостерігалася для ВІ29-ЗА, ВІ29-ВІ22 і

ВІ29-ВІ67, і жодна з химер не мала активності щодо СЕМ, ТВУМ або ЕСВ.

Таблиця 5

Інсектицидна активність химерних білків ВТ-0029 щодо шкідників, що належать до лускокрилих ше сн ее контроль)

СтуїгРа (повнорозмірний; 25 42 100 73 100 42 100 позитивний контроль) вФУ-ЗА 7777/1770 | 142 | 100 | 0 | 0 | 8 | о вФУ-ЗА 7777777/177177178 1125 | 700 | 0 | 0 | 25 | 0

ВФ9-ВЕ2 17750 | 17 | л00 | 0 | 0 | 717 | о

Фо ВЕ2 17/33 | 67 | 700 | 0 | 0 | 25 | 0

ВФУ-ВІЄЇ 177125 | 58 | 700 | 0 | 0 | з | о

ВФ9-ВІЄЇ 17/42 | 73 | ло | 0 | 0 | 8 | о веелАь 77/17 8 | 0 | 700 | 0 | 0 | 0 | о

Таблиця 5

Інсектицидна активність химерних білків ВТ-0029 щодо шкідників, що належать до лускокрилих вегЗлАв 7/0 | 0 | 700 0 | 0 | 0 | о (вефе-їга 7777/1100 | 100 | ло | 0 | 0 | 0 | 75

Приклад 3. ВІ29-1Е має інсектицидну активність щодо совки трав'яної

Для дослідження додаткових химерних білків розробили та тестували другий набір химерних білків ВТ-0029 (таблиця 6). ВІ29-1Ра являє собою химерний білок, у якому домен ШІ з

ВТ-0029 замінили доменом І з Сту!Ра. Повнорозмірна амінокислотна послідовність Сту1!ЕРа представлена під 5ЕБЕО 10 МО: 8 (див. також номер доступу в Сепрапк ААВОО0376.1).

Амінокислотна послідовність химери Ві29-1Ра представлена під 5ЕО ІЮО МО: 9, де послідовність

СтуїРа являє собою амінокислоти 459-597.

Ві29-1Ка являє собою химерний білок, у якому домен ІІ з ВТ-0029 замінили доменом І з

СтуїКа. Повнорозмірна амінокислотна послідовність СгуїКа представлена під ЗЕО ІЮО МО: 12 (див. також номер доступу в зепрапк ААВО0376.1). Амінокислотна послідовність химери ВІі29- 1Ка також представлена під 5ЕО ІО МО: 13, де послідовність СтгуїКа являє собою амінокислоти 459-597. Другий варіант химерного білка ВІ29-1Ка (позначений у даному документі як ВІ29- 1Кам2) одержували шляхом переміщення місця переходу між послідовністю СтгуїКа і послідовністю ВТ-0029 у С-кінці домену І з амінокислоти 598 (перехід у першій химері ВІ 29- 1Ка) до амінокислоти 610. Амінокислотна послідовність химери ВІіІ29-1Кам2 представлена під

ЗЕО ІЮ МО: 15, де послідовність Сту!Ка являє собою амінокислоти 459-609.

ВІі29-1Са являє собою химерний білок, у якому домен І з ВІ-0029 замінили доменом ПІ з

СтуїСа. Повнорозмірна амінокислотна послідовність Сту!ї!Са представлена під БЕО ІЮ МО: 17 (див. також номер доступу в сСепрапк АЕ362020.1). Амінокислотна послідовність химери ВіІ29- 1Са представлена під ЗЕО ІЮ МО: 18, де послідовність Стгу!Са являє собою амінокислоти 467- 617.

Таблиця 6

Сконструйовані шляхом заміни домену ПІ білки ВТ-0029

Інсектицидну активність химер ВІ29-1Ра (5ЕО ІО МО: 9), ВІ29-1Ка (5ЕО ІО МО: 13, ВІ29- 1ТІКам2 (ЗЕО ІЮ МО: 16) і ВІ29-1Са (ЗЕО ІО МО: 18) досліджували за допомогою біологічного аналізу із застосуванням комах, що базувався на використанні штучного поживного середовища, у якому розчинені білки наносили на поверхню штучного поживного середовища для комах у кінцевій концентрації 2 мкг/смг. Буфер (50 мМ МагСОз, рН 10,5, 2 мМ ОТ),

Зо застосовуваний для розчинення кристалічних білків із Ві, слугував як негативний контроль.

Повнорозмірний білок СтуїРа (ЗЕО ІЮ МО: 8) застосовували як позитивний контроль активності щодо ГАМУ. Кожний химерний білок тестували в трьох повторностях. Інсектицидну активність оцінювали як ефективну смертність на 7-й день (личинки, які мають затримку росту й умирають, оцінюються як ефективно загиблі).

Як показано в таблиці 7, химерний білок, позначений ВІі29-1БРа, демонстрував сильну активність щодо ГАМУ.

У цьому тесті було одержано недостатньо білка ВІ29-1Ка для оцінки в біологічному аналізі.

Одержаний з химери ВІ29-ї1Кам2 білок неочікувано був активний щодо совки трав'яної (див. таблицю 7).

Таблиця 7

Інсектицидна активність гібрида ВІ29-1га щодо совки трав'яної (Буфер(негативнийконтроль)їд 77771118

Приклад 4. ВІ29-ВІ22 і Ві29-1Ра мають інсектицидну активність щодо стійкої до Сту1Е совки трав'яної

Щоб визначити, чи залежить токсичність химерних білків ВТ-0029 щодо ЕАМУ від механізму дії (МОА), відмінного від Сту!ЕРа, два химерних білка ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1га одержували, як описано в прикладі 1, і кристалічні білюи виділяли й очищали. Очищені кристали розчиняли в буфері 1 (50 мм Маг2бОз/Ммансоз, рН 11, 2 мм ОТ) і чистоту препарату розчиненого білка контролювали із застосуванням системи Віо-Най Ехретгіоп (Віогад, Геркулес, Каліфорнія).

Очищені білки тестували на предмет ефективності щодо штаму ЕАМУ, який є стійким до інсектицидного токсину СтгуїРа. Аналіз із покриттям поживного середовища проводили з різними дозами кожного очищеного токсину (125, 500 ї 2000 нг/сме), головним чином, як описано в прикладі 1. Білок МірзА (позитивний контроль) розчиняли в РВЕ, а інші білки - в буфері 1 (50 мМ

МагбОз/Ммансоз, рН 11, 2 мМ ОТ). Дві обробки негативного контролю являли собою РВ5 і буфер 1. Також тестували популяцію ГАМУ, яка є сприйнятливою до СтуїРа або МірзА, тобто сприйнятливу лінію ГАМУ. Кожний білок тестували у двох повторностях. Інсектицидну активність оцінювали як ефективну смертність на 7-й день (личинки, які мають затримку росту й умирають, підраховуються як ефективно загиблі).

Як показано в таблиці 8, личинки сприйнятливих ЕАУМ зазнали контролю за допомогою

СтуїРа, МірзА, ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1ГРа навіть за найнижчої концентрації. На відміну від цього, стійка до СтуїЕ лінія ЕАМУ/ не зазнала контролю за допомогою будь-якої тестованої дози Стуі1Ра, що демонструє те, що лінія є стійкою до цього токсину (таблиця 9). Як ВІ29-ВІ22, так і ВІ29-1га неочікувано були дуже ефективними у контролі стійкої до СтуїЕ ЕАМУ навіть у разі дуже низької дози, що становить 125 нг/смг, як показано в таблиці 9, що вказує на те, що механізм дії цих двох химерних білків щодо стійкої РАМУ відрізняється від механізму дії білка Стгуї Га.

Таблиця 8

Інсектицидна активність ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1Ра щодо сприйнятливої совки трав'яної за різних концентрацій вееВвЕа 777777777777771111111111111111111712511111111111111111190с1

В2У-Вг2 /77777777771111111111111111111111150Ю1111111171111117171717117196сСс1щС

Буферїї //////11111111111111111111111111111111111101

Р 11111111111111111111111111110

Таблиця 9

Інсектицидна активність ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1га щодо стійкої до Сту1!Ра совки трав'яної ува 77111115 11111110 ува 77777115 11111110 ува /////7777777777717171711111111111171111111111112000 ЇЇ 0с1

Буферїї 11111110

РВС 0

Приклад 5. ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1Ра мають інсектицидну активність щодо стійкої до МірзА совки трав'яної

Щоб визначити, чи залежить токсичність химерних білків ВТ-0029 від МОА, відмінного від білка мірзА, одержували білки ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1ГРа, як описано в прикладі 1, і кристалічні білки виділяли й очищали. Очищені кристали розчиняли в буфері 1 (50 мм МагСОз/Ммансо», рН 11, 2

ММ ОТ) і чистоту препарату розчиненого білка контролювали із застосуванням системи Віо-

Каа Ехрегіоп (Віогайд, Геркулес, Каліфорнія).

Очищені білки тестували на предмет ефективності щодо штаму ЕАМУ, який є стійким до інсектицидного токсину МірзА. Аналіз із покриттям поживного середовища проводили з різними дозами кожного очищеного токсину (125, 500 ії 2000 нг/см"), головним чином, як описано в прикладі 1. Білок МірзА розчиняли в РВ5, а інші білки - в буфері 1 (50 мм МагСОз/мансо»з», рн 11, 2 мМ ОТ). Дві обробки негативного контролю являли собою РВ5 і буфер 1. Білки СтгуїЕа застосовували як позитивний контроль для стійкої до МірзА лінії ЕАМУ. Кожний білок тестували у двох повторностях. Інсектицидну активність оцінювали як ефективну смертність на 7-й день (личинки, які мають затримку росту й умирають, оцінюються як ефективно загиблі).

Стійка до МірзА лінія ЕАМУ не зазнала контролю за допомогою будь-якої тестованої дози мірзА, що демонструє те, що лінія є стійкою до цього токсину (таблиця 10). На відміну від цього, як ВІ29-8ВІ22, так і ВІ29-1ба продемонстрували високий ступінь ефективності щодо стійкої до

МірзА ГАМУ, що вказує на те, що механізм дії цих двох химерних білків щодо стійкої ЕАМУ відрізняється від механізму дії білка МірзА.

Таблиця 10

Інсектицидна активність ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1Ра щодо стійкої до МірзА совки трав'яної

Мрзда.ї////777771111111111111111111111111111111125 |Ї111111111101

Мрзда////7777771111111111111111111111111111150011111 11111101

Мрзда.////7777777711111111111111111111111111111120001 11111101

Таблиця 10

Буферїї ///////111111111111111111111111111111111111111Ї111111101

РВС 0

Приклад 6. Усікання в ділянці хвоста протоксину

Добре відомо, що форма протоксину білків Стгу з Ві піддається процесингу як на М-, так і на

С-кінці з одержанням зрілого токсину. Шість усічених з С-кінця форм химери ВІ29-ВІ22 (5ЕО І

МО: 3), яка містить ділянку хвоста протоксину ВТ-0029, одержували, як показано на фігурі 3. У всіх усічених варіантах, позначених у даному документі як ВІ29-ВІ22ТІ (5ЕО ІО МО: 20), Ві29-

ВІ22тт2 (5ЕО І МО: 21), ВІ29-ВІ22ТІЗ (5ЕО ІЮО МО: 22), ВІ29-ВІ221т14 (5ЕО ІО МО: 23), ВІ29-

ВІ22Т5 (5ЕО І МО: 24), ВІ29-ВІ22Тт6 (ЗЕО ІО МО: 25), домен ІП з ВТ-0022 (що закінчується

РМТА) і щонайменше перші б амінокислот хвоста протоксину ВТ-0029 (ТЕРЕАЕХ) зберігали.

Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що кінець домену ЇІЇ ії початок хвоста протоксину для ВТ-0029 або химер, описаних у даному документі, не були визначені з точністю.

Серцевинний домен І, показаний на фігурах 1А і 18, базується на вирівнюваннях з іншими білками Сгу, у яких була визначена ділянка домену І.

Усі усічені форми ВІ29-ВІ22Т11, -Т2, -Тг4 і -Тг5 продемонстрували активність щодо ЕАМУ, оцінювану як пригнічення росту (не смертність) у біологічних аналізах із застосуванням комах у разі тестування у вигляді лізатів Е. соїї. Форми Ві29-ВІ22ТІ1 і -Тт4 були найбільш перспективними, демонструючи найбільшу активність у даному аналізі (пригнічення росту на 67 9 і 75 95 відповідно).

Одержували другу повнорозмірну химеру ВІ29-ВІ22, у якій ділянка хвоста протоксину одержана з ВТ-0022 (Сту11!) замість ВТ-0029 (Сту10). Одержували шість усічених з С-кінця форм цієї повнорозмірної химери, представлених у даному документі під 5ЕО ІЮ МО:26-31, і тестували щодо совки трав'яної та соєвої совки. Сту!Ра застосовували як позитивний контроль.

Результати показані в таблиці 11.

Таблиця 11

Інсектицидна активність ВІ29-ВІ22 з усіченим хвостом протоксину

ВТ-0022 щодо совки трав'яної та соєвої совки

Буфер. Ї11171717ЛМА7/ 17011110 ува //777777777771111111111111111Ї1771117171181111111711711лою

Чотири усічені форми ВІ29-1га (5ЕО ІЮ МО: 9), які містять ділянку хвоста протоксину ВТ- 0029, представлені в даному документі як ВІ29-1Рати (ЗЕО ІЮ МО:32), ВіІ29-1Ратте (ЗЕО ІЮ МО: 33), ВіІ29-1Раттз (5ЕО ІЮ МО: 34) ії ВІ29-1гатта4 (ЗЕО ІО МО:35), одержували в системі експресії

Е. сої, і лізати тестували щодо совки трав'яної. Результати показані в таблиці 12.

Зо

Таблиця 12

Інсектицидна активність усічених химерних білків ВІ29-1 Га

ВігяяРате 71 Ї7111171717171717831Ї111111111111181

Таблиця 12

Супваїд ///7777111111117Г11111117171781111117111111111111111лов1

Буфер.//////////777777777711111Ї111717171717171717МА Ї11111111111111011111ссСсС рЕТ2Я Г//77771111111111Ї111171МА1 1 Ї1111111111111101

Приклад 7. Експресія й активність химерних білків ВІ29-ВІ22 і ВІ29-СтуїРа у рослинах маїсу

Перед експресією в рослинах синтетичні полінуклеотиди, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує химеру ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1ГРа, синтезували із застосуванням платформи для автоматизованого синтезу генів (Сепвсегірі, Іпс., Піскатавей, Нью-Джерсі). У цьому прикладі одержували першу й другу касети експресії, що містять промотор убіквітину маїсу (Біт), функціонально пов'язаний із химерною послідовністю, що кодує ВІ29-ВІ22 або Ві29-1Га, яка функціонально пов'язана з термінатором гену убіквітину маїсу, і одержували третю касету експресії, що містить промотор ШБії, функціонально пов'язаний з послідовністю, що кодує фосфоманозоізомеразу (РМІ), яка функціонально пов'язана з термінатором Шрі. Експресія РМІ дає змогу здійснювати позитивну селекцію трансгенних рослин на манозі. Для трансформації рослин першу та третю касети експресії та другу і третю касети експресії клонували в придатний вектор для трансформації маїсу, опосередкованої Адгобасієегіи т.

Трансформацію незрілих зародків маїсу виконували, головним чином, як описано в МедгоНо еї а!., 2000, Ріапі Сеї! Керогів 19: 798 803. Коротко кажучи, штам Адгобасіегіит І ВА4404 (р5ВІ), що містить вектор експресії, який експресує ВІ29-ВІ22 або Ві29-Сгу!Ра, вирощували на твердому середовищі ЕР (дріжджовий екстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), Масі (5 г/л), 15 г/л агару, рН 6,8) протягом 2-4 днів за 28 "С. Приблизно 0,8 х 109 клітин Адгобасіегішт суспендували в середовищі І 5-іпї, доповненому 100 мкМ А5. Бактерії попередньо індукували в даному середовищі протягом приблизно 30-60 хвилин.

Незрілі зародки інбредної лінії маїсу вирізали з початків віком 8-12 днів із перенесенням у рідке середовище І 5-іпї-100 мкМ Ав. Зародків однократно ополіскували свіжим середовищем для інфікування. Потім додавали розчин Адгобасіегішт і зародків перемішували на вихровій мішалці протягом 30 секунд і забезпечували осідання з бактеріями протягом 5 хвилин. Потім зародків переносили боком зі щитком зародка догори на середовище І 5А5 та культивували в темряві протягом двох-трьох днів. Згодом приблизно 20-25 зародків на чашку Петрі переносили на середовище І 5Ос, доповнене цефотаксимом (250 мг/л) і нітратом срібла (1,6 мг/л), і культивували в темряві за приблизно 28 "С протягом 10 днів.

Незрілих зародків, що утворюють ембріогенний калюс, переносили в середовище

Зо Ї501МО.55. Селекцію культур на цьому середовищі здійснювали протягом приблизно 6 тижнів, при цьому через приблизно З тижні проводили стадію субкультивування. Калюси, які вижили, переносили на середовище Кесд1, доповнене манозою. Після культивування на світлі "у режимі 16 годин світла/8 годин темряви) зелені тканини потім переносили на середовище Кед2 без регуляторів росту та інкубували протягом приблизно 1-2 тижнів. Паростки переносили в контейнери Мадепіа СА-7 (Мадепіа Согр, Чикаго, Іллінойс), які містили середовище Кедз3, і вирощували на світлі. Через приблизно 2-3 тижні рослини тестували за допомогою ПЛР щодо наявності генів РМІ і химерного гена сгу із Ві. Рослини, що показали позитивні результати в

ПЛР -аналізі, переносили в теплицю для подальшої оцінки.

Трансгенні рослини оцінювали щодо числа копій (визначали за допомогою аналізу Тадтагп), рівня експресії білка (визначали за допомогою ЕГІ5ЗА) та ефективності щодо видів комах, що становлять інтерес, у біологічних аналізах із вирізанням листка. Зокрема, тканину рослини (лист або приймочки) вирізали з ооднокопійних трансформантів (стадії М3-М4) і заражали новонародженими личинками цільового шкідника, потім інкубували за кімнатної температури протягом 5 днів. Листові диски від трансгенних рослин, які експресують кожний химерний білок із Ві, тестували щодо совки трав'яної (5родорієга Ігидірегада, ЕАУМ).

Результати підтверджують, що трансгенні рослини експресують химерні білки згідно з даним винаходом і є активними щодо комах-шкідників. Експресія білка в трансгенних трансформантах для химери ВІ29-ВІ22 варіювала в межах приблизно 25-125 нг/мг загального розчинного білка (Т5Р), а для химери ВіІ29-1ГРа варіювала в межах приблизно 25-290 нг/мг ТОР. Приблизно 90 95 і 92 95 трансгенних трансформантів, що експресують химери ВІ29-ВІ22 і ВІ29-1ГРа відповідно, спричиняли 100 Фо-у смертність та пригніченню росту личинок совки трав'яної.

Приклади, наведені вище, явно ілюструють переваги даного винаходу. Незважаючи на те, що даний винахід був описаний за допомогою конкретних деталей деяких його варіантів здійснення, не мається на увазі, що такі деталі слід уважати обмеженнями обсягу заявленого винаходу, за винятком і настільки, з якої вони включені в формулу винаходу, що додається.

Перелік послідовностей «ВМ» хупаента ВагтІєт М Овх ВХ стае, Нувкнниии дасаВв «ВМО ков урувевині постицедні БійЕВ та СПОСОБИ Внтроле шкідників ОосвкВ. «ЗО» ВІОВО во нев овоть

ІЗ мб БИ у о ЗВ «ій» вакВнів верстя 3 ха 3 сЄЕКЕк ТВ ша ВБілЛюВ Й «иа» УЧНЯ ВеСЛІВеНВНІКСТЬ «КЕ : . сх : , ; ; :

Ки песнійевність ВР-ООео, Зібрана вв підста! паяиїа аанея сему Вас З Нв, «Не 3

ВЕЖ Бу бет іуБ Зп обі яБий мех міх бі Бек Б беР Аа де КВ

Таг бі еВ вих ай Ве Та Фі век іа со акн я Те оди ТК

Фін оіюю вва йхв Бі аа ВІВ СТ; б1ж збе бір ве» ВБж Мат Мекє У 3 Я я ев їнс їі дій тв Бі ЖЕ щ1уУ її діа Ну Ух Ха ще Ту яБА 3 ях ЩО їв бі Ма вто рев із сіж бів уві іа бер ме) Тук ав не Те і іо ів вжи тТеВ бра жа Ту дух зе дів тРО 3: 16 рве щех

Фі ня ба Фів об рве Хіє яка бів кує Тв щег ТНК ТуЄє АЛа ВЕ

ІБ Зх а ак ух АТБ їв АТ Бий ви їуз шіж вва СТУ же Вій емо яв УщЗ

ТУК НІВ БЕ БЕК фев бів Бе їКр хІ38 Куз яви Аго АяВ АБО тТВе АР що ще з їви ака бе жа Уа! був бек дів зує КТ ТВ се бів ва ВВЕ ва

Уа йія Жвг вац тез ек РЕФола Уа ев бів ін ОВ ма ето їб5 їз 375 їемобто Кі тує ВІ 3 АВ ія вел ів нік іже Кен ви ем ка зма ата ее ХВ яйе Фіу хв вів Тур у ви ве аво Ва Я Же

ЗО зо

Жег ТвЕ вне їУг аа ВТ о УЗ ів ага ТЕ зе йон ТуУК бек вве «о ЯК СО

НІВ бук ТНК Бук ЖРИ о РИ» ахИ ТВО ОБіК еу дей аке Мем БЕ бік ее кап ат лю жів їв жі сх Буг йо Бі вве ака мо азв Ме Ве ви вих УА Сам дев ее Уві АТЗ реє ВН бій ще ме вав Ве НІВ ще Щх ТО ся о. ше м св. жк гі кої М; с 5. се г ря У

Щек Туг рт Між бу Тк ЖЕ 1З БІВ вх їВг ага бі жа тує тве я ях за

Ех я зх вт азв ЇМ птТЖ тнНеожаі нія ве іа Боб зак о бве зве вав Те оТВи

ОВ Ї га З

Че тує вав ап й вл лю ее Бі ве ік хі «ТТ а ва ма 53 о Ех ЗО яівсяго Заг вге міх ес са АФЮо Рів їжи 1 іа чаї ж ЕН тує 3235 З жа щероівц іви зве ве їв Бер вав те бів ту Ме аа Ме тра Же я Зах з

ЗІ нів сек іш бан вве ака ТНК Ефе вт Е дію те їжи ан ТВе ЕК

ТвЕ ЗВ біЖ БЕК ТНК дБА Тиб ЗБК ІК дей вге Уа М збе Р ВН

ЗЕ 323 З тМгохег ва яр дів Ту вка Те Ти Бе Би Та БЖ вано АЖ Бех

ЗЯ5 Ї Зо ЗХ я

Вр веу ЖЕ ОбІй Ве Уа вай Оу У прое АК ча! яву Ве ні тей ях а 5 їже Ре Уві Те мів мес ТЕ КАТЕ Бег дав оаща Ве ТЄ Тек го у «А 485 Я

Ту ків ту їв БІ ЇВ жів ії біз вар БеР сім дк бін Кеш ге з35 ЕІ ах

РБ О1; ТНК ТБ? ОіУ вій Ве ВА Ту ФР ЩЕ Тум ве не Ра еВ я Я я

Бек онік Жіз Бі їм Х16 же Аа Бек нів 941 руб АЇВ ува УВІ те ях СУКИ ту я ще ТЕЙ ТВЕ ІЗ ар ек АК дер кв ТВ АФ Ве ТТ НІВ ЗВ ож ек ТБ ТЕ сія Ї16 вБго ї5а УР вує ків ні Те Без сіб Бек шій

ЗО Б У і

Ве не жа? а вує Ту вгосоїж ве тееовіу Фу во Хі їв ав

ЗА5 й ща5 де їйк ее іт Зіу го во вій ВНе ак ов жа! ав Би я ТР

З 5 я і дей зац зок із Ак їуб ага Аза вто І АЮ Тук вів баготак ке ща ща 7 МУ: зво вза іже ве Мет тує мЕі Тв жі азів бім бів дае хіЖ ее ав Ту пах я их

Бі ве ах а тн мех аби Те ТУ ао в вва МР вве бій ве

БЕ ЕХ За

НЕ Баг тук ід Тв Хв вхо ак діа ме твг ве гу Тв Бех дів дег бек іви ТВе жи ш3ір віз ар лне бе баг Зако Біу ява осв маї

Тук Уа ар ага ваБ дів вв тів веб жа Тв оАТа ТНК реа На ак ви А жі -е а! Мн ар я бі вка ві дів Був яїа УВІ МіБ би Камо вне Же ах В ях ог ТВг вав г сік б1у фев фує ТК обже Уві АВ вує аБООМіЖ Тук о Би ва

ЖНе зи ТВЕ Хе Зк ре ек бат біз чек Ущі Ба ще сув м БУВ дет цін ага Тег ода ХК тує ака їка ЗУ ук ВуЙ дек ух вух БІВ но 5 ЩО тує рев оту Хі їв БІК Тек ТНК Жак уж Тук

Те І Ж

ХЕ же сю «им УТАНВ . , «ках Штучна вокоздианіств -атїМ Веслідояніють ВР ОЦеЗ, Зіозне зе підставі зналізу канех гемему вата,

Б НУ меж ін Кі вжи авт єї аеки Ока Суб маї вро Тук ВЕН уж во я ї 5 о і У яаи бро Ти Жег сто (18 ж вза ма Та У бле бек ве ТМ КЕ

Без. х5 З ча! аж ців жі тя вве цу 138 тн АгБ меш ЖІ Бе Бі Аж ВН

В че ЯЗ

Ме; вто Бім шіу Бек ВЕ Жія ее ту вен вне ав ем Хе те ау ів вве ачи Стр ази не тго Зее аія вве вен дев БЦ У Бі В ви хтЕ ваза дій ака Кі тТВР офі вне АТ ав ТУ ФІ ва І

М КЗ З аг іве УЩі 1 РЕ Кі ака 5ае тк аеро зує Е1в Се ва ев їув Є; тра ії аа азО) Ре деОоВяй бео АР дек рух бін Ак ОУН

МК 385 35 ву Ве аге кни ЯРОШ ТАВРО ТР АВ АБО АЇВ Біо Тв о шіу тв Бе

В 3 З кви век ліз ЖІ ве шт Ва Зі в я їйгосве бек УВІ ТУК дів 15 М ую ща сій бег вій ди му Ні вен о Аїв вем фіни дей вера жа! Бе вне м ЕЗО і Бін я їтв у еВ тв із їВе и Ви ваши вв ве тк Вее

ЗВО 355 З дга Сем був ва зве ФВ оУКуу ав Тук тиг ап міф сук МБ ба не

Зх ж мо

Жук дев Зв Бі ЕВ ТУ вм зем аа хі Іо аге бе ів тує Жук

ІВ КК та дб кН ів би: Зі бери тТвк жів бек ув! ев ой ав маї АР Се

Б Ук Таки Б " Ук ви З тї5 НІ

Бе орех ша тик ах Кі ак ВЕ тув вва За РИ ВК уж ша В холку ке керу ке у лек. ска сера Я зу дж пер их ж я г і ЖВе аг ів БІБ тує твж дер вро тів ів Зеб вка ОіУу ві біт

ТЕО і за зо хів і. тує так Ви 51 аз Уа Бе ака ім Бгто нія вве ме жа 285 ЯКО з

Бі ром ово кед ке ї1е ів Жуиг те овБік ЗУБ тує й ФУ хів др

Мів тер вів оту іє Фів Ві бім бюе Беє вга не су вва ж тТвг щИЕ ЗМ ЖІ зай вве ів атгв Бе Бо ме; тує Біу ТВговіє Аїя Тв Аза В вВго тне ага Ва рія ще Бе Зее Ве ве Без вів ви да ем вне тує ве ж Зх вх твг рей жав ТВ б) ХТО ее же вхо Бі Бе БУ ід яви Бе де ях ЗБ ЗЕ ші ага їж аг те зем озеро ма ов Біж в Є Ве жів бій ВрОУ дов'азн ші сти бій бе тк агш Уві Ав ВК веб о бе За 85 КО 85 я аз ошів вес без іже Бе ОіУ Зб ЯР бек Бей ТВ Об1В Тук ВЕ ІЗ ах я ж вгй сем су ніх а ак Ме від Бій ек бе ага й вата бій БК я 5 ЯЩ ке ав от ій дра Уа! кг меж би ер їтрожКве ніх ака ек жі я з в

ІБР кеш Жвк АВа ТВ щіє ар ге аз жа дв вк біж кт ро ще

БУК КУ я

УР Ух БЕ КО аа Без Біб Заг опію вів їв Хе Уа бук у вих

Я ЗУ ях ЯКО шіж ВЖЕ їв сіж 1» ЯЗ ЗІБ іа Агш ага те жи Ма бі Бек Не

БЕ що БЕ оіх ар мек лаго жа аа жів тр ові вк Беє ее бів вер тує вед

ЗХ 55 5

Ук ага щі АКЕ Тк іа бек Ве ВЕ а ви За На тує ве Я5а

ЗІ ЗО ЗЕ її зво Злу Те отв хів же їв бі аби ВБОш ем жек тне же два

З За БЕ пат жі вро жо Бій Тук Ту ак ва ак жі Ва У ки отв

ТНе Бга бе ВГ ОКА бег о азо АЖ Ве За Ве БНО Те жі Фу КТ

З КК БУХ

Бі зн» Бі ек бак ВЕК ах Бій Уві Тек жів Ах дев З те За ВБЕ а ЗВУ 55

УДІ Бге АТ Ки УВІ ВР Ве бів ві 515 туго Ав ж Тв вує ВІВ

ЗЕ КУ СОБІ бів сук дів жа аа Кіа зо Бе З ес дет дей Бі Хі Ту Бе ще ЕК БОКУ

Вуж ТВк аю щі їв ав ТУР НІВ Хі дер бух жі звк о яая ве тв

БВ БИ щі їО «ів Суб ГБ Щек дедобін Не Сех жи овхв ів їж яке Фі Се ак

ОТ ру МК ще ні АТМ БУВ ЗК І сук АВИ Бін АБО АБИ ЦеМ БЕЗ

ОКО Як 5

ЧІВ ж рт ази Ве дКО ТУ дів ан вер ів Биб вав ак ім тв

ЩІ НЕ БК І

АР обі ес твк дер КІВ ТНК жів бів Бім іт ази аж УЗІ ВВЕ КВ ім ей тк УВІ Тве Бе вух «Ту ТВЕ Ве ар бів бує Кук вра Те

Ох І Ж І НЕ

Жук ке отже бів Ух жів ар си век вже КБ о вуЄ вій тк отвк ага

Тук пів кже ака іх ТУ Ті ЯК яев ак ші кер без ів 3 ТЕ їв хів аге ту аа А1А су Ні бр тнк УВ?Т жен УВІ Ре ТК ТВК

Су жжк Се ТРА б ів зе аіа ів ек БТ ів БІК бух бу у

ЖК реком ТВаЖу. У

КУ ХЕ

Фіз ве дчв ау ку вів те ві вже біЯ тТРО АВАа Ка Аа Без а5е бух аг бух аа ах ів Вів кує Сух З НІЖ нів Зае МР ніж вне

Мах я | щі

Бек ка БВ КІВ вар Ма біжЖ Сех ТИР ов вер аа ур й» Мецошех і ТР ма Кі ле Ух Кі Бук Тс Б Аж Ту Мі АТХ аг еу ке х - Ко - Я х

У ща Я «і аа ав 3 внесе ів бе Бех бо їв Уа ую бе АДВО КЕЕ ли ях ВЖЕ іа ага УДі гує ага ЗІЗ (1 Пух СУБ Ттр Ага АщЕ БУХ АКВ ОВ ув

НН 7 7 що - Є ся » чЕ те ях пох

ВХ ВИ Ух вес ви Фіз ев Бі їпг о дка їі Уві же су і аа же бух ек УК

ХЕ ВО кох аби а ше вве ща ан чек ів тує ази аг ве «Б а вх Ве

Кене ІНН За вва ів аів її жів ніх віз аій яр мує аг УВІ Ні БР ОХ Аг 535 о ЗІ із азів тує вац ву ів кою бак очві Кі Кв в «ві аяп вла іх ав З ЗА їі вне ів ів сне біз іх ага жі Бе їй» дія Тук Чек о венотже век Аа ЯКО вел Ма! Бі губ АБВ БУ АЗЮ ВВЕ АЗИ ВЖН СТУ здо бае

Зх ЗЕ ЕХ

Кух тте авп чаї їж БіУ ніх Уа! ва хаі бів Бін Об ачи ка нів що Вих ОВ дга ес маї Бжм ект УВІ Бе зіч Кр Біб за Тв Уві бве дів сі 5 ще ще тУйі вка Ві ух ра сік ака обі Ту Хе фей же о ува ТВ ОоАТа зу 7 зЩк 7 В

