UA125534C2 - АНТИ-GARP-TGF-<font face="Symbol">b</font>-АНТИТІЛО - Google Patents

АНТИ-GARP-TGF-<font face="Symbol">b</font>-АНТИТІЛО Download PDF

Info

Publication number
UA125534C2
UA125534C2 UAA201911783A UAA201911783A UA125534C2 UA 125534 C2 UA125534 C2 UA 125534C2 UA A201911783 A UAA201911783 A UA A201911783A UA A201911783 A UAA201911783 A UA A201911783A UA 125534 C2 UA125534 C2 UA 125534C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
bek
uvi
tuk
rko
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201911783A
Other languages
English (en)
Inventor
дер Вонінґ Себастьян ван
дер Вонинг Себастьян ван
Філіп Боржион
Филип Боржион
Торстен ДРАЙЕР
Лор Маріен
Лор Мариен
Бук Ґітте де
Бук Гитте Де
Стефані Льенар
Стефани Льенар
Софі Лукас
Софи Лукас
Пьєр Кулі
Пьер Кули
Original Assignee
Ардженкс Бвба
Юніверсите Католік Де Лувен
Юниверсите Католик Де Лувен
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ардженкс Бвба, Юніверсите Католік Де Лувен, Юниверсите Католик Де Лувен filed Critical Ардженкс Бвба
Publication of UA125534C2 publication Critical patent/UA125534C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з комплексом людського GARP і людського TGF-β1.

Description

Винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з комплексом людського САКР і людського ТОЕ-ДВ1. т зон,
САВР----- о о ь : «З нкі пкел во ч». зе М со
Латентна фення Зрізи форма Нео в, вин
ТОВ. Латентно- ч й лет в
ІЗ ОХ а ХОМ МКК Ж, і пецтня с х, я 5 її иПИНШИИШ КИ ППО ИИИКИН І ок: ВИННІ ОВ Я
ВА их її
Ж МК За КВ КК ОН
Імунесупресія ріг. 1
Споріднені заявки
За даною заявкою запитується пріоритет заявки на патент Великобританії Мо 1707561.5, поданої 11 травня 2017 року, повний зміст якої включений в даний опис за допомогою посилання.
Список послідовностей
Дана заявка містить список послідовностей, який був представлений в електронному вигляді у форматі АЗСІЇ і в повному обсязі включений в даний опис за допомогою посилання.
Галузь техніки, до якої належить винахід
Даний винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з комплексом САКР ії ТОБ-с1, зокрема, з комплексом людського ЗАКР і людського ТОБЕ-В1. Ці антитіла і антигензв'язувальні фрагменти виявляють комбінацію переважних властивостей, включаючи зв'язування антигену з високою афінністю і здатність інгібувати вивільнення активного ТОЕ-ВД з регуляторних Т-клітин. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом вдосконалені порівняно з антитілами попереднього рівня техніки, які зв'язуються з комплексом СЗАКР ії ТОБ-В1. Зокрема, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом відносно стійкі до дезамідування, ізомеризації і окислення, так що вони виявляють підвищену стабільність порівняно з анти-ЯАВР-ТИБЕ-В1-антитілами, описаними на попередньому рівні техніки.
Рівень техніки
Регуляторні Т-клітини (також відомі як «Ттед» або Бохр3-- регуляторні Т-клітини) є важливим компонентом імунної системи. Зокрема, Тгед грають критичну роль в імунному гомеостазі, пригнічуючи різні аспекти імунної відповіді. Як наслідок, їх роль в координації імунної відповіді,
Тгед з порушеною активністю може призвести до розвитку різних захворювань і патологічних станів. Зокрема, недостатня функція Тгед може бути причиною аутоімунної патології, тоді як надмірна активність Тгед пов'язана з інгібуванням протипухлинних відповідей у пацієнтів зі злоякісним новоутворенням.
Білок СЗАКР (переважні повтори глікопротетїну А) був ідентифікований /- як високоекспресований маркер на поверхні Тгед, особливо активованих Тгед. САКР представляє трансмембранний білок з молекулярною масою 80 кДа з позаклітинною ділянкою, що включає
Зо 20 лейцин-багатих повторів. Вони також відомі як | КЕС32. САКР служить рецептором для ТаЕ-
В, особливо латентної форми ТОаЕ-ВД, і необхідний для експресії латентного ТаБР-В на клітинах
Ттєд (ЕМ ЗНнемасиі. Ехреп Оріп. ТнНег. Тагдвїв (2016) 21 (2), 191-200).
ТОаБР-В є цитокіном, який, як відомо, грає роль в багатьох процесах, включаючи проліферацію і диференціювання клітин, морфогенез тканин, запалення і апоптоз. Він також був ідентифікований як важливий фактор росту, що бере участь в розвитку злоякісного новоутворення, і достатньо незвичайно, був ідентифікований як цитокін із пухлино- стимулюючою і пухлино-пригнічувальною активністю.
Синтез і активація ТаР-Д є багатоступінчастим процесом, який регулюється на різних рівнях. тТар-В синтезується у вигляді димерного попередника про-ТЕЕ-В, де кожний поліпептидний ланцюг складається з латентно-асоційованого пептиду (І АР) і зрілої ділянки ТЯБЕ-В. Про-ТИБЕ-В піддається розщепленню ферментом фурином з утворенням "латентного ТаЕ-ДВ», неактивної форми, в якій (АР залишається нековалентно зв'язаним зі зрілою ділянкою ТОБЕ-В кожного поліпептидного ланцюга (див. фіг. 1). Локалізований на мембрані САКР служить для транспорту і якірного закріплення латентного ТОЕ-В вна клітинній поверхні Тгед, і саме з цього мембранозв'язаного комплексу САКР-латентний ТИЕ-В вивільняється активна форма ТОарг-р.
Для пояснення того, як активний ТИЕ-В вивільняється з комплексу САКР-латентний ТОаЕ-В на поверхні Тгед, були запропоновані різні механізми. Однак в цей час вважається, що інтегрини, зокрема, амрб і амр8, грають важливу роль у регуляції зусиль зсуву, необхідних для вивільнення зрілого димеру Таг-ВД.
Після вивільнення активний димер ТОЕ-В може функціонувати як аутокринний або паракринний медіатор даунстрім-сигнальних шляхів. Вважається, що в контексті імунної системи вивільнення ТОЕ-Д з клітин Тгтед впливає на активність різних ефекторних Т-клітин, а також самих Тгед (див. фіг. 1). Оскільки Тгед грають важливу роль в імуносупресії, то вважається, що ТОБЕ-В, що вивільняється з Тгед і діє аутокринно, може брати участь в забезпеченні супресії Тгед. Зокрема, вважають, що ТаБЕ-В1, що походить із Тгед, грає важливу роль в Тгтед-опосередкованій супресії пухлинного імунітету.
Враховуючи роль ТагЕ-ДВ, що походить з Тгед, в пригніченні імунної відповіді в мікрооточенні пухлині, є інтерес до націлення на цей шлях як альтернативний підхід для імунотерапії злоякісного новоутворення. Наприклад, терапевтичні агенти, здатні ослабити цей шлях, можуть 60 служити придатними інструментами для підвищення ефективності протиракових вакцин або інших стратегій імунотерапії злоякісного новоутворення, в яких використовуються можливості імунної системи організму для лікування злоякісного новоутворення.
Сиєпає єї аї. (Осі. Тгтапеі. Мей., 2015 Арг. 22; 7 (284): 284га5б) описують отримання і характеристику двох моноклональних антитіл (МНО-8 і І НО10), які зв'язуються з комплексом
САВР-ТОЯБ-В вна Тгед і інгібують продукцію ТОЕ-В. Ці два антитіла також описані і охарактеризовані в міжнародних заявках на патент УМО2015/015003 ії УМО2016/125017. Було показано, що ці антитіла здатні інгібувати імуносупресивну активність людських Тгед на мишачій моделі синдрому "ксеногенний трансплантат проти хазяїна". Результати цієї роботи служать для підтвердження того, що комплекс ЗАКР-ТОЕ-В є цікавою терапевтичною мішенню для цілей модуляції функції Тгед і, отже, для лікування таких захворювань, як злоякісне новоутворення і аутоїмунні захворювання, де рівень активності Тгед грає важливу роль. Однак залишається необхідність у вдосконалених антитілах до САКР-ТОБЕ-ВД, здатних інгібувати вивільнення ТОЕ-В і тим самим модифікувати активність Тгед. Даний винахід вирішує цю проблему, як описано в даному описі.
Суть винаходу
Даний винахід поліпшує сучасний стан забезпеченням нових антитіло і їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з комплексом людських СЗАКР-Тав-рВ1.
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом отримані з антитіла до САКР-
ТОБ-В1 "/НО-10", описаного в міжнародних заявках на патент УУО2015/015003 і
УМО2016/125017. Послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга І НО-10 показані в 5ЕО ІЮ МО:1 і 2, відповідно, і варіабельна ділянка варіанта з переставленим легким ланцюгом, І Но-10.6 (також описаного в УМО2015/ 015003 ії ММО2016/125017), показана в 5ЕО ІЮ
МО:3. Антитіла за даним винаходом відрізняються, зокрема, відносно певних послідовностей
СОК порівняно з ГНО-10 і ГНО-10.6, зокрема, відносно послідовностей СОК2 і СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга. Анти-САВР-ТОЕ-ВД1-антитіла, І НО-10 ї ГНО-10.6, мають послідовність СОК2 важкого ланцюга: ВІОРЕОСИТКМАОКРОС (ЗЕО І МО:5); і послідовність
СОКЗ важкого ланцюга: МЕМЕТУММОарІ ММЕМЕМ (5ЕО ІО МО:б), тоді як антитіла за даним винаходом містять послідовність СОК2 важкого ланцюга: ВІОРЕВАСТКУАОКРОС (5ЕО І
МО:12); і послідовність СОКЗ важкого ланцюга: МЕМ/ЕТУММОаОІ ММЕМЕМ (ЗЕО ІЮ МО:13).
Відмінності в послідовностях СОМК2 і СОКЗ важкого ланцюга, описані в даному описі, призводять до антитіл, які вдосконалені порівняно з антитілами попереднього рівня техніки завдяки їх підвищеній стабільності. Більш конкретно, антитіла за даним винаходом відносно стійкі до дезамідування, ізомеризації і окислення, так що вони виявляють підвищену стабільність. Дивно, що ці специфічні заміни в ділянках СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга, які призводять до підвищеної стабільності, істотно не знижують афінність зв'язування антитіл з комплексом САКР-ТаЕ-В1. Підвищена стабільність в поєднанні з високоафінним зв'язуванням з мішенню робить антитіла за даним винаходом особливо придатними для клінічної розробки як терапевтичних агентів, наприклад, як терапевтичних агентів для лікування злоякісного новоутворення.
У першому аспекті даний винахід забезпечує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з комплексом людських САКР-ТСИЕ-В1, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), де:
СОВЗ МН містить амінокислотну послідовність "У'ЕМЕТММУМООІ МУЕМЕМ (ЗЕО ІЮ МО:13),
СОВА МН містить амінокислотну послідовність КІОРЕВАСТКУАОКРОС (5ЕО ІО МО 12), і
СОВІ МН містить амінокислотну послідовність ЗУМІЮ (ЗЕО ІЮО МО :4).
У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, які зв'язуються з комплексом людських САКР-ТОИЕ-В1, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), де:
БО СОВЗ МН складається з амінокислотної послідовності МЕМЕТУУМарІ ММЕМЕМ (5ЕО І
МО:13),
СОВ2 МН складається з амінокислотної послідовності КІОРЕСАСТКМАОКРОС (5ЕО І
МО:12), і
СОВІ МН складається з амінокислотної послідовності ЗУМІЮ (ЗЕО ІЮО МО 4).
Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть додатково містити варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МІ. містить амінокислотну послідовність ООМАЗМРМТ (5ЕО ІО МО:11),
СОВа2 МІ. містить амінокислотну послідовність ЗА5КІ КТ (ЗЕО ІЮО МО:10), і
СОН Мі містить амінокислотну послідовність ОАБОЗІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9). бо У деяких варіантах здійснення антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть додатково містити варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МІ. складається з амінокислотної послідовності ФЗОМАБЗМРМТ (5ЕО ІЮ МО:11),
СОВа2 МІ. складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОВІ МІ. складається з амінокислотної послідовності ОАБОБІББЗМІ А (5ЕО 10 МО:9).
У деяких варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить: варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), де:
СОВЗ МН містить амінокислотну послідовність "У'ЕМЕТММУМООІ МУЕМЕМ (ЗЕО ІЮ МО:13),
СОВА МН містить амінокислотну послідовність КІОРЕСАСТКУАОКРОС (5ЕО ІЮО МО 12), і
СОВІ МН містить амінокислотну послідовність ЗУМІЮ (5ЕО ІО МО 4); і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МІ. містить амінокислотну послідовність ОФОМАЗМРМТ (5ЕО ІЮ МО:11),
СОВа2 МІ. містить амінокислотну послідовність ЗАЗ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОН Мі містить амінокислотну послідовність ОАБОЗІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9).
У деяких варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить: варіабельну ділянку важкого ланцюга (УН), де:
СОВЗ МН складається з амінокислотної послідовності ХЕММЕТУУМОРІ МУЕМЕМ (ЗЕО І
МО:13),
СОВ2 МН складається з амінокислотної послідовності КІОРЕСАСТКУАОКРОС (5ЕО ІЮ
МО:12), і
СОВІ МН складається з амінокислотної послідовності ЗУМІО (ЗЕО ІЮО МО:4); і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МІ. складається з амінокислотної послідовності ФЗОМАБЗМРМТ (5ЕО ІЮ МО:11),
СОВа2 МІ. складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОН Мі. складається з амінокислотної послідовності ОАЗОЗІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9).
У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти включають щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і/або щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), які являють собою гуманізований варіант, варіант зародкового типу або афінний варіант верблюдячої ділянки УН або МІ.
У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з комплексом людського САКР і людського ТОаЕ-ДВ1, де антитіла або антигензв'язувальні фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з наступного: (Ї) МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ХЕО ІЮ МО:14; або (ї) МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності, що має щонайменше 90 до, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:14.
Альтернативно або додатково, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), вибрану з наступного: (Ї) М, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:15; або (ї) М, що містить або складається з амінокислотної послідовності, що має щонайменше 90 до, щонайменше 95 95, щонайменше 97 956, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичність з ФЕО ІЮ МО:15.
Для варіантів здійснення, в яких ділянки антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною процентною ідентичністю послідовності з референсною послідовністю, ділянки МН і/або МІ можуть зберігати послідовності СОК, ідентичні тим, які присутні в референсній послідовності так, що варіабельність присутня тільки в ділянках каркасної ділянки.
У конкретному варіанті здійснення забезпечені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, де варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮО МО:14, і варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕ ІЮ МО:15.
У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом включають домен СНІ, шарнірну ділянку, домен СНЕІ і домен СНЗ антитіла людини, зокрема, Ідс1, Ідс2 людини, ІдеЗ або Ідс4 людини. У деяких варіантах здійснення антитіло включає домен СНЗ людського ІдС4 і включає заміну 5228Р в домені СНЗ.
Антитіла, які зв'язуються з комплексом САКР-ТИаЕ-В1, можуть включати щонайменше один повнорозмірний важкий ланцюг імуноглобуліну і/або щонайменше один повнорозмірний легкий ланцюг лямбда або каппа. У деяких варіантах здійснення антитіла містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:16, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну 60 послідовність 5ЕО ІЮ МО:17. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 до, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО:16. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять легсий ланцюг щонайменше з 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 96 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:17. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:16, і легкий ланцюг щонайменше з 90 9о, щонайменше 95 96, щонайменше 97 9о, щонайменше 98 90 або щонайменше з 99 95 ідентичністю з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ
МО:17.
Для варіантів здійснення, в яких важкий і/або легкий ланцюги антитіл визначаються конкретною процентною ідентичністю послідовності з референсною послідовністю, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг можуть зберігати послідовності СОК, ідентичні тим, які присутні в референсній послідовності, так що варіабельність присутня тільки за межами доменів СОК.
Якщо в даній заявці не вказано інше, то 905 ідентичність послідовності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити порівнянням цих двох послідовностей, оптимально вирівняних, і в якому амінокислотна послідовність, що порівнюється, може містити додатки або делеції відносно референсної послідовності для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Процент ідентичності розраховується визначенням кількості ідентичних положень, для яких амінокислотний залишок є ідентичним між двома послідовностями, діленням цієї кількості ідентичних положень на загальну кількість положень у вікні порівняння і множенням отриманого результату на 100, з отриманням процента ідентичності між цими двома послідовностями. Наприклад, можна використовувати програму ВІ А5Т "Послідовності ВІ АБ5Т 2" (Тайзома еї аї, "Віавзі 2 зедиепсез - а пем/ 00! Тог сотрагіпо ргоївіп апа писієоїде 5едиепсев",
ЕЕМ5 Місгобіо! Гей. 174:247-250), використовуються параметри за замовчуванням (зокрема, такі параметри як "штраф за відкритий геп": 5 і "штраф за подовження гепа": 2; вибраною матрицею є, наприклад, матриця "ВГОБОМ 62", запропонована програмою), процент ідентичності між двома послідовностями, що порівнюються, розраховується безпосередньо програмою.
Кожне з анти-СЧАВР-ТаЕ-Д1-антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів, забезпечених в даному описі, може виявляти одну або більше з наступних властивостей/ознак: - антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть перехресно реагувати з комплексом
САВР-ТОаНЕ-В1 яванського макаки; - антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть зв'язуватися з ЗАКР-ТОИЕ-В1 людини з високою афінністю; - антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть включати ділянку МН і ділянку МІ, які при тестуванні у вигляді Гар-фрагмента демонструють швидкість дисоціації (Кої) комплексу людських САЕР і ТОБЕ-В1 нижче 5х107 с; - антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть включати ділянку МН і ділянку МІ, які при тестуванні у вигляді Гар-фрагмента демонструють швидкість дисоціації (Кої) комплексу людських САКР і Таг-В1 в діапазоні від 1х105 с" до 5х107 с; - антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть включати ділянку МН і ділянку МІ, які при тестуванні у вигляді тАб демонструють Ко нижче 1,7х103 М; - антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можуть блокувати або інгібувати вивільнення активного ТаЕ-В1 з регуляторних Т-клітин.
У додаткових аспектах винахід також стосується полінуклеотидних молекул, які кодують вищезгадані антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, на доповнення до експресійних векторів, що містять полінуклеотиди, клітин-хазяїнів, що містять вектори, і способів рекомбінантної експресії/продукування антитіл, описаних в даному описі.
У ще одному аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить будь-яке з антитіл до САКР-ТОЕ-В1 або їх антигензв'язувальних фрагментів, описаних в даному описі, і фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт.
Ще один аспект винаходу стосується способів терапевтичного лікування з використанням вищезгаданих антитіл до ЗСАКР-ТОЕ-ДВ1 або їх антигензв'язувальних фрагментів, зокрема, для профілактики і/або лікування розладів, пов'язаних з ТОЕ-ВД. У деяких варіантах здійснення винахід стосується способів лікування з використанням антитіл до СЗАКР-ТОИБЕ-В1 або їх антигензв'язувальних фрагментів, де захворювання або патологічний стан, що підлягає бо лікуванню, вибране(ий) з групи, що складається із запальних захворювань, хронічної інфекції,
злоякісного новоутворення, фіброзу, серцево-судинного захворювання, цереброваскулярної хвороби і нейродегенеративного захворювання. У деяких варіантах здійснення антитіла до
САВР-ТаЕ-В1 або їх антигензв'язувальні фрагменти вводять у комбінації з іншим лікуванням у вигляді частини комбінованої терапії. Наприклад, антитіла до «САКР-ТОБ-В1 або їх антигензв'язувальні фрагменти можна вводити в комбінації з імунотерапевтичним агентом, необов'язково імуностимулюючим антитілом або протипухлинною вакциною.
Ці й інші варіанти здійснення винаходу будуть краще оцінені і зрозумілі при розгляді в поєднанні з подальшим описом і прикладеними фігурами. Потрібно розуміти, однак, що нижченаведений опис, в якому описані різні варіанти здійснення винаходу і численні його конкретні деталі, представлений як ілюстрація, а не обмеження. Багато замін, модифікацій, доповнень і/або перестановок може бути зроблено в межах обсягу винаходу, не відступаючи від його суті, і винахід включає всі такі заміни, модифікації, доповнення і/або перестановки.
Короткий опис фігур
На фіг. 1 представлена схема, що показує зв'язування латентного ТИБ-В з САКР на поверхні регуляторних Т-клітин. ТЯБ-В продукується у вигляді попередника "про-Таг-Д» і піддається розщепленню з утворенням "латентного- ТЕ-В», форми, в якій зрілий димер ТаЕ-В залишається нековалентно зв'язаним з ділянкою латентно-асоційованого пептиду (ГАР) кожного поліпептиду. Саме ця латентна форма зв'язується з САКР на поверхні Тгед-клітин. Вважається, що інтегрини амрб і аиВ8 відповідальні за вивільнення зрілого або "активного ТЯЕ-Д» з поверхні клітини. Ця активна форма може функціонувати як паракринний медіатор, викликаючи ефекти в різних клітинах-мішенях, або може функціонувати як аутокринний медіатор, зв'язуючись з рецептором Таг-ВД на Тгед-клітинах.
На фіг. 2 показана активність зв'язування з мішенню, виміряна за допомогою аналізу
Віасоге"М або поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ) для антитіл 3986 ІдсСі1М2970 | 3986
Ідс45228Р протягом 56-денного періоду для зразків, що зберігалися при -20 "С, 5 С і 37 "С в РВ5 або РВЗ-Твіні (РВ5Тм/). Контрольний зразок (який зберігали при -20 "С) приймали за 100 95 активність зв'язування на кожну часову точку.
На фіг. З показані результати тестування варіантів антитіла 3986-А в аналізі, призначеному для моніторингу фосфорилування ЗМАБ2 після активації рецептора ТОЕ-ВД. Фосфорилування
Зо ЗМАБ2 служить маркером активації сигнального шляху ТаЕ-В після зв'язування ТИБ-В з його рецептором. Якщо фосфорилування 5МАО2 знижене, то активність ТаЕ-В інгібована. На фіг.
ЗА: вестерн-блоти, що показують зниження фосфорилування ЗМАЮ2 в присутності різних концентрацій анти-ЗАВР-ТОЕ-В-антитіл 3986-А, 3986-АМЕ, 3986-АЕЕ, 3986-АХУЕ, 3986-АМЕ і 3986-АМК. На фіг. ЗВ: графічне представлення даних, представлених в (А), що показують процент інгібування фосфорилування 5МАВБАІ при різних концентраціях антитіл.
На фіг. 4 показані результати тестування варіантів антитіла 3986-А в аналізі, призначеному для вимірювання активності ТОБ-В за допомогою репортерного гена люциферази, кон'югованого з промотором ЗМАЮ. Графіки показують процентне інгібування сигналу люмінесценції в присутності різних концентрацій анти-ЗАВР-ТОаЕ-В-антитіл, І НО-10, 3986-А, 3986-АМЕ, 3986-АЕЕ, 3986-АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМК.
На фіг. 5 показане процентне утворення агрегатів протягом 56-денного періоду для антитіл 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕК, що зберігалися при 5"С і 37 "С. Утворення агрегатів контролювали з допомогою ексклюзійної хроматографії (5Е-НРІ С).
На фіг. 6 показане процентне утворення фрагментів протягом 56б-денного періоду для антитіл 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ, що зберігалися при 37 "С. Утворення фрагментів контролювали з допомогою ексклюзійної хроматографії (З5Е-НРІ С).
На фіг. 7 показана процентна площа мономерів протягом 56-денного періоду для антитіл 3986-АМЕ, 3986-АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ, що зберігалися при 5 "С і 37 "С. Площу мономерів контролювали з допомогою ексклюзійної хроматографії (ЗЕ-НРІ С).
На фіг. 8 показані результати аналізу 5ХО5-РАСЕ зразків антитіл, що зберігалися протягом 56 діб при референсній температурі (- 20 "С), при 5 "С і при 37 "С. На фіг. А: 3986-АМЕ. На фіг. 88: 3986-АУЕ. На фіг. 8С: 3986-АМК. На фіг. 80: 3986-АМК. Маркери знаходяться в центрі кожного гелю. Зліва від маркерів З зразка: (ї) контрольний зразок; (ії) зберігання при 5 "С; і (ії) зберігання при 37 "С, тестовані в невідновлювальних умовах, і праворуч від маркерів, З зразки: () контрольний зразок; (її) зберігання при 5 "С; і (ії) зберігання при 37" С, тестовані в відновлювальних умовах.
На фіг. 9 показана активність зв'язування з мішенню, виміряна аналізом Віасоге? або ЗРК для антитіл 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМК протягом 56-денного періоду для зразків, що зберігалися при -20 С, 57С і 37 "С. Контрольний зразок (зберігання при -20 С) бо приймали за 100 95 активність зв'язування на кожну часову точку.
На фіг. 10 показана концентрація білка (мг/мл) для зразків антитіл 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМК протягом 56-денного періоду для зразків, що зберігалися при -20 С (контрольний зразок), 5 "Сі 37 76.
На фіг. 11 показані результати аналізу 505-РАСЕ зразків антитіл після 10 циклів заморожування-розморожування. Маркери знаходяться в центрі гелю. Зліва від маркерів, 4 зразки представляють зразки, аналізовані в невідновлювальних умовах: (ї) контрольний зразок для 3986-АМЕ; (ії) зразок із заморожуванням-розморожуванням 3986-АМЕ; (ії) контрольний зразок для 3986-АМЕ; і (ім) зразок із заморожуванням-розморожуванням 3986-АУЕ. Праворуч від маркерів 4 зразки представляють зразки, аналізовані у відновлювальних умовах: (Її) контрольний зразок для 3986-АМЕ; (ії) зразок із заморожуванням-розморожуванням 3986-АМЕ; (ії) контрольний зразок для 3986-АУЕ; і (ім) зразок із заморожуванням-розморожуванням 3986-
АУЕ.
На фіг. 12 показана активність зв'язування з мішенню, виміряна аналізом Віасоге? або ЗРК після 10 циклів заморожування-розморожування для антитіл 3986-АМЕ і 3986-АМЕ.
Контрольний зразок (зберігання при -20 "С) приймали за 100 95 активність зв'язування на кожну часову точку.
На фіг. 13 показана концентрація білка (мг/мл) для зразків антитіл 3986-АМЕ і 3986-АМЕ після 10 циклів заморожування-розморожування.
На фіг. 14 показана активність зв'язування з мішенню, виміряна аналізом Віасоге? або ЗРК після тестування термостабільності при температурі від 54,6 "С до 71,4 "С для антитіл 3986-
АМЕ, 3986-АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМК. Контрольний зразок приймали за 100 9о активність зв'язування.
На фіг. 15 показані результати аналізу 5ХО5-РАСЕ зразків антитіл після 96 год. обертання.
Маркери знаходяться в центрі гелю. Зліва від маркерів, 4 зразки представляють зразки, аналізовані в невідновлювальних умовах: (ії) контрольний зразок для 3986-АМЕ; (ії) зразок, що був підданий ротаційному обертанню 3986-АМЕ; (ії) контрольний зразок для 3986-АМЕ; і (ім) зразок, що був підданий ротаційному обертанню 3986-АМЕ. Праворуч від маркерів 4 зразки представляють зразки, аналізовані у відновлювальних умовах: (ії) контрольний зразок для 3986-
АМЕ; (ії) зразок, що був підданий ротаційному обертанню 3986-АМЕ; (ії) контрольний зразок для
Зо 3986-АХУЕ; і (ім) зразок, що був підданий ротаційному обертанню 3986-АМЕ.
На фіг. 16 показана активність зв'язування з мішенню, виміряна аналізом Віасоге? або ЗРК після тестування ротаційної стабільності для тАр 3986-АМЕ і 3986-АМЕ. Контрольний зразок приймали за 100 95 активність зв'язування.
На фіг. 17 показана концентрація білка (мг/мл) для зразків тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ після тестування ротаційної стабільності.
На фіг. 18 показаний відносний рівень дезамідування і ізомеризації в положенні МУО5 в антитілах 3986-АМЕ, 3986-АМЕК і 3986-АМК протягом 56-денного періоду. Антитіла 3986-АМЕ і 3986-АУЕ не включали у випробування, оскільки у цих антитіл був видалений залишок "МОУ5" з
СОКЗ. Також показана відносна зв'язувальна активність для тар 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-
АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕК протягом 56 днів, для зразків, що зберігалися при 37 "С.
На фіг. 19 показана необхідність у зрілому ТИЯЕ-В в зв'язуванні 3986-АМЕ (АВИаХ-115) з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В. Планшети для ЕГІЗА покривали САКР або анти-САВР АБ, АНИаХ- 115. Для планшетів для ЕЇГІ5А, покритих СЗАКР, забезпечували можливість утворення комплексу з повнорозмірним латентним ТаЕ-В (включаючи як ділянки ГІ АР, так і зрілого ТИ Б-В) або комплексу з рекомбінантним ГАР додаванням відповідного рекомбінантного білка. Для планшетів для ЕГІЗА, покритих АКОХ-115, додавали САКР і потім додавали повнорозмірний латентний ТИБЕ-В або ГАР. АКОХ-115 був здатний зв'язуватися з САРЕР тільки в присутності повнорозмірного ТОЕ-В. Зв'язування АКОХ-115 з комплексом САКР-ГАР було відсутнє.
Навпаки, анти-І АР-антитіло було здатне зв'язуватися з комплексом САКР-ІГ АР. Це демонструє необхідність в зрілому ТаЕ-В для зв'язування АКОХ-115 з комплексом САКР-ТОИБЕ-В.
На фіг. 20 показана здатність антитіл нейтралізувати активацію ТИЕ-В комплексом ЗАКР- такг-р з різними мутантними формами ТОаЕ-Д. Нейтралізуюча активність АКОХ-115 відмінялася внаслідок мутації К58 в Г АР і К338 в зрілому ТаБ-Д.
Детальний опис винаходу
А. Визначення "ЗАКР". САКР (переважні повтори глікопротеїну А) є членом сімейства білків, що містять лейцин-багаті повтори. Його також називають білком 32, що містить лейцин-багаті повтори (І ККС32). ЗАКР являє собою трансмембранний білок з молекулярною масою 80 кДа з позаклітинною ділянкою, що складається в основному з 20 лейцин-багатих повторів. Повна бо амінокислотна послідовність варіанта 2 транскрипту білла САКР людини (ідентифікаційний номер СепВапк МР 001122394.1) представляє:
МАРОІШЕСГАССТ СГ АХОНООКМРОКМУОККУЗСОМІ СП ОМРЗМІРРОТЕТІ ОЇ ЗИМОВА
ЗРІ аЕМТАЇ ВНІ ОЇ ЗТМЕІЗЕ ОРСАРОАЇ ТНІ ЕНІ БІ АНМАВІГАМАТАЇ ЗБАСИї РІ РАМТ5І І ам
ЗІ УЗИ ЕВ Г СЕАРБІ НТІ ЗІ АЕМБ5І ТВ ТАНТЕВОМРАГЕОІ ОЇ НЗММІ МОТЕОСАРЕСІ РА ТНІ М
І 5АМБТСІБОББГОСІ ВМ І ЗСМЗІЕАРОТАБОРОАЕРОЇ ТМ ОІСА!ЕМКОНЕРОГААСРАСІМІ МІ 5
ММ АГРТаРРОЮЗБКИІНнНАРБЗЕСМУЗАЇІ РІ БАРБИМАБОВРІ БОГ МІ ОЇ ЗММЕЇЕПІРОБЗЕЇГ ЕНІ Т5І С
Е-МІ ЗАМСІ АТРЕАВВІГ СОБІ РСІ МІ І ЗНМАЇ ЕТІ ЕІ САВА СОБІ АТ ОСМА АОІ РРУТЕАМІ АБ
ГОВІ М ОСМАУЗРОСОРОЕРИЕРБИасСМАЕЗИїІТ5І АБ 5І МОМЕЇІЕ І ВАСАБІ НТРІ ТЕГ ОЇ 55МРИЇ.
ЕМАТОАЇ СОЇ ЕАБІ ЕМ АГ ОСМаИаІ ММ ОМ РОСРІСІ КВ МІ АЄЕМВАВІ ЗНІ РАМУТОАМ5БІ ЕМІ ОЇ ММ
ЕБІ ГРИБАМИ ЕТ5І АВІ МІ ОСМРІ БССО,МСОСУМ ААХОЇ НОСАМОМОАТООГ ІСВЕ5БОЕЕМ5І ЗНУ
ВАРЕОСЕКИИІ КМІМІ ПСТРП МБАЙТ ААСССУАВОКЕМООМУКА (5ЕО ІЮ МО:33). "Такг-В». ТаБ-В представляє цитокін, що належить до суперсімейства факторів росту. Існує три різні ізоформи ТОаБ-В (Тав-В1, Тавг-р2 ії Таг-ВЗ), що кодуються трьома різними генами, але загальні структури ізоформ ТОБ-В дуже схожі, з сгомологією на рівні 70-80 95. Як використовується в даному описі, термін ТаЕ-В звичайно використовується для охоплення всіх трьох різних ізоформ ТОаг-Д цитокіну, якщо в контексті не вказано інше.
Всі три ізоформи ТОБ-В кодуються у вигляді великих білків-попередників; ТОаБ-В81 (ідентифікаційний номер СепВапк: ММ 000660) містить 390 амінокислот, і Тав-р2 (ідентифікаційний номер СепВапк: ММ 001135599 і ММ 003238) їі ТаБ-ВЗ (ідентифікаційний номер СепВапк: ХМ 005268028), де кожний містить 412 амінокислот. Кожний з них має М- кінцевий сигнальний пептид з 20-30 амінокислот, який необхідний для секреції з клітини, проділянку (що називається латентно-асоційованим пептидом або ГАР) ії С-кінцеву ділянку з 112-114 амінокислот, яка стає зрілою молекулою ТОИЕ-В після її вивільнення з проділянки внаслідок протеолітичного розщеплення. Після протеолітичного розщеплення ГАР і зрілий ТО Е-
В залишаються нековалентно зв'язаними і утворюють молекулу "латентного ТОБ-В». У цій латентній формі зрілий ТОЕ-Д не зв'язується з рецептором ТОаЕ-ВД за допомогою ГІ АР. Для того, щоб виявляти сигнал, зрілий ТОЕ-В повинен звільнитися від ГАР. Зрілий ТОБ-ДВД, який не зв'язаний з ГАР, називається активним ТОЕ-ДВ, оскільки він може зв'язуватися з рецептором танг-р і передавати сигнал.
Зо Повнорозмірний ТаР-ДВ1 має наступну амінокислотну послідовність:
МРРБОЇ ВІ РИ РО УМЛІ МСТРОвРААСІ 5ТОКТІОМЕЇ МКАКАЇЕАІВСОЇІ 5КІ ВІ А5РРБЗОСЕ
МРРОРІ РЕАМГ А УМ ТВОВМАСЕЗАЕРЕРЕРЕАОВУМАКЕМТАМІ ММЕТНМЕІЇМОКЕКОЗТНЗІММЕЕ
МТЗЕГ ВЕАМРЕРМІ І ЗВАБЕЇ НІ І ВІ КІ КМЕОНМЕЇ МОКУЗММОМУУАМУІ ЗМА АРБОБРЕМІ 5ЕОМТа
МУВОМІ ЗВаСЕІЕСЕВІ БАНСОЗСОЗАОМТ ОМБІМа ЕТ ТавВварі АТІНОММАРЕГІІ МАТРІ ЕНАО
НГО5ЗАНАВАЇ ОТМУСЕЗЗТЕКМССМУВОЇ МІСЕВКОЇ СМ/КУНЕРКИМНАМЕСІ СРСРМІМ/5І ОТО
ЗКМІАЇУМОНМРОаАЗААРССУРОАГЕРІ РІУМУМаИаАКРКМУЕОЇ ЗММІМАЗСКОБЗ (5ЕО ІЮ МО:34).
І АР має наступну амінокислотну послідовність:
І 5ТОКТІОМЕГУКАКВІЕАІВСИОТ ЗКІСВІГАЗРРБЬОСЕМРРОРІ РЕАМІАГММЗТАОВМАСЕБЗАЕРЕ
РЕРЕАОУМАКЕМТАМІ ММЕТНМЕІМОКЕКОЗТНЗІУМЕЕМТЗЕЇ ВЕАМРЕРМІІ ЗВАБЕЇ ВІ ВІ КІ КМЕ
ОНМЕГ МОКУЗММОМАМІ ЗМА ПП АРБОЗРЕМІ БЕОУТаУМУВОМІ ЗНИасСЕЇІЕСЕВІ БАНСОЗСОЗАОМ
Т ОМОІМаЕТттТавварі АТІНаОММАРЕГ І МАТРІ ЕВАОНІ О558НВАВ (5ЕО ІЮ МО: 35).
