UA125585C2 - Анти-il-22r-антитіла - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується антитіла або його антигензв’язувального фрагмента, що зв'язується з IL-22R людини, де антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить комбінацію послідовностей CDR варіабельної області важкого ланцюга: HCDR3, що містить SEQ ID NO: 6; HCDR2, що містить SEQ ID NO: 36; і HCDR1, що містить SEQ ID NO: 34; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить комбінацію послідовностей CDR варіабельної області легкого ланцюга: LCDR3, що містить SEQ ID NO: 54; LCDR2, що містить SEQ ID NO: 47; і LCDR1, що містить SEQ ID NO: 16. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент, і способу лікування псоріазу, псоріатичного артриту або атопічного дерматиту.

Description

Галузь техніки, до якої належить винахід

Даний винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з цитокіновим рецептором І/-22К, зокрема 1//-22К людини. Анти-ІІ-22В-антитіла «|і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом мають відмітні властивості, зокрема відмітні комбінації властивостей, у порівнянні з анти-ІЇ -22В-антитілами, описаними в попередньому рівні техніки.

Рівень техніки

І/-22К (також відомий як 1 -2221 і І--22КА) є цитокіновим рецептором типу ІЇ, вибірково експресованим у шкірі і епітеліальних клітинах. Даний рецептор опосередковує передачу сигналів через три цитокіни: інтерлейкін-22 (ІІ-22), інтерлейкін-20 (І--20) і інтерлейкін-24 (ІІ -24).

Для цитокінового сигнального шляху через 1ІЇ/-22К потрібне утворення гетеродимерних комплексів на поверхні клітини. Як показано на Фіг. 1, 1-22 зв'язується з і здійснює передачу сигналів через комплекс, що складається з ІІ -22К і 1П-1ОКВД (також відомий як І-10К2), тоді як

І/-20 ї 1-24 зв'язуються з і здійснюють передачу сигналів через гетеродимерний комплекс, що складається з 1-22 і 1 -20В (також відомий як ІІ -20Н82).

Інтерлейкін-22 представляє цитокін, експресований імунними клітинами, зокрема активованими дендритними клітинами і Т-клітинами. Після продукування клітинами імунної системи 1-22 проявляє свої біологічні ефекти за допомогою зв'язування з ЇЇ -22К і активації І- 22К. на епітеліальних клітинах. Активація комплексу І/-228-І/-10К8 нижче зв'язування 1-22 приводить до прозапальних реакцій відповіді, індукції антимікробних білків, які мають ключове значення для захисту хазяїна від бактеріальних патогенів, і захисних ефектів у деяких органах, таких як легені і печінка. І/-22 також бере участь у патології захворювань, зокрема у розвитку запальних захворювань, таких як псоріаз, псоріатичний артрит і атопічний дерматит (Ма еї аї.,

У. Сііп. Іпмеві., 118:597-607 (2008), Мап Веїе еї аї., 9. Іттипої., Уап. 1, 188(1):462-9 (2012), Забваї еї а!., Маї. Нем. Огид Оівсом., 13(1): 21-38 (2014)).

Була визначена кристалічна структура 11-22 у комплексі з позаклітинним доменом І/-22Е, і вона дала важливу інформацію про те, як цей ліганд зв'язується зі своїм рецептором (допез еї аі,, Бігисійге, 16(9):1333-1344 (2008)). Позаклітинна область ІЇ-22К включає два домени фібронектину типу І (ЕВМІ!) (01 ї 02), орієнтовані один до одного приблизно під прямими

Зо кутами. П'ять петель, розташованих на границі поділу цих доменів, у першу чергу відповідальні за залучення залишків 1-22 у комплекс ліганд-рецептор. Залишки 1-22, які додають внесок у зв'язування рецептора, кластеризуються у двох сайтах у ліганді, сайті Та і сайті 165. Знання ключових залишків, забезпечених як рецептором, так і лігандом, забезпечило способи, за допомогою яких ця взаємодія може бути порушена для відміни сигнального шляху 1-22 для застосування як терапевтичної стратегії.

Інтерлейкін-20 і інтерлейкін-24 експресуються моноцитами і кератиноцитами, і аналогічно

І/-22, було встановлено, що ці цитокіни відіграють роль у гомеостазі і розвитку патології шкіри.

З урахуванням цього випливає, що стратегії інгібування або пригнічення передачі сигналів у напрямку 5-3" ІЇ-22Е блокуванням зв'язування лігандів, які активують цей рецептор, можуть мати терапевтичну застосовність, зокрема, у лікуванні шкірних захворювань, таких як псоріаз і атопічний дерматит.

Були розроблені антитіла, які зв'язуються з ІІ -22К і блокують взаємодію між 1-22 і 1--228.

Наприклад, в УМО 2011/061119 описується гуманізоване анти-ІІ-22В-антитіло, одержане з мишачого антилюдського моноклонального антитіла, початково описаного в МО 2006/047249.

Було показано, що це гуманізоване антитіло, яке в даному описі буде належати до "280.346.Т157У", інгібує сигнальний шлях за участю 1-22 через І--22БЕА в аналізі проліферації клітин і пригнічує індуковане 1-23 запалення вуха на мишачій моделі псоріазу.

Суть винаходу

Даний винахід поліпшує рівень техніки забезпеченням антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з цитокіновим рецептором 1ІЇ/-22К і проявляють властивості, які відрізняються від властивостей анти-іЇ-22В-антитіл, описаних в попередньому рівні техніки.

Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, як правило, проявляють комбінації властивостей, які є відмітними і у деяких випадках перевершують властивості відомих анти-ІЇ -22В-антитіл, зокрема гуманізованого анти-ІЇ -22В-антитіла, описаного в

МО 02011/01119. Властивості цих антитіл можуть бути особливо переважними відносно застосування в лікуванні людини, зокрема для лікування таких патологічних станів як псоріаз, псоріатичний артрит і атопічний дерматит.

У першому аспекті даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з людським ІЇ/-22Е, де антитіло або його антигензв'язувальний бо фрагмент зв'язується з епітопом у білку І -22Е, який не містить Тугбо.

У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти мають одну або більше додаткових властивостей, вибраних з наступного: (ї) здатність зв'язуватися з епітопом І--22К людини, розташованим щонайменше частково в домені 02 білка ІІ -228; (і) здатність зв'язуватися з ІЇ-22К. людини з високою афінністю; (ії) здатність блокувати зв'язування ІІ -22 з І. -22К людини; (ім) здатність інгібувати ІЇ-22-залежну активацію ІІ -228; (м) здатність інгібувати Ії -20-залежну активацію ІІ -228; (мі) здатність інгібувати ІІ -22- і І -20-залежну активацію ІІ -22К; і (мії) відсутність перехресної реактивності з мишачим 1 -228.

Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть проявляти високу гомологію з антитілами людини, як у даному описі визначено в інших місцях. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти включають варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де області МН і/або МІ. або одна або більше ділянок, що визначають комплементарність (СОК), походять від тваринного сімейства верблюдячих, тобто походять від верблюда. Антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, які мають високу гомологію з людиною або мають щонайменше одну послідовність СОК, області

МН і/або Мі, одержану від верблюда, можуть бути гуманізованими варіантами або варіантами зародкового типу областей МН або Мі зі звичайних верблюдячих антитіл, де терміни "гуманізований варіант" і "варіант зародкового типу" визначені в даному описі в інших місцях.

У необмежувальних варіантах здійснення винахід забезпечує наступні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які визначаються за допомогою посилання на конкретні структурні характеристики, тобто зазначені амінокислотні послідовності СОК (одна або більше послідовностей 5ЗЕО ІЮ МО:2, 4, 6, 9, 11, 13, 34, 36, 41, 43 (СОК важкого ланцюга) або 5ЕО ІЮ

МО:16, 18, 20, 23, 25, 27, 47, 54, 57, 59 (СОМ легкого ланцюга)) або повні варіабельні області (одна або більше послідовностей 5ЕО ІЮ МО:29, 31, 63, 65 (варіабельні області важкого ланцюга) або ЗЕО ІЮ МО:30, 32, 62, 64, 66 (варіабельні області легкого ланцюга)). Усі ці антитіла зв'язуються з цитокіновим рецептором 1 -22К людини.

У конкретних варіантах здійснення антитіла, визначені наступними структурними характеристиками, можуть проявляти високу гомологію з антитілами людини, як у даному описі визначено. Антитіла можуть бути моноклональними антитілами, одержаними рекомбінантними способами. СОК наступних анти-ІЇ-22В-антитіл можуть бути одержані від верблюда, тобто одержані зі звичайних антитіл, продукованих у відповідь на імунізацію верблюдів (зокрема, лами). Винахід також забезпечує гуманізовані варіанти або варіанти зародкової лінії людини, афінні варіанти і варіанти, що містять консервативні амінокислотні заміни, як у даному описі визначено.

Варіанти здійснення анти-ІЇ-22Н-антитіл за винаходом тепер додатково описуються з посиланням на структурні характеристики.

В одному варіанті здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором ІЇ-22Е, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить

СОКЗ важкого ланцюга, вибрану з:

ЗЕО ІЮ МО:6 (МОЕЗСТУУЗЕЗІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:13 |РРОРЕКАНУМОМКУ| або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:43 |РРОРЕКАНУМСАКУ | або її варіанта послідовності, де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Варіабельна область важкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувального фрагмента може альтернативно або додатково містити СОК2 важкого ланцюга, вибрану з:

ЗЕО ІЮ МО :4 |ІЗІММОО5МТАУЗОЗМКО| або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:11 ІСІНІЗОСІТУМІ О5МУКОІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:36 |(ЗІММОАЗМТАУЗОЗМКО) або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:41 ІСІНІЗОСІТУУТОЗМКО) або її варіанта послідовності, де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Варіабельна область важкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувального фрагмента може альтернативно або додатково містити СОК1 важкого ланцюга, вибрану з:

ЗЕО ІЮ МО:2 |ІЗМОМЗ5І або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:9 |ІЗМЕМЗ5І або її варіанта послідовності, 60 ЗЕО ІЮ МО:34 |(ІЗМОММІ або її варіанта послідовності,

де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Альтернативно або додатково антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з цитокіновим рецептором ІЇ/-22К, можуть містити варіабельну область легкого ланцюга (М), що містить СОКЗ легкого ланцюга, вибрану з:

ЗЕО І МО:20 (О505555АМАМ І або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:27 |АЗУКІ МАВБУМІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:54 (95055555МАМІ або її варіанта послідовності, де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Варіабельна область легкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувального фрагмента може альтернативно або додатково містити СОК2 легкого ланцюга, вибрану з:

ЗЕО ІЮ МО:18 (МММЕКРБІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:25 |КММТК55)І або її варіанта послідовності,

ЗЕО ІЮ МО:47 |СОММЕРЗІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО Ір МО:59 (ЕММКЕ55) або її варіанта послідовності, де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Варіабельна область легкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувального фрагмента може альтернативно або додатково містити СОК1 легкого ланцюга, вибрану з:

ЗЕО ІЮ МО:16 (ОООУУАНІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО Ір МО:23 |(ГТОТЗКОІСОУМУМІ або її варіанта послідовності,

ЗЕО Ір МО:57 |(ГОТЗ5ОІОЗУМУМЗІ або її варіанта послідовності, де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

У деяких варіантах здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором 1//-228, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент включає комбінацію СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (НСОКЗ), СОК2 варіабельної області важкого ланцюга (НСОК2) і СОКІ1 варіабельної

Зо області важкого ланцюга (НСОКТІ), де комбінація вибрана із групи, що включає: () НСОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО:6; НСОК2, що містить ЗЕЕО ІЮ МО:36; НСОКІ, що містить

ЗЕО ІЮ МО:За4; (ї) НСОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:43; НСОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО:41; НОСОК, що містить

ЗЕО ІЮ МО:9; (ії НСОРЗ, що містить 5ЗЕО ІЮ МО:6; НСОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:4; НСОНМІ, що містить

ЗЕО ІЮ МО:2; і (м) НСОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО:13; НСОК2, що містить ЗБЕО ІЮ МО:11; НСОКІ1, що містить БЕО ІЮ МО:9.

Альтернативно або додатково, антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з цитокіновим рецептором ІЇ/-22К, можуть містити комбінацію СОМКЗ (І СОКЗ) варіабельної області легкого ланцюга, СОК2 варіабельної області легкого ланцюга (СО) і

СОК'І варіабельної області легкого ланцюга (СОМ), вибраних з групи, що включає: () СОМ, що містить ЗЕО ІЮ МО:54; | СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО:47; СОМ, що містить

ЗЕО ІЮ МО:16; (ії) ССОМКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:27; ГСОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО:59; І СОКІ, що містить

ЗЕО І МО:57; (і) ГСОРЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО:20; І СОМ2, що містить 5ЗЕО ІЮ МО:47; І СОКІ1, що містить

ЗЕО ІЮ МО:16; (мМ) ГСОмЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:20; СОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:18; І СОКІ, що містить

ЗЕО ІЮ МО:16; і (м ГСОМЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:27; І СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО:25; І СОКІ, що містить

ЗЕО ІЮ МО:23.

У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з цитокіновим рецептором ІЇ/-22ФК, де антитіла або антигензв'язувальні фрагменти містять комбінацію СОКЗ (НСОКЗ) варіабельної області важкого ланцюга, СОМК2 варіабельної області важкого ланцюга (НСОК2) і СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга (НСОМК1), СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (І СОК3), СОМК2 варіабельної області легкого ланцюга (СОК2) і СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга (СОН) відповідно до варіантів здійснення, описаних нижче. бо В одному варіанті здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором І--22К і містить комбінацію послідовностей

СО МН і МІ: НСОКЗ, що містить ЗЕО І МО:6; НСОК2, що містить БЕО ІЮ МО:36; НСОКІ, що містить БЕО ІЮ МО:34; І СОМКЗ, що містить зЕО ІЮО МО:54; |! СОК2, що містить БЕО ІЮ МОС47; і СОН, що містить ЗЕО ІЮ МО:16.

В одному варіанті здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором 1І--22К і містить комбінацію послідовностей

СО МН ії М: НСОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:43; НСОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:41; НСОК'І, що містить БЕО ІЮ МО:9; І СОКЗ, що містить БЕО І МО:27; СОК2, що містить зЕО ІЮ МО:59; і СОН, що містить ЗЕО ІЮ МО:57.

В одному варіанті здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором І--22К і містить комбінацію послідовностей

СОК МН ї М: НСОКЗ, що містить БЗЕО ІЮ МО:6; НСОК2, що містить БЕО ІЮ МО:4; НСОКІ, що містить БЕО ІЮ МО:2; І! СОКЗ, що містить БЕО І МО:20; ГСОК2, що містить зЕО ІЮ МО:47; і СОН, що містить ЗЕО ІЮ МО:16.

В одному варіанті здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором 1І--22К і містить комбінацію послідовностей

СОК МН ї М: НСОКЗ, що містить БЗЕО ІЮ МО:6; НСОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:4; НСОКІ1, що містить БЕО ІЮ МО:2; І! СОКЗ, що містить БЕО І МО:20; ГСОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:18; і СОН, що містить 5ЕО ІЮ МО:16.

В одному варіанті здійснення забезпечується антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з цитокіновим рецептором І--22К і містить комбінацію послідовностей

СО МН їі М: НСОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:13; НСОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:11; НСОК'І, що містить БЕО ІЮ МО:9; І СОКЗ, що містить БЕО І МО:27; СОК2, що містить зЕО ІЮ МО:25; і СОН, що містить ЗЕО ІЮ МО:23.

У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з цитокіновим рецептором 1-22, де антитіла або антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну область важкого ланцюга (МН), вибрану з наступного: (ї) МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності БЕО ІЮ МО:29 або 31,

Зо (і) афінного варіанта або варіанта зародкової лінії людини УН, що містить або складається з амінокислотної послідовності БЕО ІЮ МО:29 або 31; або (ії) МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності, яка має щонайменше 80 956,, щонайменше 85 95,, щонайменше 90 95,, щонайменше 95 95,, щонайменше 97 95, , щонайменше 98 95, , щонайменше 99 95, ідентичність з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ

МО:29 або 31.

Альтернативно або додатково, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну область легкого ланцюга (МІ), вибрану з наступного: (ї) М, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:З30, 32 або 62, (і) афінного варіанта або варіанта зародкової лінії людини УН, що містить або складається з амінокислотної послідовності БЕО ІЮ МО:30, 32 або 62; або (ії) Мі, що містить або складається з амінокислотної послідовності, яка має щонайменше 80 956,, щонайменше 85 95,, щонайменше 90 95,, щонайменше 95 95,, щонайменше 97 95, , щонайменше 98 95, , щонайменше 99 95, ідентичність з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ

МО:30, 32 або 62.

Для варіантів здійснення, де області антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною відсотковою ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, області МН і/або Мі можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки в каркасних областях.

У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом можуть включати домен СНІ, шарнірну область, домен СН2І2 і домен СНЗ людського антитіла, зокрема людського Ідс1, Ідса2,

ІЧОЗ або Ідсаі.

Особливо переважні антитіла за даним винаходом описані нижче. 23009 і антитіла, зв'язані з ним

У деяких варіантах здійснення забезпечується виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з ІЇ -22К, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга, де: послідовність СОМКЗ варіабельної області важкого ланцюга представляє ЗЕО ІЮ МО:6

ЇМОЕРЗОТУУЗЕЗІ або її варіант послідовності; послідовність СОК2 варіабельної області важкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:36 бо ІЗІМУМОАЗМТАУЗОЗУКОІ або її варіант послідовності; і послідовність СОКІ варіабельної області важкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:34

ІЗУОММІ або її варіант послідовності, і де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може додатково містити варіабельну область легкого ланцюга, де: послідовність СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:54 (О5ЗО5ЗЗЗ5МАМ)І або її варіант послідовності; послідовність СОК2 варіабельної області легкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:47

ІСОММЕРЗІ або її варіант послідовності; і послідовність СОКІ варіабельної області легкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:16

ІОСОУТАНІ або її варіант послідовності, і де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

У деяких варіантах здійснення забезпечується виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з ІІ -22Е, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга, де: послідовність СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга містить або складається з ЗЕО

ІО МО:6 (МО ЕБаТУУ5ЕБІ; послідовність СОК2 варіабельної області важкого ланцюга містить або складається з ЗЕО

ІО МО:36 |(ЗІММОАЗМТАУЗОБУКИІ; послідовність СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга містить або складається з ЗЕО

ІО МО:34 |(ЗМОММІ; послідовність СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга містить або складається з 5ЕО ІЮ

МО:54 (050455554АМ)І; послідовність СОК2 варіабельної області легкого ланцюга містить або складається з ЗЕО ІЮ

МО:47 |СОММАКРБІ; і послідовність СОМКІ1 варіабельної області легкого ланцюга містить або складається з 5ЕО ІЮ

МО:16 (баса мМ мАНІ.

Зо Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть включати варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:63, і необов'язково варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

МО:64. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, де варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність МН щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 9095, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 9995, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ

МО:63, і/або варіабельна область легкого ланцюга містить МІ щонайменше з 85 965, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 9595, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:64. Для варіантів здійснення, де області антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною відсотковою ідентичністю з еталонною послідовністю, області МН і/або МІ можуть зберігати ідентичні послідовності СОМ з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки в каркасних областях. У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельні області важкого ланцюга і/або варіабельні області легкого ланцюга, визначені як такі що мають конкретну відсоткову ідентичність з БЕО ІЮ МО:63 і 64, відповідно, будуть мати наступні послідовності СОК:

БО послідовність СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО І МО:6 (МОЕБатТУУ5ЕЗБІ; послідовність СОМК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:36 |(ЗІММОАЗМТАУЗОБУКОІ; послідовність СОМК1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:34 |(ЗМОММІ; послідовність СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:54 (050455555МАМІ; послідовність СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:47 |СОММЕРБІ; і 60 послідовність СОКІ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО І МО:16 (СИМ МАНІ.

Антитіла, які специфічно зв'язуються 3 1І/-22К, можуть містити щонайменше один повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну і/або щонайменше один повнорозмірний легкий ланцюг лямбда або каппа. У деяких варіантах здійснення антитіла включають важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕБО 10 МО:б/, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:68. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО:67, і/або легкий ланцюг щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 9595, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:68. Для варіантів здійснення, де ланцюги антитіл визначаються конкретною відсотковою ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки поза областями СОК. 22305 і антитіла, зв'язані з ним

У деяких варіантах здійснення забезпечується виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з ІЇ -22К, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга, де: послідовність СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:43

ІРРОРЕКАНУМСАКТУ)| або її варіант послідовності; послідовність СОК2 варіабельної області важкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:41

ІСІНІЗОСІТУУТО5МУКО) або її варіант послідовності; і послідовність СОМК1І варіабельної області важкого ланцюга представляє ЗЕО ІЮ МО:9

ІЗУЕРМЄ5І або її варіант послідовності, і де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

Зо Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може додатково містити варіабельну область легкого ланцюга, де: послідовність СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:27

ІА5УКІ МАБУМІ або її варіант послідовності; послідовність СОК2 варіабельної області легкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:59

ІЕММКЕ 55) або її варіант послідовності; і послідовність СОКІ варіабельної області легкого ланцюга представляє 5ЕО ІЮ МО:57

ІГоТ550І65УМУМ5 або її варіант послідовності, і де варіант послідовності включає одну, дві або три амінокислотні заміни (наприклад, консервативні заміни, гуманізуючі заміни або афінні варіанти) у зазначеній послідовності.

У деяких варіантах здійснення забезпечується виділене антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з ІІ -22Е, де зазначене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга, де: послідовність СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга містить або складається з ЗЕО

ІО МО:43 |РРаРЕКАНУМСАКТУ|; послідовність СОК2 варіабельної області важкого ланцюга містить або складається з ЗЕО

ІО МО:41 (ФІНІЗССІТ ММ ТОБУКИ; послідовність СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга містить або складається з ЗЕО

ІО МО:9 |ІЗМЕМ5І); послідовність СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга містить або складається з 5ЕО ІЮ

МО:27 (АБУВІ МАВУМ); послідовність СОК2 варіабельної області легкого ланцюга містить або складається з ЗЕО ІЮ

МО:59 (ЕММКЕ55І, і послідовність СОМКІ1 варіабельної області легкого ланцюга містить або складається з 5ЕО ІЮ

МмО:57 (татамі.

Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть включати варіабельну область важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:65, і необов'язково варіабельну область легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

МО:6б6. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну 60 область легкого ланцюга, де варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність МН щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 9095, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 9995, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ

МО:65, і/або варіабельна область легкого ланцюга містить Мі щонайменше з 85 965, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 9595, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:66. Для варіантів здійснення, де області антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною відсотковою ідентичністю з еталонною послідовністю, області МН і/або МІ можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки в каркасних областях. У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельні області важкого ланцюга і/або варіабельні області легкого ланцюга, визначені як такі що мають конкретну відсоткову ідентичність з БЕО ІЮ МО:65 і 66, відповідно, будуть мати наступні послідовності СОК: послідовність СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:43 |РРаРЕКАНУМСАКУ |; послідовність СОМК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО І МО:А1 (СІНІЗОСІТУУТОБУКИ; послідовність СОМК1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:9 |(ЗМЕМ5І; послідовність СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:27 (АБУВІ МАОУМІ; послідовність СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО ІЮ МО:59 (ЕММКА55І; і послідовність СОКІ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з

ЗЕО Юр МО:57 (ТатеЗрІазУМУМ5І.

Антитіла, які специфічно зв'язуються 3 1І/-22К, можуть містити щонайменше один повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну і/або щонайменше один повнорозмірний легкий ланцюг лямбда або каппа. У деяких варіантах здійснення антитіла включають важкий ланцюг,

Зо що містить амінокислотну послідовність 5ЕБО 10 МО:69, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:69, і/або легкий ланцюг щонайменше з 8595, ідентичністю або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 9595, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 9995, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:70. Для варіантів здійснення, де ланцюги антитіл визначаються конкретною відсотковою ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки поза областями СОК.

У тих випадках, коли конкретні антитіла або антигензв'язувальні ділянки визначені як такі, що містять комбінацію області МН або важкого ланцюга, визначених за допомогою посилання на конкретну амінокислотну послідовність, і області МІ. або легкого ланцюга, також визначених за допомогою посилання на конкретну амінокислотну послідовність, то для кожної конкретної комбінації МН/ЛЛ. або важкого ланцюга/легкого ланцюга (якщо не зазначене інше) дане визначення може бути прийняте з включенням антитіл або антигензв'язувальних ділянок, утворених комбінацією області МН/важкого ланцюга, що має щонайменше 85 95,, щонайменше 9095, , щонайменше 9595, , щонайменше 9795, або щонайменше 9995, ідентичність послідовності з зазначеною амінокислотною послідовністю МН/важкого ланцюга, і області

Мі /легкого ланцюга, що має щонайменше 75 95,, щонайменше 80 95,, щонайменше 85 95, , щонайменше 9095, , щонайменше 9595, , щонайменше 9795, або щонайменше 99 95, ідентичність послідовності з зазначеною амінокислотною послідовністю Мі /легкого ланцюга. У кожному випадку області/ланцюги, визначені відсотковою ідентичністю послідовності з зазначеними амінокислотними послідовностями області/ланцюга, можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в зазначених амінокислотних послідовностях області

МНЛ/. або важкого/легкого ланцюга, одночасно проявляючи варіацію амінокислотної послідовності в каркасних областях або інших областях поза ділянками СОК. 60 Якщо не зазначене інше в даній заявці, то відсоткову ідентичність послідовності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити порівнянням цих двох послідовностей, які вирівняні оптимальним чином і в яких амінокислотна послідовність, що підлягає порівнянню, може містити додавання або делеції відносно еталонної послідовності для оптимального вирівнювання між цими двома послідовностями. Відсоток ідентичності обчислюється визначенням числа ідентичних положень, для яких амінокислотний залишок ідентичний між двома послідовностями, діленням цього числа ідентичних положень на загальне число положень у вікні порівняння і множенням одержаного результату на 100, з одержанням відсотка ідентичності між цими двома послідовностями. Наприклад, можна використовувати програму

ВІ АТ, "ВІ АТ 2 зедпиепсев" (Тавзома апа аї., "Віазі 2 зедиепсе5 - а пем/ 00! ог сотрагіпд ргоїєїп апа писіеоїде зедиепсе5з", РЕМ5 Місгобіо! Гей. 174:247-250), що доступна на сайті пОру/Лимли. порі. піт.пійдом/допі/БІ2.піті, з параметрами за замовчуванням (зокрема, для параметрів "штраф за створення пробілу": 5, і "штраф за подовження пробілу": 2; де вибраною матрицею є, наприклад, матриця "ВГОБИОМ 62", запропонована програмою), відсоток ідентичності між двома послідовностями, які потрібно порівняти, обчислюється безпосередньо програмою.

Анти-ІІ -22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, забезпечені в даному описі, можуть мати одну або будь-яку комбінацію наступних властивостей/ознак: антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з епітопом у людському білку І--22Е, який не містить Тугбо; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з епітопом, розташованим щонайменше частково у домені 02 білка І/-22К людини, де домен 02 представляє амінокислотні залишки з 125 по 228 послідовності ЗЕО ІЮО МО:71; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може зв'язуватися з ІЇ-22К людини з високою афінністю; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може блокувати зв'язування ІІ -22 з ІІ -228; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може інгібувати ІІ -22-залежну активацію п -228; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може інгібувати ІІ -20-залежну активацію п -228;

Зо антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може інгібувати ІІ -22-залежну активацію

І--22К і 1--20-залежну активацію І -228; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент не може перехресно реагувати з мишачим

І -228.

Анти-ІІ -22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, забезпечені в даному описі, переважно проявляють дві або більше з наступних властивостей/ознак: антитіло або антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з епітопом у людському білку

ІЇ-22Е, який не містить Тугбо; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з ІЇ/-22К людини з високою афінністю; антитіло або антигензв'язувальний фрагмент інгібує ІЇ-22-залежну активацію 1/-22Е. і

І -20-залежну активацію ІІ -22Н.

Анти-ІІ -22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, забезпечені в даному описі, можуть бути химерними антитілами. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти містять шарнірну область, домен СН2 і/або домен СНЗ людського ДО. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти проявляють високу гомологію з людським до, переважно людським Ідо1, де "висока гомологія з імуноглобуліном людини" визначається в даному описі в інших місцях. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де області МН і/або Мі або одна або більше ділянок, що визначають комплементарність (СОК), одержані від тваринного сімейства верблюдячих, тобто одержані від верблюда, де переважно верблюд є ламою.

У додаткових аспектах винахід також забезпечує молекули полінуклеотидів, які кодують вищевказані антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, на доповнення до експресійних векторів, що містять полінуклеотиди, клітини-хазяїни, що містять вектори, і способи рекомбінантної експресії/продукції антитіл, описаних у даному документі.

У ще одному аспекті винахід забезпечує фармацевтичну композицію, яка містить будь-яке з анти-ІЇ-22В-антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, описаних у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт.

Ще один додатковий аспект винаходу стосується способів терапевтичного лікування з бо використанням вищевказаних анти-ІЇ-22В-антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів,

зокрема, у профілактиці і/або лікуванні таких патологічних станів як псоріаз, псоріатичний артрит і атопічний дерматит.

Ці ї інші варіанти здійснення винаходу можна краще оцінити і зрозуміти при розгляді в комбінації з наступним описом і прикладеними кресленнями. Потрібно, однак, розуміти, що нижченаведений опис, незважаючи на вказівку різних варіантів здійснення винаходу і численних їх конкретних деталей, наводиться як ілюстрація, а не для обмеження. Багато замін, модифікацій, додавань і/або перегрупувань можуть бути виконані в рамках обсягу винаходу, не відступаючи від його суті, і винахід включає всі такі заміни, модифікації, додавання і/або перегрупування.

Короткий опис креслень

На Фіг. 1 показані різні рецепторні комплекси, які опосередковують передачу сигналів через цитокіни 1-22, 1-20 ї 1-24. І/-22К здатний утворювати гетеродимерний комплекс з двома різними партнерами рецептора, І/-ТОКВД (або 1І-10К2) і І. -20КВ (або 1І-2012), і активація цих різних комплексів зв'язуванням ліганду запускає сигнальний шлях через внутрішньоклітинні шляхи в напрямку 5-3".

На Фіг. 2 показана повнорозмірна амінокислотна послідовність І-22К людини (ЗЕО ІЮ

МО:71).

На Фіг. З показана повнорозмірна нуклеотидна послідовність, кодуюча ІЇ-22К людини (5ЕО

ІО МО:72).

На Фіг. 4 показане інгібування ІІ-22- і І -20-опосередкованого сигнального шляху через ЇЇ - 22К. в аналізах клітинної проліферації. (А) Показаний вплив тАбБ до 1 -22К на проліферацію клітинної лінії ВМУ-НІ.-228. Клітини ВУУ-ПІЇ-22К стабільно експресують 1/-22К людини, і ріст інгібується/зупиняється у відповідь на ліганд ІІ--22. Антитіла, здатні блокувати взаємодію між ЇЇ - 22 і ПІС-22К, полегшують інгібування росту, опосередковане зв'язуванням ліганд-рецептор. (В)

Показаний вплив тАБ до 1 -22К на проліферацію клітинної лінії Ваї3-пІЇ -22КЛІ 20. Клітини

Ваї3-ПІІ -22ЕЛІ20КЬ стабільно експресують компоненти рецепторного комплексу ІІ -228/ЛІ 2085 так, що клітини проліферують у присутності ІІ -20. Антитіла, здатні блокувати взаємодію між ІІ - 20 і цим рецепторним комплексом, інгібують проліферацію, індуковану зв'язуванням ліганду.

На Фіг. 5 показане вирівнювання позаклітинного домену 1-22К з різних видів. (А) показані неповні послідовності Е5Т, доступні з бЗепрапк; (В) показані послідовності, визначені після клонування І--22К мавпи циномолгус і макака-резус з бібліотеки КДНК мавпи циномолгус.

На Фіг. 6 показані результати дослідів з використанням конкурентного ЕГІЗА, проведених для картування епітопів ІЇ/-22К тАБ. Були ідентифіковані різні епітопи для антитіл МН-сімейств 1-8, 10, 11, 19 і 22. Епітопи були згруповані залежно від того, наскільки антитіла (ї) блокували зв'язування 1-22 іп міго і нейтралізували сигнальний шлях 1-22 у клітинному аналізі (нижнє ліве коло); (її) блокували зв'язування І/-22 іп міго, але не мали нейтралізуючу активність у клітинному аналізі (верхнє праве коло); або (ії) не блокували зв'язування 1ІІ/-22 іп міго, але проявляли нейтралізуючу активність у клітинному аналізі (нижнє праве коло).

На Фіг. 7 показана кристалічна структура 1І/-22К у комплексі з 1-22. (А) Домени 01 і 02 ІІ - 221 вносять залишки в поверхню поділу з лігандом 1-22. (В) У60 у домені 01 є важливим залишком 1 -22К, що сприяє взаємодії з сайтом 1А ліганду 1-22.

На Фіг. 8 показане інгібування ІІЇ-20-опосередкованого сигнального шляху через 1І-22К в аналізі клітинної проліферації. Різні тАб до І/-22К тестували на їх здатність інгібувати

І -20-індуковану проліферацію клітин Ваї3З-пІГ -22вЛІ 208.

На Фіг. 9 показане інгібування ІІ -22- і І -20-опосередкованого сигнального шляху через

І -22К у клітинних аналізах. (А) Показаний вплив тАБб до ІІ -22К на проліферацію клітинної лінії

ВМУ-пІ.-22К. Клітини ВУМ-ПІ/-2215 стабільно експресують І/-22К людини, і ріст інгібується/зупиняється у відповідь на ліганд 1-22. Антитіла, здатні блокувати взаємодію між

І/-22 ії ПІС-227,, полегшують інгібування росту, опосередковане зв'язуванням ліганд-рецептор. (В) Показаний вплив тАБб до 1-22К на проліферацію клітинної лінії Ваї3-пІІ -22КЛІ 20. Клітини

Ваї3-ПІІ -22ЕЛІ20КЬ стабільно експресують компоненти рецепторного комплексу ІІ -228/ЛІ 2085 так, що клітини проліферують у присутності ІЇ/-20. Антитіла, здатні блокувати взаємодію між

І -20 ї цим рецепторним комплексом, інгібують проліферацію, індуковану зв'язуванням ліганду.

На Фіг. 10 схематично показані результати експериментів по картуванню епітопів для варіантів зародкового типу антитіл І/-22К 23009 і 22305. МВ "дуто" еквівалентно "280.346.15У".

На Фіг. 11 показана перехресна реактивність варіантів зародкового типу антитіл до ІГ/-228 людини і мавпи циномолгус, як визначено аналізом ЕАС5. Антитіло 23039 перехресно реагує з

І/-22К людини і І-22К мавпи циномолгус (ліві панелі), у той час як антитіло 22305 зв'язується з бо людським 1І--22К, але перехресно не реагує з І/-22К мавпи циномолгус (праві панелі).

На Фіг.12 показані фармакокінетичні дані для анти-ІІ!-22В-антитіла 230С9. Мавпам циномолгус вводили внутрішньовенно однократне антитіло в дозі 10 мг/кг. Зразки крові відбирали у різні часові точки і визначали концентрацію антитіла в плазмі за допомогою ЕЇГ І5А.

Було встановлено, що антитіло 23009 має період напіврозпаду, що дорівнює приблизно 19,4 доби.

На Фіг. 13 показані фармакокінетичні дані для анти-ІЇ -22В-антитіла 230С9, яке вводили в різних дозах. А. У більш високих дозах (210 мг/кг), коли мішень-опосередкований розподіл препарату (ТМОЮ) насичується, то значення кліренсу наближаються до неспецифічного кліренсу КЕ5. В. Кліренс 230С09-М2970) у мавпи циномолгус. Загальний кліренс представляє суму 1) ТМОО, який є нелінійним і насичуваним, і 2) неспецифічного кліренсу, який є лінійним і належить до КЕ5. Період напіврозпаду в плазмі має зворотний зв'язок з кліренсом, що приводить до тривалого періоду напіврозпаду у високих дозах і більш короткого періоду напіврозпаду в більш низьких дозах за рахунок мішень-опосередкованого кліренсу.

На Фіг.14 показаний фармакодинамічний ефект анти-І/!-22В-антитіла 23009. Мавпу циномолгус піддавали впливу антитіла 230С9 у різних дозах і оцінювали дію на оброблену ІМО ділянку шкіри і нормальну ділянку шкіри мавпи. Було встановлено, що підвищені дози антитіла 23009 нормалізують товщину епідермісу (А) і зменшують частоту Кіб7-позитивних ядер (В) в обробленій ІМО ділянці шкіри.

На Фіг. 15 показаний вплив анти-ІЇ-22В-антитіла 230029 (АКОХ-112) на І--22-регульовані рівні мРНК РІ 2 у зразку шкіри, одержаному пункційною біопсією. Мавпі циномолгус вводили однократно внутрішньовенно антитіло 230С9 у різних дозах: 1, 5 і 30 мг/кг (по З тварини на кожну дозу). Рекомбінантний людський 1-22 знижував рівні загальної мРНК РІ с2 шкіри, тоді як даний ефект відмінявся антитілом 230029. На осі У зазначена відносна експресія РІ 2 у порівнянні з референсним геном. Статистичне порівняння між групами позначене лініями у верхній частині графіка з довірчими інтервалами наступним чином: "р«0,05; ре«О0,01; -хр«0,001. Показані відсотки (60, 64, 60 95, , відповідно) указують на 95, інгібування сигналу.

На Фіг. 16 показаний вплив анти-1ІЇ-22В-антитіла 23009 (АКОХ-112) на І--22-регульовану експресію гена ОЕЕВА в експлантах шкіри людини ех мімо. Шкірні експланти з області живота обробляли зростаючими концентраціями антитіла 23029 перед стимуляцією 20 мл/мл гппІІ-22.

Антитіло 23029 було здатне відміняти ІІЇ-22-опосередковане підвищення рівнів МРНК СЕЕВ4 дозозалежним чином. На осі У зазначена відносна експресія ОЕЕВА у порівнянні з референсним геном. ГО означає більш низький рівень кількісного визначення.

На Фіг. 17 показаний вплив анти-1ІЇ-22В-антитіла 23009 (АКОХ-112) на ІС-22-регульовану експресію генів ЕІ. с2 і ОК в експлантах шкіри мавпи циномолгус ех мімо. Біопсійні зразки шкіри обробляли зростаючими концентраціями антитіла 23029 перед стимуляцією 20 мл/мл г -22.

Антитіло 230С9 було здатне відміняти ІІ-22-опосередковане зниження рівнів мРНК РІ с2 (А) і

МРНК ГОК (В) дозозалежним чином. На осі У зазначена відносна експресія Р 62 ії 1ТОК у порівнянні з референсним геном.

На Фіг.18 показаний вплив анти-І!-22Н-антитіла 23009 (АКОХ-112) на первинні кератиноцити людини. Кератиноцити попередньо обробляли антитілом 230С9, і потім стимулювали сумішшю ІІ--4, 1-13, 1-22 і ІРМ-у. Контрольні клітини обробляли сумішшю ІІ -4, ІІ - 13 і 1ЕМ-у. Антитіло 230С9 показало дозозалежне інгібування секреції ССІ 2.

Докладний опис винаходу

А. Визначення "Антитіло" або "імуноглобулін". Як у даному описі використовується, термін "імуноглобулін" включає поліпептид, що має комбінацію двох важких і двох легких ланцюгів, незалежно від наявності або відсутності якої-небудь відповідної специфічної імунореактивності. Термін "антитіла" стосується таких молекул, які мають значну відому специфічну імунологічну реактивність до антигену, що представляє інтерес (наприклад, цитокінового рецептора ІІ -228).