ЩО У ЗЕ їх КА

ЗуУук кма ів БІК Тже біж Вів Бі бук бай ТВА жів нів ів ів

Мих Ї ЩО МК ін Ажв ах т АВ ТВ цем о Буз Ба ер оаст ех ЖЕ ів В

ЗК ! ТО МО ін ів стУК БР дек дяк ТК ма? Так Су» ви 455 ОТУР-ОТМК АТа

ЩОБ ЗО ЗОБУ

Тв овів із ін теє и бі Ве Жук ТВЕ Хає дк вза аг ЩІК зу я вея 2 свя. х З

За зо МО

ЖК дже БІФ ВІВ тує шін Шке дж ек Зав о Уді ре вія Зерв оту

Аа се дів тує БТ БІЙ бує 8ЇБ ТУР ВК одев віє го ага АяВ що ІЩЕ ЕВ

АБИ їНк бує Біб век єв аа біУ ТУує Біж дав тур о Бе ОБеб ек що Іо 5

Кт» бід Зі тк Уві Ку ух же бі: тек РВе ВКго і Не аа вуз жа Тер діє бів жі Б3ж Зв ТВЕ ВЕ її Те вік Як ж Мк Ох

Зі веюо Бе УЖ ТО Баш ов. оБем меє Бі ів

МО БЕ

«ММ З ха БІЛаЖ й ! «ах гучне пеелІдДОоВНі Ст «МВ» «ЕІЯ» Хиоеанех бБілвк ВЕУ

КК

Мен за Тів'яча а5п Бі жна «іп Кк У КРИ Туб Абе Сук ги Ав ї 5 їо ї5

Аж вро бін бек БІБ ЖІ фам ожаи ма! їв Її ре зек Бек сів ої

За! віх Біб Уїя Ні се» мя ЗБ ВР ко ке КТ фев СБ вам ВЕ «5. щу У

Бе КО п ее Бе БІ Біб еко Кне Віа Бе БУ змец рве вза ев Іфв г віх

З В

Хій вКе вел От: аа ін тра зас АЖ вна фар вка і жа оо

БЖ ТЕ а ща ів пів ав бів ака хів те ві Бе вія вва сію ій Аа ле ів

Ко ЗО Зк

ЩЕ дей тТук вка тМе Зак Бе жаї отв БІ УВІ Бі ве її БІ га

МК і ЗЕХ ЗВ дев ай вік вік ФТа Бей Тук Ат аж ага іх ТВ Мем АшрОозеК соби

БЕ Зю 55 ОВ

Аевяїн ем ве ква Біб у дів бег Зб оуєз УВК Мін те Зк ніх ях о «15 зе кв суб із жа агеа РНх Аа бій Бее вен вх ач Іа бі» Ба а ака з іже АЮ Ту Аля аву ХВ Бк мет Бе щое Тер ответ мі ев Бек 818; я; чає 345

ЯйговгоОо Твг оаБи Те зії вазон вероуві їфе Твб ою 16 го яв «о ах чо

Уа ке АВ нія Тв фе бів зак ші ТК те Уа чаї У су Бе 4к5 я ах Я

Біу вне їве іш ту Аве Же жо ваг аго Тровек у бу вро ее ві5 я «5 ів ВВ о чеР вм ЖК ам Кви а ТР Ва Ям его ої ам тук кі аа дра дів аАРО тки Аза БЕР їВК ТНК ака вен де ВЖЕ тує ЖЖ ЗБ хі АБ і біо аг зів Вб вів Ту Ба вне дао Ку Те МЕЖ ВВ я 535 ща

ТВ: дію аб ВК сен Ттвх ВВЕ бів Чеб Ве бот тує віх тве ж ар

Б З ВИ я тТвгоАіва вне Те БНе вою пе Буд вів Заг ЯК сеє ТВК ож ож ла

Б ЗУ 5 дао ве не Зек бе ів вза бій жі туго чаї др обга вне: щік ев

Зі вгу Уа Тева тег Бе єв аїв бів тує вав фо вів бує вія 585 ем Ох іп ост» іа ти вав Аїа зро Бе Те Заг зе дан вів Хі БЖ веу

БІ 3 Ва іЖ тйе ав МаАї Тв дер тує нія хів ажв вух жі 55 Авт яв хв

Шів є вне Же ОАЕ І Не ств ме Бо біз суб АРа ІВ ім ех -Е в щЕ

Бім вуж У БУ НІВ 15 вух вкщ еи Жуч вероозги вагу аа Бе ев

КО вах БІО

Бін ав ск Аа ваш ат і її дв аг бів Ве: лев АКУЛ У г я Б 585

АРІ Ер жар тн одер Хтя УНК Хто ДІВ ЛУ бів дав Ябв уві ВКе Кух

Бі ой ТжЖК б ЇВ ри БО ТК ВЕ РВЕ вар Бін суб ук Ре Ве

ТУ Ям туго бів ха ХТе АБЕ бі) ЗБК Бух ев Кух АТа зує ТК Аг

Тех КТ Я

ТжЕ Бій Бер вк Ух Ту (ТБ вт ак баг вія вав мем бів тіж тує

І БЕ Я У5е екв Кі дкм Ук дав ді їв Мій ін їне хі дж Щі все іш Же

МО І КО ТУ А АТМ КБ МІВ ЕН ТМ ОЖаВ АЖ УЖЕ ВРЮ Фу НЕ піт бкк ік тт Вр ік Бик АТ ВІТИ УЗ жв ші мух ге їх пів чек же МР КВ КМ ЕК АЗК Бій ее у тів У мух су щу ху ек тп 7 7 с ТЕХ їО

Кіз его ази РО бує ія Ве вія ев Бін т ази ге аа Се вве

ТЕХ 790 ТЯ Ох суз ЗЕ бух зго аз сту ти вух кує ів ніх нія бе нія ніх впв

ЩЕ що віх

Бек цим вроків йвр уді Бір бух ПМ ах фев аа ОТ вза се Ту

МВї тре ом! ВТБ. Ба ух КТ ух ТОР Бій 836 Бі Віж Та Веб ва

Ву Вав вах іу аяв ген Я Бе ів вів бів З Бра вивоУчі 1» бів ЯЗ веб щі ще во

Аіа бга ві су вка Бій ів уж іа ттроАго йзр бує Аг ВІН БУВ

Вк 878 5 ЩІ ів ТВ меш оію ЗВР ОА Ж ЖН тує Був З» АТЯ Бу Бу БеЄ КВ 885 З я зр ав ібн Ме а й ее СТЬ Тек ово ага в БЕ ід а5б ТЕ

З Ж ще яби Кі ва 18 їі МЯБ5 вія Віа а5в тує ака Уа! Ні вк жів вка ще бо вах 7 «М АіВ тує іже ТЕО Зі СВО Щетг жжі із реє іх чаї Же Аза МВ.

З 5-5 БО ї15 Ве Бір ОТ; мер осів ТУ ву ТК вне їйг Аїд ТУК еко тує

За ях а Ук

Ако ка аг Аа Уаі Зі кує Ай Те вхо віх Ява жа жіУ вве з

Зах 5 ях суб тго яна УК! вух ої Ніз Уа? хр Ма «ів ків «1 ав аа ніх - У Кі І яку же заї ви жа! Уа ва тв та о ліз ів Уві яее да То

З ЗК щЮх

Заіка жі був вга опТу ака сту Ту Ще дев ЖАВ. чаї ВЕ Аа

ВЕЖ Зо ЯКО тТук ув и дію теє ТУ бів біу ж УДА Зйе жів нія я ЮЕ «І: дав БА ТВ вв оЧНЬ ем бух ЗБ Яве дей суб УНІ ЯТа 81: ве зага зе

І Щі же ге деп БО ЯР УВІ Ве жу ва вав Те Ви Аа

Ох АНЯ ЯщЕ

ЯвеожнЕ жів Осі тує бе вію Ве тую тує бек дка аа ау 1 е нео ЛОУЗ ва

Ту дхв Іжа туго ств бег дн ев осем уві ек вів дев тує тоБх ! ца Ме я ак ів те Вів ОТО Бу» АТ ТУР тн АБО ТУ АРЕОАРВ яв

КМ М ЕВ же Те Сук бів ве ба вт Ж Тук ФУ ях оте жнк Бех рах що То З вго аа ші тує жі ЗВК оби ія ве ів стук вна ву фі отне вже 35 БО

Ме це жі ТРВ тів ств Зі іЖж Бі ТВ іш оту ТВе вве жів

ЩЯХ її 3 їх

УЖ ЕВ ек а піч ше без бен МЕ ЩІ бі з Кв «305 В «а дії. НЕ сиійх ення послідов іють ог «ой СЛІДИ ННІЄтТЬв. М КидУЄ хНееИНИМ БіНИх ВМО. «ВО вив и зх асаа сова ос сеотамааие Зсесознива жехеВає в ній ктав актори: КЕКЕВИтедес дався сндазактсв Сема Не асани їв СІКсвцадав ТРсККІВесВ ЗабоцроааЕ боса сетатетОах ЩО хна иО пен ива вада кН КСО посафрмаея З нка ав Вацак аа еко Вк еа саатееОМо зов за тиха оа ЗОВ зеаБиеева зок заходу ва сосках ЗО «асскацк сяаесовааєе часа «овес спа томец БЕК ЕКСКХ ча вес ктстасвс засів х Фета СТЕК КАЄ зва сенс віжтноякки зцскетатиа НОТ СКАЖЕ ОИ УВО А пак: зас ане важ икея СНО вах КАНА ЄЕС еЦЕ ще таіснває вика ка ткана Е ВОНИ Ва соня нах СВУ гВОя ЩЕ севозоєвух акосімтссв азонозвкех зсваєвеета тсегацатох Вест КЕ Ха

Еіресанакт ЗсОфМмагесу засвтатюся зсаєсаасжа славісваєт ааеаива КЕ звис сВе зтКеастаК от касеосву яіхакаскок Тева х З пев оє сарассткак зоассттов завооасктіа Бак КакВє КВ КАНЕЕ ЩО срошаактє засво «паса вона цовя Зовнзасацюе хау ахааК З захакаации СККСКЕКЦЕМ осв сеасноєвия вассивевов акткакавок м семан КЕКС Кан ЕІКеВк КисВвааах КИТИ КВК КОВ ЗОБУ

Чаканассве саоскаажаи таб жана КБаННасВа «КН усе. Зах зкхакскиве саваєаасою зано засво єов давен зас се ЖОВ заксаакає пасжеовоса ен тачк ствастовах «сей свко виска Я пгтаовткеа реа сноК деофкеенчкя еваесестає атакою знекесев ля тЕжКоТКОщИ свт КОСВНвеКиК Кана КЕНЕ МНК ВеЄ ВО сезакассаик сатин вени СКко каса СКС МОВкК деко ХЕ пизеткас седана серссузсва ізо овссакекоє СЕН МХЕ чеквакхтво зсхтазнасеї зісжсаваца тако ваза ОКО СтаКЕ їй весвитєсеае певакОсвкоє евнсснетока оовасвцев кеЄкеоеєВа ссеазжекаВе зве вазасваква вівса всезеваси ктссантиее жа Ктасцюк ааскакеца. ЗЖНИ аквосасєа: састсосває дзамновує ацетат сацаеекаа КВК Козах зга ісарфіваку варкттетої зфесаднекє ранктватес светеавстою ке скохе зе велрантаво витка акстсвнане дезотовати тост тає СЕСКЕЕсВВЄ іхве сапаземх паиввавоВОв зотвасовас сажа акавацкайс савкскваєє 385о зок ВОК КОВО К краси; зако: азу ювая т856 саке анОс ФСК СВЕ теВесцюаня фЕВСТЄВМУ Зжесвеке скЦаОЦеВК зНЯ апжадасває сацнесаово степової пок своава бевосаеос вед оовенх зн асп вереаита сесаєрсса сивої севаканеа вка саВеВ з таксквізес ваза тедискоава стане втасксвска Тора. хв сені: оби ся зт івива осів каз стеки каса ааї УЗ тецасвотай зіцічесау асом кеатцееює токсадесея СВ зав пузааукото садааковає фесясовосу зксакокесєа авкоонвєсЕ КажскеВцих зай тегеєцтоги: вопатошеоа пваотокриє каксаєвове ассукеисе века жо дазеснаних скаславсеє аатазаоцис стен оозкдакеее самка з55в ведсноєвно ВОЄВКОСЮЄ асбвоюахх «сномаєктс осонаєвова зєсаєтаотх СЯ зЗаацаашевс сацстевВк разово зазжааавах свое веду Оиаава ВО:

КТОКНКВИ КЕ леКаоакеая. ТОНКЕ. форс ласк шера КеКЖЕКВЖХ. аж шкщачежит еКеКОжкає асан чекав ссср сек. ЗУ насвласнсю тТтКакаВсЯе те секевтееяа Вес якеокрє захо

Шізчатюсво «КВЕЕККМІ зовакснову фОВСОТЯЄКЕ кежсйвсста єкожставає ЗБ важки а аск ках зако кс наа СЕК сао Я зазацюесазу каві ноя зоавсоуає ззссатецею сокежееоє каткосвова ЗО тонняокз) Застфеснся зозопеюсдє дтстохссво дкоркеюють катесттовх леово

Фстасвцєої зсаввадою «кековаове ооссуєаювх сажею оса є ЗІ атасвовсі застаааате саосиастВе тд вовОв аажеещксх Засе зіха акавсвіентя есдаскякас текунекстк давен жає вка как ККкУще за заксрюас здивує сеажнанує ЯКЕ фескавекс сенс акка з35а усстисвааю звазавкака касвоакеа зцяаоацаєя веВеКОЕВЕ ЗЕВС за зона астесасаює вссасєвасх даскакаеов кавановакх зозосаєеке за

СКУКАНСЯЮЮ пвх фа вок смак вежраасиеє каккоєвє Зава

Зорсвецева КОВКИ срувусвааєянх зай хода З «ЕЕ ЗО «вам НЕ І «УА» штучна пестідевність хай ще звувмізовама ди вати послідовніств, ви модеє хемервннй бін кавове

НЕМОВ

Вінн єсв ясена совок ка сКОЕВеавВсМ Кота ий сексом а возом озон кіс евоє пасок сек коей ссеквае ЗЛО заці сет овнова сусп орокеех ток ЕжесоВ КСКОКОЄВа о сесією как еова соацраєсва БИОБЦЄВЕОК сегі свинка поко зав сс сааоє ВосвоВесас шаНЕтеНєє ЗОБюсКаОВ ссакесвасо Зо ЗК тав сКЕНКЦНсоН Яке с КСВ ВОК ОНА конк За аассосв зеаноцзассв сода беани каско скВсконева сок Ку аа кофе ссессневОє сатосооєє ексудат ою сс: вес аєеь ЩО падесодега агозоєвесх свбоктсвта ск сдеєтоу вустетесов сезавацеаа ща

Как ск зизссажсах свасовеєє ее гав иасне саке вих ЩО тасвсЗаасс Зоо цеЮ КСТСЕНаЄ МІВ вас вя стос ща сенс аксцСкЕКкя вот шосзієвцся Биков Коссак УВО

КЕКжЄЮВНКК Вус иКЕКю КВК ВТК СВОпа ЗМЕН СВК КН ассквовсєц За сах скасує екон ка пстасавее неадоаККе ЩО ее Сет кавх совет сстО засада стоз тот хвеВс Сопко КЕ деВосоакий посвекуцає веооснхне ЗМО Зеаоваєвя сеанс ВО

ВОВК БОКСИ Та СОН ЗОВ Вес СЕК ще «ев ствссЕ сеоссцкох ЗааКеевис Каса Ок си сатекєце їОКе сдасозассзо сс свтсаюсвсє саван ь скСьсоя ощесвесоце КО крснтссаВс спасе соавсаеєте сассвсотоа особове се оон що застане спо сопоекесвоє спас ассссасва ВОК ізо цісацакто сскоовюює кацуажеся чафссоское вствсоссво пасе ще кісти сооаи сук вес свсоз кокс сао ХЕ сараю вок сваовс сеакасссті своє ска севацоєкее з9а часа со еааснх сів ВОК тСеа посевежкцую сегревцкиао 500 песен схс ас пЕсссЛНсОЄ КаКАОВООє се сЯхих косо ве хм зсеасктоє реак Оє пасєзеєвся Оса тсексосево совок есвАє ЗО зажсоніча згасподс сосен СккеаЕКК вас кВеВе Деко. БО ве са: саке: сао нев со прдоєвосая ОБ ЕЕ За десоцканко вис час с щажевине «онук аск зов зосувасвсв асклоозцва оусесавааа жооксовася сбкжееєво ктесаноаЄ За ск сеосє фраза Кебуасканс саскВсвоя всавоцек свасє ех БЕН пиціщкетоя додаю сік свчн пасоуеню есе сазовесае Та касвесзаас шсстскаєує срозосаае скотасяоа се соВаеВе Соня за васкаскне сиве ство аекасоаса ходових не ає М

Вас ксх Мних сОксВеОсЕє седан содвечае сеВсКесасо ща тоже лдкасс зозввакеує своє секс к всвесювєвя соках Же

Засвевтко змасиЗска щас асани хссоскана сова ах ФВ. цес ня КО к оо сао Кік Тел ЕВ пкеоме 20 засавотасоя факс свостоєЗеєє зексассвкв амдааєкс зас кщає ЗаЦО. засво еви яодасоОнсЗа даацецкосе ков веє ОВЕН ВО Бела 2850 чис шоксемасек савсваває стеку дося Сава. з зсосвосако екасом ее ВКА КЕ воза ва Вссоскаа Ж зе с Мексацх сазозОвося ока врозсцаквя пара ВО сідав мен сетер задо сма вес кооє сце Ж квас весх об неве ска асиесвася мамсоносає сосок е а звсазасвко мисок сечо сє тассБсксю Ос коєНе тс ска щесизеокто ссащскесва Зоохфае осока е скВссоюєюа Кс ЗВБО косе аессвеєча дазсоюсє ресазсвисе дсссовктв соч ІАО ник веа МОфасаскща Вес ас ВКсВесВек ес еух ЗТ есеС БЕ еВ зКшкиОкка ване ЗСУ дсЗщцовеа ка Мк піжсецерх Всаенесоє сопе ОоКТосВКа сувеєсакцях Засевкод ЗА запас Зустаеєх сЕксаВеКОЄ ЗЕ О Зо кзеек Яна ееВсВ Зіка кас тека зон квеє зусснессяю зецаЗене Все соус ЗО засаозеюєх зсзаєвасеє тен авсанеткай косе ствсвк тає ХНУ феєю «зас осо е сосну везсскасо кое Ук пса «ев ост кс песемшва ссавооноке Ядаоевиве Зайо сазан всех загин; дез Ве нескє каксоЯкцОве ЕІ

Вуса оаеє Хесиеєтевх дЕОЕркаа ВИ «Ще «Бр ЗЕ . Ї «ЕВ» дтучна поспідавнієсть хай» бпуиМізована вл маку поєтідДОКиз єть. ЗКУ КБаМє хеменняк Ток ВТ зІованосв: зсаассвовав сеаосцео спека весно ссср щу чаоасссіва зсакочекак КИТ Еаве пЗЦеАООІ сВуаНаееєа ксЕКВНиВ. кВ зеолаєстай кесувовова сте токсо секс Є БЕОКЕКесВ век есЗ З теЕсаестцОЮ ВЕЄтЕтсаВ СНО ВссВО фойбащсвиє кестєвовов Ве що КЕ педа Весуєчесає Фа сє зедодосза се ссавко ВсхеО Ве ЗК тече семналецеа ів ек песетеваву ву а сек ає 55 вав сне сін есе ссассВанеа сек а верес ссстовичЄ ЗиТКсщННЄ стос ссассотеєе ВУ ееея Зк «аванси акствсаксї сорскетссто сода ЗК ТсТксоо соаОаОоєОа В

Фет несю авассвсвї саасркіж Савко мн сановасав СЕКС що аск виех ема «жк хвсває зкквцско квас СКК БК скоуаакВоЕ ЗК ОКя песацОкв езесакс сенси СУК КО ТВ хжскеснВсх всеЗасякскю ЄмевиВсксВ йксессасс ЯК совВЕ сВеОаОюО ти асскаслєся асссааксвс сс зессаасси етос ВО ясЗЕЄ най стику сесаєсеНяЄ «вас засво га кезхстаєає сера ща зОбудсяюех юссаєтовоє Фе сасевю чат єся фезоовсвов сесоевасе я асани ссср сви вок есвсєвсюю застає стесєсвсв Ме

МОСК ОКО а БасвВЦВОЄ кеБСовКвює секс В

ХСН ЗсОсваоМк сан сяс сасВоВесВ ССС кООа ЗИСК АВ зом сани саосаеМм каско а Зоаесасн свое ВЕ зас скес систоцао сно ає сткасконак вексоєева Зк ЕОиКає ЩО песаазккев сесанваксх своя засос вссвофсква ие сєВОЇ МО хатах ссовевВовіє ОСА сССЕЄ зссваоВоса ссцвсесвОа ситовекВоВ в сама ссяЄ ТКОКеВОє скасвссск сао ося ксассовок сазан ща пескткакос Ома Е стих асктсюцесо щсжсикеує СОТеВеюВНе МО кс сса застосо щссеенокує гака окЗє деджкацюта собака е 553 зкцдансие чкжкфкнО фасскося засад кекс ова есе ев

Мана ес ЄСоКЕКНОК ЕСЕ КЕКС ВЄ щеКИЧКсоВе ЗБ все сстса сфер ксво аа є вка мчЕ хек ЗЕВС КЄ ЖИ восоосано зок са паст овис сова СКК соВО за кова кнсо зссховнях оасссаЗаО зв ася СеЕЖЕКЕСВЕ ТКС ІБ кала сонце см еоаЄ каксаакох ЗОМ СаВКОКЦЕ МО щас ста кає секта давав Вес Кееюнь завод М смак ас чес сома ає сіє тосвао Всесоваетє сао аКе що закидає спав сома с вокассве маска коєя За НАВ: песстЧесса зпозоавств кУкосцеес ссопцевекх тонам сомесоВевВ ЗО заст с «пава сзачссвац есе еею ака оєта спец а доскасакой фудакикюох дочко векемвоа тео євев сем МВ вс ое стоку ск ЗБЕ Вста КВК З поса педаокскяа саоціскосє асессвкєвох ацевожнокєс аа сскаВє ЗО закеєсюкс Ооцасоюстя фазу сє сасє ою ЗекВовкєв) сКт ОО ща десукщоє Зкиеоке свнмрає кеоцсокає сука квасу ТО песо сек шен еви Се Зав вана ЗКУВоВо ХВО паси перс саван ау сус вав з сем сстоє вогники сосок цк зссесцовов Вени е каз пЕслагсаоск аотасовсав потосвОас дасасеааея коса еп тя пек еса знесоегаї свое гесетесксо осн дакесквцох: ЗІ щесаводеею ссВтсЕкеО ок асКооку Яка о жеасоВеема КОЖ ВиКаЄ КЕН заесасоаооа всі ея оаасвЗах кесзасааса ке Тсвоску схо НН «амаесася тоасотєкця чоаесаоняє вассвосцює ооо докосекдаа З хашоа ек аоцснцкоя позичає зкстшес сво сюв ск жевКох За оквсзної асани севсоЗсае постасока кавесасоВ конце 3 звсаксоасю адезаааст стсиваєссог козвозаво возескассє осв Що зво вопаетас Замов мосая чем сно ка паса о засжюзасх зсзасуоюзс кізкаашеск вовоскецо Топ вОкся СКисВК Ва: За

ЕІ сінаВ Важно та сасоцас сосавцоаєи аеВОсстосоВ ягспваєаау І засво астзсясс ек ссеок є яцссасоюв сеаовоуех ох ваккке За

Теща зезаоот ка аск авіе ан неци вацаєаеев саке 338

ТЕНІС ВЕСТ: ЗКБаХКНВУ ЯК: за ха у «ам В «ій» ДНК «БІ» еучна посздовні сть «ЖИ» Оптичізована див МмаіКу ззслідшвність, що кадуЄ хибний біяювк ВОВК.

Ж вищозеаеси зсвзссаочах ев кещізсаасв песо сосссе щ заветсктва вецкнеєсвх стксккевцє зсаВке спа кека кефозе ко мес ков Весна х СКК ВИСОТ ЄЮ ТОЧКОВІ СБОБКЕНЄ віз скатів: варки спа акс Сецасвасву пес каока УКВ КОСУ стозисавос восоювісни (оо есоєє звофмновк єство косою ЕЕ тссоасадце сстасцаєов пес ассхеев адм ца совесеовє З

ЗКУ ЕВ ку к ск вгя Село КЕКЕСКСКВ я сне скжесамни КВОсКгеЮЄ ЄкеОВаСІОЗю са юве дана аєє НО свого єв векжтцеаеюк Сер оКТа суОБМеВето оєТсксоВ сдацачнняЗ ВХ постав зозсоаекаї сачсоекес твстсосавоє опа саєсеВає ще тасвезааск змо тс екс ас сва СОС «3 сота ВскОсстсса подача зесавсвом сб ско 2

Ессе санох акопсаксяу сасонеско аексєваксе ем енеий соло: ЖИ поста снсс асксижии сек КС КВК во ее Зо ссцацичаоє сенс тох шовсекеска засводекея Кеахекасає зи евогає що зе іси овес пОпесВев дес ска сном КОКО ЗБ заезуєєвсу соска сЗдеЗегеєв песасроок ацесзаеевв сттсвтоВеВ їВХО «едкесвн сссссвОКеК даасекекиЄ асан ю ОККО СВТ ще васзацесве смоаксас кексу квсвОцаеее секта квоє Зоо аа члесвксв: свансазсца сова а тассвсотоє поза снех оса АВ

Зассевсссе састоцвоне сові совас сен асікоєвсво СОКУ зе аесицокесю сспадаасеєх сиза бносксето Векасоссав потер оВов з кет ова сесагса Ек встаєте вссляєвеия Тедассевав сома св ЗВО везе Веб цК осв Ка свое сек ЕшЕ саке 3558 зЗстжсвсцо бсВОєваєвМ сохумаоОв Всетесоасю Вес ЕВ ссБЕВцсяВе з цісввискстоа аслоданост ЗзксшжнМхє Вс ие СОКИ ЕВ

Жкпавсжтос зсасосв ак Заскаксоко опсЗвОноце ЖК ссацокає ТВ зазцаснитиа всвссжав сс тсаше песен бквекічсає ЯКО МЕЖ

МСС ККОВ ЮК сКВ Кан цес КОС: соєве ла ановсаася зсскмак увасєоеккс часове чесасовє заскекоцае ТО дескякиа десеНнцНа ЧЕК жОоВа веб сй сескежксє квесваще ІЙ сацаесВосс соааракоюов кООасоцає фасовка єсо зсзавоєвІє саізестске та ацриесвов соВеЗийе ЄТОКЄКеЦМ: фено песто зване АВК свсоссавос оссхссосоВ своє сесстосвою всесовжеве саван є ЕК ваєсчесяшє спав кеВ шосвеоюовса КеВСКЖЕСВ ЗОНКОдеВЯ Ж часові іка збазсоваєва єдині ска аске єсазсда се саго ке тзссжагасв зазасатссвза сЗаасскаає сис есакосаств спасти ТО праквсвтка зодаевоксв спассесзва зісеаскаа секти ви оком зи пазах акотесссви сасовокієє сс Мб вкя шежОсОсНаКе Я реак асааоєссва своєю аеосаееке вопооваєсє заакскоцає 5 тстестаєє сиве ЧИВОгевеЕ спежВсіКев Вест єсвй Стос чав паса касета кех Савон сенсах ЗбдсеаєкЕ сазавтенка тео зчісвове фисакосоза окт Се веє кованая песоєт вва 58 оесоаеєи тобосаовх сааоамко засо асває дососпаєха зо я саостцо зда чавсаї сОжстакаво асєсваюх зосссцкова сосок КИ пжевасакс закасвасви место свве фас Форест ссасоксВеВ ФУ заказ ека сосвекекиї Мас с асежоюкиі Веста є МК ТЇВяО десвасиоці сеаКксовя ев За аеЕ теакоека КОХ ХВ засос зксоккаєсви чаасвосве Жесвасаасо Зкктєвшєю сени акему щО зазосксасиу сосвонесви пово нассасевеж соптосеніє деко ВЖЕ зрос ацпосаеса чека с ЧЕНКО цена саке МК підзеєце: асаженнюює сення спустооціеєв солЕсевео вагова ЗІ засасєкивсо застава нех сссеваетоє зола адасекасєє заасваюа ЗІ пфесвесовка Зсаистисях пдесатксве ммс гнсо зе та сасокгозоа ЗВ

Васвоочее зон оє ссесси ке поса тоссосвв се Є ЯКЕ пецвт он афаоцессв сао сукасвека асисскоєва Весна З зі асхзсвочкс дстксем ака ссаворєї збе ЗО шен зсаБНеску песен ва авенОо Зоо как З яка поко позов ЗМ хо В ха БУ «ЕМ БІЖНУК. | . : «иа вані ЗНиеіпоенюві «АН В меж Ото свв АК ІВ жі вва ЧІВ Сук у РКО Тук аа шуй Ви ва ї х ЗЕ 5

Ей Бех і жи «З Же я аа «1 бій АТО Щек ТР ОФІХ Аж ВВи о їх БІ вга сан АВ Ї1а ек цен чек 80 ТВ АТ Ве во ідо ЗР бі вве ен ; ; я 35 З 45 чаї пре Бі жа! Ту кі іа вве Біу їжи Ре дев ее бе тро оюіу

М ЗЕ що вне жів ТВ онко ех дев тера ее ев Бе іже вен ій їв від ІВ

Бе я їй що вжи ків іч ік ве ів БІ ТтВе ме; Фів ве ве аг АРІ Ка ТВ що 5 їБгівиойге біу сви абз одер дек Тук Бщів ХЇе стук ХВ тю ЇВ КЕ

НЕ 105 мо зів ау є - ке садку й лем вн ємо м дез ї шок га а БТ) тв Он Аїд ам РО деп дя Вів бі Бец до Бі Аза ма 1 ЖЕх хг Те діє се діа ази ТВ дев йхи вів се Тіз твеодівз зів дав

ДР КТ АТ БЕпж від ази ТТ АБ АБО БІБ Се І ТК ОІВ ЯМ

Ай вве тн оБев Тве пе вве ТИ ів ва зи фе чек ма тТук жа

Уч їч5 ЛЕ іп АЇВ Віз АВ ів Ні БО деб гяаи іжв КО АВ АВ УЧ БЕК ОйНе

Іще їТа і зх

З МК їх шіковів сік ткрошіу сам одЕро лів аз ТК Уві ай да Мі5 ТБ оз5я

Ущ З Ме дк вен дій дай ів гів іх ага тує ТР о БжЕ нія Суз вав аа СТЕ 335 В ТО тут ап вів ці ів Ота аб зер аг і ВГ ода пу вка вів жгв ій ага вка А ФІй РВе АР АР АВ БЖ; ТТГ оівМ ТНК ОМаВф ЗБ еВ гів жі АТа ісм ЕНе Віз» дви тує вв Уві АК ОТВе тУкК Вге Її ів «ах ща 5

Мк оБегожек біп зве тк ожгв бів Хфє тТжк о тВговек 5ег маі хі сів «зи о Зет Ро стяі Заг Аа аа жі о Бго ар іх ВВЕ ваз ге дів В у 8 285 вве озту хаї агдовге Бе міх іжр мес бр бе ме ди ЗБКОБеВ фл аа ШЕ щю

Уві ївк діяв Зіш так УВІ ага ет? БІБ Б УВІ те щік сів ІБ ке щх ЗІ Ї ЗЕ І зда

УВІ Же Заг Авц йво Твб Віз Піу Ах ага ї3а 55 Бе вге Бе туг

КІ З 335 с«іЖ маії Ре дал Ва БІ 51» аїВ їїе Тк ХЇБ дів взровів еВ о Ргу

ЗЕ ї4У ж ага вео гаЕ о тук дра їмк зсві вит яжр о рва Уві вве Ук Ат У ух яве дію ай РРО на тує Фа се ее ее йде сіру ма! ав вив їв

БНЮТВЕ бі; тек ахп міх зе дка Янко вне вто вн Бек БІ ЗВ ЕЕ 385 з що ще яр Зак ев веж В: Хе вчу Ви ОСІВ в к5а зе ія Віа ВР ТКА

БУ БУХ Й їх ажв дер їук Ек нів жа вав АБ НІ УЖ ТНЕ ВНа зяї дей їв БК че в чо іФ Фін щі бек бі вк ояза чис Тв аг вія Вго у ме зве Те

Я я 5

ЖНЕ нія аб бе АТа ТВе ВсО Те дяй ТК 16 вер РЕ Єв ана хе

Те вт Кі беФф сви Уа Куб жі Біб ТВ ів бів бефб вію ЖВЕОТВЕ я СУК 5 ще чаї жа! Аа БіУ БК між ВН. Тв" ОБіж бі вевВ ХХ ву АК аа ТЕ дит іж ів Бра Бе АЇщ тек ЯК. ЗІБ Маї дав бі вам бі шах рев реа бій ага тує Аква аїх Ак 3 ах тТук яїв бек УБЕ ВР Оле еВ 515 ' ща що

Ага щі тжк ма! те ої ів У СТО ага бе Зе Аля яТу бі вне вх кує ТВе Мек Ар ТНК БІК яБО во Бво ТР ЯвВе бра Зер ей ек яЯУ в ЗЕ УЖ А

Зут ій тве І1е дей БР ОАЯВ ВВ ТВР ОБбе Ве Мер оче 51 Зек бак

Жбче тВе жа: Ту «Ла дер їм Бе хар об Ту ави він ва! Бу Кі ден ага Ве сів ер жів вро жі ТВ АТ Не вве вк Аз БІД ТУЄ за ВК й ак іні а го ів ІВ ве АЛ УВК дам Ві фе вве ТНК БОГ -5 Ба ви бів Сі 16 318 БУ ТВР оз УЖ ТК джо оту нів хів де в

УВІ Заг ана ії хві ав о Схз дев ес а віч Ве Суз вен Ява ів ях БО 255 й Ас Сі сво Бек БіМ був МАТ 15 Мі вій уз АК ОБ Ще де

М БЕ БІВ сік дтв о бжмУ ік грец ів ака г до бе вуж ім жі Ват ви ЖІ

ВИ В "БЕХ іс Аза ака ФІ тер овга пі Бак оївк йо Кі тве хів Бів ага сх ж зро ка! Ба вуз Бін аза о тТжк Фа! ТВтг ого Буко біс тн Бе вза хх тій Ті5 ТВ ін Се Ту» о Бке Її о тТук меш Ту бів Бук КІФ вве Бій Шеб гбух ещ

ТВ т Ма

ТУ ВгОо Тук те о АкФф о ТуК Бі зм ака бі Тк Х?в БРШ дев Бе БІВ а тах та ав оїжм жів ТК тег свв ої дк о тук аж АЇВ вує Ні цію тк щі

Ах Уа ва ді БР оЗів баб це) тт рКб Бу Зесб оба іп вве вх чи " "хв ї БАН я КУ Ед 7 о тю шок зво бех кю іт леж: сі пу их Ех ех і шк МО: тоже, зів аг КЕ Сух сію вів ргз АЗпоАка бух дів Бе НТ ау оте

ТЕ КА ТЗ ща

КО з міх: х Е севам В муж оч Док. Яні Му у ж ожео чаю дог ка го АВ БеМ Ав Сб Заг о Су5 Ага АВ Чі Бі же сх 413 НІВ

В ЩО У во ща ях

Ніз бат Мі Ніж КБе Заг о гФгв азр гів хв чаї ві Кух Те дев Бе

БА ех В

Ат обіч ач» бен вва УВІ Зв Уві ї1іе5 як ої ЇВ же тТВе шій я вх вок КЕ

ВІ що Жах

Ж, -х Ж со Ії г ще иа у с у ам шк аку, і дк Си сн. «Іу ніх вів ага іно у ва ім жі ве дев зів бів фе жк ев

ВЗ В п ді ші: іх ів дід ва УЗ) ех да яїіВ ші фу рує Тр ОдЕ:

УР ОдіУ щі Мі Кв доя га ВР си За Аа ЯН КУБ бує ТКроАКа вев іє вк Бін фев ін сі ів сів тяг вка їв Ві тек бує Фу зм окух шою у і М РЕ і х З х З з я85 ща ВУХ вій іх біс чик Мі ав о аїв івросве Уві дж бе іп ОтУуК аж одій ке че І іо вів дів ав Те овзи ЇТо ав Ме ЗТ» ніх дів іа Аза буя Бк

І БЯ Зх чі іє зер лів ау біб А1а тує мем о кгОо Біб ву дек оті тіж вка іх Уаї айви Уші аа Хі бе бів Біз ев іже бфіх аг хів ВВ їв»

З ща 535 Бо яід ве Бе мем туго ав іа Аг ев УВІ ЖЖ кже Абв щіу 55 вве не о Ж А

І В ща дав ап Біжи Же оСжк ТВ ОДЕЖУ х БІЖ Ні Ма ач УВА «М за ВЕ ща ші ів дер ака ніх дез ет ми! сБервожні маі ве бі) тер овів аа з МОХ МН зінм У! ек ів біз Уаї вата Уаі бух вга біх ага Ту тує 318 мив мих М їв яге Ма ТВ 8їа тк їж Ко Бі Те ів бій біу Су Ма

ЗА ЛО 1035

ВЕ ів нію жів тів Єв ай йелочйк зо КІЗ вом рує вне дер 33 зах ДО дз Суз жа! ів бій ТЮ жі тТук без Ач дай їйг УВА Те Кже

Ж ОК 5 «еп яхЕ ТК твг Вік В щі» т» іу ту у Бу Ві Тек ТВ

Не Заг» і ЗО чек вво жа овга у Ту дов Ви ти туго вію дж вав ват бак

МЕ Бк вне

Уві вга дід вар їжте дів Зеко ма тб ІВ Ти рух свв отже Ве

І ЕН кеВ: дер сіУ ге АР ав АЗИ Б» ув Бі бе АБИ дта Бі пр Ту 315 38 за пк пеутьАтьк кими аа тує ответ зе ка АЗІ бі тТук жа ТВе їв БВ ев ціх

Тук вве ВО ст ек яв сує УЖ) Тк щіе БВ Ж1е ТУ ЗО Ве

Мах іа і що

Фа хіт о тне вве жів УВК 5 бак УВІ жів бе їви фірми Ме Вів

МІНИ ї3Б5 Зав ів «аЩМіх З «Вії 11АЗ «ай БідоК «ФА: щтужчнА послідДОВКіСсТЬ «Це «ей сказнстоУиОВИниЙ химерний йіяск ВТО КУ ЕВ.