Зрілий ТаБР-В1 має наступну амінокислотну послідовність:
АГОТМУСЕЗЗТЕКМССУВОЇ МІОЕВКОЇ СМУКУМІНЕРКИУНАМЕСІ аРСРМІМ БІ ОТОМЗКМІ АЇ М
МОНМРОІаАБААРССУРОАГЕРІ РІУМУУМСИАКРКМЕОЇ 5ММІМАЗСКОБЗ (5ЕО ІЮ МО:З6). "Комплекс ЗСАКР-ТОЕ-рД». Як використовується в даному описі, термін "комплекс ЗАКР-Тав-
В» означає нативний комплекс, який утворюється, коли латентний ТОЕ-В зв'язується з САКР, зокрема, з САКР, розташованим на поверхні Тгед-клітин. Не зважаючи на те, що в даному описі не вказано, термін "комплекс ЗАКР-ТОЕ-В» або просто "ЗАКР-ТОБЕ-В» призначений для позначення комплексу між САКР і латентним ТОЕ-ВД. Зв'язування ЗАКР з ТОаБ-В, більш конкретно з латентним ТаЕ-В, було охарактеризоване на молекулярному рівні, наприклад, як повідомлялося в публікації Ууапд еї аї. Мої. ВіоїІ. СеїІ.,, 2012 Маг; 2 3(6):1129-39. САЕР утворює дисульфідний зв'язок з Суз4 латентного ТОаБ-Д, і також зв'язується з латентним ТОаЕ-В через нековалентні взаємодії. У позаклітинному домені САКР є 15 залишків Суб, і ЗАКР використовує
Сув-192 і Субз-331 для утворення дисульфідних зв'язків з двома залишками Сузі4 латентного
ТОРЕ-В. Отже, один білок САБР зв'язується з одним латентним ТаЕ-В-димером. "Антитіло" або "імуноглобулін". Як використовується в даному описі, термін "імуноглобулін" включає поліпептид, що має комбінацію двох важких і двох легких ланцюгів, незалежно від того, має він який-небудь відповідну специфічну імунореактивність чи ні. "Антитіла" стосуються таких молекул, які мають значну відому специфічну імунореактивність відносно антигену, що бо становить інтерес (наприклад, комплексу САКР і ТаЕ-В). Як використовується в даному описі,
термін "анти-САВР-ТОЕ-В-антитіла" стосується антитіл, які виявляють імунологічну специфічність для комплексу ЗАКР-ТОБ-В1, зокрема, комплексу людських САКР-ТОРЕ-ДІ1 Її в деяких випадках їх видових гомологів. Антитіла і імуноглобуліни включають легкі і важкі ланцюги, з або без міжланцюжковим ковалентним зв'язком між ними. Основні структури імуноглобуліну у хребетних відносно добре вивчені.
Загальний термін "імуноглобулін" включає п'ять різних класів антитіл (дос, І9ДМ, ІдА, дО або
ІЧЕ), які можна розрізнити біохімічно. Всі п'ять класів антитіл входять в обсяг даного винаходу.
Подальше обговорення, загалом, буде стосуватися класу імуноглобулінових молекул Ід.
Відносно Ідс, то імуноглобуліни звичайно містять два ідентичні поліпептиди легкого ланцюга з молекулярною масою приблизно 23000 дальтонів і два ідентичні поліпептиди важкого ланцюга з молекулярною масою 53000-70000 дальтонів. Чотири ланцюги з'єднані дисульфідними зв'язками в конфігурації "У", де легкі ланцюги скріпляють важкі ланцюги, починаючи з розвилки "у" і продовжуючись через варіабельну ділянку.
Легкі ланцюги антитіла класифікуються як каппа (к) або лямбда (АХ). Кожний клас важкого ланцюга може бути зв'язаний з легким ланцюгом каппа або лямбда. Загалом, легкий і важкий ланцюги ковалентно зв'язані один з одним, і "хвостові" частини двох важких ланцюгів зв'язані одна з одною ковалентними дисульфідними зв'язками або нековалентними зв'язками, коли імуноглобуліни продукуються гібридомами, В-клітинами або генно-інженерними клітинами- хазяїнами. У важкому ланцюгу амінокислотні послідовності проходять від М-кінця на роздвоєних кінцях У-конфігурації до С-кінця в нижній частині кожного ланцюга. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон (у, Н, а, б, є) з наявністю деяких підкласів серед них (наприклад, у1-у4). Саме природа цього ланцюга визначає "клас" антитіла як їдс, ІМ, ІдА, дО або ІдЕ відповідно. Підкласи імуноглобулінів (ізотипи), наприклад, Ідс1, Ідс2, ІдЗ, Ідс4, ІдДА1 і т.д., добре охарактеризовані і, як відомо, надають функціональну спеціалізацію. Фахівці в даній галузі можуть легко визначити модифіковані варіанти кожного з цих класів і ізотипів з урахуванням даного розкриття і, отже, вони знаходяться в обсязі даного винаходу.
Як вказано вище, варіабельна ділянка антитіла забезпечує можливість антитілу селективно розпізнавати і специфічно зв'язуватися з епітопами на антигенах. Тобто домен МІ і домен МН
Зо антитіла об'єднуються, утворюючи варіабельну ділянку, яка визначає тривимірний антигензв'язувальний сайт. Ця четвертинна структура антитіла утворює антигензв'язувальний сайт, що знаходиться на кінці кожного плеча У. Більш конкретно, антигензв'язувальний сайт визначається трьома ділянками, які визначають комплементарність (СОК), в кожному з ланцюгів МН і МІ. "Сайт зв'язування". Як використовується в даному описі, термін "сайт зв'язування" включає ділянку поліпептиду, яка відповідальна за вибірне зв'язування з антигеном-мішенню, що становить інтерес. Зв'язувальні домени містять щонайменше один сайт зв'язування. Типові зв'язувальні домени включають варіабельну ділянку антитіла. Молекули антитіл за винаходом можуть містити один сайт зв'язування або декілька сайтів зв'язування (наприклад, два, три або чотири). "Варіабельна ділянка" або "варіабельний домен". Терміни "варіабельна ділянка" і "варіабельний домен" використовуються в даному описі взаємозамінно і мають однакове значення. Термін "варіабельний" стосується того факту, що певні частини варіабельних ділянок
МН ї МІ. істотно відрізняються по послідовності серед антитіл і забезпечують зв'язування і специфічність кожного конкретного антитіла для його антигену-мішені. Однак варіабельність нерівномірно розподілена по варіабельних ділянках антитіл. Вона сконцентрована в трьох сегментах, які називаються "гіперваріабельними петлями" в кожній ділянці МІ і ділянці МН, які утворюють частину антигензв'язувального сайту. Перша, друга і третя гіперваріабельні петлі домену легкого ланцюга М лямбда стосуються в даному описі 1 (Х),12 (Х) і І З (АХ) і можуть бути визначені як такі, що містять залишки 24-33 (11(Х), що складається з 9, 10 або 11 амінокислотних залишків), 49-53 (12(Л), що складається із З залишків) і 90-96 (І З(Х), що складається із 5 залишків) у ділянці МІ. (Могєа есеї а!., Меїшйоав, 20: 267-279 (2000). Перша, друга і третя гіперваріабельні петлі домену легкого ланцюга М каппа стосуються в даному описі І 1:(к),
І 2(ю ії Г-3З(ю) і можуть бути визначені як такі, що містять залишки 25-33 (І 1(к), що складається з б, 7, 8, 11, 12 або 13 залишків), 49-53 (І 2(к), що складається із З залишків) і 90-97 (І З(кю), що складається із б залишків) в ділянці МІ (Могєа вї а!., Мешоавз 20: 267-279 (2000)). Перша, друга і третя гіперваріабельні петлі ділянки МН стосуються в даному описі НІ, Н2 і НЗ ї можуть бути визначені як такі, що містять залишки 25-33 (НІ, що складається з 7, 8 або 9 залишків), 52-56 (Н2, що складається з З або 4 залишків) і 91-105 (НЗ, що має різну довжину) в ділянці МН (Могеа 60 еїгаї., Мешоодв, 20: 267-279 (2000)).
Якщо не вказано інше, то терміни 11,12 і І З, відповідно, стосуються першої, другої і третьої гіперваріабельних петель ділянки МІ і охоплюють гіперваріабельні петлі, отримані з ізотипів
Мкаппа і Млямбда. Терміни НІ, Н2 ї НЗ відповідно стосуються першої, другої і третьої гіперваріабельних петель ділянки МН і охоплюють гіперваріабельні петлі, отримані з будь-якого з відомих ізотипів важкого ланцюга, включаючи у, |,а,б, є.
Гіперваріабельні петлі!1, 12, І 3, НІ, Н?2 ї НЗ, кожна, може становити частину "ділянки, що визначає комплементарність" або "СОК", як визначено нижче. Терміни "гіперваріабельна петля" і "ділянка, що визначає комплементарність" не є повними синонімами, оскільки гіперваріабельні петлі (НМ) визначаються на основі структури, тоді як ділянки, що визначають комплементарність (СОК), визначаються на основі варіабельності послідовності (Кабаї еї аіІ., Зедиепсез ої Ргоїеіп5 ої Іттипо|іодісаї! Іпіегеві, Бій Ед. Рибіїс Неайй 5егмісе, Маїйопаї Іпзійшез ої Неайн, Веїйезаа, МО., 1983) і межі НМ і СОК можуть відрізнятися в деяких ділянках МН і МІ.
СОК в Мі ї МН звичайно можна визначити як такі, що включають наступні амінокислоти: залишки 24-34 (І СОВА), 50-56 (І СО) і 89-97 (І СОКЗ) у варіабельній ділянці легкого ланцюга і залишки 31-35 або 31-3565 (НСОРВ1), 50-65 (НСОК2) і 95-102 (НСОКЗ) у варіабельній ділянці важкого ланцюга; (Кабаї еї аїІ., Зедоепсе5 ої Ргоїеіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіеге5і, 5Іп Еа. Рибіїс
Неакй Зегмісе, Маїопа! Іпбійшев5 ої Неанйп, ВеїШезаа, МО. (1991)). Таким чином, НМ можуть знаходитися всередині відповідних СОК, і визначення в даному описі "гіперваріабельні петлі" ділянок МН і МІ. потрібно інтерпретувати як таке, що також включає відповідні СОК, і навпаки, якщо не вказано інше.
Більш висококонсервативні ділянки варіабельних ділянок називаються каркасною ділянкою (ЕК), як визначено нижче. Кожна варіабельна ділянка нативного важкого і легкого ланцюгів містить чотири ЕК (ЕК, ЕК2, ЕКЗ ії ЕКА відповідно), які в основному приймають рД-складчасту конфігурацію, з'єднану трьома гіперваріабельними петлями. Гіперваріабельні петлі в кожному ланцюгу утримуються разом в безпосередній близькості з допомогою ЕК і, разом з гіперваріабельними петлями з іншого ланцюга, беруть участь в утворенні антигензв'язувального сайту антитіл. Структурний аналіз антитіл виявив взаємозв'язок між послідовністю і формою сайту зв'язування, утвореного ділянками, які визначають комплементарність (Споїпіа еї аї.,..
МОЇ. Віоі!., 227: 799-817 (1992)); Тгатопіапо еї аї., У. Мої. Віої., 215: 175-182 (1990)). Не зважаючи
Зо на їх високу варіабельність послідовності, п'ять із шести петель приймають тільки невеликий репертуар конформацій головного ланцюга, що називаються "канонічними структурами". Ці конформації, по-перше, визначаються довжиною петель і, по-друге, наявністю ключових залишків у певних положеннях петель і в каркасних ділянках, які визначають конформацію за допомогою їх упаковування, водневих зв'язків або здатності приймати незвичайні конформації головного ланцюга. "СОМ". Як використовується в даному описі, термін "СОК" або "ділянка, що визначає комплементарність" означає несуміжні антигензв'язувальні сайти, що знаходяться у варіабельній ділянці поліпептидів як важкого, так і легкого ланцюга. Ці вказані ділянки були описані Кабаї еї аї., 9У. ВіоЇї. Спет., 252, 6609-6616 (1977) і Кабаї еї аЇ., Зедиепсез ої ргоївіп ої іттипо|!одісаї іп'егевзі. (1991), і Споїпіа еї аї., У. Мої. Віої., 196:901-917 (1987) і МасСа|Пшт еї аї., 9.
Мої. Віої., 262:732-745 (1996), де визначення включають ті, що перекриваються, або субпопуляції амінокислотних залишків при порівнянні один з одним. Амінокислотні залишки, які охоплюють СОК, визначені в кожному з наведених вище посилань, наводяться для порівняння.
Переважно, термін "СОМ" являє собою СОК, що визначається Караї на основі порівнянь послідовностей.
Таблиця 1 нн дн "Нумерація залишків згідно з номенклатурою Каврбаї єї аІ., наведеною в публікації вище гНумерація залишків згідно з номенклатурою Споїпіа єї аІ., наведеною в публікації вище
ЗНумерація залишків згідно з номенклатурою МассСаїшт еї аіІ., наведеною в публікації вище
«Каркасна ділянка". Як використовується в даному описі, термін "каркасна ділянка" або "ЕК- ділянка" включає амінокислотні залишки, які є частиною варіабельної ділянки, але не є частиною СОК (наприклад, з використанням визначення СОК по Кара). Отже, каркасна ділянка варіабельної ділянки має довжину приблизно від 100 до 120 амінокислот, але включає тільки ті амінокислоти, які знаходяться за межами СОК. У конкретному прикладі варіабельної ділянки важкого ланцюга і СОК, як визначено Кабаї єї аї., каркасна ділянка 1 відповідає домену варіабельної ділянки, що охоплює амінокислоти 1-30; каркасна ділянка 2 відповідає домену варіабельної ділянки, що охоплює амінокислоти 36-49; каркасна ділянка З відповідає домену варіабельної ділянки, що охоплює амінокислоти 66-94, і каркасна ділянка 4 відповідає домену варіабельної ділянки від амінокислоти 103 до кінця варіабельної ділянки. Каркасні ділянки легкого ланцюга аналогічно відділені одна від одної СОК варіабельної ділянки легкого ланцюга.
Аналогічно, використовуючи визначення СОМ по СПпоїйіа еї а. або МсСайЙйит еї аї., межі каркасної ділянки відділені кінцями відповідних СОК, як описано вище. У переважних варіантах здійснення СОК є такими, як визначено Карбаї.
У антитілах, що зустрічаються в природі, шість СОК, присутніх на кожному мономерному антитілі, представляють короткі несуміжні послідовності амінокислот, які специфічно розташовані з утворенням антигензв'язувального сайту, коли антитіло приймає свою тривимірну конфігурацію у водному середовищі. Інші варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів виявляють меншу міжмолекулярну варіабельність амінокислотних послідовностей («і називаються каркасними ділянками. Каркасні ділянки в основному мають ВД-складчасту конформацію, і СОК утворюють петлі, які з'єднують, і в деяких випадках є частиною Д- складчастої структури. Таким чином, ці каркасні ділянки функціонують з утворенням каркасу, який забезпечує правильну орієнтацію шести СОК за допомогою міжланцюжкових нековалентних взаємодій. Антигензв'язувальний сайт, утворений розташованими СОК, визначає поверхню, комплементарну до епітопу на імунореактивному антигені. Ця комплементарна поверхня сприяє нековалентному зв'язуванню антитіла з епітопом імунореактивного антигену. Фахівець в даній галузі може легко ідентифікувати положення СОК. "Константна ділянка". Як використовується в даному описі, термін "константна ділянка"
Зо стосується частини молекули антитіла поза варіабельними доменами або варіабельними ділянками. Легкі ланцюги імуноглобуліну мають єдиний домен "константна ділянка", що звичайно називається "доменом Сі або СІ 1". Даний домен знаходиться від С-кінця до домену
МІ. Важкі ланцюги імуноглобуліну відрізняються по константній ділянці залежно від класу імуноглобуліну (у, НИ, а, б, є). Важкі ланцюги у, а і б мають константну ділянку, що складається з трьох доменів імуноглобуліну (що називаються СНІ, СН? ї СНЗ) з гнучкою шарнірною ділянкою, що розділяє домени СНІ і СН2. Важкі ланцюги | і є мають константну ділянку, що складається з чотирьох доменів (СНІ1І-СН4І). Константні домени важкого ланцюга розташовуються на С-кінці відносно домену МН.
Нумерація амінокислот у важких і легких ланцюгах імуноглобуліну проходить від М-кінця на розгалужених кінцях У-конфігурації до С-кінця в нижній частині кожного ланцюга. Різні системи нумерації використовуються для визначення константних ділянок важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. Відповідно до системи нумерації ЄС константні ділянки важкого ланцюга молекули Ідс ідентифікуються таким чином: СНІ - амінокислотні залишки 118-215; СН2 - амінокислотні залишки 231-340; СНЗ - амінокислотні залишки 341-446. Відповідно до системи нумерації по Кабваї константні ділянки важкого ланцюга молекули дО ідентифікуються таким чином: СНІ - амінокислотні залишки 114-223; СНО? - амінокислотні залишки 244-360: СНЗ - амінокислотні залишки 361-477. "Шарнірна ділянка" включає частину молекули важкого ланцюга, яка з'єднує домен СНІ з доменом СН2. Ця шарнірна ділянка містить приблизно 25 залишків і є гнучкою, що дозволяє двом М-кінцевим антигензв'язувальним ділянкам рухатися незалежно. Шарнірні ділянки можна поділити на три окремі домени: верхній, середній і нижній шарнірні домени (Коих К.Н. еї аї. 9. Іттипої., 161: 4083-90 1998). Антитіла за винаходом, що містять "повністю людську" шарнірну ділянку, можуть містити одну з послідовностей шарнірної ділянки, показаних в таблиці 2 нижче.
Таблиця 2
Послідовності людських шарнірних ділянок . . . . Нижня шарнірна
ЗЕО ІЮ МО:37 ЗЕО І МО:38 ЗЕО І МО:39
ЗЕО І МО:40 ЗЕО І МОСАТ ЗЕО І МО:42
ЗЕО І МО:43 ЗЕО ІЮ МО:44 ЗЕО І МО:45
ЗЕО ІЮ МО:46 ЗЕО ІЮ МО:47 ЗЕО І МО:48 «Фрагмент". Термін "фрагмент", що використовується в контексті антитіл за винаходом, стосується частини або ділянки антитіла або ланцюга антитіла, що містять меншу кількість амінокислотних залишків, ніж ціле або повне антитіло або ланцюг антитіла. Термін "антигензв'язувальний фрагмент" стосується поліпептидного фрагмента імуноглобуліну або антитіла, що зв'язується з антигеном або конкурує з інтактним антитілом (тобто з інтактним антитілом, з якого він був отриманий) за зв'язування антигену (тобто специфічне зв'язування з комплексом ЗАКР-ТОЕ-ДВ). Як використовується в даному описі, термін "фрагмент" молекули антитіла включає антигензв'язувальні фрагменти антитіл, наприклад, варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла (МІ), варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла (МН), одноланцюжкове антитіло (5сЕм), Е(аб")»-фрагмент, Рар-фрагмент, Ба-фрагмент, Ем-фрагмент, антитіло з одним плечем (одновалентне), діатіла, триатіла, тетратіла або будь-яку антигензв'язувальну молекулу, утворену комбінацією, зборкою або кон'югацією таких антигензв'язувальних фрагментів. Як використовується в даному описі, термін "антигензв'язувальний фрагмент", крім того, призначений для охоплення фрагментів антитіл, вибраних з групи, що складається з монотіл, доменних антитіл і нанотіл. Фрагменти можуть бути отримані, наприклад, за допомогою хімічної або ферментативної обробки інтактного або повного антитіла, або ланцюга антитіла, або рекомбінантними способами. "Консервативна амінокислотна заміна". "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, в якій амінокислотний залишок замінюється амінокислотним залишком, що має схожий бічний ланцюг. У даній галузі класифіковані сімейства амінокислотних залишків, що мають схожі бічні ланцюги, включаючи основні бічні ланцюги (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотні бічні ланцюги (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин, аспарагін, глютамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярні бічні ланцюги (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, залишок замінимої амінокислоти в поліпептиді імуноглобуліну може бути замінений іншим
Зо амінокислотним залишком з того ж сімейства бічних ланцюгів. У ще одному варіанті здійснення ланцюжок амінокислот може бути замінений структурно подібним ланцюжком, який відрізняється порядком і/або складом членів сімейства бічних ланцюгів. "Химерний". "Химерний" білок містить першу амінокислотну послідовність, зв'язану з другою амінокислотною послідовністю, з якою вона не зв'язана природним чином в природі.
Амінокислотні послідовності звичайно можуть існувати в окремих білках, які об'єднуються в злитий поліпептид, або вони звичайно можуть існувати в одному і тому ж білку, будучи розташованими в новому порядку в злитому поліпептиді. Химерний білок може бути створений, наприклад, хімічним синтезом або створенням і трансляцією полінуклеотиду, в якому пептидні ділянки кодуються в бажаному взаємозв'язку. Типові химерні антитіла за винаходом включають злиті білки, що містять ділянки МН і МІ, отримані від верблюда, або їх гуманізовані варіанти, злиті з константними доменами людського антитіла, наприклад, людського Ідс1, Ідс2, доЗ або
ІС. "Валентність". Як використовується в даному описі, термін "валентність" стосується кількості потенційних сайтів зв'язування мішені в поліпептиді. Кожний сайт зв'язування мішені специфічно зв'язується з однією молекулою-мішенню або специфічним сайтом на молекулі- мішені. Коли поліпептид містить більше одного сайту зв'язування мішені, то кожний сайт зв'язування мішені може специфічно зв'язуватися з одними і тими ж або різними молекулами (наприклад, може зв'язуватися з різними лігандами або різними антигенами або різними епітопами на одному і тому ж антигені). "Специфічність". Термін "специфічність" стосується здатності зв'язувати (наприклад, імунореагувати) з конкретною мішенню, наприклад, комплексом СЗАКР-ТОЕ-В1. Поліпептид може бути моноспецифічним і містити один або більше сайтів зв'язування, які специфічно зв'язуються з мішенню, або поліпептид може бути мультиспецифічним і містити два або більше сайтів зв'язування, які специфічно зв'язуються з однією і тією ж або різними мішенями. "Синтетичний". Як використовується в даному описі, термін "синтетичний" відносно поліпептидів включає поліпептиди, які містять амінокислотну послідовність, яка не зустрічається в природі. Наприклад, поліпептиди, що не зустрічаються в природі, представляють модифіковані форми поліпептидів, які зустрічаються в природі (наприклад, що містять мутацію, таку як додаток, заміну або делецію), або які містять першу амінокислотну послідовність (яка може зустрічатися або не зустрічатися в природі), яка зв'язана в лінійній послідовності амінокислот з другою амінокислотною послідовністю (яка може зустрічатися або не зустрічатися в природі), з якою вона не зв'язана природним чином в природі. "Сконструйований". Як використовується в даному описі, термін "сконструйований" включає маніпулювання молекулами нуклеїнових кислот або поліпептидів з використанням синтетичних методів (наприклад, рекомбінантних методів, пептидного синтезу іп міго, ферментативного або хімічного поєднання пептидів або деяких комбінацій цих методів). Переважно антитіла за винаходом є сконструйованими, включаючи, наприклад, гуманізовані і/або химерні антитіла, і антитіла, які були сконструйовані для поліпшення однієї або більше властивості, такі як зв'язування антигену, стабільність/період напіврозпад або ефекторна функція. "Гуманізуючі заміни". Як використовується в даному описі, термін "гуманізуючі заміни" стосується амінокислотних замін, відповідно до яких амінокислотний залишок, що знаходиться в певному положенні в ділянці МН або МІ антитіла (наприклад, антитіла до САКР-ТОаР-рД, отриманого від верблюда), замінюється амінокислотним залишком, який знаходиться в еквівалентному положенні в референсній ділянці МН або МІ людини. Референсна ділянка МН або МІ. людини може являти собою ділянку МН або МІ, що кодується генами зародковою лінією
Зо людини. Гуманізуючі заміни можуть бути зроблені в каркасних ділянках і/або СОЕК антитіл, визначених в даному описі. "Гуманізовані варіанти". Як використовується в даному описі, термін "гуманізований варіант" стосується варіанта антитіла, яке містить одну або більше "гуманізуючих замін" порівняно з референсним антитілом, де частина референсного антитіла (наприклад, ділянка МН і/або ділянка МІ або її частини, що містять щонайменше один СОК) містить амінокислоту, що походить від виду, відмінного від людини, і "гуманізуючі заміни" мають місце в амінокислотній послідовності, отриманій від виду, відмінного від людини. "Варіанти зародкового типу". Як використовується в даному описі, термін "варіант зародкового типу" стосується "гуманізованих варіантів", в яких "гуманізуючі заміни" призводять до заміни одного або більше амінокислотних залишків, присутніх в певному положенні(ях) в ділянці МН або Уї антитіла (наприклад, антитіла до ЗАКР-ТОЕ-В1, отриманого від верблюда), амінокислотним залишком, який знаходиться в еквівалентному положенні в референсній ділянці
МН або Мі людини, кодованій генами зародковою лінією людини. Типово, що для будь-якого даного "варіанта зародкового типу" замінні амінокислотні залишки, заміщені зародковим варіантом, беруться виключно або переважно з однієї ділянки МН або Мі, кодованої генами зародковою лінією людини. Терміни "гуманізований варіант" і "варіант зародкового типу" часто використовуються в даному описі взаємозамінно. Введення однієї або більше "гуманізуючих замін" в ділянці МН або МІ, отриманій від верблюда (наприклад, від лами), призводить до отримання "гуманізованого варіанта" ділянки МН або МІ, отриманої від верблюда (лами). Якщо заміщені амінокислотні залишки отримані переважно або виключно з однієї послідовності ділянки МН або Мі, кодованої генами зародковою лінією людини, то результатом може бути "варіант зародкової лінії людини" ділянки УН або МІ, отриманої від верблюда (лами). "Афінні варіанти". Як використовується в даному описі, термін "афінний варіант" стосується варіанта антитіла, який має одну або більше зміну в амінокислотній послідовності порівняно з референсним антитілом, де афінний варіант виявляє змінену афінність до антигену-мішені порівняно з референсним антитілом. Наприклад, афінні варіанти будуть виявляти змінену афінність до САКР-ТИЕ-В порівняно з референсним антитілом до САКР-ТИЕ-В. Переважно афінний варіант буде виявляти підвищену афінність до антигену-мішені порівняно з референсним антитілом. Афінні варіанти звичайно мають одну або більше зміну в бо амінокислотній послідовності в СОК порівняно з референсним антитілом. Такі заміни можуть призвести до заміни вихідної амінокислоти, присутньої в даному положенні в СОК, іншим амінокислотним залишком, який може бути амінокислотним залишком, що зустрічається в природі, або амінокислотним залишком, що не зустрічається в природі. Амінокислотні заміни можуть бути консервативними або неконсервативними.
В. Анти-АВР-ТОа-Вр-антитіла
Даний винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів, які специфічно зв'язуються з комплексом САКР і ТОаБЕ-В, зокрема з комплексом людського САРР і людського тавг-р. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можуть бути визначені відносно структурних і функціональних характеристик, як описано в даному описі.
Важливо, що антитіла до САКР-ТОЕ-Д за винаходом вдосконалені порівняно з антитілами до САКР-ТИБ-В, описаними раніше, в тому відношенні, що вони демонструють підвищену стабільність. Зокрема, стабільність анти-(АВР-ТОБ-В1-антитіл, описаних в даному описі, підвищена порівняно з антитілами, що мають послідовності СОК важкого ланцюга і легкого ланцюга референсних антитіл до ЗАКР-Таг-В, І На-10 і І НО-10.6, описаних в УМО 2015/015003 і МО2016/125017. Таке підвищення стабільності досягається без істотного зниження афінності зв'язування антитіл з комплексом ЗАКР-ТИаЕ-В порівняно з референсними антитілами І Не10 і
І нат10.6.
Антитіла за даним винаходом відрізняються від референсних антитіл до САКР-Тар-В І На- 10 ї ГНО-10.6, описаних раніше, особливо відносно послідовностей СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга. Більш конкретно, антитіла до ЗАКР-ТОБ-В1, І На-10 ї І НОо-10.6, містять послідовність
СОка2 важкого ланцюга: ВІОРЕОСИ ТКМАОКРОС (ЗЕО І МО:5) і послідовність СОКЗ важкого ланцюга: МЕМЕТУММОарІ ММЕМЕМ (5ЕО ІО МО:6), в той час як антитіла за даним винаходом містять послідовність СОВБ2 важкого ланцюга: ВІОРЕВАСТКУАОКРОС (5ЕБО ІО МО-12) і послідовність СОКЗ важкого ланцюга: МЕММЕТУУМОарІ ММЕМЕМ (5ЕО ІО МО:13). Як описано і наведено в даному описі як приклад, було встановлено, що амінокислотні заміни 255А і МО5У в послідовностях СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга, відповідно, підвищують стабільність антитіл за допомогою зниження дезамідування, ізомеризації і окислення, в той же час, досягаючи афінності зв'язування з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В1, приблизно еквівалентної для референсних антитіл.
Зо У першому аспекті даний винахід стосується антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з комплексом САКР-Та-ВД1 і містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), де:
СОВЗ МН містить або складається з амінокислотної послідовності МХЕМЕТУУММООІ МУЕМЕХ (ЗЕО ІО МО:13),
СОВа2 МН містить або складається з амінокислотної послідовності ВІОРЕСАСОТКУАОКЕеОС (ЗЕО ІО МО 12), і
СОВІ МН містить або складається з амінокислотної послідовності ЗМІЮ (ЗЕО ІЮ МО 4).
У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти додатково містять варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ Мі містить або складається з амінокислотної послідовності ООМАЗМРМТ (5ЕО ІЮ
МО:11),
СОВа МІ містить або складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОВІ Мі. містить або складається з амінокислотної послідовності ОАБОБІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ
МО:9).
У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з комплексом СЗАКР-ТИБЕ-В1, де антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
БО СОВЗ МН містить або складається з амінокислотної послідовності ХЕМ/'ЕТУММОВІ МУЖЕМЕХ (ЗЕО ІО МО:13),
СОВа2 МН містить або складається з амінокислотної послідовності ВІОРЕСАСОТКУАОКЕеОС (ЗЕО ІО МО 12), і
СОН МН містить або складається з амінокислотної послідовності ЗМІЮ (ЗЕО ІО МО 4),
СОВЗ Мі містить або складається з амінокислотної послідовності ООМАЗМРМТ (5ЕО ІЮ
МО:11),
СОВа МІ містить або складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОН МІ. містить або складається з амінокислотної послідовності ФАБОБІЗЗМІ А (ЗЕО І (510) МО:9).
У деяких варіантах здійснення забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з комплексом СЗАКР-ТИБЕ-В1, де антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МН складається з амінокислотної послідовності ХЕММЕТУУМОРІ МУЕМЕМ (ЗЕО І
МО:13),
СОВ2 МН складається з амінокислотної послідовності КІОРЕСАСТКУАОКРОС (5ЕО ІЮ
МО:12), і
СОВІ МН складається з амінокислотної послідовності ЗУМІЮ (ЗЕО ІЮО МО 4),
СОВЗ МІ. складається з амінокислотної послідовності ФЗОМАБЗМРМТ (5ЕО ІЮ МО:11),
СОВа2 МІ. складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОВІ МІ. складається з амінокислотної послідовності ОАБОБІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9).
У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти є рекомбінантними.
У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти є моноклональними.
Термін "антитіло" в даному описі використовується в найширшому значенні і охоплює, але не обмежується цим, моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла і поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), за умови, що вони виявляють відповідну імунологічну специфічність для комплексу ЗСЗАКР-ТаЕ-
В1. Як використовується в даному описі, термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути присутніми в невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, будучи спрямованими проти одного антигенного сайту. Крім того, на відміну від препаратів звичайних (поліклональних) антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів) на антигені, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти або епітопу на антигені.
Даний винахід також охоплює "антигензв'язувальні фрагменти" антитіл, і такі фрагменти визначені в іншому місці в даному документі. Фрагменти антитіл звичайно включають частину повнорозмірного антитіла, звичайно його антигензв'язувальний або варіабельний домен.
Зо Приклади фрагментів антитіл включають Раб, Рар', Е(аб")», біспецифічні Раб-фрагменти і Ем- фрагменти, лінійні антитіла, молекули одноланцюжкових антитіл, варіабельний фрагмент з одним ланцюгом (5сЕм) і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл (див. Ноїїдег апа Ниадзоп, Маїшге ВіоїесНпої., 23: 1126-36 (2005)).
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можуть виявляти високу гомологію з людиною. Рівень гомології з людською послідовністю можна оцінити по довжині варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН) і/або по довжині варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ). У контексті даного винаходу антитіло, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), можна розглядати як таке, що має високу гомологію з людиною, якщо ділянки МН і домени Мі, взяті разом, виявляють щонайменше 90 95, щонайменше 92 95, щонайменше 94 95 або щонайменше 96 95 ідентичність амінокислотних послідовностей з найбільш придатними послідовностями МН і МІ зародкової лінії людини. У одному варіанті здійснення ділянка МН антитіла з високої гомологією з люодиною може мати ідентичність амінокислотної послідовності або гомологію послідовності щонайменше на 90 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 94 95 або щонайменше на 96 95 з однією або більше людськими ділянками МН по каркасних ділянках ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. У одному варіанті здійснення ділянка МН антитіла з високою гомологією з людиною може містити одну або більше (наприклад, від 1 до 10) амінокислотних послідовностей, які не співпадають по каркасних ділянках ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4, порівняно з найбільш близькою людською послідовністю МН.
У ще одному варіанті здійснення ділянка Мі. антитіла з високою гомологією з лординою може мати ідентичність амінокислотної послідовності або гомологію послідовності щонайменше на 90 до, щонайменше на 92 95, щонайменше на 94 95 або щонайменше на 96 95 з однією або більше людськими ділянками МІ по каркасних ділянках ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. У одному варіанті здійснення ділянка Мі. антитіла з високої гомологією з людиною може містити одну або більше (наприклад, від 1 до 10) амінокислотних послідовностей, які не співпадають по каркасних ділянках ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4, порівняно з найбільш близькою людською послідовністю Мі.
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом, які мають високу гомологію з людиною, можуть включати антитіла, що містять ділянки МН і МІ нативних антитіл, відмінних від людських, які мають достатньо високу 95 ідентичність послідовності з послідовностями зародкової лінії людини. У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні бо фрагменти за винаходом представляють гуманізовані варіанти або варіанти зародкового типу,
антитіл, відмінних від людських, наприклад антитіла, що містять ділянки МН і МІ звичайних верблюдячих антитіл, сконструйованих таким чином, щоб вони представляли гуманізовані варіанти або варіанти зародкового типу вихідних антитіл.
Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що містить або складається з амінокислотної послідовності 560 ІЮ МО:14, і, необов'язково, варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:15.
У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО:14. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність «ФЕО ІО МО:15.
У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:14. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:15.
У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовності
ЗБО ІЮ МО:14, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:15.
У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ МО:14, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:15.
У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить послідовність. МН щонайменше з 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в
ЗЕО ІО МО:14, і/або варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить МІ щонайменше з 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:15.
Для варіантів здійснення, в яких домени антитіл або антигензв'язувальних фрагментів визначаються конкретною процентною ідентичністю послідовності з референсною послідовністю, ділянки МН і/або МІ можуть зберігати послідовності СОК, ідентичні тим, які присутні в референсній послідовності, так що варіабельність присутня тільки в каркасних ділянках. У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельні ділянки важкого ланцюга і/або варіабельні ділянки легкого ланцюга, визначені як такі, що мають конкретний процент ідентичності з «ЕЕ ІЮ МО:14 ії 15 відповідно, будуть мати наступні послідовності СО:
СОовЗ МН, що містить або складається 3 амінокислотної послідовності
МЕМЖЕТМУМУМОаИОІ МУЄЕМЕМ (5ЕО ІО МО 13),
СоВ2 МН, що містить або складається 3 амінокислотної послідовності
КІОРЕОСАСТКУАдОКРОС (5ЕО ІО МО 12), і
СОН МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗМІЮ (ЗЕО ІЮ МО 4),
СОВЗ МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ООМАБМРМТ (5ЕО ІЮ
МО:11),
СОВ2 МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності САБКІ КТ (5ЕО ІЮ
МО:109), і
СОВІ МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ОАЗОБІЗЗМУІ А (5ЕО
ІО МО:9).
У необмежувальних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом можуть містити домени СНІ і/або домени СІ (відповідно з важкого ланцюга і легкого ланцюга), амінокислотна послідовність яких є повністю або по суті людською. У тих випадках, коли антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за винаходом представляє антитіло, призначене для терапевтичного застосування у людей, то звичайно для всієї константної ділянки антитіла або щонайменше його частини, є повна або по суті людська амінокислотна послідовність. Отже, одне або більше, або будь-яка комбінація домену СНІ, шарнірної ділянки, домену СН2, домену бо СНЗ і домену СІ (і домену СНА, якщо він присутній) може бути повністю або по суті людськими відносно їх амінокислотної послідовності.
Переважно, домен СНІ, шарнірна ділянка, домен СН2, домен СНЗ і домен СІ (і домен СНА, якщо він присутній) всі можуть мати повністю або по суті людську амінокислотну послідовність.