Термін "анти-ІЇ-22А-антитіла" використовується в даному описі для позначення антитіл, які проявляють імунологічну специфічність до білка І/-22Е, включаючи 1-22 людини, і в деяких випадках його видових гомологів. Антитіла і імуноглобуліни містять легкі і важкі ланцюги, з або без міжланцюжкового ковалентного зв'язку між ними. Основні структури імуноглобуліну у хребетних відносно добре вивчені.

Загальний термін "імуноглобулін" включає п'ять різних класів антитіл, які можна розрізнити біохімічно. Усі п'ять класів антитіл входять в обсяг даного винаходу. Наступне обговорення, в основному, буде стосуватися класу дос молекул імуноглобулінів. Стосовно Ідс, імуноглобуліни містять два ідентичні поліпептиди легкого ланцюга з молекулярною масою приблизно 23000 дальтон і два ідентичні поліпептиди важкого ланцюга з молекулярною масою 53000- бо 710000 дальтон. Чотири ланцюги з'єднані дисульфідними зв'язками в конфігурації "У", де легкі ланцюги охоплюють важкі ланцюги, що починаються біля роздвоєного кінця "У" і проходять через варіабельну область.

Легкі ланцюги антитіла класифікуються як каппа або лямбда (к, АХ). Кожний клас важкого ланцюга може бути зв'язаний з легсим ланцюгом або каппа, або лямбда. Загалом, легкий і важкий ланцюги ковалентно зв'язані один з одним, і "хвостові" ділянки двох важких ланцюгів зв'язані одна з одною ковалентними дисульфідними зв'язками або нековалентними зв'язками, коли імуноглобуліни продукуються гібридомами, В-клітинами або клітинами-хазяїнами, одержаними методами генної інженерії. У важкому ланцюзі амінокислотні послідовності простягаються від М-кінця в роздвоєних кінцях конфігурації "У" до С-кінця в нижній частині кожного ланцюга. Фахівцям у даній галузі техніки повинно бути зрозуміло, що важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон (у, Н, а, б, є) з наявністю деяких підкласів серед них (наприклад, у1-у4). Природа даного ланцюга визначає "клас" антитіла як

ІЧ, ІМ, ІдА, ІдО або ІЗЕ, відповідно. Підкласи імуноглобулінів (ізотипи), наприклад Ідс1, Ідса2,

ІЧО3, Ідс4, ІДА1 і таке інше, добре охарактеризовані і, як відомо, визначають функціональну спеціалізацію. Модифіковані варіанти кожного з цих класів і ізотипів може легко диференціювати кваліфікований фахівець у даній галузі з урахуванням цього розкриття і, відповідно, вони входять в обсяг даного винаходу.

Як зазначено вище, варіабельна область антитіла забезпечує можливість антитілу вибірково розпізнавати і специфічно зв'язуватися з епітопами антигенів. Тобто, область МІ і область МН антитіла об'єднуються з утворенням варіабельної області, яка визначає тривимірний антигензв'язувальний сайт. Ця четвертинна структура антитіла утворює антигензв'язувальний сайт, присутній на кінці кожного плеча МУ. Більш конкретно, антигензв'язувальний сайт антигену визначається трьома ділянками, що визначають комплементарність (СОК), у кожному з ланцюгів МН і МІ.. "І--22КК". Як у даному описі використовується, термін "І--22К" означає цитокіновий рецептор типу ІЇ, який опосередковує сигнальний шлях через ліганди ІІ -22, ІІ -20 ї І -24. 1 -22К здатний утворювати гетеродимерні комплекси на клітинній поверхні з І/-10К2 і І--2082. 1/-22К також може належати до ІІ 22Е, І -2281, 112281, ІІ 22ВА, ІІ -22ВА, СВЕ2-9 і 2суюг 11. Термін І--22К1 є досить широким, щоб охопити людську форму рецептора і видові гомологи. Амінокислотна

Ко) послідовність повнорозмірного людського ІЇ-22К представлена в 5ЕО ІЮ МО:71, і кодуюча нуклеотидна послідовність представлена в 5ЕО ІЮО МО:72 (див. Фіг. 2 і 3). Дані послідовності відповідають послідовностям, депонованим у базі даних Зм/із5Ргої як субодиниця рецептора інтерлейкіну-22 людини, інвентарний номер О8МбР7. "Сайт зв'язування". Як у даному описі використовується, термін "сайт зв'язування" включає область поліпептиду, яка відповідальна за вибірне зв'язування з антигеном-мішенню, що представляє інтерес (наприклад, І -22К). Зв'язувальні домени містять щонайменше один сайт зв'язування. Ілюстративні зв'язувальні домени включають варіабельну область антитіла.

Молекули антитіл за винаходом можуть містити один сайт зв'язування або декілька (наприклад, два, три або чотири) сайтів зв'язування. "Одержані з". Як у даному описі використовується, термін "одержані з" позначеного білка (наприклад, верблюдяче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент) стосується джерела поліпептиду або амінокислотної послідовності. В одному варіанті здійснення поліпептид або амінокислотна послідовність, які одержані з конкретного вихідного поліпептиду, являють собою послідовність СОК або зв'язану з нею послідовність. В одному варіанті здійснення амінокислотна послідовність, яка одержана з конкретного вихідного поліпептиду, не є суміжною. Наприклад, в одному варіанті здійснення одна, дві, три, чотири, п'ять або шість

СОК одержані з вихідного антитіла. В одному варіанті здійснення поліпептид або амінокислотна послідовність, які одержані з конкретного вихідного поліпептиду або амінокислотної послідовності, мають амінокислотну послідовність, яка по суті ідентична послідовності вихідної послідовності або її фрагмента, де цей фрагмент складається щонайменше з 3-5 амінокислот, щонайменше 5-10 амінокислот, щонайменше 10-20 амінокислот, щонайменше 20-30 амінокислот або щонайменше 30-50 амінокислот, або які інакше можуть бути ідентифіковані фахівцем зі звичайною кваліфікацією в даній галузі як такі що мають початок у вихідній послідовності. В одному варіанті здійснення одна або більше послідовностей СОК, одержаних з вихідного антитіла, змінені з одержанням варіантних послідовностей СОК, наприклад варіанти афінності, де варіантні послідовності СОК підтримують антигензв'язувальну активність. "Одержані від верблюда". У деяких переважних варіантах здійснення антитіла за винаходом містять амінокислотні послідовності каркасної області і/або амінокислотні послідовності СОК, одержані зі звичайного верблюдячого антитіла, продукованого активною імунізацією верблюда. 60 Однак антитіла за винаходом, що містять амінокислотні послідовності, одержані від верблюда,

можуть бути сконструйовані таким чином, щоб містити послідовності каркасних і/або константних областей, одержані з амінокислотної послідовності людини (тобто людського антитіла) або інших видів ссавців, відмінних від верблюда. Наприклад, каркасна область, ділянка важкого ланцюга і/або шарнірна область людини або примата, відмінного від людини, можуть бути включені в конкретні анти-ІЇ -22В-антитіла. В одному варіанті здійснення одна або більше амінокислот, що не походять від верблюда, можуть бути присутні у каркасній області антитіла, одержаного від верблюда, наприклад амінокислотна послідовність каркасної області верблюда може містити одну або більше амінокислотних мутацій, у яких може бути присутній відповідний амінокислотний залишок людини і примата, відмінного від людини. Крім того, області МН і МІ, одержані від верблюда, або їх гуманізовані варіанти можуть бути зв'язані з константними областями людських антитіл з утворенням химерної молекули, як у даному описі розкрито в інших місцях. "Консервативна амінокислотна заміна". "Консервативна амінокислотна заміна" представляє заміну, при якій амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, були визначені в даній галузі, включаючи основні бічні ланцюги (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотні бічні ланцюги (наприклад, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярні бічні ланцюги (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, замінний амінокислотний залишок у поліпептиді імуноглобуліну може бути замінений іншим амінокислотним залишком з того ж сімейства бічних ланцюгів. У ще одному варіанті здійснення ланцюг амінокислот може бути замінений структурно подібним ланцюгом, який відрізняється порядком розташування і/або складом членів сімейства бічних ланцюгів. "Частина важкого ланцюга". Як у даному описі використовується, термін "частина важкого ланцюга" включає амінокислотні послідовності, одержані з константних областей важкого ланцюга імуноглобуліну. Поліпептид, що містить частину важкого ланцюга, містить щонайменше один з наступних елементів: домен СНІ, шарнірна область (наприклад, верхня, середня і/або

Зо нижня шарнірна область) домен СН2, домен СНЗ або його варіант, або його фрагмент.

В одному варіанті здійснення антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за винаходом може містити Ес-фрагмент важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, шарнірну область, домен

СНО ї домен СНЗ). У ще одному варіанті здійснення в антитілі або антигензв'язувальному фрагменті за винаходом може бути відсутня щонайменше частина константної області (наприклад, повністю або частина домену СН2). У деяких варіантах здійснення щонайменше одна і переважно всі константні області одержані з важкого ланцюга імуноглобуліну людини.

Наприклад, в одному переважному варіанті здійснення частина важкого ланцюга містить повністю людську шарнірну область. У ще одних переважних варіантах здійснення частина важкого ланцюга містить повністю людський Ес-фрагмент (наприклад, послідовності шарнірної області, доменів СН2 і СНЗ з імуноглобуліну людини).

У деяких варіантах здійснення складові компоненти частини важкого ланцюга константні області походять з різних молекул імуноглобуліну. Наприклад, частина важкого ланцюга поліпептиду може містити домен СН2, одержаний з молекули ІдсС1, і шарнірну область, одержану з молекули ЇдДе3 або Ідс4. У ще одних варіантах здійснення константні області є химерними областями, що містять ділянки різних молекул імуноглобуліну. Наприклад, шарнірна область може містити першу ділянку з молекули дос і другу ділянку з молекули доз або Ідс4.

Як зазначено вище, фахівцю в даній галузі техніки повинно бути зрозуміло, що константні області частини важкого ланцюга можуть бути модифіковані таким чином, що вони відрізняються від амінокислотної послідовності з молекули імуноглобуліну, що зустрічається в природі (дикого типу). Тобто, поліпептиди за винаходом, розкриті в даному описі, можуть містити зміни або модифікації однієї або більше константних областей важкого ланцюга (СНІ, шарнірної області, СН2 або СНЗ) і/або домену константної області легкого ланцюга (СІ).

Ілюстративні модифікації включають додавання, делеції або заміни однієї або більше амінокислот в одному або декількох доменах. "Химерний". "Химерний" білок містить першу амінокислотну послідовність, зв'язану з другою амінокислотною послідовністю, з якою вона не зв'язана в природних умовах. Амінокислотні послідовності звичайно можуть існувати в окремих білках, які об'єднуються разом у злитий поліпептид, або вони можуть звичайно існувати в одному і тому ж білку, але поміщуються в нове розташування в злитому поліпептиді. Химерний білок можна одержати, наприклад, бо хімічним синтезом або створенням і трансляцією полінуклеотиду, у якому пептидні області кодовані в бажаному взаємозв'язку. Типові химерні антитіла за винаходом включають злиті білки, що містять області МН і МІ, одержані від верблюда, або їх гуманізовані варіанти, злиті з константними областями людського антитіла, наприклад людського Іде, Ідс2, дез або Ід. "Варіабельна область" або "варіабельний домен". Терміни "варіабельна область" і "варіабельний домен" використовуються в даному описі взаємозамінно і мають еквівалентне значення. Термін "варіабельна" стосується того факту, що деякі ділянки варіабельних областей

МН ї МІ. сильно відрізняються по послідовності серед антитіл і виконують визначену роль у зв'язуванні і визначенні специфічності кожного конкретного антитіла для його антигену-мішені.

Однак варіабельність нерівномірно розподілена по варіабельних областях антитіл. Вона сконцентрована в трьох сегментах, називаних "гіперваріабельними петлями" у кожній області

МІ. ї області УН, які утворюють частину антигензв'язувального сайта. Перша, друга і третя гіперваріабельні петлі області Млямбда легкого ланцюга належать в даному описі до 11 (Х),

Ї2(Х) ІЗ (Х) і можуть бути визначені як такі, що містять залишки 24-33 (11 (Х), що складається з 9, 10 або 11 амінокислотних залишків), 49-53 (12 (АХ), що складається з З залишків) і 90-96 (3 (Х), що складається з 5 залишків) в області МІ (Могеа еї аї., Мешйодв»5, 20:267-279 (2000)).

Перша, друга і третя гіперваріабельні петлі області Мкаппа легкого ланцюга належать в даному описі до 1/1 (к), 12 (к) і ІЗ (к) ії можуть бути визначені як такі, що містять залишки 25-33 (І 1 (к), що складається з 6, 7, 8, 11, 12 або 13 залишків), 49-53 (12 (к), що складається з З залишків) і 90-97 (ІЗ (к), що складається з б залишків) в області МІ (Могеа еї аї., МеїШйод»5, 20:267-279 (2000)). Перша, друга і третя гіперваріабельні петлі області МН належать в даному описі до НІ,

Н2 і НЗ ї можуть бути визначені як такі, що містять залишки 25-33 (НІ, що складається з 7, 8 або 9 залишків), 52-56 (Н2, що складається з З або 4 залишків) і 91-105 (НЗ, високоваріабельний по довжині) в області МН (Могеа еї а!., Мемпод5», 20:267-279 (2000)).

Якщо не зазначене інше, то терміни 11, 12 ї З, відповідно, стосуються першої, другої і третьої гіперваріабельних петель області МІ. і охоплюють гіперваріабельні петлі, одержані як з ізотипу Мкаппа, так і ізотипу Млямбда. Терміни НІ, Н2 ї НЗ, відповідно, стосуються першої, другої і третьої гіперваріабельних петель області МН і включають гіперваріабельні петлі, одержані з будь-якого відомого ізотипу важкого ланцюга, включаючи у, є, б, са або р.

Гіперваріабельні петлі! 1, 12, І 3, НІ, Н2 і НЗ, кожна, можуть включати частину "ділянки, що

Зо визначає комплементарність" або "СОК", як визначено нижче. Терміни "гіперваріабельна петля" і "ділянка, що визначає комплементарність", строго говорячи, не є синонімами, оскільки гіперваріабельні петлі (НМ) визначаються на основі структури, тоді як ділянки, що визначають комплементарність (СОК), визначаються на основі варіабельності послідовності (Кабаї еї аї.,

Зедиеєпсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс Неанй 5егуісе, Маїййопаї! Іпвійшев ої

Неан, Веїйезаа, МО., 1983), і межі НМ і СОК можуть бути різними в деяких областях МН і Мі.

СОК областей МІ і МН звичайно можуть бути визначені як такі, що містять наступні амінокислоти: залишки 24-34 (І СОВ1), 50-56 І СОК2) і 89-97 (ІСОР3) у варіабельній області легкого ланцюга і залишки 31-35 або 31-355 (НСОРВ1), 50-65 (НСОМК2) і 95-102 (НСОКЗ) у варіабельній області важкого ланцюга (Кабаї єї аІ., Зедиепсе5 ої Ргоївіп5 ої ІттипоіодісаЇ!

Іп'егев5і, БІйп Ей. Рибіїс Неакй Зегмісе, Майопаї Іпбзійшез ої Неакй, Веїпезаа, МО. (1991)). Таким чином, НМ можуть знаходитися у відповідних СОЖК, і посилання в даному описі на "гіперваріабельні петлі" областей МН і Мі. слід інтерпретувати як також охоплюючі відповідні

СОР, і навпаки, якщо не зазначене інше.

Більш висококонсервативні ділянки варіабельних областей називаються каркасною областю (ЕК), як визначено нижче. Варіабельні області нативних важких і легких ланцюгів містять чотири

ЕК (ЕК, ЕК2, ЕКЗ ї ЕКЯ4, відповідно), в основному приймаючи В-складчасту конфігурацію, зв'язану трьома гіперваріабельними петлями. Гіперваріабельні петлі в кожному ланцюзі утримуються разом у безпосередній близькості за допомогою ЕК і разом з гіперваріабельними петлями з іншого ланцюга сприяють утворенню антигензв'язувального сайта антитіл.

Структурний аналіз антитіл виявив взаємозв'язок між послідовністю і формою сайта зв'язування, утвореного ділянками, що визначають комплементарність (Споїйвіа еї аї., 9). Мої.

Віо!., 227:799-817 (1992)); Тгатопіапо еї аї., у). Мої. Віої, 215:175-182 (1990)). Незважаючи на їх високу варіабельність послідовності, п'ять з шести петель приймають тільки невеликий репертуар конформацій основного ланцюга, називаний "канонічними структурами". Дані конформації в першу чергу визначаються довжиною петель і, по-друге, наявністю ключових залишків у визначених положеннях у петлях і в каркасних областях, які визначають конформацію за допомогою їх упакування, водневих зв'язків або здатності приймати незвичайні конформації основного ланцюга. "СОК". Як у даному описі використовується, термін "СОМ" або "ділянка, що визначає бо комплементарність" означає несуміжні антигензв'язувальні сайти, що знаходяться у варіабельній області поліпептидів як важкого, так і легкого ланцюга. Ці конкретні області були описані Кабаї еї аї., 9. Віої. Спет., 252, 6609-6616 (1977); Кабаї єї а!., хХедиепсевз ої ргоївїп ої іттипо|одісаї іпіегеві. (1991); Споїніа вї аї., У. Мої. Віої!., 196:901-917 (1987); і МасСайПшт еї аї., У.

Мої. ВіоІ., 262:732-745 (1996), де визначення включають перекривання або підгрупи амінокислотних залишків при порівнянні одного з одним. Амінокислотні залишки, що утворюють

СОК, визначені в кожному з наведених вище посилань, наведені для порівняння. Переважно, термін "СОК" представляє СОК, як визначено КарБбаї, на основі порівняння послідовностей.

Таблиця 1

Визначення СОК 11111107 кКабай | 0 Споша? | 0 МасСайт "Нумерація залишків відповідає номенклатурі, наведеній в публікації Кабаї єї а!., вище. гНумерація залишків відповідає номенклатурі, наведеній в публікації Споїпіа еї аї., вище.

ЗНумерація залишків відповідає номенклатурі, наведеній в публікації МасСайПит еї а!., вище. "Каркасна область". Як у даному описі використовується, термін "каркасна область" або "область ЕК" включає амінокислотні залишки, які є частиною варіабельної області, але не є частиною СОЖК (наприклад, з використанням системи визначення СОК по КабраЮ. Отже, каркасна область варіабельної області становить від 100 до 100 амінокислот у довжину, але включає тільки ті амінокислоти, які знаходяться за межами СОК. Для конкретного прикладу варіабельної області важкого ланцюга і для СОК, згідно з системою нумерації по Кабаї еї аї., каркасна область 1 відповідає області варіабельної області, що охоплює амінокислоти 1-30; каркасна область 2 відповідає області варіабельної області, що охоплює амінокислоти 36-49; каркасна область З відповідає області варіабельної області, що охоплює амінокислоти 66-94, і каркасна область 4 відповідає області варіабельної області від амінокислот 103 до кінця варіабельної області. Каркасні області легкого ланцюга аналогічно відділені одна від одної кожною СОМ варіабельної області легкого ланцюга. Аналогічним чином, використовуючи систему визначення СОК по СпПпоїйпіа еї аі. або МсСаїїшт еї аї., границі каркасної області відділені кінцями відповідних СОК, як описано вище. У переважних варіантах здійснення СОК є такими, як визначено Кабаї.

В антитілах, що зустрічаються в природі, шість СОК, присутніх у кожному мономерному антитіл, являють собою короткі, несуміжні послідовності амінокислот, які специфічно розташовуються з утворенням антигензв'язувального сайта, коли антитіло приймає свою тривимірну конфігурацію у водному середовищі. Інша частина варіабельних областей важких і легких ланцюгів проявляє меншу міжмолекулярну варіабельність в амінокислотній

Зо послідовності і називається каркасними областями. Каркасні області значною мірою приймають

В-складчасту конформацію, і СОК утворюють петлі, які з'єднують і в деяких випадках складають частину ВД-складчастої структури. Таким чином, ці каркасні області функціонують з утворенням каркаса, який забезпечує розташування шести СОК у правильній орієнтації за рахунок міжланцюжкових, нековалентних взаємодій. Антигензв'язувальний сайт, утворений розташованими СОК, визначає поверхню, комплементарну епітопу на імунореактивному антигені Ця комплементарна поверхня забезпечує нековалентне зв'язування антитіла з епітопом імунореактивного антигену. Положення СОК може бути легко ідентифіковане фахівцем у даній галузі техніки. "Шарнірна область". Як у даному описі використовується, термін "шарнірна область" включає частину молекули важкого ланцюга, що з'єднує домен СНІ з доменом СН2. Ця шарнірна область містить приблизно 25 залишків і є гнучкою, що дозволяє двом М-кінцевим антигензв'язувальним ділянкам переміщатися незалежно одна від одної. Шарнірну область можна розділити на три різні області: верхню, середню і нижню шарнірні області (Коих К.Н. еї аІ., У. Іттипої!., 161:4083-90, 1998). Антитіла за винаходом, що містять "повністю людську" шарнірну область, можуть містити одну з послідовностей шарнірної області, показаних у таблиці 2 нижче.

Таблиця 2

Послідовності шарнірної області людини

ЗЕОІО МО:82 ЗЕО І МО:83 ЗЕО ІЮ МО:84

ЗЕО ІЮ МО:85 ЗЕО ІЮ МО:86 ЗЕО ІЮ МО:87

ЗЕО ІЮ МО:88 ЗЕО І МО:89 ЗЕО І МО:90

ЗЕО ІО МОС91 ЗЕО І МО:92 ЗЕО І МО:93 "Домен СН2г". Як у даному описі використовується, термін "домен СН2г" включає частину молекули важкого ланцюга, що простягається, наприклад, від залишку 244 до залишку 360 антитіла з використанням звичайних систем нумерації (залишки 244-360, система нумерації по

Кабваї, і залишки 231-340, система нумерації ЄС, Караї Е.А. еї аЇ. Зедиепсев5 ої Ргоїеїп5 ої

Іпттітипо!одісаї Іптегез5і. Веїпезаа, О5 Оерагтепі ої Неайй апа Нитап 5егмісе5, МІН. 1991). Домен

СН2 унікальний тим, що він тісно не спарений з іншим доменом. Точніше, два М-зв'язані розгалужені вуглеводні ланцюги знаходяться між двома доменами СН2 молекули інтактного нативного дО. Також добре відомо, що домен СНЗ простягається від домену СН2 до С-кінця молекули Ідс і містить приблизно 108 залишків. "Фрагмент". Як у даному описі використовується, термін "фрагмент" у контексті антитіл за винаходом стосується частини або ділянки антитіла або ланцюга антитіла, що містить менше число амінокислотних залишків, ніж інтактне або повне антитіло або ланцюг антитіла. Термін "антигензв'язувальний фрагмент" стосується поліпептидного фрагмента імуноглобуліну або антитіла, що зв'язує антиген або конкурує з інтактним антитілом (тобто з інтактним антитілом, з якого він був одержаний) за зв'язування антигену (тобто специфічне зв'язування з ІІ -22К). Як у даному описі використовується, термін "фрагмент" молекули антитіла включає антигензв'язувальні ділянки антитіл, наприклад варіабельну область легкого ланцюга антитіла (М), варіабельну область важкого ланцюга антитіла (МН), одноланцюжкове антитіло (5сЕм),

Каб')»-фрагмент, РГар-фрагмент, Ба-фрагмент, Ем-фрагмент і однодоменний фрагмент антитіла (САБ). Фрагменти можуть бути одержані, наприклад, за допомогою хімічної або ферментативної обробки інтактного або повного антитіла або ланцюга антитіла або рекомбінантними засобами. "Валентність". Як у даному описі використовується, термін "валентність" стосується потенційних сайтів зв'язування мішеней у поліпептиді. Кожний сайт зв'язування мішені специфічно зв'язує одну молекулу-мішень або специфічний сайт на молекулі-мішені. Коли поліпептид містить більше одного сайта зв'язування мішені, то кожний сайт зв'язування мішені може специфічно зв'язуватися з одними і тими ж або різними молекулами (наприклад, може

Зо зв'язуватися з різними лігандами або різними антигенами або різними епітопами на одному і тому ж антигені). "Специфічність". Термін "специфічність" стосується здатності зв'язуватися (наприклад, імунологічно реагувати 3) з даною мішенню, наприклад 1/-22К. Поліпептид може бути моноспецифічним і містити один або більше сайтів зв'язування, які специфічно зв'язуються з мішенню або поліпептидом, може бути мультиспецифічним і містити два або більше сайтів зв'язування, які специфічно зв'язуються з однією і тією ж або різними мішенями. "Синтетичний". Як у даному описі використовується, термін "синтетичний" відносно поліпептидів включає поліпептиди, які містять амінокислотну послідовність, що не зустрічається в природі. Наприклад поліпептиди, що не зустрічаються в природі, представляють модифіковані форми поліпептидів, що зустрічаються в природі (наприклад, що включають мутацію, таку як додавання, заміна або делеція), або містять першу амінокислотну послідовність (яка може бути природною або неприродною), яка зв'язана в лінійній послідовності амінокислот з другою амінокислотною послідовністю (яка може бути природною або неприродною), з якою вона не зв'язана в природі. "Сконструйовані"» Як у даному описі використовується, термін "сконструйовані" включає маніпулювання молекулами нуклеїнової кислоти або поліпептиду за допомогою синтетичних методів (наприклад, за допомогою рекомбінантних методів, пептидного синтезу іп міго, шляхом ферментативного або хімічного сполучення пептидів або визначеної комбінації цих методів).

Переважно, антитіла за винаходом є сконструйованими, включаючи, наприклад, гуманізовані іабо химерні антитіла, і антитіла, які були сконструйовані для поліпшення однієї або більше властивостей, таких як зв'язування антигену, стабільність/період напіврозпаду або ефекторна функція. "Модифіковане антитіло". Як у даному описі використовується, термін "модифіковане антитіло" включає синтетичні форми антитіл, які змінені таким чином, що вони не є такими, що зустрічаються в природі, наприклад антитіла, які містять щонайменше частини двох важких ланцюгів, але не два повні важкі ланцюги (наприклад, такі як антитіла з делетованим доменом або міні-антитіла); мультиспецифічні форми антитіл (наприклад, біспецифічні, триспецифічні і таке інше), модифіковані з метою забезпечення зв'язування з двома або більше різними антигенами або з різними епітопами на одному антигені; молекули важкого ланцюга, приєднані до молекул 5сЕм і таке інше. 5сЕм відомі в даній галузі і описані, наприклад, у патенті США Мо 5892019. Крім того, термін "модифіковане антитіло" включає мультивалентні форми антитіл (наприклад, тривалентні, чотиривалентні і таке інше, антитіла, які зв'язуються з трьома або більше копіями одного і того ж антигену). У ще одному варіанті здійснення модифіковане антитіло за винаходом представляє злитий білок, що містить щонайменше частину одного важкого ланцюга, без домену СНІ, і містить зв'язувальний домен поліпептиду, що включає зв'язувальну ділянку одного члена пари рецептор-ліганд.

Термін "модифіковане антитіло" також може бути використаний у даному описі для позначення варіантів амінокислотних послідовностей антитіл за винаходом, як це в даному описі визначено. Фахівцю в даній галузі повинно бути зрозуміло, що антитіло може бути модифіковане з одержанням варіанта антитіла, яке змінене по амінокислотній послідовності в порівнянні з антитілом, з якого воно було одержане. Наприклад, можуть бути зроблені нуклеотидні або амінокислотні заміни, що приводять до консервативних замін або змін в "замінних" амінокислотних залишках (наприклад, у залишках СОМ і/або каркасній області).

Амінокислотні заміни можуть включати заміну однієї або більше амінокислот природною або неприродною амінокислотою. "Гуманізуючі заміни". Як у даному описі використовується, термін "гуманізуючі заміни"

Зо стосується амінокислотних замін, при яких амінокислотний залишок, присутній у визначеному положенні в області МН або Мі антитіла (наприклад, антитіла до ІЇ/-22К, одержаного з верблюдячого антитіла), заміняють амінокислотним залишком, який має місце в еквівалентному положенні в еталонній людській області МН або МІ. Еталонна область УН або Мі. людини може представляти область МН або Мі, кодовану зародковою лінією людини. Гуманізуючі заміни можуть бути зроблені в каркасних областях і/або СОЕК антитіл, описаних у даному документі. "Гуманізовані варіанти". Як у даному описі використовується, термін "гуманізований варіант" стосується варіанта антитіла, яке містить одну або більше "гуманізуючих замін" у порівнянні з еталонним антитілом, де ділянка еталонного антитіла (наприклад, область МН і/або МІ. або їх ділянки, що містять щонайменше один СОК) містить амінокислоту, одержану з "нелюдського" виду, і "гуманізуючі заміни" мають місце в амінокислотній послідовності, одержаній з "нелюдського" виду. "Варіанти зародкового типу" Як у даному описі використовується, термін "варіант зародкового типу" конкретно стосується "гуманізованих варіантів", у яких "гуманізуючі заміни" приводять до заміни одного або більше амінокислотних залишків, присутніх у визначеному положенні(ях) в області МН або Мі. антитіла (наприклад, анти-ЇЇ -22В-антитіла, одержаного від верблюда), на амінокислотний залишок, який має місце в еквівалентному положенні в еталонній людській області МН або МІ, кодованій зародковою лінією людини. Як правило, для будь-якого конкретного "варіанта зародкового типу" амінокислотні залишки, введені шляхом заміни у варіант зародкового типу, беруться винятково або переважно з однієї області МН або Мі, кодованої геном зародкової лінії людини. Терміни "гуманізований варіант" і "варіант зародкового типу" часто використовуються в даному описі взаємозамінно. Введення однієї або більше "гуманізуючих замін" в одержані від верблюда (наприклад, від лами) області МН або Мі. приводить до одержання "гуманізованого варіанта" області МН або Мі верблюда (лами). Якщо амінокислотні залишки, введені шляхом заміни, походять переважно або винятково з послідовності однієї області МН або МІ, кодованої зародковою лінією людини, то результатом може бути "варіант зародкової лінії людини" області МН або МІ, що походить від верблюда (лами). "Афінні варіанти". Як у даному описі використовується, термін "афінний варіант" стосується варіанта антитіла, яке має одну або більше змін в амінокислотній послідовності в порівнянні з бо еталонним антитілом, де афінний варіант проявляє змінену афінність до антигену-мішені в порівнянні з еталонним антитілом. Наприклад, афінні варіанти проявляють змінену афінність до

І/-22К у порівнянні з еталонним анти-ІЇ-22В-антитілом. Переважно афінний варіант буде демонструвати підвищену афінність до антигену-мішені, наприклад ІЇ/-22К, у порівнянні з еталонним антитілом. Афінні варіанти звичайно проявляють одну або більше змін в амінокислотній послідовності в СОК у порівнянні з еталонним антитілом. Такі заміни можуть приводити до заміни вихідної амінокислоти, присутньої у даному положенні в СОК, на інший амінокислотний залишок, який може являти собою залишок природної амінокислоти або залишок неприродної амінокислоти. Амінокислотні заміни можуть бути консервативними або неконсервативними. "Висока гомологія з людиною". Антитіло, що містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), буде вважатися таким, що має високу гомологію з антитілом людини, якщо області МН і Мі, узяті разом, проявляють щонайменше 90 9, ідентичність амінокислотної послідовності з найближчими співпадаючими послідовностями МН і МІ зародкової лінії людини. Антитіла, що мають високу гомологію з людиною, можуть включати антитіла, що містять області МН і МІ. нативних "нелюдських" антитіл, які мають досить високий ступінь ідентичності з послідовностями людської зародкової лінії, включаючи, наприклад, антитіла, що містять області МН і МІ звичайних верблюдячих антитіл, а також сконструйовані, зокрема гуманізовані варіанти або варіанти зародкового типу таких антитіл, а також "повністю людські" антитіла.

В одному варіанті здійснення область МН антитіла з високою гомологією з людиною може мати ідентичність амінокислотної послідовності або гомологію послідовності на рівні 80 95, або більше з однією або більше областями УН людини в каркасних областях ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. У ще одних варіантах ідентичність амінокислотної послідовності або гомологія послідовності між областю МН поліпептиду за винаходом і найближчою співпадаючою послідовністю області МН зародкової лінії людини може становити 8595, або більше, 9095, або більше, 95 95, або більше, 97 95, або більше або до 99 95, або навіть 100 95, .

В одному варіанті здійснення область МН антитіла з високою гомологією з людиною може включати одне або більше (наприклад, від 1 до 10) неспівпадінь амінокислотних послідовностей каркасних областей ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ ії ЕМК4, у порівнянні з найближчою співпадаючою послідовністю людського МН.

У ще одному варіанті здійснення область Мі. антитіла з високою гомологією з лординою може мати ідентичність послідовності або гомологію послідовності на рівні 80 95, або більше з однією або більше областями Мі людини в каркасних областях ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. У ще одних варіантах здійснення ідентичність амінокислотної послідовності або гомологія послідовності між областю МІ. поліпептиду за винаходом і найближчою співпадаючою послідовністю області МІ. зародкової лінії людини може становити 85 95, або більше, 90 95, або більше, 95 95, або більше, 97 95, або більше або до 99 95, , або навіть 100 95, .

В одному варіанті здійснення область Мі антитіла з високою гомологією з людиною може включати одне або більше (наприклад, від 1 до 10) неспівпадінь амінокислотних послідовностей каркасних областей ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ ії ЕМК4, у порівнянні з найближчою співпадаючою послідовністю людського МІ...

Перед аналізом відсоткової ідентичності послідовностей антитіла, що має високу гомологію з людиною, і областей МН і МІ. зародкової лінії людини, можна визначити канонічні складки, що дозволяють ідентифікувати сімейство сегментів зародкової лінії клітин людини, і ідентичну комбінацію канонічних складок для НІ і Н?2 або 11 ї 12 (і 3). Потім для оцінки гомології послідовностей вибирають член сімейства зародкової лінії людини, що характеризується найвищим ступенем гомології послідовності з варіабельною областю антитіла, що представляє інтерес. Канонічні класи гіперваріабельних петель 11, 12, І 3, НІ ї Н2 по класифікації Споїйіа можна визначити за допомогою прикладних біоінформаційних програм, які є загальнодоступними на мер-сторінці /мумли.Біоїп.огуд.ик/арз/споїпіа. піті.раде. Вимоги, пропоновані до ключових залишків, наведені у файлі даних програми. У зазначених файлах даних наведені положення ключових залишків з можливими амінокислотами в кожному положенні. Послідовність варіабельної області антитіла, що представляє інтерес, представлена у вигляді вхідних даних, і початково вона порівнюється з консенсусною послідовністю антитіла для нумерації по системі Кабраї. При виконанні аналізу канонічних складок використовується набір матриць ключових залишків, одержаних за допомогою автоматизованого методу, розробленого Магпіп апа Тпогпіоп (Магіїйп еї аї., у. Мої. Віої. 263:800-815 (1996)).

При наявності відомого М-сегмента зародкової лінії людини, у якому використана така ж комбінація канонічних складок для НІ і Н2 або І1 ї І2 (і 3), можна визначити найбільш бо співпадаючий член сімейства з точки зору гомології послідовності. Прикладні біоінформаційні програми дозволяють визначити відсоткову ідентичність амінокислотних послідовностей доменів МН і Мі каркасних областей антитіла, що представляє інтерес, і відповідних послідовностей, кодованих зародковою лінією людини, але фактично вирівнювання послідовностей також може бути виконане вручну. Послідовності імуноглобулінів людини можна ідентифікувати в декількох базах даних білків, таких як МВазе (пер://базе. тго-сре.сат.ас.ик/) або база даних Рінскіпип/Нопеддег (пЕр:/Лимли. ріос. підп. сп/апііроду/Зедцепсев/септіїпе5). Для порівняння людських послідовностей з М-областями доменів МН або Мі в антитілі, що представляє інтерес, може бути використаний алгоритм порівняння послідовностей, представлений на уер-сайтах, таких як м/млу.ехразу.спЛооіІ5/Жаїйдп, але вирівнювання з обмеженим набором послідовностей також може бути виконане вручну. Вибирають послідовності легких і важких ланцюгів зародкової лінії людини з сімейств з однаковими комбінаціями канонічних складок і з найвищим ступенем гомології з каркасними областями 1,2 і

З кожного ланцюга і порівнюють з варіабельною областю послідовності, що представляє інтерес; також порівнюють ЕКА з УН- і УК- або дІ-областями зародкової лінії людини.

Слід зазначити, що при обчисленні загальної відсоткової гомології послідовності залишки

ЕКТ, ЕК2 ії ЕКЗ оцінюють, використовуючи найбільш співпадаючу послідовність з сімейства зародкової лінії людини з ідентичною комбінацією канонічних складок. Оцінюють тільки залишки, що відрізняються від найбільш співпадаючих або інших членів сімейства з такою ж комбінацією канонічних складок (примітка: виключаючи будь-які відмінності, кодовані праймером). Однак з метою гуманізації залишки в каркасних областях, ідентичні членам інших сімейств зародкової лінії людини, що не містять однакової комбінації канонічних складок, можуть вважатися "людськими" незважаючи на "негативну" оцінку відповідно до вищеописаних строгих умов. Дане допущення основане на методі гуманізації "тіх апа таїсі", відповідно до якого кожну ЕК1, ЕК1, ЕКЗ і ЕК4 окремо порівнюють з найбільш співпадаючою послідовністю зародкової лінії людини, отже, гуманізована молекула містить комбінацію різних ЕК-областей, як було описано в публікаціях Ои і співавторів (Си еї аї., Сіїп. Сапсег Кев., 5:3095-3100 (1999)) і

Опо і співавторів (Опо еї аї., Мої. Іттипої. 36:387-395 (1999)). Границі окремих каркасних областей можуть бути визначені згідно з системою нумерації ІМОТ, яка є адаптованою системою нумерації Споїйіа (І еїтапс еї аІ., МАК, 27:209-212 (1999); пир//таї.сіпев.1ї).

Зо Антитіла, що мають високу гомологію з людиною, можуть включати гіперваріабельні петлі або СОМ, що містять людські або "людиноподібні" канонічні складки, докладно розглянуті нижче.

В одному варіанті здійснення винаходу щонайменше одна гіперваріабельна петля або СОР в області МН або області МІ. антитіла з високою гомологією з людиною може бути одержана або виділена з області МН або Мі антитіла, відмінного від людського, наприклад звичайного антитіла виду сімейства верблюдячих, проте має прогнозовану або фактичну канонічну складчасту структуру, яка по суті ідентична канонічній складчастій структурі в людських антитілах.

У даній галузі добре відомо, що, хоча основні амінокислотні послідовності гіперваріабельних петель в областях МН і областях МІ, кодованих зародковою лінією людини, по визначенню є високоваріабельними, усі гіперваріабельні петлі, за винятком СОК НЗ області МН, утворюють тільки декілька чітко виражених структурних конформацій, іменованих канонічними складками (Споїніа єї аї., У. Мої. Віої. 196:901-917 (1987); Ттатопіапо еї аї., Ргоївїп5, 6:382-94 (1989)), які залежать від довжини гіперваріабельної петлі і наявності так званих канонічних амінокислотних залишків (Споїпіа еї аїЇ., У. Мої. Віої. 196:901-917 (1987)). Фактичні канонічні структури гіперваріабельних петель в інтактних областях МН або Мі можна визначити з використанням структурного аналізу (наприклад, рентгенівською кристалографією), але також можна прогнозувати канонічну структуру з урахуванням ключових амінокислотних залишків, характерних для визначеної структури (більш докладно розглянутих нижче). По суті специфічний патерн залишків, що визначають кожну канонічну структуру, утворює "сигнатуру", яка дозволяє розпізнавати канонічну структуру в гіперваріабельних петлях області МН або МІ. з невідомою структурою; отже, канонічні структури можна прогнозувати на основі тільки первинної амінокислотної послідовності.