Має ків їів век ЯЗ ок Аа бів сСух БІ бго Тугк ал Ку 80 АЖй ї В ІЙ їх ява го Вів ек обі їіє їн о аза хві від ЖХів Ре бак оЗек бів бів й ях Ко чві АїВ Фіз хів мія мжи муз Хв ТВгоягОо зви Ї1в ем біб АБ Не що 35 ів) веб ту Офу бек овве аїа ББж біу сем вне Азрогрен жів Тжр віу що 55 5

Зі Бе дви СІВ АБа бів тТгВ ОЗЕР АВ Бе реч АР ій УР ТВ бів й то 5 ща і«ни ів ах Фіз АкЗ їі ТВгошім вВе дів дга пів бій Аза жів бій 85 що ЗУ

Ага іш Узі Бфіу вбе бік ага бег оїуг АБВОСіУ ТК тів щи АТ Со

М ще Ве іх ім тгор бів дхв а5роБго 35 Ах Бр аїа яег бе ін Аг МВ че ак тах 1 ке їх зга їТВг ато Бе Ага твБг о ТМе дер Ав А18 ів ба ТВ ОоФіу УВІ Вга ї365 135 ке іївч Мет дів 13е ре біу Ре бів Бе 1 ТВР іо его щі тую ДІВ ча В 155 з кіп Заг Аїз Аза ів міх іеб АТ інц ої Аг хв Вів Уа Ве Рае 185 а ть зі ім аку Терожік зеу ТНгоєїв Ту дев К)ів ба ажо іже Ту Зег

АКкО і85 З

Ага ів їх вза цег їів ага аз Ту ТВК да КІЗ бух ма ага РНе їв жа 205

Тут дя Ті «у Бео Фі ах ви дян МІ Хі ага о вго Б3іВ Ум тТуг «ів «АХ ВО вга вне вів вго Бі веб отвк її; бек Ууі о АБО зо УВі дів Бен

Зме бко джи ТУг о дяв Їіє вко ТВ Тук веб Бій веб оте вух Чек щів за Ка «5

Мем о тТвкК оду зів Хі тує зве ява го бів її век овБго Зі АТ Ю діл піУ тує твг їв він архі бен ага Бі Бго Мі сви во ях

Ех Ва ах ее ін вай ага би ї185 ті їУк тТве ові Єін о тук вга ші Жік й

БМе са вал оагЗ ви жів їі ТК Те ові ім о тїжК КО ші Хв вка

КО ЗІ За

Мі Ттгроаїх іу ні біз УВІ ів; 5Звт Зег дк їМе Мік Мек меї тТвг що «т х же т «уд що Щ3 зга дхп її« ака Ве без га: Те шІіу їфртодів їн те АЇВ біз РО ТВ

Ж З 5 вгоа ве Кіз ТВгоБгО Жек о тТвгоББеа вро Біу ем ов бем вне ТК Ага зо з з

ТВ оввц бек від бто; її Ре зго зв сі Бко сік Аін ази ГТ їі 355 їі 355

Ії аг туб ага тт Бек ід уйі Зів біу Уаї іх РЕ ї15 Біб вге

ТУ 375 ЗВО с ме 2-х ех с «ек н шо кож сяду от я -е ; м Оопчи Біж щі БІ зи Бук ТИ чні кТЩреію тег Ообеви де Зак о Сви

ЗК КІ 4 що вза шій ісцй ту сей бів ші Бій бетг баг обед Тнгобід Ту Зак нія що Ї я 515

Аго іец бує ВІ УЩі Ага Раз А! ія его зви Ага хв вія Зір вто 420 425 яз іх» аз Тук і8 аг Уа кКгз ме бе бек ТК тТвРОМі вга его АЇВ і о 45

Твгобга Же дах твгоКі Зв ові Ахо Уві К1в зго бів гів Бо ем чаї їуз іа нів їісц ід век обіу тТне їв Уді ві ага у реа

ЗБ ака 475 «В

О1У вва ївг оБіє ол АБО ів зго» аг ага ТАБ жек сію віж га Ре їж В Ух вів тув жк їі ві Ав хів ава сі ів іс вра бів ага Тут Ага 5ЕЬ БЕЗЯ о із ато хіб АК тУуК Аїд чеє Тр отвК ази ве ак хе тує чаї їйк

ЗКУ ЗМ ЗК чаї «фор аго фіто ває аій «Лу ій БеаоАжи муУБОХКК меж АС

У ЗІ За

ТвгоЗі5 ВЗ кто зав о твт Бе бій Зег ВНе зврг отже АТа ТНК ж3в и

Зх Б Ах ща тТве дід ке ївгорне го ме Бабобівй Жвг бот Ббе їмг ма! т ліз

Р КУ азотне ва сег о МеК о Бі Ай жів УДі тет їв аз ага ке вів Бей

ЗИ Уа ЗЕ її Ве о УщІ Ме Та ТК ВБе вів вів Щі: тут Ар бу Б їж АВ за ще М зі ку» ія тА жа діх рев вне ТР оЗеє чего ба із х1е щі Би руб їве аер Уві ТВ аю Тег Ніж Т1е аж ру маї его їв Мщі ве в БЖ ЕН оів Ку ви Баг ож сів Бе суз сн Або жів уз АГ ЩІВ Бей Баг

ЩЕ Б я ів вух хаї бе МІХ АТВ вУБ г ос Су Азромів АТО а ря ян я Ов ха сів А КгО Ах Ре аго щіУ те дз АК осів у Аз ага Бі тТКр

Б Во БЖ агар оаіу вк очвт АжО жів зве охіє 5ів бі ОТ ахрвоаже хВі Вне рух

Фів вв тЕг Уаї тик ів го Бі їБгОРНе азровім СЕ туго вто ТВг хе У по 7 же 7 х ПІ

УКХ КО КК жк тує фац тУг Фів У жі АЮ ОТ. жк дух ЗбвоБук АЇВ їує ТНЕ аку

ТЗ У ТЖ5

Тут ш1івоівн го БУ Тут її8 ім дев пек оівй ев вени іш 18 Стук

КЕ Уа тю

" г состаре х з медалі вк Ж зни е р се ЖІ. обжск зей Хіе Агфотук аез із фу ні Сів уБу УВІ Аа ді вк дію Тие а Ж ТЗ пі жег іє; тт вта регу его вів Біб его ро їі «і Бех Суб діх 770 ТтХ тва сі; ро Ак аг Сех ДІВ ЖЕ нів би бій То о АхЙй РгО АВ ба АВ су Бек су аг ах і Бін цу Суз із Міз ніз Баб мів ні вве т й току й 7 7 джу др

ВХ ах Ії

Зег ін вв бів дз УР жі Су» ТвНг Одрі ау бін вза ів іх

ВІЗ ща 3 чаї тТгр о уйді гів но їм ї18 їх ТК Біб дев іУ чні 415 вка 1 заї згромаі Р ОоКИе ж ЖІ ЖЖ РМК зів АЗфБОБіІФ Між КІ ВГ ве сіу дж бю ові БбБа сем Бі Зів Куб вго ем оуді ІК біз АТ Ку о 5 я іа вті заї дух кв Аа БІВ їуз ка ТгВ АКО 83 1 АК БМ Був зи ів» в бів тке вед її щі тук ії Уує Фе 318 і 5 іч ок Ууді ївц бів Ме ід тик А дІіш жвЕ Ту ух СР АРІ ЖЖ Му ОК о УДО щи Вч БУ дет йід іем БВ Ма ба че ОБІй Туг АБО Аг осО (ТА Аїа Ав ТВт

БІ ща5 З да їі Ата їі Хі Н3є5 дів Кіа ах» бух Ага Уді ні Щек хів Агу

КІ ЗІ ПУ віз ді ТжЖК Мем вто сім Беу Жек за! ів Бко о біу Уа АБ АТ АВ

БЕ ЗУ я їі Бве сів ів їши Фів і дев ї1в Бра ТМг аа Тук Щек менотук

З 5 ЗЕ Б дев Зід Ага Аа УНі її фу ай біу Аз оВбе дер ази ФУ іа ат т ча ПК суш ТК; вав ха! хв Бір Міз Уві ака Уві бів ів бів дя дядй ніх 7 . ЗО зах ча « ЧНІ пу: Міо маЗ ожЖеерх Кк тунк пз; ва ках 33 дим Ж КІ ака щег уні сзу жа! Уві вго Сін ТРробіч АРа бів в) обет обій Фів п ВЖЕ зх ті ака зі бе Вк біб да бі Тег о хів зн ода маї тт АТ

Уа ага а ож БО бі аа щі ТЖК о хІВЖ ОН мас чі УМГ АТ

КІ ХИІ3 Щоки туго був із піУ туго Бім зів біж ско Уві Твб ох ВЕ бів охів

ЗУ ко ща

Фін Ав вий Тк аз сіре вує ВБе дже йжй Сех маі біб дію заяо в що

ВИ Дів ОТуг БгО АЖ аз ТНК о Уді пк оСух АБ АВВ ТУЄ ТЬК ОАЇЕ зв що ЗККХ такій біз жін тує ФР щу, тТкКОтТже ТВКОБЕе АгЕ о в5А АКе ОЯТЕ

НК лек зо їук ав ЗУ Аа тУГОФІМ БЕК Аа бек лег маї вро ЇВ А Ту чн дід жує в пін их ж не с ШИ лю й т жа оч ВІВ ую ща Бо фе ЖЕ Ту ЖИК ДЮ у ог вка АВ

Ма ХУ ца вм твг о Су Бі хвг вай Яке Бі тує Біж аа тТУЄ ТВУ кро ву

ВАТУ їв 185 вто аїй ТУ ТугБ УВІ ТНК Бе бів гар бів ту Ве о вра бід та жа Був Мі Те ія бів їіз щі дім ТВ ОСІВ Бім тТве вве їтЕ

ЖЕ 35 5 ча) ау цит Уві ім ка їев о зец меж бів іш

ЩО 3155 «ВН Я «Ех «ій ДЕ «ії» шрЕЧНВ ПОСЛІДОВНІ ЮТЬ хай кю тасвність, ЩОБ кодже Вр Яску їв «ММ» зво еаптслцла ссвзкавокє ссттатвате Зі атах зсстовзааце ЩО ваваасактв ска ткана засад казвааткса суха іо дгцкасітва се заазан мете ряска зошрваче креєветков ЕВ зо зхавтвтоОЗ (СМ тав сЗавонієва Тонко КЕсхтсВоЗ ВохВОвАВа се хтааткиаке авацоаханє вежі нЕЯ «Зеацехе каві вВО вехавсе ще схе сктахозеов зас акеме Ззсзскааааа зимова КИЕВЕ БО застсацекї свхаована некоссасх сцажетсоуВ каакіднева тост а за весла ста Нос вах сееа Мета СЕКТ ЗЕ БІВКВОХ жо пас стиив втакарік виска) знкзатчкт саке за 54О цпееставсяє заеоавиках аазіцакЕеа квувокаеах зепаеваютє свеконтої г текзсеватг вбхетоктсв Кіт хвіза втаЗо тво сретткнах секта тавовй щі севалніакІ псосфижсска азвофашнакта сват тсктвоаТсЕ ока ТЯ сттлезаахї звсозїакксо засвкахссв ахвссвасха заауксвакт звсавозоцва то акрідквсав втссанттак бтсВвсевоцт сала а птах аєксх беанкя БЕЗ ткрмниває сасвсосскак фвоскІвкта васктоакїїа стасттатвє фар озазтах а касяцвахк часто шен кцаз хат знов ЗатоВхаВех БІ даМмлеавах хтЄєсІззуа снах зсаасвнсва пассввсвка ЗЕЕхВЇа МО сет хаске сте естодксх свактлехекх батадавкх асо ЗНОВ зОаща

Чеки оа чосостватах тактаттавв татапвасвав што одя пюЗавфацов їмо ках каах сазатавсо беазгаФфске хлсєзоаека падав везе КК 123

Зиксавкіас сапікцвево заозаснає ставзстенах візвісаксв Зіка ссах ї250

Зссмнгк сосзассах спзооввиаея пласкі вкхВібквав зотскоаи 3 сте квоз свсезтспхва стосааскссх асваахвоМе ткратесаця ЗпесаїсаКе зх8О аа смнпазивеє абаїакаске саоксомкна стаєте хат длопадоукКе 1 зи коз даззазатаї меїїсгвасоа нозвцево пассвеке сІаївстаТЕ УМю

Зкхадквіае знюсвате зеосованв такса падівсцева око аКХ 1 зсзааісза члазкевсяї вами ззсззаскм км ов їсавкітаде о ззавсеткюв зіаксоопкаа ссситлонаєв БЕссВВТСХЕ пквухквом авта нї. КІ дівесксЇта «актсессвах ведссаоої «кт сасве свозтостоа фаст ї245 тсвмеюнако засів каї разсзаакх фас Заєс свічка зас 15щ0О щфезмовакато вгБівомюа впетсазцзаз во кзваху сасвастжно уТскЕссаВ. ій «азвесова» сазавасяща Фгогракеня кажесвіакта зевавамнЕх «казкам їчее же ктах сецатоавВатЕ ск стазит дааавоуєт палет охавовсвая Ми свсмоааас лості совостоеник ас тксазо втскаааі сне ча засмнаовавс свозкспкяа кеопвезо аатзсвуата скоса ка апомоацах М заосптвикксз воаазакта сотка ссоЗохвокі кв УаВИока сітка МУ вика аззавахаца сЗацієцеаа ків зкзсссвосєв байт тавша гав щасті вопвтазесв зцясхасий ВіскаАТКкза сісстаква тдснванках жив зизаєвотаз актах саци хвсошекксс асо гкісадксса аацтссВакЕ 2358 щенапснів зав кяаа ссрпатніоса Зсасвсекха звмерважхсе саке ах Ку хастсочуа Фрртущаов авзакожнеєс схов ВтКваМкЕеже сесія «35 зам сок вада: «ОаКа: ОК садна Зах вм о сс о зсеарЗанах савастех сова Зах абсо ХВ позив вості зЗаапеася аоваанаані боацаовова вопспаанах ява китах Есо свакааамвЕ зіва бвооссваанв аахскавнов КТК ЗР зкдавсксксе паквєзака зссзевами цаеазсзаата беосзакват снізсоВеа КУ

Чатизасска гака ксрмвна ас кЕссзи ЗБЕ вес За зіазасокна сквкекетоаа зовано сбозсаееке кеасмита спека ЗЕ дак ку саїква вав сісазтааха зсеївесвта сівба а Ні дівоча квОЗідія ранах чвосаксвіх світе соска ваВ Зхю касами навіси са заці МісІзЕсква ЗК В секс ЗО зіжвсвесУк асан атака оси чгвав са каюа ЗОВ ТК вахсвсвонс азстзевахх савосвастоє Зкасзацсво вавїетакст звасаневов 38 щфізакакака здат такас тТвсщактсва зЗазоватато зу всаа сакстетес ЗА «звеннмес зіцасвазаєс сізідлазас «аКВЄКВсВО єВссВассоя гато сВ З штІЗзхазну аа нікака хаканаоов вона ЕакткЗкаа кс ця Я папвтаксароЗ жкЕзасвкасс асхассвв й зуствеогов сагнвазанеМ зач Ее а козвшавакся дент акс затоки заЗизаасни запшавсвех хапеековає ЗЯВО зар миаах жастссіках соната що кам 3

Ех хи ЖІ хащах ДНК кМї3х уча посяде «о» «ВгІ питнУїзована вав ваїєу послідовність, ЗБ кодує ВТС КЕВЇ. «ке 3 віцаваксо зе снОва свв ссикса ВС сВака косо Кех У водах нееках «шЕметксНіи павсаксВ сзБацакека СКК СВААКЕ же ска сстоВ Фскткавцаа кткскізсса ВОК КС скоса сота евас З ктсцтстозЗа зсвтессва созвовасен за асес сесшвовса пахова АН ковка «Ввоспозікас засос чес кВщермкави стае кався поета ща вепосми сетасцнова аква теско ск ссваИ Оки самою З вс св пеалалдазе спіда свостслтва ссср саке Я винесе сежсЕсвивОє Кахсесоооє КтсрваЗскце свое скс вес сВКОсх ЩО клюжсущеска ксхжасасесх каксктсске соска каска сзмрачекнх Ка вок аавксавове савеваскис їастесвие сонати схе КУ «квсвсзансс аск зіао скІстжезВс Вес сктоО ясаввекжкеВа КОКО сов БО соосвасниє восасттков знан аква есе СТЕК тв стежка агсолквтси сасотассеи кекс га Фест сасвацвацаа БЕ акскисассв вжива стос овс чЧескавзпсо зе вкакокх «оваманакх а

КПА сКклскжоВе Заасттскко валок ся сатетвеве скевотає зо засоцкаиВ савсастопес проса ско сся псвовасю своя ще звасатжкцєь ссср сфрсассвки Зоссесоафеосо звоєксаасккв секквесвов ме ледтжжвогмт Тесс у паЗзсстєжіє тТасворвсхо вхо са сях 5 засос сесосоаатах свостахссво вовна кссхкоївна вача м кксвиКкак сЗаасвасоеМ сезосацека света З зопсасщеєх уза М спевссавоке паству сзЗаціскаши схсоаккваає асоІсясвВо ВеЖИХОСКВЕ за живи соми сзвоазвасзса замок вствсоєсва зас а ще ктсацзкеоЗа сесасвовіє застаскккс ВзбсаасВея ЗЄбвассомк сві и ЗВ квсатсекає ссоксазвек ссасаскесво лока ксасКдЕОї соедсакса за щік ооо сстаоцеро поІбчеовов восссткеює всассате Ук шжваснісй вс жвекх прсасвдадо схасвКос щсахоуте ДИСК їм чосцпачествс педтствовх Заєсоічосю зисоаааоа ОКО сезакксВає Мо аасзсщдесва вошссосюмх сскастцако КСтссвозесі ховав: засо саах 158 зккаєкемся ск скковх засво кес аастісакоо Мр спи КеККе ЖлЯш зро аа вра све сао часа соФфковсрає васкІтсца АВМ сксоанівсй зкхтоосо Звессаоио зспяесавсд кокс жкевкх стссавсаае 155 своуатсоцес тапаацяагсва сеїпдесоас їгассасвіхв ахсвайцідко сао Е Те акт сессії стесхКоде Оле поста ссоа дамі саае ї3а0 папорж пт скцсщи свмниннНни КТК Тоєнаод пелевастх снрецесате га жк сбрзазсваоюЗ сІдозоооос вакассдаси їжа ох 2Ммю пвсовощекоВ зосазвакта счксасвово скщовсовокх Хеоекоавтя ктакоосвов ди тасстекВс зааззасс сЗвоатссаве кіс возскоЗкта сао ати жи їаслісі змриавсваока пувсстсвво віствсєкіоа маса сода кає 235О пвоассоекея псом сасвуаектех скік КеонилкКа ЗзІсвесивІс кВ жнзина о совок сзаацсвес ассєвоКтоо вусеааеєє же каща Фа коастєкещес содсасвасца оваЗЕФєнпох сассаєстсєє ассвсктева сесоаасВІс о асо сезон саасоацанс СТО НІ песпхаткїї сазназсаау ТАК змназцасу Феквсовсїам зсбозоасайс зво сопвасацай зок ЯщО пев ми сачожх саззанезси задавав: шрвакозкаа вини ТБ сщевесто: заасезисах сзесквсаво ззовссавоав все спеки аУщи шанс мидсаанаа поз авасі двоаєсайкв хеосжвеке сема ТО загавасто сл усоЖх сви с їВІСЕЕСесо Востока паси.

ЗІВА пк Всха севістісев позастаоя во х воевосвосха стссктатаЄ за зас ачооа асо сва баз хІсЗасаасв сити ска а ав саеа социсиесои попссвоває аассаксвек суєта зако В «вза екта зако: заабЗКн ЧСС сао ка кат скткеНЕ тео зас ассациа сівсзасцав пасів сві жвова пек ЗО зазгвсстпвсв висіщанах скесвакіле «фан есе савеанкнкя 3 зЗисассуфсв асдвскаквк ддссакскав зворот ззеокасцта сзовесраца За жено жедасовсевс гхнсопазексо вахваслсюа пасковеков кій ЗМК сдеотасевн; здазевеста своею с свиню асасстоеза Фесоваєаао ЦО заствечака встмеаеоос всхесЄ вотисосов сеанс поза ех жа зи укл хи а м фея кажи ит жука дип ик сл учелувит вх сотку зи ссваацасоя зав скоу весен жав зосасаесхо касова Зав ак сви тк с де Із зоистьсавас тон есах заз е ЗБ хемах 48 хе девУ «ака» БІЛОК «Візу ща з1н5 фмигтицівазі «Ще ЩІ мет амЗ ем дви г рт й ін дав Бін гі Зі ав аїВ бенодеє 1 х Ва 15 їв рус ад чаї его ана ніх Зшг дів ЗУіВ меж дер іні Бак овта аа о ах Б ай акЕ тів і аз Чех ем ух МАТ АТХ ків бік вай Аза зе АВ а зо 5

Бра вле ФВ его АїЗобеє тйг УР дів тТВРобту ЖІ яаее хів Аїд вЕЖ

БУ рах М я ЖЕ що дез Кі вецоаіх Уві бро щі УЖі РТ Бра АЇВ Бі іп овен вв оБег їх т 25 53

Рв о тУК Ват РВЕ рр оці Бі пів вом ТКБ орг Баг Ту АгО АЮ БгО

Ех З ВХ

Зжровів бів ві мех ші міф Уа! Бі біб Хі чаї дге зів За и

МЕ іп ЩІ жі твК др Мр ЗВ аго азр Те олів Яіїе ліз дгте ль Зв о Бкж се т 5 З її 5

А їх КЗ іж ок Біж тут аецдо шеи туго сів Бій 1 сем оБів Вб оїтв Бенояве

В 35 М ди ага Аза жав дів дб) заго ат бог хі їі вага Бін ага тує ків зів БЕа вів бр ав ів ТВт ТВ Аза фі вРО веб вне пет зів Ага

За Ка ХУБ взв біз ів ві бе фей вен оююж Уві Тук аїш бін ТВ жіа вев меш ніх злу Без бер їжи вто лавр ові ек сем Ре іх век ів хУв у веж Зак лаг вії Ав У ази ІМ тує Туб Зх Те тя ХІЖ ака тег «16 ЖІ ЖІ

Тк оЄї ЄЇВ Туг дек ази Ніж їж УАЇ ція ТО Ту аз ТК ОБТУ меб

КУ а ХІ5 в дин ака вже Ага вію їв їв аїх бі: ве тур а ас тк вх ТВ рве ага аго БВ ВО ТВК їжа біЖ мі б» ве фев Узі віє КЕ ВВЕ

МЕ У е тео БеР тут АН ТР одее МР Тев Бе Хе Бео тк Тк АТ бів ее

ЗО БІ те В сів ма! ТУР ЖБе дж Бго деєб біжЖ Уа за вів ек бо 5

ЯН ле З жа ак ЗК ВБНе аг ав бі Ат ек Ве ек аза ів в Я5а дв хів її ага ів Бе: Віж рев отв ажр вне ве ТР оди сен ТвК ОВ

Чжг тег оаге ка Як ба УТ біж їн Ве іє Ме Ям ро ТВ АТЕ цію ні аке ХВ Те ОБНЄ дев бе Кі ін ві Бі бас ТК бак М 355 за 385

Мег узі тує Бі із зів тк аа ко хв) щВк УВІ зе аа ЖТЕ вКе

З ув ЗНУ дю и ЗКУ не Ві дев ян я і Жук дра че жі его зво ва І Ж меш 85 ЗВО З КУ

ЩІК щее ву ак птж Кфєе жу тує ТУ ве отне АКа УВІ ве бе Аа ж М ва

Ме їі Вбе вра аа ніз бти авр тів ді ТВб Зб дез ВНе СТУ Ні

КК щ35 Я веб і ж нія вів аїу КІБ віз тТвЕ Бій УВІ ув аз бак Яхве дів

Ех ! Я зах зви Вр ов щі би ТВе ів Біб ве» аа ТУ веВ Мія Бе зе ніх

І ях Я зи без пек НІЯ ХІЄ Жев МК ЗІУ ба ТВе ве ів бр ба ве вк

ЕХ ла Я БЕ щу

Таї тую ек ттю те ні» я век ків абе ам ТР дей То хе дев

ЯБЕ я я -и вх ага жів не Біб жів т» зон УЗ рже ві Ні тек овеВ ОТ

БЕН 5 У

ЗБК Те йК о тне жа УНІ ре іу ва Бі БНе ВР шу БУ Аза хів їви Яке аг Тйе ек вію шіу Яга вве йїх Бе зек ван жі де Бак 558 55 ща ав яви ВУА їн ек ІЙ еф теє ага я аву Те аа тре ай яВе ща ща 555 ВО їБЕ їв вав кни яку її їук уві ТК оУВіІ аів біу тн ака іо вве кіз д1У ія Бе дермі тТВе МБ ах Аїв ої АТ во Бе те вае

ЗЯЕ ЗЕ Ж

Фі бак Не я Тек Аз їн 1 аа те Мі Ве ве вве Бе НЕ

Бох ща ! Ох вка не Беж БР кенотне КТ Віт ЩА вх Хве ВВЕ ЖЕК его Ту дяй

ФК ЖЕ тре Уа! дев о ве БВЄ (1 іже БІВ сф ба БЕ ОА ТНК еВ щ 5 ЩЕ я ат АЗЯ Бі ЖК же вер оірд ве дів вва бух яТа жа бжт вт Бех їх ВО Ж те Те як Те деп пк АБО Я» веб вує ЖИР Ор МАТ Те ахЮ ОТЖЕ

БО 7 На БІВ

Між ік АЮ Бі Ук? веб язя ем ЖЕ сім суб мя Бек оАКЮ КІ РВЕ

КО 55 ув во вер ке У ве Щі ев во бів іш маї му тує аа вух бра же Баг оажще бір вагу Ах іжм ув сів вхю бета тат вве їв Жак егЗ 7 її хх яку

ДРУ 3 ТАЗ Ж

Хі бБероБіж ія те аз» вед щі гр обіє РУ бер отве Бу Кі баг тах Ж Та ів іп хів ої» Ав а гів ве гук Бі зай ТУук ЖЕ Вр о мец вго

Ж ТЯ ХВ ятуУу їйг ді Але Бі Ку тТуК ка Те Те Бе Тук щшів уз їЇ18 а5р

Ух 75 55

ЗШ Жар бів зей ув Яеє Те ТАК ОоЯКш тує Фів ібо яга БУ туго ЖЕ т ять ТЕ піц азв пегощій лерозеу фін ї1е Ту іш; Кіз АФ ОТУК АБИ АТ. Був

Б м я ва

Мі бі: ТК оре) Зег ча! ке біу ТВ ОБТв Зб вто ТК) Бо ак о щег ! 5 ВІ ВІ5

У чаї тТук о Бго Зав Біу дгоКух Щ1Ж ФІМ РКО кН Ат Сех «а БК «котів Ом тт Аяа Бе вав ім бар ос Жак о СузЗ зга отук сту В - и ї сх " У У х

КУ М Кт вух жк ді Ні ніх 5ароМів ніх ВВЕ Вроцем АБ тів Аврома щі і 55 Я

Ст Твгодер ком ах сін аЗБ сни піЖ за то жа! ХВ БА ух ох Тте і» тнж сіб ар сФі1уУ ніш а3а рух Бен бів ви ев єї: вБе Тв ли

МАХ ВХ 5 пів ву Ба еч и і КУ Дій Бе беР АР ЖВР КЖжУ АР АВ ОІВ вс Зх а іт інж ге аго азш кує Кук БМіноіра союовіт сви ЗТ ТК ОБЖ ме

Б ах Ї

Уа бує ТК осів АЇВ вує ІБ Баг УЖЕ Ява йія ів: Бе Ві Аа БЕР

Б 35 зад іпотек ви Му сви бів діа дев тб дав ків Б'ю 18 сів ВТ 1 зів Ази Гук іп уві Мі: ага іє дга вів Бе Тур Бе) Ук БІВ БВ

ЗБ ЗУЄ Б

Бгто уні ДІ) Бр сек ХТе ал віз аа те Бе бів це є ою

Між фі пе дуб а!5 ГУК ще жо Тс ввровіз вро аби ча в ке

З МЕ ще ди Фк соввр вне Ахи» ва і їжи ее см тТгродано УВЗ ж ію пе 7 жи - путч х -

НО ЗХ що ків жі вер бів ін ат Мі5 Ні АВ НК Ж се тат ме ще Ол З ек Бін ТР ОБ Аа бів Уж ме Бій Уж ФАК ага Маї Суб вро