У контексті константної ділянки гуманізованого або химерного антитіла або фрагмента антитіла термін "по суті людська" стосується ідентичності амінокислотної послідовності щонайменше на 90 95, або щонайменше на 92 95, або щонайменше на 95 95, або щонайменше 97 95 або щонайменше 99 95 з людською константною ділянкою. Термін "людська амінокислотна послідовність" в даному контексті стосується амінокислотної послідовності, яка кодується геном імуноглобуліну людини, який включає зародкові, реаранжовані і соматичні мутовані гени.
Винахід також передбачає поліпептиди, що містять константні ділянки "людської" послідовності, які були змінені додатками, делеціями або замінами однієї або більше амінокислоти відносно людської послідовності, за винятком тих варіантів здійснення, де прямо потрібно, щоб була присутня "повністю людська" шарнірна ділянка.
Наявність "повністю людської" шарнірної ділянки в анти-ЯАВР-ТОИЕ-В1-антитілах за винаходом може бути переважною як для мінімізації імуногенності, так і для оптимізації стабільності антитіла.
Як обговорюється в даному описі в іншому місці, передбачається, що одна або більше амінокислотних замін, вставок або делецій можуть бути зроблені в константній ділянці важкого і або легкого ланцюга, зокрема, в Ес-ділянці. Амінокислотні заміни можуть призвести до заміни заміщеної амінокислоти іншою природною амінокислотою або неприродною, або модифікованою амінокислотою. Також допускаються інші структурні модифікації, наприклад, такі як зміни в патерне глікозилування (наприклад, додаванням або делецією сайтів М- або О- зв'язаного глікозилування).
Анти-САВР-ТОаБ-В1-антитіла можна модифікувати в Ес-ділянці для підвищення афінності зв'язування з неонатальним рецептором ЕсКп. Підвищену афінність зв'язування можна виміряти при кислому значенні рН (наприклад, приблизно від 5,5 до приблизно 6,0). Підвищену афінність зв'язування також можна виміряти при нейтральному рН (наприклад, приблизно від 6,9 до приблизно 7,4). Під "підвищеною афінністю зв'язування" мається на увазі підвищена афінність зв'язування з ЕсКп о відносно немодифікованої Ес-ділянки. Як правило, немодифікована Ес-ділянка буде мати амінокислотну послідовність дикого типу людського Ідс1, 902, ОЗ або ІдсС4. У таких варіантах здійснення підвищена афінність зв'язування з БсКп молекули антитіла, що має модифіковану Ес-ділянку, буде вимірюватися відносно афінності зв'язування Ідс1, Іде2, дО або Ідс4 дикого типу для ЕсКп.
У деяких варіантах здійснення один або більше амінокислотних залишків в Ес-ділянці можна замінити іншою амінокислотою, для підвищення зв'язування з ЕсКп. Повідомлялося про деякі заміни в Ес, які збільшують зв'язування з БсКп і тим самим поліпшують фармакокінетику антитіл. Такі заміни описані, наприклад, в публікаціях 7аіІему5Ку еї аї. (2010) Маї. Віоїесппої., 28 (2): 157-9; 7аієм5Ку єї аї. (2010) Маї. Віотесппої., 28(2):1157-9; Ніпюп еї аї. (2006) 9. Іттипої., 176:346-356; Мейпа еї аї. (2009) 9. Іттипої., 182:7663-7671; Ргевіа І.С. (2008) Си. Ор.
Іттипої., 20:460-470; і Массаго еї а!. (2005) Маї. Віотесппої., 23(10):1283-88, зміст яких в повному обсязі включений в даному описі за допомогою посилання.
У деяких варіантах здійснення анти-САВР-ТИаг-В1-антитіла містять модифіковану Ес-ділянку людського ІдсС, що містить або складається з амінокислотних замін Н4і4ЗЗ3К і М434Е, де нумерація Ес-ділянок відповідає системі нумерації ЄС. У додатковому варіанті здійснення антитіла до САКР-ТОЕ-ДІ1, описані в даному описі, містять модифіковану Ес-ділянку людського
ІЧ, що містить або складається з амінокислотних замін М252У, 5254Т, Т256Е, Н4АЗЗК і М434Е, де нумерація Ес-ділянки відповідає системі нумерації ЕО.
У деяких варіантах здійснення анти-САВР-ТИаг-В1-антитіла містять модифіковану Ес-ділянку людського дО, що має до 2, до 3, до 4, до 5, до 6, до 7, до 8, до 9, до 10, до 12, до 15, до 20 замін відносно відповідної послідовності Ід дикого типу.
Залежно від передбачуваного застосування антитіла може бути бажаним модифікувати антитіло за винаходом відносно його зв'язувальних властивостей з Ес-рецепторами, наприклад, для модуляції ефекторної функції. Наприклад, залишок(и) цистеїну може(уть) бути введені в Ес- ділянку, що забезпечує утворення міжланцюжкових дисульфідних зв'язків у цій ділянці.
Отримане таким чином гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність до інтерналізації іМабо підвищену комплемент-опосередковану клітинну цитотоксичність і антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС). Див. Сагоп еї аї., У. Ехр. Мей., 176: 1191-1195 (1992) і 5поре5
В.). Іттипої., 148: 2918-2922 (1992). Винахід також передбачає імунокон'югати, що містять антитіло, як описано в даному описі, кон'юЮговане з цитотоксичним агентом, таким як бо хіміотерапевтичний агент, токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактеріального,
грибкового, рослинного або тваринного походження або його фрагменти) або радіоактивний ізотоп (тобто радіокон'югат). Ес-ділянки також можна сконструювати для збільшення періоду напіврозпаду, як описано в публікації Спап апа Сагпег, Маїшге Кемієм/є: Іттипоіоду, Мої.10, рор301-316, 2010, включеній в даний опис за допомогою посилання.
У ще одному варіанті здійснення Ес-ділянка модифікується для підвищення здатності антитіла опосередковувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮСС) і/або для збільшення афінності антитіла до рецептора Есу за допомогою модифікації однієї або декількох амінокислот.
У конкретних варіантах здійснення Ес-ділянка може бути сконструйована таким чином, що відсутня ефекторна функція. Антитіло до САКР-ТОЕ-В1, що не має ефекторну функцію Ес, може бути особливо придатним як агент, що блокує рецептори. У певних варіантах здійснення антитіла за винаходом можуть мати Ес-ділянку, отриману з ізотипов Їдс, що зустрічаються в природі, що мають знижену ефекторну функцію, наприклад, Ідс4. Ес-ділянки, отримані з Ідея, можна додатково модифікувати для підвищення терапевтичної застосовності, наприклад, введенням модифікацій, які мінімізують обмін плечами між молекулами Ід іп мімо. Ес-ділянки, отримані з ІдД4, можна модифікувати з включенням заміни 5228Р.
У ще одному варіанті модифікуються глікозиловані антитіла. Наприклад, може бути отримане аглікозилованне антитіло (тобто антитіло не має глікозилування). Глікозиловані можна змінити, наприклад, для підвищення афінності антитіла до антигену-мішені. Такі модифікації вуглеводів можна виконати, наприклад, зміною одного або більше сайтів глікозилування в послідовності антитіла. Наприклад, можна зробити одну або більше амінокислотних замін, які призводять до елімінації одного або більше сайтів глікозилування каркасної ділянки варіабельної ділянки, щоб тим самим елімінувати глікозилування в цьому сайті. Таке аглікозилування може підвищити афінність антитіла до антигену.
Також передбачаються варіанти анти-ЯАНВР-ТИБ-В1-антитіл, що мають змінений тип глікозилування, такі як гіпофукозиловане антитіло, що містить зменшені кількості фукозильних залишків, або повністю або частково дефукозиловане антитіло (як описано Маїзите еї аї., Огид
Резідп ЮОемеІортепі і Тпегару, Мої.3, рр. 7-16, 2009) або антитіло, що має підвищені бісектні структури СісМас. Було показано, що такі змінені патерни глікозилування збільшують АЮСС активність антитіл, звичайно призводячи до 10-кратного посилення АОСС порівняно з еквівалентним антитілом, що містить "нативну" Ес-ділянку людини. Такі модифікації вуглеводів можна виконати, наприклад, експресією антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим ферментативним механізмом глікозилування (як описано МХатапе-ОНпикі апа Заюй, тАбрв 1: 3, 230-236, 2009).
Прикладами нефукозилованих антитіл з підвищеною АЮСС функцією є антитіла, які отримані з використанням технології Роїеїїдепі" від Віоума Іпс.
Антитіла, призначені для терапевтичного застосування у людей, звичайно належать до типу
ІЧ, ОМ, ІдА, дО або ІдЕ, часто типу Ідс, і в цьому випадку вони можуть належати до будь- якого з чотирьох підкласів ЇДС1, Ідсга і Ідс2Б, ІдДОЗ або Ідс4. Всередині кожного з цих підкласів допускається робити одну або більше амінокислотних замін, вставок або делецій в межах Ес- ділянки або робити інші структурні модифікації, наприклад, для посилення або зменшення Ес- залежних функцій.
У деяких варіантах здійснення антитіла, які специфічно зв'язуються з ЗАКР-ТОаЕ-В1, містять щонайменше один імуноглобуліновий повнорозмірний важкий ланцюг і/або щонайменше один повнорозмірний легкий ланцюг лямбда або каппа, де важкий ланцюг містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮО МО:16, і легкий ланцюг містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:17.
У деяких варіантах здійснення антитіла, які специфічно зв'язуються з ЗАКР-ТОаЕ-В1, містять щонайменше один імуноглобуліновий повнорозмірний важкий ланцюг і/або щонайменше один повнорозмірний легкий ланцюг лямбда або каппа, де важкий ланцюг містить амінокислотну
БО послідовність ЗЕО ІЮ МО:16, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:17.
У деяких варіантах здійснення антитіла, які специфічно зв'язуються з ЗАКР-ТОаЕ-В1, містять щонайменше один імуноглобуліновий повнорозмірний важкий ланцюг і/або щонайменше один повнорозмірний легкий ланцюг лямбда або каппа, де важкий ланцюг складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІО МО:16, і легкий ланцюг складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО:17.
У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 90 95, щонайменше 95 956, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в бо ЗЕО ІО МО:16, і/або легкий ланцюг щонайменше з 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 905,
щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО:17.
У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 90 95, щонайменше 95 956, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в
ЗЕО ІЮ МО:16. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять легкий ланцюг щонайменше з 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО:17. У деяких варіантах здійснення забезпечуються моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг щонайменше з 90 9о, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮО МО:16 і легкий ланцюг щонайменше з 90 905, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше з 99 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ МО:17.
Для варіантів здійснення, в яких ланцюги антитіл визначаються конкретною процентною ідентичністю послідовності з референсною послідовністю, важкий ланцюг і/або легкий ланцюг можуть зберігати ідентичні послідовності СОМ з послідовностями, що знаходяться в референсній послідовності, так що варіабельність присутня тільки поза ділянками СО.
Зокрема, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що містять важкі ланцюги і/або легкі ланцюги, визначені як такі, що мають конкретну процентну ідентичність з «ЕО ІЮО МО:16 ії 17 відповідно, можуть мати наступні послідовності СОК:
СОовЗ МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності
МЕМЖЕТМУМУМОаИОІ МУЄЕМЕМ (5ЕО ІО МО 13),
СоВ2 МН, що містить або складається 3 амінокислотної послідовності
КІОРЕОСАСТКУАдОКРОС (5ЕО ІО МО 12), і
СОН МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗУМІЮ (5ЕО І МО 4),
СОВЗ МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ООМАБМРМТ (5ЕО ІЮ
МО:11),
СОВ2 МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності САБКІ КТ (5ЕО ІЮ
Зо МО:109), і
СОВІ МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ОАЗОБІЗЗМУІ А (5ЕО
ІО МО:9).
Зв'язування з ЗОЗАКР-ТОЕ-ДВ1
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з комплексом
САКР ії ТОБ-В1, зокрема, з комплексом людського САКР і людського ТОЕ-В1. Як пояснено в іншому місці в даному документі, САРЕР являє собою трансмембранний білок, експресований на поверхні регуляторних Т-клітин, і він функціонує як рецептор для латентної форми ТОаЕ-В81. На фіг. 1 наведене схематичне представлення комплексу, який утворюється між ЗАКР і латентним такг-р1 на клітинній поверхні регуляторних Т-клітин.
Комплекс САКР-ТОБЕ-В1, з яким зв'язуються антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом, являє собою нативний комплекс ЗАКР-ТОБ-В1, який утворюється на клітинній поверхні між ЗАКР і ТаБ-рВ1.
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом характеризуються тим, що вони зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТИа-Д1, але не зв'язуються з САКР за відсутності ТИБ-В1 або латентного ТОаЕ-Д. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з САРЄР тільки в присутності ТЯБЕ-В1. Зокрема, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з САКР тільки в присутності латентного ТОЯЕ-В1. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти можуть блокувати або інгібувати вивільнення активного ТОЕ-Д з Тгед-клітин.
Оскільки антиген-мішень для антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом являє собою комплекс, що включає два окремі білки, то епітоп, з яким зв'язуються антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, є конформаційним, на відміну від лінійного епітопу.
Конформаційний епітоп містить щонайменше один залишок з ЗАКР і щонайменше один залишок з латентного ТЯБЕ-В1. У переважних варіантах здійснення конформаційний епітоп містить щонайменше один залишок з САКР, щонайменше один залишок з латентно- асоційованого пептиду (І АР) латентного ТаЕ-В1 і щонайменше один залишок зі зрілого ТИЕ-В1.
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можуть зв'язуватися з епітопом комплексу, утвореного людським СЗАКР і людським ТОБЕ-В1, де епітоп містить щонайменше один залишок з САКР, вибраний з 137, 5138, 5139, Т162 і К163 (з посиланням на ЗЕО ІО МО:33) і щонайменше один залишок з ТЕЕ-В1. У переважних варіантах здійснення 60 епітоп містить щонайменше залишки ЗАКР У137, 5138, 5139, 1162 і К163 (з посиланням на
ЗЕО ІЮ МО:33).
Епітоп може містити щонайменше один залишок з поліпептиду ТОБЕ-В1 (5ЕО ІЮО МО:34), де необов'язково щонайменше один залишок представляє К338. Епітоп може містити щонайменше один залишок з латентно-асоційованого пептиду (АР) Таг-В1 і щонайменше один залишок зі зрілого ТаБ-В1. Епітоп може містити 58 з І АР і К338 зі зрілого ТОЕ-1 (з посиланням на 5ЕО ІЮ
МО:З4).
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з комплексом
САКР і ТаБ-В1. Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можуть додатково зв'язуватися з комплексом людського ЗАКР і людського ТОЕ-В2 і/або комплексом людського САКР і людського ТагЕ-В3.
У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом зв'язуються з комплексом СЗАКР і Таг-В1 з високою афінністю. Як використовується в даному описі, термін "афінність" або "афінність зв'язування" потрібно розуміти, виходячи зі звичайного значення, прийнятого в даній галузі техніки в контексті зв'язування антитіл, і відображає силу іабо стабільність зв'язування між антигеном і сайтом зв'язування на антитілі або його антигензв'язувальному фрагменті.
Афінність зв'язування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента з його відповідним антигеном можна визначити експериментально з використанням методик, відомих в даній галузі. Наприклад, методи 5РЕ, такі як Віасоге"М, вимірюють афінність на основі іммобілізації білка-мішені або антигену на біосенсорному чипі, коли антитіло або фрагмент антитіла пропускають над іммобілізованою мішенню в певних умовах потоку. Ці експерименти дають значення Коп і Кої, які можна перевести в значення Ко, де Ко є константою рівноваги дисоціації антигену з антитілом або його фрагментом. Що нижче значення Ко, то сильніше зв'язувальна взаємодія між антитілом і його антиген-мішенню.
Як відмічено вище, афінність антитіла можна визначити з допомогою Віасоге"М або 5РЕ, наприклад, з використанням протоколу, описаного в даному описі в іншому місці. Афінність антитіла або антигензв'язувального фрагмента до комплексу СЗАКР-ТОБЕ-В1, виміряну з допомогою Віасоге"М або 5РЕ, можна визначити з використанням рекомбінантно експресованого комплексу ЗАКР-ТОЕ-ВДІ1, як описано, наприклад, в прикладі 2.
Зо Антитіла до ЗАКР-ТОаР-ВДІ1 або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть мати швидкість дисоціації (Кої) комплексу ЗАВР-ТОЯБ-ВІ нижче 7х107 с", нижче 5х107 с", нижче 3х10и с, нижче 1,5х104 при тестуванні у вигляді Баб. Антитіла до ЗАКР-ТОБЕ-В1 або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можуть мати швидкість дисоціації (Кок) комплексу
САВР-ТОН-ВД1 в діапазоні від 1х10- с" до 5х10- с, переважно в діапазоні від 1х106 с" до 3х107 с", більш переважно в діапазоні від 1х10- с до 1,5х104 с.
Антитіла до ЗСАКР-ТОБЕ-В1 за винаходом можуть мати значення Ко нижче 5х109 М, нижче 2х109 М. У переважних варіантах здійснення антитіла до САКР-ТОБЕ-В1 за винаходом мають значення Ко нижче 1,7х109 М.
У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, описані в даному описі, які зв'язуються з комплексом СЗАКР і ТаБ-В1, можуть перехресно реагувати з одним або декількома видовими гомологами СЗАКР їі ТаквБ-В1, наприклад, гомологами САЕР і
ТОРЕ-В81 приматів, відмінних від людини.
У деяких варіантах здійснення антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом не реагують перехресно з комплексом СЗАКР ії ТОаБ-В1ї мишачого походження.
Альтернативно або в доповнення, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можуть зв'язуватися з комплексом (ЗАКР-ТОБ-В1 примату, відмінного від людини, зокрема, з комплексом ЗАКР-ТОЕ-ВІ яванського макаки. Перехресна реактивність з гомологами інших видів може бути особливо переважною при розробці і випробуванні терапевтичних антитіл.
Наприклад, доклінічне токсикологічне дослідження терапевтичних антитіл часто проводиться на видах приматів, включаючи, не обмежуючись цим, яванський макак. Отже, перехресна реактивність з цими видовими гомологами може бути особливо переважною для розробки антитіл як кандидатів для застосування в клініці.
Підвищена стабільність
Анти-САВР-ТОаг-В1-антитіла за винаходом вдосконалені порівняно з анти-Я4АВР-ТОБ-В1- антитілами, описаними раніше, в тому відношенні, що вони демонструють підвищену стабільність. Зокрема, стабільність антитіл до ЗАКР-ТОРЕ-В1 підвищена порівняно з антитілами, що мають послідовності СОК важкого ланцюга і легкого ланцюга референсного анти-САВР- такг-р1-антитіла, І НО10.6, описаного в УМО2015/015003 ії ММО2016/125017.
Анти-САВР-ТОаБ-В1-антитіло ІНОС10.6 має наступну комбінацію послідовностей СОК бо варіабельної ділянки важкого ланцюга і варіабельної ділянки легкого ланцюга:
СОКЗ важкого ланцюга, що складається з МЕМЕТУММООІ МУЕМЕТМ (5ЕО ІЮ МО: 6),
СОК2 важкого ланцюга, що складається з КІОРЕОООТКУАОКРОС (5ЕО ІЮ МО:5),
СОК'І важкого ланцюга, що складається з ЗУМІЮ (5ЕО ІЮ МО:4),
СОКЗ легкого ланцюга, що складається з ОЮОУАБМРМТ (5ЕО І МО:11),
СОК2 легкого ланцюга, що складається з САЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), апа
СОКТ легкого ланцюга, що складається з ОАБОБІЗЗМУ І А (ЗЕО ІЮО МО:9).
Як повідомлялося в іншому місці в даному документі, було встановлено, що антитіла до
САВР-ТОаБЕ-В1, що мають послідовності СОМ важкого ланцюга і легкого ланцюга І НО10.6, не мають стабільності. Зокрема, було виявлено, що варіанти моноклонального антитіла ГГ Ное10.6 зародкового типу (які в іншому місці в цьому документі позначаються як тАр 3986 Ідс4 і 3986 9091) демонструють тенденцію до зниження активності зв'язування з мішенню при зберіганні при 37 "С як в РВ5, так і в РВЗ/Івіні (див., наприклад, фіг. 2). Така нестабільність належить на рахунок щонайменше частково, ізомеризації і дезамідування в положенні МО5 НСОКЗ, тобто першому залишку СОКЗ важкого ланцюга.
Антитіла до ЗАКР-ТОБЕ-В1 і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом відрізняються за своїми послідовностями СОЖК, зокрема, за послідовностями СОК важких ланцюгів, так що їх стабільність підвищується. Зокрема, послідовність СОМК2 важкого ланцюга (НСОК2 або СОМК2 МН) модифікована з включенням заміни 55А, так що послідовність НСОК2 антитіл за винаходом містить НСОР2, представлений ВІОРЕВАДИТКУДОКРОИ (5ЕО ІЮ МО:12).
Крім того, послідовність СОМКЗ важкого ланцюга (НСОКЗ або СОКЗ УН) модифікована з включенням заміни МО5У, так що послідовність НСОКЗ антитіл за винаходом містить НСОКЗ, представлений МЕМЕТУУМарІ ММЕМЕМ (5ЕО ІЮ МО:13). Антитіла за даним винаходом не піддаються дезамідуванню або ізомеризації. Крім того, несподівано було встановлено, що анти-
САВР-ТОаБ-В1-антитіла за даним винаходом відносно стійкі до окислення. Ця стійкість до дезамідування, ізомеризації і окислення корелює з підвищеною стабільністю антитіл за винаходом, зокрема, з підвищеною стабільністю при зберіганні при температурі 37 "С.
Крім того, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом є несподівано переважними, оскільки модифікації послідовностей СОК2 ії СОКЗ важкого ланцюга, порівняно з референсним антитілом І Но10.6, істотно не знижують активність зв'язування з мішенню. Як показано в даному описі, антитіла проти ЗАКР-ТОЕ-В1 за даним винаходом відносно стабільні при 37 "С і не демонструють значного зниження афінності зв'язування з комплексом ЗАКР-ТОаЕ-
В1 порівняно з референсним антитілом ГНО10.6 або його варіантом зародкового типу (3986).
Як описано в іншому місці, в переважних варіантах здійснення антитіла до САКР-ТОЕ-В1 за винаходом мають значення Ко нижче 1,7х109 М.
Як в даному описі зазначалося, не всі заміни в положенні МО5 НСОКЗ, внаслідок яких видаляється залишок Авхп (М), здатні підвищувати стабільність антитіла, зберігаючи при цьому афінність зв'язування з комплексом (ЗАКР-ТОБЕ-В1. Було встановлено, що варіант моноклонального антитіла зародкового типу, що має заміну МО5М (який називається в даному описі 3986-АМЕ), стійкий до дезамідування і ізомеризації, але піддавався значному окисленню при зберіганні протягом 28 діб при 37 "С. Також було виявлено, що активність зв'язування цього варіанта антитіла МО5М значно знижується протягом 56-денного періоду зберігання при 37 "с.
Заявники також виявили, що об'ємні заміни в суміжному положенні 96 у важкому ланцюгу (тобто у другому залишку НСОКЗ) були нездатні підвищувати стабільність і зберегти активність високоафінного зв'язування з антигеном. Як в даному описі показано як приклад, заявники винаходу тестували два варіанти моноклонального антитіла зародкового типу, що включають заміни Е96К і Е96К в домені НСОКЗ. Варіант Е9б6К (який називається в даному описі 3986-АМК) не піддівався окисленню, але піддавався дезамідуванню і ізомеризації протягом 28-денного періоду зберігання при 37 "С і піддавався значному зниженню активності зв'язування протягом 5б-денного періоду зберігання. Варіант Е9бК (який називається в даному описі 3986-АМЕА) піддавався значному окисленню і дезамідуванню протягом 28-денного періоду зберігання при 37 "С і піддавався зниженню активності зв'язування протягом 56-денного періоду зберігання.
У переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом СЗАКР-ТИБЕ-В1Ї і виявляють підвищену стабільність, містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МН містить або складається з амінокислотної послідовності МХЕМЕТУММОаОІ ММЕМЕУ (ЗЕО ІО МО:13),
СОВа2 МН містить або складається з амінокислотної послідовності ВІОРЕСАСОТКУАОКЕеОС (ЗЕО І МО 12), 60 СОВІ МН містить або складається з амінокислотної послідовності ЗУМІЮ (ЗЕО ІЮО МО 4),
СОВЗ Мі містить або складається з амінокислотної послідовності ООМАБМРМТ (ЗЕО І
МО:11),
СОВа МІ містить або складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОВІ Мі. містить або складається з амінокислотної послідовності ОАБОБІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ
МО:9).
У деяких переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом СЗАКР-ТИБЕ-В1Ї і виявляють підвищену стабільність, містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МН містить амінокислотну послідовність "У'ЕМЕТММУМООІ МУЕМЕМ (ЗЕО ІЮ МО:13),
СОВА МН містить амінокислотну послідовність КІОРЕВСАСТКУАОКРОС (5ЕО ІЮ МО:12),
СОВІ МН містить амінокислотну послідовність ЗУМІЮ (ЗЕО ІЮО МО 4),
СОВЗ МІ містить амінокислотну послідовність ООМАБМУРМТ (5ЕО І МО:11),
СОВа2 МІ. містить амінокислотну послідовність ЗА5КІ КТ (ЗЕО ІЮО МО:10), і
СОН Мі містить амінокислотну послідовність ОАБОЗІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9).
У деяких переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом СЗАКР-ТИБЕ-В1Ї і виявляють підвищену стабільність, містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де:
СОВЗ МН складається з амінокислотної послідовності ХЕММЕТУУМОРІ МУЕМЕМ (ЗЕО І
МО:13),
СОВ2 МН складається з амінокислотної послідовності КІОРЕСАСТКУАОКРОС (5ЕО ІЮ
МО:12),
СОВІ МН складається з амінокислотної послідовності ЗУМІЮ (ЗЕО ІЮО МО 4),
СОВЗ МІ. складається з амінокислотної послідовності ООМАБМРМТ (5ЕО ІЮ МО:11),
СОВа2 МІ. складається з амінокислотної послідовності ЗАЗКІ КТ (ЗЕО ІЮ МО:10), і
СОВІ МІ. складається з амінокислотної послідовності ЗОАБОБІБЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9).
Ці антитіла переважно мають значення Ко нижче 1,7х103 М.
Зо У особливо переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В1 і виявляють підвищену стабільність, містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ
МО:14, і необов'язково варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:15.
У особливо переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В1 і виявляють підвищену стабільність, містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:14, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ МО:15.
У особливо переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В1 і виявляють підвищену стабільність, містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), що складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮО МО:14, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), що складається з амінокислотної послідовності ЗЕО
ІО МО:15.
У додаткових переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТИЕ-В1 і виявляють підвищену стабільність, містять важкий ланцюг, що містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:16, і необов'язково легкий ланцюг, що містить або складається з амінокислотної послідовності зФЕО
ІО МО:17.
У ще одних переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В1 і виявляють підвищену стабільність, містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зБЕО ІЮ МО:16, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:17.
У ще одних переважних варіантах здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з комплексом ЗАКР-ТОЕ-В1 і виявляють підвищену стабільність, містять важкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ МО:16, і легкий ланцюг, що складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:17.
Полінуклеотиди, що кодують антитіла до ЗАКР-Таг-р1
Винахід також стосується полінуклеотидних молекул, що містять одну або більше нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла до ЗАКР-ТОЕ-В1 або антигензв'язувальні бо фрагменти за винаходом, експресійних векторів, що містять вказані нуклеотидні послідовності за винаходом, функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями, які забезпечують експресію антитіл або їх фрагментів у клітині-хазяїні або безклітинній системі експресії, і клітин- хазяїнів або безклітинних систем експресії, що містять вказані експресійні вектори.
У деяких варіантах здійснення варіабельна ділянка важкого ланцюга і/або варіабельна ділянка легкого ланцюга анти-САВР-ТОИЕ-В1-антитіл або антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом кодуються першою і другою полінуклеотидними послідовностями, де перша і друга полінуклеотидні послідовності відповідають амінокислотним послідовностям 5ЕО ІЮ
МО:18 ї 19 відповідно. У деяких варіантах здійснення полінуклеотиди, що кодують антитіла до
САВР-ТаЕ-В1 за винаходом, можуть містити варіантні послідовності, які кодують функціональні ділянки МН або Мі антитіла до САКР-ТОЕ-В1. Варіантні послідовності, що кодують ділянки УН, можуть мати щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 97 95 або 99 95 ідентичність послідовності при оптимальному вирівнюванні з БЕО ІЮ МО:18, і варіантні послідовності, що кодують ділянки
МІ, можуть мати щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 97 95 або 99 95 ідентичність послідовності при оптимальному вирівнюванні з 5ЕО ІЮ МО:19.
У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг і/або легкий ланцюг анти-ЗАВР-ТИавБ-Д1- антитіл або антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом кодуються першою і другою полінуклеотидними послідовностями, де перша і друга полінуклеотидні послідовності відповідають амінокислотним послідовностям ЗЕО ІЮ МО:20 і 21 відповідно. У деяких варіантах здійснення полінуклеотиди, що кодують антитіла до СЗАКР-ТОБЕ-В1 за винаходом, можуть містити варіантні послідовності, які кодують важкі ланцюги або легкі ланцюги антитіла до САКР- такг-рВ1. Варіантні послідовності, що кодують важкі ланцюги, можуть мати щонайменше 80 95, 85
Фо, 90 95, 95 95, 97 95 або 99 95 ідентичність послідовності при оптимальному вирівнюванні з БЕО
ІО МО:20, і варіантні послідовності, що кодують легкі ланцюги, можуть мати щонайменше 80 95, 85 96, 90 95, 95 95, 97 9Уо або 99 95 ідентичність послідовності при оптимальному вирівнюванні з
ЗЕО ІЮ МО:21.
У цьому контексті 95 ідентичність послідовностей між двома полінуклеотидними послідовностями можна визначити порівнянням оцих двох послідовностей, вирівняних оптимальним чином, і в яких полінуклеотидна послідовність, що порівнюється, може містити додатки або делеції відносно референсної послідовності для оптимального вирівнювання цих
Зо двох послідовностей. Процент ідентичності розраховується визначенням кількості ідентичних положень, для яких нуклеотидний залишок є ідентичним між двома послідовностями, діленням цієї кількості ідентичних положень на загальну кількість положень у вікні порівняння і множенням отриманого результату на 100 з отриманням процента ідентичності цих двох послідовностей. Наприклад, можна використовувати програму ВІ А5Т "Послідовності ВІ АТ 2" (Ташвома 6ї аї, "Віаві 2 зедиепсев5 - а пем/ 00! Тог сотрагіпуд ргоївіп апа писієоїіде зедиепсев",
ЕЕМ5 Містгобіої Ген. 174:247-250), доступну на сайті поебі.піт.пій.дом/догі/рІ2, в якій використовуються параметри за замовчуванням (зокрема, такі параметри як "штраф за відкритий геп": 5 і "штраф за подовження гепа": 2; наприклад, вибрана матриця представляє матрицю "ВГОБОМ 62", запропоновану програмою), при цьому процент ідентичності двох послідовностей, що порівнюються, розраховується безпосередньо програмою.
Полінуклеотидні молекули, що кодують антитіла за винаходом, включають, наприклад, рекомбінантні молекули ДНК. Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид" або "полінуклеотидна молекула", що використовуються в даному описі, взаємозамінні і стосуються будь-якої молекули ДНК або РНК, одно- або дволанцюжкової, і, якщо вона одноланцюжкова, то молекули з комплементарною до неї послідовністю. При обговоренні молекул нуклеїнової кислоти послідовність або структура конкретної молекули нуклеїнової кислоти може бути описана в даному описі відповідно до звичайного умовного позначення послідовності в напрямку від 5 до 3. У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеїнові кислоти або полінуклеотиди є "виділеними". Даний термін, коли використовується застосовно до молекули нуклеїнової кислоти, стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка відділена від послідовностей, з якими вона безпосередньо асоційована в природному геномі організму, в якому вона виникла. Наприклад, "виділена нуклеїнова кислота" може включати молекулу ДНК, вставлену у вектор, такий як плазмідний або вірусний вектор, або інтегровану в геномну ДНК прокаріотичної або еукаріотичної клітини, або організму-хазяїна, що не є людиною. Застосовно до РНК термін "виділений полінуклеотид" в основному стосується молекули РНК, кодованої виділеною молекулою ДНК, як визначено вище. Альтернативно, даний термін може стосуватися молекули РНК, яка була очищена/відділена від інших нуклеїнових кислот, з якими вона була зв'язана в своєму природному стані (тобто в клітинах або тканинах). Виділений полінуклеотид (ДНК або РНК) може, крім того, являти собою молекулу, отриману безпосередньо біологічним бо або синтетичним способом і відділену від інших компонентів, присутніх в процесі її отримання.
Для рекомбінантної продукції антитіла за винаходом рекомбінантний полінуклеотид, що кодує його, можна отримати (з використанням стандартних методів молекулярної біології) і вставити в реплікований вектор для експресії у вибраній клітині-хазяїні або безклітинній системі експресії. Придатними клітинами-хазяїнами можуть бути клітини прокаріот, дріжджів або вищих еукаріот, зокрема, клітини ссавців. Прикладами придатних ліній клітин-хазяїнів ссавців є наступні: лінія СМ1 нирки мавпи, трансформована 540 (СбО5-7, АТОС СК 1651); лінія нирки ембріона людини (клітини 293 або 293, субклоновані для росту в суспензійній культурі, сгайат еїаї., У. Сеп. Мігої., 36:59 (1977)); клітини нирки дитинчати хом'ячка (ВНК, АТСС СС 10); клітини яєчника китайського хом'ячка/-ОНЕА (СНО, Опаць еї аї., Ргос. Маї!Ї. Асай. сі. ОБА, 77: 4216 (1980)); мишачі клітини Сертолі (ТМА4, Майїнег, Вісі. Бергод., 23: 243-251 (1980)); клітини мишачої мієломи ЗР2/0-АС14 (АТСС СІ 1581; АТСС СКІ 8287) або М5О (колекції культур НРА Мо 85110503); клітини нирки мавпи (СМ1 АТСС СС 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕНО-76, АТС СВІ-1587); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА, АТС СС г); клітини нирки собаки (МОСК, АТСС СС 34); клітини печінки щурів Ббийаю (ВК ЗА, АТСС СВІ. 1442); клітини легені людини (М/138, АТСС СС 75); клітини печінки людини (Нер 52, НВ 8065); пухлина молочної залози миші (ММТ 060562, АТСС СС 51); клітини ТКІ (Маїпег еї аї., Аппаїб5
М.У. Асад. 5сі., 383: 44-68 (1982)); клітини МЕС 5; клітини Е54; і лінія гепатоми людини (Нер 2), а також клітинна лінія РЕКС-6 О5М. Експресійні вектори, придатні для використання в кожній з цих клітин-хазяїнів, також загалом відомі у даній галузі.
Потрібно зазначити, що термін "клітина-хазяїн" звичайно стосується клітинної лінії, що культивується. Цілий організм людини, в який був введений експресійний вектор, що кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за винаходом, явно виключається з визначення "клітини-хазяїна".
Отримання антитіл
У додатковому аспекті винахід також стосується способу отримання антитіл за винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна (або безклітинної системи експресії), що містить один або більше полінуклеотидів (наприклад, експресійний вектор), що кодують антитіло, в умовах, які забезпечують експресію антитіла і виділення експресованого антитіла. Даний процес рекомбінантної експресії можна використовувати для великомасштабного виробництва антитіл, зокрема анти-сАВР-ТОЕ-В1-антитіл за винаходом, включаючи моноклональні антитіла, призначені для терапевтичного застосування у людей. Придатні вектори, клітинні лінії і виробничі процеси для великомасштабного виробництва рекомбінантних антитіл, придатних для терапевтичного застосування іп мімо, звичайно доступні в даній галузі і добре відомі фахівцеві в даній галузі.
Фармацевтичні композиції
До обсягу винаходу входять фармацевтичні композиції, що містять одне або комбінацію антитіл до ЗАКР-ТОЯБ-В1Ї за винаходом або їх антигензв'язувальних фрагментів, формульованих з одним або більше фармацевтично прийнятними носіями або ексципієнтами.
Такі композиції можуть включати одне або комбінацію (наприклад, два або більше різних) антитіл до САКР-ТОЕ-В1. Способи формуляції моноклональних антитіл для терапевтичного застосування у людей добре відомі в даній галузі і їх огляд є, наприклад, у публікації УМмапу еї аІ.,, Уоцтаї ої РІаптасешцшііса!І Зсіепсе5, МоІ.96, рр1-26, 2007, зміст якої в повному обсязі включений в даному описі за допомогою посилання.
У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції формульовані для введення індивіду будь-яким придатним шляхом введення, включаючи, не обмежуючись цим, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, внутрішньошкірне, внутрішньочеревинне, підшкірне, епідуральне, інтраназальне, оральне, ректальне, місцеве, інгаляційне, букальне (наприклад, сублінгвальне) і трансдермальне введення.