Прогнозовані канонічні складчасті структури для гіперваріабельних петель будь-якої даної послідовності МН або МІ. в антитілі, що має високу гомологію з людиною, можна аналізувати, використовуючи алгоритми, що Є загальнодоступними на сайтах мимли.ріоіїпт.огуд. иК/арз/споїпіа. літі, млум/.ріоспет.исі.ас.ик/"тапіп/апіїродіє5.пЕті і милими. ріос. ипі2гА.сп/апііроду/Зедцепсе5/зегтіїпе5/уразе ПМК.пПтІ. Зазначені програми дозволяють вирівнювати послідовності областей МН або МІ. з послідовностями областей УН або бо МІ людини, що мають відому канонічну структуру, і прогнозувати канонічну структуру гіперваріабельних петель запитуваної послідовності.

У випадку області МН петлі НІ ії Н?2 можуть бути оцінені як такі, що мають канонічну складчасту структуру, "по суті ідентичну" канонічній складчастій структурі в людських антитілах, якщо задовольняється щонайменше перший і переважно обидва наступні критерії: 1) довжина, визначувана числом залишків, ідентична найближчому співпадаючому класу канонічної структури людини; 2) щонайменше 3395, ідентичність, переважно щонайменше 50 95, ідентичність, з ключовими амінокислотними залишками, описаними для відповідних класів канонічних структур петель НІ Її Н2 (слід зазначити, що відповідно до цілей вищевказаного аналізу петлі НІ ї Н2 аналізують окремо і кожну петлю порівнюють з найближчим співпадаючим класом канонічної структури людини).

Вищевказаний аналіз оснований на прогнозуванні канонічної структури петель НІ ї Н2 антитіла, що представляє інтерес. Якщо фактичні структури петель НІ і НаО2 в антитілі, що представляє інтерес, відомі, наприклад у результаті проведення рентгенівської кристалографії, тоді петлі НІ ї Н2 в антитілі, що представляє інтерес, можуть бути оцінені як такі, що мають канонічну складчасту структуру, "по суті ідентичну" канонічній складчастій структурі, відомій в людських антитілах, якщо довжина петлі відрізняється від найближчого співпадаючого класу канонічної структури людини (звичайно на 1 або 4-2 амінокислоти), але фактична структура петель НІ і Н2 в антитілі, що представляє інтерес, відповідає канонічній складчастій структурі людини.

Ключові амінокислотні залишки, виявлені в класах канонічних структур людини для першої і другої гіперваріабельних петель областей МН людини (НІ і Н2), описані в публікації Споїйіа еїаї., 9. Мої. ВіоІ., 227:799-817 (1992), яка включена в даний опис в повному обсязі за допомогою посилання. Зокрема, у таблиці З на сторінці 802 публікації Споїйіа еї аї., яка включена в даний опис в повному обсязі за допомогою посилання, представлені переважні амінокислотні залишки в основних сайтах для канонічних структур НІ, виявлені в зародковій лінії людини, і в таблиці 4 на сторінці 803, яка також включена в даний опис в повному обсязі за допомогою посилання, представлені переважні амінокислотні залишки в ключових сайтах для канонічних структур СОК НЕ, виявлені в зародковій лінії людини.

Зо В одному варіанті здійснення винаходу НІ і Н2 в області МН антитіла, що має високу гомологію з людиною, мають прогнозовану або фактичну канонічну складчасту структуру, яка по суті ідентична канонічній складчастій структурі в людських антитілах.

Антитіла, що мають високу гомологію з людиною, можуть включати область МН, у якій гіперваріабельні петлі Ні і Н?2 утворюють комбінацію канонічних складчастих структур, ідентичну комбінації канонічних структур, відомих щонайменше в одній області МН зародкової лінії людини. Установлено, що тільки визначені комбінації канонічних складчастих структур НІ і

Н2 дійсно мають місце в областях МН, кодованих зародковою лінією людини. В одному варіанті здійснення винаходу петлі НІ і Н2 в області МН антитіла, що має високу гомологію з людиною, можуть бути одержані з області МН виду, відмінного від людини, наприклад виду сімейства верблюдячих, завдяки утворенню комбінації прогнозованих або фактичних канонічних складчастих структур, яка ідентична комбінації канонічних складчастих структур, відомих у зародковій лінії людини або в соматично мутованій області МН. У необмежувальних варіантах здійснення винаходу петлі НІ і Н2 в області МН антитіла, що має високу гомологію з людиною, можуть бути одержані з області МН виду, відмінного від людини, наприклад виду сімейства верблюдячих, завдяки утворенню однієї з наступних комбінацій канонічних складок: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 і 3-5.

Антитіло з високою гомологією з антитілом людини може містити область УН, яка демонструє високу ідентичність/гомологію послідовності з МН людини і містить гіперваріабельні петлі, що демонструють структурну гомологію з МН людини.

Переважно, щоб канонічні складки, присутні в петлях НІ ї Н2 області МН антитіла, що має високу гомологію з людиною, і їх комбінація були "правильними" для послідовності області МН у зародковій лінії людини, яка найбільш близько співпадає з областю МН антитіла, що має високу гомологію з людиною, з точки зору загальної ідентичності первинній амінокислотній послідовності. Як приклад можна відзначити, що, якщо послідовність найбільш близько співпадає з областю УНЗ зародкової лінії людини, то бажано, щоб петлі НІ і Н2 утворювали комбінацію канонічних складок, яка також має місце в області МНЗ3 людини. Це може бути особливо важливим у випадку антитіл, що мають високу гомологію з людиною, які були виділені від виду, відмінного від людини, наприклад у випадку антитіл, що містять області МН і мі, виділені зі звичайних верблюдячих антитіл, зокрема антитіл, що містять гуманізовані області УН 60 і М. верблюда.

Таким чином, в одному варіанті здійснення область МН анти-1ІІЇ-22В-антитіла з високою гомологією з людиною може мати ідентичність послідовності або гомологію послідовності на рівні 80 95, або вище, 85 95, або вище, 90 95, або вище, 95 95, або вище, 97 95, або вище або до 99 95, , або навіть 100 95, з людською областю УН у каркасних областях ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4, і на доповнення НІ і Н?2 у тому ж самому антитілі одержують з "нелюдської" області УН (наприклад, походять з виду сімейства верблюдячих), але утворюють комбінацію прогнозованих або фактичних канонічних складчастих структур, яка є такою ж, як і комбінація канонічних складок, яка, як відомо, має місце в природі в одній і тій же людській області МН.

У ще одних варіантах здійснення винаходу петлі 1 і 12 в області МІ антитіла, що має високу гомологію з людиною, одержують з області МІ. виду, відмінного від людини (наприклад, з області МІ. верблюда), і кожна має прогнозовану або фактичну канонічну складчасту структуру, яка по суті ідентична канонічній складчастій структурі в людських антитілах.

Як і у випадку областей МН, гіперваріабельні петлі областей Мі типів Млямбда і Мкаппа можуть утворювати обмежене число конформацій або канонічних структур, частково визначуваних довжиною і також наявністю ключових амінокислотних залишків у визначених положеннях канонічних структур.

В антитілі, що представляє інтерес, яке має високу гомологію з людиною, петлі! 1,12113, одержані з області МІ. виду, відмінного від людини, наприклад з виду сімейства верблюдячих, можуть бути оцінені як такі, що мають канонічну складчасту структуру, "по суті ідентичну" канонічній складчастій структурі, відомій в людських антитілах, якщо задовольняється щонайменше перший і переважно обидва наступні критерії: 1) довжина, визначувана числом залишків, ідентична найближчому співпадаючому класу канонічної структури людини; 2) щонайменше 3395, ідентичність, переважно щонайменше 5095, ідентичність, 3 ключовими амінокислотними залишками, описаними для відповідних класів канонічних структур петель 1 і 12 з репертуару Млямбда або Мкаппа (слід зазначити, що відповідно до цілей вищевказаного аналізу петлі І 1 і 2 аналізують окремо і кожну петлю порівнюють з найближчим співпадаючим класом канонічної структури людини).

Вищевказаний аналіз оснований на прогнозуванні канонічної структури петель!/1, І2 і ІЗ

Зо області МІ. антитіла, що представляє інтерес. Якщо фактична структура петель І1,І?2 і ІЗ відома, наприклад у результаті проведення рентгенівської кристалографії, тоді петлі!/1, І 213 в антитілі, що представляє інтерес, можуть бути оцінені як такі, що мають канонічну складчасту структуру, "по суті ідентичну" канонічній складчастій структурі, відомій в людських антитілах, якщо довжина петлі відрізняється від найближчого співпадаючого класу канонічної структури людини (звичайно на -1 або -2 амінокислоти), але фактична структура петель верблюда відповідає канонічній складчастій структурі людини.

Ключові амінокислотні залишки, виявлені в класах канонічних структур людини для СОК областей Млямбда і Мкаппа людини, описані в публікаціях Могеа еї аї!., Меїйоа5, 20:267-279 (2000); і Магінп еї аї., У. Мої. Віої., 263:800-815 (1996). Репертуар структур області Мкаппа людини також описаний у публікації Топтіїпзоп еї аЇ., ЕМВО 4. 14:4628-4638 (1995), і репертуар структур області Млямбда описаний у публікації У/ЛіПатзвз еї аї.,9. Мої. Віої., 264:220-232 (1996). Зміст усіх зазначених документів включений в даний опис за допомогою посилання.

Петлі!1 і 12 в області Мі. антитіла, що має високу гомологію з людиною, можуть утворювати комбінацію прогнозованих або фактичних канонічних складчастих структур, ідентичну комбінації канонічних складчастих структур, відомій в області Мі зародкової лінії людини.

У необмежувальних варіантах здійснення винаходу петлі І 1 і 12 в області Млямбда антитіла, що має високу гомологію з людиною (наприклад, антитіло, що містить область МІ, одержану від верблюда, або її гуманізований варіант), можуть утворювати одну з наступних комбінацій канонічних складок: 11-7, 13-7 (А, В, С), 14-7 (А, В), 12-11, 14-11 ї 12-12 (відповідно до визначення, наведеного в публікації МУМіШіате5 еї аї., У. Мої. ВіоїЇ., 264:220-32 (1996), і представлених на сайті пер:/Ллумлиу.ріос.и2п.сп/апіроду/зедцепсез/(зегтіїпе5//Вазе ПМ. пті).

У необмежувальних варіантах здійснення винаходу петлі /1 і 12 в області Мкаппа можуть утворювати одну з наступних комбінацій канонічних складок: 2-1, 3-1, 4-1 ії 6-1 (відповідно до визначення, наведеного в публікації Тотійпвоп ей а), ЕМВО .., 14:4628-38 (1995), і представлених на сайті пер:/Лумли. ріос.и21.сп/апіїроду/Зедіепсез/Сетптіїпез/УВазе НМК.пПІті).

У ще одному варіанті здійснення винаходу всі три петлі11,12 і ІЗ в області Мі. антитіла, що має високу гомологію з людиною, можуть мати по суті людську структуру. Переважно, щоб область Мі антитіла, що має високу гомологію з людиною, мала послідовність, що характеризується високою ідентичністю/гомологією з областю Мі людини, і щоб також 60 гіперваріабельні петлі в області МІ мали структуру, гомологічну області МІ людини.

В одному варіанті здійснення область МІ. анти-ІІ -22В-антитіла, що має високу гомологію з людиною, може мати ідентичність послідовності на рівні 80 95, або вище, 8595, або вище, 90 95, або вище, 95 95, або вище, 97 95, або вище або до 99 95, , або навіть 100 95, з областю

МІ. людини в каркасних областях ЕК1, ЕК2, ЕЕЗ і ЕРА, і, крім того, гіперваріабельна петля 1 1 і гіперваріабельна петля 12 можуть утворювати комбінацію прогнозованих або фактичних канонічних складчастих структур, яка є такою ж, як комбінація канонічних складок, яка, як відомо, зустрічається в природі в такій же області МІ. людини.

Звичайно, передбачається, що області МН, що мають високу ідентичність/гомологію послідовностей з областю МН людини і також структурну гомологію з гіперваріабельними петлями області МН людини, можуть бути об'єднані з областями Мі, що мають високу ідентичністьл'ломологію послідовності з областю Мі людини і також структурну гомологію з гіперваріабельними петлями області МІ людини, з утворенням антитіл, що характеризуються високою гомологією з людиною, які містять об'єднані пари МН/Л/. (наприклад, об'єднані пари

МНЛІ/Ї, одержані від верблюда), що мають максимальну гомологію послідовностей і структури з об'єднаними парами МНЛ/!. людини. "см" або "5зсЕм-фрагмент" о5сЕм або 5сЕм-фрагмент означає одноланцюжковий варіабельний фрагмент. 5сЕм представляє злитий білок області МН і області Мі. антитіла, з'єднаних через лінкер.

В. Анти-ІІ-22В-антитіла

Даний винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які специфічно зв'язуються з ІЇ/-22К людини. Анти-ІЇ-22В-антитіла і фрагменти антитіл, описані в даному документі, мають властивості, зокрема комбінації властивостей, які є відмітними і у деяких випадках переважаючими анти-1ІІЇ-22В-антитіла попереднього рівня техніки. Ці властивості і характеристики будуть тепер описані більш докладно.

Епітопи І -228

Анти-ІІ -22В-антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з епітопом у людському білку 1--22Е, який не містить амінокислотний залишок тирозину 60 (Тугбо або У60), де це амінокислотне положення визначене з посиланням на послідовність ІІ -22Н, показану на Фіг. 2 (ЗЕО ІЮО МО:71). Даний залишок 1--22К, що знаходиться на поверхні, раніше був ідентифікований як критично важливий для зв'язування ліганду і, як повідомляється в даному документі (див., зокрема, приклад 8) для анти-ІЇ-22В-антитіла попереднього рівня техніки 280.346.75У (як описано в МО 02011/01119), зв'язується з епітопом, що включає цей залишок. Несподівано було виявлено, що анти-ІЇ -22В-антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з епітопом, який не включає цей критичний залишок, і все ж таки в деяких варіантах здійснення вони здатні блокувати зв'язування 1-22 і/або інгібувати

І -22- і/або ІЇ-20-опосередкований сигнальний шлях через ІІ -228.

Поверхня поділу зв'язування позаклітинного домену 1Ї/-22К і його ліганду 1-22 охарактеризована в публікації допеб5 еї аї. (Зігисіиге, 16(9):1333-1344 (2008)), зміст якої в повному обсязі включений в даний опис за допомогою посилання. Позаклітинний домен 1-228 складається з п'яти петель (12-16), деякі залишки яких є ключовими для опосередкування взаємодії з залишками, що знаходяться на поверхні, на ліганді І--22. Тирозин 60 розташований у петлі 12, утвореній залишками в домені О1 білка І--22К. В І--22/розчинному комплексі ІІ -228 залишок ТугббО входить у невелику порожнину на 1І/-22, утворену в сайті 1а ліганду. Більш конкретно, ця порожнина утворюється на перетині спіралі Е і петлі АВ, двох окремих вторинних структур, виявлених у ліганді І--22. Залишки спіралі Е Гуз162 і бІй166 на ліганді утворюють водневі зв'язки з ОН Тубо 1/-22К і, таким чином, Тугб0О є ключовим залишком, опосередковуючим взаємодію між сайтом 1а на ліганді і доменом 01 рецептора.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному документі, зв'язуються з епітопом, який не містить ТугбО. Як відзначено вище, ТугбО знаходиться в петлі 12 у домені 01 рецептора. У деяких варіантах здійснення епітоп, з яким зв'язуються анти-ЇЇ -22В-антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, розташовується щонайменше частково в домені 02 1 -228, тобто між залишками 125 і 228 5ЕО ІО МО:71. У деяких варіантах здійснення, епітоп, з яким зв'язуються анти-іЇ-22В-антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, містить щонайменше один, щонайменше два, щонайменше три амінокислотні залишки, розташовані у домені 02 білка І -228.

Заявники даного винаходу вважають, що той факт, що антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з епітопом, який не містить ТугбО, має відношення до механізму їх дії. Передбачається, що антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти взаємодіють з доменом 02 І/222Е замість або на доповнення до взаємодії з доменом 01. 60 Відомо, що домен 02 ІЇ-22К бере участь у взаємодії з корецептором. Не бажаючи бути пов'язаними з теорією, заявники винаходу вважають, що молекули антитіл за даним винаходом можуть мати подвійний механізм дії, попереджуючи зв'язування з лігандом і попереджуючи взаємодію з корецептором.

Епітоп, з яким зв'язуються антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за винаходом, може бути лінійним епітопом (тобто епітопом, що складається з лінійної послідовності амінокислот на антигені-мішені) або конформаційним епітопом (тобто епітопом, що складається з амінокислот, які необов'язково є суміжними в антигені-мішені).

Афінність зв'язування

У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом зв'язуються з людським 1-22 з високою афінністю.

Як у даному описі використовується, термін "афінність" або "афінність зв'язування" слід розуміти, грунтуючись на звичайному значенні цього терміна в даній галузі в контексті зв'язування антитіла, і він відображує міцність і/або стабільність зв'язування між антигеном і сайтом зв'язування на антитілі або його антигензв'язувальному фрагменті.

Афінність зв'язування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента для його відповідного антигену можна визначити експериментально з використанням методів, відомих у даній галузі. Наприклад, за допомогою інструментів ВІАСОКЕ вимірюють афінність, на основі іммобілізації білка-мішені або антигену на біосенсорному чипі, у той час як антитіло або фрагмент антитіла пропускають над іммобілізованою мішенню при визначених умовах потоку.

Дані експерименти дають значення Коп і Коєх, які можуть бути переведені в значення Ко, де Ко представляє константу рівноваги дисоціації антигену і антитіла або його фрагмента. Чим нижче значення Ко, тим сильніше зв'язувальна взаємодія між антитілом і його антигеном-мішенню. Як відзначено вище, афінність антитіла може бути визначена Віасоге, наприклад, з використанням протоколу, описаного в даному документі в інших місцях (див. приклад 6). Афінність антитіла або антигензв'язувального фрагмента для людського ІЇ-22К, виміряна Віасоге, може бути визначена з використанням рекомбінантної повнорозмірної конструкції І/-22К, як описано, наприклад, у прикладах З і 6.

Анти-ІІ-22А-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть демонструвати швидкість дисоціації (Кох) для ІЇ/-22К нижче 2х103 с", нижче 1,5х103 с", нижче

Зо 1,2х103 с" при тестуванні у вигляді тАб, наприклад, коли афінність варіабельної області важкого ланцюга в парі з варіабельною областю легкого ланцюга тестується в контексті молекули дс1. У переважних варіантах здійснення анти-І!-22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом демонструють швидкість дисоціації (Кої) для

І/-22К нижче 2,5х107 с", переважно нижче 1,5х107 с", більш переважно нижче 1х107 с" при тестуванні у вигляді тАб, наприклад, коли афінність варіабельної області важкого ланцюга в парі з варіабельною областю легкого ланцюга тестується в контексті молекули Їдтс1.

Анти-ІІ -22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть проявляти швидкість дисоціації (Кок) для 1-22. у діапазоні від 1х106 с" до 2х103 с", переважно в діапазоні від їх105 с! до 2,5х107 с", більш переважно в діапазоні від 1х109 с" до 1х107 с.

Анти-ІЇ -22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть мати значення Ко нижче Зх109 М, нижче 2,5х109 М, нижче 1х109 М. У переважних варіантах здійснення анти-іІЇ-22В-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом мають значення Ко нижче 5х1079 М, переважно нижче 2х1079 М, переважно нижче 1,5х1079 М.

Інгібування зв'язування І! -22 і І--20 і сигнального шляху в напрямку 5-3"

У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом зв'язуються з людським 1І/-22К і інгібують зв'язування ліганду з цим рецептором. Це було особливо несподіваним з урахуванням того, що антитіла, описані в даному документі, зв'язуються з епітопом, який не містить Тугб0. Як описано вище, ТугбО був ідентифікований як залишок, ключовий для зв'язування ліганду, і тому анти-ЇЇ -22В-антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом викликають подив своєю здатністю інгібувати зв'язування ліганду і у деяких варіантах здійснення інгібувати сигнальний шлях ІІ -22Е. у напрямку 5-3".

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти можуть зв'язувати ІЇ/-22К людини і інгібувати зв'язування 1І-22 або інгібувати зв'язування 1-20. Переважно, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному документі, інгібують зв'язування 1І--22 і 11-20 з І -228.

Зв'язування ліганду з ІЇ-22К на клітинах, які експресують корецептор ІІ -10К2 або ІІ -2082, індукує конформаційну зміну в рецепторному комплексі, так що сигнальні шляхи в напрямку 5'-3' від рецептора активуються. Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному документі, можуть інгібувати ІІ -22-залежну активацію 1-22 або можуть інгібувати

І -20-залежну активацію ІЇ/-22К. Як у даному описі використовується, термін "І -22-залежна бо активація ІІ -22К" слід розуміти як ланцюг сигнальних подій, які мають місце в напрямку 5-3 від рецепторного комплексу 1-22 при зв'язуванні ліганду 1-22 з ІІ -228ЛІ-10К2. Як у даному описі використовується, термін "І-20-залежна активація ІІ -22К" слід розуміти як ланцюг сигнальних подій, які відбуваються в напрямку 5'-3' від І--22Е при зв'язуванні ліганду І--20 з комплексом

І -22вЛІ-20Н2.

І -22-залежна активація І/-22К може бути виміряна в клітинах або клітинних лініях, експресуючих 1(/-22К і корецептор І/-10К2, наприклад клітинній лінії ВМУ-НІІ!-22К, описаній в публікації Оитошіег еї аї. У. Віої. Спет., 2009 бер. 25; 284(39):26377-84, зміст якої в повному обсязі включений в даний опис за допомогою посилання. ІЇ-22 індукує зупинення росту в клітинній лінії ВМУ-пІІ -22К, і, отже, І -22-залежну активацію І/-22К можна визначити на даній клітинній лінії шляхом вимірювання проліферації клітин ВУМУ-НПІЇ-22К, наприклад, як описано в прикладі 6. У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному документі, демонструють ІСво (концентрація, при якій досягається 50 95, інгібування активації) в аналізі ІІ -22-залежної клітинної проліферації нижче 650 пМ, переважно нижче 600 пМ. Аналіз клітинної проліферації переважно являє собою аналіз, що включає клітинну лінію ВУМУ-ПІЇ -22К, як розкрито у даному описі.

І -20-залежна активація ІЇ-22Ех може бути виміряна на клітинах або клітинних лініях, експресуючих 1І/-22К і корецептор ІГ-20К2, наприклад клітинній лінії ВаїЗ-піЇ-22РЛІ 20, описаній в даному документі і також у публікації Оштошііег еї аїЇ. У Віої Спет. 2009 Зер 25; 284(39):26377-84, зміст якої в повному обсязі включений в даний опис за допомогою посилання.

І/-20 індукує проліферацію в клітинній лінії ВаїЗ-пі/-22КЛІ 206, і, отже, І -20-залежну активацію І/-22К можна визначити на цій клітинній лінії шляхом вимірювання проліферації клітин ВаїЗ-пІЇ -22КЛІ 20, наприклад, як описано в прикладі 6. У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному документі, демонструють ІСвзо (концентрація, при якій досягається 5095, інгібування активації) в аналізі ІІЇ-20-залежної клітинної проліферації нижче 1 нМ, переважно нижче 800 пМ. Аналіз клітинної проліферації переважно являє собою аналіз, що включає клітинну лінію ВаїЗ3-пІІЇ -22КЛІ 20, як розкрито у даному описі.

На доповнення до вищеописаних аналізів проліферації ІІ -22- і/або ІЇ-20-залежна активація

І/-22К може бути виміряна з використанням альтернативних клітинних аналізів, наприклад

Зо аналізу фосфорилування 5ТАТЗ, як описано в УМО 02011/01119.

У переважних варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з людським ЇЇІ--22К і інгібують як ІІ -22-залежну активацію ІІ--22К, так і І- 20-залежну активацію ІЇ/-221. У таких варіантах здійснення інгібуюча або "нейтралізуюча" активність антитіл або антигензв'язувальних фрагментів може бути еквіпотентною для ІЇ--22- і

І -20-залежної активації. Альтернативно, інгібуюча або нейтралізуюча активність антитіл або антигензв'язувальних фрагментів може бути вище для активації ІЇ-22Е, опосередкованої одним з лігандів, у порівнянні з активацією ІЇ/-22К, опосередкованою іншим лігандом. У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за винаходом проявляють більш високу інгібуючу активність для ІІ-22-залежної активації ІЇ/-22К у порівнянні з І -20- залежною активацією ІЇ/-22Е. Однак у таких варіантах інгібуюча активність антитіла або антигензв'язувального фрагмента для ІІ -22-залежної активації ІІ -22А звичайно буде менше ніж в 5 разів, переважно менше ніж в 4 рази вище, більш переважно менше ніж в 2 рази вище, ніж інгібуюча активність антитіла або антигензв'язувального фрагмента для І|-20-залежної активації І -228.

Перехресна реактивність

У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному документі, які зв'язуються з ІЇ-22К людини, можуть перехресно реагувати з одним або більше видовими гомологами ІІ -22К, наприклад гомологами 1І--22К приматів.

У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом не реагують перехресно з мишачим 1-22. Альтернативно або додатково, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть зв'язуватися з одним або більше гомологами 1 -2283 приматів, наприклад білками 1ІЇ/-22К від макака-резус і мавпи циномолгус. Перехресна реактивність з іншими видовими гомологами може бути особливо переважною при розробці і тестуванні терапевтичних антитіл. Наприклад, доклінічне токсикологічне дослідження терапевтичних антитіл часто проводиться на видах приматів, включаючи, не обмежуючись ними, макаків-резус і мавп циномогусє. Отже, перехресна реактивність з цими видовими гомологами може бути особливо переважною для розробки антитіл як кандидатів для застосування в клініці.

Антитіла, одержані від верблюда бо У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла або антигензв'язувальні фрагменти,

описані в даному документі, можуть містити щонайменше одну гіперваріабельну петлю або ділянку, що визначає комплементарність, одержану з області МН або області Мі. виду сімейства верблюдячих. Зокрема, антитіло або антигензв'язувальний фрагмент може містити області МН іабо МІ або їх СОК, одержані активною імунізацією аутбредних верблюдів, наприклад лами, антигеном 1--22Е або його фрагментом.

Вираз "гіперваріабельна петля або ділянка, що визначає комплементарність, одержана з області МН або Мі. виду сімейства верблюдячих" означає, що ця гіперваріабельна петля (НМ) або СОР має амінокислотну послідовність, яка ідентична або по суті ідентична амінокислотній послідовності гіперваріабельної петлі або СОМ, яка кодується геном імуноглобуліну виду сімейства верблюдячих. У цьому контексті "ген імуноглобуліну" включає гени зародкової лінії, гени імуноглобуліну, які піддалися перегрупуванню, і також соматично мутовані гени. Таким чином, амінокислотна послідовність НМ або СОЕ, одержана з області МН або Мі виду сімейства верблюдячих, може бути ідентична амінокислотній послідовності НМ або СОК, присутній у зрілому звичайному антитілі виду сімейства верблюдячих. Вираз "одержана з" у цьому контексті має на увазі структурний взаємозв'язок у тому розумінні, що НМ або СОК анти-1ІЇ -22В-антитіла втілюють амінокислотну послідовність (або її мінорні варіанти), яка початково кодувалася геном імуноглобуліну виду сімейства верблюдячих. Однак це не обов'язково означає конкретний взаємозв'язок відносно способу одержання, використовуваного для продукції антитіла до

І -228.

Одержані від верблюдів анти-іІЇ-22Р-антитіла можуть бути одержані від будь-яких видів верблюдів, включаючи, серед іншого, ламу, дромедара, альпака, вікунью, гуанако або верблюда.

Анти-ІІ -22В-антитіла, що містять області МН ії МІ, або їх СОК, одержані від верблюда, звичайно представляють рекомбінантно експресовані поліпептиди і можуть представляти химерні поліпептиди. Термін "химерний поліпептид" стосується штучного (що не зустрічається в природі) поліпептиду, який створюється зіставленням двох або більше пептидних фрагментів, які інакше не зустрічаються суміжними один з одним. У це визначення включені "видові" химерні поліпептиди, створені зіставленням пептидних фрагментів, кодованих двома або більше видами, наприклад верблюдом і людиною.

СОК, одержані від верблюда, можуть містити одну з послідовностей СОР, показаних в ЗЕО

ІО МО:6 і 13 (СОКЗ важкого ланцюга) або 5ЕО ІО МО:4 і 11 (СОК2 важкого ланцюга), або ЗЕО ІЮ

МО:2 і 9 (СОК1 важкого ланцюга), або одну з послідовностей СОК, показаних в 5ЕО ІЮ МО:20 і 27 (СОКЗ легкого ланцюга) або 5ЕО ІЮ МО':18, 25 і 47 (СОК2 легкого ланцюга), або 5ЕО ІЮ

МО:16 і 23 (СОК1 легкого ланцюга).

В одному варіанті здійснення повнорозмірну область МН і/або повнорозмірну область МІ можна одержати з виду сімейства верблюдячих. У конкретних варіантах здійснення область УН, одержана від верблюда, може містити амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО:29 і 31, тоді як область МІ, одержана від верблюда, може містити амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО:30, 32 і 62. Область МН, одержану від верблюда, і/або область МІ, одержану від верблюда, потім можна піддати генній інженерії білків, де одна або більше амінокислотних замін, інсерцій або делецій вводяться в амінокислотну послідовність верблюда.

Дані генно-інженерні зміни переважно включають амінокислотні заміни відносно послідовності верблюда. Такі зміни включають "гуманізацію" або "перетворення в послідовність зародкового типу", де один або більше амінокислотних залишків в області МН або МІ, кодованій верблюдом, замінені еквівалентними залишками з гомологічної області МН або МІ, кодованої людиною.

У деяких варіантах здійснення область МН, одержана від верблюда, може проявляти щонайменше 90, 95, 97, 98 або 99 95, ідентичність з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО:29 або 31. Альтернативно або додатково область МІ, одержана від верблюда, може проявляти щонайменше 90, 95, 97, 98 або 9995, ідентичність з амінокислотною

БО послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:30, 32 або 62.

Як основу для конструювання антигензв'язувальних поліпептидів за винаходом можна використовувати виділені області МН і МІ верблюда, одержані шляхом активної імунізації верблюда (наприклад, лами) людським антигеном 1ІІ-22К. Починаючи з інтактних областей МН і

МІ. верблюда, можна сконструювати одну або більше амінокислотних замін, інсерцій або делецій, які відходять від вихідної послідовності верблюда. У деяких варіантах здійснення такі заміни, інсерції або делеції можуть бути присутні у каркасних доменах області МН і/або області

МІ. Метою таких змін у первинній амінокислотній послідовності може бути зниження передбачувано несприятливих властивостей, наприклад, імуногенності у людини-хазяїна (так звана гуманізація), сайтів, що викликають потенційну гетерогенність продукту і/або 60 нестабільність (глікозилування, дезамідування, ізомеризація і таке інше), або для посилення деякої іншої сприятливої властивості молекули (наприклад, розчинності, стабільності, біодоступності і таке інше). У ще одних варіантах здійснення зміни в первинній амінокислотній послідовності можуть бути проведені в одній або більше гіперваріабельних петлях (або СОК) областей МН і/або МІ верблюда, одержаних активною імунізацією. Такі зміни можуть бути введені для посилення антигензв'язувальної афінності і/або специфічності або для зниження передбачувано несприятливих властивостей, наприклад, імуногенності у людини-хазяїна (так звана гуманізація), сайтів, що викликають потенційну гетерогенність продукту і/або нестабільність (глікозилування, дезамідування, ізомеризація і таке інше), або для посилення деякої іншої сприятливої властивості молекули, наприклад розчинності, стабільності, біодоступності і таке інше.

Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід стосується варіантного анти-1Ї-228- антитіла, яке містить щонайменше одну амінокислотну заміну щонайменше в одній каркасній області або СОК області УН або області МІ. у порівнянні з областю МН або Мі, одержаною від верблюда, приклади яких включають, не обмежуючись цим, області МН верблюда, що містять амінокислотні послідовності, показані в зЕО ІЮ МО:29 і 31, і області МІ верблюда, що містять амінокислотні послідовності, показані в ЗЕО ІО МО:30, 32 або 62.

У ще одних варіантах здійснення забезпечуються "химерні" молекули антитіла, що містять області МН і МІ, одержані від верблюда, і одну або більше константних областей з антитіла, відмінного від верблюдячого, наприклад константні області людини (або їх генно-інженерні варіанти). У таких варіантах здійснення переважно, щоб область МН і область МІ були одержані від одного і того ж виду сімейства верблюдячих, наприклад як МН, так і МІ. можуть походити від

Їата діата або обидва МН і Мі можуть походити від Гата расо5 (до введення змін в амінокислотну послідовність). У таких варіантах здійснення як область МН, так і область МІ. можуть бути одержані від однієї тварини, зокрема однієї тварини, яка активно імунізована антигеном І--228.

Як альтернатива генно-інженерним змінам у первинній амінокислотній послідовності верблюдячих областей МН і/або Мі, можуть бути виділені окремі верблюдячі гіперваріабельні петлі або СОК або їх комбінації з областей МН/Л/І верблюда і перенесені в альтернативну (тобто відмінну від верблюдячої) каркасну область, наприклад каркас МН//Ї людини,

Зо трансплантацією СОК. Зокрема, необмежувальні варіанти СОМ, що походять від верблюда, можуть бути вибрані з СОК, що мають амінокислотні послідовності, показані в зЗЕО ІЮ МО:6 і 13 (СОКЗ важкого ланцюга) або 5ЕО ІЮ МО:4 і 11 (СОК2 важкого ланцюга), або 5ЕО ІЮ МО:2 і 9 (СОКІ1 важкого ланцюга), або одну з послідовностей СОР, показаних в 5ЕО ІЮ МО:20 27 (СОКЗ легкого ланцюга) або ЗЕО ІЮ МО:18, 25 і 47 (СОК2 легкого ланцюга), або ЗЕО ІЮ МО:16 і 23 (СОВ1 легкого ланцюга).

Анти-ІІ -22В-антитіла, що містять області МН ії МІ, або їх СОК, одержані від верблюда, можуть мати різні варіанти здійснення, у яких присутні як область МН, так і область МІ. Термін "антитіло" використовується в даному описі в найбільш широкому розумінні і охоплює, не обмежуючись цим, моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), за умови, що вони проявляють відповідну імунологічну специфічність для білка І/-22К. Як у даному описі використовується, термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, ідентичні, за винятком можливих мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути присутні у незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, спрямованими проти одного антигенного сайта. Крім того, на відміну від препаратів звичайних (поліклональних) антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів) на антигені, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти або епітопа на антигені. "Фрагменти антитіла" включають частину повнорозмірного антитіла, як правило його антигензв'язувальну ділянку або варіабельну область. Приклади фрагментів антитіл включають

Раб, Раб, Е(аб)», біспецифічні фрагменти Рар і Ем, діатіла, лінійні антитіла, молекули одноланцюжкових антитіл, одноланцюжковий фрагмент варіабельної області (5сСЕм) і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл (див. публікацію Ноїїїдег апа Ниазоп,

Маїште Віоїесппої., 23:1126-36 (2005), зміст якої включений в даний опис за допомогою посилання).

У необмежувальних варіантах здійснення анти-іЇ -22В-антитіла, що містять області МН і Мі, або їх СОК, одержані від верблюда, можуть містити домени СНі іабо домени СІ, амінокислотна послідовність яких є повністю або по суті людською. Коли антигензв'язувальний 60 поліпептид за винаходом являє собою антитіло, призначене для терапевтичного застосування у людини, то типово для всієї константної області антитіла або щонайменше її частини мати повністю або по суті людську амінокислотну послідовність. Отже, одна або більше або будь-яка комбінація домену СНІ, шарнірної області, домену СН2, домену СНЗ їі домену СІ (і домену

СНА, якщо він присутній) може бути повністю або по суті людськими відносно її амінокислотної послідовності.

Переважно, домен СНІ, шарнірна область, домен СН2, домен СНЗ і домен СІ (і домен СНА4, якщо він присутній) можуть мати повністю або по суті людську амінокислотну послідовність. У контексті константної області гуманізованого або химерного антитіла або фрагмента антитіла термін "по суті людська" стосується амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 90 965, або щонайменше на 9295, , або щонайменше на 95 95,, або щонайменше на 97 95, ,, або щонайменше на 99 95, ідентична константній області людини. Термін "людська амінокислотна послідовність" у цьому контексті стосується амінокислотної послідовності, яка кодується геном імуноглобуліну людини, що включає гени зародкової лінії, реаранжовані і соматично мутовані гени. Винахід також стосується поліпептидів, що містять константні області "людської" послідовності, які були змінені в результаті однієї або більше амінокислотних інсерцій, делецій або замін відносно людської послідовності, за винятком тих варіантів, у яких явно необхідна присутність "повністю людської" шарнірної області.

Наявність "повністю людської" шарнірної області в анти-ІЇ-22В-антитілах за винаходом може бути корисною як для зведення до мінімуму імуногенності, так і для оптимізації стабільності антитіла. Як обговорюється в даному описі в інших місцях, передбачається, що одна або більше амінокислотних замін, інсерцій або делецій можуть бути зроблені в константній області важкого і/або легкого ланцюга, зокрема в Ес-області. Амінокислотні заміни можуть привести до заміни заміщеної амінокислоти іншою природною амінокислотою або неприродною або модифікованою амінокислотою. Також допускаються інші структурні модифікації, наприклад, такі як зміни в патерні глікозилування (наприклад, додаванням або делецією сайтів, пов'язаних з М- або О-глікозилуванням). Залежно від передбачуваного застосування антитіла може бути бажаним модифікувати антитіло за винаходом відносно його зв'язувальних властивостей з Ес-рецепторами, наприклад, для модуляції ефекторної функції. Наприклад, залишок(и) цистеїну може бути введений в Ес-область, тим самим забезпечуючи утворення

Зо міжланцюжкового дисульфідного зв'язку в цій області. Гомодимерне антитіло, одержане таким чином, може мати підвищену здатність до інтерналізації і/або підвищену комплемент- опосередковану клітинну загибель і антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОС). (Див. Сагоп еї аї., У. Ехр. Медй., 176:1191-1195 (1992); і Зпоре5 В.). Іттипої., 148:2918-2922 (1992)). Винахід також стосується імунокон'югатів, що містять антитіло, як у даному описі розкрито, кон'юговане з цитотоксичним агентом, таким як хіміотерапевтичний агент, токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження або його фрагменти) або радіоактивний ізотоп (наприклад, радіокон'югат). Ес-області також можуть бути сконструйовані для подовження періоду напіврозпаду, як описано в публікації Спап апа Сапег, Майшге Веміємв: Іттипоіоду, Мо!/.10, рр. 301-316, 2010, включеній в даний опис за допомогою посилання.

У ще одному варіанті здійснення Ес-область модифікована для збільшення здатності антитіла опосередковувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС) і/або підвищення афінності антитіла до рецептора Есу модифікацією однієї або більше амінокислот.

В альтернативних варіантах здійснення Ес-область може бути сконструйована таким чином, що ефекторна функція відсутня. Анти-ІЇ -22В-антитіло, що не має ефекторної функції Ес, може бути особливо придатне як агент, блокуючий рецептор. У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом можуть мати Ес-область, одержану з ізотипів (ДС, що зустрічаються в природі, які мають знижену ефекторну функцію, наприклад Ідс4. Есо-області, одержані з Ід4, можуть бути додатково модифіковані для підвищення терапевтичної застосовності, наприклад, введенням модифікацій, які мінімізують обмін плечима між молекулами Ідса4 іп мімо.