МЕ Ме М зр ага Ту тус Те іс де ув ВК Яів тре вуз ЛК БЮ Ту

ЗУ ів Ту Суб ма! ТВЕР ОЇ Бе ші че жів яка БА ТК яв

ДО МУ ДОД

УА вжи щу Ве АКО йБи Ра жа шІіН «Вб іс уаї тує вро ви

ОКХ То ек ах» Їїви ЖІ Тек Сує вані аа о Же Те зви дви БІ ЖЕК 1:

ВК ЇВ о йіу ек тйе ев сту вжи Жеб Тук Аа аг іх їук Бін а віх їжк І АБИ Аса ТК ЧНІ БР яхя ВЕБ заг дів Бпе УЩі ЕВ

УК Кт ХР тк Тбе ВУ ТЕ їж Бін мів бі ЖЕЕ ТЕ ЗВК вер ЗБЕ ОВНЕ У

МІХ ке) ра

ЯУЄ де МІ сух Ма! Жак Ач акф оїу Туг аку ба Мі ТНг Бе

Бен б Аз сію тк Уа Тв без Фів БО Фів тує ВХ Веб ВИ

ВУ ЗВ ХА

ВР ожів і У жга хів бів ів ші ів ЗК Ов бю те обнЕ

З М х ЗЕ її Мі щ3іу вет ма! Сів цер Бешозра МБЕ БіЖ У

МВУх Іще ХА Я «Ке я

«Кі ЕЕ «Кі БІЛО г. щшЩтеУчий пИиТДіМОЗруьтУ ке щтужЖМиНа ТМ МОХ їх «КУ «Ей» сконотюУйОованний химерчни Біле ВТ КгУ КВ, «в 13

Ммек біс Кі й ахв зів аз Вів Су ді БР) Тук внмй КСуз ев вав ї 5 ке ТУ ап вто щів Бегошів ків іви дви УЗ дів жів ва Зве омег птн Сів зм ЗЕ їй « 5 ж чі віз ців: жів ні Бен оіже Жіж ТР А інв Бі Кез Бін ажа Бое 35 БІ 5 зем о вго щіу жі ває ріші й ве бі їжи Бе а йо їж тур їх ім вка фу щі Баг о БлшЕ біта вда діУу зи пе ба бен хів ус ооту

З З яка їв вне ях ом аз оці тгрозег Аів Ре рез дгу шій ві зн іш в 70 75 во мо ї1а вжи біб Аг Хі тйгошію Бе АЇВ Або Бім ін аа щі їй 83 ще з ето Бжи ж! фу ве бік ага чат тек Бр Ожій тує іє бан оаіа бе

КК ще КН мук біз ттросів лаяв Ав оБто ав АВ РКО АВ ВК ОБУ зів Абе Уа т35 І Іо за5 й кож ке ага пр оага кре ага ве тВг яв ов ів ка веч їВг обі Уві вго

ОАЖЕО С ї3З5 Що іез МЕЖ дів ЇЇ вге Бі вМе зів ев аа їВг оїау шек Уві Тук дій їх їі ККУ в

Зі же аій8 азч зи нік беу дів се зв Ага во вій маї КЕ вне я чо жух Зк 125 ЖЕ їт5 сіу іш ака тКо ойшіу сени отве обів Уго аз Їтїе чий або ви тук ве вт) вжи Муз ан фщет Хі ага др жу Так оса Ні СУ УАЇ дк вна із5 опа Зх

Тут Аа ті Ву зви о бпіу б із аз Уві їі ага вБге жів Тук Ту хів їх Кк ага вМе Бій яса пі сви їБг жів чек уді ев Аж ве УВІ Аа Бу 7 Ол я ай с УМ Кен я ве кро аща ТУР АВ КІВ АТЦ ВР ТУ ВгО КЕ вРб Те ож Бек бів

КЕ ее КАХ ва же дгу іє жі тТук тТбе джв Рг їта Кіз Зек Бге бі аїв ів аід Бім кек ТК цез бій аб жаї ев веу біюобтє Ні ре Меб ар

Зх зва Я м «3 А вне ів ях й ев їі ій Тек тк оБі» сім тує Ак ові її Ага

Чі їга о Аїв Біу ні5 їв жа! бій зе Заг ага ТВг сту мех мех ве

Зщ5 що 5 за пт кій й ІК: зт ж жні рег бе ув дій а ху: їз їх ТЕ х кап одіІв Ба КИ о бге См БУК Бі ТБ ОАЕ АТ ЗБг АІЗ Бі Бе ТВ ги Ве ків ту Бу б Тв обі Ше Ен іш Кк ї ій бЖЦх ох дебу га Бл Юіе ТК Ба зе тТНгОобНв Бе осі БО аа і еНвоБвК тек мед 343 345 З їйг ву ее ЯТ Р дів влє ака У і) Бга бік вів аа же їТе ах З пе ху ЗО 55 хі ага отже ягф тни 5егорен Уа б Те зві щік Бе Хі бів вка в 375 ЗИ 55 аа Б'У Бін дій і отТук ака УБі АКЯ БІВ ТВБ і ємо азрв ак ен з5 ха 355 СУ ка дів іа вт рез сів БУ Біб Бек Бер Мен ТВ ОСІВ тег Баг нів вец нм су ВІ мАї Ага Бе вія бів ек вве аг вам АЇВ вів ле еВ 325 35 іви вза тує дій вищ зді ог беж БНе заг оте ТБ нія згц оЗег Аїд.

ТвговБРО ЯйкК аж Те гів аз Бр ж» Уа бів ТВ опій ків вга зе

Ам Ж о «щі БЖ дів ІБ ТВК ем ів барв Бі Так ТвеочзаЗ жві Був «і Ре ях 474 ях як ау ня Же Фі біж ар Кі дев ага яко Твкобеє с фу Бе Ві Вів

ЯчЕ 235 «їв не бог де Уві вай і й Бо зх іви Зак обі дека тТУК й. дів имя Му МІ жЖщі поши вим Бе о Баем ЗИ шІВ АД тег м шо Бе

Аза ваги їж ага тжг Аїв ХК оте ТВк ямі ївУ др Її тук жа ТНК - м - ку С я. сек - жу ут шок ся поч 5 рія ше чаї ата віє ота ака хі вне вій і щЩіп оре ав іх Твг Мет: дер | 135 й БУ о

А з щі. від жк їв се вна пови; вах пес ах с щї до жест пу

ХІжЖ ОщІЖ ж БЖ СВМЦ УЮ а оба же реве бугая ТВ Її ОМ

Без Зв ха5 БЕ тТве ліз ВБа Же рве ве Біо ве Зак ває его омав тв Хі шіу йїВ 505 ЗІ 575 ер отв вве хв Бек іу Ажпожів чаї тує жві дер орд я бін ав їі «та еді тк із ТНК ша із ді ші бує вх» і во їі їн дій їж зів ках ВГ од аз пг КЕ хі) МІВ йіщш ТУ АВ УВІ Ух мі 5 я ВУ

ІВ зу АТ жа! вано Ав зе Не ТВК обег ее дев Бій фі бію Бе 5 І ко ук ТР о АЗИ Уа ТР ОА» Тук Мів хів ахв вка Уа! кебоатв ме Ма

БІ ак З вав

Суз їгв о зек ази бін РБВа суч іве азоа іо мух аг ОТ фев ек ща СУК Б ох сік Фк икх вий В ооркх хи ву. фе скул с ж дит; зх : пів ів маї вує нія АТ цех аг ев Суз вав Бі аг ав сем цем як ща ув 1 АЩщО БО ав рве Аг Шіу хів Аза АК Фів БТ ар аг БТ те

БЕК БО ВУ вк ЗК ЖВвР ов ів Тве хів щі ші -1У яв вв ді Бак їж щ --У МЕ іш Ав туго чаї ТВК ов виб біх ТВг о ББе МеВ он Сує тує Веб те я та ТІЙ ТЕО

Тут еи тТуК ФіІй уз ів ав ів БВ вує Бе уж Аа ту їйК одеВ

Тех ХУ 45 тео ців моз ага шіу тет Кіз 5 А Хек й вже рев бі хе тне

КА та я І

Кей жі ак туго ажи АТ губ Ві бів ТВ жа? дяй ма Ба бу ТАг

ТОК БО те піт Бек рем о тТРв вто їв) зЗеркояів вій Бек окт се офі рух ух пік

Ттта ТУХ ЗО !

Зім вто Ай ака сСух АТа ЗВ нія без Фім Тгр АЖ Бгто ав ів Аза

Сче ек Суз вка дя сі бін іме Су і МіЗ Мі дет Мі МТА ВИК щі що ціх

З обжк АВ ІТ ЩІ УВІ! Ф3іж Суз г АВ СНО Ба Бім АВ ЖЕН ОщіВ а ХХ КІВ зві Тте ма! же шке їв її ім ТВ іх ве дія Ні. дів дед ЗЕ

М Кок: Кіш о Ммие гу дж БЮ УК ФУ а ху НІ дів Кя р бе

ЩІ щАВ ЕХ

Бім аа жи ім кае їни хід ів вух ре іже УЩі Оіу зі дія вес дім ас УВІ муз ВК Віа сім ух ж» тт агО АчО Був АКБ Ох Куз

КБУ о вуз я зве б'ю БвМ вів Те дай Хів Уві ТУ їу5 С АТЗ Буш вже ще охщі зер ві ів Ве Уа! аз ожек Фів Туг дар ге ія ів лів ар отве

Я 5 БЖ ве їі 33 її Хі ні 518 іа Аа іже Ага Ма! Ні Бек Ї18 АБО

Оіч о Афа тТук цем овго Фін озею жек ма! ста го бі УЖ; ав АЇВ Кі її вне сів сг ів біз ші ага хі ББе тк оія Тук жеБ ЕВ ОтТує

КЕ Зх ща Як досех їз даю що ди ж умо аж ж о» ас вх ім рми ЖЖ ав лів ага аа жі їі Ух АВ Обі» АЗОВ МО Ам Бі Кжм Б що ап С еакя

Кук Тго Ажя чні із і мі У жав Уа ів вів ЗіБ дей дж Мі

ЗО ЗИ ща зга чигохші ім У Ві во оЗіно о Тгровіс а3з бів Уві Бек вів Бі маї ага жа Кук г Зі вага Бі Тут ї18 вер оака за) твт вів

НО Зх за

Тук ік Бі ші тк БТ оБіз ші Жук УВІ ТКе оЯфв ніж Бів їїв 3.25 ЩО іх ів ява ва Те керівн ме) зу вве бек ані Сув тав ів лів

М 135 М іч ЖКів тус Бр вай ай Тис о УВІ Те Суз аа вас тує ТВе дів тВгоБі» біз Фів туг БТ птжЖж їв тує тег зек га два зга Ж

АВТО М ЗКИМО

ТЕ Аза БТУ 14 ТУР Кін З аБа Бак бее маї БРУ АЇВ АК ТК

З Жук хїа же ів пін о рих Ж скан ке пе яко сук ха ка чек діа тує ЗВ Бім оїшжо ІВ ж Ве ов сі ОБ АРК АБУ

МИ їх ЗЕ

Ам отївк Жук хі: баг оажиа вію Біж Ту ЩІіМ йо Тут ле Бере їжу о із Б5іу ЖУг жві ВК об Бін ме сів ТБ БВ Вге ів їВе

М ЗАЗ м аз зух МАК тк їв Фів бів щу ів тв обВів «і» тТВе вне жте 3155 в Іл

Уа Ак БеР Уа сів зе офен о ее меж єтв Вів «ВІК В «ії ЗО «ваг ДНЕ «А В учНна СЛІД ВНІ КМ «ший песліданність. Не кодує Ве кежікві «МюЮе 34 вішчавеасти зіазтсацва сс ченІЄ сотка твакх тео їаЯв хестцвавне їх пезахасеан асассвсвже сів таа вас сввавасека ккезааоВКе їхо вечкосікза кхозововв ско сся еко оаах КішсаКт СК ВК Ах ї5 хІватаниМм чаакотЕтва сова сая оф аї тек ООса пахвова а тж:звкїазти задо еви: (пастка ЗОаоЗОгааа каста ЗВО Н Ж куванні чт аи зі вкз саке зваво века сова З засос кх свазоваво ато ск сеактсоь св віца СКК ЧИ чяпМмині стсосвісак авиїскавех Коха ква сквеиковкс ТОКІО що киаїсанска ахотвовеикЕ восеставжка зовозевеиа как еккее ознаки З пас товсас зазсвазіаї вав заст аах свенавактє саке щ кахасавеє Зп сік авк акне кіни ан ЕБааа тек Бо

КЕЛЬНІ ЗК зання восантикоке КосхсчаНсх кеВ ККХ ТО ткІссяазке зсннасесв звсвтЗсса сао звота ааафесеакє васановов. ЩО пЕпІдтно яекКцнївО ТК Х псвснццсве ЗисаЕсх кезОа що тізацазахс сасвссіве зпвскмів виксезсіра БІЗКіїнтас Пи оуках ОО сосисок всєнв ацаасакоВ зіазвасств цізовасвоо хакозсаЗх ЗБ вас стестеоа Бас о зказсзвсао звссазсвсо вектатавсх Зоо с«етвЧкаеЕВ ЗвкскВоаох КиЗкОНВкї фаіваавсві Катсвлеєтес дасте сви 308 часдавсю дазствахакх каїхактаорз хатвовасЗв здо оа видане з зктакесавс савахвасюи кезасяссї сасвовувая дес воно Ме

ЗвІсвактак соті о сховані аох ствасткит візаксаосз вес ек ставка сосні есвВЕх аніс пазесеткав втсвідсеве засо 332

Екстра своих Босак е дкчавкасав ХіЗЗієкм ук Ка КВ ЗІБ самка смів саке сиаксоцехв сваківіаоа зазори Аа зе Іакац Ффоиюшеовакак скіссцксов зсавосвно здаскактує гтЕТащВах З

Зктваїству вісітнаютЕ чісасавзцю патсомасів даасзязиова гас ктнек З агІвасстав жаатктасих звсопокеасВ збідансдав вхткоастев гсаако 3052 ззвазсоатов жсосхвот сеспІтааса тес асЕ тн асоас ззоспВитаФ ЗБЕО асадсківз сажксссаюх назвтсзвос зок закта без зєков хвої ації 1740 ксазцкзак ваз хзке? ех Завіхваєсс азухЕакіоце авсзтктову іо педа асака зікізовЗаа мрісвоваа зсодузаати сцскакітає істтксаах зе квантова: гвазаасвв щпРовннве Каїкитаєка змив аке сааЕссаКЕ 1925 пав таї квовіааї Стрес твцах докевоєвав аавккщкесов аа сава. Мо гвізсцааас авсостіда мимо бтаствєваз зесжвавске квововс й засзцасави саван свое вазуУа зосжсцваея сЕаєсзісєв зЗпВОцецах з103 засосакісв зацаожаста сактасія сс зміни став за таікхакагс зазнайіаов совок я сват зкасссаєта пзавікяада ян поставі, зни аотка певскІаваз атетастіат кЕсвеїсаз когсваааєВЕ за цасзсадіав зішцтозксвоЗ гасу се Фтатодесве хехевосска завтсеаае за вза: зацавксоваа зсаіщ Ка нсаквоска дак Бика аХ А миїсвинка запаски оа заоч свккавкесво атсатккеєс садах Аа ага птвсзоассх пава с сізодастах оооівтежк тааовтео жах вскааовка сісвіосоаа ясівооавах сізоаветК кепамоа зоесакомиа ВО леклаявює гасло зЗазвааЗааоо задазазавє сзададвзсєва везсввавиа ща піІзовВкрвІ завсянатаїх Фгоїттатвая звнказаза закстціааца Оса Кх яю вівваєтстє заіасатнО аттасвассо затаєваев зсеосоасанї топа ЕК пагазасоєюв сісаоносяї іспабварся фгассіскав аоілевста пактесово щей птаватоєв стахтЕсзоа запласевоаа бЗВсдхаетх стсасазеєскв СЕСКстаєвї ге свідєввнова зБвссахева заапшричях сісавівауа Зкетатевтв седан БЕ зване сараї а вами явссатої суВіскттОх ев соВова ще ная я) агосмсвов зоводітсшЕ зісккаю зісокоєта ЗаКсКівКаЕ ЖІ паса вевамру зізіпевоази засів Ева сцазісвеа вікова ах За захасацвкзЗ даскозаасх слогани птвозвеаоо зазкататсс ваасаакасво ва чівасвІЗти дЕцастакас сраассяа дааоваїаи зошсаМспів саЄТВеКеВх зиха заксцацї зкоасзовас ствідазарв закелакід сассаеоє рат опазся як стві звазазсаив самі зоваовозса ВІастіЗоа ВЕсСтваєаця із соБиса ним стїнсвск астассвоє оостатщіда смннинватї уми аск за скрдаааскц ев ако Затїовааке пава запоавснеї хатещове ко щвромовак їастсскхаї позщаакай Ти слі0йо 1 «ек ТУ «іт Білак «ії Вт уУЧчНа ЛЕСЛІДОВАТКТЬ «о «ЗХЯ» жюененяй йіпок ВКОЧ- 13 сах їх

Мет пір ув дв дл Пій ази бій Суз Узі Вр Тук ха Суб гм вол 3 й Що їх вза рго бів ес Бі» 1 ме; аБИ УЗ! АЇЯ Хі Ре бер бек Фів б т ЯЗ за

Уа АТЕ 165 тів Між Кен бух Хів Тнг Ага із Ті ів сф АЖ ВБе за ж ікц о Кх Кі б ош чек йчиа Зі ви СУ їжі йвбуу й ім ті досжем , в Кт жіу бу ек о БчБ дія Впае шрУ Сен обзе дев ей Хі ТВ шу

За У В

Яів рве доз пів аби Бій їко) пк Аіа б» фвр ага бів у біз б1х вх Та Та о мем Кіа ваза бів агу хів тв обім Ве аіз ага бі Фіп а1а жів бій в ще Вих вагові Уві бік вне біу ага бек Тув яв бів їмт К1ів рйр 4878 зе

Ммю М ща іже сів те щі ва АЖИ бро дев Ей Вге діа ЗВ ої» ів Аа ЗВ 1 5 їг5 зга ТНе аку Ве ага тйк ТНК аеро АБИ а1в фжв Ми їве дію ді Бго

132 35 о іяв мек «ба дів ро зу Бе йіз зва аа вк оз Зег Ууі Тут 478 зх 15 355 і бів жвг вій ад5п їв Ні іч діа ід си вго дев від Уа Бе рак 155 175 125 іх щі ага Тгр оШіє жи ТР оВій ТНК дже ЖЇБе АЙ Яр гемо тує Зек ваги овен ух ака дев Хі Ага Ажюв о ТуУЄ ТВ АБА Біє Се Маї ака ВН зви ми т се ом «з коемх й тю КУ Її прювю ТрУуки тт дп жіфіж Сі ін біу зп ім Аа ка! Кіа дк БгОа «ій тую тут 235 ті15 я с ся дише ож у єю зе пух з жк с- «

Згш Бе бів вра ів зез їТвг Зі дик Ж: Бемоаве меу Уві АТ зе дих Я 235 я вне Бк Аша Тугоазю їі АгУу ТвгоТук Бга їі Бга тТБК веж бе дів

Я М 5 іи ТВг Ага бів її Тук те дао рга щі 3Зїе бек о вго Кіж Аїа ій я за ЗУ азів щіу Тут ЖВР осв ів аа ха 8 вгеу Бів РТ ні рев КеЖ АВ та ін аз Аа кан хів її ТУ тТвВге Бі Віз Туг зга ім їі Ку мів тгв АїЗ біх ні5 зів Уві бів баг Бек ге оте шіУ вої веж же

З ща ЗКУ ЗО аха ті аго вве Кго іш о Туг бі Так о аїя АР тВк діва бів Бр те

КИ ЕХ 335 ака Був їі те о вКго ее ТаговМНе рго ші бшр аа се На тує аг

З ве хм тк орвц ват дід вро Ії за дтє дв Об кгРО Бі АіЗ дов з1ю її

ІНК ОБфен БОГ АР Бкро хі вп о дтв АБ пІМ КгО Бі ЛіХ АБИ бів КТЕ

ЕІ З їб5 та Аг Ту де тме ек офец Уві Фіз Ву хв! сів Бе хів Фів оРто о 375 За х пок сек г. і сопежмо дому зе мує жа аг пгт муках дп ов сі вів бій феи Туг зга ча аго Фі Твгоіем дев 5ЗакКобве

ЗК я КІ Я хв сій івнобго ів ів бі О1ч его Бак о фец ТВе БівЮ Тук щетг нія

З ща жу ага мев сСуз Ні Фі аг БМе кій сій Бегоієв еВ Аа вій Зі РКО

З ЗЕ аа

Бен ажв ТУ ав вк жа! Бео же БЖ їжкоїКо ТНгОМіз аб бек АЇВ а: я 445

ТвКОоБго Твгоаав ТВ (16 Ашв Бго АЖи УЗ) Сів Те обіяй КіФ Бе сец 450 ЗУ ява

Уа! зу аів Мі ТБ осв Фіп Бер обі тТвгоОївг ді Узі зу ЗУ ве

Зх С з ще

Оіу пае о тйгобіу 53у азв сів бец Аг АКб о ТвК Бек оФіу Зіу вка рве в Я

Ві це бе ай ші аз цем вар Бе дп ойви Бек осіп га ТУє га

НЕ це щій дів ага їі ага тТуб лів 5ер ТВ тагоаха ев Ага ЗР тує маі ТВг

З Зк 525 «ві АТ біу бік дга ї16 ве АТ бі ів бо 55 уз ТВгоМех Аз

ЗО з35 Мо іш СІУ д3іж беж фе; їі Бее ів его Кне бЗет о Тук Ат ТНК У18 Ах 545 ЗМ Ух ТМ

ЗЕ АїБ рпе ТВ ва б Бім Аг обмаж Вже о бет ін їйт хів Бі АТ зах Зо ЗУ джа ТНК оБВа бак озег ші аа ім УВІ ту хві Абе ака вве бі рем

ЗБ 55 ЗВ її вій Уа: УвВг о АЇВЗ ТвВгоВе бів Аза бін Шеб бзр ів Бія ага Аа гц ув Аїа Ууйі ява дія їси вне тб Зак Бе Аа бів (ЗК Біу їжи іх Те Аа УНі Твг оадю ТугК Ні жів д5роіує жаї Звк ай вдец тд їо5 кю 5 54 сім су Кез Б5Бг АЮ іш Ре суб БИ Афв Бі» МУ АБЕ ОБіН веб Баг ках ВЗ 555 зів уз Уві уз ні5 АЇЗ їу5 ДГ ів Сух зр щі агО дял ве Евю по 5 ге дів бр вта йлв Бе ага Зі Хі дя ага бів вго Аж ага ші то ве ве 5 ву іє Бек о твг о Азов фік ївтб 316 Біб О1У Зі дяр взводі БМФ о гжа ща ща т бій ачи Тут Ма! ТБг оф) Бгаз о йіу ТвК оВВе зв бів сСух Тугб зга оте ох | тів 735 Ї тв

ТУг йеи Тук ія уз ЗіБ дарошів его гу зву У АЇВ ТУР Тнг Агд 7 ук З Її

Я Х «ЗЕ ТЗ

Туг бів той аг біїж Ту їі бі дав Звб бів азбБ ін ід Зв Тут тав 745 ща ін їз вт Тук аж азів фу Ні Бін Тит Уа ази жа Бе біт Так чим - є же чюкк є

ЕХ г тах цію зег вен ої вго бен зак АР бій БегоБРе 118 сі зУ5 Се пі

У У як тва й 7 ї

ТМ теУ «и піз вто лап ом Су діа п ОМНіВ бу 15 ТЕ о АЖХа го Ар осли АВ тА ТО за о пух чек бух аги ар спі» дів вуз Сувз за мів нів его нів нія Ба

КУ І ящх

Зег ьец АВ Хі ор ожаф ТУ Су тн АВ я ЗВ БІВ ВЗ яв СТУ що 25 ВО

УВІ ТгооУВЕ Хі Бе їухз Жів8 ж їВгощі» аз ші ніх аіВ8 го ве 8 850 КЗ біж вчи ред бів Бе ів) Біц б'ю бує Бгто ів: уд Бі Б3в тя Кам

В ве ВЕ віз Ага Уві ру ге вів бін ж вуб ТКО Аг а5Б Був ГО ші Бук тер й ої жи; бі о тве дк їла ша стевії ме єЗи дія їх вує ори ща

Ме. а сл Мекки ноя г. же ох У « 7 ню м ік я жо Ко

Мен ВІ КЕ І габощх Ів ОЖДІ КЖтг МУХ Фін Аз ку Бук виг жд 85 за вах

Взр АЇВ ів ває УР да Ов Щій Тег ойхр ве ви бій АВ язКоОТНе кі ща ще дж КіЖ АВ Же їі нія АЗв Дід Ахроіа ак чаї нів жк Ї15 АКА ів ат тут свв око сі) рев олег ха Кі вто піж а м» аа вів з же ЗО її вве шіц зів сей бів щік Ак їі Ре фе АТ тк Баг ве тег

Ах 5 Зх5 ВІЗІ з пок ВО ст у з ще с. хх вк. - си ке ФсЕжкк Кох ав оКжів Аг яЖМа Ві ія 85 мб зу Бр тн Май Вопобіж Сем бат

Су тТгр дж У! іуз Біу Кіз Уа ар Ум! вів зів пів зб Ажн НІЖ ко яву о с ш- сен жен їи31 м. їх її жу пери жк ге : хе 1 аг БегоуУВь кац о Уухо жа тв БК тТке ів ата ін уві Бе Бій ків

ККУ кю ЛЯККХ

УВЕ ага жаї пух вт бік АК фіУ Туг 18 зи г ча тТнЕ АТ хар Кік см

МО щих їй тжгбоїжх ів Ві ТЕТ ощіжовін о Бі Сх Уві тв її о оміз бо х1а ах НЕЮ ща піп вщо вхи ТНг аз Нове фуд ФВ оч АВ сук Уві «Ні біз

Мак пк КЕ

ЗІБ З ЗІ іч Кіз Зуг РТ АБ Я ТВ Уві ТвгосСуж Аж ов тує їн дів щу НЕ 395 тв оБія бі шівю туК шіш обі ТНК Тут ТК Зб дп о АВ ДРУ БІХ

МК М що їв Ващв бів віх тТУукК бів Бах ази жк ОВК чаї Бга дій аз ту я кокудея де

ОКУ Ме ча

Віа бак АТХ Тек ів фун їж діа тує тТне яв Зі вк ага де

КЕ Да а жа ТЕ о Сх БІВ бас дя ге Бі Туб іу вевотує ТНК Був ви ах 153 32

Рг ата бі Ту уві Тне обу ін беа дію тжео вве о Бкб сів тег 13 З ХЕ во ку чаї ТТ її бі Зі у «В тв жів бі Ота оБке де ла та як вико ж ях зе «Зі ази ак аі Ой ке це: сви Меї ія 3

МІща 155 «КАК ай «ож ЗУ «діб» ДМЕ «Вії3»м нтуюНнА ПОСЛІДОВНТЄТЬ «ках «тий жиму НЕО ЗКА «НК Ів анкрзакта діІзахсацва кова токщіє сскЕвтТаВії ітлавакаай тесІЗаващє ВО пари аттва вофстакнах тігтаотаде дазсапвіаа сзцввайссв сківаацаке КО зкасщкЕЕкха Мкстацавеи МІБЕхІакса сао тост В СІ тоВХх Іо застане звакетмтва созацаксза аа єнсах сс са песо а їткавттантє злавстахвах Фа тксзся завооцкаа сяк ас оцу КО ткІознвОса татові Зя «КкВіаЕекІВ ссемосваєн авізрована кзажкскиВх За вастквоасяс сааннивмааа зптвсовст са лооа свастоаіча сти 42 заці «ска кті засісквщовІ кіїЗаніта совок такс КЕКВ ка сззіснМсв ВкстасажЕї зесєгіВкІа зозовіоста катів позик о ячакковса: вазснааКаї пвакцакЕта свкзотгавряї ааливаєте сактсошкоВ ОВ

Таїасаетс ЗІВІНссЯ ТККІТасвах аклоВктІтаз зазаїкевав світах ве сжазацідіх вес тсся заозадакта зсзатніста ета екй КеїаесЕї ТЖО хЕкссаваке зкщахніскиа вози візссваєта запа звевацевая ТВО яіткЕзІасвоа зіЄсЧцакеви Ефес КОЕ зсасацасВви ЗВкаОвКЕ гевацавх Ба зкоасимає сасвептїах пувеМевкіІВ знссвзовки КОВЖКЕВтЯє кфкааокаї КО препа е жфксаскацас пасе ва птаааїстя Фозозасаюво сао аа пазахєваиї кісскЕака КцонвессЄ зспвсвнкво зассваєхвоу вектакевих Мо ссзаціастЕ сіссктщщахсх тазсеунех аск зсах сатсвеєвсє мама Зоо

Фахова оЗ давктантах васіактавв питаеввсв: ЗКсІЗОтОшЗ вапацтацув 315 зкІатхсавк севатвасно оз е хаозозахов задоаасас ватку А цвісавізас свопи столовою «тавсокуває зіаютсвтоо асізіксвх зго цухв.акето сосаавткВух дадозасока вил тІтав азтятвсава пестксодакоу і тхІБсксоаЗ сасажтсЕни тесавссске зсзавеасва кеша ска МЕ сдлазтвисих хадзхнзавас встав сзоєсзоаіа станок ззазвоєса ВН пЩкттасвоу дізвазнтак ссхсосовсов актаокасдав Зассатттає кутка цеаВх І5щ

Чктаакттац веттжнаскх сЕкасвааня Каїзсееаєсхв Зиаїакщцста КаЄкКХхн БО так свазв даагтезсої азс а Фооовакива ТТ КТоктво тсавттеває За зазнсазклз зІшсВЦцкос вІсСасТався ТтссВватстк катка дастатЕаВІ за всацкаккіа как сеВах вавассаех застав сти СКуеТествВ сек ї153 зквозсвака ак свкв: зано кте застає зопстаєкоє засзекевав зо шовізатсва Етно васясоаваа Ффопициато соки Екає Ек тКкавї ЗвщО сам ілююЕ фаавзвасаоца фдтозсоовх паїсатвтка акхвазвтатс сважєтаціеї їгВ язати вас сезаковакт кет аЗаЇ здааавокввм вах ма вав 193859 «аксони щасхстахоца реа кеівсттсваац акссаанике квоаЗосате Я азкацзвсам: сапеснове кТОовмаа зе Звакха кіассасиях воуазоаає ов

ЗахохакЕсв жнмеааєха сука секта сех квас сиве АЖ тасттавтатк зазна саоз смів ав Кене ант ссех соч се застане ею знака азвкотаова лежіастква кое тккав косваавеВу ща здаавсазтав вакансию каспосікис статок Мито сса званих «аа дшепаалесєва сохне селом асасєвесеем законами ге кТУ: ях

ЖЕК В Фев званшмеск сеекакке ЗКсВЕКею сксецаєних а пав сеасацчаєст аздіоме созатеаких дос к квавакказо з55а зопсахзаха дссвівсзаз ассаозовавї стнуавеКеє мин цаз зопавЕата ЕН пре мкс кох защрцвни о дааезавих «во псав зсодсоаана Каже тато зайвсенваках кока дав ваваз асо воВ ЯКОБ ах віцвасєсїс вас ав «сБасчвнко весаееааія терас ковка ІБ затв осо схкатвоває сек заїскжав затоки пакт ха чканасшсно став пахв о пово х кквквоска тк Еакх ха ісораз зеосаїтза ванн мах Кісвакває; зсктассатв скдаваєека ен завоизосвоа саопзнада вовасзоває азс систе кт свОва ЗО; хаозазосза зако всВ зов зтстОжосаа ФЕН МмахеККВКо що іквІасої вона засво зоссіасаа сао ааксвааки зо ваївсовцаст вакідназкЕ кадслста Зкаозазаов азасвіатксє завсазеасв І3кО знасоіта акшактатас тосвактева давовакажа явна акт зе паїсчниоса асан ває сіведаваязе зате тста тассаОстоя ІВЦ сСВ МЕ жі чіонац вовна каса аа аодванаенасв вбасекУкиа акегеаюас. 3) з2авмноащев ахоасалвсх всктассанск постава саавадавту адавеаєтке Зах ха кса кан ака саке Ех позоваасва вазах ВИКО зако амкаїгоавах звскежетае попвоцаатав з5ї «КМ АХ «аа ВВ «йіх БІЛЕХ «тії» вази зНиубтицієпьїх «НК ОКУ меж БІВ о вім Ай аз бій Аа Бі сСух їв РКО туг аз Се із ВЕР і х ЗВ д кв ЕГО Біб із о маї веб ж; жа Бі бій дк хів ХЕ е ЗВГ ОСіх Аа

Зі й за

Щек бер ків вм ті Бак вен зе ви УВІ ій ве ме чі ваг ва

ХХ ах тва жа гро Бфу іх Бі Ре сви У! бБіж ев ХІТ зв ВО Уа! тт чо м щу щіу їі Ма! Біж го Хек піп Їтр о аво від БЕ Бер та бія Кік ЮТЬ

ЕТ ЕКЗ 5 М

ІЙ Бе Її Аши із Аг Хв вів ів вне АТ аг дши 1 дід КІВ

Зо Ї Зх зіз Ача бзи біз ПТУ ен дію ая АБО РАК Аа КІВ ТК Уа бі АЛЕ

АдИ міх І вв ру Бі Тр ія Бі дов Бго Аз» ака ка іх пйг ака тв ка їжу Я ї5 таї їв аз го Ба Ага її св ар осі свв Бу біз вга да ХВ де - т аж х як в м 1 150