Фармацевтично прийнятні ексципієнти, які можна використовувати в цих композиціях, включають, не обмежуючись цим, іонообмінники, оксид алюмінію, стеарат алюмінію, лецитин, сироваткові білки, такі як людський сироватковий альбумін, буферні речовини, такі як фосфати, гліцин, сорбінова кислота, сорбат калію, суміші часткових гліцеридів насичених рослинних жирних кислот, воду, солі або електроліти, такі як протаміну сульфат, динатрію гідрофосфат, гідрофосфат калію, хлорид натрію, солі цинку, колоїдний діоксид кремнію, трісилікат магнію, полівінілпіролідон, сполуки на основі целюлози (наприклад натрій карбоксиметилцелюлоза), поліетиленгліколь, поліакрилати, воски, блок-співполімери поліетилену-поліоксипропілену, полієтиленгліколь і ланолін.
Терапевтична застосовність антитіл до ЗАКР-ТОБЕ-ДВ1
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можна використовувати в 60 способах лікування, де індивіду вводять терапевтично ефективну кількість антитіла до САКР-
тТакг-В1 або його антигензв'язувального фрагмента. У деяких варіантах здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можна використовувати в способах лікування, де людині вводять терапевтично ефективну кількість антитіла до ЗАКР-ТОЕ-В1 або його антигензв'язувального фрагмента. Забезпечуються антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з комплексом людських ЗАКР і ТОаБ-В1 для застосування як лікарських засобів.
Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом зв'язуються з комплексом ЗАКР-
ТаБР-В1Ї вна регуляторних Т-клітинах і можуть блокувати або інгібувати продукцію або вивільнення активного ТОЕ-В. Отже, в додатковому аспекті винаходу забезпечуються способи лікування індивідів, що мають або що мають підозру на наявність розладів, пов'язаних з ТОавБ-р.
Такі способи включають введення індивіду терапевтично ефективної кількості антитіла до
САВР-ТОаБ-ВДІ1 за винаходом.
Типові розлади, пов'язані з ТОБ-В, включають, не обмежуючись цим, запальні захворювання, хронічну інфекцію, злоякісне новоутворення, фіброз, серцево-судинне захворювання, цереброваскулярну хворобу (наприклад, ішемічний інсульт) і нейродегенеративні захворювання. У деяких варіантах здійснення розлад, пов'язаний з ТОаБ-рД, являє собою хронічну інфекцію. У деяких варіантах здійснення розлад, пов'язаний з ТОаБ-Д, представляє злоякісне новоутворення.
Для застосування при введенні індивіду антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за винаходом можна формулювати у вигляді фармацевтичних композицій. Композиції можна вводити перорально, парентерально, з допомогою інгаляційного спрею, місцево, ректально, інтраназально, букально, інтравагінально або через імплантований резервуар. Як використовується в даному описі, термін "введення" включає, без обмеження, методи підшкірної, внутрішньовенної, внутрішньочеревинної, внутрішньом'язової, внутрісуглобної, інтрасиновіальної, інтрастернальної, інтратекальної, внутрішньопечінкової, в осередок ураження, інтратуморальної і інтракраніальної ін'єкції або інфузії.
Стерильні ін'єктовані форми композицій можуть представляти водну або масляну суспензію.
Такі суспензії можна формулювати відповідно до методик, відомих в даній галузі техніки, з використанням придатних диспергуючих або змочувальних агентів і суспендуючих агентів.
Зо Стерильний ін'єкційний препарат також може представляти стерильний ін'єкційний розчин або суспензію, в нетоксичному прийнятному для парентерального введення розріджувачі або розчиннику. Серед прийнятних носіїв і розчинників, які можна використовувати, знаходяться вода, розчин Рінгера і ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, стерильні нелеткі масла звичайно використовуються як розчинник або суспендуюче середовище. Для цієї мети можна використовувати будь-яке м'яке нелетке масло, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди жирних кислот. Жирні кислоти, такі як олеїнова кислота і її гліцеридні похідні, придатні для приготування ін'єкційних препаратів, як і природні фармацевтично прийнятні олії, такі як оливкова олія або касторова олія, особливо в їх поліоксіетилованих варіантах. Ці масляні розчини або суспензії також можуть включати довголанцюжкові спиртові розчинники або дисперсанти, такі як карбоксиметилцелюлоза або аналогічні диспергуючі агенти, які звичайно використовуються при формуляції фармацевтично прийнятних лікарських форм, включаючи емульсії і суспензії. Інші поверхнево-активні речовини, що звичайно використовуються, такі як твіни, спани і інші емульгуючі агенти або підсилювачі біодоступності, які звичайно використовуються у виготовленні фармацевтично прийнятних твердих, рідких або інших лікарських форм, також можна використовувати для цілей формуляції.
Режими і дозування для введення антитіла або його антигензв'язувального фрагмента у фармацевтичних композиціях можна визначити відповідно до відомих способів для цих типів продуктів, наприклад, з використанням інструкцій виробника. Наприклад, антитіло, що знаходиться в фармацевтичній композиції за даним винаходом, можна вводити у концентрації 10 мг/мл в одноразових флаконах по 100 мг (10 мл) або 500 мг (50 мл). Продукт формульований для внутрішньовенного (в/в) введення в 9,0 мг/мл хлориду натрію, 7,35 мг/мл дигідрату цитрату натрію, 0,7 г/мл полісорбату 80 і стерильній воді для ін'єкцій. Значення рН доводять до 6,5.
Для клінічного застосування антитіло або антигензв'язувальний фрагмент можна вводити індивіду в одній або декількох дозах. Для парентеральних шляхів введення разова доза антитіла або антигензв'язувального фрагмента може становити, наприклад, приблизно від 0,01 до приблизно 100 мг/кг маси тіла. У одному варіанті здійснення разова доза антитіла або антигензв'язувального фрагмента може становити, наприклад, приблизно від 0,1 до приблизно 50 мг/кг маси тіла. У одному варіанті здійснення разова доза антитіла або антигензв'язувального фрагмента може становити, наприклад, приблизно від 1 до приблизно 20 60 мг/кг маси тіла. Для багаторазового дозування індивідуальні дози можна вводити одним і тим же або різними шляхами введення. Також для багаторазового дозування індивідуальні дози можуть бути однаковими або різними. Наприклад, перша або навантажувальна доза може бути вищою, ніж подальша доза. Також для багаторазового дозування індивідуальні дози можна вводити по фіксованій схемі або по коректованій або змінній схемі з урахуванням, наприклад, клінічного стану індивіда або клінічної відповіді. Також для багаторазового дозування індивідуальні дози звичайно можна вводити один раз на день, через день, один раз в 3, 4, 5,6 або 7 днів, один раз на тиждень, один раз на два тижні, один раз на три або чотири тижні або один раз на місяць. Інші схеми також передбачені винаходом.
Зрозуміло, що ці дози і схеми є зразковими, і що оптимальну схему і режим можна визначити, беручи до уваги такі фактори, як конкретне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, які треба вводити, захворювання або розлад, який треба лікувати, розмір, вік і стан індивіда, що підлягає лікуванню, шлях введення, інші види лікування, що застосовується для індивіда, а також афінність і переносимість конкретного антитіла. Такі фактори і міркування дозування можуть бути визначені в одному або декількох клінічних випробуваннях.
Даний винахід також стосується способів стимуляції імунної системи у індивіда, що включають введення індивіду терапевтично ефективної кількості антитіла або антигензв'язувального фрагмента за винаходом. Даний винахід також стосується способів інгібування імуносупресивної функції людських Тгед у індивіда, що включають введення індивіду терапевтично ефективної кількості антитіла або антигензв'язувального фрагмента за винаходом.
Даний винахід також забезпечує способи лікування злоякісного новоутворення з використанням антитіл до ЗАКР-ТОаЕ-ВД1 і антигензв'язувальних фрагментів за винаходом. Такі способи можуть включати зниження імуносупресії в оточенні пухлини у індивіда, який потребує цього.
Для варіантів здійснення, в яких антитіла до ЗАКР-ТОБЕ-В1 або їх антигензв'язувальні фрагменти призначені для застосування в способах лікування злоякісного новоутворення, антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти можна вводити в комбінації з одним або більше додатковими способами лікування злоякісного новоутворення, наприклад одним або більше імунотерапевтичними агентами.
Для варіантів здійснення, в яких антитіла до СЗАНВР-ТОЕ-В1 вводять в комбінації з імунотерапевтичним агентом, вказаний імунотерапевтичний агент може представляти протипухлинну вакцину. Альтернативно, імунотерапевтичний агент може представляти імуностимулююче антитіло. Не бажаючи зв'язуватися з якою-небудь теорією, антитіла за винаходом, ймовірно, підвищують ефективність імунотерапевтичного агента за допомогою попередження або ослаблення виявлення будь-якої імуносупресії. У певних варіантах здійснення комбінація з імунотерапевтичним агентом може виявляти синергічний ефект.
Різні види злоякісного новоутворення можна лікувати згідно зі способами, описаними в даному описі, включаючи, не обмежуючись цим, адренокортикальну карциному, злоякісне новоутворення анального каналу, рак сечового міхура, пухлину головного мозку, гліому, рак молочної залози, карциноїдну пухлина, рак шийки матки, рак товстої кишки, рак ендометрія, рак стравоходу, рак позапечінкових жовчних протоків, пухлину Юінга, екстракраніальну пухлину із зародкових клітин, рак ока, рак жовчного міхура, рак шлунка, пухлину із зародкових клітин, гестаційну трофобластичну пухлину, рак голови і шиї, гіпофарингеальний рак, карциному острівців Лангерганса, рак нирки, рак гортані, лейкоз, рак губ і ротової порожнини, рак печінки, рак легені, лімфому, меланому, мезотеліому, карциному Меркеля, метастатичний плоскоклітинний рак голови і шиї, мієлому, новоутворення, назофарингеальний рак, нейробластому, рак ротової порожнини, рак ротоглотки, остеосаркому, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак навколоносових пазух і порожнини носа, рак паращитовидної залози, рак статевого члена, феохромоцитому, рак гіпофіза, новоутворення з плазматичних клітин, рак передміхурової залози, рабдоміосаркому, рак прямої кишки, нирковоклітинну карциному, рак слинної залози, рак шкіри, саркому Капоші, Т-клітинну лімфому, саркому м'яких тканин, рак шлунка, рак яєчка, тимому, рак щитовидної залози, рак уретри, рак матки, рак піхви, рак вульви або пухлину Вільмса.
Придатні пухлинні антигени для застосування як протипухлинних вакцин, відомі в даній галузі, включають, наприклад: (а) антигени раку яєчка, такі як ММ-ЕБО-1, 55Х2, ЗСРІ, а також сімейства поліпептидів КАСЕ, ВАСЕ, САСЕ і МАСЕ, наприклад, САСЕ-1, САСІЕ-2, МАСЕ-1,
МАСЕ-2, МАСЕ-3, МАСЕ-4, МАСЕ-5, МАСЕ-6 і МАСЕ-12 (які можна використовувати, наприклад, для лікування меланоми, раку легені, голови і шиї, М5СІ С, раку молочної залози, шлунково-кишкового тракту і сечового міхура), (Б) мутовані антигени, наприклад, роз бо (асоційований з різними солідними пухлинами, наприклад, колоректальним раком, раком легені,
раком голови і шиї), р21/Ка5 (асоційований, наприклад, з меланомою, раком підшлункової залози і колоректальним раком), СО 4 (асоційований, наприклад, з меланомою), МОМ 1 (асоційований, наприклад, з меланомою), каспазу-8 (асоційовану, наприклад, з раком голови і шиї), СІА 0205 (асоційований, наприклад, з раком сечового міхура), НІГ А-А2-К1701, бета-катенін (асоційований, наприклад, з меланомою), ТСК (асоційований, наприклад, з Т-клітинною неходжкінською лімфомою), ВСМК-арі (асоційований, наприклад, з хронічним мієлоїдним лейкозом), триозофосфатізомеразу, ІА 0205, СОС-27 і ГО К-РОТ, (с) надекспресовані антигени, наприклад, галектин 4 (асоційований, наприклад, з колоректальним раком), галектин 9 (асоційований, наприклад, з хворобою Ходжкіна), протеїназу З (асоційовану, наприклад, з хронічним мієлоїдним лейкозом), ММ 1 (асоційований, наприклад, з різним лейкозом), карбоангідразу (асоційовану, наприклад, з раком нирки), альдолазу А (асоційовану, наприклад, з раком легені), РКАМЕ (асоційований, наприклад, з меланомою), НЕК-2/пеи (асоційований, наприклад, з раком молочної залози, товстої кишки, легені і яєчника), альфа-фетопротеїн (асоційований, наприклад, з гепатомою), ЗА (асоційований, наприклад, з колоректальним раком), гастрин (асоційований, наприклад, з раком підшлункової залози і шлунка), каталітичний білок теломерази, МОС-1 (асоційований, наприклад, з раком молочної залози і яєчника), 5-250 (асоційований, наприклад, з ниркоподібно-клітинним раком), і карциноембріональний антиген (асоційований, наприклад, з раком молочної залози, раком легені і раком шлунково-кишкового тракту, таким як колоректальний рак), (4) загальні антигени, наприклад, диференціювальні антигени меланоми-меланоцитів, такі як МАКТ-1/Меіап А, ор100, МС1К, рецептор меланоцитостимулюючого гормону, тирозиназа, споріднений тирозиназі білок-1/ТКРІ і споріднений тирозиназі білок-2/теЕР2 (асоційований, наприклад, з меланомою), (е) антигени, асоційовані з передміхурової залозою, такі як РАР, РБА, РОМА, РЗН-РІ, РОМ-РІ, РОМ-Р2, пов'язані, наприклад, з раком передміхурової залози, (Її) ідіотипи імуноглобулінів (наприклад, асоційовані з мієломою і В-клітинними лімфомами) і (9) інші пухлинні антигени, такі як поліпептид- і сахаридовмісні антигени, включаючи (ії) глікопротеїни, такі як сіаліл-Тп ії сіаліл-ї ех (асоційовані, наприклад, з раком молочної залози і колоректальним раком), а також різні муцини; глікопротеїни можуть бути зв'язані з білком-носієм (наприклад, МОС-1 може бути зв'язаний з ІН); (ії) ліпополіпептиди (наприклад, МОС-1, зв'язаний з ліпідною молекулою); (іїї)
Зо полісахариди (наприклад, Сіобо Н-синтетичний гексасахарид), які можуть бути зв'язані з білками-носіями (наприклад, з КІН), (ім) гангліозиди, такі як 5М2, СМ12, 502, 03 (асоційовані, наприклад, з раком мозку, легені, меланомою), які також можуть бути зв'язані з білками-носіями (наприклад, КІН). Інші пухлинні антигени включають рі 5, Нот/Ме!1!-40, Н-Ваз, Е2А-РАГ, НА-ВЕТ,
ІСН-ІСК, ММ -КАЕК, антигени вірусу Епштейна-Барра, ЕВМА, антигени вірусу папіломи людини (НРМ), включаючи Еб і Е7, антигени вірусу гепатиту В ії С, антигени Т-лімфотропного вірусу людини, Т5Р-180, рівбегтЬВг, рівбетЬВ-3, с-теї, тп-23НІ, ТАа-72-4, СА 19-9, СА 72-4, САМ 17.1,
МиМа, К-газ, р 16, ТАСЕ, РБСА, СТ7, 43-9Е, 5Т4, 791 Тор72, бета-ХГЧ, ВСА225, ВТАА, СА 125,
СА 15-3 (СА 27.29/ВСАА), СА 195, СА 242, СА-50, САМ4З, СОбВ/КРІ, СО-029, РаЕ-5, Са7З3З3 (ЕРСАМ), НТор-175, М344, МА-50, Ма7-Ад, МОМ 18, МВ/7ОК, МУ-СО-1, ВСАБІ, БОССАСІ16, ТА- 90 (білок, зв'язувальний Мас-2/білок, зв'язаний з циклофіліном С), ТААГ 6, ТАС72, ТІ Р, ТРБ і тому подібне. Придатні імуностимулюючі антитіла включають, не обмежуючись цим: анти-СТІ А- 4, анти-РО1, анти-РОЇ1 і анти-КІЄЕ антитіла.
У деяких варіантах здійснення способи лікування злоякісного новоутворення, описані в даному описі, включають введення індивіду антитіла або антигензв'язувального фрагмента за винаходом до, одночасно і/або після введення іншого протипухлинного агента або лікування злоякісного новоутворення, такого як хіміотерапія.
Даний винахід також включає способи профілактики інфекційних захворювань введенням антитіл або антигензв'язувальних фрагментів за винаходом, для підвищення ефективності стратегій вакцинації. Наприклад, способи за винаходом можуть включати профілактику інфекційних захворювань, таких як ВІЛ, малярія або лихоманка Ебола, комбінованим введенням антитіл або антигензв'язувальних фрагментів, як описано в даному описі, разом з вакцинами, специфічними для цих захворювань.
Набори
У додатковому аспекті даний винахід стосується набору, що містить щонайменше одне антитіло до ЗАКР-ТОаРЕ-В1 або антигензв'язувальний фрагмент за винаходом.
Термін "набір" призначений для позначення будь-якого предмету виробництва (наприклад, упаковки або контейнера), що містить щонайменше один реагент, наприклад антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за винаходом, для специфічного зв'язування комплексу САКР- тТакнг-В1. Набір може рекламуватися, розповсюджуватися або продаватися у вигляді комплекту 60 для здійснення способів за даним винаходом. Крім того, будь-які або всі реагенти набору можуть бути представлені в контейнерах, які захищають їх від зовнішнього середовища, наприклад в герметичних контейнерах. Набори можуть також містити вкладку в упаковку, що описує набір і способи його застосування.
Приклади
Винахід буде додатково пояснений з посиланням на наступні необмежувальні приклади.
Приклад 1. Отримання антитіла зародкового типу І НО-10.6.
Отримання і характеристика антитіла "СНОо-10" описані в міжнародних заявках на патент
ММО2015/015003 і УМО2016/125017, зміст яких в повному обсязі включений в даному описі за допомогою посилання. Антитіло ЇНО-10 отримували імунізацією лам клітинами НЕК29ЗЕ, які надекспресують комплекс людських ЗАКР-Та-ВД1, і було ідентифіковано селекцією і скринінгом
Еаб САВР-ТОЕ-В1. Підхід перестановки легких ланцюгів (як описано, наприклад, в міжнародній заявці на патент УМО2014/033252) використовували для підвищення афінності моноклонального антитіла ЇНО-10, і варіант ""НО-10.6" (що також стосується в даному описі до 17Н5) був визначений як такий, що має поліпшені характеристики зв'язування. Послідовності МН і МІ ГНа- 10 і варіанта з переставленими Ук І На-10.6 показані в таблиці 3.
Таблиця З 11111111 |Ї5БОюЮМО.
ЕМО МОРОАЕЇ АМ5САЗУКУЗСКАЗИаУВЕТ ЗУХІЮр ділянка МН ГНО- ММАОАРСОСІ ЕУМа ВІОРЕОССИТКМАОКЕРОС 4 10 Но10.6 ВМТЕТАОТ5ЗТ5ОТАМУМЕЇ 551 В5ЕОТАМУУСАВ
МЕЖ ЕТУУМарі МУЕМЕМ УУСОСТОУТУ5о
РІОМТО5РББІ БАБІ СОВМТІТС ОСАБОБІЗЗМІ А ділянка М ГНО- М/УООКРЕООАРКИЦ М сСАБЗНАГОТ 2 10 СУРЗАЕЗОаБИБИаИТ5ЕТІ ТІЗаїЇ ЕАЕВАДСаТУУС
ОООМО5І РУТ РОСС ТКМУЕК
РІОМТО5РББІ БАБІ СОВМТІТС ОСАБОБІЗЗМІ А ділянка МЦ УМООКРООСОАРМИШТУ САБЗНВІ КТ З
І нат1о.6 СуРЗАЕЗОаБИаБИаИТтТ5ЕТІ ТІЗаі ЕАЕВАСТУМУО
ООМАБУРМУТ ЕСОСТКМУЕЇК
Було встановлено, що антитіло 17Н5 має 88,5 95 ідентичності з найбільш близькою послідовністю зародкової лінії людини (Х92343|ІСНМ1-46701) по ділянці УН і 86,2 95 ідентичності з найбільш близькою послідовністю зародкової лінії людини (Х59315|1(аКМ1-39701) по ділянці
МІ. Це антитіло було піддане перетворенню в антитіло зародкового типу з використанням 3- стадійного методу: 1 - Створення бібліотеки генів з використанням олігонуклеотидів, що перекриваються, для синтетичного отримання генів, що кодують варіабельну ділянку легкого (МІ) їі варіабельну ділянку важкого (УН) ланцюга, за допомогою ПЛР. 2 - Клонування цієї бібліотеки генів у вектор (рСВ13), що містить гени, що кодують людський константний домен важкого ланцюга (СНІ) і константний домен легкого ланцюга каппа (Ск) (конструювання бібліотеки).
З - Селекція функціональних Раб з використанням фагового дисплея і селекція афінності.
Зо 1. Конструювання бібліотеки
МН 17Н5 порівнювали з найближчою послідовністю зародкової лінії людини і ідентифікували залишки каркасу, що відхиляються від зародкової лінії людини. Цим каркасним залишкам давали можливість мутувати в залишок, що є в М-ділянці людини, також одночасно зберігаючи в бібліотеці вихідний залишок. 12 залишків МН, яким давали можливість мутувати в людські аналоги, наведені в таблиці нижче. У доповнення до цих мутацій для отримання зародкового типу сайт ізомеризації в СОК2 (054; 055) і сайт окислення в СОКЗ (М100) піддавали мутації. Ці сайти також показані в таблиці нижче.
Таблиця 4
Залишки-мішені в ділянці МН 17Н5 21 Щ1Е /71977777777771171717171711111111105. 1111712 27 ДР 7 187777777717171717171717171171111111105..ЙД.1...2 2 Ф 2712 |В 6177777 177717171711105.ЙДЙ.ї..72 2 Ф 72714181 |41Р 77777 7177171717171105..ЙДЙДЙДЙ.1...72 2 щФ п т: з Г: По Пе Ох НО Ж ОО НО ЗОН 5а4(нСрна) | ФЕ 7/7 / 177771717117105..ЙДЙДЙ.1...72 2 щФ « 769 (ЕЕ 7 |М 7777 17717171717117105..ЙДЙДЙДЙЙ.1...72 2 Ф
Я ДА (877777 1771717171105..ЙДЙДЙЙ.1..72 2 щФ 280 ЇМ М 7777 1771717171105.ЙДЙДЙ.1..72 2 Ф ло 97777777 01Є77777171717171ї111111105..ЙДЙ 1.42
Для МК 17Н5 порівняння між найближчою послідовністю людської зародкової лінії і каркасними послідовностями призвело до ідентифікації 11 залишків-мішеней. Ці сайти показані в таблиці нижче.
Таблиця 5
Залишки-мішені в ділянці МІ. 17Н5 742 07777777 41777 Її 05 | 2 2746 11111171111111111117111111106 11112 25011811 11111105 |... 2 2 7779 1Е 19777777 17711111 05 Щ | 2 280 ТА 7 |ІР 7 / Ї77717117105. | щ(-:2 БМ 106 01 17111111111111111711111106 111112
Теоретичні розміри бібліотеки 17 Н5 зародкового типу показані в таблиці 6.
Таблиця 6 11111117 бібліотеки 2. Конструювання бібліотеки генів
Бібліотеки генів зародкової лінії були створені зборкою генів. Синтетичні гени МН і МІ (два набори), основані на цьому дизайні, отримували зборкою на основі ПЛР (5іеттег еї аї!., Сепе (1995) 164: 49-530). Олігонуклеотиди, що перекриваються, зі специфічними мутаціями в певних положеннях збирали з допомогою ПЛР. Нуклеотиди були виродженими для кодування амінокислоти людини і лами. Це було зроблено для попередження повної втрати зв'язування у випадку, якщо залишки лами були критичними для забезпечення стабільності, фолдингу або високоафінного зв'язування.
Синтетичні гени бібліотек МН і МН 17Н5 спочатку клонували в рСВ13-СК1, фагемідний вектор з людськими доменами СК і СНІ відповідно. Після конструювання цих підбібліотек МКСК і
МНОНІ кінцеві бібліотеки отримували лігуванням вставки важкого ланцюга в бібліотеку легкого ланцюга. ПЛР колоній проводили для визначення процента вставки, і клони відправляли для секвенування, для оцінки гарантії того, що всі бажані мутації були присутніми в бібліотеці.
Характеристики різних бібліотек наведені в таблиці нижче.
Таблиця 7
Характеристики бібліотек 17Н5 зародкового типу ню ни
Було встановлено, що бібліотеки зародкового типу хорошої якості, і їх можна використовувати для селекції. 3. Селекція Рар з високою ідентичністю з людиною
Фаговий дисплей використовували для селекції Гарб-фрагментів з високою афінністю до комплексу людських ЗАКР-ТИаР-В1, як описано раніше в УМО 2015/015003, зміст якої в повному обсязі включений в даному описі за допомогою посилання. Коротко, мікротитраційний планшет покривали О/М при 4 "С комплексом САКР-Таг-ВДІ1, і на наступний день фаги, які експресують
Еар, інкубували протягом 2 год. в ямках, покритих різними концентраціями комплексу. Планшети промивали і специфічний фаг елюювали трипсином і використовували для інфікування клітин
ТО1. Деталі умов селекції наведені в таблиці 8.
Таблиця 8
Деталі раундів селекції для бібліотеки 17Н5 зародкового типу 17717710 лобо-чоото Її 72 | 77777717171111171111ловбо-лоото Її 76 ЇЇ 1 1 1000-00-10 | Ттиждень. | ї00хпист
Після першого раунду селекції збагачення спостерігали тільки з покриттям нерелевантним білком у концентрації 10 мкг/мл. У другому раунді збагачення було в 10 разів вище, тоді як кількість введеного фага була в 10 разів нижчою. Починаючи з третього раунду, жорсткість селекції збільшували за допомогою підвищення тривалості відмивання і додавання надлишку мішені в розчині. Додавали великий надлишок розчину розчинної мішені для попередження повторного зв'язування дисоційованого фага. Навіть після 6 раунду, з відмиванням протягом одного тижня і 100-кратним надлишком розчинної мішені, все ще спостерігали збагачення. 4. Скринінг Бар з високою ідентичністю з люодиною
Зо Майстер-планшети відбирали з раундів селекції 2, 3, 4, 5 і 6 (48 клонів на кожний раунд).
Готували периплазматичні екстракти, і швидкість дисоціації визначали з допомогою ЗРК (з використанням Віасоге). Всі клони мали секвеновані ДНК, і з них були виведені амінокислотні послідовності. Клони з ідентичністю М-ділянки Ід зародкової лінії людини вище 92 95 наведені в таблиці 9. Швидкість дисоціації цих клонів вимірювали у вигляді периплазматичних екстрактів в аналізі БРЕ (з використанням Віасоге) і порівнювали зі швидкістю дисоціації Рар 17 Н5.
Таблиця 9
Афінність зв'язування клонів з більш ніж 92 95 загальною ідентичністю з люодиною . сайт швидкість Зо Зо о; й . ризик шля ті «1. |до загальна)| ізомеризації
Еар дисоціації (1073 ідентичності! ідентичності ідентичність 054-055 окислення 4 2-1 з с7) УН Ук НСОвВо Мт (НСОВЗ) 17Н5 М(054Х555) лм (МТО0Ї "ета 606 | 954 | 962 | 958 |ЕБКОБ5 тт? "З9АБ зон 4Он3
З9АТО "3986
З9Е6 4004 зво 393 Е54;055 то 3909 Е54;055 тт?
ЗВЕЗ ОБ4;АББ5 "382 О5А:АБ5 ттоо "39810 ЕБА;О55 39с6 ЕБАО55 ттоо 3906 їтоої 38С5 ЕБА;О55 звв2 тт "5 Бар, які реформатували у вигляді повнорозмірного Ідс1
Ці 5 клонів, що мають загальну ідентичність з людиною на рівні » 93 95 і швидкість дисоціації, порівнянну з такою у батьківського Раб 17Н5, реклонували у вигляді повнорозмірних людських Ідс1 антитіл. Послідовності СОК, МН і МІ. цих антитіл показані в таблицях 10, 11 і 12.
Таблиця 10
Послідовність СОК МН для АБ проти САКР-ТОИаБЕ-Д1
ЗЕО І ЗЕО ІО ЗБО І
3986 2 |5УМІО ВІОРЕОСИаТКМАОКеОСІ 5 |МЕМЕТМУМОРІМУЕМЕМ 6 (
З9А12 | БУМ ВІОРЕЕБСТКМАОКЕРОСІ 7 00 | МЕМЕТУМУМООСТУЕМЕУ
З9А5 |5УМІО ВІОРЕОСИаТКМАОКеОСІ 5 |МЕМЕТМУМОРІМУЕМЕМ 6 (
З8Е2 |5УМІр ВІОРЕСАСТКУАОКЕРОСІ 8 0 | МЕМЕТУМУМООІТУЕМЕУ 39810 | БУМІЮ ВІОРЕЕБСТКМАОКЕРОСІ 5 |МЕМЕТМУМОРІМУЕМЕМ 6
Таблиця 11
Послідовність МІ. СОК для АБ проти САКР-ТОаБ-Д1
І ЇСОВІ 5ЕО І МО. |СОВ2 5ЕО Ір МО. |СОВЗ 5ЕО ІО МО. 3986 |ОАБОБІЗЗМІА| 9 |САБ5БВІКТ ООМАБУРМТІ 11
З9А12 |ОАБОБІЗЗМІА | 9 |САБВІКТ ООМАБУРМТІ 11
ЗА |ОАБОБІЗЗМІА| 9 |САБ5БВІКТ ООМАБУРМТІ 11
З8г2 |ОАБОБІЗЄЗМА| 9 |СА5ВІКТ ООМАБУРМТІ 11 39810 ІОАБОбБІЗЗМІА| 9 |ОА5ВІКТ ООМАБУРМТІ 11
Зо
Таблиця 12
Послідовності варіабельних ділянок для АБ проти ЗАКР-ТОаБ-В1
ЗЕБЕО ОЇ ЗЕБЕО ОЇ
ОМОЇ МОРОАЕУМАКРОАБУКУЗСКАБОУВЕТ рюмтовреві зАВУвоВУ
ЗУМІОМУМТОАРСОСІ ЕМ/ИМОВІОРЕО ПТоОАВОВІВБУ АМУУООКРОО 3986 22 АРКІПМаАВНІ КТОУРОАЕБаБО 23 ваткуУАОокКРОСаАМТМТАОТЗТЗТМУММЕЇ 551 АБЕОТАМУУСАН СТ5ЕТІТІ55ІЕРЕОААТУУС ООХАБУРУТ
МЕМЖЕТМУМарІ ММЕМЕМ МУ/СаОСТІ МТУ ЕСОСТКМЕК
ЕМОЇ МОРОАДЕМККРОАБУКУЗСКАБОУАЕТ РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТ СОАБОВІББУ
ЗА? ЗУМОМУВОАРООІ ЕМУМОВІОРЕЕЄССЯ ТКУ р ГАМУООКРООАРКІМОИаАЗНІ КТОУРЗВАЕБа 25
АОКРОСАМТЕТАОТОТОТМУМЕЇ 551. БаБОТОРТІТІЗ5ІОАЕОРАТУУС ООМАБМРМУТІ
ВЗЕОТАУУУСАВ МЕМЕТУУМООІ-ТУЕМЕУ МУСОСТІ МТУ ЕСОСТКУЕЇК
ОМОЇ МОРОАЕБЇ АМРЕОАЗБУКУЗСКАБОМАЕТ РІОМТО5РББІ БАБІ ЯОВМ ТІ СОАБОВІВЗУ
З9АБ ЗУМОМУВОАРООІ ЕМУМОВІОРЕОСОЯТКУ 26 ГАММУООКРООАРКИ ІМаАЗНІ КТаМРОАЕ 27
АОКРОСАМТЕТАОТЗТОТУУМЕЇ 551 АБЕОТАМУУСАВН авБавБатов ТТБ ОРЕСААТУУСОСМАВУРМТ
МЕЖ ЕТМУМарІ-ММЕМЕМ УМУСОСТІ МТУ ЕСОСТКМЕїК
ОМОЇ МОРОАЕІЇ ККРОАБУКУЗСКАБОУВЕТ РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТ СОАБОВІББУ
ЗВЕ? ЗУМОМУВОАРООІ ЕМХМОВІОРЕОА,ТКМАОКРОС 28 ГАММУООКРОКАРМИ ІМОАВАІ КТЕМРОЗАЕ5 29
ВМТЕТАОТ5ТОЗТМУУМЕЇ 551 АБЕОТАМУУСАВН авБаБатТОгТ За ЕРЕВАСТИМО ООМАБМРМТІ
МЕЖ ЕТМУМООС-ТМЕМЕМ МУСОСТІ МТУ ЕСОСТКМЕїК
ЕМО! МОБОАЕЇ ККРОАБУКУЗСКАБОМУАЕТМУМІОЮ РІОМТО5РББІ БАБІ ЯОВМ ІТ СОАБОВІВ з9в10 М УВОАРОССІ ЕМО ВІОРЕЄЇВИа ТКМАОКРОСЇ зо ЗМ АМУООКРОСАРМІМОАОАІ КТамР 31
ВУТМТАОТ5Т5ТАУМЕЇ 551 А5БЕОТАМУУСАВН зниБававатонгтітІваі ЕАЕОРАТУХО
МЕЖ ЕТМУМарІ-ММЕМЕМ УМУСОСТІ МТУ ОСООМАБУРМТ ГаССТКМЕ ІК 5. Характеристика тАБ іп міїго з високою ідентичністю залишків каркасної ділянки з лодиною
П'ять клонів зародкової лінії, переформатованих в людський Ідс1, отримували транзієнтною трансфекцією клітин НЕК 293БЕ. Всі антитіла тестували на зв'язування з комплексом людських
САВР-ТОЯБ-В1 з використанням ЗРЕ, і вони показали афінність зв'язування, схожу з батьківським клоном незародкової лінії (Ко в 2-5 разів нижче, ніж 17Н5). Заміна залишку М100: в
СОКЗ на треонін знижувала Ко «- в 5 разів. Зв'язувальні властивості і характеристики АБ 17Н5 зародкового типу наведені в таблиці 13.
Таблиця 13
Зв'язувальні властивості і характеристики АБ 17Н5 зародкового типу сайт изиКк М м кратна |. в . з, . о, 95 загальна тАБ Ко (М) відмінність ізомеризації | окислення | ідентичність | ідентичність ідентичність роаабо Мт УНН Ук 17Н5Б | ПО0Е-10 м (ра 3986 |1,67Е-10 м ра 39810 | 2,62Е-10
З9АБ | 2,98Е-10 м (ра
ЗвР2 | 4,80Е-10
ЗОАТ2 Т| 5,05Е-10 6. Стабільність тАБр 3986 зародкового типу
Клон 3986 відбирали як основний клон зародкової лінії на основі його характеристик зв'язування. Це антитіло отримували в двох форматах з дефіцитною ефекторною функцією,
Нідст1Ме970 | пІдс45228Р, і проводили тести на стабільність. Перед тестуванням стабільності афінність дефіцитних по ефекторній функції антитіл до ЗАКР-ТИЕ-В1-3986 аналізували
Віасогет200 з використанням біосенсорного чипу СМ5, покритого комплексом ЗАКР-ТИаЕ-В1 при 7508 (таблиця 14) або покритого антитілами при 1000 (таблиця 15).
Таблиця 14
Формат Кратна відмінність
Гнат10.6 Ідс1-М2970 8,19Е-10 3986 Ідс1-М2970 8,63Е-11 3986 Ідс4-5228Р ЗЗЕ-10
Таблиця 15
Термостабільність антитіл 3986 тестували з використанням наступної схеми.
Підготовка зразка тАБр: 1 мл тАбБ (3986-Іде1 і 3986-94), свіжоприготовлений вихідний розчин (5 мг/мл), вміщували в скляні флакони зі скляними кришками, що загвинчуються, ємністю 2 мл і зберігали при 5 "С і 37 "С. Флакони відразу ж перевіряли на відсутність частинок.
Негативний контроль РВ5: аліквотні порції 1 мл профільтрованого РВ5 Дульбекко готували в скляних флаконах ємністю 2 мл як негативний контроль РВ5Т. Флакони відразу ж перевіряли на відсутність частинок.
Негативний контроль РВЗТМ/: аліквотні 1 мл профільтрованого РВ5 Дульбекко, що містить 0,02 95 Твіну 80 (Зідта), готували в скляних флаконах ємністю 2 мл як негативний контроль
РВЗ ТМ. Флакони відразу ж перевіряли на відсутність частинок.
Контроль з високою агрегацією: аліквотні порції 17 мл власного антитіла готували з численною видимою агрегацією в скляних флаконах ємністю 2 мл.
Контрольний зразок: для кожного антитіла аліквотну порцію тАБр 60 мкл готували в стерильних пробірках для ПЛР ємністю 500 мкл, маркували і зберігали при -20 "С.
Стабільність антитіл, що зберігалися при різних температурах і в різних умовах (РВ5 порівняно з РВ5О5ТмМ/), контролювали протягом 56 діб. Вплив зберігання на активність зв'язування з мішенню, виміряний аналізом 5РЕ (Віасоге"М), показаний на фіг. 2. Як видно з представлених результатів, антитіло 3986 (в обох форматах з дефіцитом ефекторної функції) виявляло тенденцію до зниження активності зв'язування з мішенню в РВ5 і РВ5З/Івіні при зберіганні при 37 "б. На противагу, зразки, що зберігалися при 5 "С, не виявляли значної втрати в активності зв'язування з мішенню у часі.