У ще одному варіанті здійснення модифіковане глікозилування антитіла. Наприклад, може бути одержане неглікозиловане антитіло (тобто в антитілі відсутнє глікозилування).

Глікозилування може бути змінене, наприклад, для підвищення афінності антитіла до антигену- мішені. Такі модифікації вуглеводів можуть бути виконані, наприклад, зміною одного або більше сайтів глікозилування в послідовності антитіла. Наприклад, можуть бути зроблені одна або більше амінокислотних замін, які приводять до елімінації одного або більше сайтів глікозилування каркаса варіабельної області, щоб тим самим елімінувати глікозилування в цьому сайті. Таке деглікозилування може підвищити афінність антитіла до антигену.

Також даний винахід стосується варіантних анти-ІЇ-22В-антитіл, що мають змінений тип бо глікозилування, таких як гіпофукозиловане антитіло, що має менші кількості фукозильних залишків, або повністю або частково дефукозиловане антитіло (як описано Маїзите еї а!., Огид

Резідп ОємеіІортепі апа Тнегару, Мої.3, рр. 7-16, 2009), або антитіло, що має підвищене число бісекторних структур СсСісМас. Було показано, що такі змінені патерни глікозилування підвищують активність АОСС антитіл, забезпечуючи, як правило, 10-кратне підвищення АЮСС відносно еквівалентного антитіла, що містить "нативну" Ес-область людини. Такі модифікації вуглеводів можуть бути виконані, наприклад, експресією антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим ферментативним механізмом глікозилування (як описано Матапе-ОНпикі апа Заюй, тАбрз 13, 230-236, 2009). Прикладами нефукозилованих антитіл з підвищеною функцією АОСС є антитіла, які одержані з використанням технології Роїеїйїїдепі м Віоума Іпс.

Винахід у визначених варіантах здійснення може включати химерні верблюдячі/людські антитіла, зокрема химерні антитіла, у яких області МН і Мі мають повністю верблюдячу послідовність (наприклад, лами або альпака), і частина антитіла, що залишилася, має повністю людську послідовність. Анти-ІЇ-22НА-антитіла можуть включати антитіла, що містять "гуманізовані" варіанти або варіанти "зародкового типу" областей МН і Мі, або їх СОК, одержаних від верблюда, і химерні верблюдячі/людські антитіла, у яких області УН і МІ. містять одну або більше амінокислотних замін у каркасних областях у порівнянні з верблюдячими областями МН і МІ, одержаними активною імунізацією верблюда антигеном 1-22 або його фрагментом. Така "гуманізація" збільшує відсоткову ідентичність послідовності з областями МН або МІ. зародкової лінії людини, у результаті заміни неспівпадінь амінокислотних залишків у вихідній верблюдячій області МН або Мі. еквівалентним залишком, знайденим в області МН або

МІ. зародкової лінії людини.

Анти-ІІ -22АВ-антитіла також можуть представляти СОК-прищеплені антитіла, у яких СОК (або гіперваріабельні петлі), одержані з антитіла верблюда, або інакше кодовані геном верблюда, пересаджені на каркас МН і Мі. людини, і інша частина антитіла також має повністю людське походження. Такі СОК-прищеплені анти-ІЇ-22Н-антитіла можуть містити СОК, що мають амінокислотні послідовності, показані в зЗЕО ІЮ МО:6 і 13 (СОКЗ важкого ланцюга) або

ЗЕО ІЮ МО:4 і 11 (СОК2 важкого ланцюга), або ЗЕО ІЮ МО:2 і 9 (СОК1 важкого ланцюга), або одну з послідовностей СОК, показаних в ЗЕО ІЮ МО:20 і 27 (СОКЗ легкого ланцюга) або ЗЕО ІЮ

МО:18, 25 і 47 (СОК2 легкого ланцюга), або ЗЕО ІЮ МО:16 і 23 (СОКІ1 легкого ланцюга).

Зо Гуманізовані, химерні і СОК-прищеплені І/-22К антитіла, як описано вище, зокрема антитіла, що містять гіперваріабельні петлі або СОР, одержані активною імунізацією верблюда, можна легко одержати з використанням звичайних методів рекомбінантної ДНК і методів експресії з використанням прокаріотичних і еукаріотичних клітин-хазяїнів, які сконструйовані для одержання поліпептиду, що представляє інтерес, і включають, не обмежуючись цим, бактеріальні клітини, дріжджові клітини, клітини ссавців, клітини комах, рослинні клітини, деякі з яких описані у даному документі і ілюстровані в супровідних прикладах.

Одержані від верблюда анти-ІЇ -22В-антитіла включають варіанти, у яких гіперваріабельна петля(ї) або СОК області МН і/або області МІ одержані зі звичайного верблюдячого антитіла, продукованого проти людського ІЇ-22К, але де щонайменше одна з зазначених (одержаних від верблюда) гіперваріабельних петель або СОЕ була сконструйована таким чином, щоб включати одну або більше амінокислотних замін, додавань або делецій відносно послідовності, кодованої верблюдом. Такі зміни включають "гуманізацію" гіперваріабельних петель/СОК. Одержані від верблюда НМ/СОК, які були сконструйовані таким чином, що вони можуть як і раніше мати амінокислотну послідовність, яка "по суті ідентична" амінокислотній послідовності НМ/СОК, кодованих верблюдом. У цьому контексті "суттєва ідентичність" може допускати не більше однієї або не більше двох амінокислотних послідовностей, що не співпадають з НМ/СОК, кодованими верблюдом. Конкретні варіанти здійснення анти-ЇЇ-22В-антитіла можуть містити гуманізовані варіанти послідовностей СОК, показаних в 5ЕБЕО ІЮ МО:б і 13 (СОКЗ важкого ланцюга) або 5БЕО ІЮ МО:4 і 11 (СОК2 важкого ланцюга), або 5ЕО ІЮ МО:2 і 9 (СОК1 важкого

БО ланцюга), або одну з послідовностей СОК, показаних в 5ЗЕО ІЮ МО:20 і 27 (СОКЗ легкого ланцюга) або 5ЕО ІЮО МО:18, 25 і 47 (СОМК2 легкого ланцюга), або БЕО ІЮ МО:16 і 23 (СОК1 легкого ланцюга).

Анти-ІІ -22АВ-антитіла, одержані від верблюда, можуть належати до будь-якого ізотипу.

Антитіла, призначені для терапевтичного застосування у людини, звичайно належать до типу

Ід, дО, ЧЕ Ідс, ІдМ, часто типу Ідс, і в цьому випадку вони можуть належати до будь-якого з чотирьох підкласів ЇДС1, Ідсга і Ідо26, доз або Ідс4і. У кожному з цих підкласів допускається виконання однієї або більше амінокислотних замін, інсерцій або делецій в Ес-області або виконання інших структурних модифікацій, наприклад, для посилення або зниження Ес- залежних функціональних властивостей. 60 Переважні анти-1ІІ -22В-антитіла - 230С9 і 22355, і антитіла, пов'язані з ними

Переважними анти-1Ї-22В-антитілами і їх антигензв'язувальними фрагментами за даним винаходом є гуманізовані варіанти і варіанти зародкового типу антитіл, одержаних від верблюда, описаних у даному документі. Гуманізовані варіанти і варіанти зародкового типу демонструють високу гомологію з антитілом людини і переважно проявляють високу гомологію з молекулами людського дО, більш переважно ІдсС1. У деяких варіантах здійснення переважні анти-ІЇ-22В-антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом містять гіперваріабельні петлі або СОК, що мають людські або "людиноподібні" канонічні складки, як у даному описі розкрито в інших місцях.

Переважні анти-ІЇ-22Н-антитіла за даним винаходом можуть мати ідентичність амінокислотної послідовності на рівні 93 95, або вище з однією або більше областями. УН людини, зокрема у каркасних областях ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. Альтернативно або додатково, переважні анти-ІЇ -22В-антитіла можуть проявляти ідентичність амінокислотної послідовності на рівні 96 95, або вище з однією або більше областями Мі. людини, зокрема у каркасних областях

ЕК, ЕК2, ЕКЗ ї ЕК4. Переважні анти-ІІ-22РН-антитіла за даним винаходом можуть мати ідентичність амінокислотної послідовності на рівні 9395, або вище з однією або більше областями МН людини і ідентичність об'єднаної амінокислотної послідовності на рівні 93 95, або вище з однією або більше областями МН людини і однією або більше областями Мі. людини, зокрема, у тому випадку, коли ідентичність послідовності визначається каркасними областями.

За рахунок високої гомології з антитілом людини переважні анти-ЇЇ-22В-антитіла, представлені в даному описі, проявляють низьку імуногенність, що було оцінено з використанням платформи ЕІразе"М від Іопла (оцінка гена ОРВ-1), використовуючи настроювання "НГА сіабз5 І - Сайсазіап м3.0". У деяких варіантах здійснення анти-1ІЇ-228- антитіла за винаходом мають бал ОКВ-1 нижче 950, переважно нижче 850, більш переважно нижче 750, найбільш переважно нижче 650.

Переважними анти-1ІІ -22В-антитілами за винаходом є моноклональні антитіла, що містять шарнірну область, домен СН2 і домен СНЗ з людського дС, переважно ІдсС!1. У деяких варіантах здійснення Ес-область моноклонального антитіла не має ефекторної функції, тобто є нульовою Ес. Це особливо вигідно для терапевтичних блокувальних антитіл.

Переважні анти-ІЇ-22НА-антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом демонструють комбінацію властивостей, які роблять їх вдосконаленими анти-1ЇЇ -22В-антитілами, у порівнянні з описаними на попередньому рівні техніки. Переважні анти-1Ї-22В-антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть проявляти наступну комбінацію властивостей: (ї) зв'язування з епітопом у білку І -22К, який не містить Тугбо; (і) зв'язування з епітопом, який розташований щонайменше частково у домені 02 білка ІІ - 228; (ії) висока афінність зв'язування з І -22К людини; (ім) інгібування ІІ -22-залежної активації ІІ -22К і Ії -20-залежної активації ІІ -228; (м) відсутність перехресної реактивності з мишачим 1І--22Е; і (м) перехресна реактивність з ІІ -22Е макака-резус і/або мавпи циномолгус.

Переважні анти-ІЇ-22В-антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з епітопом, який не містить ключовий залишок Тугб0. Переважні анти-ІІЇ-22Н-антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з епітопом, який розташований щонайменше частково в домені 02 1Г/-22К, де домен 02 знаходиться від амінокислоти 125 до амінокислоти 228 у послідовності 560 ІЮ МО:71.

Переважні анти-ІЇ-22Н-антитіла за винаходом можуть також зв'язуватися з ІЇ-22К людини з високою афінністю, звичайно проявляючи швидкість дисоціації (де Ког вимірюється Віасоге) для людського ІІ -228 на рівні нижче 2,5х107 с" при вимірюванні у вигляді тАБб. У деяких варіантах здійснення переважні анти-ІЇ-22В-антитіла за винаходом зв'язуються з людським 1/-22К з високою афінністю, проявляючи швидкість дисоціації (де Кої вимірюється Віасоге) для

БО людського І/-22Е у діапазоні від їх105 с до 2,5х107 с!. У деяких варіантах здійснення переважні анти-їЇІЇ -22В-антитіла за винаходом зв'язуються з людським І-22К, що має значення

Ко нижче 5х1079 М.

Переважні анти-ІЇ -22В-антитіла можуть також інгібувати ІІ -22- і І -20-залежну активацію Ії - 22 і, як правило, проявляють інгібуючу активність для ІІ -20-залежної активації, яка не менше ніж в чотири рази вище, ніж інгібуюча активність, що проявляється для ІЇ -22-залежної активації.

Переважні анти-1ІЇ -22В-антитіла можуть зв'язуватися з людським 1 -22К з високою афінністю і перехресно реагувати з видовими гомологами 1І-22ЕК. від макака-резус і мавпи циномолгус, але не реагують перехресно з мишачим І -228.

У деяких варіантах здійснення переважні антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним бо винаходом містять щонайменше одну варіабельну область важкого ланцюга (УН) і щонайменше одну варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де область МН містить:

СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ІМОЕ5ОТУМУ5ЕЗ5І, ЗЕО ІЮ МО:6,

СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ІЗІММОАЗМТАУЗОЗМКОЇ, ЗЕО І МО:36,

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ІЗМОММІ, ЗЕО ІЮ МО:34, і область Мі. містить:

СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності |(0505555МАМІ|, ЗЕО ІЮО МО:54,

СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності |(ЗОММАКРБІ, ЗЕО 1О МО:47,

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності |(ОС( УМАНІ, ЗЕО 1О МО:16.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, що мають послідовності СОК області МН і МІ, як визначено вище, можуть містити область УН, що містить або складається з послідовності

ЗЕО ІЮ МО:63, і/або область МІ, що містить або складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО:64.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, де варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність МН щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 9995, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО І

МО:63, і/або варіабельна область легкого ланцюга містить МІ щонайменше з 85 965, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 9595, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:64. Для варіантів здійснення, де області антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною відсотковою ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, області МН

Зо мМабо Мі можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки в каркасних областях.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, що мають послідовності СОК області МН і МІ, як визначено вище, можуть містити повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну, що містить або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО:67, і/або повнорозмірний легкий ланцюг імуноглобуліну, що містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:68.

У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 9995, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ

МО:67, і/або легкий ланцюг щонайменше з 85 95, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:68. Для варіантів здійснення, де ланцюги антитіл визначаються конкретною відсотковою ідентичністю з еталонною послідовністю, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки поза ділянками СОК.

У деяких варіантах здійснення переважні антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом містять щонайменше одну варіабельну область важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де область МН містить:

СОМЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності |РРОРЕКАНУМСАКУЇ, ЗЕО ІЮ МО:43,

СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (СІНІЗССІТУУТОЗМУКОЇ, ЗЕО ІЮ МО:41,

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ЗМЕМ5І, ЗЕО ІЮ МО:9, і область Мі. містить:

СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності ( АБУКІ МАБУМІ, ЗЕО ІЮ МО:27,

СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної 60 послідовності (ЕММКА5З5І, 5ЕО ІО МО:59,

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ГТ ЗБОІОЗУМУМ5І, ЗЕО ІЮ МО:57.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, що мають послідовності СОК області МН і МІ, як визначено вище, можуть містити область МН, що містить або складається з послідовності зФЕО

ІО МО:65, і/або область МІ, що містить або складається з послідовності ФЕО ІЮ МО:66. У деяких варіантах здійснення даного винаходу забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, де варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність МН щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 9595, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЗЕО ІЮ МО:65, і/або варіабельна область легкого ланцюга містить Мі щонайменше з 85 95, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО:66. Для варіантів здійснення, де області антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною відсотковою ідентичністю послідовності з еталонною послідовністю, області МН і/або МІ можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки в каркасних областях.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, що мають послідовності СОК області МН і МІ, як визначено вище, можуть містити повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну, що містить або складається з амінокислотної послідовності «56 ІЮ МО:69, і/або повнорозмірний легкий ланцюг імуноглобуліну, що містить або складається з амінокислотної послідовності 560 ІЮ

МО:70. У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 8595, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 9995, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ

МО:69, і/або легкий ланцюг щонайменше з 85 95, ідентичністю послідовності або щонайменше з 90 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 95 95, ідентичністю послідовності, або щонайменше з 97, 98 або 99 95, ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:70. Для варіантів здійснення, де ланцюги антитіл визначаються конкретною відсотковою ідентичністю з еталонною послідовністю, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг можуть зберігати ідентичні послідовності СОК з тими, які присутні в еталонній послідовності, так що варіація присутня тільки поза ділянками СОК.

Перехресно конкуруючі антитіла

Даний винахід також включає (моноклональні) антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які "перехресно конкурують" з антитілами або антигензв'язувальними фрагментами, описаними в даному документі.

Зокрема, забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з цитокіновим рецептором І/-22К і перехресно конкурують з антитілами або їх антигензв'язувальними фрагментами, що містять комбінацію СОКЗ (НСОКЗ) варіабельної області важкого ланцюга, СОМК2 (НСОК2) варіабельної області важкого ланцюга і СОК!1 (НСОКТ) варіабельної області важкого ланцюга, СОКЗ (І СОКЗ) варіабельної області легкого ланцюга, СОК2 (І СОК2) варіабельної області легкого ланцюга і СОК1І (СОМ) варіабельної області легкого ланцюга, де комбінація вибрана з групи, що включає: () НСОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО:43; НСОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО:41; НОСОК, що містить

ЗЕО І МО:9; І СОКЗ, що містить БЕО ІЮ МО:27; І СОМК2, що містить 5ЕО ІЮ МО:59; ГСОК1, що містить ЗЕО ІЮ МО:57; а також (ї) НСОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО:13; НСОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО:11; НСОКТ, що містить

БО ЗЕО ІЮО МО:9; І СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО:27; І СОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО:25; І СОК1, що містить БЕО ІЮ МО:23.

У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з цитокіновим рецептором 1-22ЕК. і перехресно конкурують з антитілами або їх антигензв'язувальними фрагментами, що містять щонайменше одну варіабельну область важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де область МН містить:

СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності |РРОРЕКАНУМСАКУЇ, ЗЕО ІЮ МО:43,

СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної 60 послідовності (СІНІЗССІТУУТОЗМУКОЇ, ЗЕО ІЮ МО:41,

Зо

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ЗМЕМ5І, ЗЕО ІЮ МО:9, і область Мі. містить:

СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності ( АБУКІ МАБУМІ, ЗЕО ІЮ МО:27,

СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ЕММКА5З5І, 5ЕО ІО МО:59,

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить або складається з амінокислотної послідовності (ГТ ЗБОІОЗУМУМ5І, ЗЕО ІЮ МО:57.

Перехресно конкуруючі антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть конкурувати з антитілами або антигензв'язувальними фрагментами, які мають область МН, що містить або складається з послідовності зЕО ІЮ МО:65, і/або область Мі, що містить або складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО: 66. Перехресно конкуруючі антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть конкурувати з антитілами, які мають повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну, що містить або складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:69, і/або повнорозмірний легкий ланцюг імуноглобуліну, що містить або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО:70.

У контексті даного винаходу перехресно конкуруючі антитіла представляють антитіла, які зв'язуються з ІІЇ-22К у сайті (сайтах), який перекривається або ідентичний сайту (сайтам), у якому зв'язуються анти-ІЇ-22Н-антитіла за даним винаходом. Конкуруючі (моноклональні) антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть бути ідентифіковані, наприклад, за допомогою конкурентного аналізу антитіл. Наприклад, антиген І-22Е. або його фрагмент можна зв'язати з твердою підкладкою. Потім додають антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за даним винаходом і моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які передбачувано можуть конкурувати з антитілом за винаходом. Одна з двох молекул мічена. Якщо мічена сполука і немічене антитіло зв'язуються з різними і дискретними сайтами на антигені ІІ -22ЕК, то мічена сполука буде зв'язуватися з тим же рівнем незалежно від присутності або відсутності передбачуваної конкуруючої сполуки. Однак, якщо сайти їх взаємодії ідентичні (або перекриваються), то немічена сполука буде конкурувати, і кількість

Зо міченої сполуки, зв'язаної з антигеном, буде зменшуватися. Якщо немічена сполука присутня в надлишку, то дуже невелика кількість, якщо така буде, міченої сполуки буде зв'язуватися. Для цілей даного винаходу конкуруючими моноклональними антитілами або (їх антигензв'язувальними фрагментами є ті, які зменшують зв'язування антитіл за даним винаходом з 1-22 приблизно на 50 95, , приблизно 60 95, , приблизно 70 95, , приблизно 80 9б,, приблизно 8595, , приблизно 9095, , приблизно 9595, або приблизно 9995, . Докладна інформація про процедури проведення таких конкурентних аналізів добре відома в даній галузі і може бути знайдена, наприклад, у монографії Нагпіому/ апа І апе (1988), Апіібодієв5, А І абогафгу

Мапиаї, Соїа ріпа Нагбог І арогаюгу Ргевз5, Соїй бргіпу Нагрог, Мем Моїк, радез 567-569, ІЗВМ 0-87969-314-2. Такі аналізи можуть бути виконані в кількісному варіанті з використанням очищених антитіл. Стандартна крива будується титруванням одного антитіла проти самого себе, тобто одне і те ж антитіло використовується як мічене антитіло і його конкурент. Титрують здатність неміченого конкурентного моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента інгібувати зв'язування міченої молекули з планшетом. За результатами будують графік, ії порівнюються концентрації, необхідні для досягнення бажаного ступеня інгібування зв'язування.

Полінуклеотиди, кодуючі анти-ЇІЇ -22В-антитіла

Винахід також забезпечує полінуклеотидні молекули, кодуючі анти-ІЇ-22В-антитіла за винаходом або їх фрагменти, і також експресійні вектори, які містять зазначені нуклеотидні послідовності за винаходом, функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями, які забезпечують експресію антитіл або їх фрагментів у клітині-хазяїні або безклітинній експресійній системі, і клітину-хазяїна або безклітинну експресійну систему, що містить цей експресійний вектор.

У конкретних варіантах здійснення полінуклеотид, кодуючий анти-іІЇ-22В-антитіло за винаходом, може містити одну або більше полінуклеотидних послідовностей, показаних в ЗЕО

ІО МО:52, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 або 81, де такі послідовності кодують області МН або МІ. анти-ІЇ -22В-антитіл.

У деяких варіантах здійснення полінуклеотид, кодуючий анти-ЇЇ -22В-антитіло за винаходом, може містити варіантну послідовність, яка кодує функціональну область МН або МІ. анти-1ІІ -228- антитіла, де зазначена варіантна послідовність має щонайменше 80, 85, 90, 95, 97 або 99 95, 60 ідентичність послідовності при оптимальному вирівнюванні з будь-якою з ЗЕО ІЮО МО:52, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80 або 81.

У цьому контексті відсоткову ідентичність послідовності між двома полінуклеотидними послідовностями можна визначити порівнянням цих двох послідовностей, які вирівняні оптимальним чином і в яких полінуклеотидна послідовність, що підлягає порівнянню, може містити додавання або делеції відносно еталонної послідовності для оптимального вирівнювання між цими двома послідовностями.

Відсоток ідентичності обчислюється визначенням числа ідентичних положень, для яких нуклеотидний залишок ідентичний між двома послідовностями, діленням цього числа ідентичних положень на загальне число положень у вікні порівняння і множенням одержаного результату на 100, з одержанням відсотка ідентичності між цими двома послідовностями.

Наприклад, можна використовувати програму ВІ А5Т, "ВІ А5Т 2 зедпиепсез" (Тай5зома апа аї., "ВіІаві 2 зедиепсев - а пем/ 00! ог сотрагіпа ргоївіп апа писіеоїіде зедоепсев", РЕМ5 Місгобіо!

Гей. 174:247-250), що доступна на сайті пЕр:/Лумлиу. побрі. піт. піпй.дом/догі/БІ2.піті, з параметрами за замовчуванням (зокрема, для параметрів "штраф за створення пробілу": 5, і "штраф за подовження пробілу": 2; де вибраною матрицею є, наприклад, матриця "ВГОЗИОМ 62", запропонована програмою), відсоток ідентичності між двома послідовностями, які потрібно порівняти, обчислюється безпосередньо програмою.

У деяких варіантах здійснення варіабельна область важкого ланцюга і варіабельна область легкого ланцюга анти-ІЇ-22В-антитіла або антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом кодуються комбінацією першої і другої полінуклеотидних послідовностей, де перша і друга полінуклеотидні послідовності вибрані з наступних пар: () перший полінуклеотид, кодуючий варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО

ІО МО:52, і другий полінуклеотид, кодуючий варіабельну область легкого ланцюга, що містить

ЗЕО ІЮ МО:73; (і) перший полінуклеотид, кодуючий варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО

ІО МО:74, і другий полінуклеотид, кодуючий варіабельну область легкого ланцюга, що містить

ЗЕО ІЮ МО:75; (ії) перший полінуклеотид, кодуючий варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО

ІО МО:76, і другий полінуклеотид, кодуючий варіабельну область легкого ланцюга, що містить

Зо ЗЕО І МО:77; (ім) перший полінуклеотид, кодуючий варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО

ІО МО:78, і другий полінуклеотид, кодуючий варіабельну область легкого ланцюга, що містить

ЗЕО ІЮ МО:79; або (м) перший полінуклеотид, кодуючий варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО

ІО МО:80, і другий полінуклеотид, кодуючий варіабельну область легкого ланцюга, що містить

ЗЕО ІЮ МО:81.

Полінуклеотидні молекули, кодуючі антитіла за винаходом, включають, наприклад, молекули рекомбінантної ДНК. Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид" або "полінуклеотидна молекула" використовуються в даному описі взаємозамінно і стосуються будь-якої молекули ДНК або РНК, одно- або дволанцюжкової і у випадку одноланцюжкової молекули її комплементарної послідовності. При розгляді молекул нуклеїнової кислоти послідовність або структура конкретної молекули нуклеїнової кислоти може бути описана в даному документі відповідно до загальноприйнятих правил представлення послідовності в напрямку від 5 до 3. У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеїнові кислоти або полінуклеотиди є "виділеними". Даний термін, застосовуваний до молекули нуклеїнової кислоти, стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка відділена від послідовностей, з якими вона безпосередньо є суміжною в природному геномі організму, у якому вона знаходиться.

Наприклад, "виділена нуклеїнова кислота" може включати молекулу ДНК, вставлену у вектор, такий як плазміда або вірусний вектор, або вбудовану в геномну ДНК прокаріотичної або еукаріотичної клітини або організму-хазяїна, відмінного від людини. Застосовно до РНК термін "виділений полінуклеотид" означає головним чином молекулу РНК, кодовану виділеною молекулою ДНК. Альтернативно, даний термін може означати молекулу РНК, яка була очищена/відділена від інших нуклеїнових кислот, з якими дана РНК асоційована в природному стані (тобто в клітинах або тканинах). Виділений полінуклеотид (ДНК або РНК) може також представляти молекулу, одержану біологічними або синтетичними методами і відділену від інших компонентів, присутніх у процесі одержання.

Для рекомбінантної продукції антитіла за винаходом рекомбінантний полінуклеотид, кодуючий його, може бути одержаний (з використанням стандартних методів молекулярної біології) і вставлений у реплікований вектор для експресії в вибраній клітині-хазяїні або бо безклітинній експресійній системі. Придатними клітинами-хазяїнами можуть бути прокаріотичні,

дріжджові клітини або вищі еукаріотичні клітини, зокрема клітини ссавців. Прикладами придатних клітинних ліній ссавців є лінія СМ1 клітин нирки мавпи, трансформована 540 (СО5- 7, АТОС СНІ 1651); лінія клітин ембріональної нирки людини (293 або клітини 293, субклоновані для росту в суспензійній культурі, сгапат еї аї., У. Сеп. Мігої., 36:59 (1977)); клітини нирки новонародженого сірійського хом'ячка (ВНК, АТОС СС 10); клітини/-ОНЕК яєчника китайського хом'ячка (СНО, Опаць еї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОА, 77:4216 (1980)); клітини Сертолі миші (ТМ4, Майнег", Віої!. Вергоад., 23:243-251 (1980)); клітини мишачої мієломи ЗР2/0-АСТ14 (АТО СВІ. 1581; АТСС СК. 8287) або М50О (номер у колекціях культур НРА 85110503); клітини нирки мавпи (СМІ АТС СС 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76, АТОС СВІ -1587); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА, АТСС СС 2); клітини нирки собаки (МОСК,

АТСС СС 34); клітини печінки щура лінії бийаю (ВКІ ЗА, АТС СКІ 1442); клітини легені людини (М/138, АТСС СС 75); клітини печінки людини (Нер 52, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТСС СС 51); клітини ТКІ (МаїнНег єї а!ї., Аппа!5 М.У. Асад. зЗсі., 383:44-68 (1982)); клітини МЕС 5; клітини Е54 і лінія клітин гепатоми людини (Нер 52), а також лінія клітин РЕКС-6 О5М. Експресійні вектори, придатні для застосування в кожній з цих клітин-хазяїнів, також добре відомі в даній галузі.

Слід зазначити, що термін "клітина-хазяїн" звичайно стосується культивованої клітинної лінії, Ввесь організм людини, у який був введений експресійний вектор, кодуючий антигензв'язувальний поліпептид за винаходом, однозначно виключається з визначення "клітина-хазяїн".

Продукція антитіл

У важливому аспекті винахід також стосується способу одержання антитіл за винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна (або безклітинної системи експресії), що містить полінуклеотид (наприклад, експресійний вектор), кодуючий антитіло, в умовах, які забезпечують експресію антитіла, і виділення експресованого антитіла. Даний процес рекомбінантної експресії може бути використаний для великомасштабного виробництва антитіл, включаючи анти-ІЇ-22РВ-антитіла за винаходом, включаючи моноклональні антитіла, призначені для терапевтичного застосування у людини. Придатні вектори, клітинні лінії і способи одержання для великомасштабного виробництва рекомбінантних антитіл, придатних для терапевтичного

Зо застосування іп мімо, звичайно доступні в даній галузі і добре відомі фахівцям у даній галузі.

Терапевтична застосовність анти-ЇІЇ -22В-антитіл

Анти-ІІ -22В-антитіла, забезпечені в даному описі, можна використовувати як лікарські засоби, зокрема, для застосування в лікуванні або профілактиці розладів, де патологія обумовлена порушеною передачею сигналів через комплекси 1-22 клітинної поверхні. Така порушена передача сигналів може бути пов'язана з надекспресією або надлишковою продукцією будь-якого з цитокінів ІІ--22, ІІ -20 і/або ІІ -24.

Термін "лікування" або "проводити лікування" означає уповільнення, переривання, припинення, контролювання, зупинення, зниження тяжкості симптому, розладу, патологічного стану або захворювання, але не обов'язково включає повне усунення всіх пов'язаних з захворюванням симптомів, патологічних станів або розладів. Термін "профілактика" означає попередження розвитку розладу, патологічного стану або захворювання або попередження початку розвитку симптомів, пов'язаних з розладом, патологічним станом або захворюванням.

Ліганди, які передають сигнали через ІЇ/-22К, залучені в розвиток ряду захворювань, і, оскільки 1-22 вибірково експресується в шкірі і епітеліальних клітинах, основними захворюваннями є ті, які уражують шкіру і епітелій, включаючи, не обмежуючись цим, псоріаз, псоріатичний артрит і атопічний дерматит. Високі рівні ІЇ/-22 були виявлені в псоріатичних бляшках людини (Вопіїасе еї аї., Сіїп. Ехр. Іттипої., 150:407-415 (2007)), і залучення цього цитокіну в патогенез псоріазу було експериментально продемонстроване на мишачих моделях запалення шкіри (Ма еї аї!., 9. Сііп. Іпмеві., 118:597-607 (2008), Мап Веїе еї аї., уУ. Іттипої. Уап 1, 188(1):462-9 (2012)).

У деяких варіантах здійснення забезпечуються способи лікування запальних захворювань шкіри. У деяких варіантах здійснення забезпечуються способи лікування запальних захворювань шкіри, вибраних з псоріазу, псоріатичного артриту, контактного дерматиту або атопічного дерматиту, у людини. Способи включають введення пацієнту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості будь-якого з анти-ІЇ -22В-антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, як визначено в даному описі в інших місцях. Усі варіанти здійснення анти-1іІ -228- антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, як розкрито у даному описі, однаково застосовні до способів лікування за даним винаходом.

У деяких варіантах здійснення забезпечуються способи лікування синдрому Шегрена або бо раку, вибраного з гепатокарциноми, ліпосаркоми, плоскоклітинної карциноми ротової порожнини, раку ободової кишки і колоректального раку, раку підшлункової залози, дрібноклітинного і великоклітинного раку легенів, раку молочної залози, гліобластоми, Т- клітинної лімфоми шкіри, анапластичної великоклітинної лімфоми, лімфоми з клітин мантійної зони у людини, які включають введення пацієнту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості будь-якого з анти-ІЇ -22В-антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, як у даному описі визначено в інших місцях. Усі варіанти здійснення анти-ІІЇ-22В-антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, як розкрито у даному описі, однаково застосовні до способів лікування за даним винаходом.

Для терапевтичного застосування у людини анти-іІІЇ-22В-антитіла, описані в даному документі, можна вводити людині, що потребує лікування, в "ефективній кількості". Термін "ефективна кількість" стосується кількості або дози анти-ІІЇ -22В-антитіла, яка при однократному або багаторазовому введенні пацієнту забезпечує терапевтичну ефективність у лікуванні захворювання. Терапевтично ефективні кількості анти-ІЇ-22А-антитіла можуть включати кількість у діапазоні від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг на одну дозу. Кількість антитіла, що вводиться в будь-яку задану часову точку, може варіюватися таким чином, щоб оптимальна кількість анти-ІЇ -22В-антитіла, незалежно від того, використовується воно окремо або в комбінації з будь-яким іншим терапевтичним агентом, вводилася під час курсу лікування.

Також передбачається введення анти-1ІЇ-22В-антитіл, описаних у даному документі, або фармацевтичних композицій, які містять такі антитіла, у комбінації з будь-яким іншим придатним лікуванням для вищевказаних захворювань, у вигляді комбінованої терапії.

Фармацевтичні композиції

В обсяг винаходу входять фармацевтичні композиції, які містять одне або комбінацію анти-

І -22В-антитіл за винаходом або їх антигензв'язувальні фрагменти, формовані з одним або більше фармацевтично прийнятними носіями або ексципієнтами. Такі композиції можуть включати одне або комбінацію (наприклад, двох або більше різних) анти-1Ї-22В-антитіл.

Способи формування моноклональних антитіл для терапевтичного застосування у людини добре відомі в даній галузі і їх огляд є, наприклад, у публікації МУапуд еї аї., доигпа! ої

Ріпаптасецшііса! бсіепсевз, Мої. 96, рр. 1-26, 2007, зміст якої в повному обсязі включений в даний опис за допомогою посилання.

Зо У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції формовані для введення суб'єкту будь-яким придатним шляхом введення, включаючи, не обмежуючись цим, внутрішньом'язову, внутрішньовенну, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну ін'єкцію, підшкірне, епідуральне, інтраназальне, пероральне, ректальне, місцеве, інгаляційне, букальне (наприклад, сублінгвальне) і черезшкірне введення. У переважних варіантах здійснення композиція формована для підшкірного введення.

Включення за допомогою посилання

У вищенаведеному описі і у наступних прикладах згадуються різні публікації, кожна з яких включена в даний опис за допомогою посилання в повному обсязі.

Приклади

Винахід буде додатково пояснений з посиланням на наступні необмежувальні приклади.

Приклад 1. Імунізація лами

Двох лам імунізували сумішшю рекомбінантного білка І/22К людини (К 5 О 5узіетв) і людського Еп14-Ес згідно зі схемою імунізації, показаною в таблиці 5 нижче. Після шести ін'єкцій рекомбінантних білків раз на тиждень відбирали зразки крові і сироватки імунізованих лам використовували для оцінки гуморальної імунної відповіді проти І/22К по детектуванню присутності антитіл проти імунізуючого антигену до імунізації і після імунізації. Обидві лами генерували значну і специфічну імунну відповідь проти 1221.

Таблиця 5

Схема імунізації для кожної лами 7 они З імунізації

І/-221(80 мкг) еф огеюво | о дов 1

І -2215(40 мкг) ото в емо

І -2215(40 мкг) я рфрояионо | дю 1

І -2215(40 мкг) о |фовлоо | ге юю 1

І -2215(40 мкг) 9 |фоввиоло | ге еюдюю 1

І -2215(40 мкг) я им ж (дна 001 400 мл імунної крові овпло| яю 17777111 помлімунно крові плавмюу

Приклади 2. Конструювання і селекція бібліотек

Після імунізації збирали РВМС і екстрагували РНК. Проводили синтез випадкової праймованої кКДНК ї з використанням ПЛР ампліфікували сегменти генів МНСНІ, МАСА ї МкСк лами. Для ПЛР-ампліфікації легких ланцюгів використовували два підходи. У першому підході використовували первинну ПЛР-ампліфікацію з праймерами без лінкерів з сайтами рестрикції з наступною ПЛР-ампліфікацією з праймерами з сайтами рестрикції (Араї І ї А5сІ). Для другого підходу використовували мічені праймери для ампліфікації КДНК безпосередньо. Бібліотеки

МНОСНІ конструювали з використанням двостадійної ПЛР, у якій проводили 25 циклів з неміченими праймерами і потім 10 циклів з використанням мічених варіантів цих праймерів (що містять сайти рестрикції 51 і Мої!) (див. УМО 2010/001251).

Ампліфіковані ПЛР легкі ланцюги розщеплювали АраїГ І і АвсіІ, у той час як ампліфіковані

ПЛР важкі ланцюги розщеплювали 5 і Мої! і об'єднували в бібліотеку ар клонуванням вставки бібліотеки легкого ланцюга у вектор рСВЗ бібліотеки важкого ланцюга з використанням сайтів рестрикції Араї! ії АвбсіІ. Було встановлено, що кінцеві бібліотеки Бар мають необхідну різноманітність 2109 різних клонів.

Після конструювання бібліотеки продукувалися фаги, і селекцію з використанням фагового дисплея виконували на І/22К людини (Віоїесппе, 2770-ІК). Для селекції І 22К-специфічних клонів людський ІЇ/221 (ї) наносили безпосередньо на планшет МахізЗогр'м (Мипс); або (ії) захоплювали неконкурентним антитілом проти людського І/22Е (МАВ2770, К 8. О 5узіетв5); або (ії) захоплювали нейтравідином після біотинілювання. Покривання і захоплення ІІ 22К звичайно проводили у двох різних концентраціях; наприклад 5 і 0,1 мкг/мл.

Після першого раунду селекції не було видно чіткого збагачення, але після другого і третього раундів спостерігали дозозалежні збагачення у всіх бібліотеках; до 100 разів після другого раунду і в 10000 разів після третього раунду. Було виявлено, що збагачення на захопленому антитілом 122 вище в порівнянні зі збагаченнями з прямим покриванням 1221.

Це може бути за рахунок того, що ІІ 22К становить усього 25 кДа, і пряме покривання впливає на його конформацію або обмежує доступний епітоп. Тому проводили третій раунд селекції з

Зо використанням біотинільованого ПІІ22Е.

На доповнення до вищеописаних селекцій виконували два додаткові раунди селекції на біотинільованому рекомбінантному мишачому 1/22К після першого раунду селекції на

МАВ2770-захопленому людському ІІ -22Е. Даний відбір проводили для визначення перехресної реактивності бар з мишачим 1(/22К. Як позитивний контроль селекції паралельно проводили відбір на людському ІІ -22В-біотині, захопленому нейтравідином. У цілому процес селекції був дуже успішним зі значним збагаченням, спостережуваним для ІІ 22К-зв'язувальних Еаб.

Приклад 3. Скринінг на І. 22К-специфічні Бар

Після успішної селекції на основі фагового дисплея Еаб, присутні в периплазмі, тестували на їх здатність блокувати зв'язування І//-22 з І/22К. Крім того, проводили скринінг для визначення зв'язування клону з мишачим 1І/22К1. Був розроблений новий підхід, оснований на поверхневому плазмонному резонансі (ЗРК), який дозволив тестувати в одному скринінгу конкуренцію за ліганд, афінність до людського І/22К і перехресну реактивність до мишачого 228.