Вт Бек БО Або їі его пі Блє Сів Заї Бгто мем обер еко маї те їі45 ж ї55 що іа мів віз 15 дв Мей нів фей АЇВ Х3Б ія я або Бек УЩі хе вне бі щі Аг Ткв Фіу ев ТВЕ ТВг хів Аза хаі ява щі Аза ТК 150 їЖУ АК. вчи аАгО Бе Кі ага нів (ів ваше обід ТУ їх ар ні Сх аїв АБИ

ТвВе туг йшо бу піт вам дж АВ ін Кто уз пев отвг отУк ів др пе 7 7 Б КУ т

МЕ ж Ам тев дів їБготуг ази го рвз ага але за вм їйе оре їВе я ге цу У жк Є - ук У и 235 ех аа яр Ії ала із впе ва Рго дей їУК в аж ага аг ТУ БО дів ін оте УВО Ру пів дво їй» ага піц уві ту Те Аа РгО Ба Т1В

І КІ ЗК

Ми фра ах кре Бім ілі із бегома)ї вів ЗіБ іже ве ТК ОБве дев

У ЗЕ РЕЖ чаї мес біз Бог ожхекК 5іф ІТ аг яз Вч НО Сем осв Вр ЖіК рем жа ває а Тв Хв ББпя Те овжр о їтв Ба Бек уд! Фу Аг Ав рве ще й ще ЗВ тк тТРа БІЮ Бі ніх ак Ук гів Зак ек фецч Хі іх Бі пік аа ів їв Бет ву 15 Тже Бі АТХ Бі ай а іп ів гео рев ага ща . 7 7 ха ах т вовни шля МА

Заг овна те Ре А) іх БгО У Ре аг ТВг фер баб ба Бе тве я Зх кош лічі о ьжу Вів бів Бге Тр Вт дія тб обгав Ба де рев Аг їі ві щі іє а ди БВ одекК тн ве»отве за че вВЖ о тВе тує

За ЗУ 395 «як ам Зі ага сі тек оУві аж оБеє ео тн ошів без вге вго ші) АН чах Я р ха Вег а! га вка ака Бі Біу тує ожек ІВ ака Без Сук тя АТ

ТвВговбе Уа із ака бвт соту Тйб вро вне ев Ве о тТве ст УВІ уд! 5 яка ах

Бе дес ТероївЕ ні ак бек АТ Тс їв ТВг ой тис ЖХіз АжО го а 5 АБО піч ага жів вза бів Кі вра ве щі уз вію рве одкоа ха отр ді щщ І 7т5 «ВМ сік Твгкошет Уа їі пр віє Рг біу Ва тк бі Бі ява хів ви я Б Я ага вга аа Ве вне і» Ав Ве уві век сви іп чаї АВ Хія БА

Бек вез хі ТНК ОЗів га ТУгб Ага Бу Яге ВВ Аг тУК вів Вег же

Б 525 525 зга аз іа да заї їі Уві ву їВгосіх Ааїа із Зак тве Зі шві ще піс п гаї как Уа! дже БЕ Вт зам і іш ви ВВЕ тк їі БЖ КІ ша: Ваг жд вата жаК ВгО БМ жі жа тТагОВЖ Ота Кі ау У зх Ба іт зії а5п ів Те оЗек аг ої Бішж бра тує ТВеОАЖО Бе его одай вго вне Звгорлев ага Аїа дз го або жів ї3е Бі Ті ЗвгФ о щім ій

ХВО ЗБ щ

Его се; вве сію вів о біу заг ків ев ак обі сів зе) ту ї1Ф щу ях ЩО ЕСЕ

Бух ків Бін хів тів зв : хТа жме піче іш від ін кат жав

Бу кі не хів гів зе мів в йіа їнК рве біб відо Бі; Ваг варю

БК Ех ОО їви и ага вій пів їУ5 АВ Ма аа Аа ев ре ТВ хаб Заг вав

Фів їв піУ іни зу Твкг оахв Уві ТР оджа оте Мі їіж азрвобів Уж его ам сви узі баросЄує ів ее ах пів Ре Суб бе ав «1 Гуз о цех БІО зга із сви жве Зі ру ві зт нів дій рух Зі ів ек вЗщ шЕ

КТ КО БЕХ

Ага ай ев фїеи бій ат) БО аа РВЕ АгО БЕУ їі Аа АБО ів о рта

ЯКЕ 5 КО з5н ака іч їгр ага ші» кг оїйг оазв Хі ТНгоїів Сі шію єфж жа

ТУ 733 715 ХВ ззвоуві ме су ій АЗК Жук Щі ТВг обео Во бі Тве У) др бів

Та У 235 їУЄ Тек ВГ Ли Ту іви тує БІЙ Буш ЇТ8 АхоО бів бе рух вв ру

У а 75 іх тив тн вс тує сія ів з щіу тк КВУ хви шк й щем

Іо ТЖг авг г тує шт ом МЕ їхбу ТУР КЗ КЕ М шт ше ах

ТУ ТО Та іже і: ї3ж ХК км їв аг туго дя діяв їу ніж СТ жів Ущі зв ме Ух ТВО зві зх зе Твгодіх Хек оїже тв обго ів) Зеговаін Бій Зб Бге жів

ТЕЗ Ї Ж тах ЯКІ іх йже ув Біж під вка дае Ага Суз діа го ні Кем 015 ЇВ АяВ

І У Ба ВІЗ «ГЕ А жах вт ам о а Су БеЄ Са Аг дяо віх бі уз суб вія мі МІЖ

З КІ 53а хнеоНів Між вне Згоїен о аво Хіз джхо Уві бі Суз їВг важ ее дай вах ко Бах «ім ав ів ші ща тт Уві Х165 вв Був ХЕ бе ТНК оБів ай Ту шк 855 С

М Зх вже ці АБ АКО Бе Бі жа ву Бі ее рем сів бів в веж рем їжи

ЗК БУЄ тк ВкО зі біз вів ви віз аку Уа) вух агч аїв бів суб бух Тгта аг АВ

І ВІ | а сив ат Бін бує ем Щій би «ЗИ ТВ о Аяв ів Ма! Тк іх ів АВ вч я ЩІ ск дім ще «аї ап ія Бец ве Узі ви я сід пе во ака жи кл Е а МК

А як КАК пів жаі два ївго АБИ їі ід Ме її НІХ А3За зія ав ік о вго Уа с зЗ35 ЗО шо Я М ніх аку хів АКРО Сія я тТуєви вка щів сов обек уві тів вка сту ча! Аа віх вів Хі вна ім бір ен Вів біж ака їі вве отне АВ

ТУ Бе ВО УК Аз вія дго АБИ УАЗ Ще фу ах 01 ав вне АЙ ко вах З

Ави о БІЖ вен бен сх тТго ана УЗВІЗ Бу бі нів саї ах» Уві Фів ів

ЗчУ ЗО МЕ; піп ой ода ніз ага о бЗего жа? о іа уві їв ре бі тео бів 818 щі ма! зак бів віз узі яев о УВІ Су Бра обі ака Бі тує їїя виз МО МЕ

Маи овга омаі ТВК Біб тує ше ів БіЖ ху біж і: БЖ сук ма

ВМ Т5АХ нкні

ТНК ої з БІВ хів бів азО ява ЯК Зав Бін ів Був Бак оба

ВЕ ЗОБА Мщх

Ав осо тат ів ів бів Уві тек Рг» захв два ТВго Р їйК ув ва аа Тек ТМ Зі ТВ оБів і сів Тже БІВ ту тнкК тУукотТНе

МІХ ВЕ ща

Зак оАго аа ціп Бі туковаявю ШТ АЇа ТЕР одіж п. дБА Бе ощаг

УВК вгРа аа АХВ ук АВ ВК ВЕ ТеКоІВ ів ут жав тв тн»

Іа а тая акр йіу аг заго вію ази БКО Сук бін йег аа аг ЗТ Тук ЩІ пл З хо

ЗЕА ТР таб ота рео о веа АТ і ук ЧР тн зує дев ом тю 3155 Ах ВАХ

ТЕГ оба вРо фій тБк дер овух жа! тго (фа сім хів біЖ о тВг це 105 За сіз шіж ТВг о вБНЕ їів Уа дод о бек УуДді піч ішц іви феном оц 1325 мо ЩЕ и «ех 18 «келії ЗЕ «фі?» ВІЦІ «КІіЖ» штУчВаА послтТДдОоВНІСсТЬ «ох Й шк І хай)» СиЗзнетреКованиМ химерним КБівзк ВК ІСВ. «Вік 5 мех шіз її дз» дяп піп аз бій Су» чаї Ба Туг ав Сех ге АщА 1 5 за їх от Шахи с : що ма х. з п хоугує Жоджк ії А ви рев ОТ Щег сім Щ1е цем АБ УВІ АТЗ ж!Ж Ме Бек бек Бін ой 28 5 3о узі аїд пів їв мі кар оїУх ЇЇ так зга овен жів бен дію аа РВЕ 35 БУ «5 іжу ати спі бі ог вн дій ве діж сем ке дер оси Хі терожію ща 5 ЕС)

Ії ви аа Зін Ава Бій тгрохак дів ге без аге бів Уві БЖ Фіз 55 ТО т що іі жів вза бій дк її ТВг обід вве даіз ге зі вів вів Біб бів во як щу : щи К- о х дея чо - с шуут у косуке Жук дує» Ма! пі» ро Оіу ага Зак тук ав пів ТУК Хі вом дій іже 300 зх ії іїхв ів тТтр бів зап 850 Бго аз аз Без ій Ще? оку ЩІМ АР ЖІ т ЗжЕ г в

ЗКУ МК СК вка твкК АгЯ ВНе Ага тт ТВ дер о аво Вів ве ве ТВ Бі Уві вго 155 145 їв век Аа1а жів Кг віЖ вве ім бен ойів ївйг обвмо зве УВІ Тег вій їч5 1 її з іп бек від Ай веж нія ве аїВ зи ву Ага ЗВ лід жві вва влє а і їх

Піх бій яге о тер оЯ ТУ рес ТВб бі Те вха іо ва Айр веб Ту Я ще ї85 я зга вва зу вай его хів ага ВИ ТкК ЗБЕ ля ній Су Уа? бага Бе 135 м БО їжк а5п жів Біх дя бу Ам бе) вав жа ів го вто щі оте тТУук зго вве Зра АРІ ЖІ вм Те ХТя ве ЖІ фев джросем щі АВК СяУ сх ром ЕХ а 23 З Ку

Бе вс Ах Ту АЖЮ її де тк ТУ БРО Дів БКО те флех ве бе з 5 шах іїву ТИЖ АГФОБІЦ ї16 о ТУК ТЕ деровто Хі (ів сек вто Бі Аіа вів зе ке вх

ВИ КЯкУ я аж 1 тУЄ ТНК озеро фів ази чаї вжи яка Фів ве кіх ев Ве АБИ ук ще ща

Уа зо кВА

Ба ве) вза яса сем Ї12 фіє їТує Те Біх сів Тугоага Бі ХІЖ Аг

ВО їх ЗЕ ві ттв авіа діу Бі Зір Уві Зі вт ЗК дра тв ту Мет веж те

Ма з З ЗО двпоїїв ге бе о вео мезо Те 1іу ТР від дів тк ЇВ Ра Бе те 53 и БЖжх Х іх вд ле.

ЕХ зх Ж гц ви 11 їЗзе ото шер о ЖВК ОВее СКОБУ бец АЖА фбц Бе тує Аг

З Ба У с за ща ї5О тврожднц век аід вго хів вне аг ав чів вБгеохіу АТХ АБИ ІЗ ЗТ ях Б) їх

ТТ Ага ТУЄ агф отр оба свв УТ бі Сію ча! бі БА ХР ошів вгО

В ї5х ЗО дка АЖА шію ЗіБ бій мер тує ака щі вага с1ф ївРК іже аж от ях

Зх За В Б

Зх ій дес Бе ев бів Щі біз ЯР бак зво твеовів тк як НІЖ

Ех о 315 кга вом о сСуз віш зді аг Вне Аз бій Шев оіви ак дв А1а Бі: го

Зав з а їви а5р тує дів згу УВІ бгє мес Бе бет ТК» оТВг віх алго Заг ої

ЗУ Я за

Твг орто ТВгоАщАА ТК її з3в обо ваша УудДі Хе ти дій Хі ргО ів

Уві уз віє кре дра заї тво біжЖ ші Звг ОЗ УЗ ЗТ їВгбобту зу «Ва ЗУ І І 475 ЗА пі Ве тег обі біж АБр їїе зеч Ага го 3 ТВк о вме пію а5В ває

ЗА ЯК 5 «аі бек ем бів ді аа жів Ав баб рго ЖІ1е їв обій АГ ТУуг ву

З м хо їви б вве ага тує іа Хек о хвг ага зр дів втц уві тів маї ке

КК Зо ЗАВ їве біт дій ді еко жВк бі УВІ «Фі бі бій аб Бек кві ява вах.

ТО х35 зай

Вт фем ощів зу То МаФ щі: хе бі бій дай сем тки Хе ва Тве

Ве вагу тує їй вза ббе его ба Бго БВе баг о рбе дк; вів ей ко

ЗЕХ хи 575 дав їіа ї1е Бі ків Щек бір БІВ роб рем Ме і Аїв є1у Зег ї18

ЗВО ях що

Заг щок Щі дім сей Туг Хі даю мух ХІТ (3; її Хі кше 813 а5р се " кл 7 Я 55 о Би із тег рвав бін дід бів ТУК дов і бі їу« дід Бій бус мій уд хів тТйк ОР Кім Рі об БУК АБ ОКО БР Ої1Ух Ас БІВ у ВІВ Ж джап Аїд Кр гі ЖБК Чек ше Аа шій Ків охіу ів ге ТВ ов тд 3 5 ща

Тнг ази тує Мі Хі ахр бух маї зег йзп сви МаЗ бі Ся вже аг ах г ге вав ін вва Суб ца ази піч збе ага він сем жег ін фже чі Щу5 в вх я ніх вій іже Ак вжи Су 3зВ Об лге Ап сей іно Бій ах БК АЗИ

БЕ ЕЗБ 55 ун Ага 0іу ів азп ага бів вга в55 Ага Біу ти ода дію век отв ща КОХ щю ав ії твк жі мів віх Фіу Ази ар ої ВБе вух ів ваза тує тд пою З З с в м ТО ККУ с

Тївкозец око оту ТНК О Рв девобів сСух ТУ Бк ТНК отТук рем туге ЩІ

ТІ та 25 їжа її» ар шій бак іх пен ів іа ТУг ТВк Ага Тк щі Беб даго

За 745 ТУ іх тТук жів Сів аз Якг о О1й лаяв ев ЩІів ЇЇ18 тТУК офв Ті АКа туг

ТБ ТБ ТК вп оАія се Ні «ФІЗ Ж Уа! Ах Уші Рг фік Тйгожіюк 5 вже Тр

ОО ж Уява Й и ТУ Х Ум

Бго вве Звг ЯЇв піз бег Ба ків вію бух Куя Зі ом кт) ха де

ЯКЕ | т95 ВОК

Ух АВ їВе нії ска Біб їгр ам бго Аа іхв Аа Сух бат Сух вед

ВО 3 815 ар озік ів ру Сух Аа міз ві хек ні« мів ра Бек оба: АБ Хе

В ЩЕ щи

АзЗр ові щі сь ТВК ов ін ва ів 83р ев бік ві те чаї Хе 835 ав ку

Ре вуз 16 вуз ТВг Фів в5в осі ніз лів г овжу Бі АЙ ве 350 Б Бо

Ре крем щію біцш дув бро їж чаї фі біш дів вез дів аго маї Бу

ВК ІВ ах НЕ зго віз БІ Був і БРВ ОАГО Ар вує АГуОбіш Був ред мів вен щім

Би КВ дах їйг оаша їте Ущі тує цуз БІБ дід зу» вух Бек УДІ дер вій ее ВВЕ

БЕК ще що чаї ап Зав ців Ту ав ага їн ців Аз о ахв Тв ляхи Хі аїа зів ах І І м ЗАЗ

Іів ніх від ді АлєВ ух агару! нів Зк її Абу бів АВ ТУ в а ЗУ ЩА го бів ев бек уві! фе вКго бік ші кв дів та ія вве Фів ів ще за З а

Бемоєфів Б'Ж Ага її БА ОтТнР АЗА тує его ів ТУ дбав Аза вка йди щу За Зт5

За! хів іже ОіУ дер ББе ха ваза Бі ув хек сух Кт дай ха

ЗК С ЗИ вже і і УНІ Ав Ома Зі сім бій ахап з3 Ні де о хек уві ву ях Мк МюХ

УБі зай ВЕБ ошіц ТЕО бів аїз бів щі звгбоБіфя хів жа! ато тд їв1о КЕ зАю су вт» Біжх Ака віх Тек Її о івбБоага УВІ Те АЇа о Тук Бу ЩІ ї25 цо Зах сту стук і Бі ш3у Суб ат о тнК хз мі вів її пі ар Аж

МеВ м ЕЕ

Тк вва Бін рев уз вве чає аз су УВІ ОВе ів; ім хів їж

Ето важ Ба ТР ча! ТвК Суб аа аа тує Ме АТМ оїТвк БІВ щі

Ва їх 155

ФЗіз те вів Фі; тве тує ту Зегодга дай вага щі тує ам у

Ех МК МУ

АТЕоОтии ФР о БЗек ави ак зак о Зі вгта діа аж тує КіЗ чег Аа

ЕН ЗБЕ ЗМЕН їтт вів ТВ Бжж Аа туго їв» АЖИІ ОТУ Аг аг ява Ве ВК Ку

МО КЕ

Іво вив дев іу Туюк 3е Ав отБує твг го ї8у Без ата щу

З; ПТ 7 Я 7 оч Зх

ІВ 355 М тк узі Вгору Фіцсіве Зі) бук Бе вго Зів Тк о ява ух тд

Я 5 у по

Ії з ТЕЗУ ткев ої іш далее бр бі жвУ ФУре б» твк о ББе їі Ма) ЗБ пек во 1315» ЗУ чі ум роми ма М Е: 5 і Бім Бар їм ме МЕЖ Бім БК вх 1150 хе З «каїїх ЗУЯВ хааї» ВтТучна послідовність «ех «яЖЗ» хи ВТЯо А

«Ж зкаолаагта зіазксвова ссзатотатє ссктвеажке цеттовитав Есстовааде що вадататква вегпітоєвах МкЕтавкаск паасвовіз свозазешкв стсаеннуаїє КН зицевстІав кхехвондав КхІЕКкЕВЕсв прСОНцаНеВ сте ги МВ мтазіаксцо чЧозтЕїїїаз хозвозіква сЗовокцкаю ска деіновацай Ні їізаїклзакс заеаніва: Занактсосх уаооагяац сзвакксанає асіакацоа М тстоозааав зЗітаетоа втзевіІК довоставзаз ззсцоЗзавав саке оЕ БО вапстеостт саемниало зпспедкасх казахттсовв квакттяа хом БМ вместе стсттвівас зветсснаЗх стозаесаЗ сток с ето ЗВО тзатсяйков аксохвовтх звсссквсха вавдахоєста тако завозеаеоЗ що щавтсзасак давсзантак азваковіккв тасвоасаззе сасвазаетс сао І хатасвайкк аЕтиІціткО сткствІяат зізазіктаз доза каж бвіхатавоа ВХ сова зссВТкхсса зазаовзахта еветакс сети кет ТАМ зкЕсСсВЗаатх всовтвтсся засасВЕсся ВТВКсВВсСВ За саасх васаявода У з асвмеа аксуаттак ктсноєтхв оспоаодєяа збквиемокх товавна я тесовнразвак свозссстаї осв жктВ аассовокта стзЕхтакає бруква ВЗА кесевавіхх вісБоое: зоцнсвкава каз а засво кате А закаіанас проста оввасацює ЗожваомиКао зесаасвосв неті ахааКе ве ксхавкаскЕ хсстофит З ввТХічЕКх газноанВоВЕ Кафсацстех ХАКІ ВОоВ МОЯ закдазсю павстваках саїсвісзо: гатацавсца зе звопеЧ иа ЕІ «такт авЕ канакиасец соЗаасаце таєсвомиов Звоцазсак пемлевеху; КН чексазІтас кастквазом совозокацх ставом зійатеака вссвиескаХ ЕМ

ЗкссввккхМуУ сві свКЕ паза заяв згас пок еа ІІ текста: сзІжтсВіве хесавксскі зсвазіаєва біпасссае мекв ЗВО саавтіассвс сопіЗаваце стека сооснсвВ скеавпеокааЕ кВеюосска іч «оасегхасса зи сопзхаї век ен ссетга ОКО пак сасяй 50

Фкрезсакіа веиоккіак гпсескчвово какощесккає скік ІБК СВОК МНК свсанічещє Федак сВК ФеОфоВСКеВЄ ОсВсВОєВ КоЦОЕЮ косу 1629 ск очася Мксржоса пвасвккака ваввком зеааескінває саке ОН тка скав ссозІсїв сват Вес ткво совеассюоц кхвхакеоце зо зхвесваас ве сстцех тесосоЗас вався сарана вата зв вазах чана сорт сова еЗася готова заВЕнЕцаЕЄК зона я саспазацсоа сани Ії КаКТКст сссаассава сещоВстава весадакоюа іч зссповсївіє как аіав яакаїжкань ставок: Кг євця боВЕЕМОЕ БЕ сим охва зопосчнвавеї Фо иаВ зЗеспвасаки сраецсаМЬ села и ак чвщазкстає кісавовткс азс кЕсаци ект весааскава се я я минав стат ве акксввиа сова соаою сахстсвиааа павтствецхх АНЯ косе еаскіктов пози сесії сага свв вазецакоай дО

Укщани хом меча секс тев Кіа х заккюв какая За жвава хкі акевавекмЬ ство звасниїчаай сазізаахак псезпЯкноя ЗІ щеКТОКіІТАТ СКС ЕКІс ВКА ссвабковаа вуса зсоонаєтва о

Срок увсв: ассктцчако заасеетивс уза стетК соБотноюмх озон ен хатка діт НКсВ КЕТгесСтта свовттасо тазове зааестаиї 58 час стви підізіовие ааіссїкзаз астазаасє азам прое ЗМ

Зазаатктви загс ссва завцаааєка туз вазі сота КН нрасвивов апвантшрво афасвансох ззаззаєтоа зв кн чазкжжкакх МО тасазадно) сазвазавіс єрвовівсв іарЕчне зсЕсскзаех уві ЗУВИ сапу соантаст: пахвасткає зсоомвовія засосеткса базсаї кох ВО фак КЕССЯЦУКХ ЗЕстокаВеК сезон ЗВ тає ХЕЕТОоВащаХ БК садок жаток аск ста сао атає какенва як фровікося візасвоюти асан свсоіщивац засо й какая ЗК см авіє абс Е ствах сеауваєоцв звесвоае пісна мА ца сис серсхакате соц сирої аєав зо ах ЗКУ кни оіптасеНи ссопБіОаоЄ синапс сзовсВаасх шва своє ЗІАО засцчиас зєадниах ат ссвває дасВвсонас сова каВ аа ЗА звоіснннаю аа хавсовет тісна паца сор х З цазаоасвак сстсмрясє засічаєтає зсдісзоассх абваназаа аасцтатаса я звірам єеовнса КЕНЕ єї зав юаї чем В свонесВокВ ЗАЗО «севцскаВкХ зкцічасва возами аск сскає заассшнюме чЧесацювКх БК зано засо васакскає чем ацсо есе схов ха дантау 35 «ем ий «хі йх БУХ хкїйх БІТОК хай ШшТУЗНнЕ ПОбВІДИНІКТ В «ВТ» , «ак ВЕНУ «не о ве: ів їі ажха ви сій в» Ми Кух МВі Бго Тк Ази сСуз ву ази ки шоре фів: жа пах ож щої Я КУ к. х х дай вто іш ще Зіз жів ву лаяв ві аів Хіб Ре хек бек Бін «Й

З т т.

Я шо ЕІ х З се де с : п ат іє тв Кк ща ох ТЗ сти й «ке ТЕ Ї хі АВ вів її Щї15 ем о Кух її Твпгоага Бе хів См ші аа вв

Ж що 45 чок Ук ЖІ кома ХО хо духа . се. ни Я з їх ве Оу шіу 5вг рве лів МФ Фіу ем Ве аж цем Хв тро бію - м х тиж

ЗО ж КО р ща дея ФУТ: здтюх думу шою лаз т ти ї ї їж вве ви ів Ач ій ткр ек ків вве зи о Ата дів Уві БР Фі

ГКУ о т І ВЕ хек жу свт ск ом Ж си у яжуію їх х. тр І с у

МО жів АЖи Бій й жів те Ів реа аа ага пі Фі оАТа дів вів

Щ Ні У дж ім за 8 «сх Їх вм й ща аж уж - ії дер оіжм жа в КОР ФУ АД ХЯК ук яхр ів Тут Ків цем АТАа Ме

МЕ що о ї хижа ух І ши сх с йшли вк су х ї : п 5 т уже МІ У тів'ахп ар обко аБо аха руб лів Заг Був Бі агф от! но 123 Зх 7 нку іа дохо ех пих шк жкфитх шко йде з с орки ч з а щи Те Ага ке АТО ТТН ТКС ав ар ата ей вжи Же оту Уді Бей

З ЗУ З зі: Муте 38-х УЖ Шру іш м Бу Кох хів ; с : сеш мес віх Жів Бра (іх вве дія бе афз ТАЄ Ким шек щі туг АТ 355 ТУ 355 855 жи щем 5. хаещої о вкй о ком ок . . че па ї

Зк Зег лів Аж вам іх ее лів Бен їви АКО вав ІВ Уа ке кщх

І їтО ї75 ши вжи СК те вотефких чу шк о їх вів яти Тр овіу ем ТВеоші» Те ав І18 дув Ба веб тук хе

Зо Ії Хой

РФ Же фух Ай Зв хів аг ар тує ТК одн Ні СХ чаї Ага рве

ІЗ КК ФМ І

ТУ дк хів ше ів БУ вай рев оди Ж їм хе кра ж я

Ту аа БЕ ФК жо БУ ах ев АжВ Маї хі Дт га БІВ туго ту жІй 25 УМ Ї су ноз що мі КУТ тис ду жк юки ; щ х 2

АгЕ яве пів де ів ів їВг ої кр оМа! вв Аашщіфвм омаї Зір еш

ЕХ ЩО ТУ ДВ їх є. скиаж ж й о я у є - - не Вб о АЦВОТує 3е Тіе АР ТК тут го 12 в ЖК Буд ле ДІВ сх М ШУ

КН НО Трою ско ВМ шо ще 4. щ : я вен ТНК де 1 Хі тут Так оезв Рга Х18 Ххтв пек вго сіу Аїв бів

ОВ з жа хід осв жов Уа «ху же. вх ді мм пк «ах аа Ту тує ТЕ зем щі «в їец ага ІЧ вРа ні ів УК АБ т де ях

Бе їв ах Аг обен зе їфв Тек ТВг обі біз Трг о Агя бЗіу К1в дг5 «Хі ШЯх За мі« тке діа ЗЕ МІЖ ів Уві Біц ет Бетб ага оте бу мет меж тв 5 ЗЕ дв Іі вка вне вт бан Ту дію Тк оаїв дій те дій біц БрУ Тв ага Ба ЩЇіа тб ОВУ бек оївг Бве вгРе біу зем ле рем Бе ту Ага

Яд ЩЕ 35

Жвт феи Заг вів Бгто лів бав вго ар обні вго іу вій дп їв її

ЗХ За Зх її ака тук аа їБг очек ого ха! біб вію а! сіу ве хто «ій вро я зу Зка віп а Бі біз біп Меч Туг ага Уаї вра Зі ВК оре Ар ОБег Бех ко чех "ов 7 жобм 5 З ах ща аа Бій ви Бо їв піз біУ Від зве бек вен о тТвкК Біб Те ЕК ОМ че Са 15 ага єм сух Ні таі ака ВМе а3із бів цеє зе ягу аз Аза остя вка

За ща ЖИ ви в5р тує «ЇХ аг УЖІ ро Мет вне 5вг о тТгБ же ні Аг БАК АТЯ 5 а щу

Тве Бгто ТвВе ваза їйк Хі ах Кго азвоУВІ жТє ївК дій жів веб о вец

БО З БО

«Ві Ух Аїя МіБ ТБ (шу біп Заг о Фіу ТР отТВг УВІ уз! вух ім вго ях КЕгИ яг5 що їіу Бе твт ФТУ Ві Ар Же зва АК ага от ек пі іх рт вав яц5 Я Са іа вве бек доп жі Аза зем АБО Тер оаа і ва бек іп ага тТуг АБ

М ЗХ Зв хід ага ків Ага тугк АЇЗ 5еготвг ТЯГ Аа БЕН Агро жеє тб У ТВг за же ча їі азів Сію біз Аг Їіе рве Аза іх БЕ вве да МУ ТВ Ме дБА 5ха 55 хо тТвгобіУ аж бка іже ТвВге вв Фій Бек оре аг о Туг діа Те її Ав

ТВ оАта Ре Твг о кае вро тТвг о мже Ді З ее БЮ ЖНЕ Уві Біж ВІ ах КУ 9х

Ав ТНК ВНе бегоЗвк БТЖ АЧИ Фів Ма) ту ма? аеоага ВВ осів го її рго уві тТВгодів То о Рйе віє ів Фів Туг двріва пін ку 518

Ум що вх сій фУз дів Уві 85 діа жо БМе ТКК Звк Баг о джв о дів Се бі ве що ІК БІЛ

ШУ Ве аж а! ТВ олею тує Ні ТЗ. дрож УЖ! Бев ям кан тв

Ка 53 3 в щВ 3 535 Б ім буУжЖ це: охве о бід РБе Сує во др бір вух щях ЯМ «М я «дал БІНОК «ВЕїе штучна спцслідоВнієтв «Ех «ї3в ВІЙНІ ЛЯТги «МК ХЕ щех Сі; її вв аа ЗБ АБ" бів бух УДЕ БТ тує дей Суб оз ай 1 5 з їх акт обро Бім же 1 Ків ре овяц ма! ді Ків Не Зек бек зів Ф1в а 3 я хаі вій зів їі ніб5 сей вБу5 116 ТВ АРа їв ЖІ їв ів АшА ВАВ їжа Бе і піт ве вбе Аз Бе ЗУ мед бе дер вжи Хе тер офіК

М 5 о їіе- вве ази сіє Аще Но тгр дек АТ Вів вефобів мат дів СВ

БУ Та Та В «ко . ех ект пакую ктіі Х по шж у у а м пе іжи лк АЖИ Пів вгу ТЕ ВК Сі Бе бів дже ту іп діз У в їУ З 55 ча сем хі піу Ве діб ак беб тТжК АВ осі Ту Хів греа КВ ее

М ха ВМ їжи ЗК то зів АяЗ АБро вто дев АБИ РРО Аа Бек вує Тв ага жа м Ех 25 ага те ваг віа агц о тТве їНг оз5р яв дій ін ве Тнк Оу хі ГУ ке 535 її оц ек лід фін овка біт Бе жів сом олій жВе ве: бе АК їфе АТХ зах щі їх 350 бій зве вів ди рен онів вен аів Бе вв аг дер АТ Уа Бе вне ух 32 о

ФУ ІМ АТ ГО БУ Мву тк обія тТве ажа ів а ав вро тжк ЗМ їж 1 Те ага іно вух джа зег Тів яке аю тк тк ОА ні су УК Аг ВВЕ це дю 5

Тук аби Мі 015 Кви ів вп їв ап чаї іє дра БО сі туго тує зло 215 З два ре дій ага бі Как Тв жів хег о уйт Бей АК СВУ ЖЯТ АТУ у

ЗИ «35 250

Бе вро жа туК 85р КІ або Те оту вро жфЕ вба тТНе ех Жак ОТ ха 20 835 вБеч їн аАКЕ Бі ЖІ ТуК те одев вра фе хів еко октУ фу Аїя Фів і шію ії тк Бер щі зар омаї їси ам вт ні іо МеЖ 5 вх я 85

Кн бер ази ак вмец КТ хів тує те ЗТуУ БІВ ТУ абв Бі жів Ага ніз Те Аїд бі віз бів пі БРВ ек о бегодгу Те одіж ек меж тве дев хів ага вве БгОо ве ту Ту твтоаїЗ АВ тТйгРоАіВ бів вко тТВЕ г КНе рів зВговга Бек оте Ме вк ік ви вав ім вче тую АГ

Зо зах З

Зве бен баг від Без Кі ие аб: ахю бій кт бі Аів вай жів ів ї5 З їЩУ

Ті ди турБ ага їйкК Зак оїем УДУ Бін обіу ЗВ) ші ви тів ота ву хм КК ЗО ан ви Бі бін Зій беи тує уч УдІ аг шІЄ пж ке зо жег ої 5

Зх З 5 «З вва пін іа Ро ія Очі Бін зве бек ЦЕМОТКЄг Щів тує ЗК ні яп ща 515 ага се су Ні Жаі бе: вне біз щі че ве дес БЖ АЛІ ЯТЮ Вка

Я жи 7 ЕКО:

ЖЖ ж БА мем лаяв тук вія АкЕ о Жаі РКО Мек вбш явк о їгВ о жїВе Ні аг же АХ

ТвсоБко ТвВе хе ТВК їі яз Бк ар ож! жів їВе Бій ІТ Кг сем жо «3 БЕ

Узі су аїв мі тб озеуц вій Бек ошію хе тве маї чаї кує Бім БК

БЕ У ЯКх яка ців Ра твУ 1 біу др хів ми ага ве те век БІ Біу го вве

ЯЕх я жк

Жіх вне жк Ах УЖ хи рвново ТВ АБИ ршю Бак Бі ака теР вке зіз ака (ів вка тує аЗв во ТНК обвВе Ажп рев аг мех ТукоУді Те їі АН у ій Ат ІЗ ВН Азв ві бів Рв АБ Бу ВР ОМВК АЖА

ЯМ оіш ав вгО зай г реа вів аг о бйж ве чук від Вк ОК Жев

ЗУ Ух ЖЕ тк аа ква ТВЕ вне Бра ТК куп вія брак дек ке Тв омві БІУ ВІВ

КІ Ук ЯКУ дЕротвг вве зак вк вів вхповів ха! туго УВЕ АБ Агов Вів ви

ЗВ ЗВУ З її Беекуаії ТвВК Зв тк вве вів їв бій оту» вхо ве бів удо ій ах Б их стіп вуз аа УВІ Ай АТЕ сни вве те бек ЗЕ ви вів її су Кам

КО Щщ ки у ТК оаБв за! Ву во Туг ні вів аз вух Уді 585 ЗО ЖІ хек 85 ххх ВілЕК «Й» йтуУучна поспідоВвність «а «уфїх ВеРЗ акт

Меї віч їТе Ба ажп бій аз вія Суз ма! Вто тег деп бух їм аз ї 5 і5 35 ва жо Оім хек о бім Ще ев дат ма! аівз ЖЖ ВНе Бек ек ом цу Фів

ДО ха за ті аТа ів ків міз рез зу Хі ТВг ди ів хів їв ім дай Ра 35 «а Ж їжи вго фу Фіж вег вБе аїш ве Бі ім РВЕ дер о мец ї18 їгрошїу ка 5 З

Їїе вне днп бів дев пі їко; бек АРТ ве іч Ак бій УВІ Бі бі я та їх жо яви ї3е ден шій дед її тк о бів вве ія Агьодіу зій ал ків щій

ВУ о зх

Ак іср ха сім ра щік га свт тук ЯЗ МІВ зує 18 їв Мі іду її Ох ЩІ ву шію тев шІЮ ап АБО БГО а5В АВ ВРО АТХ Бек їує ШТ) Ага Уві

В 150 Мах ага Тк аг бе ака їйг о ТБ джв а5р АЇв іжи зам Те Бі Уві вта з3в 1ї5 140 іви Веї Аїа Жіє Бгеа ст аю біз ів віза ТК їни его жаі Туг дів 145 5 КУ за

Зі» БК лід вка во нів Бо дів без Би ага АБО лій маї ва РЕ

М 175

Пі йів АгЕ Тв ошіЖж Боб тт обі тт дай хів жа Ашв реа тек Б

Вл шк х 180 їК І зго іже ух Аа Бек жів Аг лю Тут ТВО АфЯ ніх Кк а АЖ вна

УКХ яю 25

Тег овал лів пі ів п1У дай кев асвома! Хі зга Еге біз тТжеотук

Й гій іх з

КУ ак шк в озна вій вже ін і о їве о їіб бек ох? зе др Бен заї Віа ів их т нд пк : па а КК КО)

Ба рго дя тТук аль її аг ТВК оте» Рг Хі га ТВ вує ет бів ї зах КІ Вк ях ж сх їв ТВт Ат щі їі Ту Так дб вка ї16 їв Заб га бі Ві щіІВ

ВЕ а БЕК

ДІВ дію тТжЕ Тв орви вів 855 а івм о дгв бій га із їжи Мет а

ЖЕ ЩО ЖК рве ву яп о АГу Бжи Хе іо Тег те обі Фів те Аг ОсТУ ХВ АВ

ІК КЗ з ніх тт АїВ Вік Міз бід в! жів Бек хег о вго тТвгобіу меж мет тве

МЕ І зі за ачи хі зп вне орга ем о тук бі ЇїБт Аїд АїВ Ве Ав пів Є ВЕ 325 3 335 ака ве їі ТвВК о рго Жак Тв ВН Беє Шіу Ме Ах беи Не ТК АКО

Зфгофєз Звг дів ро Ї15 вВлс ага др бін вто БІ1У дрів дав Б1в її її ву Тук вка тн во ін УМ бів бі ді діє ве жТве вій ро з ;

Зо 37 ЗВ база дай Ту Сів бі ву Тук аг чаї вго щіЄ ТЕ каб Аа Зек КВ ї85 З х95 о ща бій їй го озез Сім щі Біц бвгобеє ідв їВбощів ху ек мі 425 я3о БО зго іш сСуз Мі Уві Ага вна Аіз піб баг ої ага вза АТВ ія БгОа 42 а25 3 пев ав Тут Аїд вка тар Бо мех БМе ек Тер оївк Ні агф хек 58 435 ма ях

Тег огго тр оаап о тнг Хв др орга авроза! Х31іе їВрБощіВ її вго би

КН «5 я чаї іх вій Вій ТВг ої Бій йег бію ТВготТне хв? Уа вух шіє Бга пік оре тв біу Фіж 55 Хі іс ака ага ТВ Баг обі Біж вто ваг «КЗ я 95 віз вне шек ди Уа! Ажп Бен о Ашо ТЕО аяй збе Зв Бі ага тТУК ага як що зв від ги їв вги оте Вій цех таг о ТвР дев без дев о мек тУуюК УВІ п іх 2 525

Ті« Аїд щіУ ів аг тів ве АТа жі бій Ве ав вуз ТНТОМКТ АВ 3 535 ка

-й пу че у чі шок 2 є шошиє жк ї чі Зх їБР осіу АБО РКО ем о ТВг о РйЕ Зів Биб БВе пе оту 51 тТБг о ї15 дЯв 55 БТ Зх З

ТвВтг оАіа вве чиг о вМе вго тБт вух Мів звгоЗег мееозунуУ жаї бів АТа

А ївг рНе заг ЗК Біу Ап обів Уві Тк уйді вав га ВВе щі во

УК У 5 ї1я Бтй ма? тк аїз те вав бі Зв «ів тУК ар оївм о Бім ме ії

УЗ БОШ ЖК не Фокін -. ». о - с кро Б якос - - у ; «і рух АТ о Уаі еп зі рей Бе тТнгосвк чего Аа бів Х1е ще БІ що «Аме ве ши Я т «аЩоз Білок «А33» Штучна пжлідовніств «ТЕХ хеййх ОВТИЧе ВЛ яТКЯ как 8 ех бі 18 аа А» хів два бій Схз зді Рто Тут Аж суб їм вай у 5 я 15

Аж вка дів ве 16 Хе зей див уаі Аїв Хі ве Зет зе жін Фів о 25 З ча Аза бБіа Ті Мі ів фуз 318 ТВгоАКВ о їез Кі жи Бі Аза БВ я З ів Рга ші йіж Звб Бе дій не Біж рез вБе дрон їів тер оБіх що 55 І п 7 сх КУ ЯК їїе вне аа жім аз оБій Тгр Зак Жід тав зано вага пів за! БВ ОЗ кі сх Тт5 КУ

З ГБ о ЖЕ ін ї1в дж" сій Аго Щі тв ойшів Ме й1а гу ЗіУ бі лів 16 бів 5 що а ага сво УВІ ШІіу вче Бі ак ес Тук дев пів Тїже Кв фюи тя їжу іо 135 ТМ вок «ра с с дах шожмис дже жав в Мем гум кх шжа у жк ЗіЯ тт Бін да акроБго о АБп' веб АЇЗ Ше се Біб зи ж 115 Й 355

ЯК М КЕ аго Убгоаку ве Ага тб отак аз але іа рез БЕ ОТВРг ші Уа1 го 150 135 і іль мет ІВ Кв реа ві вв ож: фр ід тТвКомец баб узі туго дід їщ 355 150

Зі Жак Аа дев без Мій ім вій жо ев ага Ар аа УЖ рБНе рве

ВУ 37 1У5 щі бій ака тк бу Ме) тТве БІВ ївК вав 14 дай зв іжи Тук Заг 10 їх 350

Ак ія був яв Бак БфіЕ ге БО ТУК ТВг ОА мів Сже жа) Аг о бВеЕ їчУ І 2 тжК ав ків ошіУ ем 1У дам ки Ази жаї її вгб бгро він тТук Тут вЗка Ке сі АгОа Фів фе: отне 18 хег Ма! іще айв ян УЖ яв і

Кк 75 Ех КК

ЖЖ ХК « МУ її

БіжоКгОо й туго Ів АКа ТВе тує Вт Зі ВРО ЇВ ух ях 53 7 зак 7 7 я 7 тк

ЖЖ хо Ж ЗЕ ве те Аж ств кіш Ту Твгс дев овго бів За яВК реє Фіж ВІВ ОБ від щі тує Ттвг іа) пів вза Уві ін вга Бі БО Ні во ом ак р "хе - «о М лек ЩО Ва вве іш вве йга фжи їн жЗк тост пі шій тТУуК вра ші тів» Би виже вно аа оагм кни жі Кі е тжг тЧК оч у се тфуг БКаокіж Я вох ї

Я ж БЕ

Міф Ткв ОА і МЕ зі з бів жу бег ага те о ЗТУ Мет ве Те ще ща КУ ЗА

Аа хе ага рес оРко ом тує Бім тТвтгодів ів тБк о Аазв ів губ тТНЕ вЕЩ Ві хів Твге о Бео бек Тр ОоБне бро Фі вен ява ев о Блш тує

КЕ 345 35

Тве веб бек дів Бе: жі Бе аго вен обім бто біу Аів одна ків Хі

ЗМ ЗО зах

Хів арго ттк вату ТКгоЯеє ви за ої сіж У бі ке хів бів вро ай АЖИ іу ФІН ІЙ зн тре ага ОЇ ві бі ТР обев йяв ай Бе яка З Ок ах аа щі" уви вро ін Бів біу Бім Зее Зак Без тТБгоБі Ту щок ів а ЗІ

Ага МеВ сСуЗ Міз і ага ВЗ АТЯ В чек ів) ЗК АЖ Ай Ві ве я Й Зох 30.

Мен ар Тук КІВ АКщ жі РгО Меж МЕ Зек о ттв ТїВг ОНів йга хег аї іУ БАК 35 те окт Те оди ТБ ОХ азв о Бгто АБ Фа ї15 ТВе бів Щі вра БЕ ча Я й а! вуз Вів міх Те озже Фів Зес БІ Те тв" ча! Уаї вуБ бу Без ах я З ка

О1У ве тВг бі бік ах (10 би АГш о АКО ТВК ОБО Фіу Піу КРО вле

ЗЕ 5 Би

Аіа вне дек ап Уві Ази івь ази Тго йза вжи Баг осів йге Ту АК

МК Ох Б І зій ага хів Ага тТуг А1В Жик ТВе Тве аз Бен ак Мет Ту уві Те її АТа шіу ім ак Хі ББе АїЗ шіу ЩІ вна де бух ТБ ОВеТ Ав тТвгоБРУ хв оБко век тнг о кне шій бек вва Зег отук Аза ук о ї18 а ах ща в за

ТНг Аза вве ТВе бе Бк ТВг зу лів Щег о бек їжи о ТВКожді 5іЖ АЇВ

АвротТнг вве сег о бБег біу аа пів Ууйі туго Уаф ар Агу ве Ффію рем

З За виг

Зі овге ув: ТАК вів тар овне ІН АТ БІЗ Ту АЖВ рев бів вже АТ чХ СЯ БУ піп гу

Ба «оіїз ВОУ «Фі ідо сії» щчучна поснідожністе «оо» хойй» ВДВ ЙЯтТКУ «НН дя меж він їі азп ав сік дав бій Єуз жа? Бго Тук АВ СУБ БИ АВ

Х х 18 М вхя вк бів Зег о йію їів5 іже деп ді віз хів бвв бег обекодін Бів

Ех. у. я «К ж Б

УЖі АТ Оті Чі Ні вен обу ї3ю Твг Ага сво Ж ів бів аки Бі «а 5 ідно вето ві йіУ Веб БВе Аїа бе біт сей БНе лов мам Хв Же іх

Зі ВнНе ай ЗІб дер бій Ткрозвег іа Бе сви ага бій Уві шів вів що та ї5 ха іч; її дав о щів дез їі тк осів не аї3 Аг піу біб аїд 1 Фів

Ага ів таї хін бив іх аг Заг оТук др Обій Тег Кіа ве яій зе

ЕЕ зу з ів віх Тер біз Аа АЗв вго ар АСВ БУВ АЇВ Зеб огує Ів Ат Уді

І З 5 ду о тВК ак Бе ага їйкК ТВг Ар во дій зерен тТВкК о Яіж жді пу 3 135 зо іви зе дія її гг бі вче Бім ідо АЇа тат оісю Зекожиі Жуг ДЗ

Ха яУ 155 З чіп вшК її лЕп се мій іо дід зв сш АГ АВ їв УЩі вБЕ вне я зх " Кч 1 їх 35 бі Бім й їгроБію ям ТвВгобій Те 45 Кі й5а др обею Туг бе? їі 15 і

Ач іа був аж бом їік Аг дор ТУ? Так Аа нія Сувх УДІ ага о ліне і95 ОК З

Туг да ТЕ ШіУу сер сію вл іши жа о УВРЬ фів Ага Бго щіюв Ту тує - у й 213 хі 225 зго ле сів вга зів іез тт їі ек Уві іжи зв ів Ма АЇВ ев

КУ еВ 55 АХ те вро Аа ТУуг МеВ Хі дга твготук Бк Щі ро нг Бу ЗБК ОІВ

ТУ я 5 пи тн оч сів ї3е тук ТВЕ дев бтО хі її ЗеБ рев біу аїа сів

Вей 5 КВ

Аа вік Туг їВг іво бів аБр Уві меч дев Сім вБга нів ме Меб Зх ве си вза аг фрем Хі Жіє Тже ТВКОбІУ БІБ Туг ага СТу Зо Аге т ЗУ ЕЕ міх Твоя йіу Міз бір жа бі; егобег дк ТНг о оїу Меї Бек отне зу. т чо ср М т м

Зх о хі5 За аа їід дга Ве бра їеев тує Бі Тве віз та ТНК від ші Бест т пу х х У зак й зе да зго вл віє УВе БР бик ТвК Бе ге чіУу гри АВ ів Ве ту Аг

Зах кт

ТКгокею о хвг Зід ра Кіз бпе ага яв ожі: Бгто Кі дів з Кі їв 3 зва Зк є к. ЗА - шк . . в - чі вен юна т З - п

Ї18 зга Зфуг Аго їйЄб Ба" о вее жа) ти щіх Уві іх Ве хів ів бРге х2а ять ЗВ хз аа віж шій Бій їФб Тек дев Уві дтп щі ТНК сен ар ЖЕК Бек 3 Зак Мк С дже іп сер виб ев сів біж 1 цеакоеК іш Тит Вів туго Бек вів ще ща х

Мгц ввц Сух Ві УВІ Ага вве АТа щі Зюг ог ага аа Аза їі бух

ЗО БІ 3 інки ази Туг віз го УДІ го Меї вве баб тка) ТВгРОМіЗ ага о БАє ВІВ я а

ТБеобго твгоаки їв о їТ» аБровех» яхо ма1 Хе ївс ів хів жо оц а азу БІВ чаї бу» від мія ТВе осені» зве бі жтве зго ма уаі бух жіу рге

АВ УТ я я ід же тптозіу сіу вар жі рез Ага аг їВК зер обі ші вто вне

Я Я 5

Аї) рив Зак яви Ма! дей вжи аБЮ Тевоажа рем о жек бій Ага оту Аг ма ще ч від ака хів дра ТУє Дій Бе ТВготвР дк ія й Мет Туг ож ТБЕ 515 Зк з тів Аїд біу бів ага її Бе АБЗ сі бій ефе ах губ ТВе МНЕ А 350 ЕК а

ТвЕ ойтУ ви те іви тик вве бій 4еє бе Зак отуг дід ЗВг ОХів а5в ії ЗМ ЗЕ щи

ТМК АЇВ РИйВ ТВ БВе всей уУВт гу віз Бак о шЕК Демо зве Уві і Аа 585 щІВ ІБ

АВ ОВК ва баг обеє Бір аяа бів ді тек о УгІ дер ага КВе Бім ук

Ук Ук У їЗле ее шві ТВе дія тн" Рбе бін дів ів ТуЄ ахросем бів ух

Уще ЩЕ БОБ аю Ей «й «ВІ жЖіяаЕ -З4Ж» жЖтучна послідавнієсть ке «ВИ ОВТ -ВЕИТКВ «а 25 мет зів Х1ів Ап вал щі АБИ бій Сук маї Его Тег ап Кух ца АЕЙ ї У і2 15 аба рка іш его фі Хі зве Ахй Упі Аа Ха рве Бег щек 1 бів

ТЕ 25 Би чаї аі8 бів Хі нія вн оф Хі тТВгодга ів хів реа Бін ля Бе ін Буре Бі Чі ек ВБе АР Ріж Шію Мео бе ахроівноКів їтробіу їі РВЕ АХА Сів Ар обій Троє аа Ве рев Аг бій Уві вія МВ змен пів Аж сів вра їЗв тТве осів ББе АЇа ака сі ій Аа ів пів дгаовже ха ту вав Фіу АБО жає тУК аЗБ БР тує КТЕ ви ів ви мо Мк їв

ТУ МІ їгв с ів аб) вже КК аброахн вто дів зве су іч Аг жа

Щї5 150 їх ага їй ага бе ака г ївВг ях до дів вв рез так біу жаї реф

КЗ їж їі мес мет дів Х1в рта 5іу Ве бід їев АТ ТР оїшу бре ув) Тук АЇЗ зх Мк 25 з «ІВ жнк Аза а5в вер ній іец віз іщрішо зго в5в АВ ма вВВе РАе

Ме 170 175 5іу «і ага їге Біж цей ого БІВ тат о Аа Сів АБИ аз фен о туУК Баг і 285 з

Ага мем зух зв деє Ві Аг ав Тек ТВг аа Ні Суз уді вго вне 155 Я Зх

Тїку Аза Ті Бір бе» біу ай їжи вжи ві Їж Ага йга щі Жук жек 3 15 аа

Ага кБе шій ага ів їв тах фіФ Хек зді зер аБЕ ем ув! АТБ ом ей ЗМ Зї5 Іа віє рт ази СтТуУг дже Ті аг ота Ту Вга їфе вг ТВгогух ще БІЙ зву їв Ага та їі Тут ТВ о азровчх Хі ТЕР Зак обте пі Ат зхій ек КЕ Ке «ів Бі Ту тв іа бін азр ові їси ага фр Рг» мів ев мех ар

Кіа о ї«р Ах» зго зе жі їі тТук ЗвВе ді шім Тек Ага ів 31» аг

Й 25 ЗК ніх їтв о аїв «кіу із щів зді біб Бек зе ге їйкК щіу Мет меї ТВ

Ме ЗІ Зх за вай її гу вве го ід тТже зі тв ів Аза тт аїз Овба вКБ так аг Вб. Хі ТВг ово Зег ТВРОББЕ о вБРо бі і ай Каб бле їУг АгЕ ща 45 КЗ

ТНК беи 58 АВ РРО Хі ве агш еф бів Ра БРУ віз Ач Ще Хе

ЗЕ 65 їі аг ТУ ага ТК Заг оіву У? Фів Фіу Уйї бфж Бі її бів вго вза зи Біх біз бій іей тут АкИ Уві гу Фіу ТВг огев ваю ек Оогву аа ЕВ З Я вав шій ів бгоОа веб ЗР оту ів Бер оБаг фаз їбгосім ТуК Чеб Ві м Ба 15 зга се бух нія Улі Ага Бе азів шій бек оїжн засво ази ві Бі Вге а 5 з вва дер тТуг АЇВ Ат чі БО Ма РВЕ 5ег ТК ТВ Між ака жаб лій

У Я за

Те вВго Тмгоахв ТК Оїхів йха Рг ви ха! хів тагошів Тіє га бе я ах щИ

УВІ іуз дів ні їВК ів бів Зекобіж ТАК отйг УВР чаф бух ші ре

Я з75 СУ Зв іт вве з Біу ЩІЖ ащи Зі ів аг зга ТВ бер пі біЖж бе рве х У Я не ФУ 7 т - Ко й

ЗБ З 45 від вне З»г вача Ущі аз сем Ав тгв а Же Бек шів ага тут ага им С МО Е:

МК У БО іх Акф їі йге тує дів Зак ТВРОТНе Аква Бем дб Ме Ту УР ТАЄ 515 58 За

Зі іа січ б'ю дго їів вве Аїа фіу бій ВБе дк вух ТЗг мех ви

З ЗІЗ о

Те РУ зр вто зеб ТНК о БНе Бій бег о кце бегоТер Аія ТВ тів ах ах М УК мк

Те Аа вне ТВе ве ву ТБ Гуз вій зеб фак зе їнк Ма! Фіу Та

За З ЗК їВк бе док ше сі ав осів УЛ! тує узі ах Ара ВБе» о ЄЗн ре

Ті г Уві ТНК одій тТвг вне бів 8іа 03 ТУг «830 «б «81123 УК «дій мм «КАХ» Штучна поспідовність «ах Й «Ваз ВИТ И т овуї «ВНІ ЗБ мек біз хів аще аша піп д5й ія Су Уві Рг тує дея Суб ви дай х З ій ТУ аж Ві сів Зеб ші їів Бен ав ув: зії Хе РЕ аб зве шів вів 2 5 з «ві Аїв Бі їїе Мі фец їз Кі ївг ага ів їі вро обіц Аза ве а Я5 іяц Кт Ту сіу бег ввБе дія БбЗе ф3іу (св; ВБе аха і Жія г сту ща 5 БО

Іб8 ве дае бів АБ бій тго жає віщ бе о їви ага осів Ущі бів оту

Кен Хів ав пів лю За Твг опір вне дія ага щі сій Ата тів ія

Аг ія: Уа! сім Б'е Бі з виг о їук бр жін тжг ЇЇ2а веа від ви не МН іуз Бій тр оін 2ап апр ве В АБЗ га АТа кг ру ФР де ді 335 АЖ 32х

Ага їВг Акб БЖ Ага ТвВг отТВК Ах АВи АТа Бер Бей ТБг обі а о вго 330 з5 1835 їжи Мет Аза Ків реа бі бзевобтб Без Аїв тик ви Бек Уві ТуУКоКівВ 15 ха 155 Б сій бЗег Аїда аж р Мі5 ій: ій сема із вага дар ові Уді Ве риж

Зх З Мт віх щім АР ОТГК одіж ев ТВРОФІЙ ТВг зай фе Аз АЮ Бе ЖК ЖЕ

ТО ЗУ А ага ів бух ача бек жі аг АБО Ту ТВг о джа НІВ був Уві аге ве 7 а фи З и що с т ї55 тав що

ТУук АБИ ів СТУ ів; Бі вза ів дя УНР ї1ів о вбо бо бів Тк о туе й Ід пожкік З 7 4 шЛЇ шк аг бе іа дб Бій іш їВгОоїів Заг узі Без ачровев Уві віз гей їв Бго да Туг АБО їТе Ага ТВе Тур орга Хв бга те ру За «У 85 7 з зх

Я ЖІ ка рем отр Ага бів їі Тукє їВт Ав Вк Кі Хі Бе вк» ту 18 дів « Б г їв оі1Уу ту ТВг ої бів вве УВІ би Аг Бі Бгоа Ммі5 ве мех ядо

ББа зав ба де Бен Хі Хі Тугб Твг оФію Зі Те вка бі Її ага

ШЕ БЕ в

Міз їв аїв БіУ із сів Уді ім ЗЕК боб ага Тк обі меї мех Твг

У ще 315 КУ діпожів Аг вне вуз іє отук і Вк оаів Аїд ТВх Діз Б'є Бра твР ага вне хів ТНК вк о чегб ТК Бе орга бію ін ази іш бив тТук Аг

БИ Зах ЗБ

ТНг рен бак дід вго тів Звне ага Ахр Бін Бго пі дів дво її Тів їТе ага Тут АГРО Те дет зви заф (ію б'у а! щіу Ве хе Фів Бех йхпоаавопіх Бін осів і їук аг Уа аго шію твгоївн аврозаг всех ик о в с

З 355 жк зквобіп мед Бе зв і ші біб бег Зб фрем о тйР сім тук о бетг Ммів ях Б ЗХ зго ін Су нів пі ага ра дів зів чЧеб озен Ак ах лід ів та

М ще й: 2 ах С ім Аж ТЕЖК дій ага Уяі рго о Мех БВЕ о агоїгв Так нів ага Зек ав 355 Я АЖ І

Те овка ТВ дей ТР їі 5зноКко йхрожві Кі те бій ХтФ вга бо

У Ех юю чаі ЗУ вій ній те фе ій Зак обі те Тве Уаї таї вуз Бі Бей

Я як 35 я

Єїу вне тб обі 5іу ар жів їец Агв обі Те бБег іх біу Вго Рве іа вва Биг дз ЖЕ? Ап бем АВВ Тур аб Без я бій ага тук Ага

ЯК ко АВ

Міа АВ ЗІ АРО тує АТЯ бек тб тк ай ір агО Ме ту чаї тТвК

ЗІ зай 25 ів Аїа і ім Аг Хі ве ія біу Біб Ре да бе Ве меж Ав

ЗІ БУ ве тт оці яр ока вед їнгт ол: 1 Заг оББе вро тут АЇВ ВР хів зр ху З Ух м

ТНе Аа те їйт вто; Бей тв ому Аа яв Бе вв ТВг очі БУ АВ

ЗА Ж 75 аа т Бе Баг Зв ші аа зі: Ууді туг чаї Аз АКО БВе у ви

ЕХ т чо

Її Бга уді ТВК Дів ТВ газах ів Аїд аї ТВт АЮ іо дів ага АВ що 5 зів оіт5 АЇн о заї віх Бім це; вве тТВкоЗег їве дж вто щі біу ар ща щі що зу ТК зп Ма із ім дав нія тУК ТВ де хв оті зог іє ХВ

МУ тк ов жа Аа Му В АВ НІЖ Бук тп дека тяг осів БР цк за" ще ІХ 535 що чі дів заг УВІ рРВе о дга сух да сСув звгозів Аа тв оАжЯ хів тук їх ща 55 вуе ТКВ оБів о тжк го пе» овжх му 036 Тк Жкв о Туг ї3в ТгтвоБіу тТук

БО ВЕ ТО

ТвгоЗак вже ТУ

ВУХ

«Мк Ст «Зі Я «ЕХ ВХ «ел ОБТлЛОЖК

Ії» штучна вослідовнІсть «ВХ» овтеавтТаа-тЬАйиВ «МЕ У мит ІВ Ів Аа АщВ ЩІ оо сів сСев УдДі БгО Тука Су ім АБ ї 5 но ї5 дя вка Бін З бір 115 рем о ажи Ма аа Жів Ве хак Хек вів Біб о ж ха ча) вів бін Зіе Мі фве вуз Зі Те ага Бер хів мем біб ваз КНе 35 «в як іа Бгто Бі Оу Зек РБа діа Рае З)іу зом Кб дав оівн Х)ів тТевоЇ3

Б щ5 а

І18 РВа лаяв ів Аяше Фів ТРрочик Аїд Бий роз ага бів Уві бів ім 55 в т ВЕ їв хів азп іп агу Ті тег бій РБе зів ге бік бій Зта жа Ба щі З аг мем Уці щі ББо біу го заг туге З53 сію Туб 1 сем Аза яв

І іо що їУ5 Ін Тео шів ам Ар о вго вав вай рго Зід Бек гуд Бій вка чаї лк тТаг о Ата Баг Ага ТВг ТА? Аз Ар АЇщ Без іже УК РФ Уаї гу ща її5 їі ер Мет Аа 1 Бе» му Ва ОТ зом Аза лвгоіви бек Уві туК дід ха їх М 5 ів зег діа Ам ів Ні їв АВїз іш і во Ага Аза АЗВ УЗ Бе гне 425 їі 135 віх дів ага тв о шіу ів Те обБів ТВгоАка Жів Аза Аж ев тую АК ік їх МН

АРОвМЕи Куб Аа еб Хі АР АБЬ ТУР ТВгОАБА віє Суз УЗ! Ар вне

Зь В Ка

Тут Ап ЗТ бір вен сту аа мес дви ма! Жіф де ккО Фі Тук тує з 215 ї2о

Аа ВЕ сій Ага бів вв о тТвг Хі бек хі ви дав ваз ЯР АТд Бо -ї ям з 7 хи шу ве Ух ж

МЕ кко ап їв АБО ІТ АГФОЖВК тег вгО жів его тТвФгогух бек Бій ів ївт аг озіц Хе Тук ТНб вро бе ЗТ хів бек о рте ші АТа Фі від «15 Тук Тр обави ЇВ Ар Уві йо ага Оіц Без Ні йю Ме а5р тп ів аз Ага мезо Ті тів Туг жнт сі ім туго ага О1уУ їЇЛТе АгФ го жу З ніх ув АЇВ о Біу Щі5 біс Уві? 5) ЗР о жвк аб тн Бію мере тнг

Аа Ків оку не вро сем оту біу твх ліз віз тк о АїВ Бім Кто ве 325 ї30 35

Ага БВе ЇХ! тт о Ббо Хек УВгобве веб йіу мен дай ваз Ме їук Ага

За ах Ж

ТБт сво бег о АЗв о вгО жів Ре Аге Ах» бік го біу дів дев хе жів

І1і8 ага тУг Ага тн шаг їв о Уді ші бі Уа ді Ве Хв сій ро

КУА КБ Іа ох - - жк зза ав Біу ів Бій ем ТуК дго УДІ Аг боту ТВ сем аз Бек Зв

Ака піп іжн о Бга ів жін РУ Пів Зак беє ів тВе Фів Тутгт йют МІЗ щк УМ СУЯ

Ага іви Суз ніх ма! аг Бе дія біб чес веб ака Аза вій Шім тва 450 аль я ін пер ої Аів йта Уві Бтє Щет Бе Заг Ткр тТагоніх вгор Хек вій

Ж ка 5 тТвВгобтє Те оаза Те їі5 аз оте во УВІ фа ТБ бів 318 Бго ке»

Я 5 я

Ма! вує БІВ ні тВгогжв о бів беб о пі Твг о тТвг ді Уві уз щі ге их чи «ЕХ Я

Бі КБе тБгозі Зі АБО їі сом ака ага їВкК о зек Бі ву ге вве 8 аб ях вій Ва же" дей Зі лот іо вжвВ Її Ах о Бем Бек шій га оту аг «0 Ох 5383 вів агу їі ага тег вій Бек ожНЕ їбге о дялп зв дб Меї тує Уа ТВЕР 8 5 її Аїа піу біз аг Зі Бе вів сі із вне дав БУ ТЕ Ме АЗИ

Іо 535 я

Твг шіу Азр ого іжи ТК Бе бів бегб ВБе Заг Тук дів Тит їта А тТае діа вна вк Ве вгО ТвВг ої Аіа ек БЕ г їм ТВг У ЩІ АТЕ

ЩХ У их двір впав Зак озвк Фі ве бів Уві Тук ув! вже ага ве зів се

ЗВ 5 хо

Хі вко УВі Тиг о ата Твгобев бів дів жа) те дер ем Ти ага Аа и сов що сій іже від ці ні бін ев бе тТВе ек тт дов ке Ту піМх ів іже тТвВе авр Уві Яій фу ар міх тТже тТвк дев тТвг хів бек бує Вер

СО ВІ їх 4 чі сів ет а «Мі БІ «ие БІК «3» щтучва вослідовність «й зах бів Хі ав ява ій дя о щіпй сСух хв| вБго Туг а Сує вано ача вгай Бі) ак пів 318 івем ва маії Ав зів вне веж о вак оц КУБ хх Б с»

КУ га ЗО

Уа Вій шів же нів еВ вуб МІС Ве ага зем жів Сем ФТв ва Бе

У За 485 зуби го шу і Бег вна АВ Ве Бію сви Рв ав ви 1 го іх й во іє Би дей він йо му ТР бек АТБ ве Зав дка Сі Же тн м щу ЕЕ ЖЕ ко їм її ака ій ве щі ТК ші) ВЕ вів го Бі ші аїв Хі ів

ЖК «5 й Що я ага вен Уа іх ре іт ага ек тує аа ів Те жі бу А ке

І В ВЕ ло

Ук ів те Бі Ап вв га ВО АБИ КкКа Дій аг ув ша же мя мо 32о зах вгу їй пса Бе ага тег ВР одер аз Аїв вем ренотве Бі УР вгаз

Кз КЗ В ви Щек Кіа іє Брут у вне Єїя їж) Яїа ТВровяю ее уві тує жів ях ї5О їз5 ІН нь аїй вв іже ні вен ах ме) ши Бе аж вів ма БИ втях

Її ВО ВУ сів БЕ: яки Хув дію їжа тик ші Ве ча їі дв ве ри ре же їі55 їщ5 ще

Мерів ув Аа г хів дра ж ТУК Те аа НІВ Себ У АК РНе

Ю 25 теє во МЕ ЕК ре жи жа бер ви Ма жів вк ве вів жк Те а 215 ЗО га ке ій яге щі веш так ХіЄ Заг ча) зевоаню вепоУВї Аа ее