Приклад 2. Розробка антитіл проти ЗАКР-ТаЕ-ДВ1 з підвищеною стабільністю 2.1 Отримання варіантів 3986
Було виявлено, що зниження активності зв'язування з мішенню, відмічене вище для антитіла 3986, пов'язане з дезамідуванням, що мало місце в положеннях 95-96 СОВЗ УН. Таким чином, була проведена подальша робота з підвищення стабільності 3986.
Спочатку цей клон піддавали модифікації УН ланцюга в ділянці СОК2 для введення заміни са55А (3986-А). Ділянки МН і МІ 3986-А реклонували в скелет людського Ідс45228Р, тобто у форматі людського антитіла з дефіцитною ефекторною функцією.
У спробі підвищити стабільність антитіла 3986-А Ідс45228Р було отримано п'ять варіантів, що мають мутації в положеннях 95 або 96 ділянки СОКЗ МН. Ці варіанти показані нижче. Всі варіанти були отримані в дефіцитному по ефекторній функції форматі Ідс4522ве,
Таблиця 16
Варіанти 986-А 1111189В6АМАГГ////О МІВ «залишок уже находиться в 3986-А
Антитіла фільтрували і концентрували до 5 мг/мл і зберігали в РВ5 Дульбекко з 0,02 95 Твіну 80 (Зідта). Твін 80 був необхідний для стабілізації складів антитіл.
Афінність всіх антитіл до (ЗАКР-ТОБЕ-В1Ї (включаючи 3986-А) тестували аналізом
Віасогет200 з використанням біосенсорного чипу СМ5, покритого комплексом ЗАКР-ТИЕ-В1 при 150 (таблиця 17) або покритого антитілами при 200 (таблиця 18).
Таблиця 17 711117 39В6АМЕ | 7 8е4ЕЛО ////177777777777771108111171 1111117 39В6АУЕ | 77777 763ЕЛО 7 17777777777771711081111сС1С у 77771717 З9ВвбАМК | 77777777 880ЛО 77 17777171717171717111111098111171 711117 З9В6БАМА | 7777777 884ЕЛО///17777777777771711098111171
Таблиця 18
Здатність блокувати вивільнення активного ТОЯЕ-В клітинами Тгед людини аналізували з усіма варіантами по визначенню рівня фосфорилування ЗМАЮО2, стимульованих СОЗ/С028 людських Тгед в присутності тАБ. Як показано на фіг. 3, антитіла 3986-АМУЕ, 3986-АМК і 3986-
АМЕК мали схожу активність в аналізі фосфорилування 5МАБ2 порівняно з вихідним антитілом 3986-А. Варіанти 3986-АЕЕ і 3986-АМЕ показали явну втрату активності.
Аналогічні результати були отримані з використанням аналізу САСА-Іис, де клітини 293т-
ПОАКР транзієнтно трансфікували репортерною плазмідою, в якій люцифераза світляків знаходиться під контролем ЗМАЮ-реактивного промотору (САСА-Іис). Антитіла 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМК мали схожу активність в аналізі з люоциферазою порівняно з вихідним антитілом 3986-А. Варіанти 3986-АЕЕ і 3986-АМЕ показали явну втрату активності (див. фіг. 4). 2.2 Дослідження стабільності
За винятком 3986-АЕЕ, інші варіанти тестували на стабільність з використанням різних підходів, як описано нижче.
Для кожного з різних досліджень стабільності антитіла тестували, використовуючи один або більше з наступних методів: - візуальний контроль; - ексклюзійна ВЕРХ; - 5О5-РАСЕ (відновлювальні і невідновлювальні умови); - афінність зв'язування з мішенню з використанням аналізу 5РЕ; - концентрація білка.
Протоколи цих методів описані нижче.
Протокол візуального контролю
Зразки досліджували "наосліп" і оцінювали на наявність видимих частинок візуальним контролем флаконів трьома аналітиками. Зразкам давали можливість досягнути кімнатної температури протягом 30 хв. перед аналізом. Наступну оцінну систему використовували для оцінки:
А: зразок прозорий, видимі частинки відсутні;
В: дуже мало частинок;
С: помірна наявність частинок; р: наявність численних частинок;
Е: волокна.
Протокол ексклюзійної хроматографії (ЗЕ-НРІ С)
Система, колонка і пробопідготовка
Колонка, що використовується протягом всього дослідження, являла собою Хбгідде Ргоїеїп
ВЕН 5ЕС 200А (3,5 мкм, 7,8х30 мм, Умаїегв5), яку звичайно зберігали в 20 95 ЕН. Передколонку
Хрпадде Ргоївіп ВЕН 200А з'єднували з аналітичною колонкою (3,5 мкм, 7,3х3 мм; Умаїег5). Перед кожним використанням колонку врівноважували РВ5 Дульбекко в об'ємі щонайменше 5СМУ, і перед видаленням з системи її промивали 5СМУ води категорії І С. Всі розчинники фільтрували і дегазували перед використанням.
Хроматографічна система, що використовується, являла собою Адйіепі 1260 Іпбпку, оснащена насосом для чотирикомпонентних сумішей, автоматичним інжектором, он-лайн дегазатором і ОАО-детектором. Колонку не зберігали в термостатованому відділенні, і зразки аналізували при кімнатній температурі. Детектор був налаштований на довжини хвиль 280 і 214 нм одночасно (референсна довжина хвилі при 360 нм з відсіканням 100 нм). Агрегацію контролювали на каналі 214 нм. Збирання даних проводили за допомогою програмного забезпечення Спетвіайоп (Адіїепо).
Аналіз зразків проводили перенесенням 25 мкл всіх вихідних зразків безпосередньо з розчину з концентрацією 5 мг/мл в асептичних умовах. Зразки центрифугували при 2000 об./хв. протягом 1 хв. і 20 мкл обережно переносили у флакони з коричневого скла з кришкою, що загвинчується. Об'єм інжектування для кожної умови становив 5 мкл (25 мкг) зі швидкістю потоку 0,7 мл РВоБ/хв. протягом 25 хв. Кожне інжектування супроводжували промиванням голки водою категорії І С, і промивання септи проводили в кінці аналізу кожного зразка.
Кожну послідовність часових точок починали з 2х інжектувань РВ5 (пустих; інжектований об'єм 5 мкл) з подальшим введенням 2 мкл стандартної білкової суміші ВЕН 200 (Умаїегв) і зразка тАб з відомою агрегацією. Аналізували кожні дванадцять зразків, і вводили пусту пробу.
Кожну аналітичну послідовність завершували як починали, але в зворотному порядку (контрольне тАБ з відомою агрегацією, стандартна білкова суміш ВЕН і 2х пуста проба).
Метод, використаний для визначення 95 агрегації і 96 площі мономерів
Використовували наступний протокол: - Інтегрують всі хроматограми за допомогою методу АКОХ-115 (основні технічні параметри: стандартний режим дотичної, чутливість нахилу 2,0, відхилення за висотою 1,7, відхилення за площею 1,0, ширина піку: 0,02) - Потрібно переконатися, що всі піки інтегровані таким чином, щоб це співпадало з результатами попередніх аналізів - Експортують результати інтеграції в файл РОБ і Ехсеї - Розраховують 95 загальну агрегацію як суму площ всіх піків, елюйованих до піку мономера, поділену на загальну площу інжектування і помножену на 100 - Також розраховують 96 площу мономера діленням площі мономера на загальну площу і
Зо множенням на 100. Ця 95 площа мономера відображає наявність нерозчинних агрегатів в зразку - Зберігають детальні звіти для моніторингу продуктивності, ефективності і розрізнення аналітичної колонки (тобто симетрія піку, площа мономера, загальна площа, відтворюваність часу утримування і т. д.).
Протокол електрофорезу 505-РАСЕ
Підготовка зразків
Аналіз зразків проводили перенесенням 25 мкл всіх вихідних зразків з концентрацією 5 мг/мл в 100 мкл суміші РВ5Б/0,02 95 Твін 80 (скорочено позначеного як РВ5ТмМ протягом всього цього дослідження) в асептичних умовах, з отриманням проміжної концентрації 1 мг/мл, для проведення електрофорезу 505-РАСЕ (у відновлювальних і невідновлювальних умовах), оцінки афінності зв'язування аналізом 5РЕ і визначення концентрації білка. Для аналізу зразків
ЗО5-РАСЕ (Віогад) використовували 4-20 95 Тріс-гліциновий буфер, не забарвлені, готові гелі
Міпі-Ргоївап. Готували партію 4х концентрованого барвника з відновником ОТТ або без нього, і готували аліквоти для зберігання при -20 "С. Звичайно 5 мкл відбирали з проміжного розбавлення з концентрацією 1 мг/мл, і потім додавали 5 мкл 4х концентрованого барвника (/- - ООТ) разом з 10 мкл то). Кінцева кількість для кожної умови становила 5 мкг. Зразки кип'ятили протягом 10 хв. при 95 "С ії потім наносили (20 мкл) на готові гелі. Електрофорез проводили протягом 35 хв. в Тріс-гліциновій буферній системі при постійній напрузі 200 В. Подальше забарвлювання синім (Сепіацгї) проводили протягом 1 год. Всі гелі промивали водою то протягом щонайменше 1 год.
Визначення 95 повнорозмірного АБ
Інтенсивність різних смуг визначали в системі серії Одузбзеу м3.0 ГіІ-Сог скануванням білкових гелей з одноканальним детектування (700 нм) при настройках: зміщення фокусу 0,5 мм і "висока" якість. Яскравість і контрастість для кожного аналізу встановлювали на 50 95 з лінійним параметром ручного керування 5.
Метод був наступним: - Сканують гель і підтверджують, що всі смуги на гелі оточені вузькими прямокутниками - Вибирають "експорт" в настройках для отримання необроблених даних по інтенсивності всіх смуг в форматі Ехсеї - Розраховують 95 необроблену інтенсивність кожної смуги, присутньої на доріжці, як 60 необроблену інтенсивність смуги, поділену на загальну необроблену інтенсивність смуги, і множать на 100 - Для невідновлювальних умов 95 повнорозмірного АБ визначається як 95 необроблена інтенсивність смуги, яка відповідає смузі «100 кДа - Для відновлювальних умов 95 повнорозмірного АБ визначається як сума 95 необробленої інтенсивності смуг, які відповідають смугам 25-35 кДа і 55 кДа.
Протокол вимірювання активності зв'язування з мішенню аналізом Віасоге 3000
Підготовка зразків
З усіх зразків з проміжною концентрацією 1 мг/мл, описаних вище, для аналізу 5РЕК готували додаткове розбавлення 1/250, з отриманням кінцевої концентрації 4 мкг/мл. Це розбавлення 1/250 готували для всіх умов двома стадіями: а) 5 мкл (1 мг/мл) ж 120 мкл НВЗ-ЕР (буфер для
ОРЕ) і 5) додаткове 10-кратне розбавлення (15 мкля135 мкл НВ5-ЕР). Для кожного антитіла і кожної часової точки будували окрему калібрувальну криву, починаючи зі зразка, замороженого при -80 "С. Його аналізували разом зі зразками, використаними для випробування стабільності, для визначення нахилу кожної кривої після загального підбору стандартів. Ці нахили використовували для розрахунку процентної активності зразків в аналізі стабільності, встановивши контрольний зразок на 100 95.
Визначення 95 активності в аналізі Віасоге
Для визначення активності зв'язування з мішенню в Віасоге сенсорний чип СМ5 покривали комплексом людських ЗАКР-ТОЕ-В1Ї при 4000 КИ. Потік встановлювали на 30 мкл/хв. з режимом введення "Кіпіес!" і двома введенями для регенерації (1 мМ Масі, 2,5 мМ гліцин, рн 1,5) з 5-хв. інтервалом.
Метод проводили таким чином: - Відкривають криві в програмі ВІАЕМАГ. і вибирають значення "2-1" (1: пустий, 2: ПСАКР- такнг-В1) - Вибирають одну криву на час для накладення графіку - Видаляють частину кривої регенерації - Вибирають базову лінію безпосередньо перед введенням і трансформують вісь У на "нуль при медіані вибору". - Вибирають "Загальна підгонка", починаючи із 120 с. після введення і закінчують через 155
Коо) с. - Будують стандартну криву в Ехсеї і визначають нахил кривої для кожного антитіла - Ці значення перетворюють в процентну активність встановленням контрольного значення (зразок, який зберігається при -20 "С) на 100 95.
Протокол визначення концентрації білка
Для визначення вмісту білка для кожної умови зберігання використовували систему
МапоОгор, вимірюючи оптичну густину кожного зразка (2 мкл) при 280 нм. Контролем в системі служив РВ5Б, і визначення білка проводили вимірюванням оптичної густини при 280 нм кожного зразка в трьох повторах (проміжне розбавлення з 1 мг/мл). Всі значення, отримані при 280 нм, ділили на коефіцієнт 1,51. Вимірювання оптичної густини пустого зразка з РВ5 проводили після аналізу зразка для кожної окремої умови. Всі дані були представлені у вигляді середнього значення для трьох вимірювань для кожної умови зберігання. 2.2.1 Дослідження термостабільності
Для контролю стабільності антитіл у різних температурних умовах зберігання слідували наступній схемі:
Підготовка зразків птАБр: 1 мл тА (3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ), свіжоприготовлений вихідний розчин (з концентрацією 5 мг/мл), вміщували в скляні флакони зі скляною кришкою, що загвинчується, ємністю 2 мл і зберігали при 5 "С і 37 "С. Флакони відразу ж перевіряли на відсутність частинок.
Негативний контроль РВЗТмМ: аліквотні порції 1 мл профільтрованого РВ5 Дульбекко, що містить 0,02 905 Твіну 80 (Зідта), готували в скляних флаконах ємністю 2 мл і використовували як негативний контроль, позначений РВОТмМ/. Флакони відразу ж перевіряли на відсутність частинок.
Контроль з високою агрегацією: аліквотні порції 1 мл власного антитіла готували з численною видимою агрегацією у скляних флаконах ємністю 2 мл.
Контрольний зразок: для кожного антитіла аліквотні порції 60 мкл тАбБ готували в стерильних пробірках для ПЛР ємністю 500 мкл, маркували і зберігали при -20 "С.
На різні часові точки проби тАБ відбирали зі зразків, що відповідають умовам зберігання, і тестували таким чином: - Візуальний контроль (510) - ЗЕ-НРІС
- БО5Б-РАСЕ (у відновлювальних і невідновлювальних умовах) - афінність зв'язування з мішенню в аналізі ЗРК - концентрація білка
Візуальний контроль
Результати візуального контролю наведені в таблиці 19 нижче. Всі тАбБ знаходилися в
РВЗТмМ, що повинно надавати стабілізуючий ефект.
Таблиця 19
Результати візуального контролю зразків таб 3986-АМЕ, 3986-АХУЕ, 3986-АМК і 3986-АМА протягом 56-денного періоду в умовах зберігання при 5 "С і 37 "С 7777.7.7.ю р Їдобаб |добаї |доба7 |добаїт4 |доба28 |доба56
Зразок 0 фУмовизберіання5"С //777777111111111111111111Ї11
Контрольний зразок з високою) 0-0-С б-60-6 6б-0-р агрегацією 00000111 Щ|Умовизберіанняя37С 77777711
Контрольний зразок з високою) 0-0-С б-60-6 6б-0-б р-р-с агрегацією
Для умов зберігання при 5 "С середні оцінки для тАБ через 56 діб були наступними: 3986-АУЕ: "зразок прозорий, видимі частинки відсутні» 3986-АМЕ і 3986-АМК: "дуже мало частинок» 3986-АМЕ: "помірна наявність частинок".
Буфер РВЗТтМ був оцінений як "зразок прозорий, видимі частинки відсутні" при 5 "с, вказуючи на те, що частинки, що спостерігаються, зв'язані з білками.
Для умов зберігання при 37 "С середні оцінки для тАБ через 56 діб були наступними: 3986-АХМУЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ: "дуже мало частинок» 3986-АМЕ: "зразок прозорий, видимі частинки відсутні".
Буфер РВ5ТМ був оцінений як "зразок прозорий, видимі частинки відсутні" при 37 "С, вказуючи на те, що частинки, що спостерігаються, зв'язані з білками.
Аналіз з використанням ЗЕ-НРІ С
Агрегацію і фрагментацію білка вимірювали з допомогою ЗЕ-НРІ 0.
Результати агрегації білка для таб 3986-АМЕ, 3986-АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ, виміряні з допомогою ЗЕ-НРІ С, узагальнені в таблиці 20 нижче і показані на фіг. 5.
Зб
Таблиця 20 до утворення агрегатів, контрольоване ЗЕ-НРІ С, для тАБ 3986-АМЕ, 3986-АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМА нини п Я ПО ЛК Поля ПО Кт ПО 228 1777777711111117117100977777777711117Ї1711117171109 | 30 2 2щ( 01111110 Ї111111ло 228 17777777111111171171009777777777111171Ї111117171109 | 714 ни ши п Я ПО ПК По ПООО К ПО 228 17771111111111111710097777111111171Ї11111111109 1111111 561 7777777117117111097777777711Ї7117171717117109 | 07 2 щЩщф шили пи а я ПО Ох ПОЛЯ ПО М ПОЛЯ
При зберіганні при 5 "С не спостерігали змін 95 рівнів агрегатів для тАб 3986-АМЕ, 3986-
АМЕ і 3986-АМК протягом 56 діб. 95 Рівні агрегатів, що спостерігаються, були низькими в межах від 0,9 95 до 1,1 95. Незначне збільшення рівнів агрегатів спостерігали для тАр 3986-АМКЕ з 1,1
Фо до 1,4 95.
При зберіганні при 37 "С не спостерігали зміни 95 рівнів агрегатів для тАб 3986-АМЕ і 3986-
АМК. Для 3986-АМЕ спостерігали незначне збільшення з 1,1 95 на добу 0 до 1,5 95 на добу 56.
Для 3986-АМЕ збільшення 95 агрегатів спостерігали з 1,0 95 на добу 0 до 4,4 95 на добу 56.
Присутність піків фрагментів для тАр 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМК, як виміряно з допомогою 5Е-НРІ С, показаня в таблиці 21 і на фіг. 6. Оскільки піки фрагментації спостерігали тільки при зберіганні при 37 "С через 56 діб, то представлені тільки ці результати.
Таблиця 21
Фо утворення фрагментів, контрольоване аналізом ЗЕ-НРІ С для ттАБ 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ на 56 добу 77711177... | 3986-АМЕ-Процент фрагментації (95)заданимиааналізу ЗЕ-НРІС:Д/-:ЗУ 2561 111111110117111111111111011Ї11111111111103 71717777... 1 3986-АМЕ-Процент фрагментації(д5)заданимианалізу ЗЕ-НРІС: ДГ -:ХУ 2561 11111110117111111111101Ї111111111115 77111111. 1 3986-АМК-Процент фрагментації (95)заданимиааналізу ЗЕ-НРІС: Д/-:М/ 2561 1111111170117111111111111011Ї11111111111102г 7777777.7.7.юИ 1 3986-АМА Процент фрагментації (95)заданимианалізу ЗЕ-НРІС: ДЛ -Х 561 1777111171011111111711111111111101111117Ї11111111111103 1
Для тАб 3986-АМЕ, 3986-АМК ї 3986-АМЕК процент піків фрагментів становить від 0,2 95 до 0,3 95 через 56 діб, тоді як для тАб 3986-АМЕ процент піків фрагментів становить 5,7 95.
Результати 95 піку мономерів для всіх тАБб узагальнені в таблиці 22.
Таблиця 22
Площа мономерів (95), контрольована ексклюзійною хроматографією, для тА 3986-АМЕ, 3986-АМУЕ, 3986-АМК і 3986-АМА 01 3986-АМЕ - Процентна площа мономерів (95) за даними аналізу ЗЕ-НРІ С
І (доба) 770.1 .990 | ...юрюрюрюр 990 2 юЮющ | (9950 г ЖРрКЕБ 27717771 990 7 | ...юрюрюрюр 989 юЙюьи| 5 Юю 988 щ щ 77171477 17777171111990 |... 990 4... | ..ЮюЮюЮюЮюЮюИД978 щЩщ щЗизш/ 1 3986-АМЕ - Процентна площа мономерів (95) за даними аналізу ЗЕ-НРІ С
І (доба) 77770. 988 7 77777990 юю. | ...ЮюЮюЮюЮю990 4 щжяюкшШ 2277 17777111111990 |. .990 7... | ..ЮюЮюЮюЮюИ990 4 щжюжющя2ЕшКр 71771471 990 | ..юЮюрюрюр990 2 4юЮюжкю | (Б 989 щ ЖККНЖФ 777756 2 2 ЮщЩщ! щМ989 2 щЩ З ЇЇ щ щ-Р990 ЇЇ 938 Ж 1 3986-АМК - Процентна площа мономерів (95) за даними аналізу ЗЕ-НРІ С
І (доба) 770.1 .990 | ...юрюрюрю. 990 2 юЮющ | 9950 г З«Кб 777728. 77777991... 7.7. 990 юю. | ..ЮюЮюЙюИюжи989 2 щф: 1 3986-АМВ - Процентна площа мономерів (95) за даними аналізу ЗБЕ-НРІ С
І (доба) 777770. .990 юю. ЇЇ .ЮюЙл7/ 989 юю. | ..ЮюЮюЮюивВо сю 7777728... ..7.юрюрюрюД990 юю. ..ЮюЮюЮюИюИи990 2юЮюЮюЮюЮюЮюЮД|.ЮЙКИ71987 щ ЗЖ 56 2 ЮщЩщ| щММЖ9950 2 Ї (986 2 щЩ | 982
З0О5-РАСЕ
Результати аналізу 5ХО5-РАСЕ для всіх антитіл показані в таблиці 23 і на фіг. 8.
Таблиця 23
Загальний процент повнорозмірних АбБ/важкого ланцюга, виміряний аналізом 505-РАОЕ і скануванням Одузхзеу, для тАр 3986-АМЕ, 3986-АХУЕ, 3986-АМК і 3986-АМА 95 повнорозмірного 3986-АМЕ 11111111. |Невідновлювальніумови |Відновлювальніумови.//-:/ .0-77/С(К
Контрольний о о Контрольний о о досе) 770.1 772 | 744 | 967 2 щЩ | 966 195 повнорозмірного 3986-АХЕ
І (доба) оо ШУ | ве ие шин ве Теле зразок зразок 770. 742 | ---фЙ746 | 964 2 ЮщЩщ | 972
11111111 |Обповнорозмірною ЗОВВБАМК.ЛГЛ/:-/С/С/://:КРСССССССССССгггСгСгС2шС 11111111. |Невідновлювальніумови |Відновлювальніумови.//-:/ .0-77/С(К
Контрольний о о Контрольний о о 70. 747. | .-ю73 | 967 2 щ | 966 7728 | (08 | 7007 | 742 | 970 | 969 | 895 11111111 |Обповнорозмірною ЗОВВБАМАДГ/::.ССС/С:ОССС/С/С/С:/363ї./////////://////-/ НД.
УЗ | зх ие інн | верх зразок зразок 7770 | 762 2 щ | 765 2 щЩ | 9 | 969 7728 | 784 | 78.7 | 73,5 | 969 2 ющ | 961 | 849
Якої-небудь тенденції до деградації не спостерігали для жодного тАр для температурного режиму зберігання при 5 "С в аналізі, проведеному як у відновлювальних умовах, так і в невідновлювальних умовах.
При зберіганні при 37 "С всі тАБр показали однакову швидкість деградації в аналізі, проведеному в невідновлювальних умовах, за винятком таб 3986-АМЕ. Дане тАр показує схожу швидкість деградації до 28 діб, але демонструє більш високу швидкість деградації в період між 28 і 56 добами порівняно з іншими тАБ. У аналізі у відновлювальних умовах всі тАБр показують однакову швидкість деградації.
Афінність зв'язування з мішенню в аналізі Віасоге
Зразки тестували на їх активність зв'язування з мішенню в аналізі Віасоге вимірюванням нахилу на кожну часову точку. Контрольний зразок встановлювали на 100 95 активності.
Результати для всіх тАБ наведені в таблиці 24 і на фіг. 9.
Таблиця 24
Процентна активність в аналії Віасоге для таб 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМА 11111111 3986АМЕ-АктивністьваналізіВіасотеуу. -/:/:(////(у 77770... | лоб | 77777 99596 |. 995956 2 щ ЗКхЖ 11111111 3986АМУЕ-АктивністьваналізіВіасоте(9б). /-/:/0/::: 77770... лоб | 777777 93596 | 7 95596 щ-: 11111111 3986-АМК-АктивністьваналізіВіасоге(30у.д /-/:///е:/ 777770... лоб | 777777 збе 777777 1301961 11111111 3986-АМА-АктивністьваналізіВіасоге(90. -/::/( б 777770... | лоб | л1о0бо9 | 777 100,996...::щЩС
Для зразків тАб, що зберігалися при 37 "С, тільки антитіло 3986-АМЕ зберігало активність зв'язування з мішенню протягом усього 56-денного періоду. Всі інші антитіла демонстрували значне зниження активності зв'язування з мішенню протягом 56-денного періоду при зберіганні при 37 "С.
Концентрація білка
Концентрацію білка у всіх зразках вимірювали для кожної умови на приладі МапоЮОгор.
У таблиці 25 і на фіг. 10 показана виміряна концентрація білка для всіх тАб.
Таблиця 25
Концентрація білка (мг/мл) для тА 3986-АМЕ, 3986-АМУЕ, 3986-АМК і 3986-АМА 11111111 3986-АМЕ-Концентраціябілкаємуимлу.д//-:/ /( б |/ нини ши п я ПО ЛЕТ пох ПО ЛК» ПО 11111171 3986-АМЕ-Концентраціябілкає(мимлу.д -/-:/ ГО ши пи а КС Я ПО ПИТ пох ПО Кт ПО 11111171 3986-АМК-Концентраціябілкає(мимлуїд//-/:/ г ши ши а я ПО т ПОЛ ПО их НОЯ 11111111. 3986АМА-Концентраціябілкаємимлуїд -/-:/ ее ши пи а КС Я ПО ПИТ ПО НО Кт ПО
Резюме і висновок за результатами дослідження термостабільності
Дослідження термостабільності виявило деякі істотні відмінності між чотирма тестованими таАб: агрегацію на рівні 4,4 95 спостерігали в аналізі ЗЕ-НРІ С для тАр 3986-АМЕ через 56 діб при зберіганні при 37 "С і фрагментацію на рівні 5,7 95 для тАб 3986-АМЕ. Однак ця фрагментація для тАр 3986-АЖЕ не впливала на активність зв'язування з мішенню при зберіганні при 37 "С в аналізі Віасоге; через 56 діб цей показник все ще був таким же сприятливим, як у контрольного зразка. Тим часом, більш низьку активність зв'язування з мішенню для тА 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМЕ. була чітко видно при зберіганні при 37 "С через 56 діб. 2.2.2 Дослідження стабільності при замерзанні-розморожуванні
Для контролю стабільності антитіл в умовах заморожування-розморожування дизайн досвіду був наступним. Аліквотну порцію тАБб 1 мл (з концентрацією 5 мг/мл) заморожували щонайменше на 6 год. при -20 "С і розморожували протягом 1 год. при кімнатній температурі.
Цей цикл повторювали 9 разів (всього 10 циклів заморожування-розморожування). Зразки аналізували візуальним контролем, 5Е-НРІ С, 505-РАСЕ, оцінювали активність зв'язування з мішенню в аналізі Віасоге і визначали концентрацію білка. Контрольні зразки, що зберігалися при -20 "С, використовували для всіх аналізів паралельно. Оскільки тАб 3986-АМЕК і 3986-АМК мають можливий сайт дезамідування, то вони піддавалися аналізу тільки візуальним контролем.
Візуальний контроль
Результати візуального контролю в дослідженні стабільності при заморожуванні-
Зо розморожуванні наведені в таблиці 26. Всі тАбБ знаходилися в РВ5ТМ, що повинно було надавати стабілізуючий ефект.
Таблиця 26
Візуальний контроль в оцінці стабільності при заморожуванні-розморожуванні для ітАБ 3986-АМЕ, 3986-АУЕ, 3986-АМК і 3986-АМ нІ;ЬНІННННОГЛИЛИИООТТТ 1ох т
Зразок 3986-АМЕ 3986-АМЕ В-А-В 3986-АМК А-ВІ-ВІ 3986-АМА
Контроль з високою агрегацією
РВЗ ГУ В-АТ-ВІ
Середні оцінки для тАб були наступними: 3986-АМЕ, 3986-АМЕ і 398-АМК: "дуже мало частинок"; і 3986-АМЕ: "зразок прозорий, видимі частинки відсутні".
Буфер РВ5Тм був оцінений двома експертами як "дуже мало частинок", і, отже, частинки, видимі в зразках 3986-АМЕ, 3986-АМЕ і 398-АМК, можуть бути не зв'язані з білками. Можна зробити висновок, що всі тАБб залишалися без змін після 10 циклів заморожування- розморожування.
Аналіз з допомогою 5Е-НРІ С
Агрегацію і фрагментацію білка вимірювали з допомогою ЗЕ-НРІ 0.
Результати за оцінкою агрегації білка в дослідженні стабільності при заморожуванні- розморожуванні для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ узагальнені в таблиці 27.
Таблиця 27
Фо утворення агрегатів, контрольоване ексклюзійною хроматографією, в оцінці стабільності при заморожуванні-розморожуванні для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ в 3986-АМЕ 3986-АМЕ 10х ЕТ 1ох ЕТ 1 то1111ї171о1111111107777 17111082
Якої-небудь зміни процентних рівнів агрегатів не спостерігали для тАбБ після 10 циклів заморожування-розморожування порівняно з контрольними зразками.
Площі піку мономерів для всіх різних інжектувань також були досліджені. Результати 95 площі мономерів для тАб 3986-АМЕ і 3986-АХУЕ узагальнені в таблиці 28.
Таблиця 28 до площа мономерів, контрольована ексклюзійною хроматографією, в оцінці стабільності при заморожуванні-розморожуванні для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ в 3986-АМЕ 3986-АМЕ 10х ЕТ 1ох ЕТ 11777111 990111117171111990 | ..юЮюйяо|в
Яких-небудь змін в 95 площі мономерів не спостерігали для обох тАбБ після 10 циклів заморожування-розморожування порівняно з контрольними зразками.
Аналіз електрофорезом 505-РАСЕ
Зразки для оцінки стабільності при заморожуванні-розморожуванні аналізували на цілісність з використанням електрофорезу 5О5-РАСЕ в невідновлювальних і відновлювальних умовах.
Результати показані в таблиці 29 і на фіг. 11 для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМУЕ.
Таблиця 29
Загальний процент повнорозмірних АбБ/важкого ланцюга, оцінений аналізом 505-РАОЕ і скануванням Одуззеу в дослідженні стабільності при заморожуванні-розморожуванні для тАб 3986-АМЕ і 3986-АХЕ 11111111 ФОбповнорозмірногоЗ9ВБ-АМЕ З: ///:/ОСССС/С/С:(//:Х (ССС: 11111111 |Невідновлювальнумови (|Відновлювальніумови./-/-:///;/Н/А8//:(ЕЕ ви ї1111793 | рю 959.4юЮюЮжЮ | 96 11111111 ФОбповнорозмірногоЗ9ВБ-АУЕ.ДГ/::/:2ССССССС7777ССсСшС 11111111 |Невідновлювальнумови (|Відновлювальніумови./-/-:///;/Н/А8//:(ЕЕ 77111788 11117877. | 77771963 1797002
Яких-небудь змін не спостерігали для обох тАбБ після 10 циклів заморожування- розморожування.
Аналіз зв'язування з мішенню з використанням Віасоге
Зразки тестували на їх активність зв'язування з мішенню в Віасоге вимірюванням нахилу після 10 циклів заморожування-розморожування. Контрольний зразок приймали за 100 95 активність. Результати для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ показані на фіг. 12.
Результати показують, що після 10 циклів заморожування-розморожування зміни активності зв'язування з мішенню не спостерігали.
Аналіз концентрації білка
Концентрацію білка в зразках, призначених для аналізу стабільності при заморожуванні- розморожуванні, вимірювали на приладі МапоОгор.
У таблиці 30 показана виміряна концентрація білка для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ після 10 циклів заморожування-розморожування. Крім того, на фіг. 13 показані ці результати в графічній формі для обох ітАБ.
Таблиця 30
Концентрація білка (мг/мл) при оцінці стабільності до заморожування-розморожування для таб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ 11771111 39В6АМЕ 7/7 | 77777777 3986 АУЕ С ши п я По ТОЛЯ ПО ЛК пох НО А НОЯ
Висновок
Дослідження стабільності при заморожуванні-розморожуванні не виявило яких-небудь істотних відмінностей для тестованих таб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ. 2.2.3 Дослідження термостабільності
Для аналізу кривих плавлення тАБ нагрівали по схемі, наведеній нижче. Після завершення термічного циклу в приладі для ПЛР зразки тестували на афінність з використанням аналізу
Віасоге.
Протокол, що використовується, був наступним: 1) Аліквотні порції по 1 мл кожного тАб зберігали в скляних флаконах при -20 "С на початку дослідження 2) Після одного тижня зберігання їх розморожували один раз 3) тАБб розбавляли до 1 мг/мл як звичайно, і потім додатково розбавляли до 100 мкг/мл (10- кратне розбавлення: 200 мкля1800 мкл РВЗТМ/) 4) Розбавлені тАб вносили в планшет для ПЛР (з розрахунку 50 мкл/ямку) 5) Витримували достатню кількість зразка і також зразка при 5"С як контролю для паралельного аналізу б) 1 год. в приладі для ПЛР при температурі, вказаній нижче 7) 2 год. в приладі для ПЛР при 25 7С 8) При 4 "С в приладі ПЛР 9) Готували зразки і контролі для аналізу при 4 мкг/мл (25х розбавлення: 168 мкл буферу
Віасоген7 мкл зразка).
Запускають наступну програму в приладі для градієнтної ПЛР: 0 | температуракришки.ї/// | -:( 80777711 111111111111111111111ссю 0 ЇСтадя!, 77777777 71111 546-714"С 017 бохв. | 4 0 ЇСтадя?о//////77777777777771 71171711 25С11111111171112охв. | 01 0 ЇСтадя3,//////77777777777777/|77171717171711714С1111111лопауза.7/7/7/7/ | /////: нин Я ПО ПО
Протокол аналізу Віасоге: - Використовували той же біосенсорний чип СМ5, покритий комплексом людських ЗАКР- тТакнг-В при - 4000 КО - Відкривали криві в програмі оцінки ВІАЕ і вибирали значення "2-1" (1: пустий, 2: ПОАКР- такв-р) - Вибирали одну криву на кожний час для накладення графіку - Видаляли частину кривої регенерації - Вибирали базову лінію безпосередньо перед введенням і змінювали вісь У на "нуль при медіані вибору» - Вибирали "Загальна підгонка", починаючи із 120 с. після введення і закінчуючи через 155 с. - Для розрахунку ІСво: нахил для контролів 5 "С вирівнювали на 100 95. Можна було розрахувати процент (вісь У) інших температур (вісь Х).
Оцінювали термостабільність чотирьох тАб, і результати узагальнені на фіг. 14.
Температуру плавлення розраховували як температуру, при якій 50 95 антитіла все ще функціонує. Контрольні зразки, що зберігалися при 5 "С, приймали за 100 95 активність.
Температури плавлення наведені в таблиці 31.
Таблиця 31
Температура плавлення в дослідженні термостабільності
МАБ 3986-АМК і 3986-АМК показали найвищі температури плавлення: 69,13 "С і 68,5570 відповідно. МАЮ 3986-АМЕ і 3986-АУЕ також дали сприятливі температури плавлення, 66,99 С і 66,53 "С відповідно. Всі температури плавлення для всіх тАр можна вважати високими.
Висновок з дослідження термостабільності
Чотири МАБ демонстрували хорошу термостабільність. Температури плавлення були порівнянні з вихідним тАб 3986-А в попередньому дослідженні стабільності, 66,8 "С. 2.2.4 Дослідження ротаційної стабільності
Для дослідження ротаційної стабільності протокол був наступним. Аліквотні порції по 1 мл
Зо кожного тАбр зберігали в скляних флаконах при -20 "С на початку дослідження. Після одного тижня зберігання аліквоти розморожували один раз і обертали зверху зі швидкістю 15 об./хв. при кімнатній температурі.
Зразки оцінювали на наявність частинок на вказані часові точки: - Години: 0, 3, 6, 24, 30, 48, 54, 72 і 96
Зразки також аналізували через 96 год. з використанням ЗЕ-НРІ С, 505-РАСЕ, аналізу активності зв'язування з мішенню в Віасоге і визначення концентрації білка. Контрольні зразки, що зберігалися при -20 "С, використовували для всіх аналізів паралельно. Оскільки тАб 3986-
АМЕ і 3986-АМК все ще мають можливий сайт дезамідування, то їх оцінювали тільки візуальним контролем.
Візуальний контроль
Результати візуального контролю в дослідженні ротаційної стабільності наведені в таблиці 32. Всі тАб знаходилися в РВ5ОТм/, що повинно було надавати стабілізуючий ефект.
Таблиця 32
Результати візуального контролю в дослідженні ротаційної стабільності тАр 3986-АМЕ, 3986-АМЕ, 3986-АМК і 3986-АМА 7.7.7. | Огод. | Згод. | бгод. | 24 год. | Зогод. | 48 год. | 54 год. | 72 год. | 96 год.