Різні канали чипа Віасоге (СМ5) покривали: 1) нічим (холостий контроль); 2) 1,-22 (3000 КІ) для тестування на конкурентну активність Бар (коли І/22К вводиться спільно);

З) людським 1.22 (3000 Ку) для тестування на зв'язування з мішенню; 4) мишачим 122 (2500КЦ) для тестування на перехресну реактивність.

Для тестування конкуренції за ліганд перед інжектуванням попередньо змішували периплазматичні екстракти з низькою концентрацією розчинного І/22К1 (0,2 мкг/мл). Таким чином, також можна було виміряти здатність аб блокувати взаємодію ліганд-рецептор у каналі 2. Одержані периплазматичні екстракти піддавали скринінгу на зв'язування з людським 1/22К (канал 3) і мишачим 1І22К (канал 4).

Перевага даного методу в порівнянні зі звичайним ЕГ І5А (зв'язувальним або конкурентним) полягає в тому, що одночасно тестуються декілька характеристик Рар: 1) зв'язування з цільовим людським 1 -22К; 2) конкурентна активність; і 3) перехресна реактивність. Крім того, показник швидкості дисоціації дає чітку вказівку на афінність тестованих Еаб.

Використовуючи даний альтернативний метод скринінгу, Бар з усіма можливими характеристиками були ідентифіковані і розподілені по категоріях на основі значення їх швидкості дисоціації: - конкуруючі або не конкуруючі, - перехресно реагуючі і не реагуючі перехресно, - конкуруючі і перехресно реагуючі, - не конкуруючі і перехресно реагуючі.

Потім різні клони піддавали секвенуванню.

Приклад 4. Аналіз послідовності І -228 Бар

Клони, ідентифіковані аналізом Віасоге (наприклад, конкуренція за ліганд, максимальне

Зо зв'язування, низька швидкість дисоціації або перехресна реактивність з мишачим білком), були секвеновані. Потім клони були згруповані на основі ідентичності їх СОКЗ з утворенням сімейств ун.

Загалом було ідентифіковано 67 різних УН, що належать до 13 різних сімейств МН. Було ідентифіковано значно більше сімейств легких ланцюгів (більше 80 послідовностей Млямбда і

Мкаппа). Велика різноманітність у послідовності і функції Бар показує, що імунізація і селекція були дуже успішними.

Амінокислотні послідовності областей УН і МІ. клонів, що представляють особливий інтерес, показані нижче в таблицях 6-8, і полінуклеотидні послідовності цих клонів показані в таблиці 9.

Таблиця 6

Послідовності каркасних областей і СОК МН-областей ІІ -228 Бар сн| то шннія | т б яю Ж т- Ж не|5 в В

Кві ІВ срв1і ІРД Ір свк2 БЕВЗ з) соВЗ ІР ІВ

Мо: Мо: Мо: що: що: Мо: щі Ншш НЕ засобу 8 РОК, бВМтТА МТБУБОММБІ, УББ оитиБ

ОРОбБІ, ЕпУ5 УБОБУ КБЕОТАМУТС З

ВЕБСАА ко АК зЗокЕтЕБ кет ення З вокКаРв СОІТУ МТУ БОоМиМІ. АнНуІМоМ їБУтТУБ

ОРООБІ, Би Тр КРЕПТАУХУС ку 5

АГБСАА ко УТ

БОЕТКО

Таблиця 7

Послідовності каркасних областей і СОК Мі -областей І -228 Рар вко вко ЗО вЕОо вЕОо ІК во клон ЕВ1 ІВ СБВІ Ір кЕВ2 Ір срна Ір ЕВЗ ІВ сов Ір ЕКА Кв) ні) фіни іш п Еізе Ж зв біне Ж ве ВО 157А2 МЕМЬТО 15 поасу їб шхооКк 17 ОМММе. 18 МТАТЬТІБСА 12 ОоБавЕ5 2о кооот 21

РЗАУВУ УААН РСОАР ва ОАКРЕАВУХС АМКАУ НЕТУ,

КІТС ібеспв | МЕМЬТО 22 тот 23 ос. 24 кУчтЕ 25 МТАБОТІВСТ, 7а АБУ 27 кОпОотТ 2В ввБ5УБо КрІВ РОТАР Зв ОБЕПЕАРТУУС АВУУ НЕТУ, тракту рУчуУ КЬІтУ

Таблиця 8

Послідовності варіабельної області І -2228А Бар

Клов чи ро У ІВ о: | МО: 157А9 ОО УЕВОСОБУОРОСВІВІЗСААЕСЕТЕБОХОМОЯМ 1 923 | МЕМОТОВБАУБУВЬСОТАКІВСОСпУУАНИХОСК Б Я

ВОзрОоКОИТЕчуУОТУМООАТАуаОБУКОСВТТІ БОМ Ї | ВОсОДРУЇМІХСМММВРОСІРЕВЕВОЗББСМТАТІ, і

АЕМмтиХіОсиМ кер АМХуСАКУЧЕВОТ ЕКО Ї | ТІ5САОАКОЕАЕХУСОВОЗВБАМАУКОССТВІКО : остоттує Ї ке

ІБЕНВ ОА УВЕНССРУ ОРНІ ВСААБСВТСВУЮМОМУ 031 МРМІЖОРРЕУВСТНЕТИТІВОСТаКНВНІСВУМУ | 55

ВОдеОоКорЕИЙМВОІ НІГТІВ АСБВАТІВАПИ Ї | УБИТОСЬРСГСАРКТИТУКУМТИВЕОТРОАЕВОБК Я

АКМТОУСОМИМЬКРЕНТАУХХУСУТВРОРЕКАНЕУМОМК | | ВСМТАБУТІВСЬОВКОВАПУУСАБУВЬХАВУКО Я

Таблиця 9

Полінуклеотидні послідовності І -228 Еар

ЗЕ зкОо клон УН тв М Ір

Мо: МО: 15ТА2 СсАССТОСАсССТтостТосАатТстТавОаСАсасСтТтТспТаСА | 52 | ААТТТТАТаИСТОАСТСсСАсССОССсТтОоСесаЗтотоса 73 обостоооООаТтТоОтТстТОАСАСТОТССТаТОСАСБССТСТа ТОТСТЕТООСАСАПАСОаССААСАТСАССТОССА

САТТСАССТТСАОТАОСТАССАСАТОаАССТОоСС СС Або астТАТТАТОСТСАСТОЕСТАССАССАБААО

САСБСТССАСОсСААсосОостТОовАСТООаТОТосСАсТАТ СПАБСССАООССОСССТОТОТТООТСОАТСТАТОВБАА

ТТАТААТОСАСОСТАСТААСАСАБССТАТТСАСАСТОССЯ АТААТААТАВОССССТСАСОЗАТСССТОАССОСТТ

ТОААсОаССОАТТСАБССАТСТОССАпАЗАСААСОСПСААО СТСТОССТОСАСТТСТОаСААСАСАСССАСССТО

ААСАСОТТОТАТСТОСАААТОААСАОСТТОАААТОТоА АССАТСАВСОООССССАСОСТСАССАСОАОсОСО

СБАПАСОССОТОТАТТАСТОТОСААААСТІСОСТТТА АБОТАТТАСТОТСАОСТСАСААССАОТАВТОСТАА

СТООТАСТТАСТАСАСТОААТСАТтТОосСОпССАСссОоСАСС ТОСТОТОТтСоосСОБАаОпАСССАТОТО

САССТСАССОСТОСТССТСА АсСсстоСсто 16658 САостоСАОоСстТостТопАОатТотТосососАОасСтТТОостТасСА | 74 | ААТТТТАТОСТОАСтТСАСССТОЄССтТосСотТОотТетО 75 бестоасасАТІСтТотТаАапАпТОСТоСстТатОСАОССТоТа СААСТОСТОПОААААСОаНТСАССАТСТОСТОБАСЄ

ОАТТСАССТТІССОБСААОСТАТТТСАТОАОоСстТОоССсТоСоС ТтТОБААССАСТССТОАСАТТОООССАСТАТААСТАТ

САС АСОААА ОО ССО БАТТ ТТ СТСАСОТАТ СТСТОТООТАТСААСАССТОССАОАТТООСС

ТСАТАТТАСТОСТОЗТАТТАСАТАСТАСТТАСАСТОССО СПАААСТОСТОАТСТАТАААСТСААСАСТООСАТС

Таз ЗАТТСАССАТСТССАЗАВАСААСОССААС СТСАБОБАССССТОоАТСОСТІСТСТООСТОСААо

ААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСААССТОАААСОТОА ТСАБОССААСАССВОТОССТОАССАТСТОТОоСОС

СБАСАСООЦОТОТАТТАТТСТОТААСАСССССОВООСС ТССАСТОСТВАОСАСОАСОСТОАТТАТТАСТОоТОоС

ССТІТААСаИСССАТТАСААТОССАТОСААИТАСТОСИЬОС СТСАТАТАСЧАСТОСТАСОСССАТТАТОСТОТТОСОСО

АААсСОоОАСсоСстТОСТСАССОТСТОСТСА САС ЗАСССАТСТОАССОоТОоСТО

Приклад 5. Характеристика Бар

Клони з найкращими значеннями швидкості дисоціації реклонували в рСВ4, експресували і очищали за допомогою ІМАС (Таіп від Сіопепіесп). Дані клони знову тестували з використанням аналізу Віасоге. Результати подальшої характеристики Раб наведені в таблиці нижче. 10

Таблиця 10

Характеристика зв'язування І-228 Рар

УН людським І/-228А | мишачим 1 -228 І -22 дисоціації (с 71 .| 76008 | так/ні | тако 323 72 | л6в0б2 | так 1777777так/// | ні 177 7175030 73 | 715864 | - так. /777777отак/// | ні 17 67503 Щ 74 1572 | так 177771717сні///// | тако 0 37503 74 1714 | так 17717171717171ні//// | тако 0 5903 74 1ИЛАТ | так 1777171717171ні///// | тако 0 4лЕоЗ ( 74 л17в1 | так 177717171717ні///// | тако 0 193 74 ляс1 | 7777так717717171717171ні//// | тако 0 35Ео3 75 | 15988 | щ- так/ні | тако 0 153 | 16608 | так. 1777777 ні//// | тако 0 88-04 ЩГ/ 75 | 716901 | щ- так ї777777сні//// | тако 32Б04 75 | лв9НЯ | так 177777171717ні///// | тако 4750407 75 | 716908 | так. /777777сні//// | тако 4304 5 | 16в9Нт0 | так/ні | тако 0 65-04 Щ 5 | ливо | так/ні | тако 12Бо3 6 | 715708 | так. 1777777 так/// | тако 433 6 | 15708 | так. 1/7 так/// | тако 0 86Е-04 ЩГ-" 76 | 1ИЛАВ | так 1/7 так/// | тако 0 4803 77. 15788 | так ї777717сні/ | ні 017 7753040 78 | л58нЯ | так 1777717171717ні/// | ні 017 2903 117 16588 | так 177777так/// | ні 975304 ЩГ 19 | 16904 | так 7777777 -11717171171Ї711ні 17 73Б04 720 | 717009 | так. /777777так// | ні 0 6ЛлЕ04 22 | 716608 | так. | 777сні//// | нії 383 (У спостерігали тільки один раз з очищеним Раб (не пери або тАБб), що вказує на дуже низьку афінність.

Залежно від різноманітності в сімействі МН, конкуруючої активності і афінності (виміряних з використанням значення Конг, одержаного в Віасоге), відбирали один або більше клонів з кожного 5 сімейства і переформатували в моноклональні антитіла (тАбБ) для подальшої характеристики.

Приклад 6. Характеристика ІІ -22В-зв'язувальних тА

Як відзначено вище, відібрані клони кожного сімейства УН одержували у вигляді Ідс1. Після реклонування варіабельних областей НС і ІС в окремі експресійні вектори рРОРЕ, що містять константні області людини, клітини НЕК29ЗЕ транзієнтно трансфікували двома плазмідами, одна з яких кодує повний важкий ланцюг і друга кодує легкий ланцюг. Трансфікованим клітинам давали можливість експресувати антитіла протягом б-добового періоду культивування клітин.

Після виділення антитіл з клітинного культурального супернатанту з використанням магнітних кульок з іммобілізованим білком А очищені антитіла тестували на їх здатність нейтралізувати сигнальний шлях людського і мишачого І/-22К з використанням різних клітинних ліній, як описано нижче.

Клітинна лінія ВУУ-пІ.22К: одержана з клітинної лінії ВУМ і має стабільну експресію людського І/22К, що забезпечує 1І/22-залежне затримання росту. Отже, клітини будуть проліферувати тільки тоді, коли блокується взаємодія ІІ/22-І/22К. Активне антитіло буде сприяти проліферації в низькій концентрації антитіла. Проліферація вимірюється по включенню тимідину.

Клітинна лінія ВаїЗ-ті! 22К: одержана з клітинної лінії ВаїЗз і має стабільну експресію мишачого 122Е, що забезпечує ІІ. 22-залежну проліферацію. Антитіло, що нейтралізує ті! 22К, буде блокувати проліферацію залежним від концентрації антитіл чином.

Клітинна лінія Ваї3-пІ! 22КЛІ 20: одержана з клітинної лінії ВаїЗ, але коекспресує ПІ! 22К з пі2оКкбреїа, дозволяючи клітинам проліферувати у присутності І/20. Антитіло, нейтралізуюче

ПІ22Е, буде блокувати проліферацію клітин, стимульованих ЇЇ 20.

Результати тестування різних тАБб до 1Г/22К проти клітинної лінії ВМУ-ПІІ 22 і клітинної лінії

Ваї3-пПІІ 22КЛІ 20КЬ наведені на Фіг. 4 і в таблиці 11. На Фіг. 4А показаний вплив нейтралізуючих анти-І-22В-антитіл на відновлення проліферації клітинної лінії ВМУ-пІЇ22К. На Фіг. 48 можна бачити вплив нейтралізуючих анти-іІЇ-22В-антитіл на інгібування 1-20 проліферації клітинної лінії, експресуючої 1 -22К. Антитіло до І/221Е, описане в МО 2011/061119 (280.346.757У), було включене в експерименти як стандартне або еталонне антитіло до ІІ -228.

На доповнення до оцінки активності на клітинах вимірювали кінетику зв'язування іп міїго і блокувальну активність очищених антитіл в аналізі Віасоге (3000). Для вимірювання афінності рекомбінантний 1І/22К наносили на чип Віасоге СМ5 при 200 Ки з використанням стандартного протоколу покривання (122. інжектують у концентрації 10 мкг/мл в ацетатному буфері, рН 4,5).

Антитіла, випробувані в діапазоні концентрацій і приготовлені в буфері НВЗЕР при рН 7,4 (Віасоге), інжектували при 30 мкл/хв. протягом 60 с і промивали буфером НВЗЕР з рН 7,4 (Віасоге) протягом 10-20 хв. Одержані сенсограми аналізували за допомогою програмного забезпечення для оцінки ВІА, і кінетику визначали з використанням стандартного підбору кривої (рівняння Ленгмюра 1:1 з перенесенням мас).

Для оцінки блокувальної активності з використанням аналізу Віасоге 3000 рекомбінантний

І/22 (Ка О Зузіет) наносили при 2000 Ки на чип СМ5. Антигензв'язувальні ділянки (очищений

Іо, очищені Раб або периплазматичний екстракт, що містить Бар) попередньо інкубували з рекомбінантним людським 122 (концентрація від 0,2 до 1 мкг) перед інжектуванням у канал, покритий ПІ/22. Детектування зв'язування (І/22К: 122) вказувало, що антигензв'язувальна ділянка не конкурувала, коли зв'язування не детектували (ІІ 22К:1І 22), то це вказувало на те, що антигензв'язувальна ділянка блокувала взаємодію 1/22:/221К іп міго. Результати аналізу

Віасоге і проліферації узагальнені в таблиці 11 нижче.

Таблиця 11

Узагальнені дані по характеристиці панелі анти-ІІ -22В-антитіл ' . Блокування | Активність в аналізі 001111 розвязуваннязньожевасю ооо | роліфераці сх (Му о, Ка (1/с)

Ме людини миші дисоціації) 1 | 17082 | 76бЕЮО5 | 93-05 / 12Е-0 | так 60200; | - 1 | п7006 | --/"(/|| 22е304 77777777 | тако 1 3830 | - 2 | 160Б2 | (| 605 77777777 |77/сні 177777 - | 1406 3 | 15864 | -: | 604 17777777 |і 1777-17 - 4 | 157А2 | 39Е:05| 1ЛЕ-03 | 28Е-09 | так 8030 | - 4 | 1йЛАТ | | 746304 77 | 77777171 3520 |. 5 | 15988 | щ-Х | 2Б303 | | тако 0 л00-20 |. - 5 | 16608 |92Е:06| 20-04 | 22Б-Л1 | тако 70-50 | - 5 | т169с1 | ОС 77777777717171717171717171717171717117 так 135907 1 6 | 15708 | -(Х | 54605 | | так. йл74/209001.4.юЮю-- Ж "" 7 | 15788 | -( | з4Б05 | | ні 19000 | з8000 8 1 л58НА | | зе 05 | 7 -//171717лсні 1500-1600" |Б-2ох1о ліф л65ВВ | | злЕюб 17777771 | ні 1777-17 - 719 | 16904 | Б4ЕЮ5| ЗЛЕО3 | 57609 | щ ні | 1489 20 | 17069 | Й. Ї 77717177 ні 171 -ї1- 22 | 16608 | | З2БоЗ 77777777 |Ї777лні 1 74000 | - «діапазон, спостережуваний у декількох експериментах.

Антитіла до І/22К 157А2 і 166058 проявляють активність на пікомолярному рівні.

Приклад 7. Видова перехресна реактивність тАБ до І -228

Зо ТАБ до 1/22К тестували на видову перехресну реактивність проти мишачого 1--22К і 1--228 примата, відмінного від людини.

КДНК для 122 мавпи циномолгус була недоступна, і її необхідно було витягти з бібліотек

КДНК мавпи циномолгусє. Праймери були сконструйовані на основі загальнодоступної бази даних МСВІ. Декілька послідовностей для ЕСО супоі/ 22К були доступні з загальнодоступних баз даних (Сепрапк, МСВІ) ї містили інсерцію, делецію або і те, і інше (див. фіг. 5).

Невизначеність відносно істинної послідовності І/-22К мавпи циномолгус підтверджували клонуванням із КДНК мавпи циномолгус.

ЕСО 1Ї-22К мавпи циномолгус ампліфікували за допомогою ПЛР з бібліотеки кДНК і клонували в рамці зчитування в напрямку 5-3" сигнального пептиду І(дсОкаппа і вище по ходу людського Ес у вектор РОРЕ. Незважаючи на те, що використовувана кДНК була одержана від мавпи циномолгус, секвенування декількох клонів показало, що І/22К макака-резус також клонувався. І. 228-ЕСО макака-резус характеризувався відсутністю делеції і інсерції, виявлених у мавпи циномолгус (у рамці на Фіг. 5), і двома амінокислотними відмінностями між 11/22 макака-резус і мавпи циномолгус (жирним шрифтом на Фіг. 5).

Після одержання і очищення су! 228-Ес і гпІ/222-Ес тестували специфічність зв'язування з

І-228-ЕСО мавпи циномолгус, макака-резус і миші всіх антитіл з первинної селекції в ЕГІЗА і

ЗРЕ (Віасоге). Мономерний мишачий ІІ 22К одержували від К 85. ОО 5у«етв5 (номер за каталогом 4248-МК). Результати узагальнені в таблиці 12.

Таблиця 12

Видова перехресна реактивність тАБб до 1І--228 11111111 Зв'язуваннязі 22 від: //СС/ССГ/ 71117082 | так | вн | (п | п' 71117006 | так | вн | пй | п" 77772 | 160Б2 | так | помірне | так | так 7779... 15864. | так. | ні 17777 так/ | так 771774. 1572 | так. | но так/ | так 7775 Ю.М 15988. | так. | ні /77777сні | слабке: 1775 (| 76608 | так. | но /77777ні | так 7775 Ю.М. 16961 | так. | ні /77777сні | слабке 77776 | 715708 | так | помірне / так | помірне 77277 15788. | так. | вн 177777 так/ | так 7778 | Я58НА | тако | помірне | так | так 1178 11111 20БА5 | тако | помірне | так | так 71177117 16588 | так | помірне / помірне | опомірне9 7719 | 716964 | так. | ні 77777 так/ | так 77720 | 17209 | так | помірне | так. | так 7722 | 16608 | так. | ні 177777 так/ | так пі-не тестували.

Приклад 8. Картування епітопа

Для ідентифікації і порівняння епітопів, зв'язаних з тАб І 22К, використовували два методи: конкурентний ЕГІЗА і ЕАС5. 8.1. Картування епітопа з використанням конкурентного ЕГІЗА

Епітопи, розпізнавані антитілами, порівнювали один з одним за допомогою конкурентного

ЕСІ5ЗА. Щонайменше одне репрезентативне тАБб з кожного сімейства УН наносили на планшет

Махізогр. Потім додавали біотинільований людський І/22К у присутності великого надлишку тАб, призначених для тестування. Зв'язування біотинільованого І/22К з покритим антитілом детектували з використанням НЕР-кон'югованого стрептавідину. Коли біотинільований 1 22Е не детектувався, що означало, що розчинне тАБб запобігало зв'язуванню з покритим тАБб, то було визначено, що обидва тАбБ зв'язуються з одним і тим же епітопом або мають епітоп, що перекривається. Картування епітопів додатково уточнювали з використанням Рар замість тАрб.

Менший за розміром Рар-фрагмент давав можливість розрізнити дуже близькі епітопи.

Ідентифікували різні епітопи для антитіл МН-сімейств 1-8, 10, 11, 19 і 22. Картування епітопів показує дуже широке покривання епітопів для такого невеликого білка (25 кДа). Як показано на

Фіг. 6, епітопи були згруповані відповідно до того, наскільки антитіла: (ії) блокували зв'язування

І -22 іп міїго і нейтралізували сигнальний шлях 1-22 у клітинному аналізі (нижнє ліве коло); (ії) блокували зв'язування ІІ -22 іп міго, але не мали нейтралізуючу активність (верхнє праве коло); або (ії) не блокували зв'язування 1! -22 іп міго, але мали нейтралізуючу активність у клітинному аналізі (нижнє праве коло). Було встановлено, що шість епітопів, що перекриваються, але помітні, блокуються і нейтралізуються (див. нижнє ліве коло), і з цих шести епітопів два (тАБ з сімейств 4 і 22) мали епітоп, що перекривається, зі стандартним антитілом (280.346.Т5У, див. заявку на патент УМО 2011/061119). Епітоп не був ідентичний такому для стандарту, оскільки ці

ТАБ (з сімейств 4 і 22) були здатні конкурувати також з усіма тАБ з сімейств 1, 5, 6 і 7, навіть якщо вони не могли конкурувати зі стандартним антитілом. У сукупності, ці дані дозволяють передбачити наявність двох різних груп епітопів, однієї, сформованої стандартом, і однієї, утвореної тАБ з сімейств 1, 5, 6 і 7, і третьої групи (тАБб з сімейств 4 і 22), яка перекривається з обома групами (Фіг. 6).

Як показано у верхньому правому колі на Фіг. б, було ідентифіковано 3 антитіла, які зв'язуються з І/22Е, але не блокують зв'язування 1І 22 або нейтралізують активність іп мімо. Ці антитіла, імовірно, зв'язуються з областями ІЇ/22К, що не беруть участь у зв'язуванні ліганду або активації передачі сигналів, і можуть бути використані просто для детектування. З антитіла, показані в правому нижньому колі на Фіг. 6, незвичайні тим, що вони нейтралізують активність

І-22К іп мімо, але не блокують 1122 іп міго, що передбачає наявність нового функціонального епітопа і несподіваного механізму дії. 8.2. Картування епітопа з використанням аналізу ЕАС5 допез вї а). (Зігисішге, 16(9):1333-1344 (2008)) повідомляють про структуру 1І--22, зв'язаного з позаклітинним доменом 1221. У цій статті автори показують, що два домени 1Г22Е, називані 01 ї 02, взаємодіють з лігандом 1-22 у сайті 1А і сайті 1В, відповідно (див. Фіг. 7). Два ключові залишки в І/22К-01, залучені у пряму взаємодію з сайтом 1А 122, являють собою лізин 58 (К58) і тирозин 60 (У60). Триптофан 208 (М/208) І/22К-02 безпосередньо бере участь у взаємодії з сайтом 18 ІІ 22 (див. Фіг. 7).

Тестували зв'язування анти-ІЇ-22Н-антитіл і стандартного антитіла (280.346.15У) з клітинами ВМУ, надекспресуючими різні мутанти І/-22К. Мутанти 1І/22К містять мутації амінокислот, про які відомо, що вони беруть участь у взаємодії І/-22/ЛІ22ЩК. У даному аналітичному режимі антитіла біотинілювали, додавали до клітин, і детектували зв'язування антитіла з І/22К міченим стрептавідином проточною цитометрією (БАС5). У таблиці 13 узагальнені одержані результати.

Таблиця 13

Зв'язування антитіл з клітинами, експресуючими мутанти 1І--228 зан| ев рела |са ясла сво тво вання 122

АМА22 | : | - | ях | «| х | хх 1/1 280.346.15У| -:: | - | їх | 5 | х | хз л5вна | 8 | «5 | ях | ях | її | 5 | їз | з | з | з в-зв'язування; Х-мутація в І.22К приводить до втрати зв'язування антитіл.

Результати РГАС5 чітко показують, що стандартне антитіло 280.346.15У взаємодіє з залишками домену 01 (К58 і 60). Те ж саме має місце для другого контрольного антитіла до ЇЇ - 22, АМК22, хоча епітоп не є повністю тим же самим, оскільки мутація К112А впливає на зв'язування АМК22. Як і передбачалося за результатами картування епітопів з використанням

ЕГІЗА, показано, що деякі антитіла лами не конкурують з антитілом 280.346.Т57У, інші тестовані антитіла не були зачеплені мутаціями, що впливають на зв'язування 280.346.Т57У з І 2212. Це підтвердило, що антитіла націлені на інший епітоп, можливо, включаючи залишки в домені 02.

Фактично, мутація А20О90 у домені 02 І/22К елімінувала зв'язування 198А1, підтверджуючи, що

198А1 і антитіло з сімейства 5 зв'язуються з доменом 02 ІІ 22К (див. Фіг. 7В).

Дивно, але на антитіло 166058, яке має точно такий же УН, що і 1984А1, але має інший Мі, мутація А209О не виявляла впливу, що дозволяє передбачити, що МІ. бере участь у взаємодії.

Можливо, МІ. 16608 допускає наявність більш великого залишку в положенні 209, у той час як

МІ. 198А1 ні. Ця гіпотеза підтверджується їх специфічністю зв'язування з ІЇ22К макака-резус.

В1ІГ22К макака-резус має місце серин у положенні 209. Оскільки 166058 допускає наявність більш великої амінокислоти в цьому положенні, то воно може зв'язувати І/22К макака-резус, у той час як 198А1 не здатне зв'язувати гПІІ22К, оскільки воно не допускає великих залишків.

Приклад 9. Нейтралізація сигнального шляху ІІ 20 і ІІ 24 у клітинному аналізі

Анти-ІІЇ 22В-антитіла тестували на їх здатність блокувати ІІ -20- і І -24-залежну передачу сигналів у клітинах, коекспресуючих 1І/22К і 120. Існує механістична відмінність між І--22-,

І/-20- ї І -24-залежною активацією рецептора. Передбачається, що 1-22 індукує передачу сигналів, спочатку зв'язуючись з ІЇ/22К, запускаючи рекрутинг корецептора І/10Ка2 і активацію тримерного комплексу. Передбачається, що для І/-20 цей цитокін спочатку зв'язується з корецептором (І.20К2) перед рекрутингом 122К і активацією тримерного комплексу. Нарешті, для 1-24 залишається неясним, як рецепторний комплекс піддається рекрутингу і активації, а також неясно, де зв'язується ІЇ -24. 9.1. Сигнальний шлях ІІ -24

Декілька клітинних ліній використовували для тестування ІІ -24-залежної передачі сигналів,

Ваї3-пІ, 22К/20К2 або ВаїЗ3-тіі! 2288/2082. 1-24 індукував проліферацію цих клітинних ліній зі значним вікном, що визначали по рівню гексозамінідази (даний показник використовується для підрахунку клітин) у діапазоні ОО від 0,17 до 1,5 для клітин ВаїЗ-пПІ! 22/20 і в діапазоні від 0,15 до 0,8 для клітин ВаїЗ-ті! 22К/20Кр. Жодне з тестованих антитіл не виявляло впливу на проліферацію, індуковану 1-24. Ці результати передбачають, що або 1-24 має зовсім інший механізм активації І/.22К шляхом зв'язування з сайтом, який сильно відрізняється від 1.22 і І - 20, або І/22К не бере участь у передачі сигналів 1-24 у тестованій клітинній лінії (і аналіз не прогнозує нейтралізуючу активність). 9.2. Сигнальний шлях 1-20

Клітинна лінія Ваї3-пІ22КЛІ 20 походить від клітинної лінії Ваї3, але коекспресує ПІІ 22К з

Зо пПІ-2ОКВ, дозволяючи клітинам проліферувати у присутності ІЇ/-20. Антитіло, що нейтралізує

ПІ22К, буде блокувати проліферацію клітин, стимульованих 1-20. Результати тестування антитіл лами разом зі стандартними антитілами 280.346.Т57У і АМК22 показані на Фіг. 8.

І -20-залежну проліферацію в Ваї3-пІ22кКЛ/ЛІ 205 тестували паралельно з аналізом ІІ-22- залежної проліферації в ВМУ-пІЇ 22К, що дозволило провести адекватне порівняння між двома цитокінами. Результати трьох незалежних експериментів наведені в таблиці 14.

Таблиця 14

Активність антитіл у блокуванні ІІ -22- і І -20-залежного сигнального шляху через ІІ -228 с. ІСво у блокуванні ІСво у блокуванні рсмеютомн бом 00000 ом п Ст: їх РИ ПО: ЗОН ПОЛОН СТ То ООН КОН Ме "Діапазон, спостережуваний у трьох експериментах (2250, 2292, 2301 для 1-20 і 2253, 2292, 2301, 2428 для 1І -22); пс: не конкурує; пі: не тестували; с5: переставлений ланцюг.

Можна зробити висновок, що всі антитіла з сімейств 1, 4 і 5 були здатні блокувати як ІІ -20, так і І--22. Важко порівнювати активність між І--22- і І/-20-стимульованою проліферацією за рахунок різниці в чутливості, яка залежить від концентрації цитокінів, числа рецепторів і внутрішньоклітинної біологічної варіабельності. Однак було встановлено, що більшість антитіл більш ефективно блокує ІІ-22-залежну передачу сигналів у порівнянні з блокуванням ІІ -20-

залежної передачі сигналів.

Приклад 10. Селекція зразкових антитіл і перетворення в антитіла зародкового типу

Афінність антитіл, що представляють найбільший інтерес (нейтралізація сигнального шляху

І22), додатково підвищували шляхом перестановки легких ланцюгів. Під час перестановки легкого ланцюга УНСУНІ відібраного антитіла об'єднують з бібліотекою легкого ланцюга від тієї ж лами, з якої був одержаний МНСОСН. Потім проводили декілька раундів селекції з використанням фагового дисплея по швидкості дисоціації для ідентифікації пар МНСН.МІ СІ, які мають найбільш високу афінність. У випадку антитіла 16658 було виявлено декілька клонів з поліпшеною кінетикою зв'язування, у тому числі 198А1, але, на жаль, даний клон втратив більшу частину своєї перехресної реактивності для макака-резусу і тому антитіло 166058 залишилося найбільш привабливим кандидатом сімейства 5 для подальшої розробки.

У випадку 157А2 (з сімейства 4) було виявлено декілька Раб (наприклад, 218А7) з поліпшеною афінністю в порівнянні з 157А2. Наступні антитіла були взяті для подальшої розробки. Дані антитіла були відібрані на основі активності, видової перехресної реактивності і епітопа або механізму дії. 218А7 (поліпшений варіант 157А2, сімейство 4) - було встановлено, що це антитіло має дуже гарну активність відносно 1-22 і 1-20 (на субнаномолярному рівні), перехресно реагує з

І-22К примата, відмінного від людини, але не реагує перехресно з мишачим 1І/22К. Було виявлено, що 157А2 має на 1/22К епітоп, який відмінний, але перекривається зі стандартним антитілом 280.346.Т57У. 16608 (сімейство 5) - було встановлено, що це антитіло має високу активність (на пікомолярному рівні) і має перехресну реактивність для деяких видів, оскільки воно зв'язується з 1/22К макака-резусу (але не з І 22К мавпи циномолгус і не з мишачим 1. 22К).

Характеристики відібраних анти-ІЇ -22В-антитіл наведені в таблиці 15 нижче.

Таблиця 15

Характеристики анти-1ІЇ -22В-антитіл лами, відібраних для перетворення в антитіла зародкового типу 71111110 | Перехреснареактивність | Активність | | Епітоп п Відносна ожини 22 проти І--20 о 157А2 | 4 | вне як но | - 131-570) 184-545 | 109 | пМ/О2 218А? | 4 | вне як но | - 350-366 па | -( - | 002 16608 | 5 | нн - | ж- | - | 684 | 160170 | 367 | 02 280.346.Т5У| | вне) як | же | ян |22-250| 280-800 | 75 | п п-людина; супо-мавпа циномолгус; гп-макак-резус; т-мища.

Приклад 11. Перетворення антитіл 218А7 і 16608 в антитіла зародкового типу

Перетворення антитіл у зародковий тип проводили, як описано в міжнародній патентній заявці М/О 2011/080350, зміст якої включений в даний опис в повному обсязі за допомогою

Зо посилання. СОМ були мутовані для видалення потенційних посттрансляційних модифікацій разом з деякими іншими положеннями, які, як було встановлено, відрізняються в антитілах з однакових сімейств МН і МІ. з ідентичним спарюванням. Області МН і Мі антитіл зародкового типу, одержаних з антитіл лами 218А7 і 166058, оцінювали на їх ідентичність 3 людськими послідовностями. Також було проведене порівняння зі стандартним антитілом 280.346.Т5У.

Результати наведені в таблиці 16 нижче.

Таблиця 16

Ідентичність анти-ІЇ -22В-антитіла зародкового типу, одержаних з антитіл 218А7 і 16608, з антитілом людини й й до ідентич- Швидкість Швидкість

Назва оо ідентич- оо ідентич- . миши дисоціації для клону ності для МН | ності для МІ. носп для /) дисоціації для У 1Ї/-22К1 макака-

МНаАМІ С 11С-22К1 людини резус" 16608 | 885 | 848 | 867 | 1225403 | го2вбг 6| 22406 | 943 | 937 | 940 | 43404 | 185502 8| гав | 954 | 924 | 939 | 7114-04 | 465Б03 9| геБАТО | 954 | 924 | 939 | 15БЕ-03 | 1075302 218А7 177954 | 911 | 954 | 8лов-04 | 9705304 6| 2312 | 989 | 975 | 982 | 4335-04 | 13303 8| г2г29Е6 | 989 | 975 | 982 | 4599-04 | 5АЕОЇ 9| 22902 | 989 | 975 | 982 | 1862-03 | 330603

І |280.346.15У| 885 | 100 | 943 | - | - "Визначено для Рар-фрагментів.

Антитіло 230С9 було відібране як варіант зародкового типу антитіла 218А7, і антитіло 223055 було відібране як варіант зародкового типу антитіла 166058. Послідовності областей МН і МІ. антитіл 218А7, 23009 і 22305 показані в таблицях 17-21 нижче (послідовності 166058 показані в таблицях 6-9 вище).

Таблиця 17

Послідовності каркасних областей і СОК для МН-областей антитіл 218А7, 230С9 і 223025 у о) вко ЗЕ БО | 8ЕО о)

ЕВв1 Ір срві Ір сриг Ір БЕВЗ ІВ срвз ІБ ЕКА ІВ

Мо: МО: що: що: Мо: Мо: 218А7 Оу 1 ва 2 пУКОд З ЗІїМО А ВЕТІВКОМАК но Уусквот б Морат 7 зсосгу Б вскОї, вБМТА МТУ БОоММЕТ, ХїБЕБ оМтУив

ОРОС, ЕМВ хБпБУ КБЕПТАМУ ТС 5

КЕВСАА ко Ак

БОЕТЕ5 23009 | ОоУОБУує 33 зим 33 | МУКОА 35 хв) 36 |КЕТІБЕОМБК 37 УБЕБСТ коБОоотТ зв заБО1У У ракаї, АБКТА МТБУТОМИБІ, уїБЕ5 їУтУув

ОРОбБІ. вИйУБ У5ОоБУ КАВОТАУТУС 5

ВІБСАА ко Ак

ЗСЕТКВ

22355 | ОМОТУЕ 39 ЗЕМ З ЧУКОА 40 5ІНІВ 41 ВЕЕТІБ5КВМАК 42 РРОРЕК а3 |Мокот ЧА чеше еВ 5 РЕОКовЕ ЗСіІтТ МТУ гОоММІ1. АНУМОСА ТУитУуБ

ОРООБІ, 5 УтоНМУ КЕАКБПТАУУУС ку І

КГВСАА ко Мт

ЗОЕТЕВ

Таблиця 18

Послідовності каркасних областей і СОЕ для Мі -областей антитіл 218А7, 230С9 і 223055

БО во ще) БО БЕО | БЕ БЕО клон Кві Ір срні Ір БВНІ ІВ сок2 Ір кв чо сон То КквА Ір

Мо: Мо: Мо: Мо: що: що: що: 218А7 | ТРУГДТО А5 позу 16 шхоОоКк АБ БОМ 47 МТАТІТІБСА 48 Оо5о55В5 26 кЕБОостТ 49

РЗАУБУ ХАН РОСОАР Е5 ОАЕРЕАВЕХУС АМАУ КІтТУї,

ЗІБОТА У1УтУ

ІТС

230с5|БУКЬтТО 5О ОБУ 15 шок 51 СОМИ 47 МТАТІТІБ5КА 3 ОоБОоВБОоБ а КЕОзостТ 55 вББ5БУБУ тАнН РЕСОАР 5 ОАКЕРЕАТУХС 5ЧАУ кІтУї,

АТСОТА УМІмІх

ІТС

223055 | ОБАБТО 26 тОотЕ 57 хо, 28 ЕУМКВА з | МТАББТІ СІ, бо ВУХ 27 КЕОСОоТ в1і

РЕБУБОа маВИче РОКАв 5 ОАБОБАБУХОЄ АПУ ОТУТ, 5РЕОаОБУ ЗУчу КОТУ

ТтІБС УБ

Таблиця 19

Послідовності варіабельних областей антитіл 218А7, 230С9 і 223055 5ЕО 5ЕО

Клон Мн ІВ М, чІр

МО: Мо: 218А7 | ОМОТУКВОССГУОРООБІВІЗСААБСЕТЕЗБУМБИУУВО 29 1РУБТОРБАУМБУБІСОТАВІТСОСОСУХАНИУООКР 62

АРСКСОПЕЙУББІУМОО5МТАУЗрОМКОКЕТІЗВОМАКМТ ООАРЛМУТУСОММеЕРБООТРЕКЕБОБСАСМТАТІТ І

ПУТ ОММОІКБЕПТАУУУСАКУСЕ5СТУУБЕБНСОСТОМТ Б5БАОАКОКАКУУСОБСБББАМАМЕСССТКІТУТ,

УББ

230с9 | ОМОБУКБОаССсЬМОРОСБІ ВІ БСААБСЕТЕББУ ОММИУКО еЗ БУЕГТОРББУБУАТСОТАКТІТСОСОСУТУАННУООКЕ 64

АРОКСГЕЙУ5БІХМОАВМТАУБОБУКОВЕТІВВОМОКМТ СОАРУММІХООММЕРБОЇ РЕКЕ5ОБСАСМТАТІТ І

ПУТОММБІКАКОТАУУУСАКУСКОСТуУБЕБЩСОСТІМТ ЗВАВОАКБОЕАрУУСОБО5Б5БОМАУКОООСТКІТМІ,

УвБ 223055 | ОМОБУКЕБООСІМОРООБІ ВІ, БСААБСЕТЕББУКМБИУВО во ОБАГТТОвРБУБОБРООВБУТІБСТОТОЗРІСБУМУМ

АРОКОРЕМУБОІНІБОСІТУУТОБУКОВКЕТІБВОМАКМТ ЗМХООТРОКАРКІТІУЕУМКАББОУРОВЕБО5КБ5О

ІХТОММБІКАВОТАМУУСУТРРОРЕКАНТУМСАКУЙОКСТ МТАБІТІБЗБОБОАЛЕОБАПУУСАВУВИХАВУУКОССТ

І1УитТУ55 от

Таблиця 20

Послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіл 218А7 і 223055

КО Бій

Клон Важкий ланьюг ІБ ЛлЛавкий ланцюкв тв ма: МО: 230с95 | оУсьУукОсосБУавООоВБВЬБСсААБОСЕТКпБУрММКУВ 7 ЕУЕМТОРБЕМБУАБООТАвІТСОпОоУХАНМУООКР 08 сАРОКОБКИУВВІХМОАБМТАБОПУКОНЕТІВВОМИК СОАРУБМТХСОММАРБОТРЕВЕВОБВОАСМТАТЬТІ

МІГУТОММБЬКАКсТАУХУСАКУСКсСТУ ВОМ СТ 5БЕАОАЕгЕАпПТУУСОБОБЕБЕМАМЕЗОСТКЬЕМІ, пече КК а,

ХОМ

22355 | ОУСБУЕНОССБХОРОСЕЬНЬЧСААНСЕТЕБОТЕМОХУВ | 655 |ОБАБТОРРБУБСБРООБУТІБЗСТОТЯБОІСБУМУУ | 70

САРОКОРЕШУБСІНІБСОСІТУУТОБУКОВЕТІБКОМАК БМХООБРОКАРКЬБІТЕУМЕНОВОУВОВЕВСВКОС

МТУ ОММОЕКАВОТАУУТСУТЕРОРЕКАНУАКУ КО "ТАББТІБСЬОАЕРЕАПТУСАБІВЬТАпУМ ЕТ кОотТІУутУВЕ й Ота, й

ОО КК ОО М

Затемнені ділянки послідовності представляють константні області важкого і легкого ланцюгів. Залишок "ОО", виділений жирним шрифтом у константній області важкого ланцюга, представляє мутацію з "М".