МЕ песо ай ТУК ВЗ Хе вка ЖНгОТує бга Ж РЕК ТНе рук Зоб вів

Я; Ж Ж вен ТвкК вка жів жів їжк Те за бе вої ще вто у АТ В 7 Ов 7 ЗК - вед ще ОЗ ЖК дід ші» тУуК Не се Бін яз Уа ек АБа ОБ РО НІ ЗВО ВЕК АЖ

ВЕ іду аа АК іже її ків ТУуК ЇВ пі В Зук ДК БІ Х1ю дко що Я ю

Міз Тга АТ сію ніз сім щі 015 Бе Баг Аме жк Бі мах ме оте

ЗБ 315 328 вх ІЗ ага Ра го фей тує фу ТБК дій КЗЗ ТВк АЇВ о ВБіШ вко ТВг

Зах Зо З3х

Аг бле іє Те оБее баг тТве БЕ Бе» Бі бен дв зец вва» Тук дгу з з ЗМ тТвгоіжу ше Аза ГО ффе Бе аго АБр ОБ Рг біх Аїв аа Хв Хе 5 я Зв їів га Туг Ага ївг его ве хв сів біж ув) сіу ве 18 вій Рее

Узі: ін Вк 7 ек

ЗУ 375 ЗО ази ака пі сів бів без тег Абе Уві Ага бів ЇйК обврв Аа ик ові 355 За Зх щю

Аахор бБій си рКЗ їі8ец біз Зіж Зім Зекобек веб ТВКОзУБа ту зак міх 5 У 5 ач Бео сСуз ніх мві Аг Бе АТя пів Зек же аг ав від бін вБКо

НЕ ІВ ще 38 А а

Бей аа тег Аіш вагу щі вро мет вве ес те твгокіз дев бок дія я Б ча

Тавг ока твгоАвБа те ОЇ Ав Бгоа АБо Уді бів тео осі Х1в БК кв

З5 5 в хі уз ата нів тТвг обо бій бегобту те отве Уа) Уві Був О1х Кий

См я 475 «ЩО «Фі РБе тег обі біх АБО Хів іем Ага агш Те бег Ту біЖ Рго Ра 5 щи ах вів Бра не ака ущі й яки ер ТК Вей жо Зек осів ака тТУгБ Ге

Б 55 51 аїн аги їік ага Туг аїВ Беб Тнг ЖВК Аа Бей ак меК тТУК оЖВї ТНЕ

І12 818 щі із ко гів о кМе Ба сі Бій Ве аа туз ТВгОМЕЖ АВ й . 7 зах І М таб ошію зп бух Бей Те Бе бів бак оте 5ве оТуб вій ТК ОЖХІВ Ар ах зай щх БО

ТвгоАЗа вва те вва вБта те вх АЇа Чек Зве із ТВк омаї біу ді

ЗЕ 7 «ІЗ дер оТНЄ РНе З Бак Біх аа Зі о Упі ТУК Уві ар АБ БЖ ШТЮ Бе

Зо 585 59

Жіш вко Уді тв АТй ТВК Се ІН АТ УВРЬ ТАКОЮ зжи Зі Ага ІВ ко що ух вВіпоішз дій ма! ніх бів мви вне ївг оБагоївг жав ве) Бі піу о

БІ щі ев жк ТР ав Уа вів їх вв нів тже тв ще 53 І «ее В «Фзю З «кій» БІЛО «1» ВеуУЧчВа послід ЕТ ках хе 8 шег ків хіе ах аби бів ЗБ хів сек маї вго ТуК Ай ду сви аа ї х т ії т - зх ї я М 5 ду рез Бім Щек біз Кіз без аа узі віз жів рМе Зеб зак вів дій 35 35 з

Уві аа хів З18 35 рем гу їі тТвВк аге їж Те їв оба дав рве

Її о ча соди тяж у и зх сх ших о шоу. «м «до ще вч мне рю щі БіУу баг Бере Ал вовк і зїаи Ва аз ів Хі їквовіу що 55 БО

Іі5 вве ака Бій ар Бій тер оБЕК аі5 Ве івм о абе вів Узі 518 вів дж тт во деа жів Так ЄВ вве лій дтп і пів ав їн ІВ

Мем діє ЯК БІЙ АТ БІВ ЇВ БІВ впЄ ЛІВ КГ БК БІ АТО ХІН МІЙ ага оіви хаї іу Бе бі ага Зег оту зр жів те Вів бе А1Вв ев не НЕ іо вух Він тто бій ди аа Ко Ак ава Вт лів Зак груз бід Акф Ма! 12 ТЕЖ вищо б'юкач Ж Фо рах ум, сх од дя я тку СТЕ луки ж - вер тве Ак Бе мг тво таб ази дев дів іно огед ТРОЄ у жд БКо 5 Ах КУ іїсв яж Аїд жі во бі вно бів рез 814 ТВ мем ож жві те діа

Зх їх ІБХ ї50 ій зер віз ямі гер ні Бе) АіБ ве себ арго азо вів жа вне вне

ТБ Зо 5 ге кока ее пух я с ях тех - 2 ще чи зак Ж х 15 БІ Ага тТкв біу цем тв обі їВг оди ЖХЇв ал АЗОВ гео тук бог ага КМ іже апи Мшг хів аг Ар тук ТБг о вяВ ні Суб хі ака вне

Ка ОЙ КУ те Аза жів ту ім оік аа ім ази щі Кі Ат Бго о щів тує Тут 7 зі 7 пок ХЕ т 7 «Ам Ж ве: ага вне бій дра бів бец ТНг ОХ ее ха іву дев зве ВР АВ КВУ ва вто» ава Тук ва їі Ага ТВР о ТЖК БгОо їіш БО ТНБ орух чат ощжівй

КЯХ 5 У їз о твг одказ ін їі тТук тег дах пра Ті жів сек рев бішж дів шій се ї ак хів о тТук тчг ОА о вкКОо бе хз ОК Кто біуж АВ ОІВ ів іх Тек Тгосен бів ар уві їв аг ів га Мій зон мех ах

ЗУ ку й Т85 ех У ж ре ів; би акфоіжв її 38 ТУк тб обі бів тує ага піт хів аг з за Кю мів ттродів біт Між Фі) ді Рим Хвг о Зеб зго ТВ Обі мет Ме Тв

У МУ 15 ЗО до іі Ага Не Бе іве туго і їВе дів Аа ТВе Аї« бів его твР 55 338 55 аг ве ї1е ТК оРта Бек ТМУ Бе ро Ф1уУ і8ц АЗИ ви Ра СТУК Ата

З 345 З

Твр зви бек 433 РтО хів вне ле азробів вто піу вів аза Хв Та її дгц тує де їй обегоіви УЗ 01 шіу хві щі Ве їі бів ве ав вай Бі Бі Сів Мгц ТУгГ АБ Уві ЗК Ру ТйР Беу АЮ БР ої вх 555 З 35 З аа іп ве то ву ім )У б'є Бегожек вай тк отр тк щеє мів

КО ії зга іль бух міх Уаї Ага Бра діа вів Зег ів г АХА АїЗ бів БКе ака за5 вн і«в 555 Туг аїа ага Уущі Бго Мет еме зекотер о твВК віз ага Бек 818

Так ро ЖК аа Те їі вав) Бе аб Ж ЛІ те сій жі6 вто Бек

Уві ух АЇя ія ТР іже Фів ек обію те зве жеі Вії вує «У ев

Як а 475 480 сі Ви ТНК Фі КУ аеро ті бо ака вгш Ве БЕК ім Ту вто вве

За 5 що кій Бе яшк ахий УЖ! дви ве) аа ТО В5В ія его оОТВ ма ту ЯКЕ їз Аг її аго тує ій его тВи ТМе дев сви АР оМЕт ТУК УВІ ТВ їі віз сію ві; аку Зі вне АТ Ту ТВ РВЕ АБИ Бу ТК ВЕх А

За 35 5

ТК ОЯ1ів АВЮ Б Бей ТВе бе Тр Зегб Бе бЗеб Тже Аа Твг КВ Або 54 ще 5 я

Тве АТа Не ТБ БУЄ РРО Те ру АТ; ЗБЕ Яее Беб Твг УК? бі ків жав тб Бе бек ек ім аже ім Ущі Жук ША? хр дра ЖНе б вва

ВО 55 в

Ііє вро Уві їБт в'я те сви сів ій УВІ ТР айв ве бів ге АВ сій вуз іш УВІ ніх Ти їжу БЕ ТНК БЕР ТВК Аби ВР «ТУ пе ЖЕ ще «Ех лю «Кай» БІ

Ай» Штучна восвІдавнІяте хрЕщх и «ий» ВТ Те «Бе ЗВ

Мак бів їі дей вже бій аква ої Сех жі емо тує аа суз ге аа

ХК ї 18 їБ

Ав го Зі: его в Кі ін вза уві аїв їі Ме бек БК жк а чаї вата жів бів В3ж в ке її ТВгоагу Беб о яів фе ЦЕ дБА БАК

Зх ща Я

Мо орг сіу сТіу 5ек вве дід ее єїу меб Бе др ен хів ткроху а Зх ЩІ

Кі бе АУБ бів АБО Бій Жгрвобагб Аза Бе із Ага ів ді БТ Фів нк І їх що мен Хі Аа Бій аге Хі ТНК бін Ве лів Ага ТУ (іа Аа ЗЕ 01а 55 Зі 5

Ага їв Уві «15 РАВ СТУ АкО ек о туг зв ост тук Хі гемо дів ме їж шів Ттробію дп одер Кг йзроахий га аа Як Буз бів агар

Ко 32 їг5 зга отБт Аг Рв АгО ТМгОїТВье яв АЗИ АТА вже ген ТТ щік Ма! вро 135 5 їжи век аів Ків Рго піу вне Фів ве вій ТНК озеб Бег Уві Тук дід 145 ї1ха Ух 16 сій его Від Ахи і НІ іс дій ів обов го вав ій ві Ме ве

ІБ їй 5

Єтж ів вго тКрозіє бен о тйпг ій те ах Ха дл Ав о бец о туК Зк іо МУ 152

АгО Бен фу дей Заг о їфв ага 5 ТУР Так оязеа ні суб Уві дк вне 355 т хОУ

Туг ап Ків БУ іжц о бію ха ї8у АБ о УВІ жів гу о вгРО о Зію Жук тук ака вва бів ага від їецотве Щїїв Зак Уві їв» аа Кен Уді АТа ро

ЕЕ т З ЗВ зак жах ФВ А 4

Бе Бгто аа Тут Ар їі Ага ТУвЕ Тк Бо Хі Ву тТВробже Зек ФІ и КУ Й ть

Ах ве У

Мей твгоака Сім Жіе Тук їБко ав вго ІІ Кі ее го Біб 8тТх бій

ЯК Б ТВ

Вій ів ТК ТВт жи Бій АВ уві (жу Акф бів КгОо нії ев АхЮ ка 280 «вх

Ве ін дз крови Же тіє тує Твг обу Бім тує Ак о Біу ІЇ165 аг ні трі 0іУ Мміз хів чі ОМ бек кг бе ТВ шу МЕ ЗК УВЕ

З Ка її ЗО

Ази їі аг Ба вго ів тує 0іу те аАта ав ївтг олії жін вро тве дге ОКНе Кі Те ка заг ТВ вне ре і пеноакий ев о вБВе туго вго в за Б тйтоікн его дід КЕКВ оуїв ебе зга аб одін виб діє із аз Жія Хі жіхк ах паж меч ливе ходоух з а У ді 1 31 з ж КУ ок ге її ага тут ке Оотиг ож Ко і ші -віЖ Ж хі ЗБ фі б в то ЕН ЗВО

ЗЕ аа СТУ БІБ Філ рев туг Ага жа! АКф Фі Тв о) а5р Баг ву

ЗВ ще їх як

АщІ пів ей бгв о іецз «імобіу сім Зеб бегкоївм ТвК оба Тук бек МІХ

Бе З У га св) сб ні маї ага Бе із БІ Заг о се дб ВМ АЇВ ТВ БК аа с 3

Мем дув їжте дів аг ха! ВгО Ме вне 5еб тгр ок ві ага Заг дів

Я С тХ тТвговго ТР оазй ТНК жі а5Б Рв Вр УдДІ ЖіВ Те б3в хів вра век а ях м чаї уз аїВ ні Тнгоієм бів Зак обі їве о їВР Уа Уді ржв щі Бк

ЯЖх ак С Зк пі впв о тБЕ ці бі де їі фви го вра Вт бевг бі ціє рез вне щіІЖ пе ю му між Ви оз со мг ок жо ЛЕЄ ШІ ТУ ж

ЗЕ 5 А

АЖ вне Берг дяв Уві Ай МеЗ АЗИ ТГО ва ВМ ВК Осій дге о Туб АгО щі ЗУ БК вів тв їі вка тує дія Зак отвЕ тТйговзй ев обра мет тук чаї отв 515 ЗО пе тів аїв Бі іч Ага Хі КБе дів бік Філ ВВе Аа ЗУ ТВЕОоМеї Ах 358 і з

ЗвБгобіу ар вт сечо Вр осо бій Явг свв ошет тук ва тТвК о хТв ле) за ва ЗБ БЕ їкт діа вве твг о рРБа вго тТЬгб о їе5 Аій Баг оЗютг врач їйк за! Бі АЇа

ЗЕ УМ 55 дв їй вне чек охиК Біу взй ші: зді тек Уа аа АЮ РАЄ СІМ ве їі ге уві тТйгоаіїв тВгобен ші: віза жав ТК Ав зем (ім Ага Аа

У В - хі. Фк

МОВ що «й І «М ЩО «Ве БІЛОВ «ВІЗ: нчзучва песлідвиність «и ЛЕ» «йлЖУ Нова Тоо ть «ВіНКе ЗІ

УК ів 1» Аз о акв бій ап ів Сух Уа В; тТУг ААУ СУ Вам дей

З 5 і0 І ака Бра бін хек обі Тіє рей Аза ві аїз 36 рве дек Зв Ів бій о 3 5

Уаі 81: ів 31 Бі Бей ож» Хі тк зго іжм ів сви Бін ва ВВЕ

Же че зх іец та сів бі ее Ре дід Кйе біу сен беж аби Зав Хе тев о діту

З ЗА -

Хі вне ав «і» зв сій їгроЗег Аза ве рено ага Зій Уві їз бік

ЩЕ т ТУ що їец жів аа «і вага дів їв ші1О иа Аз АК Щі зів Аа хі Фів ях ча щх вгаіФн ма! Оіу пе Оїу агюр его Тує взводі Тек Хі ін вів бе) ї0о їв ще

МУ бі ТК Біц ап Ар орта АБО аа Вга вії его овуз БіМ ага жа

ЗЕ Ух ах

Ку М Кк зга оте ага Вне ага тн отТвК аз АЗВ АТВ осв фва ТК обФіу УБІР Кк

М 135 ВИ ізо Ме діз Кіа вто іх ВБе жін іо вій Тв оіжм зве жа! Туг Аа 345 ЕЕ з55 ЕІ

КІ лм АЖ КК бів бек дія йхл їв нія ів оаій ія ів Агф Ар аа Уа БИе вне

М ї75 щі Вів ато тгор о Біу іа ТЗг біб тТве вза їів ви ов беб отже Заг

ЗА ї55 В чі ії 5 га ще ще хі по вІчх й тв рн вх чтх су чаї дги Ева га ке Ж «вояж дів ака дав їж ГК ов НІВ Куй мМяс АК мае - по - чик - яті т

Ії а 205 туУуг авя ЖІ Біт ем іх дов ізн дн уд їЗі6 ак ККо ів тую тут 310 2і5 28о вгц ве біб аго вів сег те Ії Заг УШІ ке вЗрівми ЩІ Аїд ів

Ки Т5О 25 жо

ВЕ Бгто Ай Тее АЗИ жів АГ| ТВ Тук БгО ЇТе бкєб ТБу із бве Вій не Б - ке я пи ах г кВ вжи тт ага бів Зі тує Тк ваз Бго Хі Ї185 чек бе піу АТд вія хі 255 я іа фу Туг тт ог бій Аве жа! ів аБО ЕВ Би Ні без мех авр ке В ТК тре вжив ап оаго меноХік Хі тує ТВг оО1у із туг аго счіх Її аг рас е 25 ЗЕ

Ніє тТгроАта сіу Мі бій жвф бів его ще ага ТК оо1у Ме меж ТВе

З Мо 35 ЩЕ

АЯ Хів Ак оРНе Рг грец тує ФТУу ТВг діа За ТК оаїа ів бу ТВг 1235 358 ЗУ зга Ве Хів Твг оБго беб ТВе ве бго бі ев о ажи Бен ВБе Туг вго и У хо твгобям ЧК АТМ ге фі Ба агш Ав озіз Бе ЄїуУ Аїа вав їв жів

Та5 зо ІБ

Те аг туК вга же хюг ія Уві 53 сік Уві діїу бе хів сік вко ї7о Зо зви ах дев бБіу ші) Бін рем тк агар за ага щі їБгоБем АВ ОБаеК ої

Ка з 355 ще

АВи Бій змен овга свв оБін сіє Щі Бак обег вже ЇВ обін тує бер ів ау З 55 зга рев су міб Уа! ваг вне дій Біб чех о рже Ак оасп діа дій РК

Б ЯКУ З ен оахротут дія Ага уві Вес меї Бве зе Отто Те віх агу Зек дів з «ав 445 тТБковге тбг вже уУБе Ків 45) бге яБрозаї ТТ ТВ БІВ Хв его ях а 5 а чаї й» Та віх ТНгозмем бів кг обіж тБтотвг оУаі Уді Беж фік Бевз а5а АТО «75 Во іу Бе Тв Бі біж дв їі іви Ага Акад отвР о Беє щіж Бір Бра вне янх Я з5х зіх йне бог дав Уві Ажа сер яв їв дей Ме чек Біт ве Те Аа із вагу мів «протик дія бек ЗУ ТР ода ев аку Мак тк У АР їїв аїа соту ків Яга ків бе діа 5ію бій Бе ази ув Те Беж вки

ТвВи БІУ АБЮ Вес еВ тТве БЕ бів ее бе Бек Тук Кі Твг хів дає я ЗБ 560 ївте дів БВе Те РБЕ Бго ТВ рух Вів бркобеє во Твт ЗВТ СіЖ ді ахв о їйг Бе дес ЗК шію жав бів ха его мі ар аг Ве ОВ Б ща ах З ів вто жа! Те дія тяг зе Ту я «гії» що «а» Бідок . . ке» БЕРУЧНІ ОБЛАСТЬ «ов «ес ВЕ аТК ее ЗЕ

Ме ЗТ ЇВ Ахв ваз Фів вай От Су уві вРо о тТук аю су рев а ї к 10 її

Же го бів Бек ій Жів рею яжа уз дід ЖЕ Віне бек бек «в ФМ

У Та бів зів ніз вве бух Ж) ТР Ага вви ІЗ рев дій аа Рв

З ся 5 іш бго 1 0іу бак рве АТйа РВЕ бі ев БВе дев ве Бе Те обСіх

З ж що їїе Рв ази Бім ахо бів Тур озек аа КБ іже ака бів Уві бів БІВ іже ді яха сій агро хі знб Тв Бе іа го віх о1н іа сів ок де ЕХ ВХ

Ага іх чаї Фі РБе сію ага жег ТЖг о АБрОбіи тТук ХіФ рве Аа мем в пу Ка цу ЖІШ ТТГ ОБ'Я АБИ 45 Вго жо АБИ Бе АіВ Бек руб Віз Ага ХВ

МКУ КЕ 155

Ага тн аАгу вля аг тТвгОТвК АБО ах аїд жа Вам тв боту уаї ро

ММ 35 19 іо мех дів Хі о вге бію КБе Бін цем вій Тс беи баб ож туго від 145 Ве їж за «ів вт діз дей зву Мі рен АТ ЕВ ої ага ар АВВ Уа Ве о йное

КЕ ей : ! м ї155 ї70 ши зіюк сів аго ге осіу ме: тб ошін тю оахи Хі яз ахр ем туго бек 18 ії М

ГО вн озУ5 АБИ ЗБК ОЗіВ ІЧ АБО ТУуГ ОЗВгОвай Мі Су УВІ АТ ОБНя 455 Мк Ох тук Аж Кі б'ю іже біу ази о іец аа Удаі Хі вагу Бга Бій Туг бе лга вве (іп ага ів ря Тег ОКів Заг ов) зе вро омев Уа Та жо

У Ек -Е на 3У з За ж вве ртє Аши Тук дію її аг їйг оТук реа 1» вс Те вм Бек обій зах КУ ах іо тик Ав пів ЇТ1е о тугб г Аврора Хі ів его вго 5іу авіа БІВ ак «55 а віз бі Тугб ТВг ій піз ав) УВі без ага бів Бгто міх бе Бех Або 255 ЕЛ 285

Кс ку Ко іш ран аа Абе Бо їв Зі гже їВг осі єїю тТук ага щі хт8 Аг віз т"ровід Бір ніз Бін ті бій Зеб его ага ТВгбосік мех ме твг зх що зі з2В зап ЇТе де ре го ім тує Бір Те АТа АЇа ТВ АЇа Фі вка ТВг

Жах а 355 ага вне їів тВг вро сЕР о ТВе Ве вта О1У рев оаєт гер пе тує аг 348 355 Зх ївВт ке его Зід БКо їі бе зго азр ів ЕгбО о Біу дів вх їі Ті в вк М ої

ЗУ ще Зх ї1е Аг Туг аг Тк его і ву УР Бін БКіу У біу й ї1в біб орга за Аа Біу ів Фів ів Ту Ага Ма! АГРО БІУ ТР оїшк АЗВ Ба з 8у

ЗЕ ЗчО З НЕ

Аха хів ішев Кг сечо Мін щік під Беб Зегосви ТК він тує хек ніх ще ча 4і5

Ага Бен су Ні УВІ Ага ве дій біб Бе б) аа вай АЇЯ Фів Рвго

За Я25 щУ сан А ТУ Вів аг уві го ВОЖ РБЕ Заг о тт тНе ніж Агв о жек ліз «35 зо ах

ЧКтг ово тТвг Одже тТВе Хі АБ оВгО АЮ УВІ 16 ТВР осів Кі ве вв

З 35 Я «ві їма дід Мміз ТВгоісги бін шегоіу їВрг ої маї Удї дко щіж Вка а: Кум за ом г Сем БР КК Ффіу тмг от ох Рагу жу Кк 365 за 875 я пік вне тнгоуїу Біт Ажа Кі ке оду АБО ТК век іу Фі Бр вве

З Ба 55 дів ту тТве ів жа! Ача хів ву біу пів зом РК бів ага ТУЮ ВГ ще ЩО М іх аг зів дб ТУг Аїд Баг о їве ТНК Ба Бей Ат їі тУук Уді ТНК жа вів бі бін ага жів вне з РУ шів Ббе аз фу ТК ве зе а3О 535 чай

Те Біу Ав БгО іо те ваш Фів бек Раз ЯФе туг аіа ЗБЕ ОЇ15 АЖ

Зах 558 5 БО

Твг Аз че ТВе рве во ЕЕ Ще бій Бек жаб ве Тома! сі АТ хду «3 ЗУХ ме їй ра Бек баг сту аз Бів Уві тк ЇЇ АЗБОАКО РКО БІіШ век її вто узі тївг Аа Те Бвбе бів Аа ам Туб джробян Бім дб дів чх ще БО віп ож

КЛ

«Ж «Ех ОЗ хаАйх БІНОХ «АК» оштжзна поспідювність ке Аде «ак ОВТІЗ-ДЕщТЕ «Ох З мек біс Хі азп о жжа бів Аза іп о сСух Уві бе Тук дя Се іще АЖ у м Ух ув з ЖЖ се 3 Зх КО МО дай вро Фів Бегосів дів фем Ав Узі Мі Уж вне Бег жк ОМ ОДіЙ а Кс І

Уа Аїа Бі Ї16 Мі їец вуз ї18 УВК о АКБ Бон їі іш Бі аби ВНе ях зо 45 мен вто о1іуУу шіу бек йме Мі вне біт сви вле Ар мви ї18 тТтробБіх

З У щи її. вне бай ів ззвошів то Заг оАів вва вен АРЕНА заі ів ев

Бах га 7 щи ін 11 да" бій ага їЗе ТВ ші ре дів ага Бі бій дії Т12 бій

Ех ча 5 ат ів Ма! «іх РВе фіф як ит Жук зво ів тт ої іа дів жи я 135 ма іїУз ім тео обі АЕВ АБ ОРГО АБИ доп БО АіВ Баг ОБУ шій АРФ ОВ іх ко ха вага тВгоаго РВЕ аго ТК ОТВг Ах» аз ОАЇВ Бем ів ТВ От Уві вто

АЖ 35 І

Рец Мет Аза Хе Бе фі вве іч їев Аа тн зем о їек чаі Те АВ

І ж ЕВ і ій чес Бій дБ зт ніз ен авіа зни іви ага Авро дів та вне вне і55 ї7о їх щіу Бі агОо ТР осі ве отнт щій Таг ОА Хі дев азровн тує Ве їй 185 о дк ій от АБи ек ків ага ев Тук ТВ Ай НІ Суз УВІ аг вне ї55 щи Евя

Тут кяв хів Бію йеи ші аз іжу дав Уді ів Ага бгш 1 тує ТуР жав ! хе адй ке в 22

Ага вве вів ага бін із тТВгоОїів бег Уа! ів Ажа Бевз уд 1 ви зах 3 У Я

Вме Бко аАМма Хуг ажв Хе Аг ОТВК тТук Бте І) ге ТВе ому Вего дів їх У Ка іже ТВговчь щі лів Тк ТВ одно га жі ТїТ1ів 3 оБРа бі АТ сів

КЕН «55 то від сі тТукК ТНг ої вів АБ жа) ів Аг ій бе Мія без Меж АЖ

Тож дна " з45 І ше «М Б ве бор аа дгц цем ї31з тів тує їве обі бів Ту ага ші 31 ЗК

КЕ 5 ЗЕКь ніз їтв о ата ші ні бій таї бі) Зак БК АкКа ТВК Бію ОХ Меї Те два їїв яса вне вга змши Її Ффіу їве бів аз зве дів Біб его ТВ хх 350 33х аг обйза жі Тв о йго зар УВК о РБж Вго Фі ее дя їни Бе Туг аго " заг Б М і

ТНК Без беж АїЕ Бке Хі ВВе Ага а5в бів Бгто бі ві: ава хз хів 355 ЗБ хх їТе ага о тУРК дКфотТНе Зекроіїзу Уві зно біу ха? осів Ве хі ОїБ его зи 75 158 дахи вв ові Бі ій фев о тжк аАги хві да бі тв о іем Ас Зек ге

З ІЗУ БУ: ах бій іви рев іва Щі Бі Бін бр не овевз о тТве Бім тує 5ВК ОНах

МЕХ Ба я ага ви осСуз Нік УВІ ат Ме ій бій же овФе агФф яви АЇЗ бів вто

І Іо | зи я їм Ази їУК АівВ Яга Ма БгО МЕЖ РМе 5ег ТК Таб оніб Ага вет АТ 535 ча 445

ТВРобгоОо Те 5 Твг Хі ар о брко дви УЗ: Ї1Те тТйе бій Ків рев Бош

У Ух яр чаї ух ід Мі ТЕг їв ЩІ» Зек дію ТвтеоТвг Щі у) Ат оту Вго зв; ще вух зво пі Ббе тн обі Бі йяр їі зу вагу дб ТР оЗеє 1У Пі ВеОо вне

Як БЕН Яч5 від тук твк ків тв? Аава ків аа щіу сій ев оРге бій йгу туго ага дів ат їі АГ Туг яід ек ТНК ОЛвг вай зяб Агро зів тує жа ТНК

Ах а 525

Уаї аїа бі ба ага їз ее Аїв зіу зів Ба Аа рух ТВг мех АЖ

Іа тд 30

ІВ обі аб вро гм ТВК КНе я) вег ос бек отук дія бе ї15 дав

Ух Туз М ве

ТВг о АЇш Блє тТВг оно вБго Межх Щек дій Заг о баг РвВе тВг ох! дім дів

Ух ЗУ Зх ач Тк ріж ес биет Фі ам шко! ТУК бів яажев ага Ва От ем

КО КК З жів бге Маї ТБг ої жк ве жів ід бів ТК ажа рев б Ага щи ОВ БУ «йі0ю 38 «Ві» ВИХ «Ай мм Вж «її» щтучна ПОЖЛІДОШНіСТЬ «ей» «ої» вес їіКВТК «М» Я зе бів Їїїе зап дв бів ва ЗіБ Є: хаї кро тТУгб АБ Су іє а5в

З к 7 й - 7 ії 3 сх Ка да аа Рг бін ек Фіш ків зів а» Ущі 18 Хі. РВЕ Заг оЗек Бім Фів жо її ще шої їв і: хів мів вод рух 165 Й пе іі тій їв Ої1: ддий вк

Уяі вій сім Ті НІВ БВ бух і Так Б У БІіЖ сво О3р вай вве

С зх ев вга Фію вію Заг вп. лід РЕ Сі се вне ав цем ї3іе ткроміє шо Ії 5 їтв ца Аа Бі аз БІВ ТО Зак вів ве Бе Ат вів жі ів БІВ 3 То ях ЩО вам їі АЗВ о щ'Б а хі твгобів Ре АіВ Ака БіУ шій Аза дів щів

Щ5 що Зх зга їла жа! йі Ббе бБіу бга Зеготук Азв обіц тТУк ЇЇ бер дів зва

Мк З 4383

У із їв о бін дози ав кгМо аа дв вВге віз Бек оту вів аж хв ух їх їх

Ага оїТвг ока юве де ївг Тег АБО Ав дія вва іо ТВг обі зді вс 1 135 З іч мак ів Хі Бе єте БВб дів ве АТ Тв зх Зак УР тук жів шій ве ат вт мем Ві сей жів вер ем дерев аі5 чаї ее Вб лох АЖ їж ік зів ага то біт сво ВК обі те во хі Аа вар БО тук вее ко ЩУ ве рф ів губ вва ее жів го АВ ук БК дяй ню Сує УВІ! яку вне

ТУ: аа ЗЕ У ев обу дев вец Аов Ма КІВ дра Бра ші жк Гук щей вне дій ага біо ібр Не І1е его! ів в яз ві дій б я25 Я З зо ва без аж тек ва сів ака їйк оїук Бе жів ек ТВКовух вг осів фан Ву да бів Же Тк тТНе Або го КВ ів Жекобеа ту та в

ФО 283 Бе аі у КР отВе СБ ом аа УдДІ еВ аба сін Ре ніх ве век ав ях ЗВ 285 рик їж) аб аг іже Бе КТ те п осіМ бін був аей ТУ 16 дез

МЕ сх ЗА ніх тра вів бТу Ні оба ма: біз бег яве яко Же щік ме Ме Те ях М З ЗИ ази ї3Зв АБ ЕН во мае жує БіЖ о тив Віа дів зе Азов ВР ОТНе

ЗХ 53 ху дРШ ВН Кі ВК ББО бек ТР ОвВе РО щфу Бех вже КМ бле тек ВР я ЗБ я

Жве ія Щек В1а Бе іє Бе аг або біє го сів азй аб хів лів

ЖЕ дос Хек АТ ТНРоЗвр веб УВІ БО ЗРЖ Ж бу Ве (16 и вра

Б У ВО дей ав ОТ Вів ів звер тує вка Уа дра ож ЯК гбяв дже ек ме

Зк ЗЕ ЗХ я ще щівВ Без Бгб ан ім бі ФіЗх Зоб зако сер те што чує бае вт ча я ЯІх дей ів жа вт; Мах) зго Би із біз Зак ів) дра азп о АЇВ ім бга га 43 я їжи аБротує дій алго ді вб'є) от фе зЗек тТго ВК оМіз вка заг дів

Б 5

ЯМ Вро ТР одяв ТВб Бі аяв Бо Аве Уві Жіє так бій Хі бго сем

Се Б Я ча рух АТВ НІ ТВКоїву біз Зек іх ТНК отТнК оз Ма Аг ТУ рео 455 ат ях ЗВ іу вне Твеобіу бі аб 12 ів акф о АгО ТНгОбев Бу сію БО БМЄ яке а «5 вів Тує Те тів ув! й Тіт Аме іт Бій тео бге бі» аку Туг Аго мк що5 ЗІ діа дк їі Бгу туго аід Заг отТвье ТВт дав їжи Ага За тує уві ВР

З15 за зи чаї аід Біу лім ага їі Бій а3а Зх ій ББз ай кує ТНК МОЖ АБО

Тк Бі АЖВ ВгРо ізм тв ВБе бів Жекб Ра ЗБ ТУ АТВ ОТВК КІВ дол за З заз Ме тТвго8іа Ба о ТВг рве вБго Ме ек сій Зеж вес вче ТМ Уві щі АТа

ЗБ; Уа УР

Аз ЇВе Ба деко све сіу депобів чаї ту ДЗК дев ага важ ків бем

ЗК Зо що ії вто УВІ ТвеоАїн тТвВУ Ра Фів Віа ФВ тур за ще «аЩо» 35 «Ин «вай БІЛОК к«ЕЇй» йтучна шослідовмість «Та «ий ВОК «іх 5 мес Зін 18 ахй ав ІБ АБА СІЙ Сех УДІ РГО тує ака СУух рен АЙ ї Е із М аж го Зі бек дію ЖІ іже Аа уді АВ ХТе бе бек оЗек Зір Бі р ЗУ яз во "аф АТа О1о Та міз їерозже Кі» тТвг дв осв Хі ев ів ва ве я Б ів Кто бів ЗЕ» Бек вне аз БНе бі їби Бе дер ів її тТеробту ща 5 їв шИ хів Ре ап дію АвроФфів терозеюк від вве грец ака ій ма? піб щію ве а ге р цеч (1 АБ шій Абе ЖІ ТВК бін вве лів Аге Ф1у бів йів хіє ти

М Б 5 ага вм уд ох рн ків вкш щЩеє тУук вер ТМ тує ЯТЕ ом АТ ве куб Піч тЄв їн Аба ач Ре Аз ами Ргз АД Бек осух Фу АВ ха

АГ ОТВЕ АРЕОВВЕ АР ТВО ТБ АБр вхо ій без зе твер Ущі веш

І 135 іа вна ек АІВ Хі Ки Сі Ме Сім вже АТО ТВЄ зею зеб о Уяі УК від 145 І 135 ЗВ

БЖ ие ВІ а те міх Бе Аа емо іжн ага АВ) А1В У вве вве біЖ БТб АТЕ ТБ б зви ТВ ОФІй ТВРовжн Те Ам Аервофеу ТК оЗег дгрівч ув ке бек Ті вт аби тує ТМ оавА Мі Суб Уві де бе

БАКУ а: гХ пря пах Кл: «Як її сту хи юс їх с. ки ех к тож :

Гуг жа Тів бі івв 1у ав ізи вн хі Її аг бе обіц ТУЮ тує зежкх "я - 2 ї т - ж 235 Ж зкфорБе бін Аге Фів іви ТАК ІТ хаг Уж! ісу ар зе ВЕ АІВ ве

ВУ 3 235 я вре вго дви Тук ах ків аку Тв ОТує Веб охфа ве те; вує Зек вів -ЯУ У 5 еВ тн ве Б Ж тук отв АЖЮр вс Хі ї1е Зак вує Ту АТ УРА ей ах І зей сбеакю Ах м - сАЛ а к Е у

Ар у ТюготТяК Бен Зів ах маї їси Ага він ве Мі БЕб З АяК бК5 зві ФК ріе їси ява ага Бе ХТв Кі тук ТвРобію ів ТР аке оєіу Ї1б ваг тав т З | Й ніж тей аа ФІУ ВР 016 ЖЕ бів его бек дтВ їВаг оФіуУ МЕЖ мех ТВе 318 зх І реа

З Ж А ази фів ага вва кто за тек шіу тг ої АТМ тег о аїв З)фю ва тве

Зк ве рів ївгорго Зак оївВк Бе йко б3іу сей адап ее вве тук вка

За заз 5

ТЕГ орец як АТа РРО жі вне ве аз ів Рез 01 вій ай КТ хі) їїв де) ТК Ага тви Зак огре ж) Мій бі Узі хі ра ї1і8 вій рез

З 35 З вх й бік Бім зів вен тує дез ді Яга сіу їВг обом др ек вер акр піл сво Бк ів фр ік дім зе хек зе о тчкК дію тує Щек мік

Яга ЧЕ З лев ве СУБ ні Уві Аг Бе із ій 5агої8) Ага Аа йів піц вга я Ах 4 іеу АзНоїТек віз бго Уа) Бе оМех виє бек тер о твг о міз ага Зет дів

ТвтгоВго ВК Аза ТВгОїів азни вро ахроуві Хі тає бів хів го Бе

У ях я чаї ее дів Ві тайги щівп Заг обію же їВгозві Уа! ар бі го

ЗБ ча 475 З

Фі пе ТВкОБіУ ОТУ Ажр о Яїв веб Ач Аг ЯК ак Між вію еко Бра

ЗАХ 450 3855 дів Тут твк її 9) Ав оЇів аз сфу дій бо орг Кіл ага Ту АгО

М БОБ 5 ліз за хів Ага тТук аіа хе твг їі Аа вн вка бів Туг Уві ТБг чаї АЗа Бім щів гр Хі све дій б5іу піп вне веб Був ТК оМмеЕЖх лев

ТНК БіУ ар ог вен ув ва щів Заг ве янг тек дів ТК ОХ дей

БУ 55 85 БЕ їВЕ оАЇв ве тк ва кру век хек фіз баг бак вве ївгожві Бі АВ

Зх 5 Зх ар оТве вне Заг ошеє діт ав о бім маї тТук 518 дер Ага вйе 1 Би

Хі ве чаї те аа тТвРовБЕ 01

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Химерний інсектицидний білок, який є токсичним для комахи-шкідника, що належить до лускокрилих, який містить: (а) амінокислотну послідовність від положення 1 до 597 5ЕО ІО МО: 3, або (р) амінокислотну послідовність під зБЕО ІЮ МО: 3; або (с) амінокислотну послідовність, яка на щонайменше на 95 905 ідентична амінокислотній послідовності з (а) або (б).