Зразок | 77777777 3986-АМЕ | АВ-ВІ | А-В-ВІ |А-В-Ви |АгСІ-СТ|АРВІ-СТ |АВ-ВІ |8-В-ВІ І8-В-В: |В-В-ВІ 3986-АМЕ | А-ВІ-ВІ | АТ-ВІ-ВІ | АГ-ВІ-ВІ | АГ-ВІ-ВІ | АРВІ-В | АВІ-В | АРЄВІ-ВІВ-ВІ-ВІ | В-ВІ-ВІ 3986-АМК |А-ВІ-С |АГ-ВІ-ВІ | А-ВІ-ВІ | АВІ-ВІ | АВІ-ВІ |АВІ-В | В-ВІ-СІ |В-ВІ-СЇ | В-ВІ-СЇ 3986-АМА |АГ-ВІ-ВІ | А-ВІ-ВІ | АТ-ВІ-ВІ | АТ-ВІ-ВІ | АВІ-ВІ | АРВІ-ВІ | АВІ-ВІ | А-ВІ-ВІ | АВІ-ВІ
Контроль з високою б-в-б І6-0-0 16-00 І10б-0ООгІб-ОоОг 1-0 ОЄ 16-01 0-00 10-00 агрегацією
РВЗТМ
Було встановлено, що всі тАр мають середню оцінку "дуже мало частинок", тому вони залишаються відносно інтактними після 96 год. обертання. Буфер РВЗТМ не містив ніяких частинок при жодній з експериментальних умов. Це вказує на те, що оцінка, що спостерігається, "дуже мало частинок" зв'язана з білками в зразках антитіл.
Аналіз ЗЕ-НРІ С
Агрегацію і фрагментацію білка вимірювали з допомогою ЗЕ-НРІ С. Результати оцінки агрегації білка в дослідженні ротаційної стабільності тар 3986-АМЕ і 3986-АУЕ наведені в таблиці 33.
Таблиця 33 до утворення агрегатів, контрольоване ексклюзійною хроматографією, в дослідженні ротаційної стабільності тАр 3986-АМЕ і 3986-АМЕ вн 3986-АМЕ 3986-АМЕ - Контрольний нинннІИ а Е Я ПО ПО ПО ЛК ПО
Яких-небудь змін у 95 рівнях агрегатів не спостерігали для тАбБ після ротаційного напруження порівняно з контрольними зразками.
Площі піку мономерів для всіх різних інжектувань також були досліджені. Результати по 95 площі мономерів для тАб 3986-АМЕ і 3986-АУЕ показані в таблиці 34.
Таблиця 34 до площа мономерів, контрольована ексклюзійною хроматографією, в дослідженні ротаційної стабільності тАр 3986-АМЕ і 3986-АМЕ вн 3986-АМЕ 3986-АМЕ - Контрольний нини ХВ ПО: ЕК ПО: СЯ Пооя ПО: ТК по
Якої-небудь зміни в 96 площі мономерів не спостерігали для тАБб після 96 год. обертання порівняно з контрольними зразками.
Для обох антитіл не спостерігали зміни профілю 5Е-НРІ С після 96 год. обертання порівняно з контрольними зразками.
Аналіз електрофорезом 505-РАСЕ
Зразки, що піддавалися обертанню, аналізували на їх цілісність електрофорезом 5О5-РАСЕ у невідновлювальних і відновлювальних умовах. Результати узагальнені в таблиці 35 для тАр 3986-АМЕ і 3986-АМЕ.
Таблиця 35
Загальний процент повнорозмірних АбБ/важкого ланцюга, оцінений аналізом 505-РАОЕ і скануванням Одуззеу в дослідженні ротаційної стабільності, для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ зразок зразок 11111111 ФОбповнорозмірногоЗ9ВБ-АУЕ.ДГ/::/:К2пССССССС77ССсСшС 11111111 |Невідновлювальнумови |Відновлювальніумови.//-/:|/;/Н8./С/З(КС зразок зразок 1111101 77111и7бе|771711179077 | 7771915 2 щЩщ | 926 2 (з/
Гелі 520О5-РАСЕ для обох тАБбБ після 96 год. обертання представлені на фіг. 15.
Яких-небудь змін не спостерігали для жодного антитіла після 96 год. обертання.
Аналіз зв'язування з мішенню в Віасоге
Зразки тестували на їх активність зв'язування з мішенню в аналізі Віасоге вимірюванням нахилу після 96 год. обертання. Контрольний зразок встановлювали на 100 95 активності.
Результати для тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ показані на фіг. 16.
Аналіз концентрації білка
Концентрацію білка в зразках, що піддавали обертанню, вимірювали на приладі МапоЮгор.
У таблиці 36 показана виміряна концентрація білка для тАр 3986-АМЕ і 3986-АМЕ після 96 год. обертання. Крім того, на фіг. 17 показане графічне представлення цих результатів для обох тА.
Таблиця 36
Концентрація білка (мг/мл) в дослідженні ротаційної стабільності тАб 3986-АМЕ і 3986-АМЕ 11111011 83986АУМЕ 7 | 3986 АУЕ З Ф зразок зразок нини а Кс я о х ПОЯ ПОЛ ЛА Я ПО их НОЯ
Втрати білка не спостерігали для обох тАБб після 96 год. обертання.
Висновок за результатами дослідження ротаційної стабільності
Дослідження ротаційної стабільності не виявило відмінностей між тестованими тАб 3986-
АМЕ і 3986-АМЕ. 2.2.5 Аналіз первинної послідовності за допомогою пептидного картування
Зразки з дослідження термостабільності, стабільності при заморожуванні-розморожуванні і ротаційній стабільності аналізували з використанням методології КР-НРІ С-ОУ-М5 для триптичного пептидного картування з метою виявлення модифікацій (дезамідування, ізомеризації і окислення) на рівні білка (пептиду).
Дезамідування в СОМКЗ важкому ланцюгу в положеннях 95-96 (амінокислоти МЕ) було сконструйовано в тАБ 3986-АМЕ і 3986-АУЕ мутацією положення МУ5. Даний сайт дезамінування, як і раніше, присутній в тар 3986-АМК і 3986-АМК, і значне дезамідування/зомеризацію виявляли через 28 діб при зберіганні при 5 "С і 37 "С в дослідженні термостабільності, а також в дослідженні стабільності при заморожуванні-розморожуванні і ротаційній стабільності. Був зроблений висновок, що дезамідування неможливо попереджати введенням об'ємних позитивно заряджених залишків даунстрім від МО5.
У положенні 1007 СОКЗ важкого ланцюга знаходиться метіонін, який необхідний для забезпечення високої афінності зв'язування. Дослідження термостабільності, стабільності при заморожуванні-розморожуванні і ротаційній стабільності показали, що окислення МІО0ї не відбувається в тАб 3986-АМЕ і 3986-АМК, в той час як окислення все ще спостерігається для тАр 3986-АМЕ і 3986-АМК. Це свідчить про те, що амінокислоти в положеннях 95 і 96 впливають на чутливість до окислення даунстрім метіоніну. У таблиці 37 представлений огляд рівнів окислення і дезамідування пептидів, що покривають СОКЗ важкого ланцюга, які були отримані триптичним розщеплення.
Таблиця 37
Ступінь окислення і дезамідування пептидів у СОКЗ важкого ланцюга 111111 Окислення), |Дезамідуванняб)їд7/ 1 5"С | 37С |Ротаційна |Заморожування-| 5"С 37"с Ротаційна | Заморожування- доба | доба | стабільність | розморожування) доба сутки28 стабільність | розморожування 28 28 96 год. 10х 28 96 год. 10х 39в6-АМЕЇ 1,08 |т10,51| ї58 | 347 |0| 0 0 0 3986-АУЕ|Нижче межі кількісного визначення (00). | 0 | 0 1ЮБ и 0 / 0 " Нижче межі кількісного визначення (І СО) - інтенсивність окисленої форми близька до фонового значення
Відносний рівень дезамідування і ізомеризації МО95, а також відносна активність зв'язування варіантів, що зберігалися при 37 "С, представлені на фіг. 18. Також на фіг. 18 показане вихідне антитіло 3986-А (позначене 3986-АМЕ). Оскільки МО5 був мутований в тАр 3986-АМЕ і 3986-
АХУЕ, то рівні дезамідування і ізомеризації дорівнюють нулю і тому не були включені в аналіз.
Кореляція між дезамідуванням МУ5 і більш низькою активністю зв'язування з мішенню, що спостерігається, для тАб 3986-АМК і 3986-АМЕК, дозволяє передбачити, що дезамідування МУ5 негативно впливає на зв'язування ІтАб з його мішенню.
Висновок
Варіант анти-СЧАВР-ТИаБ-В1-антитіла 3986-АМЕ є особливо сприятливим антитілом до
САВР-ТаЕ-В1 для клінічної розробки, тому що воно: - зберігає високу афінність зв'язування з його мішенню, комплексом ЗАКР-ТИаБ-В1; - показує хорошу активність в аналізі фосфорилування 5МАО2; - не піддається дезамідуванню або ізомеризації в СОКЗ; - не піддається окисленню в СОКЗ; - показує високу гомологію з людини (95 95); - показує підвищену стабільність порівняно з 3986-А, оцінену в різних аналізах стабільності.
Послідовності СОК і варіабельної ділянки для 3986-АМЕ наведені в таблицях 38 і 39 нижче.
Послідовності повнорозмірного важкого ланцюга і легкого ланцюга показані в таблиці 40.
Полінуклеотидні послідовності, що кодують ділянки МН і МІ, а також повнорозмірні важкий і легкий ланцюги показані в таблиці 41.
Таблиця 38
Послідовності СОМ МН і МІ в 3986-АМЕ о З9ВБАУЕ | 77777771 ЇЇ. |15ЕОЮМ СС 77111111 |сов2 /////////// |ВІОРЕСАСТКУАОКРОЯЇЇГ/З/ | -:/../о712//:УС" 77777.7.7юИ |сов3 0 ЇМЕМЕТУУММОСІМУЄУЕМЇГ | 7777/3711
М 7111 |1сові ФОАБОБІЗМА ГГ //ЗОЇ 7777779 С 77111711 |1сбов2 7 |бАБ5ВІКТЇГ/Г//// |Ї777777717111ло1С 77111111 |сов3 777 ФЇООХАБУРМТЇГ/Г/:// С |.
Таблиця 39
Послідовності УН і МІ. в 3986-АМЕ 39в6 вро
АХЕ МО:
ОМОЇ МОРОАЕУМАКРОАБУКУЗСКАЗаТМвЕТЗУМ ОМ ОА РООСІ ЕМ М
МН. | аКІОРЕСАДаТКМАОКРООАУТМТАОТОТОТУУМЕЇ 551 АБЕОТАУМУМСАНХЕ 14
МЕТУУМООІ МУХЕМЕМУ СЮСТІ МТУ55
М. ВІОМТО5РБОБІ БАБМАОНКМТІТ СОАБО 15 5ІБЗМЖ АММООКРООАРКІМ САВАН КТаУРЗАЕЗОБЗОБОаТОЕТІТІЗОІЕРЕСААТУМСООМАБУРМТРООСТКМЕЇКІ
Таблиця 40
Послідовності важкого і легкого ланцюга в 3986-АХЕ
ОМОГ МОРОАДЕМАКРОАБУКУЗСКАБаТмМ КЕТ5У МОМ УКОАРОСаГЕММОНКІЮ
РЕВБАаТКУАОКРОСАМТМТАОТОТОТУММЕЇ 55І В5БЕОТАУУМСАНКНХУ ЕМ ЕТУММ
СО МУЕМЕУМ ВОСТІ МТГТМ55АБТКОРБОУМЕРІ АРСЗАОБТ5ЗЕБТААЇ ОСІ МКОМЕР
Важкий ЕРМТУБУ/МЗОАЇ Т5аМНТЕРАМІ 05501 51 55БУМТУРЗББІІЯТКТИТСММОНКР 16 ланцюг ЗМТКМОКАМЕЗКМОРРОРРОСРАРЕНБІ СаРБЗМБЕЇ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММО
М5ОБОРЕМОЕМУУУВОаМЕМНМАКТКРАЕЄОЄМЗТМ ВУМБМІ ТМ НОМ МОКЕМК
СКУБМКаї РОБІЕКТІЗКАКООРВЕРОММТІ РРЗОБЕМТКМОМ5І ТС МКОЕМРБОІАМ
ЕМЕЗМООРЕММУКТТРРМІ ОБООЗЕБМЗАСТМОКЗАМОБаММЕЗСОММНЕАЇ НМНУТОКБІ. 51 5І Сі
ВІОМТО5РББІ БАБМООАМТІТСОАБОБІЗОЗМІ АММООКРООАРКІ МОАБНІ КТ
Легкий СМРОНЕЗОаБавзатоЕТІ ТЗІ ЕРЕСААТУУСООМАБУРУТЕООСТКУБІКАТМААР 17 ланцюг ЗМЕІЕРРБОЕОЇ КЗаТтТАБУМСТ І ММЕМРАЕЕАКМОМ/КМОМАГ О5БаМБОЕВМТЕООБКО
ЗГУ5І 557 ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕМУТНОІ 55Р УТКЗЕМНОЕС
Таблиця 41
Полінуклеотидні послідовності, які кодують 3986-АМЕ 5ЕО
Іо
МО:
СААОТОСААСТТОТОСААСОООСОССОсСААОТОСОС
ААОССОООСОССАССОТОАААСТОСТООТОСАА вОСАТСООСАТАССОАТТСАСАТСАТАТТАСАТСО
АСТОВОТСАСОСААОСОССОСОССААОСОСТОСА
АТОСАТООООСОСАТСОАСССОСАСОАТОССОООА
Ун СОАААТАТаСОаСАААААТТОСААСааСасСОаТсСА 18
СОАТОАСОСССОАСАСАТОСАСОАССАССОТАТ
АСОТООАССТОАОСТСОСТОАООАОСОАССАСАССО
СООТАТАСТАСТОСОСОСОАТАСОААТООСАСАССО
ТОСОТСОТСОСОСАССТОАТОТАСОААТАССААТАСТ
ООБОССААСССАСОСТТатсАСООТСТоОАОС
САСАТОСАСАТОАСТСАСАССОСТТОСАСОСТОА
ОСОССТОТОТОООАСАТАСАСТСАССАТСАСАТ
М СССАСОСТАОТСАСТСААТТТСТАОТТАССТООСАТОСТАТСАОСАСААОССТООССАСОСАССТАДА 19
АТОССТОАТСТАСОСАСССАСТАСОСТОААСАСАСОСОТОССАТСТОООТТСТОСОССАССОСАТСТОО
САСАТОСТТТАСТСТОАССАТСТОСАТОССТОСАаССАСААСАСаССОасСтАСАТАСТАТТОТСАаСА,аТАТ
ОСТТОСОТОСССатСАСАТТООСТСАОООСАСТААОСТСОАСАТСААО
СААОТОСААСТ ТТОСААСООСОСОСОбААОТОСОСААОССО ОО ОСОАОСО ТОАААОТОТОО ОСА
АСОСАТОООСАТАССОАТТСАСАТСАТАТТАСАТОСАСТООСТСАСОСААССОССОООССААССОСТОО
ААТОСАТООСОСОБАТООАСССООАОСАТОСОООБАСОАААТАТОСОСАААААТТОСААССОСОСОТСА
СОАТОАСОССОСОАСАСАТООАСОАССАСООТАТАССТОСАССТОАОСТСОСТОАОСАОСОАОСАСАССО
СООТАТАСТАСТОСОСОСОАТАСОААТООСАСАССОТСОТСОСТСОСОСАССТОАТОТАСОААТАСОААТАСТ
СОООССААССОАСОСТТОТСАСООТСТОСОАОСОСТАОСАССААСОСССССТоСОотаттосссстососостт
ОСТОССООТССАССТОСОАСТСТАССОССОСТСТОООСТОССТООТОАААСАСТАСТТОСССОАОССТаТОАСо
СТОАОСТОСААСТОТОССОСССТОАССТОСОССОТОаСАСАССТТОССТОССОТОСТОСААТОСТОСООССТОТА
Важкий СТОССТатостосатоотоАсСАСТОСОСТоСТоСАСССТОСОСАССААСАССТАСАССТОТААССТОСАССАСАА панцюг| ОССТОСААСАССААСОТОСАСААОСОСО ТОСААТСТАААТАСОСОССТоССТОСоСоСоСТаСоСТОССостоА 2о
ЧЮГ| АТТТСТОСОСОСАССТТОСОТОТТТСТОТТоСССССАААОСССААОСАСАСССТОАТОАТСТСССОСАСССССОААС
ТОАССТОСаТООТООТОбАСОТОТСССАСОАДАСАТССАСАССТОСАСТТСААСТООТАТОТТОАСООСОТОСААОТО
САСААСОССААСАССААОСССАСАСАСОААСАСТТСААСТОСАССТАССОСОСТОСТОТОСОТОСТОАССОТОСТОСА
ССАОСАСТОССТОАДАСООСАААСАСТАСААСТОСААСОТО ТССААСААОСОССТОСССТОСАССАТОССААААСАССА
ТСТОСААСОССААОСОССАСССССОСОАСССССАССТОТАСАСОСТОСССССТАСССАСОААСАСАТОАССААСААС
САСОТОТООСТОАССТОТСТООТОАААСОСТТСТАССОСТОСОАСАТТОССОТОСААТОООАОТОСААСООССАОСОСО
АСААСААСТАСААСАССАССССОССТО ТОСТОСАСТОСОАСООСТОСТТСТТОСТОТАСТСТОООСТОАСАСТОСАТААОТ
СООООТООСАОСААСССААСОТОСТ ТСТОСТОСАОСОТОАТОСАСОАООСОСТОа
САСААССАСТАТАСССАСААСТОССТатосстТоАосставас
САСАТОСАСАТОАСТСАСАССОСТ ТОСАВОСТОАОСОССТОТО ГО ОСАСАТАСАСТСАССАТСАСАТОССАСОСТ
АаТСАаТСААТТТСТАСТТАССтТООСАТОСТАТСА,САВААХаССтТааосСАсаОаСАССТААААТОСТОАТСТАСОСАСаС
САСТАСОСТОААСАСАСООСТОССАТСТООСТТОТООООСАОСОСАТСТОСОАСАТОСТТТАСТСТОАССАТСТСАТ
Легкий | СОСТОСАСССАСААСАССССОСТАСАТАСТАТТОТСАССАОТАТОСТТОСОТОССОСТСАСАТТОСОТСАСОССАСТ панцюг| ААОСТООАСАТСААССОТАССОТоОСОСООССТТоТататтсАТТТТОСССОСАТСТОАТСААСАОСТОАААТСТОСО 21
ЧОГ дстасттстатастстТатстостОААСААСТТСТАСССТАСАСАСОССАААСТОССАСТОСАААСТОСАСААТОСТСТОС
АСАСТОСОСААТТОССАСОААТСТОТСАСТОАОСАСОАСТСТААОСАТАССАСАТАСТООСТОТОСТСТАСТСТОАСАСТО
АССААСпОаСТаАТТАСОАСАААСАСАААСТаТАСаССтТатаААСТСАСАСАТСАСОСО,аСТатстАатстаТаАССАААТ
ССТТСААТАСОСОАСАСТОС
Приклад 3. Випробування партій 3986-АМЕ (АНах-115)
Дослідну партію лікарської субстанції АКОХ-115 випробовували на стабільність протягом тримісячного періоду. Випробувані зразки дослідної партії лікарської субстанції зберігали в призначених умовах зберігання при -70 "С, в умовах "прискореного старіння" при 5 "Сів стресових умовах зберігання при 25"С. Дослідна партія лікарської субстанції була формульована в наступному складі: 10 мМ гістидин/гістидину гідрохлорид, 200 мМ сахарози, 40
ММ аргініну, 0,03 95 (мас./об.) полісорбату 80 при рн 6,0 і концентрації білка 20,0:22,0 мг/мл.
Було підтверджено, що дослідна партія лікарської субстанції АКОХ-115 є стабільною протягом трьох місяців при зберіганні в призначених умовах зберігання при -70 "С. Активність зв'язування в аналізі ФХРЕ також визначали як показник стабільності. Активність зв'язування виражали в процентах від активності зв'язування контрольного зразка, який зберігали при - 7076.
Результати показані в таблиці 42 нижче.
Таблиця 42
Метод Зразки Результати
ЗМ 101 96
АВаХ115 Віасоге ТЗзмМ-707С 106 Фо
ТЗМа257с 107 965
Ці результати підтверджують, що АКОХ-115 стабільне протягом тривалого періоду зберігання.
Приклад 4. Характеристика зв'язування АКОХ-115 з комплексом ЗАКР-ТОаг-р 4.1. Зрілий ТОЕ-ВД, необхідний для зв'язування з АКОХ-115
У природі комплекс ЗАКР-ТИБ-В (ЗАКР у комплексі з латентним ТОЕ-В) утворюється в ендоплазматичному ретикулумі за допомогою ковалентних цистеїнових взаємодій (дисульфідних містків) між САКР і латентним ТИБ-В. Цей комплекс потім розташовується на клітинній поверхні. іп мйго комплекс ЗАКР-ТИБЕ-В може бути утворений з рекомбінантного людського ЗАКР і рекомбінантного латентного ТОаБ-В (С335)-Зхвігер-ауд людини. Мутантна форма С335 латентного ТОБ-В не утворює ковалентних взаємодій з САКР (або будь-яким з латентних Таг-Д-зв'язувальних білків (І ТВР)), подібних присутнім в нативному комплексі.
Для демонстрації зв'язування АКОХ-115 з утвореним іп міго комплексом рекомбінантного
САКР і рекомбінантного латентного ТОаБ-В (С335) планшет для ЕЇІЗА покривали рекомбінантним САКР (1 мкг/мл людського САКР О/М при 4 С), блокували з використанням блокуючого агента (казеїн-?В5) і латентний ТОИБ-В (5 мкг/мл протягом 1 год. при кімнатній температурі) захоплювали покритим ЗАКР. Для АКОХ-115 і антитіла контрольного ізотипу (1 мкг/мл протягом 1 год. при кімнатній температурі) забезпечували можливість зв'язуватися з комплексом і визначали з допомогою НЕР-кон'югованого антилюдського дО. Як показано на фіг. 19, АКОХ-115 зв'язувався з комплексом СЗАКР-латентний ТОБ-В (С335), тоді як для контрольного ізотипу таке зв'язування було відсутнє.
Також було встановлено, що аналіз "працює" в зворотному порядку. Планшет для ЕГІ5А покривали АКОХ-115 або антитілом контрольного ізотипу (1 мкг/мл при 4 С) і блокували з використанням блокуючого агента (казеїн-РВ5). Рекомбінантний САРКР (5 мкг/мл) захоплювався покритим антитілом АКОХ-115, планшет відмивали, і рекомбінантний латентний ТИБ-В (С335)-
Зхвігер-їад (5 мкг/мл) захоплювався і детектувався з допомогою стрептавідину-НЕР. Активність
НКР детектували тільки в присутності АКОХ-115, але не в ямках планшета, покритого контрольним ізотипом.
Для тестування зв'язування АКОХ-115 з комплексом САКР і латентно-асоційованого пептиду (ГАР) ТОаЕ-В був утворений комплекс між рекомбінантним САКР і рекомбінантним ГГ АР.
Зо Планшет для ЕГІБА покривали рекомбінантним САКР (1 мкг/мл О/М 4 "С), блокували з використанням блокуючого агента (казеїн-?РВ5), і ГАР (5 мкг/мл) захоплювали на покритому рекомбінантним (ЗАКР. Зв'язування ГАР детектували з використанням анти-ІАР-НАР.
Зв'язування анти-Ї АР-НКР показувало, що комплекс ЗАКР-ГАР дійсно утворюється іп міїго.
АВахХ-115, однак, не виявило якого-небудь зв'язування з комплексом САКР-І АР. Крім того, коли планшет для БЕЇГІЗА покривали АКОХ-115 (1 мкг/мл ОМ при 4"С), додавали рекомбінантний САЕР (5 мкг/мл) з подальшим додаванням ГАР (5 мкг/мл), то зв'язування анти-
І|/АР-НКР не детектували. Ці результати підтверджують, що зрілий ТОЕ-В необхідний для зв'язування АКОХ-115 з комплексом ЗАКР-ТИаг-ВД. 4.2 Вплив мутацій в пТав-ВД в комплексі з ЗАКР на нейтралізуючу активність АКОХ-115
Клітини 293Т, які стабільно експресують інтегрин самрфб (293ТсІ. ІТОВб), транзієнтно трансфікували сумішшю з З плазмід (суміш плазмід): () репортерна плазміда САСА-Іис; (ії) людський САКР (рЕЕ-ВО5-риго-пОАкР); і (ії) людський ТИЕ-В дикого типу або мутантний ТИЕ-В (роОізріау). Інтегрин амрб є одним з двох інтегринів, що активують ТОаЕ-Д. Клітини 293ТсіІ./Тов6 відділяли і збирали з напівконфлюентних шарів в колбі ємністю 75 см-, підраховували і розбавляли до 1Е0б клітин/мл і розподіляли по 1 мл на пробірку Еппендорфа. 250 мкл плазмідної суміші додавали в кожну пробірку для трансфекції. Безпосередньо після трансфекції трансфіковані клітини розподіляли в 96-ямкові оптичні планшети, по 50 мкл (4Еч04 клітин) на ямку, що містять різні тАб, що тестуються, (АКОХ-115, І НОо10.6, 1011 і МНО-8 при 100 мкл/мл). 1011 являє собою тАБ проти активного ТаБР-В ізоформи-1, -2 і -3. МНОа-8 і І НО10.6 описані в
УМО2015/015003 ії М/О2016/125017. Після інкубації протягом 24 год. при 37 "С вимірювали активність люциферази. Значення, отримане при трансфекції мутантним ТОЕ-В, виражали в процентах від значення, отриманого для ТИЕ-В дикого типу. Результати показані на фіг. 20. Як можна бачити з фіг. 20, нейтралізуюча активність АКОХ-115, виміряна відносно мутанта ТОарг-р, що включає заміну К5ВА, і мутанта ТИЕ-В, що включає заміну КЗЗ8Е, була достовірно знижена.
Це вказує на те, що ці два залишки в комплексі ЗАКР-ТИаР-В особливо важливі для виявлення нейтралізуючої активності АКОХ-115.

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 60 1. Антитіло, що зв'язується з комплексом людських САРР і ТОаг-Д1, де антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), де: СОВЗ МН містить амінокислотну послідовність "У'ЕМЕТММУМООІ МУЕМЕМ (ЗЕО ІЮ МО:13), СОВА МН містить амінокислотну послідовність КІОРЕВСАСТКУАОКРОС (5ЕО ІО МО:12), і СОВІ МН містить амінокислотну послідовність ЗУМІЮ (5ЕО ІО МО 4); і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де: СОВЗ МІ. містить амінокислотну послідовність ОФОМАЗМРМТ (5ЕО ІЮ МО:11), СОВа2 МІ. містить амінокислотну послідовність ЗА5КІ КТ (ЗЕО ІЮО МО:10), і СОН Мі містить амінокислотну послідовність ОАБОЗІЗЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО:9).
    2. Антитіло за п. 1, де варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:14 і варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:15.
    3. Антитіло за п. 1 або 2, що містить домен СНІ, шарнірну ділянку, домен СНІ і/або домен СНЗ ЧО людини.
    4. Антитіло за п. 3, де ЇД людини являє собою Ідс1.
    5. Антитіло за п. 3, де (до людини являє собою Ідсаі.
    6. Антитіло за п. 5, де ІД4 людини має заміну 5228Р в домені СНЗ.
    7. Антитіло за будь-яким із пп. 1-3, 5 або 6, де антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕС І МО:16, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:17.
    8. Один або більше виділених полінуклеотидів, які кодують: (ї) варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла за будь-яким із пп. 1-7; і (ії) варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла за будь-яким із пп. 1-7.
    9. Один або більше виділених полінуклеотидів: (ї) які кодують важкий ланцюг антитіла за п. 7, і які містять послідовність ЗЕО ІЮО МО:18; і (і) які кодують легкий ланцюг антитіла за п. 7, і які містять послідовність БЕО ІЮ МО:19.
    10. Один або більше векторів експресії що містять полінуклеотид(и) за п. 8 або 9, функціонально зв'язаний() з регуляторними послідовностями, які забезпечують експресію антитіла в клітині-хазяїні або безклітинній системі експресії.
    11. Клітина-хазяїн або безклітинна система експресії, що містить вектор(и) експресії за п. 10. Зо 12. Спосіб отримання рекомбінантного антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна або безклітинної системи експресії за п. 11 в умовах, які забезпечують експресію антитіла і виділення експресованого антитіла. САКР оон я Латентна форма Зріла форма ТОБ-В. нер сх спини асоційований сту ск 5: й с І її п с у Іічуностиресія
    Фіг. 1 сек і З ес хх Я сим -к : п ї а ож, и - ШІ, 1 КЕ пек, щ Б Тооше б : чо Ж ХЕ ка Я ДИ : йо Я ШЕ жк ее ен в ОС В ЩЕ ОООЗДЕЖКХК потоки ДУШ ДО ТЕМУ В, що : У аж ле М ПКД : Б що З ої МИ ник ОК пу! : : п З МЛ: в, - » х Ми - щ : : Я ї : хз ЗУ : Я В Н до : Я В : й Уч : у и ї г їз чн 5 я м ще Чи ізо знести Ех кет КИТ ее ВН суч г Ек ж КА ТАКІ Н Е й : : й : бо ее : : ще ї п щі жим : х ї : Й те Ук м Я "Ж лох ШЕ х ОЗ еИ Н УЖ ий : ТОМО0ЖОЬ.
    ВОВК оф ою жк Й ТОНЕ МИ КИТ тн, : тої кох І : п АН ВС : : : : ої Шо ких Її: т Н І : ЩО МЕМ: « пе : : -ї В ІНН: Я Е Я : Я - Н : : у м ї : : : З: ї й : : Я - ї ї : : : В їй ла З ща КЗ 5 Частлава Ех мВ -о У зе уві БЕДТХ ее КВ Б,
    й стижулятиї котовеутятих. жу ЗУНВЧАЧЄ (вкліжих ВЧЕНА вки ЗНЕНОАУЄ (Мен) ЗБЕ (как то з ер; зн Іа вино КУ Іа (КА камазЕ Бонн ща ЩЕ ПФ КО ЗЕ Ед ВУ ЗБЕ ШИ ПИЛ. ПЕН, ЗЕ дп ин НК ВК ВААЖТМН зер Я зам зник Ок НК ЕЕ ЖУК ЗМК БУЄ ВК ЗО ЗБЕ ке З; хе зак НЕ ЗВЩЕ Бах стивеулет Зутиушянія ЗОБЕА імя ЗЯВАНК (мкм 0 ЗЗНА-АМК пекгім З пере БОЖУ як ГМК ВЕ не З к Б З 5 5 ТЯМАЮЕ ее с вве з ос фев аа я Б ВЕБ ОВ 5 Б ж жк
    Фіг. З
    Результати аналізу ХОМА : ДЛосліліЩКИ 8 З : ов я : Р НИ в як і : я : і се М : ко : ша я : НеЕУ Я Ки й шт в МЕ ІЖОре : с ві я : : ро ЕХ Я « є - еф дае: вод е де Ка о еВ: НЕУнся 5 я 7 : НЕ Ж ША У : ВА ООЖ є : : Ж дрон ннннння : : За ака Вон Яке : : ТА закгізаль : : «еслід ОБ І : ож : : НЕ : се : ТОК ОЇ кс : ОЗ : й С се й да К в Я ек ІВ зв зняв ОЇ ЕХ Неї С їй т 1 ож їх : : НЕ : Е що МВ : івж : : : вам заве вух заже : : вад) мега В
    Фіг. З (продовження)
    Результати аналізу ДОДАВ : Деслів ОБОВ З Е с : в « це сгдксх корі, ! іш Я КІ р її я ВС НК ях рак: и Й в Ей ж - веезюваУю Ї
    Б. й в і пн НА т Не ох ОВ зву у, Ще ж. хе : Заж зьвгв в дяка зааже : : Леза) макейаяуя Е Десліх 160606 БИ -щео ВО. : ЕЕ : Н Ж з: ! х КВ : по : : ІК вже ран ЗИМ І 7 : Ех | я «ба: во : т : ОЗ : і о Зк : ВЖЩО КУ «х : Е я щи «ВЕ АНЕ Ж ! : : Фа змиа пе за мк : В ГААА В) веакенеух :
    Фіг. 4
    ГУД зе ре в хе агреганії ЗАВ А греганії ЗОВА-АУЕ жо шо я: : : : ї І їх І : : : м кеВ т ї- Що одн ї Й Енн : ЖОДНУ : : Ж : я : : Й : ШЕ оо Я (А Я Я : Ж її оду км ; ; Уві в МАК : ДАЕ : : : : в їх вжи -- Щ М 1о ТІ за а НЕ г «3 яра о в Не Чала зак СНО сор ЩЕ сен ДАЕ ду оре М он КЕ сн ва агреганії ЛОБА у т агреганії ЗОВО-АТЕ с рен нин дн до : : : : : : щш : : : : : ШЕ АЧНЕ : : : : : з | : : ння
    БО. : Я : щ- х 0 ; : : шо 4 ОН с ни М. : : го х х З Х м ХнкнККе 2... ЩЕ : ї : ШІ їв ОКХ їн З ощ: : В : : п ВЧ Їх І А: і: «г кр - М ал Б ПА їж чи ХВ дл МКК синий моих х засоба ПК сення КУТКУ сесодбюх В р слива ТУ АК ее агреганії ЗЯВО-ДК - я ї : Н Е : у їй ке : : : : Я я : В : : : : Е Я фреон кое ннннВМ щ- ї Я іо: ДИ УК КК й Бо Е Е : : и х М - ефе МУ хоне ЦЯ скйо ВК ж зла Ту й г зб агреганії З9ВБ-АМК е шк : : : : Я : : алі я Е : : : : 3 от в Е пт : т : щ Я Е : : : : : Ж з: : : : : Я : ЦЕ : В В І: : : : г : : : : : : : НН НН а Ко ї Кок ном МНН ще Ш : : : : : : : КЗ "беж ще о ше я дов чен НЕК я с ЯК
    Фіг. 5 (продоження!) зе фрагментації при 37 на добу 50 -к їх й ме КУ Я Бо її » » » БУ вк ко... ВО ж.
    м . й сухххммМУм, її я Й хехухХККиХ ДШМ п ТЕ ЖЕК МОМ .
    Фіг. 6 дк сах ИН ЗЕ зе плоша мономерів З3Б0-АУ оо ее нин нон кн нини : щ- ВЕ С : : З В Я Ш ле У ОХ в НЕ : : жк Ол ї ї : хм : : :
    ОЦЕ. У 2 ї н Я т. СПУ ххя : К ТО ЗК пня - сни - нн в Сн їх ; Ши ї : В : СЕ ОА ї : В : : В о:
    ЩЕ. ЗА ФЮо : Н : ! : : кох ик ї І : т Н В ї щ ж ї Я : : : : ОО ЖАР От ї ї Е : ї : ко ї ї Її ї р т м м ї т : т : : : М жу ї ах ких с ях пл Кчя М МИ ЯМ Б що М що Час юоюєви у ко НН ЕК ре, ак й «5 плоша мономерів З9В5-АУЕ се ЛОВ чом ерія хх х їх Й К кер о ооо к мк мини ник Ж ех пох до ах й в й нн : Кеш ПИМАХ ОЇ 7 Я нею : ЩО 7 : : паче : : ЗИ : І Н ва : : ше ре ї Б : : «сх ШЕ офененнено нини внних бно уд нн й жк М : : Я : В ее : шо : : Я : В Ше : шоЖ он нн содовий ЗНАК Я : В : ЗЕ м що ї ї х : К м Гежашка Ше : Я : ї : : хх ї І : ї : й І КО І 5 щи Бе о т пе Час ОВС пеня МКК сен ТЕ мя В я. . сх вк х с ків Зо площа мономерів ЗЗНО-АМК 2 й ром КО КК КК ковкою : СУ ЕЕ СУІрХ Й Воно но и нн ОО : : : 5 Е «ж : : : : : Бош УМ: : : : : : : БОБ дя : : : : : : не Гаї й І н І 1 І : и І : : : І и ї щя З МЮУ обоє ттттвттинний Ж ОЗ Бо за ЖО о БІ БУ 5 тт. сущаще тіве слова зн сен МЕ об ДК зв наата мономерів ЗОББ-АМЕ а БО а З аерЕв ОКеАИ 7 щьх АХХКВКК КВ Кук ЕК нн Б ИЙ ШЕ ся ше : : : : : що : : : : : В СЯ Ме : : : : Е Ж з щу В т й : В г -ш- У хх - М Кк й . - щи д ще дол ле «ж кох г - ву ДІ КК ТМ І ІК кд Час лабо оо У сення ВЕ куб ЖЖ й В ча Ко: : о п я сш є - о - 7 ВЖК с п ПИ В по ен ме Е с : «- шк т : де ШО - - п Є в зво ев: ее ї же жк ке тех не в ве о : -ек КооЕ ЕЕ і о пон ДЕН КК за я -- ЛЯ (Фе о
    Фіг. й саду дк дих ЖЕ» Уч - АК ка КК ВНАУ У : : ХО: : Я З З Кен С т ій и : : в : о схо Ж жом ще а щи Кк з ЕЕ КУ ВЕК он но нн Ви Я МО у я ккд - Ме пи питний М ок МО: асо Я щем : йо : до хе Жохю Я З ов МО Сей Я : що В есе : ОО лІММ. : : ооо Б ЛУ ОЇ Км, Я : зм Я - зи те -к КЕ дет ем У т КОЮ КІ З 5 що Зак сю ще ІОН з ШЕ сини ТУТ з. Пр зеффене р З у хе сей ЩЕ ІМК АТ КЕ, змУм ММ: : ; : : і : Ко Я : Я : : : че Мо згудх м жк : я : дов шо ХУ Ен й с рн МОМ од : Я : : : Н КЕ М КЕ 4. :. ях и щшоОсО : : : Я : : : шо : : : : : Я Е ХЕ Я Я : : Я ї ОМ пед : : : Я В р ТІМ О : Я : : : їх ЗІ ва сх. ат ЩІ щу М МО «М и веж М ве Че бле о о о и ДИ С ОК "
    Фіг. 9
    СЕК М НАМ У ЗК с -- нт - - : ее ок одн нн нн ванни І о, ія, : : : їх ЗУ У «Худі КК Мік УНН зе В ЕН нн с оо в нн нн ЯН -О м І н Ша : : : ті ще Я Я хх : : : іч Ж теми : : 7 АК УКю уж жк з : х Там щІКе З ї пуентмтнн я ше СИ се я. т 1 ї 1 1 МО хх : : : : : Б ОО пня : ! я ! щ-щ-о : : : : : щш шиї : : В : : НН щі КЕ в Б ОЗ - Я о у и НН З Й вика Ж жав ик М ве и зе КІ ХОДИЛИ М, ОЇ В ско денно : : ОО ВЩУМ Босояннярууюв КС ккменк кдд ин - й ше Н ПО НН КК хх Ка І : Коли : : : Оу пом Її У Не Н К ХХ я ЖЖ остолилилиииииииниитиииититии рити ккд ин дитини де ща т : : жк : МО ша і ! : пас : шо ки : ОО: - Ж СИМ ї т т й нини р шк : : : : : й сеї : Я : : ЖИЛЕ І т : : 7 ї Н гум ї ї Н 4 Н : Не Ві КЗ: о Я У ЕВ Ха - Час сю ефе се сен ДВО
    Фіг. З (продовження!)