Таблиця 21

Полінуклеотидні послідовності, кодуючі послідовності варіабельної області/послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіл 218А7, 230С9 і 223055 5ЕО БКО

Клон Область УНН 16 Область МІ. тп

МО: МО: 218А7 | СВостосСАОСТОСтТОопАСтТотТОовоосАоОсттостОасСА ке стосстТотТОоСтТаАСТСАОСССТОоСОососСтотосот 77 сотТбОабасТТстТотТОАСАСТСТОСТОТОСАОССТОТОосА сТОСТТТапбАСАСАСОСОСАСОАТСАССТаССААО

ТТСАССТТСАСТАССТАСОПАСАТИаИдОаСТОсСтТоСсеСсСАс баб БСсСтТАТТАТОСТСАСТОСТАССАСОСАСААбБССА

ССТССАпОвААсБООСтТОасАсТоват т сСАСТАТТТАТ СОССАСОССССТОТОСТОСТСАТСОТАТССАСАБАА

ААТОАСООТАСТААСАСАСССТАТТСАБАСТССОТОСААО тААТАСССССТСАСОСАТСССТОАоСОСТТСТСТО

ССОАТТСАССАТСТССАБАСАСААСОССААСААСАСО стос ОссаСстТоОаОААСАСАОССАСССТОСАССАТО

ТІСТАТСТОСАААТСААСАСПСТТБАААТСТОСАОСАСАСО АБСООСПСАСОСТАОСАСБАОЗСТОАОТАТТА

ОССОТОТАТТАСТОТОСААААСТТОССТТТАСТОСТАСТ СТОТСАСТСАССААССАСТАОТОСТААТОСТОТОТ

ТАСТАСАСТОААТСАТОссООпАСООБАСОсСАООТСАСС това АООЗАСсСАдастоАссоТосто

СТОТОСТСА

23009 сАСОСТОСАССТССТаСАСТСТОСОбСАСОСТТОСТОСАС 78 тССТАССААСТСАСТСАоССсСТоСТоССТОоТоСсат 73

СОСТтТОобОООТТСТСТсАСАСТСТОСТОТОСТОССТСТовА Бест АСАпАСО ТАБ САТСАССТОССААО

ТІСАССТТСАСТАОСТАССАСАТОААСТаОСТССОССАЄ сАпОСТАТТАТОСАСАСТОСОТАССАССАБААСССА

ОСТОССАСОСААСОСасСтТОСАОТОООТОТСсСАССАТТТАТ ООССАОССССССТОТОСТООТСАТСТАТОСАСАСАА

ААССАСОССАСТААСАСАСССТАТТСАВАСТОСОТОААО ТААТАСССССТСАоОоОАТоССстТоАосСОоСсТтТСсТотОо

СБССЗАТТОАССАТСТСОСАХАЗАСААСТОАААБААСАСОо Стос асСстТаЗчААСАСАаССАСССТЗАСААТО

ТТОТАТСТОСАААТЧААСАСОССТСАСАССТСАББАСАСО АаСПОСССССАСОСТОАССАСсАСОСТОЗАСТАТТА

ОСССТОТАТТАСТОТОСОСАААСТТООСТТТАСТОСТАСТ СТОТСАСТСАСОААССАСТАСТТСТААТОоСТОоТОоТ

ТАСТАСАСТСААТСАТОСООССАСООСАСССТОССТСАСТ тОоБОСОСБАСОЗАССААОСТВАССОТССТо

ЗТСтТОСТСА 22355 | САСОтТОосСАОСТОСТосСАстТотТОоОСОосОосоОСстТтостТОсСАС во САСтТІТОСССТОАСТСАСССТоССТосотоТСТтоб ві

ССТОООсАТТСТОТОАСАСТСТССТОТОСАСССТОТОСА АТСТССТОБАСАСТСТОТСАССАТСТОСТОСАСТО

ТТСАССТТСАСТАОСТАТТКСАтТОсдастТтОостТоСассАс ОААССАСТАСТОАСАТТОЗСТОСТАТААСТАТОТО

ССТССАпАААСсоСОСССсСАсТоват тА ТАТТСАТ тТОСТаСТАТСААСАССТОССАВавААсССССССАА

АТТАСТООТОСТАТТАСАТАСТАСАСОБАСТССОТОСААС АСТОССТОоАТСТАТСАСОТСААСААСССАТССТСАС

ОБССОАТТСАССАТСТСОСАБАСАСААСОСАААСААСАСО бООТСсСсСстТОоАТосОСТТСсСТоТООСтТоСААСТСАСсОоС

СТОТАТСТОСАААТСААСАПСОСТВАСАОСТОАаСАСАСо ААСАССОССТСоССТОАССАТСТСОТОСОСТССАСОЄ

БССОтТОТАТТАТТОТОТААСАСССССОООСІСССТІТААО ТтТОАББАСБАБОСТОАТТАТТАСТОРОССТСАТАТА

ССССАТТАСААТОССОСОААСТАСТОСООСАААСОСАСС ОАСТОТАСОССОАТТАТОТОТТОССОСОБАБОСАСС

СТСОТСАСТОСТСТОССТСА СААСТОСАСССсСТОСТО

Приклад 12. Характеристика варіантів зародкового типу антитіл 230С9 і 223055 12.1. Афінність зв'язування варіантів тАБб зародкового типу

Афінність антитіл 230С9 і 22305 вимірювали з використанням 5РК (Віасоге 300). Коротко, 250 КО людського І/22К (Віоїесппе, 2770-ІК) наносили на чип СМ5 з використанням стандартних методів (ЕОС-сполучення ІІ 22К у концентрації 2 мкг/мл в ацетатному буфері, рн 4,5). Потім антитіло в різних концентраціях інжектували в буфері НВЗЕР в (рН 7,4) протягом 2 хв. Зв'язування контролювали також під час 10-хв. промивання (НВЗЕР к).

Афінність, розрахована з використанням програмного забезпечення ВіАемаїчайоп з використанням підбору кривої рівнянням Ленгмюра 1:1, показана в таблиці 22 нижче.

Таблиця 22

Афінність зв'язування варіантів зародкового типу антитіл нн Ка (1/Мс) Ка (1/с) 22315 6.6Е--06 1.0Е-04 1.6Б-11 22464 9.3Е-06 9.8Е-05 1.16-11 23009 6.8Е-05 8.9Е-05 1.3Е-10 280.346.157 4.9Е--05 3.4Е-04 6.9Е-10

Антитіла 22305 і 224С4 (обидва варіанти зародкового типу антитіла 166058) показали дуже високу афінність до І--22НА (10-20 пМ), тоді як антитіло 23009 мало афінність, що дорівнює 0,13 НМ. Усі варіанти зародкового типу антитіла показали більш високу афінність, ніж стандартне антитіло 280.346.75У (0,69 нм).

За рахунок потенційного ефекту авідності, спостережуваного при використанні бівалентної молекули як ліганду під час вимірювання афінності, проводили тестування у зворотному експериментальному режимі. У цьому аналітичному режимі антитіла покривали до 250 КИ з використанням стандартних методів. Мономерний людський І/22К додавали в різних концентраціях, і значення афінності, розраховані з використанням програмного забезпечення

ВІіАемаїІчайоп з використанням підбору кривої рівнянням Ленгмюра 1:1, наведені в таблиці 23 нижче.

Таблиця 23

Афінність зв'язування антитіла 230С9 з людським 1 -228 нини Ка (1/Мос) Ка (1/с) 23009 пІ22А 9,2Е--05 2,2Е-04 2,2Б-10

На жаль, антитіло 22305 інактивувалося у процесі нанесення, і за допомогою цього аналітичного режиму не вдалося визначити афінність.

Афінність антитіла 230С9 є постійною незалежно від режиму вимірювання афінності, показуючи, що низьке покривання, використовуване в обох експериментальних умовах, є достатнім для зниження будь-якого ефекту авідності. 12.2. Інгібування ІІ -22- і ІІ -20-залежної активації і сигнального шляху ІІ -2281

Антитіла 218А7 (варіанти незародкового типу) і 230С9 (еквівалентний варіант зародкового типу) тестували разом з іншими варіантами зародкового типу антитіл на їх здатність нейтралізувати І/-22- і І -20-опосередковану передачу сигналів через І -22К1. Тестування проводили з використанням аналізу клітинної проліферації, описаного в прикладах 6 і 9.

На Фіг. 9А показана здатність 218А7 і 23009 нейтралізувати ІІ -22-залежну активацію І - 22К1. На Фіг. 9В показана активність різних серій 23009 нейтралізувати 1І-20-залежну активацію 1ІІ-22МК1. Відносні активності тестованих антитіл показані в таблицях 24 і 25 нижче.

Таблиця 24

Активність антитіл 218А7 і 230С9 у блокуванні ІІ -22-залежного сигнального шляху через ІІ. 22 (клітинна лінія ВУУ-ПІІ. 22Н)

ІСво у блокуванні Відносна активність у порівнянні з

І--22 (НМ) 280.346.1 53 218А7 230С9 23005 23она 11070666 11111110 280.346.Т5У 00666911 23087

Таблиця 25

Активність антитіла 230С9 у блокуванні ІЇ -20-залежного сигнального шляху через І. 221 (клітинна лінія Ваї3-пІ. 22РЛІ 20)

ІСво у блокуванні Відносна активність у

ІС-20 (нм) порівнянні з 280.346.1753 280.346.Т5У 1,487 ни 23009-М2970 (41). 0,7807 23009-М2970 (й 2) 0,5671 "Різні серії очищення антитіла 230С9. 12.3. Підтверджувальне картування епітопа

Підтверджувальне картування епітопа для варіантів зародкового типу антитіл 230С9 і 223055 проводили з використанням аналізу ГАС5, як описано в прикладі 8.2. Було встановлено, що антитіло 230С9 конкурує за зв'язування з ІЇ/-22К1 зі стандартним антитілом 280.346.Т57У, атакож з антитілом 223055. Антитіло 223055 не конкурувало за зв'язування з І/-22К1 зі стандартним антитілом 280.346.Т57У.

Результати аналізу ГАСЗ об'єднували з результатами аналізу проліферації, описаними вище, і висновки, що стосуються епітопів, наведені на Фіг. 10. Як зазначено, можна зробити висновок про те, що: (ї) антитіло 23009 зв'язується з епітопом, який відмінний, але перекривається, у порівнянні з епітопами, які зв'язуються 280.346.Т157; і (ії) антитіло 223055 зв'язується з епітопом, відмінним від епітопа для 280.346.Т 57.

Аналіз ЕАС5 також проводили, як описано в прикладі 8.2, для дослідження зв'язування варіантів зародкового типу антитіл з різними мутантами І/-22К. Результати наведені в таблиці 26 нижче.

Таблиця 26

Зв'язування антитіл з клітинами, експресуючими мутанти 1ІС--228 -/-«ечасткове розпізнавання мутанта, що має К112А.

Одержані результати підтверджують, що антитіла 230С9 ії 22305 зв'язуються з епітопом, який не містить У60. Було встановлено, що мутація А2О9О впливає на зв'язування 22305, тоді як на зв'язування антитіла лами 16608 ця зміна не здійснювала впливу. Імовірно, це пов'язано зі складностями визначення чутливості 166058 до мутації А2090 (166058 тестували тільки один раз) і, можливо, пов'язано з незначними змінами в послідовностях СОК під час перетворення у варіант зародкового типу 166058. Одержані дані підтверджують, що антитіло 280.346.7157У зв'язується з 01 1/22К, антитіло 223055 зв'язується з 02 11/22К, і 23009 має епітоп, який відмінний, але перекривається. 12.4. Видова перехресна реактивність варіантів зародкового типу антитіл

Антитіло 230С9 зв'язується з людським 1 -22К, але не проявляє перехресної реактивності для І/-22К миші, щура і кролика. Це узгоджується з тим, що 230029 має відмінний епітоп у порівнянні зі стандартним антитілом 280.346.Т57У - див. п. 12.3 вище.

Здатність антитіл зв'язуватися з І/22К мавпи циномолгус, експресованим на клітинах, тестували створенням химерних конструкцій позаклітинного домену (ЕСО) ІІ! 22К з різних видів, злитого з людським трансмембранним (ТМ) і людським внутрішньоклітинним доменами (ІВ).

Незважаючи на те, що ефективність транзієнтної трансфекції була невисокою, результати аналізу БАС5 показали, що антитіло 230С9-М2970, але не 223055-М2970О, зв'язується з супоїЇ 2248 ЕСО-питаптмМ ПпитапІСО, про що робили висновок по наявності більш широкого піка на графіку ГАСЗ (див. Фіг. 11 зі стрілками, що вказують на більш широкі піки).

Крім того, коли химерні конструкції також котрансфікували з репортерним геном ЗТАТЗ у клітини НЕК, то активність І/22Е після додавання людського І/22 можна було вимірювати в присутності або за відсутності нейтралізуючого антитіла. Результати, представлені в таблиці 27 нижче, показують, що всі тестовані антитіла були здатні нейтралізувати людський ІІ 22 і тільки перехресно реагуючі з приматами (230С9 і 280.346.Т5У) були здатні зв'язуватися і блокувати активність химер мавпа циномолгус-макак-резус, що свідчить про те, що ці антитіла будуть функціональними в дослідженнях на приматах.

Таблиця 27

Перехресна реактивність анти-ІЇ -22В-антитіл з І-22К людини, макака-резус і мавпи циномолгус

ЕСво (НМ) ЕСво (НМ) в (НМ)

ЕСО людини ЕСО макака-резус мавпи циномолгус 12.5. Аналіз імуногенності

Імуногенність варіантів зародкового типу антитіл оцінювали з використанням інструментів прогнозування. Зокрема, наявність потенційних імуногенних пептидів у варіабельних областях оцінювали з використанням платформи Ерібазе"М (182-1) від Іопла з використанням настроювань "НІ А сіав5 ІІ-Саисавіап м3.0". Дана платформа аналізує специфічність зв'язування

НГА усіх 10-мерних пептидів, одержаних з послідовностей МН і МІ. Профілювання виконували на рівні алотипу для 15 ОКВ1, 6 ОКВЗ/4/5, 12 0О і 7 ОР, тобто всього 40 рецепторів НГ А класу

ІЇ. Були ідентифіковані сильні і середні зв'язувальні антитіла для ОКВІ, ОКВЗ/4/5, а також сильні зв'язувальні антитіла для епітопів СО ії ОР. Підрахунок епітопів проводили окремо для високоафінних і середньоафінних ОКВІ1-зв'язувальних антитіл. Пептиди, що зв'язуються з декількома алотипами однієї і тієї ж групи, визначалися як один. Приблизний бал, що виражає найгірший імуногенний ризик, розраховували наступним чином: балеху, (число епітопів х частота алотипів). Інакше кажучи, число епітопів, що впливають на конкретний алотип НГА, множиться на частоту алеля зачепленого алотипу. Для даної послідовності продукти підсумували для всіх алотипів ОМВІ1, використаних у дослідженні, які присутні в 2 95, або більше популяції суб'єктів європейської популяції.

Результати наведені в таблиці 28 нижче.

Таблиця 28

Бали ОКВІ для варіантів зародкового типу анти-ІЇ -22В-антитіл у порівнянні з різними іншими комерційно доступними антитілами

ПНЯ НВ НН НИ

Як випливає з таблиці 28, антитіло 230С9 має дуже низький бал ОРВІ1, значно нижче, ніж у інших комерційно доступних антитіл, тоді як антитіло 223055 має низький бал ОКВІ, порівнянний з іншими комерційно доступними людськими або гуманізованими антитілами. Ці дані передбачають, що антитіло 230С9 (і 223055) буде мати переважний профіль імуногенності.

Приклад 13. Фармакокінетичне дослідження (РК) антитіла 230С9-М2970 на мавпах циномолгус

Проводили фармакокінетичний аналіз клону антитіл 23009. Двом мавпам циномолгус внутрішньовенно вводили однократну дозу 10 мг/кг антитіла протягом 2 год. Зразки крові відбирали у різні часові точки і визначали концентрацію тАбБ у плазмі за допомогою ЕЇГ ІЗА.

Зокрема, мікротитраційний планшет (Махізхого Мипс) покривали рекомбінантним ПІІ22К 2 мкг/мл (Віотесппе; номер за каталогом 2770-І К) в РВ5 протягом ночі при 4 "С. Планшет промивали З рази сумішшю РВЗ-твін і блокували протягом 2 год. 250 мкл РВЗ-1 95, казеїну. Після З промивань сумішшю РВзЗ-твін наносили зразки. Усі розведення готували на 1 95, об'єднаному

Зо пулі плазми (це пул від З нативних мавп циномолгус). Зразки залишали для зв'язування на 2 год. при кімнатній температурі. Потім планшети 5 разів промивали сумішшю РВо5-твін і поліклональні антитіла з адсорбованими важким і легким ланцюгами козячого біотинільованого антилюдського дО, зв'язані з НКР, наносили в 50000-кратному розведенні (ВеїпуїЇ, номер за каталогом: А8О-319Р) і залишали для зв'язування на 1 год. при кімнатній температурі. Потім планшети 5 разів промивали сумішшю РВоЗ-твін і додавали реагент 5(Н5)ослаблювач ТМВ (5ОТ, Ж 5ТМВ-М). Забарвлення проводили протягом 10 хв. і потім зупиняли додаванням 1М сірчаної кислоти, після чого вимірювали оптичну густину при 450 нм. Зразки аналізували З рази, і 230С9-М2970) (з тієї ж партії яку вводили тваринам) використовували для побудови стандартної кривої.

Відповідні фармакокінетичні параметри для аналізу двокомпартментної моделі при в/в інфузії наведені в таблиці 29. Фармакокінетичні профілі антитіла 230С9-М2970 показані графічно на Фіг. 12 (наведений результат є середнім значенням для двох мавп). Ці дані чітко показують, що антитіло має тривалий середній час утримування (МКТ). Цікаво, що хоча 5О0 антитіло містить неглікозиловану Ес-область /дс1і без яких-небудь модифікацій, що забезпечують підвищення періоду напіврозпаду, період напіврозпаду 230С9-М2970О несподівано був високим. Зокрема, 230С9-М2970) має період напіврозпаду, що дорівнює приблизно 19,4 доби. Таким чином, очевидно, збільшений період напіврозпаду антитіл за винаходом обумовлений властивостями Раб-областей.

Таблиця 29

Фармакокінетичні параметри

Подальше фармакокінетичне дослідження проводили на мавпах циномолгус при однократному внутрішньовенному введенні 230С9-М2970) у дозах 0,1, 1, З, 10 ї 30 мг/кг у цілому 10 мавпам. Кінетика у мавп циномолгус демонструє двокомпартментну нелінійну кінетику.

У дозах нижче 10 мг/кг кліренс (СІ) збільшувався зі зменшенням дози, що приводило до пропорційного зниження біодоступності (АС) зі зменшенням дози. Це добре відоме явище для моноклональних антитіл (див. таблицю 30 і Фіг. 13).

Таблиця 30

Фармакокінетичні параметри у 2 мавп/дозу і в 5 групах з введенням різних доз

Параметр | Значення | Одиниці | бмбет | СМ, і мкто | 7710 | мк/мл. | 001 | щ 996 2 щМК

Масштабування цих параметрів для прогнозування фармакокінетики у людини дає профіль у людини, подібний з тим, який можна було очікувати на підставі емпіричних даних, одержаних з іншими молекулами ЇдД51 людини, включаючи точкову оцінку періоду напіврозпаду у людини (1725), що дорівнює приблизно 18 діб, який узгоджується з результатами попереднього дослідження, наведеного вище.

Приклад 14. Фармакодинамічні ефекти (РО) антитіла 230С9-М2970 на мавпах циномолгус

Фармакодинамічні ефекти антитіла 230С9-М2970 (АВОИХ-112) досліджували на мавпі циномолгус при внутрішньовенному введенні мавпі антитіла 230С9 у різних дозах (0,3, 1, 3, 10, 30 мг/кг). Зріз шкіри мавпи також обробляли іміквімодом (ІМО) для оцінки впливу 230С9-М2970 на шкірне запалення. Повідомлялося, що ІМО) викликає запалення шкіри у мишей (Мап ВеїППе егаІ., 2012, 9. ІттипоїЇ. дУап 1; 188(1):462-9), і в одному повідомленні також були описані аналогічні ефекти у приматів, відмінних від людини (Роїгіег еї аїЇ.,, 2016, Ехр. Оегтаг!цої!. Маг, 25(3):233-4; Роїпег еї аї., 2016, 9. Іттипої. дап 1, 196(1):274-83); і у людини (Міпієг еї аї., 2015,

Вг. У. Оесгтацої. Рер, 172(2):345-53).

Зо Через 5 діб після обробки ІМО відбирали біопсійний зразок з ділянки шкіри, не обробленої

ІМО, і ділянки шкіри, обробленої ІМО, для оцінки ефектів 230С9-М2970 на дію, викликану ІМО.

Ефекти оцінювали порівнянням товщини епідермісу і частоти проліферуючих ядер в епідермісі (частота Кіб7/-позитивних ядер), і результати показані на Фіг. 14. Зростаючі дози антитіла 2300С9-М2970 були здатні нормалізувати товщину епідермісу (Фіг. 14А) і зменшували частоту

Кіб7-позитивних ядер (Фіг. 148). Значення ЕСзо становило приблизно З мг/кг.

Приклад 15. Взаємозв'язок РК у сироватці крові і РО реакції відповіді шкірного експланта після однократної інфузії 230С9-М2970) у мавп циномолгус

Контактування шкіри з мішенню досліджували на мавпах циномолгус, яким внутрішньовенно однократно протягом 15 хв. вводили антитіло 230С9-М2970 (у дозі 5 мл/кг). Самок мавп залишали без обробки або піддавали впливу антитіла 230С9 у дозах 1; 5 або 30 мг/кг у день проведення випробування 1 (по три тварини на групу). Кров відбирали у всіх оброблених тварин (Зх150 мкл) в різні часові точки, при цьому останній зразок відбирали на добу 7. Зразки сироватки (1 95, об./06.) аналізували на рівні експозиції 230С9-М2970 з використанням ЕГІ5А.

Зразки шкіри, одержані пункційною біопсією (3 мм), відбирали на добу -1 (до введення) і добу 7 від кожної тварини і інкубували в присутності (доба -1, доба 7) або за відсутності (доба 7) "І -22 протягом 24 год. при 37 "С у вологій атмосфері повітря/СО» (95 95, /5 95, ) перед вимірюванням рівнів мРНК Р. с2 за допомогою кПЛР. Результати показані на Фіг. 15.

Стимуляція ПІІ -22 приводила до 5-кратного зниження загального рівня мРНК Р 2 у шкірі.

І -22-опосередкована репресія транскрипту БІЇО2 достовірно відновлювалася у тварин, оброблених 230С9-М2970), що вказує на значний вплив на шкіру у всіх групах з введенням різних доз.

Приклад 16. Вплив 230С9-М2970 на життєздатні шкірні експланти людини і мавпи циномолгус ех мімо

Для оцінки здатності антитіла 230С9-М2970 інгібувати рівні МРНК ОЕРЕВА, індуковані гп1І--22, використовували свіжовідібрану шкіру з області живота у здорових донорів.

Зразки шкіри, одержані пункційною біопсією (З мм), поміщали у вертикальному положенні в 96-ямкові планшети для культивування тканин і культивували на границі поділу повітря-рідина в 100 мкл середовища Ерії їе, з додаванням добавки для росту кератиноцитів людини (НКОБ5) без гідрокортизону (Іпмийгодеп).

Зразки інкубували зі зростаючими концентраціями антитіла 230С9-М2970 протягом 24 год. при 37 "С у вологій атмосфері повітря/СО» (95 95, /5 о, ) перед стимуляцією 20 нг/мл гпІ--22 (НО Бузієт5) протягом ще 24 год. при 37 С. Відносні рівні експресії гена ОЕЕВА у лізатах шкіри визначали кількісною ПЛР у режимі реального часу (кКПЛР) з використанням валідованих аналізів експресії генів (Арріїй Віозузіет5) і системи визначення послідовності АВІ РКІЗМФ т90ОНнт.

На Фіг. 16 показане дозозалежне зниження рівнів МРНК ОЕЕВ4, індукованих гпІ-22, по даних одного репрезентативного експерименту (ЕСво ІСІ95 95,1-4 НМ 10,5-29 нМіІ; 4 донори).

Аналогічну ефективність одержували при збільшенні часу попередньої інкубації 230С9-М2970 до 48 год., що дає підставу передбачити досягнення рівноваги зв'язування ІІ -22КА. Контрольне антитіло того ж ізотипу не виявляло впливу на опосередковані гпІЇ-22 підвищення рівнів МРНК

РЕЕВА.

У свіжовідібраних біопсійних зразках шкіри (З мм) від мавп циномолгус (Масаса Разсісціагів)

Зо ген ОЕЕВА не регулювався г -22. На противагу, як РІ С2, так і ГОК піддавалися понижувальній регуляції після 24-годинної інкубації з Пп -22 з використанням того ж протоколу, який описаний для дослідження зі шкірним експлантом людини. Дані реакції повністю блокувалися 24- годинною попередньою інкубацією з антитілом 230С9-М2970 (ЕСво-11 нМ; обидва гена), як показано на Фіг. 17.

Приклад 17. Ефективність антитіла 230С9-М2970О на кератиноцитах людини

Дизайн був розроблений для тестування активності анти-ІЇ-22В-антитіл у функціональному аналізі на первинних кератиноцитах людини. Клітини стимулювали сумішшю цитокінів ІІ -4, ІІ - 13, 1-22 (усі 10 нг/мл) і ІЄМ-у, 1 нг/мл протягом 48 год., і потім у культуральному супернатанті вимірювали рівень ССІ 2 з використанням платформи М5О.

Кератиноцити суспендували в середовищі ЕріЇйе (Ійе Тесппоіодіе5) з наступними добавками для росту: ЕСЕ; ВРЕ; інсулін; трансферин і гентаміцин/амфотерицин. Клітини висівали в 384-ямкові білі проксі-планшети (Регкіп ЕЇІптег) і інкубували протягом 2 год. при 37 2, в атмосфері 595, СО2/95595, повітря. Потім клітини обробляли 80 нл антитіла (у різних концентраціях, як показано на Фіг. 18) або носієм. Потім додавали 40 мкл стимулюючої суміші (1-4, 11-19, 1-22 (А 4 О зуз(ептв, усі в кінцевій концентрації 10 нг/мл) і ІЕМ-у (К 5 О 5узх(етв, кінцева концентрація 1 нг/мл)) і планшети інкубували при 37 "С, в атмосфері 5 95, СО»2/95 Ор, повітря протягом 2 діб. Контрольні ямки обробляли сумішшю 1-4 і 1/-13 (обидва 10 нг/мл) і

ІЕМ-уУ, 1 нг/мл, і визначали 100 95, інгібування сигнального шляху 1-22. Концентрацію ССІ2 у культуральному супернатанті вимірювали за допомогою набору М5О ССІ2 (МезозсаІе Саї Ж

КІ51АУВ-2). Життєздатність клітин оцінювали з використанням реагенту РгезіоВійеФф.

Активність-23009 М2970) тестували в 5 експериментах, і було показано дозозалежне інгібування рівнів ССІ2 зі значеннями ЄЕСво 0,10 нМ 10,042-0,24 нМі|і. Репрезентативні експериментальні результати одного дослідження показані на Фіг. 18.

Даний винахід не повинен обмежуватися в обсязі конкретними варіантами здійснення, описаними в даному документі. Фактично, різні модифікації винаходу на доповнення до тих, які описані в даному документі, стануть очевидними для фахівців у даній галузі техніки з попереднього опису і супровідних креслень. Передбачається, що такі модифікації входять в обсяг прикладеної формули винаходу. Крім того, усі варіанти здійснення, описані в даному документі, вважаються широко застосовними і можуть комбінуватися з будь-якими і усіма бо іншими сумісними варіантами здійснення, залежно від ситуації.

Перелік послідовностей «1105 Ариженнко БЕБА іо Антв- т-ва «ІЗ РЕА МВОМО «Ві» бВіб5і-337.4 «ІІ» да в-п7-15 ків» 151 «Ї702 Бабевсїв уетвіст 3,5 «вій» 1 «ії» Зо «Ві2» БІЛОК «213» Лама «аврох і бів Уві біз бе) Узі бій бек і ОіуУу Фіу їєю Уві біп ко бі Бу 1 5 18 15

Бех без Ак без Зехї Суз вйіа діа Бех С3у Бе ТВх РБе 5ех 50. 5 39 «іх «2112 5 «кіз виюК хай» Нами «ап» я дежтх Тук Авур Меї Зек 1 5 хіп» З «вії» 14 «Вій» БІЛОК к2і3» Дама «00» 3

Тер уаї Ака бій йіаз Вко сі був Бі тен бій Тер уді бех

А 5 16 ків» 4 «гії 17 «дій» ВЕЛОК «ії» Лама «0 5 дех Її тує вбив Взо бБіу дек Ави їх Віз Тук бЗехб Азр дех Уві Буз і З 18 15 піт «шій 5 «Ай а чі БІЛОЮ «віз» Дама «4005 їх

АхЗ Рбе ТПжх їїє ЩХех Аз до Авц ія уз Ав ТВх ви тую Бей 1 ї У 12 15

Меї Аза деж пев буд йевк біб Ав ТВх Аза Уві Тух Тух Суз Атїа Буз зр д Й "ві «М ак зо «І» в «В1їз 11 «вій» БІЛОК «кіз люма. «Во» 5

Уві біу Бпе бех Зіу ТЕ ТУук Тух Бех біб Бех і 5 15 кі 7 «2І1К2 13 «ій БІЛОК кгі3» Лама «400» 7

Тхб біу бів біу ТБх Біб Уаї Ту Уві бек Щек 3 ц 150 «Війх 8 «Вії 30 «дій» БЕНЮК «813У дама «00» В сів хаі вій цей Узі сія бек 5іу бБіу зіу Без Ууаї сів Брз сБу др і У то 15

Зак о їв»вои ка їем ек Суч« віз Аза Беж біу Бе тах бе Бі

В 85 за «вій З «11» «Війх БІЛОК «8513» лама

«пох З ек Тух Бе Меї Бех і 5 «ам 1 «211» 14 «312» БІЛОК «213» Лама «од» 16

Тк» Укі Аху біб ліз Рхо б1іу уз БІіУ Бхо сіз ТЕвВ Уві ес 1 5 10 «8105 ЛІ кіз 47 «ій» БІЛОЮ «щі13» дама кзОов біу ї3їє Ні (16 бек бБіу іх їїі6 ТВЕх Тух бух йец Авр. Чех Уві Гу

З З ї8 15 віу «ій 35 «віх 3 «Вій» БЕНОК «5ії3» Лама «4005 15

Ак Ре ТВ: ї1і6 ех АгЗз Ав Ан АТ бе Ави ТВх без Тух ев ій і 5 18 15

МеЄ Аза вап осей був РЕ бів Акр о ТВ Аза Уві Тух Тук сСув чаї ТОЖ 2 25 Зо «210» 15 «ії» 34 «вів» жІЛОК «дії» лама «яп» 13

Вус Вк» йіу Бхб ВМе Муз Дій Ні тТук би Яіу Мей Бу Тук 1 З 16 «іо» 14 «8112 її

«215» БІЛОК каі13» Лама к800» 34

Тхв Бу бух пі Таж бео у«і3 ТНу Уві зЗех Бех каійз 15 «81їх 8 «іс» вІЛОК «8135 лама «Ох 15 дз оввпз Мек їн Твх ік Рро Зех Аїз узі беж Заї ех бйем біу 518 1 КУ 18 15

ЖНЕ діз зузв її ТВх Сув

ЕЕ хЕі05 16 «81їх 7 «вій» БІЛОК «213» Лама «ох ї5 зів осі Бу Ту Тух біз Нів 1 5 «105 17 «рії» 15 «із ВБІДОК каї32 Лама капа» 17

Тхр Тук Сіп б3ів бу Бхо Шіу бів із бго Уа) цею» Уеі І16 Тух

З 15 15 1 З кіт 18 «гії 7 «ій БІЛОК «2135 Лама «ясно ів піу дяй Ази дкв Ах Ру веж 1 З «їз 15 «511 728

«212» БІЛОК «135 Лама «300У 189

Аки тик Аіїз ТВК їм ТВх Із Бех С5іУу діа бів дія бій Авб бів дія 1 х ІЗ 15

Зі Ту Тух Суз 29 і го кіз 10 «218 ВІНОК «Ві» Лама кадо» й зіп ех СіУ Бех Хек Бех діз Двп Аїз Уві ї З 19 кетоз 23 «2ї1їх 10 «122 БІЛОК «213» Лама «ах 21

Ре біт Бу сіу Твх нів без Тк УдА ев 3 5 16 «вій» 29 «11» 95 «війх БІШЕ «кіз лама ха» 95 ази ге Мак іч: Твх бів бко Бхо Яех уз) беж МУ ТИЖ їжи БУ Був. і х. то 15 тиж Чаї Тв ї1їе дех Сук «ід 73 «ДІї» 18 «кій БІНОЄ «Еі3» Лама «во» 95

Тв біу ТвЕ Бех дкуЗ Вар Її фу Авр о Тук Азп о Тук уві дах і ве 310

«дій 24 «Зі1їх 15 «вій» БІДЮК «Ві» Лама «5005 24

Ттв о тТУх БІО бів Бей Рко БІУ Без йї3 Бке Був Мей без їзїе Тух ій 5 їз 15 «Мі 95 кві» 7 «Вів БІЛОК «ВАВ» Лама «40805 85

Бу аз Ап ївВх бе бек ек «102 КЕ «31їх 5 «812» ВІЛОК кхгії» Лама хай» ЗБ

Вап оТпЕ біз Жеї Без ТБЖХ Її2 бех біу Без бів Бех біз бар сі) дій 3 5 18 15

АвротТук Тух Суз о «від» 27 «Вії ло) «вій» БІК «ім Лама «800 77

Аа Бех Туг Ах їво Тух Аза Ар тТухк Уві їй У 15 «дів дав «вії» 10 «дія» БИК с13х лама «а» 95 ве пі бі Бі ТБх Нів Бей; ТВвж Уаї бе) ії З то

«23» 2З «віх 180 «гі1ЗУ БІЦОК «іл» ЯЛзме «Із хо сів баї бів без уві біз Бек біУ біу піу їєз Узі бів Вхо сі Біу 1 БУ ї5 ї5

Бетс рез Аху Сей бек Су ВІЗ Лі бек біу вве Тах Ре Зек щех тТух 2о 25 зо

Ахв Меї дех Тур Уа) Ахо бБіп вія Бхо Бі Сеуз біу Беб Бім Тхр о Уві ча аз вах Бек Зі Тухк деп Ав пі Бех АяВ ТЕ Аіа Тух Зек др йех Уві 50

Був піу дк Ве ТвВкх їі бек бгу йвр Аво діа Був два отв Без Тук 85 70 та зо ім піп меї АзбоБек іжи Бо ех єї Бер Тпх Аза Уулі Жух Тух шШуя 85 зо З5 їз цу Уві Сіу ВМе бек бі Так Тук Тух бек біз йдех Ткробіу сів 189 105 316 чім те зів Уаі Тих ові бЗеєж дах 115 ії38 «віх а кхвії» 103 «305» вІДОК «132 Лама каз 30

Ази вве Мекоїао Тк бів хо бек Аї5 Узі бек узі вк Без о1їу БІВ 1 5 30 ї5

ТвВк аіз Муз її» ТВвх Сух Пів БіУу Біу Тух ТуУжх Айїа Біб Ткр Тух б5ІВ я З 35

Бі Буз Рхо біу бів Аза РЕо Чаї без Уа) Хі Тух бБіх Авв Ав Ави 55 45 45 куп Бко бах 51У ї1їв Рко біз Ах вле бех ці бек бЗех дах о1у Ав

Ко) зе «0

Тих діа Тах іїжо ТАХх її беж піт дів бів Віз 35 Вво сім Аза 51 й ча ТУ во

Тук Тук Сух й5)10 Зах 01т ех Бех бех Аїа Авп о Аїа Чаї ре йіу щу

Я за з щу ЩЕ НЕ Бей тах чаї Бей 3953 «віз Щщ «ії» 153 хаіїг» ВІДОК «15х Лама «4дох зу

Біб Чаї був без ув) піз бек біу біу бі їв Узі бів ро біч Авр ї 5 15 35

Хек Без дк їз дек Сув Біа Діаз Бех Бі Бе ТВЕ Бе зЗіу 5Звт Тук

ФУ 5 30

Бе Меї ше: Ткр уві Ага бБіп о Аза Бхо сі Пуя зу рхо БІО Тв Уа 35 40 45

Чек біу їіз Ніх Хі) бак біу спіу їі тТпх Тух Тук їз Вар бех Уві

БО

Гуз Бі Яха бле Твх їз Ввх дк Ар дев Аза МУЗ Ави ТБх їєю ТуХ що то 78 зо їв бій Меї Дяд о Аво цем Буз Рко бі Взо Тв Аза Уві Тук Тухк Суз ях з0 35 чаї Тв ро Вко с1у бко ББе Бух« Віа Ні Тух АБ) біу Меї пу Туш їао 185 що тжв лі Бух СІ1Уу ЖЖ ім) Уві ТВК Узі дех Бек 115 зи