2. Химерний інсектицидний білок за п. 1, де химерний інсектицидний білок містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 3.

З. Химерний інсектицидний білок за п. 1 або 2, де химерний інсектицидний білок має інсектицидну активність щодо комахи-шкідника бродорієга пидірегаа зі стійкістю до білка МірзА або білка СтгуїР.

4. Полінуклеотид, що кодує химерний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-3, де полінуклеотид містить: (а) нуклеотидну послідовність, що кодує химерний інсектицидний білок за будь-яким із пп. 1-3; або (Б) нуклеотидну послідовність з (а), яка є кодон-оптимізованою для експресії в рослині.

5. Полінуклеотид за п. 4, де полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка містить: (а) нуклеотидну послідовність під зБЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 6 або 5ЕО ІЮ МО: 7; (р) нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична нуклеотидній послідовності з (а); ЩО (с) нуклеотидну послідовність, яка гібридизується за жорстких умов гібридизації з нуклеотидною послідовністю з (а) або (Б); або (а) нуклеотидну послідовність, яка відрізняється від нуклеотидної послідовності з (а), (6) або (с) внаслідок виродження генетичного коду.

6. Молекула нуклеїнової кислоти, яка містить полінуклеотид за п. 4 або 5, функціонально пов'язаний з гетерологічним промотором, що забезпечує експресію в рослині.

7. Вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 6.

8. Трансгенна клітина, яка містить полінуклеотид за п. 4 або 5, де трансгенна клітина являє собою бактеріальну клітину або рослинну клітину.

9. Трансгенна рослинна, яка містить трансгенну рослинну клітину за п. 8, де рослина являє собою: (а) однодольну рослину, вибрану із рослини ячменю, рослини маїсу, рослини вівса, рослини рису, рослини сорго, рослини цукрової тростини або рослини пшениці; або (Б) дводольну рослину, вибрану із рослини сої, рослини соняшнику, рослини томата, рослини культурного різновиду капусти, рослини бавовнику, рослини цукрового буряку або рослини тютюну.

10. Трансгенна частина рослини з трансгенної рослини за п. 9, де трансгенна частина рослини містить химерний інсектицидний білок.

11. Трансгенна насінина трансгенної рослини за п. 9.

12. Інсектицидна композиція, яка містить химерний інсектицидний білок за будь-яким із пп. 1-3 і Зо прийнятний з точки зору сільського господарства носій. ЖЕ ЄВУ По «М УК ккю хх ОК УМИВ ВЕК Ах Життя КЕ КВК ВКА ЕКО ТЕ КЕКОК КЕ ВЕ ИЕ КОМІ НИК КН КК С ЕВ КК КЕ Е МАНКИ пеВКЕжх кож МКК ТКВХ пиятижжтюкюи ух ЦК КРІЮЛУ КИРИК МЕККА пет тятя я АК ОМ КА УЖЕ КИЕВ ККУ УВК ТЕЖ ЇМ УМОВИ І МЕККА КВ КЕ БЕК МКК ІКЦ ІМК УК КК КЕР вЕоВОщВ ЕЕ о ВВ КН КЕ КК ВК Я ж ях МЕЖОКЕКІН КІВ КНЕУ СВА ЕВ КК ОКУ МиК ут ОМ Е М Г КВК КВ сУУККх. ТЕ ЗАМКАМИ ЕК КЕНЕ ТТ УК УК У КВ КАК КК КК КТК КВ ТТ КЕ КВ У ВККС шу КІ КЕКВ К ВУВАТИ А В КУДИ КЕКВ КЕКВ АКуКИХ ВК ИЕВ ШОК ЖЕК ЖЖК КОТІВ КЕКИКН КВ КВК КК КВ дя КТК ККО ВК КЕ ВВІВ КуКК и Х. ХОБКАЕТУ ТУТ Ве ЖЖ БІСКВІТ КИМ ККУ ВК УК КК п ВІК ЕК Ки ВОВК КАК ЦЕ ЕХ КЕ ВЕК Кук ЕХ ШЕ ХЕфКОМВ ІКТ УК АТАК ЕК НК ВБІК ІАЕ ВН КІ КВ КИ ЕЕ ЕВ ВОВКОМ КК КЕКВ ВЕУ ЕМ ВК КК АКТ КІМ КІК ТТ ОСИ Х КОЖ З ЖК тат мости НК КУКИ КК КВК КП КК МНК КК КТК НЕ ЕК ЖАННА КВК КУРОК ШЕ КЕРІВН КЕ и ЕК Е ВК КВТ ВКМ КВ КАК КК КЕ ЕК КВК

ЕЕ. ШЕ БУК КК тує КК КУМО МІК МУКУ ТЕМ УК УВУ ОХ ВИКО КАК ярі ЖК ДІ с ВВЕ ВІТАТИ АМІАК КУКА КВК ККУ МИ ДКЗ УКЕКИХ рок ЗУ ВЖБІ ЕКО МК КеМК КК КОХ ПЕКТИ Кн Ок кускеКККрнКи ет ртеретттеня ЧК ТОЖ КЕУААМАКЦУКЦ МУ КИМ ІДЕ КИ МУК МЕККА ВИМИ УВІМК ВОК У сеї ЖЕ ХеХМеКУЮЄВХ ВУУ ЖУК У КУ МК Ма дн КОХ вн нн и ен нн сежїях ІФ УЖЕКЕсНН УВІ Ким Е КЕ КК ІНК Е ЕТО КМИН МК ВІВ КУА УКЕ. ЖЖ ТЕКІКІ ЗВИК ККУ КОКО КК У КК КК КК ХМК КК КД К КИ КК ЕК КК дУЖІК. ЗБК КВК КО КАК МКК УК УК КУТ КНЕУ КК М КАК ТМ УТ ХМК КАЖУ умі Зх. ТІМКИВА КИ МЕЖА: МОМ ИК ХДАК К ТММ МУК КК КК ККУ ЕКО КК МКК Й «ДЕННЕ вро ЗБЕ КЕКВ ККУ КК ЖЕ мен УТ КН КК КВ КК ВЕНЬ В КК ПЕН В В ес Во ХХ МОЖ ВЕК ТО КОКО мир ВК ВК КК КІ КУ КЕКВ КК ДК, бЕхМКх ДЖ КеМЕ ТАМ АК КМ В ККВ ВВ КВК КУКИ КК КК и ХЕ ЕК КАК КК В ВЕР куки У В и КВН

Фіг. 1А

МЕЖ У в КН В М У ІЕЕ, о и и и В скуХКХ ЖК КВК ЕЕ КВК КТК КИЕВ КТК МКК КЕН УК КУКА ТАК КУ КУКИ жу ВК ОХ Ха МУМАККВукК и КО КМ КН ОВ ВК КК В ТК ВАН жк ВЕЖ Х СЕДЖ сежжжхю кіт тку тю жу КМ Я Ж ЖУКИ М ЖЖ, ААУ ТУ КОЖ ЖАН КУМ АКТ ТА ЖК МАКУХА КО КУЄ МК я КК уд МЕЖІ ЕХ ТЕТ КУКА КК В ОАЕ КВОТ ЕК КИ ВАК ПАНЕ ПВ КК ММ КК ВИ ОВК ЕВ В о ОК КО я КН в У Я ЖЕ ЖЖ ВИВИХ МЕККА КК КІ Ку Вих зу : І І ХЕ ЖУК ЖІ КЕР КК ВАМИ КІВІ АВК ОВК КК МАУ І М ВЕКИ КК В ЕК и ОВТ ЕЕ ЖОХ КУЗЕКИ ВКМ ОКУ КК КК КТК КК ВИК КК КН КЕ КК ЕК ВЕЖ ШОЕ КЕКЕОЕККУМВаВМ МКМ МКК АВК МК УКВ КВ УВА ТЕ ЗІКА ЖИ УКВ ТНК ЛКК КУКА КК МЛК КИ Ж ІКТ ЖК КК УКХ я я ЕК ЖІ ЗУ я ЕП УЖ ЖК ню Ж жі дже ЖЖ КАКЕОККОК ОВ ВА КК КУКА КИ КК ОКУ ОК ІНК А КК ВВ КЗ ВН ОВК ВХ КкеїЖх ЖЕ МаКХАХВЬ ПА АККОКУ КМИНУ КИ ОПЕК ІА УК и УК КУ СН ЕаиК Ве ВОХ йІШХ БОКУ КУТ УНК и АКВА КУКА ВІ НМ І В МК ИІКІККУТВКККК шт Каши вза в кА м пи и в а м п р А пи р в Кк КЕ ШЕЖЕЖЖ ШО ДЕК К КВИТКУ МІК ТК ККУ ККУ КК КУ КУ ЖК КК ВВ КАК КК ВЖЕ ЗІяХ КХІМІВКУВ КЕНЕ ВМО: ЛЕЩД, жиди ніжкою жяктуюи шЕЖАКХ ді КЕН И МКК ува Е КкихіІшх дХЖЖ МЕМКММІМИККІИ КВК,

Фіг. 16 Ме шная х ОКУ ВК В ВИ НІВ КТК КК КЕ ВК КК КК В ВЕК М ЕК КК ВХ і жила З МЕТЕМООПУЕУКС КЕКВ КІШКА АК ЕМ КК КК КК КУКА КВ КТК АВК ТЕКУ кеша ї: МЕТВЕЦБППУКІВСЬНЕТК ОУН ВВ КМТ АКНЕ АМІАК ІЕМ АКВА ня ши А КИЖХ І ККАКЕУВАТ ТОВ СКОУАВК КОКО КК ОК КК АК КВ И КК КВК КЕ КИ КК ВКА КИМ ЯКІ Іф ЕОВИУМИ В КЕКВ КК КЕ УТ КК ВУ КОТ КК ВОВКА МВ І М КК щих ЗІ КЕОДЕИКК ВИКЛИКИ КЕ КТ КК УК ВУ КУ МОВАМ МАК УКВ шк хх ДВХ МІЖ ВККІ ВОК АМКУ КВК КРИК ЕК КУ СУ КВ ИКАЕ КВУ КК ЕК КАМ КАК ЖЕЖХИ: ОР КВК ОМВК УК І КУМ В КЕКВ КТ ВЕК КН ВХ СІМКИ ЗІ КУКСИ КМ КІМН КИМ УВК КЕ УК ВВ КК МІЖ ЖЕ УМА ВАМИ ЕКО ТУКА ККУ ТКА КК ОККО ТКУ МІК ТЩХ ЖУК КИ ВІККА УМіКУУіКККТІЯКОООИХВКККУ СМК ТІХ ВУ Іх ЗИ МІН ХрОМусКВ ВІВ ик у КЕН КАТА КН ЕКО ВИК УК. ШИ КІХе ОК ВОКЕР ЕК КК ВЕК КТКИКК ВН КИЕВ КЕКВ ВЕК У ККУ. ВЖК ЗА КУКИ МКК КАК ККУ УМІВ КУХОНЬ ВЖК ХО МОКЕЖОУМИ ЕМВ КУКА А ВЕК КЕ ТЕ КК ЕКО КМ ВЕ И ВК ВН у » но ДИКІ Ух пон нн нн кн екю вхо ХА ІК РМКЦКО ХУ КВК ВЕК у ВМ КЕ ик КІМ МЕККА УК МО КК МО КВК ВТК КК ЗБ МІМІКИ В А КМУ МКК ЕК К КТ АИТ ККУ КК КККК КХ ККОК УК МКК ВЕЖІ лк ЗяЖХ МКК ХКЕМІН КУКА КОВі ВАК КАК МІК и КК ОКХ КК КК КК ВЕ ЗХ ДЕК ОК КВ КВ ТК ВН КК и ВК К КК МІК МИХ К Я УТА КАК КИ КК УК КВК щ са податко вав іннова З ВК, ККАЛ КИЛИМ, ЖЕСВБІК "МУ МеЕУЛЕКИУИ ММА КАК ТКУ ТАКЕ КУ КОМИ А У КО УК КК ЕКЕ ВОК АВК МІД в в ЖІДЖАЖХ МЕ КУМ ККУ І КВК КК КК КК УА ЕК КІ КУ АК ВЕ КК КК ВЕ ЖІШЖНІЖУХ Б МЕОКККУ НИКА АК УК УК КОКО КИ КК ОК КІН ЕКО ВЕ КЕНЕ «вккАВ. О5І ВЕУЖККММУККИКИ ІМТ и КОВКИ ЕКО ВКМ МКК ВКМ КУТОК Ха МУ ВКЖНОККН КАК ВНУКИ ВИК КК ОК КВК КЕКВ НО КК ОК ЕКО ВЕЕеВКЕ За еко кХОККИМаК КИ ВУ КИМ ОК КЕ КН МК КУМ КК В КК ТАК КО КУ БФ ОКУ ИКМОКК МОВ МТ ие ОКУ КИВ ВУ КВК ОНЕУ ЕК -

Фіг. А

ЕЕ пі мук кКку ЦВК кЕ МК ІК КК КЕКВ Е КАК КАРЕ ВМО ВКККК УКВ ЖУКХ ЕІ ПУСЕЖОУУ ТИВИ КЕ МКК ТІК КК ТК КАК ЕК ЕК ВІЛ Х ЦІ МУМЖКЕУХМ ЕТИКА КЕ УВУ ВК КК ЕК КУ КАК КК ЕК УКВ КАК В КК А СХ джу Змі шеКкМиКи Мі Е лих УВУ КАМ КАКККУКУК ЦК МК ВКМ ВЕЖ ЦМХ ШВІВ КК ВВ КЕНЕ УНК УКХ ККУ КК КВК ВВ МКК ВАВ и КВК ЕКО ВИК ВЖК ЕХ. ЩО КАВОВЕ ВВА К и В КИ КІНА ВИМ АК УКВ ОКАКЕККЕ МКМ АВК КЕ ЕЖ ВК КОМА КМ КК КТК ММ ЕК АК КЕ КА ЖЕК ОК КИ КЕКВ КВК КВК КУН ИККХ ВЕЛЖ ЯК УЗ КВУ я КК ВТ КК КК ЕК КА В ЗК Ко ЕК ВІ НЕ СІКИВКИУК ВИ НИКИ КК КК КК НВ и УВК КК КВТ КК КИК ІКИК ОК КК Ки ЖЕНЕ ЗО ХИБМ КОМИ КІВ ТАКА ХА КЕКВ СКК ВУ В КА ЗКУ ККД ККУ І КОВО КУ НИК ОКУ МйщеїЕх ОН о А КК А В о и АУЯ вх жеїкх ХаК КЕКВ ЦК УЮ НАЕК КАК КМ КВК КИ КУМ ЕМ ОКА КО КК КВК пи: щох ЩО. КИАООУК УК А ККУ КК М УК КК КИ КК СКК ТОК КІ ХК КУ ЕЕ ККУ, ЖИВОВА Х ВТ ВЕК МУХ ЕСЕ ХХ КК АТУ КК КК ХІТ КУТИ КВ КК ЕМ ІК ЕМ У Л ХК К КИЕВ. мед кх ВУХ БЕХ ЕК МЕКСИКУ КК ОК КМ КАК ВК В ТНК ПЕКИ КУ АК. ЖУК ІН ЗАКО КУ КВ КУКА ТАНКИ МОВ НЕК КК Ки ВК Вин ВЕСНКАХ ТАМ ВХЖКОАЖУВУМОІМ ЕКО КК КК КВК АКТАХ КЕ ВХ. МЕККА ОМЖЖУ ІЩЕ КИХИКИМ ІНК Кр КК КК КЕ КК ВАЖКЕ АКО КОТУ КХКЕВАКИММИММАКККОКТКК КМЕ КК ЕК УК КАХ КАККК МЕ ККУ ІЩЕ ККУ ІА ВИК МЕ ТКУ ЕК Ещ ІВ ВІЯ В ВЕК М ЕК ІК ВК КОВКИ КУ ВОК ВК КМТ ВИК: БО З Ом жЕ х ВІВ УВ НАВ ОКІКМІЕ М А КІ КМКККИМІ МЕМ ОНи ВЕ ЕВ ОКХВ МО Е МЕ. КО ІВ ІІ Ж МЕНЕ УКВ ММК КОМАМИ КН КК ЕЕ НЕК У ЗК КБ ХЕ З МЕХМО МУК НЕК МКК КУ В КВК Ка ВК ЕК МКУ ВК ВК: ЩЕ Ж ОБУ ї МЕМ ХМК КЕ МАТ Х ЕК І КМУ ВКООАЙ ЕІ ВОК КВК ОВ БЕК А ТВО В ЖЕКи ММК ІК ЕІ КЕ ВВЕ МЕ КИМ АК ЖЖАМ КВ ШОВ І ех КВК КВК У МКМ МИ МКМ А КН ВХ: БЕХ КИ ЩІ МЕККА ОКЕАНИ АКА ВМКУКУКЕ ТК КОКЕКАТ МИХ А, ЗЕ КК КОХ Х ОКО І ТЕКА ТІВ НЕ ГОМ ОК КВК ВКМ АВ ВЕ ВАХ ЖЕ Ж ОХ ВА КІВІ ВВІВ УМ КК КАСКО КУ ВОВНУ ВИК яв тю маних ЩЕ БОКОВІ ККВКМ КК ОМ Ки КЕ ВВА УЧИ БЕЩ ЛЕМ ИХ й ВАК ЕТКУКВ ОВО ВКМ АВК ЕМО ЕКАКХ МУ ІК ОКХ МЕ ЕМО МОНА А КК КМИН ККУ ВМО КИ КУКА ВЕК с ЩІ БІО ТКАНІ НК КК КВК ЕВ КК КК КАТКИ ЖК Же МУКУ І МАМО ІЬКИВИМ КОКОН КИМ ВИТКУ МАК ЕК Е КО КМ БО ЖВОНИХОЕ ЖЕО ОКА О НІВ КІННІ КК КАК ІК КТК УКВ ЩІ ХВ ОКХ. ХЕ ЕКОН ТОМ КМ КОКО АЕН ЕЕ ОШВ о щХ Б МЕККА КУКИ ТЕНи ОККО КЕ М ЗМОЖУ М ША ВУККМОКОВУК КМ ІОВ ВЕВМИ ВО УК МКК Ки КИ КЕ ше В МІЯ ІБЖ ДЕНО МОВИК КЕН ММС ВК ТОК КК УА КАК УК МЕМ пт В: ХВ ІІ ОФАБИНИЯБЕВОКУК ие КІВІ КЕКВ КЕН МІУ ККУ КК ЕЕ щем шия ТВ БЕБІ МУХКІСТКО КЕКВ АТМ ВИН ВК ТММ З фі: ха ВБЖВІУКІТХВ КМИНОМ Ви ВН и и КК х шЕЩИ ХМмОМОКХА ях КрНОВІКІУХКІТЕКМКНИ ХЕ ЕК ВУ УМОВІ Ко КЕ КОКОН ВК ЕМ Ед В мо: ХХ ТВ ЖБК ОКО КВК КОМУ МВТ ВИК УХ ТК ММ ВН Ки ТОВ ск ж ак с. а ЗВ, ше жи Я Ух Я УЖ Ми ВУЖ ЗА о. же же х ях. ж хх Яка ЖЖ Б МеВ Зх ВКВОУВ КУБИКИ МКК ОВК ВЕТО КВК КОХ В ІВ ВО, ТЯ КЕНЕ ВТХКІКІККВВ ЕК ХХ ТВ ВК оВНА ХК КК МУ ВН ВО КУ М БО ЕХ да ТКВУКІКУ УКВ КОКО ОВК КК ОКУ КЕКВ

Фіг. ЗА

ІГ.

ЕМО ЖИ Я ДМ МЖК УККаВ ТУ ВРУ ТК ВОВИХ В В ВИКО ІОВ КВК ВБФ А ВУХ КА МЖІБКККЖООВВ ОТТО ЕКО УК КВ ж ТОЖ Іі нІвжКиУкІа тик іТЕ ВИКОН Т КО ВТ ВВЕ ОВУ МВ БЕК БЕ ж ХЕ МШУЖКМОТЮК АКТИВИ МОВНЕ АСК ВІКО КУ ВК ВЕ вк хх ОВО ха ЯКІ ВІККА АК МКІТМаТТВВКВІУК МВВ КЕКВ ВК В ЗЕМ ЖИМ Ма: ЗХ БІБКУСТХТММТЕЕ ТЕ ВМО КК МеВ КК ВЕ ОМ ОЖНОВ КІ ВІБКВОЕТА МКК УНК ОАЕ НОВА ЗБЕ е ов пУВОТЬНОМ МБ БК ЖЖОЗ Ж ВОСКОВИМ КК КВК. дО ХМ МНК КУСОК КК ЗК о В ВК ЕК о НК ВК КЕ сво ож ВЕБ ЕХ ЖИМ ЯК. ІЕЕ КОХМКвІМКи КВЕСТ ОККО дя З Ве ЗХ ВК ККОЄ ВВЕ ВВЕ ТЕ ЕК Ж ОКУ ВЕН ВК КИ КТК КІ ОКУ ГЕ ВЕН ММ КОКО ХВ ВІ Ве МОМ А НКИ КЕ УНК ЕК ЕЕ НЕО ТК ЖЖ ТНЕУ. КОВЛКВКВ В ВК У В КВУ ВОК ВЕ КК ВЕН КО ВО ВУ МОВО МВ Я ОЕМУКК ВУХ В КВ НК КВК КВК КН ВЕК КВ УТ КЕ ЕКО КН ЗБФОМУ ВУ ДНІ ЕКО ВК ВИК КУКА ВКМ КВК Ка Хе ов ВІ КУН КК ОККО МІ КК КК КК КАК ща ЩОКА ЖАХ кет Е АЕН Кук ВХ ВК КЕН ЕК КК де ХХ ФВ ОЕМ М На иКІКККов иа ВЕ те вок ДК ЖОМУ К АК НК ККУ КМ ВЕ В МК ВЕК ВО Ж ВоИХ ЯВЖ ФЕКОКЕХ КОКО ЕЕ ОА КВУ Я ВК ОК КК НК ТК КК КВК КВ БЕМОЩА Ме УЗ В А КК В Я а УК КЕ КВ ЩЕ Ще ВХ ЗБЕ ЗАБЕРЕ ВУЛИК МКК ВМ УА КВН КАВОВУ ЗЕ ЛК КОМ В КЕКЖК ЖЕРТВ ТЕ МКК ВЕ ЕТ КАН ВК ВЕ КІ КОХ КК ВЕ ЯМ ЗО ЗБЕ ШЕУ КК У ТКА ВК НКИ МК КАК КК МКК АНА КН ВЕН КО КК Вк Хм ОВУ ЕЕ ЕК МТЕ КК КАК КК ТК хомут ВЕСТ МО: КА ХОКТЕЖЕККУК АК КВККМК КОБУ КЕ КВТ КК хоть тжхіу яхк я ик МК ХМ ВЕК. ММК АБЕТКА МВВ ЕЕ КУ АВ ТЕ тт и тут ня ххх ик ЖК ЖІ Ж ли Дня м МЕЗО КОЖ ЩІ ЖЕКУКВТВАА ТВО ТК БУКВ ст коки КА ЖЖ М Ком Жюля ха ук кк ія

Фіг. ЗЕ БО ЖО ЖК ЗЕ МКБООМОКИ ОККО МКК ОК ПЕКИ зве тип МО: оон п а ОК Фліт км телт АНА тя МІК Ж АВ ЖК Ж КОЖ МКС ЖИ АТАК рн ПТК Ох тя ження ТШХ Жук юс же. зЗжЕ ЖЕ Ва ФК замку ю хе Хо жюх ко ЖЖ ЖК УЖ КОЖ Ж ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖК Ж КК В жі танні ин який М МО МЕКОВКУН ЗЕ ЗБК КОСЕНКА жо же Вт МКК ие доня Др ЮК як ЖЖ ИН ЖІ КК ЖК ин ЕІ яння ЖІ ЖЖ яи жі т ді ох Ко же МО: АК вт ІК ЖІ ЖЖ Ж пи Ж ЕХ ТІК т ЖІ ЖИ ил ИМЯ ВТ ТИХ ОНИ ТТ АТХ АЛЬ КАХ ЛИХ КАХ ДЮ ТВ ЛИ ПАК ЮК ке В ВИХ ЕК В М и М а В ВИК КУ ШО Же ОХ ОБ ними жк жк же лиття попи ЖЖ КУ ТИ КК КТК КК, ЖИ АЛ КСАА Ж Ті КСВ ЖОВ КА ЖК ЖІ ЖІН Ж ЖЕН КА МИ ЖК КК КАК Кон тедеїжею сх ЕЕ ХК ше ея ВИЖЩ сить лили лиля м хек АЛЕ МИТИ ДК КАК АЖ ІК ДИ АКТА Ж у ля КИ УААН мкА КК УДК УМ по УДК ЖК Кох я тож Зо ТЕО: ФЕКЕЮЮ сипиитилити линии ЛЕТИ ТИ КТ ПТК я Тож юс пн Ж о ЖЖ А ЖИ Може Ж ож ню і жу кт яти яке ХЕ Ж КУХ ЗК КМИН КВ ГК В ОК КК КТ КА ЕВ ВИК КК ВК Ви Жах ВХ ККУ Кн НЕ ж км Б ВХ ЩЕ спе кінні пря ік жи можиююі же пряним Ж Ж ЖІ аж І ІК ЖІ Жжт нЖЖ еко Ж ЖЖ жужх КУЖУ жи т диких дк. ЩЕ ЩЕ ВК В ШИШЮЖ сля кн кюте жк юн я ПЛ ДІ ЖЖ ЖИ АЖ КИТИ МИЛІ ЖК КАТКИ Ж КИ Ж АЮ КАЛИТА КАЛ ДК ВК КА до Те КВК ил ЛАТ, Ж ВОВИХ За БЕК ЕКЕ МКМ МО НАСК В ЕЕ НІ КЕКВ КО НАВ КК ВК ТКУ Б ЗВ Кн З ВУЖ хни М МД МЖК ЛИ Ж КК АЖ ЖК ж ЖЖ ЖЖ КК ЖЖ Ж ЖЖ ЖЖ Ж ЖЖ ко кужн жуть хіх ках ум ща: ІД споєесттрит и У КИ АЛ КИ АТИЖ АК КК дк ТИ ТК ПО ТТ нт ПЕ Етно тидя скнхто В за ОК БУДЕ жовтки нав лити ла Жити и Пл ЛИП ЖК ККУ ЖИ ХВ ЛА ЛАДА КИ ІЛИК М МУ ЖЖ ДИ КК ЖАХ КИ КИ КК КИ МК ті КАЛ МАХ КК АКА КВ

Фіг. Я

ВЕКЗ- НК ХХ МЕ еВ ККУ МЕ ВК МЕН КК ОВ КЕ В У ВВ В ВУ ЕВ Е В, ВВ КВ В В КВН КЕНЕ ЗЕ ЖК КВ ФК спо теми хок АТАК Ж ЖИ М УКХ Ж ЖУАН АХ ЖАМКІАТЖ КИ ЖК УАД УСОКНЖ КОЖ Ж Ж КОЖ тк юю мжнж ні кю нж жу житя тя КТК КК КАК ких, хх НК Ж жи и М в а а и жо Ве ва: кн нн и о и и в п о ХЕ З мя ев ЕН и в п а о М А МЕ Томати ФЕН мхкжюю ди я тю ую тю ЖЖ УА ХК ДІДИ КК ЖАХ ХХ ДЖІКНКО АХ АУД АКТА КІ ЖД ККУ ДУМОК М УТ КУ МОЖ М АД УК Ж Ж ката дк лютих ки ОЗ МІХ Фр теж уд ию тки ж жк аск кн зд АТР А Є КК ЖУКИ УЖ ТК ОУН УК ЖЖ УК КТК юю к тітки жк жикя ЗЕЗ ше ХВ ФМ сюжетну кет жжютю юю тітки тиху нику Ж ж ЖЕК ЖЖ ет Жедятяяуж ЖЖ Ж ня КК КЖх Ж ЖИТА Ця Таж ки же ж ку тити миття, пЕшШ ОБ них ФК лому тт зе екв ж тю пек кад М М Жив ТКЙ Все М Ж ОККО Кт ЗТ УЖ ЯКО В РУХ дю Же Ат ск ЖК ит окктежтх ВЕК оВиКХ ЗКЖЕ ПОВ К КВК КЕ КЕ ув МЕ ка ща Ей ДК «житя М долях жк А КАЖУ У Ж ЖУК МИ КМ Ж МУ ТИ У жи же же жу кВ Хе ех ЩЕДУ схе отже юю ую мує ому хх ХУч кох Жид кх уко ОС жу ху мк кох кЕ 5 М: ХЕ ХЕ а ЖЕ З ЗК ЯКЕ секжежутттт у мм у ку ую у юю жу тю мують ЖАВ вони 858 джек: ту ж жк ю ик ТІ ки ку ЖИ КЕН ке как жк ше шек де Щодня тях ян ЩЕ ЖЕ МИХ ДІДА; сподсятненелию тю за отуаете т Де поле ДА ле т Кия Кей КТК пк тити Ко овеяте