    за А ЕЕ Я : : : : : їх і : : : В : : Ж Коко : : ї шк КУ ШЕ м НН НК СОТ шк Ї : : : ї : «Б і : : : В : : хо і : : : В : : п» : : пис : ї Я - що у : : : : Ж : : : : : : же ї : й : : Я ММ што блежтах Часідюобд; кое ДІМ сехфкно КОКО юрбу У ЗЕ В ше ОО : : : : : : гу ї : : : : : :
    т. н І 7 Н г : ще З онко ок дк : сов х З ке КК КК о ОО Кон в З КЕ ня КЕ | : : : : В : шк : ї І й І 7. Н ж ї ї у : : : : у : : Я : : : : же : : : : : : : : Е : : | ; : їх її їх: кх БУ Ех Ти КС, ще СТЕ о З І зо в вх 50 5 Же ск, Масідващ оф твЕ екю в схфрне ХУ ЕЙ
    «ЕЕ ВЕ клени в же ж ш М 5 : : ще : НЕ я я ооо УК ДОС З ОК : : Ше І : : : - : : : ї : : їх : Н : : : : ща Кеш : : Я : : : пк! Я Годин м : ОМ : : : : : щ Е : : : : : Б : : : : : : ї : : Я : В : Гу її ї. ї й ї : в ш ІЗ 15 Ж КІ С МО ви К х Фіто б тую ме Зве блофа) ее ЕЕ сен КК лесі в БІ мкм БІ ЗУБ И Ки7 г : г і : : КУ -к : : : : шо що З ОД К км КК : х В : : : : : Бої ї : : ї : : Я т І ї ї І. - : : : : Е і пої : : : : : КЗ Що : : . : . нн : че : : : Я : : -Е ї : : н : : хх х. ї : ; К : : Я ще шО не дах схех схе іх - ше Е З 1 І пе що о щі ш Час іщова! Х МЕ є похо ся птдкех в нн нини М сн Й
    ЗВ ї Соя Ж г Я й Зк т що : хе с ОН ОН що ще ! : По А ВИНО вх ЗНИК ї5 ДН за По ВН а ЛИЛЛИЙИИТИИИИ ОТИТ АКТИ ПИ ППП. Н Н Ж ст с с я Е є с і ібциклів заморохунання розморожування ї нн -о достатня пул . -- і ! БНевілюочлювальне її Веновлювалькі умови і І | умови і й і з і і п о нн пп пн п в Кв ща Ка КВ Н Н Н Н 1 : і у Н Н 1 І шести М е пи мм поп Ус те ЗНА 15 15 ТВ : ' ' ї Н 1 І З ЯНЕАЖЕ їз НКУ 17 їй Е і | Н і Її В «ріг. 11 Звактивнності вдосліфженні стабільності нвн заморожуванні розморожуванні в аналізі Війсоте З ї- БУ їх ТЕ. Я ня ши х і пиши ХМ» ОКО ИН я о ПЕВНЕ Х КОН ОО в ХХХ ОПИНННН ХХ п МНН Е о й. ОО: м х х ПИШНЕ СХ ХХ ШИК х ОАЕ се 5 ХЕ Я В ООН о ЗОВ Зо і Фу пу вом Кх МК ПЕН С ЗХ БЕ хе КК птн ВВ ХК Кн КВ ОО «и КК ЕЕ у ОХ о. ПИНИНННННя З о. ВЕН 7 ХХ хх ПЕКУН: ОХ ПЕК - ОО ооо З КОВО З ожини о. ше: НН шк ШИ ОК: Во СК о п ОО Ох ВЕН В Мем е я ще п ХХ ИН, ОК ПЕИНШННННННННИ ТЕ, зіпллттттнтнно я жи НИ ХХ ПИ МАХ но е зи а ЗОНА
    Фіг. 12
    Концентрація бітка в деслізженнієтабізьності. нризаморожуванні розморожуванні от я ШМК КН дк х «Ж ОХ ж КОККККНН . й ІННИ у т ОКХ ШИМИ Е ОН сх 0. 5 КОКО НКУ КЗ ОО Б В п. п х вк ех аа В В щ І ОО Во ОМ с Ж о ПЕНЯ БУ ХК ОВ ОК не Б ХЕ ММК МОМ Пе -Е ОХ ОК ЗМОСО В ЗК зх ан Б В ЗМО соя р ЗК я ПОС пн -к ЗЕ Б ш шк Ко БУ СО о - ЗО С п ж о Я ї . ООН - ХК Я ОХ НН й о о о с ї тк БК ОО ОСОБОВА Ос не СКУ питний о ОК ння ння ниття ккд кен о о 5 ННЯ - шк, ОО ОО В Я : ВО е Я (ріг. 13 Яеслідження терностабічьності варіантів ЗЯВИ в Е чан ЗЧВЕАМЕ ; ще фон дент -е ЗВО ТЕ чех З Кн с ванн ів ес кв Е Кк з 7 «ИК х | в -ае ЗОБА Ка Е З я яв Кх че ЗЗВБ-АМА що ! В вх І в ше Е Шов, х Е Зх й 55 та та с ! о - жи г гу се МК Твавплература ГО шу»
    Фіг. 14 п нн о НА т х ПИЛИ и в НА т Од Пи з58 зви. що! те шо за ! В СЕК, ХУ яй : ВК о ом ен т се ПЕКИ ЖКЖЖНКХ ЗКанк пе В як с ПЕК 7 : їх п, ПЕК з нн п пп Сортанкх протягом ЗО ЕК. і ї Н Невітновлюювальні мови Віхтковлювальні умови З і З ; і і і йог В БЕ ! Неї Ї ЯБН їх Н ІЯ Н аз ачеЕ Е їе 12 Е їх Н Ех : ЕК ! ї ї Е у БАХ 1 НКУ 17 ій і ї ї Я Н Е Н Ї !
    Фіг. 15 як щ Сяй : Злі Е - як як вв ЩО ї и щу Зоя бо КІнанОост вною еннІ У Та НЕНОЕстВОТьнНОСт В'ЯНЕ Вионе бля ших Кох ДМ ЛуААТУЄ ХХ ПЕШИПИШИННИИ НИ ОХ ЕН ІК ХХ ПИМЖИКНННН хх ПЕВНИМ НИНН: м ЗК сени КЗ . ЕНН 2 шех тю ПО о М те х КО ОК ОК МК Сп - З ОО п їх В І ШЕ Уж ХХ ШИШКИ, ХК ЕМ - сни МК ШЕ ПОЗОЕ Ше ОК Ж З ОК Зо шо Й А
    Кх . ше о я УК тя. тей ПИПИНШННИНИНИЕ ЗХ ПЕКИ ши й ЗАБУВ . Сх ВО о. ПОН й КЕ ШІИИНИННН х ЗХ ПИШНЕ їх ОО а
    Кк. Зх ЕШИМШ НИМИ, СХ ПИПИКИНИНИ ие Я ХХ МНН МАМ На ще і Хо ВЕ ПЕК ПЕНЯ ОО ПЕКЕ НЕ ЗВУК НА св
    «г. 16 х Концентрація ів Ї «нпентрація ка влосліпженнії й ! дослійженні реланійної ставі З КЕНЕ «табільнасті хх ; ; фена і хх ЗОВ З о. о ях Я СХ х ДИНИ, СВВх а де: до о. ПКЕЕ ОО ОО МЕД т ОС Со ОМ З ОХ
    Б. З ПАК СНО я 7 Ж ся ПЕ ОХ Я є о. о ОО ЕК пиття Ж З о о С КО ЕСХООООЯ ї . . о ОКХ Я : каш о. о. КЕ я ОКХ ОО п НН КК я о ПЕК ЗХ 7 Еш . о. ОО ПЕКИ погтттттгия. ОХ 5 ЕОМ ЖК ОК - СО ХХ ДЕМОНИ З і с Ко ння КОКО: Ко п В в п 1 зх Ж ДИН я ХМММКЖМУКМУМММ 0 ТИОКИМИИИМИ МИ. ши пий ЗО ВЕ Ля БУ К ОБ ЖЕ ХИБНЕ «ріг. Ли чис Же ; ВЕ й " 1 в Яся я зх як і яоонх, У хх нан му ше ща не я щ Їх й З БО В ек щ : (гі Кк - ДНО одн нут в о ідрннннон Кене а киш и Доба Активність зв'язування (ЗРК, -я-е ЗОБА К со ЗВВАМИ -- М Овен ЗОВС-АМЕ -- М ашио ОВ АМЕ Мій ЗОВ АМЕ
    Фіг. 18 а щі зх й ех ще "Я хе їх рнічий Ах ах Ух : щ- НК ШИ С ГКУ ї їде В ; -ей ЩИХ ЖІ: З М З ЗКЖІЕ ЗЕ: ЗЕ: пла ЗК: і, ша 5 М й З М К.ж ЗЕ: и ЖЕ: с. ж ов . х що. КЕТІ Вік ж мк ИЙ ШЕ оо ж т, ік х МИ Кк НИ Кох 15 : Ст. РВ5 ІНТЕ АР-антнті АРіЗАТЬ іт 0 ге ВНІ АР -анентіло пк. х І дере тити тлу МЕТИ ТУВІЧЕ ЯНІНТБЮ покриття сЛАКР захоплення латентнага ТОР-Й ПОВИ НТЕЯ й - ЗАЧ ЗаТЕНІНО КІ 1 Не фрпокрнітя знтн-сТАКР АВ, долання АКР, захоплення латентного ПОТ-В Чі ГОБрНгтя 5 Ку ща, далане м У ЗЗАЛИЛОНЕ: СНІНОГУЮ тр - т ; гузвустття 5 перу сЕттіто Ї дв че покриття САКР захоплення І) 4 я хі я Ул гі тож Й струк дув -(ї з В ді перло т і Б сдзееуттт 1 «е ІВЗБНІТЯ ЖНІН- АК до додавання АК захоплення АГ : Е 1 Е : : ї ї І Н ї ї ї І ї х їх і. : 1 ї ї ї і ї : ї х 1 ї ї ї ІЗ ї ї ї ї ІЗ ВМО ї ї ї І Е ї ї ї 1 ІЗ ї х І ї ї ї ї І : І 1 : ї т. : ї Н 1. У ї ї : ї Е їх ї : : ї ї ї ї 1 ї т ї Ту х ї ї ІЧ ї КУ ї 1 ІЗ : ї і ІЗ 2 НЕЖУ її. її І ТР ї Н : Н Е І І : : ї і Н «А твої: Я І 1, ї І : Н Е ї т : : : І тт Ж ВИ Тож 1 ї що : ї Е січе : 4 : ї їх З фе Не ї Ба 15: ї - : Н Е трі, : ща сли З ЖЕК 1 І ЗЕ ек СХ нених КИ ЗКУ ем ІЗ ї ї ДЕКО ше М ММ ів г ЯК Же НАХ ен и ЗШ ТЕ МЕ гаї ем Тетху її КЗ Не: ЗУ їз :11х ї І, З хе Ох ЕЛ І: КАК З т ЗЕ ЧИ ря т ТУ І НЯ НЕ МЕ Ії ке КЗ аю Я Яр зх юеше ЧЕК о: ме: ЧК ЖІ нн ЩЕ: з Но: веЖХ : " хх са Ж: НК ЖЕ и С КУ м ВЖК ЧК ЗУ в ІБ ННЯ НЕ ЗВ І їхч В СЕМЕН: вх о МНН ех м ме ЗКУ ї КУ Зх АХ ІП їх це Я ІМ щш Що КЕ НЕ су ее ча: чн: не НО ах КіСЕЗ « ї: паї ІК вх КЗ ТЕ Ех же Не Шен: ее ФЕН НВ ї ня Ре ЧК ї ЩІ 0 РК Е НЕ ее ЖІ ж вк: В семи вя их Ка ЗХ ЖЕК Ж: НУ хх З М КЕ З: КІ м РЕЖ ЖЕК МУ ВХ КІ 1 : и на НБК НЕО МУ Я жк: МІК З Мих КУ ЧНУ ї м ЯН ЕХ Е НЕ ЯНХ : Те На ЗУ КЕ Кає ре ее ее ває ЗЕ 4 Ж рек Чи В - мне а ї На: Ева : щ НЕ Еш Км Ж ее Сх ЗКУ м КЕ ї А ї шо ЖК Е Ії В с: ВЕК :
    в . БЕ ЩЕ ІК не З и НЯ ХЕ а ко УНК Ж: ІЗ ЗК Ії Ех НЕ З І - Не х Шо ж КИ ех и вх Би БЕК вх ФИ ї ІК ВК Фея они Ен не ВЕН ВНКЄ Не фе ее ЗЕ ех Ж ЖЖ се КИ ї ен БЕ ТЯ ее ЖК ХМ че са: ЗЕ ВНІ Же Би Ж КВ х хх м РЕ КО жука х РЕЖ 155 РУ НЕ. ЗХ ЖІ Я МИ ОВ ЕМО З НК І ЗЕ КУБ 1 М ве ЧК ее УМ І ІК їх НВ ДЖ ІЗ в ше ЗБЕ РИ ЖК и КИ РК т ше ЕК ЗННКХ тр ї Я ФКХ Е Не: ЗЕ : як ІК ЕНН: ние: и БИ м Я зе а ЧИЖ хе: М Ко Е ЧЕ: : рей НУ Еш кт НН Ж к-т ЗХ КУ о ЕК КК С У Я БК ї че ЗВ М ж ОМА МЕН вет НН З и БЕ ЗКУ ех РК КК ЖІ ККЗ ї ІА І їх Не: ФВ ЖІ ж ік т35 МІВ Ме че ех МНЕ їх в МЕ НЕУ ТЗ ї 11 І їх ШО Х І с неш-: ЕМВ: в: ре: Ге КО ЕХ ж в: НЮХ Кі: Я: вино НЯ І ЖЕ НОВ: ее: ЖИ НУ А СЕ СЕМЕН рН Ах жи ен: зх віх рек ЗИ КІ КК ік х не; же Б а: БЕЖ - - ЗШ не а ви вх ЗК М не чи в МН и ККХ Е НЕ: З : - НО ЕНН ЕН КУН А ВЕ КВ ЗУ Ж БЕК ЗХ в КК КІ КЕ ЕХ ї Не ЗХ І ПЕ ОК СЕН Не не ЗЕ Не Ух 15 С КО НЕ ен си ЖК їх ее ЗХ : ке ше ФЕМ У Те Не ФК Звеє зах Ме РЕК: Зх Фк ши ЖЕКА КЗ чих ВН КК ЇЗа ве: ЕЕ ШЕЕВЯН ЕН Б Же Ме Ух ЗО ВЕЖУ ЗВО жа Я ЖЕК: КУ Не ЧУ : у ЯКО Ве ве фе и ке ІК Ме р: Ме УНН ех КУ Е НЕК ЕХ : к ло ЗОМ З ек я ІЕЕ І ей п їх ї кох М НІНУ Я 5 х НЕ: ІК ;-Н що : МЕ БЕН КВ ние І Бе ї ї ее МБ че я ни Я ВК х БІ же: КЗ КВ : чех Не ПЕК ГИ КН тк З Ки те не ЧК У ЕЕ ет УКХ їх І У Ме Ж нн ех ЕКО ШКННУ вже ие же не Ки жи ЕК «КУ ве же Ят Ке Е НЕ Не : ех Енн МН Х си ее ме М вве НН «Не ИН «мн ар Ями І ІН ше : КІ 1 ве С х м РЕК м г Ж: Ф Е ЩЕ ее по НА Я, ЖАХ се КК кс СХ А улемн Ж КН я а КЕ С СК ЕЕ КО У п М В І: І ї : єї жо її Я ії ї Е еї у гу тою : ВЕ І: УНН. У: З З НЕ І ЗНЕ: ПИ З п В І ПИ І З В З З: В ЗИ ЗІ ПИ ПИ В ЗИ НН НЕ НЕ НИ С: Ох з ЗИ І и У жи З ЗМ НИ ЗНМ ЗНУ : В УМ ЗНМ НИ НИ ЗМ НИ У ЗИ ПИ З ЗМ НУ і 1 5: 1 ї , ше и НУ СЕУ МН ГОШУ Ж їв: 5 1 В: Гн У р Ж ОО 1 У У ї ж и и и и п З Пи З З З и НИ ЗМК У з: З ВИМ ІН З М ЗІ М и: ЗІ В ПМ М ВЕ ЗНУ 1 І і ї : ІЗ ї 1 ї Я Її Ж: ї : ї Е ї 1 : Я ї ї ї ї : Н ї ї ! їощі ї Н ї Е ї і Н У ї Її Н З Її : ї Н 1 її В: Н : ї гу В ї : Я ї : : : : : ї ї : У ї ; ї Е ї 3 : ї ї ї : ї ї ї ї ї 1 її в: ї : ї Ех ї 1 : : Її 1 Н 1 ї ї В ї Я ОЇ Е : ї Е Е і : Ї ї ї Е І ї ї х ія 1 їж: ї І ї їх ї ї І ї ї ї : ї ї 1 х 1 ї ї ІЗ : ї Ех ї : : : і В З : І 1 і ! ЕН ї Н ї З Ї : Н : Її ї ї : ї ї 3 ї : ож х : ї ї ї 3 : У : : аа чн : Влевитте Мітки ша» іво-хе еко ЗЕ
    Список послідовностей «110 АРЕжЖЕНКО БЕБА «1У0й2 АНТИЯ-ОАКР-ТОК-АБЕРТА-АНТИЯТІНА «130 МаА118743щ «1А0з востУувБроаІ1ВипогиВ «тат» 2О18-05-11 «150» пві7ТО75Бь.5 с15Р» 7017-05-11 «1вп7уУу 48 к17И» Рацапріп тувкаіоп 3.5 сли ШИ -лплімо ло ей нт «2153 БІЛОК кРІ13У 1ідша сіата «аппМм 1 та тд от я тя ді -и их й у (7134 тн Аня Датою т; А бі Уаї біб Без Уді Шіп РЕ зіУ Аа 'їзій пеп Арго влдпооеї сіу діа 1 5 12 15 Ззет Уаії Був Уаї бБеї С Буш Аів бек бі туї Ака Рпе Топ Бек тур м: 25 за туї Ті Аво о ТкроУді АкЯ біп Аїда РБко йпіу бсіпобіу Бей бій Ткр Мет зо 45 ад зі дк тів Авбз Рго бід; дер оці щі Твкотов Тук Аїд Зі Буш Бе БІ АКс ів 'АВЕ гБТО бід длжросіУ біУ рфпЕ пуз зукх пла бай було вгпе Аа ща дип о 55 по біп піуУу Ак оба! ТВт о Бпа Твк Аза АвроТтТОпк бек ТпгБ обйет Тпх Ага тую яп За пра ди 6 НН 5 во Ууаї піц їйец бек дек Бе) Акб бек піч Ав оТтТпт Аза Уві Тук ТУК Суд в Зо з5 Аїа Акч о Аво осі Ткхр о бі) Тпк Уві Уді Уві піу Адр о Пец Меж Тух бі1ц 100 105 119 Тух піц Тук ТкоросіУу піп біу Так сіп о уаі Тпгоуві бевгобехг ля зп ле 115 120 125 Коран 5 пед Ка г за «ії» 117 колють тот «ій БІЛОК слу ть, т - що сде13их Бфіазата зідша зада щ «4пО5 я, І тн М Фін і. бр ту Сея нн Тоня Є АЛ дм Тоні хх Авротів о біп Месє Тпкх Сів Бек Рко бек бек обейп о бег АРа бет Пец обі Й Ен та 5 ї З о 15 брату зних нти у щі плн плято ї йлошо я тю ння т Фони пи спо вяя апр Акц чаї ТтТпро 11 тБтпроСув Біп Аід 5звкойпіп Берг Бі бек бек туї те р 73 в «о меж тод: Ві з тен ЯПхю (За Тхущо Пані Її хх 01 Ал Гн т яхт То тТ-щ ті ав вій ТЕр ГУК йіапосЗіз уд Его ОбімМ зіп о дій его уд он оп з1і1а ла 45 Фін п йлодо тю йо Туя ут я трьох а нн ну НН НН Тук зі Аїа Бек Ак о Пец обйпіп ТОК ойпіу Уві Рко бат Абе Рое швкос5і ца з БО Сян у? 31 Одні тв ру нн з ов п а НА на ен льш т т то бек сіу бек о Сіу ТВ дек о Рпе Тато їй Тпу Ті бек Сіу Пл бій Аїд т та те зи п НЕ 15 ви т дя Алла 1; ірро бен аз гляутщ 07 сті тку нт рт - щи бів АвБро Аза пі Так Тут ТБТУк Сув піп осів ТУЄ Авробек Пеп Рго Уві в Зо 5 те То її 4 7 ни у нн ек м п он а ті т т попе бБіу їі о бу пт о У Уві (п о оелр о »Ууд ль ти 100 105 «рій» 3 лях Я гурт «115 тТО07 «иа» БІЛОК тут т, т -ї тост де13х Біата чзіатша я лю "7 сао» во хе тил я Минув ря Фр Гу Тон Літо АТ тую Тодяя 07155 Авр оті біб Мет То біп бек Рко бек о беї о Пец бек Афїа дек Бей о сіу щУ вт ШІ Зк ї З о 15 очи о и те що піно ут ті лоша т у ню т Соячя 0, сп. я Авр Акта Уаї ТтТпк оті тп Сув біп Атд о 5ег ойіп о бег їі бек бек Туг як Зк пе ди ра зи т- дія тк Фіг ті во Тато Тікуу З Баг 1-1 пни де тт Ти: т Тен оАфїя ТЕр Тут біп о бівп Був Рко піу зі Аів РКО Ап оїів Без їТів 35 а 45 Тит пі Вод шеако блчет Ту Толя Че бліх т т-т-т лу Ази ТИН Сб 7 їУк о оіу пі век во пей бУуш 1пЕ обі Уві РЕо Бег Ако РБбе бек ш-щіУ ва 5 ви тез ил т о ізн Фін зт ПА ря 33 ная ти ин їх тах 13 В бек Спіу бек о йпіу Так о бет Ре Тпї Тез Ток о тТіє бек о біУу Ппезп Сів Аа
    75 Зп ее пи 15 ща і га о зядо дл бод що ха "71 чат Атіа пі тек оту о Туєк бу бів о пія Ток А1їв дет о уУді Бро Мі зів АвроАта сіу ТБ о ТтТук Тук Су біп сій Тук Аза бак Уд 85 зо а5 кА -А поті КО -х - т рило, пня зво я 711 тони Туя ТвжІ Бпе о бБіу іп о сіу ТйкоБув Уаі сСіцп їв Був Щі ки зт Тс 105 яр А виш ени ї кине їі ЗАДІЙ о сит БІЛОЄ леї» Бідща чівта сад д «ап» 4 дае Ти тів Ал ват Тут Тук тів Адо І Б і З «1» 5 лож 7 стуяртину тпяис «ат» БІЛОК 213» Бізта цдіата «аа» 5 - тт «7 ве Гу ши шен -т -1 ші інн 141 лоді ко; те тлу тн АТ тт й же пів ака тів Ахр Ро бій Авзрошіу сі ТЬж Гуз Тут Аіа о сіп Буд Ре о ціп З Е З ще йо і 5 19 15 пі х зіу че105 Є «ЕТ» 17 тт тим кит» БІЛОК -у т щем ри ния «кл» Бідщша савІшщ и нача д «апп 6 -2ї Фан тТвгоУуаї Саї Уві сі Аве Бей Меї туго обі Тук піц адпобіз Тгросіц Тк оУаії Уаї Уві біу Авробец Ме Тук бій Тук пі: 1 5 Ро 15 пк У дядя чари і ся я кеті1л 17 «28132 Біата ціата й Аля 7 «сапу» ;
    - жа д о тт тах дол ті г піз й1. піт тве о Тоє Тут Азд Сів тля РББа пів АкчЧ їі АБр о рко Зі біп піУу бзіу Тк Бу Тут Аїя бій Гуз РБе сії АкчЧ ті АБО РЕ у у ЕВ 1 5 1 15 Н нк о ня п Сіу чат а дя ГА. рало я ни щи ки - нюють тттиуми стій» БІДОК шу т тлі - «1 - «Іа» Міавта підт мою о «-8 ОО ш й ІН льш! ть ття т - 1 глухо толк з йті1 т т - Бк» 1 Азо Аїд піУу Тк о Бо тет Аїд ші ту пе пів АкаЯч Ті Аво о гго зі Аз о АТ -а у жпЕ Був 1уГг пла ап Бе ЕВ АкКЧчЧ іт Аво х У ЕВ 4 е в же Н Е о ї та У я У и и У сиза р ще ная спа втпици «к12 ван тролю ки пан пи «ІВ Мміата піаца Для З «400» - пт В с МАН Ср ті Здат о йевк То Т- Дід Зі дів о сег ціп бер тів оспвк сов 1уї ті ві с КО: І: о 1 Ко ая тд ем о тром т виш ш Н «Е1тИйУ БІНОК лю, тот її дтдоз жи БМіасртв спіаца «апа А «4п05 10 та, Фен же Тая Ту Тв спіу Аїа 5Бет АклЯ о Пен опУуз ТЕ ї - рану но з а ОН о кій У яотх з тт «ти БІНОК кр тя тА гі нт «132 ПБідювтва ціата сдуг. тя Кк І Гл аа хг «лоту 1 - пагн Дія тю ге зи, Зщ ная Зі о бБіп Тук Аїз бек Уді Еко Уві ТБуУ Я 5 тля п т Ма А я т че 17 се1и» БІЛОК п13» Штучна сг лють Дім злихивіте песптянті і де «вах фрагмент антитіла «Аве т чари 17 з тях пом я пн нн в А І А А по п по ли Акз оті АзроБко бій Азр о АТїа бі тт Пуз Тух Аа бів Був Ре обій і а 10 15 лі 34 у -е105 13 «11 17 дет2з БІДОК й» Штвкучна Колютуйк ул аи чаші фрагмент антитіла «00 3 Фіат и 53 стін, т. тптіая 2 А ТЛ х7А Я хх тів тА - х нанні оси не и ША тут Бій ТкЕр опій ТпгоМаї уаї Уві біУу АБрб о Га; Меб Тук обЗій Тухк іс 4 е д чЕ ї З 10 45 тет «ІМ 18 рих а «е1Р1и 175 «тав БІЛОК силі пли гл «піз» Штучна «их -7 З Зея оо сут яті НА сег фрагувнт антитіла л ад» 18 пл А хтАЗ З тодия дво 0 пні т у 11 ХА Дону туя ри 22157 51. піп очді бій їеч Уві зів ко їла у вза бій Уві ВДЕ БУВ ЕКО зсаУу вій ї Гай КІ їх т - -ж ще А хх тк тр Ток хо ов икке Тут АТ шою АХ пяти А жи р пт дя Тату загочхаї БУуБ Уві Кхеаг СУуз Був дів цег сіу ЇУКЮК ВЕЦ Бе о тТптІ бек їУгГ й 5 за пак тіні пу хи джин ТА пн ї113 ТТН ул ту Тояя у71н пу МУ гук тів Ар ігрові агОо зізАїТв ро їз у зі прості мМ БО Са 1 Го Має 43 4 тля: дя ле іні їх дян А тя; чу Тіт ОВ ле Тлтв НЕ іа У АВ 112 Ар оБЕЗ піц Ав Аїд СУ ТЕ пуп ік відо сій пуп рпе во 55 о іл пл. Тоня хх ті М фія ВТО ваш ті ря птн стю пи в гля піп біу Акщпр Уві ТП Мет Тв дів Ар о ТОпк бер Тк бек ТВкоУвВі Тек ск, па В, доп бо г го оо ха З А бл ин 1 Вл У А КІТ я й п А р щі Ті о пля тю Улаї бій іец бег Бек Гей АкЯ бек із АБо ТтТпк Аа Уві Тук Тук Су ак гії оц зо МН 5 Аля дан ряст 15 рн Ії. є хи хе БУДА м а пла ВАдую о пяти 1571134 дів Акц о ТУкК бій Тер бів Тпг узі УуУді Уа! йіуУу Ашробец Месє тую піц іо 135 110 од й 34 тю ПИ лехе лижна нше Іл ку ють: т Фо ит ра 8-0 дя ТУук обіцш Тук Тгробіу біпосіуУу ТБкоїец Уді Тк Уві хек пек 115 12п 125 «гій» 15 Ки п х мишка чк112 107 «жі» БІНОК «ві» Штучна «вих рю туя и шзптилті - «20» фрагмент антитіла ек не -4009 ДФ 15 ло й з У пр "тя ту у Сак с о от т тї ще ся тло з с й т с ях Авр о їіє Ззіп Ме Так обіпб бек Рко бек дек їен бек Аа бек Уаі ціу У х ц й г ї во. М 45 ле баки ян тн 1 те обізнані т Се Ше Пл р АвроАкоа Уві Тато Ті ТпПт був сзіп Аїа беї біб о бек Тів бек бевБ Тук -е зи га 25 зи тота ВО борну бух: ще ті но тлі зт їз у 21 Тощо тн ко тонша ті ів. о Ата ТЕО Тут біп бів бух Рго біу іп Аа Ро БУуз 11 ї-ши 11е рда БІ Я с о 45 ума ява То Тов пі ут ху хе я -і де ї що 1 хх Тут біу Аїа пет Ак б оГев о Буд Тахо бі Уві Рко бет Ахка Рів бек біу 58 55 Бо Од фл дум я ря тн Фін Тай тва Щі Се Сени - Зо дгьняя завк обіу Бак 5іу ТП о бегї Рпе ТпПк ії-бй тТпгоТіе бе бет Бей бій Рго 65 19 З во 7 7 шву Кх - то пе пПідатя ся у яти сю Гаси ня Н -. ше ожина чЯ 1 х -к Я Сів о АнроАтїя Аа ТВ тую ТУкК Сув сбіп осів ТУук Атїа пак Уді Рко Уві 85 за 5 Так оРБе бі біп о сіу Тпжх Був Уві бій тів Був ля я іже; 1035 я льлогух з-д «10» 15
    «8112 452 «вій» БІО втаМ о Штучна лю гуя и з вудтуєцнт антиті на сдиРа» фрагевнт антитіла «Для ча ха ів т 37 г т п-уТяяні И7 І-ої тло дону Таро Б ве 171 ху ДІ. шщіп Уві 5Зіп гей Уві біп Рез осі» Аїд 51 Уві Ато Буш Рго біу Аїв і 5 1 15 1 5 - з : і па ті зу хт- неон і наз ши ни: ни ши наш чук Ака!;а, Ввае ть Пане ту -еїІ Уді Був Уді бер о Суш БУБ Аїд бе піУу ТУуї Ака Бпе о тпЕ деготУук 25 за 2 28 зо 4 т слу т я т про Уві два бій лід Бк піУу бів пу Тецп бій Ткб; Меї Туї тів Або Тго Уві! дга біп діа Рго СБіу біп о біу Бей обії Тгр Меб Й 35. Й дій де, 35 и -а ЗіУу Атго ее АвроРхо біз АзроАїв бі ТпхоБуз Тут Ага Сіп о Муд Рпе 5іУу Атч ті АщвроРто біз АЗроАїв біУу Ток Туз Ту 31 і й т дфЕ дл й в й щи Зо У т с т хя-щЩ ї тля АЗІЇ пн пня У - ть оба ть Ми тив сЗіпобзіУ Ак Ууаї Так оМес ТБЕ Аїд АвротТпг о хеї ТВкобек тТпкЕ Ууді ТУБ У З й по Іще р 7 В що 7 г Бо хі "б т т т оту тиші Дону Шк 71 дян вжи віщо тТостотук пуд чаї бі іеп бек век іє АТФ век шар оаАло Тв Аа уві чук Руку я З 45 в о Зо ВІ л ДН тенет ть ел лд х Дт Тир; Мах тах пі Атїа ака ТтТУук бій Ттробіч Тк оУугі Уді Уа! піу Ар оБецй о Мес Тук Бі що що ач тт 100 135 110 13; тек тва птУу пін пі тТвк оте Ууді Тв Уві дат дек Аід бек Тух ЗІЗ ТУ ТО ї1КО їйлру бій па у пр іє ха Тпг Уві бек обБек Аїа Бех 4 ляп те 115 129 155 5 тех зе свкобаі рве рве т-; Аід Без бич бек дує це ть ТВі Буз 5іУ Ро шек Уаі РБе Рро їз Аа Ріо Сушх бек АвЧЯ о бек ТаБ З т з зд пл З 135 ШИНИ 133 оо ве - - т ; т Ве (53133 дек ТНК ді АР о Ппем ці ТУ» ід Уві У Атрво ток Ре о гго цйек біз бек ТБкЕ Ага Ага їец обі» Сез Пер Уві Буш Алротує Ре г: 145 150 155 150 -4 - : й ті, тт Я г-З Чаї тТьк о оУві дат Ттко Ада Кат пі Аід Тер отвкв о дак Су Уді піц оБко Уді Тк оМві Чек Тр оАдпп обБетїх С1у АВа Бац отв бек обіу Уаї ге А я-е 1565 10 175 я с т т ш т ше 4 т т дл ху тод 1 ее ли 47 хг тот гло ет тер 2 ніш тТпЕ Бе Рго Аїв Уві Бацп осіб сег бек піу Бад туї бек і12гоб 5ехг 180 185 150 ши Або 2 ск т я пі тяг пе ев тину рай ох ди щ но хо ОПнкиА брил Кр с У оОпвк отит т г; тик пвх Уаї Уді ТБк Уві Ругбо баг бек Бек Пец о сіу ТВ оБух ТВБЕ ТУук ї1а8 ж и і5-о «Ци «і тях дез и дол тіЯ єю толку гу х - да Фе Тк хклї Вт о НК Сув Авпоущі Адеонів ув РКО бет Авп оТпх о ГБУубБ Уві АвроБув Ака уді кр тат пт іх А я-и тя бору Толуто пПОяуюо ї7 то дан, Ву» гГб'кзе: Ти Шен б'яєтто ки ре ря 1. -»6 піц бат був ТУК о біУу Рг вко Сув Бко Бко Су РКО Аїа Бко піц Бе гри пла зле зла пе 23 З ай тощх яд 0 ни Пи ті т 4 л-- НК очи шк ши а Со Гвеачпсвіу Біу Рко 5зег Уві Ре о Бей Ббе Бго РкзО БУзЗ БЕо Бу Апю так 245 БО 255 точ ен тт і Дак півонії ї71 131 ля нини ну ни о чн ие вича Ванну хи їезо Меб ті бву Ак о ТБКоБко сії Уві Тих ув Уа! Ма! Уві АвооУуві щи дае тт 250 265 то т -- т ги я НИ Тан, т ХР - ле з Ту лух Н - пах тА Тури т я 15-31 зек біп бзіц Ашо» Рко бін Уаі бів) Рпе Азп о ТЕ отук Уаї Ар осбіу Уді То во 25 тт хг Тс пт АЛ що тки р Полят ее ОК КУ АЖ Ган чення бус - Сі Уві Ні5 Адп Аїд мч тав Буд Бк АБЗ Іс осі бій РББе Ааз бек 7 тег лл 230 255 зо пір яю Анни 1551 хдт Сн НЯ 1 пах 7-1 Ті пл я Зо йшрк; спа у тї тТпг Отут Акш Уві Уві Бек оЗаії Бей Тк о Удлі Без Ніз біп АБроткКропйец зе зла зле зар 305 ЗІ 315 32о М инші неону ниж шах ши УА Сдює йти т шо її я; лан Пе Авпошіу Був бій Тух Був Сув ГУБ Уві бек Авп о Був сіУ Гей БкоОо бег зв зал шк рада яки Гьж В) дек т 11: Рига ву т Фе Тит А тля 21 хх 1 гу Вк ої нт чех Рів зіцйц Буш Тпх І1І1іе бек Гу Аїа Гуз біу спі Руб Ака о бій РЕК зЗАп ЗдЕ з щи лях я 71 т блять т я кн о Вк; бек бле 131 7131. Мав тье іт й срну 13 біз Уві ТуУук о ТвкКоїбевиа о Бго РКО бек бів 31 об5фіп Ме Так обу Ав під рт лег За 25о БІО виш хв Сб Тодуті Я здяші Жонру З35 тот 07157 нт пута у сі нн и и так бек Гпезч Так обу Бен оУуді Був щі Бе оБуг РтОо бег Аврогівє Аїд З 375 зво тт зл бін, (113 Св деу т, т ее за ке НИ пах дл роя чаї бій Тер біб Сех АвБпобіу біп Ркбо бій Алподап ТУук Буз ТВЕ ТВЕ по пам пат ле зн и 4 ап ря Пани ти тот Док ді Дт НН Ше ТА М т- пер кени , НИ Его Рто Уаї Гей Ар бах Авробіу бек Рв Рів о їец Тук вет Аго о їец ям Арх ал ВОЗ 419 Зі и Ше в пра Ху с «одних 7 зу ло ил 71317 пу 15-71 ті падали Зі т так оУаї Авро Бу бБеї Акта Ткробіп біц п5іУу АвпоУаі Ра бек Суд бег дп ги па 422 425 4 хк- т. - тд т пУше Хот 4 є - ті с а нн т и НИ ЛЬ хк аа о НИ реч чаї Мес Нів о зЗійп Аів їні Ні Адп о Нів ТУує Тс піп Був Бек о івц бег 15 ля яяс 425 440 445 іем бек Гецп піу ке РАН иа ж кл 17 ЕНН ЗА чі» Іа «вій» БІДОК ли питгдхгг «кіз» Штучна рак иья ач дк лили фра-тртчклтуттг гріти тт тт вищ фрагмент антитіла папа» Я ро 1 Н дво тів бій Мат тв пів Шевк орко бак бет Тевп лев дід Бех Ууді піт в-во зів ОІіг Масло о бпІ бапооег ТО ютер о пш-тт пе ок під оз Уущі піУу 4 мк та 15 Дек, Аж їв тьювко те; пью я; ТІ ді арени -щк т Сет тик АшроАкоа Уві Тк оті Так обу йіп Ага бек обіп бак тів бак бек Тук ЗА ЗЕ Зп 20 о и т т дл в ни на то Тляжт лу пух кт т -щ поре д« тлн- Хор. їевап о Аїа Тго Тук о бсіп сів уз Его біУу піп АтТа Рко Був Ті їецй тів - п ЛУ 15 39 45 Палі тіл о зи ї тод бно ут ях з Си-шо дет ния Се 1317 тТУук біУу Аа бет Ах Гей Був ТЕ біу Маї Рко бек Ака о Рбе бехїх піу о ВЕ в Стє 11: Орні ть ода Св піна тера пін тт обр 2 НАЯ Зк пекопі бат обвіу ТБе бек РБВе ТвК оїей Тих Тіе бек бек Газа біб РКО ОК т -г 5 НЕ; Но: по піз Ав» Аїд Ата ть тет ТУук Суд Сі Пій Тк Аїд дех Уді Рко Ук зі дав вій лів ВПО Буг 1УК Оу біг саАп Ушг дід о зет Уві ЕКО УВІ а ай 5 тек Би їх» п потік ма току РА 111 т Толя доки пи ТАТО А дТ ТтпЕ вБе зі іп осзіу їпто Був 'Ууйдлі БЦ рів пуд АБО гпЕ УАі лід діа Со 105 1О0 іди У - 175,1 тнНА ТІ ї ту пет п - де пт ст тя Тл дур т Рго Бек Уді Рпа ті Рпе Рго Ро Беїг Аво спіцп іп ієц Пух бек пшіу да яп дя 115 172 125 те Аіщ ста ді ллді фло Тизіф Твізї дат що ре па тт ї- дар ті І ТВБтІ Атїа Жет Уаї Уві СУу5 Гаеч БевоАвп оАвпоБпе Тук Рго Агаопів Аїд тро миня тр 130 ищь 150о Тожж хк т її ї пан Ж кем КУ от Вл і - тони. г. т ек ту ж Коток ан ув УМаї 5Біп ТгроБу» Уві Ар оАвп о Аія їй бів бе піУу Ав бек сій й лег е я шт 145 15 155 15п т 2 я Бод яті . льш ор омшеуня адек подіє а ОО. т юдтех Со Тоащшлі Чек йЧябацл о вет Уаї Тпкосів піп о Ашор бек о1Уув АвороЗХек ТптоТук рек о Бей рек адц я тут, ат т65 170 178 Ср ьо Те ть Та бр Тут В що шу Фівю с 1:53 Тв Я шо т хаш Лящ таху йекг о оТбк Ге ТБ Пен бек Буд Аід АзроТук бід пух Ні Буш Уді ТУук то те пл 180 5 1щ.