Ач КУ «210» 32 ккіїз 119 «щі» БІЛОК

«Ккі15з Лама «100 ле

Авв рве Мек Беш ТЕ бів Рхо то Бех Узі Зек бішж ТИХ бе» Біу БУ5 ї 5 19 15

Твж чаї Тож їі Бех Сух ТБх біу ТВу бех да Аз їі БіуУу Аво тує «й 25 35

Ап отух мві Бек тТЕо Тух Біб біл Ме Ехо ЗУ во) Аза Рхе Був Бем чо 45 їви Іі ТУук Пуз таї дви ТИХ Ах дех Хех сіу ТВх со Авр обкя Впе ко 55 5О ет пі Зежх Муз беж су Ва ТМ дів Зежх їй ТВ бів бех БіУу Бе 52 Ти ТЕ чу

Зіп бек бід) зв 53» Аза Аво Тух Тух Сув Аїа Бех тую Ата беб Ту

ВО З

Аів зр ТУух Чаї Впе слу Бі біу ТВк Ніж Пец) Тпж Уві бе 150 1855 10 «2122 3 кхаів 35 «жі» БІЛОК каії13з Лама «Оз З зів Уві вів без уві бів вес пБіУу Біж іуУу цем УЗ Бів вже бу БУУ 1 Ко 15 і5

Бек без ака ем Бек Су Аза Віа беж вБіу Кпе ТВХ РБе Бех

О З За кій» 38 «віїУ 5 кві» БІЛОК -кіїМ штучна послідовні» «их «223» фраиємент варіанта зародкового типу звтивіяа «00» 34

Хвзк Тух АвроМеї дев ії 5

«10» 35 «вії» 134 «Вії БІЛОК «ІЗ» Лама к4а005 55

Тхр Ууаї Ахо бів Аїа Рко пі» Буз Біу їж 03» Тхроуаї Бек 1 5 18 «21072 ЗБ «ії» 17 «210» БІЛОК «13» Шетчна послідсвність чего каеВЗ» Послідовність заріакта зародксвоко типу авититіла «3305 36

Бех ї1їє Тух бий Аяр Аїів бек айви ТНЖ АБа тТук Беж двр 5Зек уві цу 1 5 ї0 15 піз чу квіпУ 87 «ій БІЛЮК «КЗЗ щЩеУчма ПОСсЛіДдеВнНість кейОх «Фї3» Послідовність варіанта зародкового типу антитінпа каооз 37 ка Ббе Тв їіз 5аг Ако ДВБ одяг бак БтУуя Ай ТВ о бец Тух б6з БІЙ х їх 10 15

Меї Ах о бек їви йко А1з Біб йяр Тих дів Уві Тук Тух Суз біз бух ке 25 З «2305 Зк хаіїв ЛІ «їй» БІЛОК «ії штузна послідовність «дей» «ВІЗУ Посвідовнусть варвійнта заВедкового типу звевтіня «ай» ЗВ

Тхр Бі бі» Зуу Твх Бей Уві тах Уві Бек ех і 5 18 сиіїі05 18 «гії: 39 «ліво БІЛО жкегїї» Нама «апа» 33 піп туяі сі) ви Уві Бій Зех бі бі бі рез чаї бій Бко Сі 515 1 З 180 15

Бех пец де Бей Бех Суб діз вій чек БІ рРБе Таж ЕНе Бех 2 5 за «жі» 49 «вії» 14 «війу ви «віз» Дама кад» «о

Тхр зії Ако піп дів ро біу був сіу Рко біз ТЕр уві Бех 1 5 195 «вій» я «кіїз 17 кої» БІЛОК сті» штучна послідовністіх «чада «223» Послідовність взрійнта зародковоко типу антитіла «00» 41

Згу іє ба гів Бек сь біуУ Ті тТНЖЕ тую туї тТвВх Авр очах Маї Ба 1 З 10 15 пу «210» 45 «вії» й «1» БІЛОК сеі3з шеуУчна послідовність «тб «ВОЗ Послідовність варіанта зародкового типу зититіпа «0 аз

Ако пе ТВх їі Бех дк Авр дя діа Був вп оТвх без Тух Цез бій з 5 Іб 15

Меї джа бек їжи Ака Аз 515 Ар тн Аза Узі Тух Тух був Уві ТБЕ зо 8 зо «іх 45 «Вії 18 «812 БІЛОК «віл» ЩШтучма йрелідсвнікте «ийох «ВИ3У Послідовність зарізита зародковоко типу звититіла «400 43

Бхо ро бі рхз БвБе муз Віа Ніз Тух йзп о сіт Аза Був Ту 1 не ІЗ «518385 44 «ії» 11 «їі» БІЛОК «2132 Лама «ар» а

Тхв щіу Ту 1Уу ЖЖ о бва Уаі Тех За) Бех Зак 1 5 іп хеїйв 45 «-51їх 57 «812» БІЛОК «213х дама «00х 45 їв» Бхо Уві їжа ТВх іп орже Хежї діа уві Бек Ува. бек гемо сву сіїп 1 5 13 15

ТвВх діа вуха ї1із ТВх Су а «210» 45 «вії» 15 «ВІхх БІЛОК «2135 Лама «чо»

Тхв Тух Біл сій Буз Бтз Біу сів віз хо уві во Уві Їіє Ту х 5 їх 1і15 «210» 47 «Ії 7 «Вів» вШшКЖ

«Іа» Лама «ах 87 с5іу піп АхМй дав дЕч вхо пах 1 В «і» 48 «ії» о «аі2з БІДЮК «213» Лама «щнх 88 дап о тТвК вха ТЕЖ Без) ТБжх Хі Хек 5іУу Азїз бів Аза щі Ар обБін діа 1 5 18 15

Бі Тух Тук суз за «21йх 45 «ії» 10 «ій» БІЛОК кій Лама «яз «58 вве Бі пі Біт ТВА Був йбем ТБжЖ Уві ред

ІЗ Ко То кій» 50 «112 77 «дія» БІЛОК «433» шШтучма пеюгблідсвність «дО кааа» Посвідсовмість варіанта зародкаовоко типу антитіла «кв 5)

Бек Тух бі: бео ТВ Зів фегз бех Бек Уаії Бех Уа) Аїз Мео ЗУ са н: а Іо 15

Тих Аза Акта їЗе Тнюк Су за ах «-й10» і «а «гів БІЦДОК «кі» йвме «400» 51

Тев Тук піл бів бує Бо бі бій АТа Рко Уаї їй Уаї Ті Тук 1 З 19 15 «війз 5 «211» 360 «125 БІДОК. «813» Нама «4ПОх 5?

Сув Аіва БУ ЧіУ Тл зЗЬу Сув Аза БіУ Сух Тк о Су СБУ Те бі 1у

З 5 15 15 дів сіу ТВх Суз Твх сіУу ШЩіуУ БіУу сі» біу Аза Б3уУ у Сув тТВЖ тах о 28 ЗО

Бім Яіу ТВк біу Сух Дів б1у Суз Сув ТВЕ біу 5іу біу Б1іу б51у Трг еВ 45

ТНЕ Суж ТУ Суї ТНК бію діа 815 діа буз Тих Суб тТвк Сув суб ТИЖ

За ва во ві Тнх біу Сув Аїа біу Суз Сув їпж Суз Тпс бБіу 01у Аза ТвЕ ТЕХ 5 7 75 ва бує Ата був був Тв тТМвк Сує А1з 619 Тйх Аза 5319 був Твк Аза Сув 85 90 З5

Є1іу Аза Сув Аіа ТВх сіу Аїа піу Суз Трх біу біу сіу Ту був Суб 100 155 по сіу Су Суб йіа біу б1іу Сув Тв Сузв Сув дія біж бі біт Аіа дів і. 120 125 1у біу сьу с1іу був ТНж Б1у с1у лій сіу ТЕ БіУ СТУ бу твх б1у 130 135 140 тТМвт Сух був діа біу Тих Віа Тих Ту Тих дія ТВх діа Аіа Твх біт 145 ї50 155 150 їз Суз піу Біу ТНУ Я)іа с15 ТВ Аза ві: сув Аіа Сув Аза пі був

Шк 170 175 бує ТвВЕ Аїа Тркх Тв був Аза 5іу Аза Сув Тахо Суб Сув сіб Тв о біу 189 85 195

Аза Аїа Біх сФіу БІУ Сув Суз біу йїа ТОх Тпжх Суз діз Суз Суз АМча тТвк Суз ТВЖ Суз бу дів су віз сіу дів Сув Аза Аза був щіу су хо 215 йо уз Аза Дів сіу Аза Аза сСуз віз бух бі» ТАХ ТВі біу тТвх дЬз ТвЕ та 30 Кк 2 ув Твх б1у Суз Віз дів діа ТВХ Сіу Азія Аів Су діа Сіу Сув ТНх 245 5 2555 твЕ оіу вій ліз вза Твх Суз ТВЖ Ф1у Аза бБіУу піт Аза буз Діва сСув ви ва 23 пі біу Сує Сув 019 Твьу біг ТвВу дів Тв Тву Віа Сувх Твк бі ТВх 275 280 285 5іУу Суз Аа Аза віз ліз сі» ТВжЖ Тахо біуУу Зіу був ТнНжЖ Тих ТВ Аїа їв 233 зо

Сіу Тех осіу біфу їпх біз Сув ТвВх ТВх Ліза був Твнхї діа Сув Аід БІУ

ТтТнЕ Б1у Аза Аза тТВК Суз діа ТвВх 1 Бі щу сі Суб був Віа у 325 130 335 біу біу Біу діз Сух Суз Сув віз бі5 біу ТВх Суз Аіа Сув Сув З1у 380 зав з50

ТтвК об1уУу ТВу Су Су ТВІ був о Аза 855 зка кгіоз 53 «віїх 7 кеій» БІЛОК «13» Штузна послідовність «ОХ «23» їКнолеюдовність варіанта зарзджевото ФвпУу анжитінва «00» 55

Анип ТЕ дів Ту бец ТВЕ Іі Бех ха Діє 035 Азія бів Авр обі іа 1 5 16 ії

Азов о тТук Тух Су го ки» 54 «ії 10 «ій» ВІК «вій» щеечна послідсвнашсжи «ших «Кі» Послідовність варіанта зародкового типу антитіла «ОО» ва

Бій БЕК Бі ВБк Зек вах Беж Аа діа Уа

Її 5 15 «4105 55 «ії» 10 сеї» БІЛОК «вій Штучва послідовна шже «ах «ваЗ» послідовність вазріакта зародкового «вйу антитіва «ОО» 55

ВМНе біт бі Бі ТвБжЖ пуз їжа Тех баі Бец ії 5 12 «ідо я «їм 5 кій» БІЛОК «813» щеучняа лесі дсієть «ЕвОох «ВЕЯ» Послідовність зазріснта зародкового типу антитіпи кЗщОз 5 вів бак діа без Тв пів Во Рхо Зет Чаї Зек біу Бех Вк сту 51 1 З 15 їх

Бех Уві Тих Ті дех Пув за

КА квій» 57 «83ї» 34 «дій» БІЛОК «ам цвезНна посЗзідавність кв «ше3» Послідоввість варізнта зародкового типу звтитіна «400х 57

ТВк б5іу Тйх бек ех йзр їїє «ту бек Тух дзо Тук Чаї Зек 1 5 10 «210х 58 «вії» 15 «війх БІЛОК кі» Штучна послідовність кад» «083» Послідовність зарійанта зародкового типу антитіла «400 58

Тхр тТужЖ бій бів їжи бхз біу Був Вів Рхо Му їні їею х3Зе ТуЖ і 5 10 їі «810» 53 «3ї» 7 «219 БІДОЄ «Вій» Штучна послідовність «вх «сеї» послідовність варіанта зародкового типу знититіла «400 5 піз Уаї Аза був Зк бах дек 1 5 «віз й кВії» 80 «Вії» БІЛОК «213 Штучна послідовність «кам «г23У Послідовність заріантз зародкового типу зититінла «400х БО

Авпожнця Афз Бек би Тк їіе сеї бі Без сіб Аза сів Ав обі Віа і 5 18 ІВ

Авротує Тук Суя 2 «дій ві «Вії 10 каїй» БІЛОК «шіЗх лама «43п0х сеї пе Фіу су Ру Так бій Бей Тк Уа фе 1 З 15

«ві» бе «екіїз 103 «да БІЛОК «кі» дама «й» 53

Пен Вк: Зві цей) Тахо щіб Во бек Аіз Хаї бек Щі бек ва б1фУу ай 3 З ІВ 15

Ти: діа дхз Тіє ТВх Суз бів щі бжу Тух ТУ Аіа Ніз Тхр Тук БІВ 2 25 30 ів Буя Рхо 5іуУу іп дія Рко Узі Брец 9а3 їі Тук біу бій В85в Аа за 35 йко Буб ак 01у сів его Біб дкз РБе ех піт Бех біу Віа піу дв

ЗО 55 ко

Тих діа Твжх Ген ТВх Її ех пбіу Аза бій Аіз піз Авробій Аза 01

У за 75 Б

Тух Тук Сув зів Бек слу Зех Бех бек Азіа Ав» Віз Уяі Ре Бі 515 85 за з5 піу ТБу Був бпейх ВХ Уа ев 100 «хів» ві «ії» Ії «вій БІЛОК «хіх йШеучнз послідовність «ФРОх «ВЕ Послідоввіствь варіанта зародкового вип антитіла в «4002 Б сів Уаї бій рев Уі «Ма бек бту пі Біу во маї бій хо пі БІ1у 1 З 10 15

Беж бйей дз без Бех Суз Дів йіа Бех 5іх Ріе ТВх вне Бу Зек ТУЖЕ хо 5 КІ дер Мек лап отТхр оУЗі да іп Аза Бхо піу Буз Б)» бва бій То УаЇ

МУ 40 35 ек бах Її ТуУух Ля» дзр Дія Бех дз ТВх із Тек бЗех двр Бех Чаї

За 5 що

Був Сіу Ах Не Тк їі беж йго Авр о дя бех Був Аза Таг оїз Тух ей бів Меї Ави бех без Ах Дів сій Авр Тпх Аза чаї Ту Тук пуб 55 Зо ах

Аза Був уві 01у РБе Бех су КВж тує Хук бЗех чо Зек тер зу вів їп8 іп що

СіУ ВЕ Бей Узі ТБу Узі Век Зех 115 їхО «810 о «Вії» 153 «1 БІЛОК «кій» Штучна послідоввість «ВО» «ги3» послідовність Баріавтя Ззародковаоро типу антитіла «800» ва

Бех ТуУк пі) Бей ТАх бів рез бек Бек таї Зех Уаї із Без біу бів 1 5 18 15

ТвХх Аза Аха Ху Твх Сув О31в бпіу Б1у Тух Тук ів Вів Тхр о Тух Із о 25 Зо сів був рхо б1іу бів діа Рго Уві Ген Чаіїі із ТуУух біу бій Аза вл 35 Се 45

Зкч Ехо Бех Бі її Бко Бім Яху Ве бак Біт беж пі від біу два за 55 Бо

Твх Аія Трх пем ТВх Ї16 Бех дк Аза бів йіа 61) двр о біч діз дю ва 70 75 во

Тух тТух Сув бід бек Зі ех бек беж вк двї ліз Уаї вме і Бу зо 5

Оу Тих Буд їво ТВу Уві ем 389 «І0О» б «Віїж 183

«вій» ВІЛОК «МіЗх ШПтузва зослідеоввість «ах каві» Послідовність варіанта зародкового типу анти Ртіля кад» Б біп Уаї пів Бей Узі бій Явк обі Біу 219 їм ув бів жо піу БІК 1 5 10 15

Вех ї2о дхФ Пес бетх був А)із Лія Бех бі Ре ТВу Ре Бех Зевх Тук о ж 30 вве Межє дек Тхор Уві йха щі Аза Кхо сі» Буз Біу рко біш Тхр Узі зе чо 45

Вех Бі Хі Нів їі бек Зі с1у Іїе ТтТВх Тух Тук ТнХх Ввр Хех Уді

За 55 5 пуз бБіу Ак Ре Тис Її бек Аху двр Аякп Аіз пу Аза ТВх цей Тух й 7 та но

Мев обід Меї Або бех бео Ако Ліз Бі Ар о Тве діа Чаї Тук Ттк сСух 85 за 5 таї ТнЕ Ехо бго 03іу Рхо Ре буз дія Ні Тук Ап оБіу Аїв бує Тук іп а 310

Ттр біу Пувз Біу ТВх Пец уаї Твх Уаії Вех Хех 115 ї25 «МУ пе хлів» 113 «тії» БІЛОК «іЗ» Штучна послідовність кнйх «23» Послідовність варійнта зародкового типу антитіла «вод ве п Зібв Беї із їз ТВ бів Бжо Ро Зєк Заі хек ЗУ ех ко З1ю спів ії З 10 15 ех Уаї Тву Тіз Яек бу ТвВх біу тиж щех Бек Лав Фів бі Бех ТУк о т 30 дав Тут уаї Зех Тхр Тух бій біп без Ро Буу Був діа Бхо буз їец

35 Яо 45 іви Ті Тух сів Уаї дзп о Дуя Ахо беж Бах щіб ді Бкр Ар Ахя ВЕВе о 5 о яву Фіт йех Був беж іу шви ТВг одЛіа пек бва ТК Хі бек БЕРУ Бе 7 75 зо зів діа шій дзв Бізх Аза дяр тТух Тух Сув діа Бех Тух дез Пей ту 5 зо З5

Аіз вер отух Уаі Ве біу Бху щі Тк осів їжа Твпж Уаї Бей ї9о 105 116 «Вій» 7 «віїх «50 «іде БІЛОК «кіз» щоучма послідовність «йо» каз» Послідовність варіанта зародкового тиву автитіла «а. в бів Уві бів мем Уві 515 йех Біу 0їУу Зі Бех Уві сів ро Бі 0І1У 1 5 15 15

БЕХ їм Ах беа Вех Су Аза іа ех сі Ве Ту жпе Бех Зах Т9х о 25 Зо

Азр Ме Азв о бхр Узі Ако сів Аза Рхо пі Бу 1 Без бів Тхр Уаї 5 45 45

Бех сш жїхе ТУК Аз» Ар Аза Бак Ази ТВх дів Тух зЗек Адр бек Хі

ЗО ве 5 уз сіу вка пе ТБу Кіз бех дхЗ Авр Або йех пуб дев тах рев Туш 7 5 о їжи бів Маїс дво бЗеї Без Вия Аза біз дае тих Аіва уві тує ТуК Сук 85 за 5

Ма був уві піу Бе Бвх сім ТвУ ТУж Тух Зек бід Зех Ткр Бу бів 188 55 15

ЗВу Твх Ту Уа) Твж баф бех бех Віз бек Тйх Був біу вхо бек Ув) 155 158 155 пе рРхо бен Аіа Кто Бех Бех Був Бех ТЬх Бек 5Бфу щі ТИЖ Аїз діа її 1535 150 вм сіу Сув їй Уві Бу Авр оТух ББе Кко біз Рко Узі Тих Узі Звж 145 58 їі85 їко

Тхв о аза бек діу 3із їх ТВх бех біу Уві Ніз ТВх ре Рко А1з Узі 155 іо 175 іч сів Зех йеху Біу ец ТУХ дех Бе) дек Бех баї уві ТВх бві бго 180 385 156

Хек Бек Хеж Пи Б1іУ ТЕ Бі Ту Тух Їіз Суз Авт Маї Авп оМів Бу 195 20ю 2705 ко беж Ап тах ПУ Уві Аз оБбуз мув УВА сій Бко Був Бех Суд вв 236 215 22

Був ТВх Нія ТЬк Ста Вхо Бхо Сув Рко Дія Ро віз їжи Бен біу 51У

Ку а 3 240 хе Бех Узі РББе Пе) ввБз Рхо Бто Муз ВхФ Сув Вао ТНх їеи Меб Щїїє 245 Коекя В дех дка Тих ко б5ім узі Таж Сув Узі Уві зі бар Уві Зек нів бІ: аео ев тв джр Рхз бів таї бух РБе Дяй Тхр Тук Уді 5зр дію узі біз Уві ів ї75 286 285 да» віз Буз ТВХ Бу ко Ак бі: Біб бів Тух бів Бех ХВх ЖУух АК

ЗО » 5 З

Уаї чаї Веїх Уаї їмо ТБу Уві Пен Ні біп дар Тхр Гео два б1у Був

За 10 315 Зо

Зіч тухк МУ Суз був Уді Бех Аа вуз Віа бец Рхто Азія хо їле 3 339 535

Му Тих Ії дет МУ Віз уз Бі бій Рко бу бів Бка сій Уа) Ту

За 345 зва

Твх йеи Рхо хз бех Агу Ар о Б)уа Бех ТВОх Був Аво біп Уа бах бе

355 Зо: 65

ТнЕ Сув зви уаї Буз Ф1у Ве Тут рко бах Дер їі діа Узі 51: Тхр

ЕІ 315 За

З15 беж део біу біз ро Бій два Аяй о тТук бує ТВ ТВ Бека Рух» Мах 385 аз 395 380 пев дер Яех дав біу бах ре РНе Ген Тук 5ех Був їею Тих Уві вро» 495 10 415

Був беж Ако Тв б3в сів біу Аза уаі ББе бек Суз бек усі Меї нів 20 125 430 пів йіа пес) Нія Аза оНів Тух Тв бій Ббуз беж іЇмі. бек Їмн; ех Еко 435 340 345 щу пув 456 «Вій» «8 каії2 508 «ній» БІЛОК кій» Штучна послідовність «ей «823» Послідовність варіанта зародкового типу звтитіяа «4005 68

Хег ТУх Бім без ТВх біз Бко бЗег бех уз) Бек Уві Дія см б0і1у 51 1 5 15 15

Тк лйіа вх їі ТвВЕ Су Бів Бі Бім Ту Тух діз Ніз ТЕв тТук бів 20 25 30 біб бук Рко біу піз Аза Бгто Маї Бей узі 1 Тукх біу сій дви Ава 35 40 45

Аха Вкто бех піу Ті бко біз да бе бех Зі Бех біу Ліз 03у До за ЗБ 5О

ТВж іа таж їжо ТВБх Ї165 Беж Аху діа бів дів бій др сіб Азїа Аз де 7 7 КО тТУж Тух Сув дів бЗех піу Бех бах бек бех Аза Дія Уві Ре бі біу

Зо за сіу Таж Муз без ТвВк баі без бБіу бій Бхо суб АТ Віа хо Вех Уа) 1п5 ке

ТВЕ Гей ВБе бкз Бу бех бЗех Фів біз ев іп дів йзап о Буз Афз ствЕ 115 128 155 їер о Уаї Сув цем їзв Зах Дяр Рреа ТтТух Рхо Фіуу Вів Узі ТК Уві Аїа ї30 135 158

Ткр о гПуз Аїіз Дев йех Бех Ро Узі уз Віз бьу тай Біо ТБх тв Тпх 145 ї5о0 ї55 їв

Рко бек Буз біз Бйех Азп Ап мує Тух із Діаз Зех Зех Тух цес бек 155 ї7а 175 їж Трх Рко біз бів Тжр бує Бех Нів Ах Бех Тух бек Суз біп уаї хво 1685 ї5о

Ткх Ні сів» 51У бек ТВ Уві Сів Буз ТВх Уві дів го Зпу біз Сув 135 КО 205 ех «із» й «ії» за «Вій» МІДОК «вій» штучна послідовність «Ех «Ва» послідовність варізнта зародкового типу «нтижекиз «ро» єз біп Уаї біз йжм Уві біч йвк обі біу щі» рей узі Бій хо біу Біу ї 5 18 18 зехк и дхя без Бек Суя віз вій ех біу Бе Тнпс де щех бек уж аа 5 зо

Кпе Меї дек Ттр о Уаї дк бів діз рхо щЬу Був біУ Еко біз Ткр Уві

ЕВ 45

Вевк 519 Ті Нія ї1іе Зех бі с1у їі ТВх Тує Тух Тк дер бек Уві

ЗО 55. 50

Гуз біу Ажа вка ТБ ї1з бек Аху йзр Ахп Аїз бує Ав ТВКк без Тух 55 73 75 но їз зів Меї Аз бек Бей без Аїз 5ів Ав о ТВЕ Аза Уузь Тех Тух сСуз. ва зо Зв

Уві тТВх ркз Рко б1іу Вхо Бе бух Віа Ніж Тук Дех зу Вів був Тук іо 125 315

Ткв осіу ПУує слу Тк їжи За) ТА Уа йех бек Азж бах ТВ був шу 115 ї80 125 тТхо ех ві Ве Ехо Без віз Вжо ех Бех Муз бек Тахо бек Бі пуу ї3а 135 145

Тв Аїз Бьа їв Б1у Суз їеі Ууаї Муз АлротТук бе Рхо бБіє Вхо 581 145 ї50 55 150

ТвВх Уаї бек Тер дал йех БІУ Аза цео Тр бек б3іу Маї Нів Трх Бре 165 І і175 вхо іа УЗі ге) сів ех бек Сім Бев тує Бех Бем бек Бек Уві З8І 150 155 135 тТвх уаі Ехо бех ех йех пе біу ТВЕ бів ТВ Тук Ії сСув Азп ча) 185 го 295

Аза о Нів був Рхо щЩех Аза ТВх Буз Уаї Авв цуз Був Уаї 530 БЕЗ Буз 210 15 ео

Явх Суз Аз» о зуз ТОХх Ні ТВх Су рРхо хз Суз Рко Віа ко 5із грец вда 230 "35 245 їси іж бі5 Рко бек о У«і Ре їз ВВ го рРго руз ро Буз зв ТЕ 745 250 255 їец: Мет їіе «ер Ак ТвВЕ ро Зі: Уаї ТВх Сув Уа) Узі Уаії Авр Узі 255 2785

Зеж Ніз біш Авор Бо 010 Уді Був бе Ахп о Тхв Тух уві Азр о сіу Уві но 285 щіц Майї Ні Аз» Аія муз Тк Муз РЕс Ах із сія бів Тух бів ех 235 35 Зпо

Твх Тух Аку Таї Узі йдес таї Без ТБЕ Уві ві Вів бій зро Тхр сви зве 330 335 Зав

Ави піу Був бій ТУЮ Був Сук був барв Бек Ай був А1а бе) вка лій 385 338 335

Его ї1е біз Був Твк т1іє бех цув Віа був о1у Бі) ко ка бід рго 349. 345 З50 бів Чаї Тую ТВХ Ббем вхо Рко вех дта Авросах цез ТВ пу Ай СІВ 355 зва БЕ

Уві бек ем ТВх Суд їв Уа3і ув біу Бе Тук Рко Бех дво ї1іє іа 379 35 зво

Уаї був тер біо Зех Ав о Зру сів РКО бі Аве Дви о тТух Пує Тйх тах зв85 Зо 335 | о ко Рхо Уві ей дар Бех дер о піу бек ВБіш вве Пец Тух бек Буш Пец 305 31 415 тво Чаї Аве о Пуз дех вх Ткр осів біз зАЖ Аза уві Ре» Зек Суж ау 420 425 339

Чаї Меє Нів п3іо) Аїз Пео Ні Ав о Ніє Тух ТВ біл Був Зек бе Бу 435 «аб 445 іїеи век РХБ Бі Був 459 «вій» 75 «іїх 3816 хі БІЛОК «215» Штучна послідовність «420» хай» Послідовність варіанта зародкового типу антитіла каб» 73 бік Яви Алча їж ТК Бівп РЕО Рго Зах ді йеї сСіу беж Рей сі Бій 1 В то 15 чек Уаї ТВвх Ііїє Зек Суз ТВх біу ТВу Бек Бех Агро Тіє біу Зех Тує 25 БІ

Авп тую уаї бек тТтв о Тух бів біп пев Ре 4іу уз Віз бто Був дей зо 45 бе; їіє тух біб Уді Ав о Пуз йжу бах Бек у баз Бко Авробка впе

Зо аВ 56 цех сіб Бек Буз Бех піу Ав тру Дія бек Бей Тих їі Явх біЄ Гей 7 75 Що

Бі: діз Бій Ав осі Аза Ав о Тух Тук Сух 5іа дехї Тух Вхо Пе тує вх за ЗВ

Віа Ави Тух Уяі РБе біу Ску бу Та бів Бе тах Чаї без с1іу Бів о 105 115 тжо Був Віз Аля Рко Беж уві Твк бе РКе Рко вх бек ех сві хо 115 125 їг5

Мем біп Ліз Азп Муз Аіж ТВу бе» Уві був їви ле бек Ар бе Тук їз 1735 ї15а вко слу Дія Уа Тих У«ії із Тр Бу діа АврозвЕ 5ех БКо Увю Муз 145 1556 ї55 ї5о

Аіа сфу Маіф ім Тве ТЕ ТВк Бго йех уз бій ех Депп дявй був ТУуХ ї55 у 175

Ліва Міз Зак йех тТуУух Бей бек їм ТВх вк Бім піз тв Ббуз бек нів 150 155 156

Акч пак тує йах Суз зів Узі ТЕ нів бів біуУу Хек ТВ Уві вів БУз 1955 205 295

Тк Уві Віа рхо Твж Бі) Сув Бех ї9 215 «ві00» 71 «ії» 574 «із» БІЛОК «шій Бощео зарієпа «яв І

Меї АкЗз Тпх дес бен ТЕ Ті без Твпх Уві Біу еж Гей Аза Аза Ні 1 З 18 із

Ків Бко пів дер обо Бек Ав о цев без 03105 Віз Заї Був Ре бів йех кіз 5 Зо ех дек Ре сіб дж» її8 їжу ТВх ТЕр Аяр ех біт Рхо сто 515 ТБЕ

КЕ 46 45

Рхго Дар о Твх Уві Ту; бех ті біз Тук пуз ТВжх Тух Бім со Акта Авр

Ше що

Ттв Уві Аїв був Ббуз бік сув бів Ак їі ТВх АжхУ Буз ек сСув Ахв

БА 76 5 50 їжи Тниж Уві Біб Таж Бі дай Ме) Тмж сій; без Тухє Тух діз Ва бах ща за 5

ТтВх іа уві Зех дів Біу п1у ха бех АЛіа ТОх Був Межб Тпх Лев ко ї39 105 119

Ре Бек Яек пе) ст» ів Тв Тахо без Гуз Бхо г Авр Узі тн Суб 115 130 185

Ії» Хек Муз Уаі Ас Жек їів бій Ме Їіїе За3 Нів Рко Твк Рхо ТЕ

Ії30 138 148

Ркз їі Ак Аіз біу двр обі» Вів ку пеи ТЕ ем БМй дв жів Кле 345 І505 155 і50 із Ащо їв» Ве Тух Ніз ви Біб Бей бів Мі Ав вх ТВ тТух ів 155 175. 175

Ме Ні Гез бі 5БІіУ Був біз дк 2-4 Тух біб Ре Ве біу Бей ЖаЖк їва 185 9 хо дер ТВх бій РБе пес біу ТЕ Ї18 Меб їіз Су Ув3і Ро Ту ТЕр 135 ОВ 25

Азії Бе маз бек лів Еко Тух Ме Суб Аху ба3 Бук Тк пев йо» Ар ех пт пав ж АВ БЕ

Ахо Тк ТЕр ТЕ Жух Бех Вле Бек бБіУ Аза Ре беш Ре Бек Ме Біу ни 230 235 240 сне Гео УВА Аза Уві йпез Сузв Тух Пец Бех Тух Ак Туд Уві Тк бук ав о 255 вто Вто Аіа Рус Рго Аяп оЗех Тез Аз маї бій дк Ма3 Їм ТВ ре 853 258 што бів» тб їв ВХ Бе їі сіб бій Нів Ма) їжи їі бо Уві Ре Дер 275 880 5 ем йдех біу Рко Зек бек есе Дія піп Рко Уаф біб Тух бек бів ї1їв аа за 300

Вгтз таі Зах Біу хз все біб БЖжб Віз щі Аза Бхо бів дху Нів Беж 15 315 зо їв: Бех із її ТМпт тую Бе біт біз Бо Алр о її беж Іі Без іх 325 КН 335

РЕО Чех Два Уаї Вуз Рро бхо біп Ї18 цео Бех Ркб Бей йвк Тук іа з4о 345 зва

Рхо вав Аіа іа ко сій уві біу хо ко Бех Туї Аїда Рхо» біб Уві 385 Зо 385

Жвж хо біз Атавз Біб рве Бко Бне Тук діа Ро бі0 Ліда ТР Зек Бух 37 37 КЕ ук сій Вже ву Беж Тук діа Рг) бів Аза Тв кБко Аве ек Тжхрв рухо з85 355 зав 00

Рко Зах Тух йпіу уві Сув Мех бій 01 ех Зі БУ бар Бех Рко ТВЕ 05 415 415 бБіу Тк Тем дек беж РКО БУ ніх Бе Ага Ро був ЗКу бів ем «їй «2о 425 4230 вуз пів Бко Рко діа біу бек Суз Мек їси Фіу ТУ без Зех без бів 435 ай 445 сіз ба) Тих Бех їжу діа Меє піз Бій дех бів біз Віа Ббуз ех їм 459 555 50 мів шій Ро Бей пі іє був ТНК Азв о Ага ТвВЖ Яех Авр оржо Вав Учі 5. 476 375 385 їео Ніж бех біу 13 Бі сіу ТЕ о рхо 0103 бух пем був біу 510 Бе

«55 аа 435 ко Бей їез йех дек Уї пій їі січ 3іу Нів Бко МебЄ беж Бей ко вав ий ій їйем сій БкЗ Бжхо Зех Аку Рко Сув Бех Кхо бБес Ар зів сіу Бхо дек 515 ЗО за5

Бхо Тв оВіУу їжа бви біз беу ву Ууді Суз Рез Буд Азробім Ава буз

ЩО 535 545 бех Екха Зїа Вк бів Таж бах Айр о пем Бі) 015 Бо ТвВх біз Гец Аво 545 ЗУ 555 Зо ех їм ре Акз шіу ев йіаз Ген ївх Уаі бій Ткр бів Бех ко 5 «вх та «кВі1ї5 31725 «218 ДЕК «і3» Вощо зарівгив «ВО ТЕ засіазчасоас сасідлассае стіпассчто здасвосізЗ3 сіпсссвоЗс ссоссзаоЗх во кистсоЧчаїсс соссссвзуса счсопаваєто сацісозоуса ассккуазава сабсстувся 129 куззчасацоо зососавод3 сассоссзуас асодестаса зсабозауюа саззасуксає 30 пезчесатза зосокЗос завовачоачс саїсзвезча Ссасссочаа ЧгосстЗсаде 240 «ккчассзсзо ззасчопева ссссапузаз стссзстасс ссзоззссас сассзесвух Зо пидцоазачаєс загсвусоас сСаздаєзчас ЗасвуЗзекса зпеоборочса зесзозорате Зо сіЕсвачссвс ссчасУвуво стосавскоо вазвзукзаФгеї сузегсазаї Зах ссах а5О сегассссов оОФфсссабсоз сосадасоаеє дпссвзоозає сззосстоаое звоузовкскке 50 сакодассво: кстасозоєх адазсбосач збсаасодса ссбассаває дсасстбода 54ао чочазацсвоз саздавасасза «Ессе с ссЗасссоско зсасачазчтї ссстозсасе 5 ахсзутзассс зсексссовс ссзЗзшесзаЗ зачачкосос ссбасвЕЗзбЗ ссдзакзва5 во асвзитщвосая зссозасвоо звосіасесс стссссоЗаЗз ссібссвЗеу соссевсцое ТжЕО ха кочсеч сачивсстсо ссасссзвас басвозвквЗз Ссассвазос чсссцевоссе тва посазвиксос суазссовссв зочазссста азтеїссвус оФоксосіх сабссачоза вій свсзсестав бесскаие кодосесазс здоассссзуєа зобу ссса чоепооосва 500 ївсесссада БсазузсЯсс сзЗзасссауз зачсссосвзу чадссссаса зочоасаєзас зво сідсссзаца бсасстасіс зуЗзасвдассз Засабстссз Ксстссаусс сессзасзєа 1020 ссассксссс зчдасссостс сссастассс сабчсоссва асчссусссс счазутскооо 1080 сессссабссї абодсвосїіса узсдассосс здадссосаак Есосавтева сусссеасва 1140

Чесаєстста задЕссадесс Єссогсстає зссссісааз сосасоссода садстудесе ї200 сесстсстахоа заздсаксосаї ззаачакссї задсавацаєсс сссссвсбоаз часвссевесє 1250 ацісстзаас асесктаадсс базвачдбову ссїсаззазау зассасєсвоє соазавусвУє 1325 асчсказасч псстксссє удсазчачучва асссссскоЗз сстасвзузучза абсссзззад із80 зчсааззєсаї гасазссачео сстздудаєє гдсасацаєз дайасаєссбоа сссазакаєд 1440 стасасвусс зоаззззаачя сасассасзу сасстаазуз зссацесбесо собсссссос 1500 їсадессаза ссзззу3сса ссоссабосєсве сососстєстуєЄ аасстсссто соухессаса: із5о тссосесссоЧ ассзазЗзуссс аззЗзксоесстоу ЗусссасеЗЗ адсесстває час сессваЗ 1629 часпдзадсса аводзасосадс сссудадасс ссачаєссуу адсацсосас адаассудає 1658580 ксбсссЕсса дазЗсссоде сстчастаЯявбу сачссчазаце сстда 1725 «1» 73 «вії» 30 «війх ДНК «813» Лама «00» 73 закжекасує Кавсксвааос сссоусаЧчед бесусекске годаасауає ддесавовке ба ассідссзаз чачустаєса бусссассоу їзессадсада зассаауссвз засссстау 129 скауссатосу асудазаїза сазсзацосе ссззачатсе сізачсуєсе сеокоаЗесоо їв ачЕсстоууда асасвуссас себдассябс зусззоассс ззостзадуз сзасассово 24а тактассабс зуїсвузаза савуєвзавасе закастустує сгсадсодзава зассосвЕсїу Зоо зосксстд 309 «війз 74 «211 365 «23122 ДНК «213» Лама «300 74 сзадіцсавас созссозаїс спосодадос Стастоасвує скадачассє сссзазастто 5о їсссзсусава ссестдавсе сасссссоза ачскасссса бозастааЗчх ссуссачасс 120 ссаззуазачя зусссдадсз забсссзазУ; асїсасаєкта чсодсазкаї баватастає 180 їхадзасєсссу бгозазоазссу авсссассаїс їссачазЗасча асассвауаа сасастзкає 240 скосазаєзча зсаасстідчаз зсобссаззуаєс асзассукУє ассассУуса: засассссску запо чассссстта зазусосаїта сазтсаасвсу аачказсс5оу дозавоууає сотазтсвсе ЗБО чЧесвоскса 369 «102 7 «2117 330 х122 ДНК каїї3» Лама «аа» 75 ззккутакзс гхадстсзвос госсбсосака сструзастс буууаззазчас сабевссаке о жсстосасеу заассачесз сдчасзесучо засбвезасї абебстосста збассазсва 120 стсссачузї кодессссаа астсссцаєс сасззазсся асасссЗатс сссазззаєсс 180 сесгчассосс кебссадссс сазвоаєсвзудо аасзсозЗссї ссосбуассай сесеЗуУсЕе 240 сачїсічазу асчааастза сгзЕтассої доссссасаєа сдассусасоє счаєсасуку Зоо тгсодсязаз зсасосатсї засос 330 «10» 76 «21їз 365 «ії» ДВК «2132 Лама «ва» 76 сзо3зсоасачс ссусадазЕс судсдасачос ссадсасазс стчааазеКес бебозаасес 50 їсстуїасва ссїсквазу саєбєссссвуї зЯстіазозаса бЗачссозуях ссаосвааде 120 ссзоздчазоз зустачвазкУ Зебсагссазб асесасзасу азасдасадзсва сасаасссвЕ 180

КсазчасбссЗ сдазадассу аїбсвссяхс бссззазаса асадсосзвува сасаккосах о седсаваєда асадоссзаа абсізаззас асодссокує ассассустуєс завачстуди: зо тссавоасачзЕз сіїзссазсву бузаксасзд зчассвузуза сссазуєсає сазбабсссса 350 «2105 77 «11» 305 «218 ДВЕ «213» Лама «ай» 77 стзспстокас бозстсацсе стсозсуУУ гссзсуКсЕ годдасвуае зЗассаузасє о ассідесвзач зуЧаскаста костсвстуд сгассацесаза зассазуєса здасесескока 120 стзубсаєст асодасадаа сзасвлазшес бсзазуаєсос сгчазесзсьї сеобузстоє 180 засастзазча зсзсзчосає спекзассатв забсавузссс афуссзаздча сзвозссоаа 240 с5акссзссзусєс азбсезосавц сацеачкокк закоестусУує ссозсузазо дасозачеса ОО зпеадоскс

Зо каз» та с«и1їз 35 кій» дик «213» Штучна послідовні «80 «аа» Послідовністж варізвта зародкового типу зититіла «ос» ТЕ пзвучсссаче гозсзчаУукс сачооовоуЗс Козусуєвас соя с сссСуадассе 5 костзчсіо соссоїзавкх сасскковає азсовесдвса сдазвстоцзає скухеазасх 155 чевдочамущ з здаува за ссопачо асжевЕзасо васуєсвавав сасадєстає 183 ссззастісся гдазочуссо азссассвіс Кссадзувов есстизавава сакуєкакак 240 сеЕцсвааков зсзоссгуЗзо застоувоЗас асо ч:З всїастасос ззазустаде 305 кстзЗзКащта стсастасво бзаасзтоз сасезааоча ссевсксас ссексекой 80 «аїр» 75 «811 «гіб» дик «кій» Штучна првслідави ач «их «ве3» Послідовність взріанта ззродковоко твпу вивижіва кад» ла тстоіасувас Есасосавцог стссбсзчбу бссчіасса спозасезЗає бопсоаочяе 5 зестоесвао сажаскзета соозсастод сассзоасСада зуссвсоска зусоссьУку 150 ссгооссвесо есоузсвааа тазбозвоасос ссвузЗзаасс сеіцаасасое сіскацсее 188 засчссузцуа зсасацесас себоасаавс зосозсассо звассаеаЗчУа созаасеУх ка такгасоусс деїсазазач сазбазккеє авесуссекУсє бсчсодчазу чассзачссо ще зсосзксасее ща5 «ккіс» 80 «211» 353 «Мій дНЕ «218» Штучна поспьдовність кайф»

сгй3» Послідовність варіамта зародкового тиоу антижіна «або» во «впдсосяус гсосоЧачес содузосече Єтодеаовоє сроЗзчаєссх кскодваасКе 0 сссізкасву соБстЗзаєї сасессссвах ззссесЕсся созасчче ссзсоваж 155 «ксззздазаз3 сасссозвзсч Чзсссазаї зебсатаєта збочссочкак свезЕаскао 1855 зсшусастссу сдазозасся асссвоссаїс Єсозцадаса асусавачава саєдесвасат КЕ скдсаззхзЗа асацессстзач засбззодас зсузосочсяє зеБаскасує засвососсу 309 зссостета зададсссвуїа сзакуусуєсЯ ззасастоцдо дсавазеачас ссеззусасхї ЗО ана стетовея 555 «кі» ні «кі2» ДВК каі3» шщтуєна послідовнусть ка» «223» Послідовність взріанта зародкового тилу зититіла «адпох ві свуксхоассс кдастсацис воостснукЗ кстозавсво стоазасаао соассассаке жо сбеипкзоаска Зазосвусау каса Костаисавеши зе сста чкессазвсвЗ 125 кхехосгсцаа адосссссказ аокоестзакс пасзжукса зосзеаруюаако сову ї80 сеїфасесцех мист сааусозуче сасасучосе состаавовЕ сессУацсКе 240 сзачссузуд асовузекЗа стасевекаЄ зссссавака звсбабасас сзайсбавако 300 гсгочоасоуцап Фоасссвавої часпососке 339 кві» 82 «іі 15 «діб» БЕЖ «сій ого варієпа «чн» же

Ом вхо їуз беж Суз АвроБуз Тк Ні ТВ

З « Ж 3 5 30 «10 ВЗ «іх 5 «Жійх БІЛОК «вії» Бпощо заріапа «На» 83

Сез Ехо Рхо Сх ро і 5 «10» 85 «ВЕ» В «шій ВІК «еі3» пово заврівеюйш капо» ВА дів РкбЗ бід ївв ем Ку БУ БЕ» 1 5 «ві» 5 «БЇї» 15 «іх» БІЛОК кій Ббощо зархвиз «ЧНІ 85 піз без кув Тйх Рхо рес спіу бю тах ТОЖ ія тТВх 3 Ка 16 «кій» 88 «аа» БО «ій БІЛОК «213» Божо зврівйх «00» я

Сух РКО Аху дуб Ве піз Екс буз Зек Суз бзр Тих Бо Рко Бхо Су і 5 10 15 вхо йка Суз БкОо біз реко Буд беж Сує Аврв о Твк о бжо Ру Рка був Рко в: 25 За дгч бує Вхо БІО хо дув ех Сув Аве Тв Ро Вхо Рео був бу Атя

Я 45 сСузв Бка «ЕЕ» 87 «жіїх Я «БІ боб зарієпх «Оп» 87 діз Втхо цім беб їм ові бі Ро

«о» 88 каік 7 «ії» БІЛОК «ії» Мощео взрізпе «Ой» 68 пів Бек буз Тух Фу Бха вк 3 З «Ві» Ва «81їх 5 «лі22 БІЛОК «813» Бощо зарієпа «400» ва уз рез пак Су ро т Б к мо «210х зо «ії В «Й ВІЛОК «ії» Бпошо харієйв кап» 50 діа вхо БВ вва їву бББу піУ РЕо 1 З «іо 51 «82115 3 «кій» ВБІДОК «82155 йошто зарієпе «айх ві пів вка Був ії «210 92 «12 «гід» вБІДОЖ «ті Боше заріевв «таб 82 су сСуя Чаї січ Су Рто Рже Рко Сув Рхо

З 5 19 «іх З «Еі1ї15 7 «вій» ВІЛОК «із БовФо заріена

«ЗО» 93 віз ро хо» Маі Аів опіу ке 1 5 «Тіп» 98 «3 78 «віїУ БІЛОК «і35 Щтузма цпослідзвність. ква» «Уа» Послідовність БТ «300х 34 чі дк ек ї1іе ів Ме іє Уа) Ні Бко Тих ре ТВх Рко їі6 лхВ 3 З 13 15 ів б53іУ Авро біУ Мі Аг Бей Тв Гей 51) Авр ї1іе Бе Ні йвр ва га В за

Ре Тух Нів Гей Біо) без бів Уві Ав духо ТВ Тук бій Меб Щіз їцец 33 40 45

Фі бі дув бів Ако спів ТУЮ 53) Бе Бе Бу Бевз ТВЖ ро дво ВЕ о 55 во він Ре цем піу Твх ї31іе Мей ї3іе Суз бХві Бо Твх о тТто Аїв 70 Тт5 «ЕМО» київ ТВ «дій» БІЛЮЖ «ії» Макав-резук «Б» 5

Уаї дхз Бех Кі пів Меб їі узі Ні Бхо ТЇвВк охо ТЕ Вко їі АКа 3 5 18 15

Віа біу Азвр Бі Нжз йта й ТВ Бей б) взр о її Бе Ні вро Бей

І м за | :

М ж ЗО

БвВа тує нНіаз без сій без сій та) ай Яху ТВк Тух бів Меє нія гео зу щі Бі: пі Ас Біо Тут Бі) бе ре бі Бей Твх Вхо Авю Тв хо 5а Фо

Бій Рне Бема бі Тих її Мек Зі бук Уві Ро Типк отТЕЮ Бех 55 то 5 «і» ЗЕ «вії 75 «вій» вІЛОК ст1і3» Мавпсе пиноМмоптуУс «вдо» 55 маї жа бек їі піп Меб її Уаї Ні ро Тпж о вко Твх о бжо ее Ко 1 5 18 15 іа 5іу йвр О1у Ніз де ей тТнЖ Бей Сів дев Ії Тус Авро ої Бех 5 30

ТУЖ Мі їше бін ви бій зі Аби Ако Тй Тух сів Меї Уь вп о нів 35 їй 45 пез біу бі рух біп Ахо біз Тух бід ре ріпа йіу пен ТВжх Рго Дер 56 55 5о

ТвЕ бі Ре ви сі ТВЖ хів Меб Ті Суб уді Кко Тв ТЕр бе ка Та 75 «105 97 «2117 «Вій» щІЛОК «213» Мавиза цпиномельує «ох З ті вес беж Гіз 51 Мас їі ті нія ро Твх Бо ТВЕ Рез Хів ДЕ 3 З 15 15

Аїів бі Азр біу Мі йкз Ген Те» Тем пі) дзю їів Тух Авроїми ЗвЕ 20 28 Зо тТук нія ем бім Бей зів узі йо Аа тТвАх Тек бій мес чаї дай Ні

ЗЕ 4 45 їз 5Щ3іу 01 Був сій йхка біб Тук Зі Ре Ре піу реи ТВкх ро Вар ва ва 5

ТЕ біо бне зво 5іу Ту Ї16 Меї їі Суз ові ко ТвБх Ткр беє та 75

«міо» 98 «ії 77 сії БІЛОК хкиїії» Мавла пинамелжКух капа» ЗА уаї дк бек їз біб Меб їів Чаї Бі Бк ТВк о Бхо ТИЖ Руб Ге ка

Х 5 Іо 15 діа піУу Ар слу Ні Ах пев тих йев бі дв 01е ТУх Азр обва Бех 28 25 БІ

Тухк Нів їхех 1) їжи біп ба) Дап о йку ТВЖх о Тух бів Меї Ніз без с1у за 48 45 5іУ Муз Бій Аху біз Тух БІО ВБйе РБе 5іу Бей Так Вжо Язр так бів

Зо Б о

Бе їєб бі ТВх їі Меб Іі Су Узі Рко ТнХ Тхр ех то та «ві» 88 «8і1ї5 253 «із ВІДОК «533» Вово зарієва «00 35 їз дк Мец бід Тух ем їі Вке їжнх Тк Ї1іє біу Тук Ак цей Вав 1 5 19 15 пі ТІЇ діа Віа Тих мех зіу Ткор Вехк Суб Зі Ті це Ва Бей Уві

З 25 30

Аіз тах Діаз Твх піу уді нів Бег рхо біб Вяюр Вко Зек Аярв бемх Бе за а 35 бів Нав таїі Бу ВОе бій Бех Бек Ази ВБе бів Ав сте бею ТЕ Тер

Зо 58 в зар БвЕ БіУу хз біз бу ТВЖ хо Авр о Твх Узі ТуХ леї Ті бі: тТук | 7а ТУ В

Бу ТЕ Тук бі Бім дк Азр о ТІр Мі Аза буз Бу Су Суз бій Яку я зо 5 їі Тв Ако Був бех Суз Дао без ТВкЕ о Уаі біз Твх біу ев Без ТБЕ

159 105 110 січ пев тТук Тух Азз Ага уМаї ТНК вів Узі бек А1а бі Б1Уу Ак ек її 129 125 діз Ту Був Меб ТВІ Авр Ах Бе Бех бек Гєц Зіп Ків Тлх ТвВк Мей

Мо і35 155 зуз вро Рко Авроозі Тк Сув їіє Вех уз Уа1ї Ах Зех ї1« Ми Мек 145 ї5о 155 їво

Ізї« Узі Нія Рхо Тож Бгто ТВх хо їі ВжхЗ Аіа Бу Авр 51іУ Ніз Ага ї155 1:95 1785

Бе ТВХ бе: сі Ако іє БвВе нів Алрвобео БМНе Тух Вів без бів Бех 180 185 і1838 сій Уаї Ап ойкЯ Тпх Тує біп Ме Мів пе сіу зіу уз зій Аку ім 153 200 295

Тужх 5із Бе ББе щіу Бей ТВх рхо Азр о ТЮжх бій Бпе Без Біу Твкх Щіє 38 ій Ба

Ме тів Суз Уа) БЕ тТВК о Тхв дія бух пів Бех Аїа Бо Тух МВБ Су

Ве 230 235 240

Акт уаї мя ТВх без Вуо Авройхя ТВе Тхр о ТВУу ї31е бій бі Ак Авр 235 230 238

Меї дер РКО Був звт Суз Ввр Бу ТВКк Нів ТВх Сув ро Рко Сув Рто

МЕ 265 73 дід Ехо 1 їве їв бБіу дк Бо Зек Уаі Ве ке) вве Бко ко Бух 275 28 285

Бго пух Ав о тТвх цез «пі» Зо «Вії» ка «81йх БІЛОК «13» Макак-пезує «Ой» 100 їжи й Беш сій ТУЮ їм ї1єе Ажа Бе» тТвВх ТБ Бі. ТУуж Аа Бей Ав

3 У 18 15 біу Тв Аіїа Віз ТВ Має біу Тур Яву Суд їїе іє ри Ре беч уяі о 25 Зо

Аїа ТБх ді ТВЕ о біУ Таж ів ех РКО біз Авр о РКО Зах Ар о пемо їни 45. бів Віз уаї Пцуз Ре сів» Зех Ав дзп рме бі) Авт їі це) тв тЕр а а

Азвобет Бу РЕ бім сьу ТИЖ Кхо Авои ТВУ Узі Тук чек їТі6 бБіш Ту т7а 7 8 ру Твх Тук біу бій Аг бер Тр уві діа був Був 0іу Суз б1п йх9 хе 0 55

Їїе Тпї Акй бух бех Сув би Ле ТвВх Збаї бі ТЕ бі Авпонів ТЕ ща Ох 110 бій їву Тух Тук Аїа Ахку Маї ТВ й1а уаї бек йіа вБіу щу Ак Вк

ЗУ і» 125

Віа тТиЇ Буз МЕ ТУ Азр доа Бе два Зех в ій Ві Твг Аів Гей

Іза 135 140

Туз хо Бро Авр Уаії ТВЕ Су Їїе Вуто Бує баї АтгФ бек тів бів Мет 345 1585 158 1650 їїе Уаї нія Рхо ТБж Рхб ТВ Рхо тів АкЯ із б1іу вв біу Нів Аху 165 175 ІЗ їв» Трх рем біз Вер ї1ів ре Ні дДвю бйей Ра Тук нів Бей бім ей ї9о0 Ів 130 зів узі бай дка Тпж Тух Бій Меб Ні Пез З1Уу Бі пім Біп Ажа БМ 155 ОВ ток тУукК бів вив РВа біу рем ТЕ вхо дар Тих біз Бе ев біу Твк Т316 21о 15 х2о

Ме Ї1іе Сузв Уві Бро ТЕ ТО Бех був буз Беж АТ Ро Тух МеЄ Сув 225 230 835 280

Акз Уві Вкз ТвВх Зеб Рхо Авр о Аку ТВх ТкроТВх діє ім бі Абу йвр

Меж Ахр о вКе Гуз Зек Суз дер обу Тк ніз ТВк Шу Бхо бго Суж РЕ зо 255 та

Аіа Рко йіб Гец без б3іу БІ рРуо Бех Узі РБе без Ре Бко Рго фу 275 зно «85

Ехо Був бар ТВх цев 50 «-810» І «дії Х83 «дій» БІЛОК «Її» Мавпа цдимоменгуУє «же 10 їви ку гер бі) Тух цей їі Аке Без тах Ті біу Тут Вкхя ев Ави 1 З 18 15 піу Тис: Аіа діа ТБх Мех біт Тхр бек пу Ті їіе беб Ре ей Ух

У 85 зо

Аіїа ти Віа Твк бі Уві нія Зех ро 53) дБр о РКО хек Ахв їй Би се Я сіх нНіз Уаі йуз Вме ціп Зех Ав дви Бе бій дяпої1е ем ТВву Ттр за 5 50

Аарохву б1іу Ркоз о біцш щі ТВ Бто зв ТЕ чаї тТух Зв її щі тує

Б5 7 78 о бух ТП Тух С1уУу Бім дкЗ Вяро Тк о Ууаі Аз УЗ бух 1 Суд осів ка 5 чо ЗВ їі ТвВх Ах муз Зах Суз дя їевз ТВжЖ о туаї Біз Тв 5іУу Аяю Ніз ТВЕ зо ї35 138

БУз Бей тТук тТух дів Аж стві Тих із Ууаї йех Аза бі Щіу Ба ех 115 їз5 155 із Тв ув Ме Тве Авройко Ве Аз) бек їжи ШІіб Нів ТВх Аза ге 130 155. 159

Був Ро Вго Вар Узі Тьх бує її рхо був Чаї За бех їі бів Мех 148 150 155 ії80 т1е уаї нів Рюб Тих рРсо ТВЕ РО Ї16 дк йіа пі» двробіу Ніє АБУ 168 а 175 їм ТВх Бей бій Дар ї1е Тух Авр Бей) ех Тух Ні їви бів пев сій 189 ї155 190

Уаї Аза Аху Тк Тух Пів Меї Ніз без бі 1у ув бів дка бій тТУк 195 по до5 їм вве вна й1іу без ТВ бхо ар ТВ сл Ре обєм су тв тМїе Мех 2510 215 230 т1 Суз Уаї Рго ТВу ТкробБеї Буб Муз Бех йіз Рхо Тук Мех Суз Ед ви 230 288 2940 таї вка Тахо пе) ВБуо дер о АКОу Тих Ткр о ТВх тів біб біт да Ар Меє 245 250 255

Аве Еко йуз бек Суз АвроБув ТОХх Ні ТВх Су Буо Ро Сув Рко дія ве 285 27

Вхо бім пе Пе шіу біу Ржо бЗеї Уаї Ре бен бле бто ро Був хо 2т5 8 КЗ їу5 два Тйх БМ

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з ІЇ/-22Е людини, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить комбінацію послідовностей СОК варіабельної області важкого ланцюга: НСОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 6; НСОК2, що містить 5ЕО ІЮО МО: 36; і НСОМКІ1, що містить ЗЕ ІО МО: 34; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить комбінацію послідовностей СОК варіабельної області легкого ланцюга: ЇСОРЗ, що містить ЗЕО ІЮО МО: 54; ЇСОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 47; і СОМ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 16.

2. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить комбінацію варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ), вибраних з наступного: МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 63 або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентична їй, і МІ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 64 або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентична їй.

3. Антитіло за п. 1, яке містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, вибрані з наступного: важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 67 або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентична їй, і легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 68 або амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентична їй.

4. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент проявляє щонайменше одну або більше з наступних властивостей: (ї) зв'язується з епітопом у межах білка ІІ -22К, який не містить Тугбо;

(ії) зв'язується з ІЇ-22К людини з високою афінністю; (ії) блокує зв'язування ІІ -22 з І -228; (ім) інгібує І -22-залежну активацію ІІ -22К і/або ІІ -20-залежну активацію ІІ -228; (м) не реагує перехресним чином з І--22К миші.

5. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-4, що містить шарнірну область, домен СНЕ2 і/або домен СНЗ ІдС людини.

6. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5, яке проявляє високу гомологію з (ІД людини, переважно з

ІДИ.

7. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-6, де області МН і/або Мі, або одна або більше СОР, одержані від тваринного сімейства верблюдячих.

8. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 7, де твариною є лама.

9. Виділений полінуклеотид, який кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь- яким з пп. 1-8.

10. Перший виділений полінуклеотид, який кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла або антигензв'язувального фрагмента, і другий виділений полінуклеотид, який кодує варіабельну область легкого ланцюга антитіла або антигензв'язувального фрагмента, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент зв'язується з білком І/-22К людини, перший виділений полінуклеотид містить послідовність, показану як ЗЕО ІЮО МО: 78, і другий виділений полінуклеотид містить послідовність, показану як ХЕО ІЮ МО: 79.

11. Експресійний вектор, який містить полінуклеотид за п. 9 або 10, функціонально зв'язаний з регуляторними послідовностями, які забезпечують експресію антитіла, антигензв'язувального фрагмента, варіабельної області важкого ланцюга або варіабельної області легкого ланцюга в клітині-хазяїні або безклітинній експресійній системі.

12. Клітина-хазяїн або безклітинна експресійна система, що містить експресійний вектор за п. 11.

13. Спосіб одержання рекомбінантного антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, який включає культивування клітини-хазяїна або безклітинної експресійної системи за п. 12 в умовах, які забезпечують експресію антитіла або антигензв'язувального фрагмента, і виділення експресованого антитіла або антигензв'язувального фрагмента. Зо 14. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-8 і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт.

15. Спосіб лікування псоріазу, псоріатичного артриту або атопічного дерматиту у людини, який включає введення пацієнту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-8.

16. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-8 як лікарського засобу.

17. Застосування фармацевтичної композиції за п. 14 як лікарського засобу.

18. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-8 в лікуванні або профілактиці псоріазу, псоріатичного артриту або атопічного дерматиту.

19. Застосування фармацевтичної композиції за п. 14 в лікуванні або профілактиці псоріазу, псоріатичного артриту або атопічного дерматиту.

потоки ДОКУМЕН ОККО еко МАПТИЧ ІТИ НУ МЛМ КИ, КО Е су У -- ча шення ті ЕЕ. ОО М: Ід фе п ЗМ зе ; ОК ОВ и ОЛИВ у Ж В ПЛИТКИ ОО. ЗЕ В Е: КО До шу Ко Зоо ПН ВК Коня У Зк и і

КК. о о В ВАННЯ: "пи ува вовввввави г ХК: ЗМ НАМ МІ ЗОН : с УКОНН ОН З Звання ЗОВ

0 і. Б: о. о ; Б 0. МО ЗКНННЯХ . Вишншнн о. Мн Пе й ; ; о. ій ща о 1 ; о МО Ж ПЕН г З ВН ПМК з г о о Я ВО о. З о КО М ЗХ У ХХ х 5 Я ОКХ 5 ОК ООН - -

Фіг. 1 І МЕТІ ТІМтУ СБОААВАРЕО ББІЛЯНУКИ ОББМКЕМІБТ МОБСРЕСТЕО ЗЕ ТУЖВІЕУКТХ СЕНОШУДАКИ СОВІТЕВБОМ ІЕС ТЕ БУУАНУТАУВ дасВаАТЕМЕ ПЕКІНІ Т БЕРРОУЖСІВ КУВБІСМІУН РІРТРІАДАСВ ік шнвотОБІтЕ ОСЕУНЬЕБО УМЕРУОМНіС сКОВЕЖЖЕКО БІРОКЕКУВ ПЕ ІЇМІСУРТЯАХ БЕБАКУМСВУК ТОРОДТНІТТВ ЕБОАТОЕВМО КУА В 25І ЖКУУТЕРРАР РОБІН УЄСВУЄ ТОРІК НУБІВУКООВ сРЕЗОАОВУЄ З01 УВОІВУБОРК ЕБЕИДОВеОМНО БЕКІТУЦОЮК ПІЯТТОРБВУ РРЕОТСЬОРІВ 281 УАРКВАРБЕУО РРЕХАРОУТРЕ БАОЕРЕЖАРО АІББУуОРаВУ АРОМТРИВИР з ражсуємМмеса скощУТИТІя БеКНоВеКООо ОоКЕввАсВс МБО ОМ ЗБЕ ТБСАМБЕОСОЮ АКБІБОРІО СТІВЕН МУ БНВО ТвО УЖ М БУФШІЕСНРМЕ БЕОБЕВВЕС БРЕФОСРЕВИ СОСЬЕБІСВК ПЕЛЗКЗРАЕВУ

Фіг. 2

Її АТОДСНМИМІ ТОКУКОДОССВЕ СХОДИ КИ СПАТИ ТОВ СТОСТОВО СОТОК В) СюСРСООЗАО ОСТРОВА СОТОААВІРС САБО ВОСЬ АСТЕКОВАКА ПАЖССТОВОО 183 ТОЗОАСАОШО СОСОК САСОСССАСАЮ ВОБОТОТАСА ССАКСОДОХ ТАВСАСОТАХ 183 СОАБАОдОшО ДСТУХОТОЦО дАОдВОМО ТОТСАССОКаА ТОАОССИКОАА ЗКССТОСАВ пЯХ СжОМСОУ ВО ЗОВСсНОСАВ ССТОВСОСАС ПТКС СОЛІСТОМ СОС ТОВе ВО ССО ОСС САЛАТ ЗАСВОЗЕТОВ СТУСА ССАПАСТАЮО ЗБ СТО ОССА СТОДТІАЮ СТОТАТСКОХ АВС Є СОРТ АТ ОВТ КОТТОКТ ЗІ ССТАСКОССА СБОССАТИСЯ ТОСаОА ПОССВОСВОС ТАЛСОСТОСВ ВДВ ВІ СсАТОВОСТСТ БОТАСОДСТТ Де ТооВо СТОВАССОИ ОССТАСОВАВЕ ОСВОСтТІСВ й СОСБАЛОСАВА САС А СТОЛОМ СТО СТОо АСВОДОДОТЕ СОКІВ ПІ дТСАТОАЕЖТІ СУК ТОВСАС СТООЛОСОДО ПАСДИМНМО ССТВСВТОх МОХУ ТОААх ЗІ ВОАСТОСИАО АОООСЛАСАТО ЗАСТАЄ ТОЄ ТТСКОСОовАУ ОСТКОСТОК СТОК ТЕВ ОБО ОВ ОВС СТВОСТОвОЄ ТАСАСАКАТЕ ТОВОСАДО ССО САОСХ ТІ СССАВИЖСОС ТОВАСТКОА БОССЛОТОМЕЄ АТЕТСОДОС СОСТОСОСТ ОВО САо ВЯХ САСТЕКИТОА ЗМОВИ ТОВОСТОАВС пОМОССВАЕСА СТСТОСЮОСВ ОКСТОТОЮВО 03 тАСРТСОССАА ТОАОЗОТОО ТОВСОСАВО ЗМОВ СВЕСТОАСВ БОБОСАТВАОС БІ ОСУКМУБИОСАВА ТСАССТАСТЕ ВУС ЗАСАТСРОКА ТОСТКСАСОЄ СТОСАДССх їх СоВОСтоСС ВСАХОСТСТО СсСУВИХОС ТАРОСОССАВ АСОСТОСКЄ ТОВ СКО ії сОоСсАТОСТ АТС ЗСТОВСОСОС ЗАВОСТОВАК ТСОСАХТСТА ПОСОССВОХ 1153 ОЮА ТетТеТА ЕОМ ТТОСТОСУАХ ОСТ ОВАУ СОВИ ЕОСОА САС 1801 СПО РОТАВЬ СОСТАРОСАТ ОА ХКТСТ ЗОСАААОВСТ СОСССАСТО: ЗЛОАСХЕТЕ 151 АШЖОСТААВИ АОС ЖАСОС ТВАВХКОВ СКУЛ АВО ВИС ННМУС ТООАВХКС ії жи хртМмОгОо ОсурУєтХк сом ВЮЄСТССКТвО СТАТЗОВОВЬ АТОССААОВА іЗ81 ОАБАВТСАТ ТОСАССВОМИ ССО ЩУТИ ПОЯВИ САВСАКСТИВ СОПАВАТОТЕ 1541 СтТАПАЮДОТО ССОУХОВІО ОВИДССВОВО ТАССТААВЕВ ОСПЛОСТМО СОоТОСЕСРОЮ 1505 ТОАОТССАшА ТОСДОСОСОД СОПСАЕКОС ПТИССКРЕОМ АЛОСТЕОТТО СОБТССВТОТ 1541 ОО ТКОоВ АССПВХОТОК ДАШОК ОКУ КОв ДеТСсЕТО ЗО КОСШСАДО ТІ шАЗУВАОССА АДМ АОК СОСТОДОАСМХ ТСВОВАССТОК ВОСВОСССВО АХА ЗАТ 15НІ ТС ТРЕТСА САОСССУЮС СОТОДСЖаКИ СВТОСОВОТ Ста

Фіг. З

Зоо -а- зоаАя г . -о В ЗВО є щ | оо ониву КІ я ге я з Ечкя й ай ще г кож А хо з а А й о Го Мн вдо ви ви з чо здо Кенцентрація антитіла ІНМІ тт

!

. та зва Дж «НН «фе затв? р ши ех МИ Я в о 1. От ль чі ще 166235 ць ж в'' х Я м «ах ЯВО- ОТ - о Ех ЗУ В ХУ ч У Я ц що М, ; З о вч - а

0.04 : --

в.о щої вл 4 зо че Концентрація антитіла ІНМІ

Фіг. 4 о г-З Ж Км хз З шою М: В Доки шо їв ж хх558555 шо що пи вх ше й ж зе МУ Ж ж 4 охо т ЧЕ МІ БІ: ВІЇ ї г х " сх З : - по». Є оз ці вве ЖІ БІ. мі є. Ки Ко Моє за к й я хо я ; й : Ж шою Ох моб у що КОДУ МІ мох шок М рах р АННИ оо йо хх ах. Моя їх зх у Ж». хе кох в МІ В: Бім щем в ж ни НЯ ше ВИ: що 8 Шеф тя хх ток ох ГУ У щи нь що В я Е кВ д Кох Ма. ох У і тої око В Моя хо» кох Й ки пани ОА м и З мо В

І... Фо КІ хх шо Б ж 1: з ої ОЇ» Фо в ЕОЗІ м З Ту ; вх меш Р о» Що» ОН іга нижня шо. Щщх аг. шо МО ,: 1 Мт Бл я о В ші м: М: ж ше чн Ін оком ох в 1 ІН м кох Ді 7 . ОВ ШУ є кн я Р. Б 1 ХУ: Ки км нан а я ШЕ У доз Ки ц хі є В о ох Во КУ ше ОН шо; я Мох хі шорт о ох НИЙ меш ПОН ЧИ кУНИч УМ 15 є й щ кох Що... Зоя око не маш и шою М я» ОЦІ з» х шо: їх 1 ша Пр Я І: 1 Р НИ НН 417 В 15 аз 1 Км Кор Ку рам Фу ях мя МО 1 Ж ж Й ЩІ хе ше и я З ж обох РУ ря Мо: ори ОЧНУ Ме у дов 3 я й Її »- Во ге ШЕ ЗЕ Ж д Х шок тях Ж Бор рижнч и ша ен Ка о: Ж ЕЕ 5 Я : що х ХМ Ше ЕХ ЧИН пох що їх ж ши ши НН ш "ох г кот Я ж - кож М г «хх Ж ех в

Я. нн х ШИ чу йЦ:1:::8 ше и ЧНУ реч пр НИ с ок їмо «є їх - ХХ їх ва От. я М Жора ЖК «о по е НИ и Ін а У То Мом ох Ж ту «из ж ЖК Щоб» Мох з її « мед Фі я ох що г щ НИ коко В що шок ку її т ї й Мо. мох ще : ЦІ: ЩІ: І: ші: ПІ 11115 ж: :.: ШІ 5111: Бої бо ях що «ро то Ох їФ ою» яхжш ож по К Ну хх ем ом оо В - ми ож г: ою ІК аьшеай щопКя Що в» М Ор І: 81: ОВЕН Бус 51: ЩІ: Фк що ЦІ: инші виш ше ее РМ Бо ц Б Ії В їж п ле ли не ? хе з УМО мох Фо ов У Я ха реж НН Що м х : ш и ни Не М М ми ш І че Пш 1 ЖІ. м... та 41 101 жо Вт шо ще - - є г вк щі Мо ЕЦІ:І11:: Ії І: Ж ох Е : Га нн Ії мор яю 1 ФОТО: хі Ц:І11: БІ БІ: КІ: 54111: 1 Ж 1 М я. о м Я171 7, а. Мом Щи хх ОО: Ан и ШЕ СНУ о що - М ВІ: КІ: щої: що жк шоб ше Не шІ:с В: У: г НИ Я мо» Х її: І. 3:11: Ії: 5: ШИ Форт 1: ВІ: СОДИ ЖІ 2:11: віх КІ Ма: і що» роя ня ми -щш- ее чним я що вЯ я шиттю ок ха жа льни ут о ЩО міф пт сш шо т 8 ХХ ку Коха пор шщщоМмоМмож екю м КО АХ й Й хх р парео че КУ чо ме рф су те ох Ух Ух, їх м Ж м ре ее м ІМ с. я М М х 5 М щ секр г у ж Ізип жави иа ФО кт хо Ж до КУ ЩЕ шо М то хо гафея ях м г х щ ю х НЕ ЗНУ г М шо аж іже х ре о ОО Зхщкв Вк ях х см М ош Ю в в В НЄ Я Момірк о М в пе ххх М й "Кк х х х х х 5 її шо х ШУ я М в Ех 5 Кк Жк Б .

Фіг. 5

Ва ЕЕ з ЕЕ я п т В ЕН Є Ж ш Ж х ; НЕ х Ге 8 8 ж ї КЗ ож жі 8 ЕЕ ж я | Е ї Її я ї Е ЕТ |водвнв ви ЕН АБИ в ші в ев й Ен 3 З ЗК МА Б С я 5 шва ваш в ЕІ - ні и ЕЕ ше: вія ер зх ВІ - ва с поки ре " ' І йо і х х с /, і ре данних - вся пенні | ро і ро єч я - і ші і ; І ; Е / -ї | вк, г ; ! та мування шиття еч | зону ан их в ау, Б оИлН ЖОВ | "е о) ії чл рт й ж т м / Ми І ший ОАІА ці Азмафа рлліванаміне чнАУЛа веомеЕшейиЗНо

Фіг. 6 я сь В ПИ Мини ча де вва» КУ о и М ЕЙ ц ; С й. З : Шо "ФС б, - Е У в оте їй с ві а ші Е. ці Зх З х КЕ о й і ск вв. я и Хо У зве Б жено зно І. АС мм. М Се же шо. - екв, ще че ! 3 ле ої У з С : ай 3 З із "ті шо ун 7 Е К о ОК и ше ння Ом; а я ГО З З о Б Б ШЕ ! же Е СЕ І. Ки хий 5 е . хх я АН З З ї й Ж м шо і я

Фіг. 7

Кк! Ян М ща ес с, оч В пи 1Бтяа в ; й й, с Кк чи дося ЗБВНА : чу че чайн 39787

5. Ка Ух й к ЗУ чено «Ве 188 Ж 05 Че чу Ме у х я й щих я з. тк 2803а8.Т5У Е СН 0 я АМО2НМ б в.о -

0.00 ви в . 10 чо НМ антитіл

Фіг. 8

А 100000 и. се в дня щ сля Є 25 я я в. ха оо М БОСОЮ Я ї й тен з3ОСо - | че 23005 жах «ре ; 8 Ки Є що ОВУ нн Я увозав ту и ол вл 4 чо 300 Концентрація антитіла ІНМІ В їй З Х Ж нов з и зе чан ПАВОЗОС МОВО - ! Ше ШЕ ек ПАВОВОМЯМІВТНЯХ М, як зво тех гя х Е х аж жк КЕ в.

є ь. о і ЩІ Ху а і оон ооо аж о а Я т чо ще Концентрація антитіла (ННМІ

Фіг. 9

Конкуренція за 11-22, Біофізичний тест Бісаналіз Що, 1 бл 4 х ' нейтралізуючої я | ЖКонтр, активності 8 х/ -221) їп то х На Я 4 різних епітопи о у йуто 22305 | У 23009

Фіг. 10

- 23009 М2970 т 02305 М ж Й унів існу Е , «08. ДО КУ них ик з х 1390 7 їх Ж Я Кк 1 жі г | Хі б Е ою В | в 1 Холостий Я в |! з щі Х Н шоит як : в | : . контроль ЩЕ а : Я «3 ; шини | Ше С: І. и и я о З режнакнютї яке пава Ж и Ж Ява и не м й РЕА гЗ й ВО дрон пнях, дю жити же єюю тк етутю, полем - зам : їмо і вищу вні Є ! є Ва. й а 80 | во 7 | і а Моя Я Я і х Н 2 і х ї Як ! ії : 5 |х Я Н х ї 3 ї У ї - і В шк К- х -е -. Піт В детевня во бл ие ше в ее ОО БЕ - РЕ-А х й нн б рр ж ЛО х ЕН х Ж 2 Х ї їі 5 5 ї зе . з Ї Бе : : і дей ЗОТУТІ ТЕ 3 1 ге ОНУШОВЕСО 5 в ви орі щі і : па ИЙ повір жи шина | ше р : Ж ОО очіеттнутнняс же и ши У Й РЕА РЕА

Фіг. 11

19о З чи : г Спостережувана ; - о : х є К нн Прогнозована о |, - Ж х г З ж і0б-н В ГК ШЕ 58 др з - г 10 зо за 40 Час (доба)

Фіг. 12

СОЮ (мкг/мл) А не Бі 3 х Поу гу Я не ж Й ; Де сш Ше о ЗО мг сич чада а 10 мкг о Ж. Бо Ше «її ка киш: ЧІ "не й и а у ро їв Я З й Б г : К. Я 77 і в й як З зді са ща ШЕ імп З з : Ів Кк за за ще МАК нини СЕ ха нен в нні кол ни нн х 338 | пн їла пн Же , ж і і: дні ва ій он нин - і | . Я же и о Шен нй «о паддоенння я зо нн зо 302 за за Ї

Фіг. 13

А Товщина шкіри (середнє значення/ 5ЕМІ 1004 е МО шк . Норма - се 805 ас во- ; можу : ; ! Во ' оо ; Е : ж ТА го 7.45 о о 04 1 10 чо Доза (мг/кг) В Частота Кіб7-позитивних ядер (середнє значення/ 5ЕМІ а ! ее МО КО ж. Норма 3 Я З В 494 мех ! в Б й І а ж в шкі ЕТ і т п вл З 18 100 Доза (мг/кг)

Фіг. 14

КОХ моде ПІД ; е ше Ж

5. шк а ни Ж -4 ж -щ з. "ав ще ви вах о З Е з. Ве -- т -Ще- г: «й. ев аз " г Ов) -йк- т ва ря З «Де г бо

-В. -8 доба 7 «В ухоннчннннюютеюютетьтетотооооко ненні коректечкноносннетннурнсцнеконкнторуетннтечтеснт» Я - з оф А ба Ка Ук р в ЗД СОМ х Кк а в ще я

Фіг. 15

Соде а АВОХАЇІ з о Контрольне антитіло того самого ізотий рик 5 з в О-8я м З й Б з я » . М я ? 2 і-жщ " З лі « козе:, Нм е е е я е | | й » 04 20 ним І» Мода нене не чнннотннеооо «А онука ннннн нн ктсстотоестотекеестестекестеерестеет тест тестер попе пн конк Фа С КК Ж ж ж ж ж» гри МУ ще Кк КУ Фіг, 16

А ех й зіод? гЦ.о2 ше М ї ші Ко и. пф ж дн ЗИ КЕ: 4. е і че о. кс иниРЧННИНТЬШИИИ

7 . в я ка і -й в. 0 нм то - « бан М дви М'єбНМ вм ан Об еМ В од ок З ш з . й «. ад 5 а М " те " й Ж | н я щі -- «М ча» 3 во ва З «20 німи й 29 х - ббнмМ Бен М'іаннИ вом МенМ ХО й дешжне

Фіг. 17

22 ав 23О0С549с1-Ме97О І 359 Ж З 119 г шООЮО ня й де са ;

У. Ме ах хе е ою щ : Б 40 з є ае Ж с КЕ Ва що ЕЕ в! те КЕ Концентрація антитіла (нм!

Чнг. 18