- Ал жу 1 тд р Я шо я (Ії така ну хі пе Тахти вк птіа уві Уа: Ті нів ' г СіУу їй Бек бек Ро Уві? Би ААУ оюшІ твц ШИНИ мн іо и Об т-- де Дак тіл, (тт ес п.» о ввБп вЕФ о бІіУу іі ОМА що Іо ярих р ти 18 «иРі» За доль Тіт Зеіш ДНЕ «віЗ»М Штечна си2О0 чага» фрагмент антитіла кали а «Оу 18 савчуставс ст ссаасо попичедупа сспсечозаваос сопзапослач стозавацьсх во пит тих тт пи я ит внут седан лу жир Ноти пити Я сс ссавстоя сапсоцлчациа ссспабссаса їстапатраста ссзазосбазцо сзосевацеио 125 псодтоасаацч злогоздааєся чаглазчплочо агозассстоа апоаводося пасодаавтат 120 тр що дощову доти пр тс учи щі щтетиру я ис щит діти ситу в ді ЗАВ Зсчсвадває песвавацоадес спросасчастя авссасстаса свсспаслач сасоеавас лає чгЕспдтстла пспедстопвс спалесчацевс деспеспцтдот встівубссос спостдгастлда тив тоолазслав чсососзсоуалт зчадсчацтчвс всосзсозбас астаспсчо подласастад и тчпаззассч печсеочссосо здлассспася Басдзатасу аабастоцдео повадеоаст Зо ж трати вн тла алі састчи бостслаЧче хів «2102 13 «ері Зв ТАТІ там, ЕІ и ел днЕ «Іа» Штучна сиг их фидгишна внаяті на мае фрагмент антитіла кп ча «апо» 15 чи нич а пт и пе зве тити ра Ж чит ж дружити а спасвіссала сластісачат сссбБссацче сгочвалодсспт стогадпазча галачесасс во ахсасатцос ацостазіса зпотсвацобст атопасстоаз сазлагаєса пеоазвацесе 17о тассаццсає сіававсссо зчабстасоецав спосасловоцло гчавзчзасазу зпуплссався іх паче сцсспоа здсассппаце боіцасвосст сстассстла ссабсбсаца сссппдлоса -а6 пед у а н а, я її ЗТ дасте алоию читач вивів сети епі тий лаазцасцссос стасатаста бспосазсву бабоствостп соспсозосас автбспубсаяу НН чзидевадти вепалдеедя т пе чдопсасСссяася ецачатсаай з ща тій то че ши сити» пНЕ «ВІ» Швучна для ванни де» фрагмант антитіла «4100 йо саассссаас кіпцбссавсос чоалласплаа позчсозавсо сполпчоастац сотоававоо о веретено тещі вих еавателщих Фечеу стерво (дет 17а бсзсопсаачо сассзоадата сслабссаса бсасбассаса ссчасолоячс сацпоасадоася 15 ссеопснисавтл слиблидато пабсзсрио псецпасссси дчЧадіпссотлт спосопваднкаї, ік поцпсеосвазл поасозтавсосї чЧасчоесчссзч асстпасосспоу попаопссол сппозававмсає же пдиссазазат боссавзтоасос сптптсоаставл аспоссзчабса сассзасчац састпутатас гай тиж чити пити р ит пе ититик г пірувату тет зу Зп жЖтозачесда довспостпач зацсзацязво аспоасоазрає астіавстцсрпо поесататава 30 бсоопзацастсоп бодбсзрсоасл пзлвссславо гасцавсвсчз ваквссопоасло зпставлолчато Я сни ери Вин зиєщіиИчири пики роту ІВ утри петичи тих ал сс саслл о боестсрпадсоцс газлсассава поссссоссц сабо ссоссі здопсепосгос З- ее АЛІ че 1 ложа чик «вій» НЕ б ть плтгІЛІТУ ч-ї13» Шпучна АЛТІя вени «й» фрагмент антитіла йод -- «85092 21 од орн пир по щ Витерти ори тер гір Вир сів ди р пня чання ча состлабсса сттссчалис пасозсооов сгопоеостосоп оці пвавдца сбасссссос о ср ит ув и 2 пдв ин ач ги ит: ме пен начи пи зчзазсстоесуа созсодазссо чпавстостоедо тосстадаассос ссоалпозсоаса сассбссопе 175 преаития жан жан пр па ян -- рних пет ІВ труди пре и я рей чсесоасастус ватсстссоаз ссіцтасесс соасссотссоа тгоасоласачу сасобостсо 159 рн ан аа ана пк п ор пан о дрів чн до у ци цсветутьє ЗАЙ апсстодоса сезазасста сассочразво зсбопдассвса звчосспсопсав сазосвачосз ща» до доететатит, вес доня щи т дрочити я ри ут - еф ит и ри дити - пл часаацтодя босдавостаа агасоедессь состоссссс сстпопсопс спос паднет 305 пе ери ти чес шити иа уд руху що вирвати пронущ яти вт стцалосцас сісссцьоате кс соссто ссавасссса ацочдовоссо чдатдаєстосо зи пет тю тини три яти и уж - пн ан кра аа а а п а а ти спцчасссссо авапссасссо сзсзасоазба лпасптоасссо водавзассс атадтодсад во їтІсвасіоцу вічі їзчасцп спіІцзаачьї сасадсоста ацассавцоис сзнозовопдва во пн о ма ня тиж нет чит и ит и тику т р и т перев сети -Аг сажсостсазвто шеасспасооп посол то зсастаасоц тоссзсасса ззастоалоу за сощоуніжиру щвия Я щихщовит стресу шо дови дор ти вини ід В из я хз Щи азвслчусазат васпратааоиот саволочіссо засвазчодес пососіссво сагочаднап во ассатссссв ачассвгасцо ссвоассссзо пачссосазча тоасвсассст попсссссбасе зе сю р, ра дет жди щук чит, крат юри о теж гу з, і йт -- - кт п сацчагчаца глассавчавав ссвоадсоціссо срадвосссоссос спцесчазвзачо сбтеБбасоссс А гериення якости в мч що ; тиж рт щощі учив тити дужі ищова В що докт доня заг ссспасаєкс ссУуссзлаато дпазчоссаво зоазсацссосу адавсавстд свачасоивосо го нисствифит гіди о сгичевие віеневива русів вересня ф до дя сиссспочьоас созасотода падоссоос Сососспкасо споссосісдо азозавсоват 345 кети хи дир дос ити т пураенв ин и вер уртих шо оф йузтучеєручче че ичиз де до опе боссссодоас заддаводсза сабоспососо соповосопсав Спсасависе ссеподсасавас Мо сассавбассс вапвацісссб сісссодазо сосщас з иа пб/ля тт т-к ща яр Зк чі им пра тя тісну «тій БІЛОК кі» Штучна «их и фрпліимант днитито «апп» по тлу т Твії Зб ф-т, ти Дт 1 ли тля Ванні ху АТ біп Уві біп оБез; уві біб РЕЗ о СіУ Ага спів Уві пЕЯ4 пух га біу Аів « є Ще Щ 1 5 Іо 15 Фадуко Ху Тягн тйдо нужя фтяиє Тлущуї АЛ дум ту но ди зано Шон іх зек удпі пух чаї зет Сук Був віщ пек ілі1у 1УКЕ вІпП о гпео Тпк БЕаег АУБ п т МАВ го ро 3 Філ о ТІ демо пня хв й вин п Щлодо би тлу 21 13470 то1а (2131 ну; М їТук їі АБ ТтІв Уві Акчосіп Атіа вкЕо сіу сіп біУу Бей пі ТкрМеє 7 ли 5 хх дон -6- А Тікн, (3713 Ат їх» 7. кор Бгто ду Ти В Бі АкКо 112» АБО ОБО бо АВІх міаоУу піу ТвВЕ Був ТУг Аїд БІВ пуй Бгпе зи оо пу Зо, пін зв ьає мА тва АЛ що пені тая бен пня Су т т. спі: біп біу Акоа Ма1ї Типг Ме ТВі Ата АвротВБр бер о Так бек о ТП Уві Тукг я т-66- п і ЩО 75 по хящл 42131 ті я бу т Аме вно тА ре тка да яд ія Пляж тт Уаї бій їецп бек бег о їецз АтаЯа дев біз Авро Тк о АтТа Уві Тк Тут Суз вь Зо з5 Аля однин ем тт, Фаеюко фл 33 тру ли дао ха тік дев, тот Ме Фауст.
    Аіїа Ака о Авзпобіц Ткробіз Тпу Уаї Уві Уаіфі З1іУу Авроївц Ме Тук бів Баг зд чи по Ай 11 блю 7141 тут у шина шині шин Шин че шЬЯ пня хе Фр о бдя іУК Біц тТуг іКб віч біп о біу тк оївц оЗМаї Тер ові бек бе 43 й «Зк 115 120 1х5 «рій» 73 «ті» зпа7 зе ом; спа пт кн БІЛОК ал юку и вратмванто антпитлла -апах 73 вик нене От пот тля ті» ин ті т Ст ви Студ тот п Ал бек лтА г ку азвріїіїв зЗзіп Мес Так обі) сбег Рко бек бек їей бег Аа бек Уді шо-у ч 5 та 5 ії З 4 і дот А чт хі тра прп В ДН Се пів. - та Сах Обду ту, Агро Ах Мді тТВЕ Ті ТЬх був біп Віа бек біп дет тів Бех Сет Тук Ре 25 зу тота В в п Пазюк зви и Ток Таоя тях 1 Дт нт шт яті ів пІій ГБО УББ Зій бів МУ Еко бі Зі.
    Ага го ув ллє зем ла -к 4 щі 35 40 45 білу 7757 7 к зи - доня 13 Ж ок пу т гу хх А пк п но пре, їй 71 - Тук піу А1іа 5ег Агу Пец о бух ТК опіу Уві вро 5ег Ак Ре сек Щіу пи ЗО во Сбеуян 7? Се 7 33 пр Стир я пі ян Тощуяяд плляя т сеяє о Є Тони й 34 зе пек обіУу бек 54 у Тіт ек о ББе Тк їви сп оті баг бйевхт Гей ліц Ро б Ти шк ЗО пл йди Дід АТ зеобяую отв ог тя 11 лю А донні лящ пні хі їла Авр дід Аіва Тпгрот МК ОКчК СУ міг са УЮ під виг УМді Еко Уді зо а5 ке ан АК Шан шов ник ьо НГ АКН ННИК Тлят ТЕ о Бпе сі у віп ліу іпгоБупй хаї сій дав Буд лий о 1во 185 «в10х 94 птряуя ек кк1172 125 ши лм туз чеіт БІЛОК «щійр» штучна ол бьрьх. ча трі, сту шоу хек діт ї - Маки врагментт антитіла Абе ЗА «поз 24 пл ох ота ха т брилі ДІ п тд таз То ка тю дід пін Уві сбіп їви Уві біп Ро -сіу йла січ хМаї ув ув Го сіу Алла і 5 їв 18 йбдн я АЛ ОО Тло ля перо бує Ту Ал дурно 13; я Анни па опік пек ома1і Був Маі Бек Пуз БУуБ Ата бБву піу Тук Ак оББе тТвБк бак Тук ре 25 35 тік Ті Ал ть тя Дачт тів А Вкар ліс 1 волі хя тел і Ти Ма і1ух з1іваАріІіШр Уа АК сСсіп діа вБгоО іту сапосіУу ней сіл іо мех Б АВ піз» дже ті-ш ода, Бий (7114 0134 2313; (715; ль Толя тую А пі тля Ві ЗіУ Ач тів АвроРко біз вій сіу біУу Тк о Буз Туг Аїа віп Буг Рпе зи 55 Бо сля я днинтя 1-1 і пах Вч Вау Пн ми низ ке НК а ДН пет іп біу Ак Ууаі! ТаБ Ре ТБг о Ата Ащо Тако дек Тбгт о Бах о твЕ Уді Туг ЗБ Зі З ст по ТЗ 15 зи хі 003131 Тел Со пек --і те Ся 731 дет ль ДІ хо бтяро Птятяя фу туві БІ Бей бек бек Ге АЕС Бек і5зій Ащо ТЕЖ Ата уві УК ГУК СУух ц5 Зо За для одних Де т я 113 нн АХА 121138 Дату Тідая піч Плату (7134 нів Агсеа вн соди Ттр З1в тк Ууаі Уві Уві ш-а М АБО реп ОО УК Сл 100 т1п5 112 берує 231454 Па беру (УР. 1, 0713, т Тез хлві пру хтаї тах бек Тук піз Тує Ткрозіу Б5іповіу ТВк ої) Уві ТБї Уві Беї бек 115 125 125 ноту з НЯ р 25 «115 107 «тій БІДОК «із» Штучна «пли чего Три Яру доти яті ІТ -ї т - ки вТрагьент антитіла ди З ча» 2 пд тів тн Ма три ит оду ло тро тт тда ля о Ал я тм ТАЛИХ Авр о ї11а біп Ме Так осів бек оБгро бек бвг о беб об5ег Аїд бек Уа! С1У т к а т ї - во 42 демо дня ді тя. допо іє й ро пл я бан 1 дає Ж А Сб Федр пли АвроАка ді ТЕ Тіз Ток оСбув сів Ата бек обіп бет їТів о бет бек ТУ ро 25 Б тона до ту пк: зве 1 Зк Тіні Зх 11 нн шо тя тоняя т пед вІЙ ІБ УББ БЗіп біпй МУ ЕБй бі лай відд Его пущш паю і а 45 Філ 11575 АТ доатию 13 Тл пік (2157 371 ку лок дк тр. бю іл Тух п1іу А1а бек Ага Пец Буз ТВкобіу Уві Ріо бек АкФ о РБе бек сіу о -Е - ви За Бо Сбдя т За 3; фТнНе один Бра ть Тен пвьам ті щоб Тер пі АТ пек піч бек пі ТВ о АвроББе ТВБк оїевцп тт оті бек о йеїт Гей піп Аа по. ті тт що 65 го 25 зи 113 дит В щі фреон пу тут (т т паху А я ях Ма Сів Адо» гБев о Аїа ТагоТут Тук Сув піп о біп Тук Аіва сег оУуаі гро хаї зи ЗВ ман я м Во Я о по о пи з ПИ тп пе -1у бік 5ІУ іпПпЕ БУ Уві сіщш лів гуд п зак 100 1055 «Пій» Б «112 185 шопутотю т, готи «ВІйх БІНОК «па» Штучна дю лави НТ тЬ, дер тот лит дллт ї - хи ВпрагрменУт антитіла спр ЗЕ ча од тт 17-00 тя х7Ат хни 7 від т, ен Тонер тт, ді піп ові бЗівп о Ббезлп оУаї пів Рг5 ім діа ій бе) аку вап его су діа з То та а її - ва - т - хилдуі Тк х і Соду ето пл ЩІ Ср ськ тат тут ТІ мине дит по. -- зехт Уві Мов Ма! пек осв ув Аа бек Сі Тут Акое Рпе Так пек Тек п а Зо Тако тіше Твпрозгадї дк пін А Пе. право сія» Теза (111 преу, Мей Тук ті Авр о Тгроуаї Ако бів Аіа руз біу піп бі Беп о бій Тр Меб 35 49 45 лях й вик Те пошті зк-т 14145 Док 1 тя бант Тан Во з гл ток зм піУ Ак тів Ах Ів Еко піц Ашпр о віу пьу БГТпЕ о ГУув їУукК лів бап Був впав ази Зо сг тя т, вк лк ть бВіщо твья дент даму пня сн ть оо сдрає тьяня тд Фіг сіп біу Акад Уаі Тпжх Рпае о тТБжІ Ага Авротапк обеє ТБг осдеї ТБкЕ Уаії Туг Кк те Мгкяо Гай З 15 ва Де гл а1 Торі ау ся уза ом дан 7131 п пе В худобу пляж зу Мел бій Без бетї бег Гей Ат бек о бії Аво Та діа Мді Тук ТУЮ Сез ва ай за тд о дрвияо Ася (1353 бари 1353 тва 328 171 17 ряд щі Мафбобаею 0113 Аїа дк Авпобій ТкЕб біз ТБбт Уві Уві Уаії б5іУу Абвроїей Меб Тук біц 100 122: 110 сягяя та Піт стану с(7Тяу Зв (115 пиво ТАЧЯ 3741 пі ді дя тах їж бій 1уЮ 1ЩроСіУу сСіпобіУ їпрогебв о Уді Так Уві ЗХек бек зл т2а лот ни 2-5 і-о5 «Ріах а7 молю м тут хг1їх 107 чит» БІО «мій Штучна диво» побу ху тів лот дікзтияасї тт дев сбрагтьвнт антитіла АЛ» 7 са00» 27 Маю тів ів Мей тек с Се кт Чек лек Те шт ДІ рт тоні 237 ху пвр ії зіп мес зп обіп сег БО оте ОсК ід ве пла ок їм слу 1 5 18 15 де в АН плнюк тт пою гля г пз ще Шк Ср тт "У - Сід Птах Авр о Акл о Маї Тр ої1е ТБЕ Сув Зіп Аа бег бсіп бет їТіс дек бек о тукг вт ЗЕ що п Ре 1 пут А бно пато ут тр Ток Піч у 1У- я Те - її Тяї ТІ.
    БКечп о Ата ТкроТухк бій бій Буд Рко піу піп Авра Рко Бук Бей без Тіє 4а 45 Тлітує дл ху В ду В дн зх Тон ун (14 ХА Гн тонів Тиня - (ті х» Ттук Сіу Аа бек Акчз о Бец обу Тк обі Маї РКО БагоАто Ре бек пі У 3 З ї В. - 7 чад БИ 55 пе. шо ---- з т кт Тіла и 7-3 1 де твЕ отр Тв ті даху дек о тец пів БКо СіУу ет іх пит дво п іп іх г и з І мит Ак лак гі ве Сіу сек сіу тТаг АЮ Ре Тит їй ТВК о ї1іє без І ще ще пп а чи 55 ще я - т аж спогян т ГП/дуз 7-1 тю ху 31 з-р Аїа Аїа ТПг Тут Тук Сув біп о біп Тухт Аіа Бек оУді Ркро Уві сін Ашр Аза Авіа ТБ Тук Тук Сув бсіп біп Тут дід у ще 55 а 5 и т з --1 т гл, вм тя щі 71134 ет ТьЕ о РББе спіуУу бБіп біу Так оБуз Уві сії ті Гуз 100 125 «гій» В «211» 126 тура ту, тво паїйУ БІЛОК сеї ШПвучна ЯЛТИ Гу ви и пт дан шеітпо щртптяє ла «ші» шфрагьиент антитіла гг по ча рі 1 1 1 т те бан лу ЩІ - т очи нин ал ши ху "ж ку тях; ДІ р Тха Тух УшЕ о ВкКо йпіУ Аїд сіп Уаі піп Бею Уві біб Ріє піу АвРд обсій їєй вуз Буш Ре їз і 5 19 15 ї - ї ть. т обкл от тт - же жлжт ВО - ше (Зі, ббПпхукво Дт Ома гне лек гхт Щек МаАї У Уві Шен пев ук Аїд ет іі Уу пог вЕцОоЕпа пп ва звичаї ух Уві свгОСУув У ліщ ою 54 У у я щй як те МН КО; А и - - 4 3 томі ті в тд а бів дід Бре пі бів пі Гви бі, ко Мет ТуУук Іі А5р о Тгр о Уді Ахтоа Сів Аа Рго сіу біп піу Бей бій То Ме тук Ті АЮ Ткр о ув З і і ше і 49 ле Зо У со; РИ : тн длщо и ті тд - й тиотесхух па 5313 Аа Аід пі Твк о Ггов Тек дів ів Бухп Бе бі Акц Ті АБИ Еко зі двгролів са ІПТ Був ІМ х У 5 а аа щу зи ; - я й тя яті - 4 з тд: о Вр пл п.
    Даші Піх тотьЕ дек отьк о Ууді Тук біпв о біу Ак Уві ТБ Рпе ТІ Аа АкротТпх бат ТБЕ бек Тк о Уді Гу з Й Й 78 75 ва 5 га З 8-1 т пн А тя пт туги Годі хи 1113 Таз пек тр Те Дкил йшюк л1і1ю Дяьу пнк дід зва сб мЕ ТУЮ У» Уві бін Гпаеач пек дек о Ппей Ако о пек бро А їпк о Аїа Уа ут Ту 5 пк о зе ць ве Зо З зхАлЗоох -- т ї спууаєо 114 ; : Бій ТЕр піц Тьж о Уді Уві У; піУу Ар Бен Ті: Уукозіц Віа Ач АзпоБіц Твгробіц Тк Уаі Уві Уа)! Біу Ашр Тев Тік ту що т 7 я чи 100 135 119 100 и 4 сл 1 ті то уще піну лла її дру тилу т 14 рт пря тлу, її ік п тель ли пт У Н его тУук сій Тук ТкЕрозіу б5іп біу ТБк оїей Уві Тк Уві пекг щі й Щ чоти яотк ТЕ Ак Я «10» 59
    «келі» 105 крах певними «вій БІДОК яр тен шк Ше чн «20» блю Дуртосв ол ситі шоллгплтиті - чтЕшаР о фрагмент антитіла кА 2724 3005 25 Дану ті -щ ти МА Фін бно юну гпонн, Су Со юко Тл Сдуюн А рн НТУ НИ АШНО Ашротіє піп Меї Тпг бів бек РКО баг о бек Гємй бат Аїя бек Уді пшщіу 4 Кк ат Яд ї Мо я; 45 дош для А ОО ть бір б'куєк сх З долин г ю а тіні шия об рах АвроАкс Уві ТЬт Бівз Тк о Сув о бЗіп Ага бек о біп Чет тТіє бекК оба Тукх ще --к з 2 ех за -л ді у т пе т м тя Грея піт 1ксї т -щ Так бпошщшажи то- т ті - їви діва Тко Тут біп о біп Був о Бко бйіу Бу Авта Рко Авпої-й Гей їі о 45 Фатує іс у ЩО но поодоаниє тоді Тохтс Чян т141 7-1 зву був ач лину Од т х Бук ціу Аія бат АкЧоїєвц Душ Тк Січ Узі Рко бек Аг рожпле шк слу БО БВ БО Федів т йди ви о Те: Ти ля ут ху Тоня (тт при 14: ові жніу сег ілі у тТпх Азво РБе о Тик ій ТЗ бек -а У ід СІЙ ЕКО бл ше те преп впй по а й ше дев дів (рію ть ху о тако оч пін пря тик А Од ді не, тр: вир від спіУу ТЕ тТУух Ту СУувВ'зіп о сіп зує Атїа бек о Уаії Рго Уді тик с ап спе, не а Зо т піз тя ія: нь тк лід 13 те туя пе сіу ій Спіу ТтТпх Буз уді Бій 116 БУух па тп з 15 Ди як «102 30 чеЕїі» 125 сеї БІНОК «кіз» Штучна хи киш Я йгмМмаент антитіл «ап» зо З хв 1 те лі ре Зі ля АТО 03 Тіз То Тс банні т ху 1 піц Уві бій їза Уві Біб пек оці у вія Саш о пей БУВ Бул КГО шІіУ дів я в ла 5 ї но) У вищ року иа ши НИК а -оорижкує Тяга (71 тт жи ТІ пі м/добу ек Уві ув Уві сг ОСУВЗ пуй пів сови ооіу Ту: АК гПа ІПКЕ осоЄгОЇУБ р пе па 2 м ть тик тів де ета на На Ше НК ЗтТиоо Тоді тр тю МАН 1УК хів Арі Уві вЕОЧосліп вла гг оїу сіп совбм Се сій Бо мес рід до Я. о и о пт й них І: дощу те п 07114 р: и у рн То ппяун АТ ЩО ТУ Тк пон спіУу АкЯа Тіе Аво Ро піц бій біу сіу ТБ Пух ТУуг Аїд бій Буд РоПе ап 55 ви кт 03139 дали тя ть Ма ту Аїлщ овен, я и Пп ді няня В що птн Сіп біу Акта Уаі ТБ Ме ТБЕк Аїва Авро тк о бет Тато бех Тпх дів тк ще та та ЗА во и Не: во тя инші шок ша ши фрукт Ши 7131 йду НУ А одоохянбзютую буру тт Меї бій опез бег обек Без Акео ойек обі: Або Так Аїд Уді Ттук Тук Су рен пт пд па - МО Ге дян бр (т 1333 пні 13 т 151 35 ха ля ту гуї3 Ме бан А Аїа Ага Авп обід Твробіз Тк оУві Уві Уві біу АвороБецй Мет Тук піц зп чпи чле 1п0 05 110 пря да - п ПАВНЕФННАЧН Тк пін тема 37 три 31 др дин гук бій бук Тко сіу піп о біу Тпх оіїецй уві Тйг Уві пек бек хх з ал ч-і17 15 щи вера дя я «510» 31 «ТЕ» 107 «тив БІЛОК «іЗ» Швучна «асп со «вад фрасмент антитіла Аг гх, З кас шо 31 те ті ЩІ М ть пі бди ти дя Ся тут ню Але Х нху 1 л Авроїїв біп Меє Ті бів бек Руо бБеї Бек Пец бетг Аід бек фей зіу я Го 3 а з ц ії но ща. іо рі НН ки хи- спе -- пря кб?ята 711 тло тп ч- ан т тт подач т оби Ар ат уві Іл тіз так оСув бій Аїд бек о біп бдеїх тТіе бек бек т УК и и ни НАВИ НЕ Хол тання 713 тн АТ з М ті Те Ті пе Атїа ТІ оТук зів біп БУуб5 Рка бі біп Аіа Его Ап оїів Пецп Ії 2 ди Е ЗВ и 435 пат рт ху переко дкек о Тоія Товт Піча т т 35 Зати, б Дати ния док 11; УК біу діа оЄг лАЕтТ БЦ Бу ПЕ лу У аі РкОо пек Аг ФовЕпя сяк слі пи 22 Бо Сб (ія; бра (3: тн дк Тра отптья Тела: ті 1 бек о гія т 1113 АТ бек йпіу йвкобіу ТБЕЖ АвроББе тк о ії-З4 ТВБкЕ Рів бек о біу еп бів Аїв ккд ча те п во ги Еш по 1130 дну Ве А Ло пря яко пПтях о їн дн ру АВ ут гнуяяу ха пів Авто Ре о Аів Тк ої ЧУБ ОЕМЕ КУ го бат Тух Аїіа зе а еко чаї а за 25 тва Ша ат ря Ру тва тля з17д (7113 0 Тор ТпЕЕ Пе бу біп сі їпЕ Буд маі ій Ів ух 1па 125 ять он, грн «ке10т зе се» 17 штрих стояти коня Білок ТВ пт зо штучна СЛешеВНя 3 врдпушит ді поз Ж трагоашнт антитіла ДЕ з «Я се дог ля баня 333 пряні ли: 5 АЛЛО ХВОЯ 7 яд тодзія про прятяя 71: бСпагає т. азп осай 1хтробіц Тк Уві Уві Уві піу Ав огГев ТпЕ туго сад гук зі ї Го п 75 і З іо 5 блутух іУВ У 77 ер Зо «Тіз во и, пли у став БІЛОК «213» Номо дарівпа «дл «4005 з3 М Доник они нт : то- тотії жи нн А нн о он а у и Мет АГ ЕКО Сбітр ада Кіеспоіец о бец бецп дід Гей гей Так Бей слу іш-и я 5 та тк А З и о Аза дп МІ й дог т тщ о БнА.
    Сіхіяо То; М ді дане Ток Тляє дів Аа ліпні ліп алроьув Ул рго Табл их Маеб Уді а»А-о МВ ях хо 25 3 се нка Шах ША хущ -щщ 21 ху Бої Течії 173 хі нию о ще Тер рве Уа ват ухіп Уві тес: обі белпрівц бів Уві Рко бек оУваі їТец Бго -ре я яд г
    Тл Мк твоя (77350 ує 13 А Жди ра НИ ши ЩЕ У ВЧ тім т ї ту ббрук о т Еко Аве отТБк біз ТБ їецн о Авроїєц сег піу Аза осліп Бей АкчЧосбек 116 ще ва гг аа за щи з т - 2 та дз т з 1: т -щ-31 що дян Та 313, СН яв тя оту духу Ці до 1 Дер Тіна: іч Аза пак Рус еп осСіу пе ТК ТБт Аів пед Ак Нів Пі АЗо о Бец де М пе Зла по НЕ 15 а т я Фр пат гл ті сн ян Тотщія в а р ВО аск ля тд; Хек Тв Авпобіч; Ті дет Рпа Бецп о біп Рго бі Аз Ба піп Ата гео Зк -д де по -к то па ці ті (71113 04 є 1 Ст т - Аллу Ця дозу ех тех УЗ до мн А - ТйЕ пів о ПеЧ обізч Ніз Пец обеїх Без Аза пів Ашо Ако Бецп Аза Месє Аїд ий чис да ГНН М лі Іо о 45 сіру т одтї ян А У 1 ху 717 ху Тоечтя 7 3 Гужиу тот ян ач хе сту ее тпІ Аїд без Бек о Аіз бі по Бец ппіу Рбто бе) гка Аго чаї тТвк бек т топи пи 1 ки із
    : Дек о Товії Срезяя пііяк дамі Ор Толя Пк Сдяю 7 5» Тоді тоди 173, Для Тоді івц оАлр опац бйег обіу Алхо бек Бей Туї бек о бпіу Бей обецй бій Акоа Бай з на й мя ап а -щ они - з ат РТ 3 (ит До бе; тю тона 114 пот ик То ДО 1 пат Чиж їзи бі біцп діва Еко Бек їй Ні ТЬжх Без бег ій Аа бі АвробеБ що яд -дЕ яд 145 151 155 180 --кл тва дк тя тнк де ї - плврво я Арев д ман Юк. хід т, 1 Без ТтТпг о Аку Бей Тк оАко НіЗз їТпрогпе Ак Ар оМес Ро дія Бебв осі а св дя пе іо 179 175 ьш Тощтзї Дон, То ті пА ек дя АТ: та Деко тА (13454 дит (т 17 АТ Сапопед о длро бе Бі бек Адпоуді іевроМеї Атрої1їаеа о шій дв о сбіУу діа ай ше 1 150 155 150 пнях (71: тля т Пт ву тех твоя т пат : т що дз це ле Рпе сіб б5Біу Бей Рго Ар о Бев о тТпрг о нНів ів Авп о Бей б5ег АгЧ о Аво бевг пд зап 7 185 по 2415 пз тва гляд т ил Дт з; пп - Тег плн т І пе чт оятя Вошт, Бий о твВг оСув 11а Заг АвроРбе баг ої біз біп о бео Ако о Уві Бей о Авь чи яп я» 210 гі 22 -швтщІч Соня бю дош ан ни и ан я ие ть 1 ле нини Сян 721 Я плн тло Тец бек Сук Ап бек т11і6 31 Аза Бе о бів ТБ о Аіаз бек о бів Бво біг вл ла ре нея зда Фо щи «о вас І НИ АНН ро ТЛ чо Тая прі ко фан Жощяя Турині Тон тонну т 313 де тхе Пощут Тот-т Аіда бі Ре біп Без бпЕотКр ос АЗзроБєм Ага бій Авап о Бук Гей іец 245 25 255 пі - ті зких А лу Тех Ав А тя ВУ боки Тела ТІ беру т ся до тен піз Ре ко Азробей Афа Аза Бец Рхо Акчобецп о т1іеве Тук Пе Азпобец гу зи пет 280 2а5 27 хат Ал о Алп о Баеац тів Акоа пецчп о Руо Твї о піу Бко Бго піп Ав» бек ГУ сет З зак пово Во ї-1 тло міді ни но и 13 27 ху рин няття Дін пек д- сіу тів Нів Аза Ркро век обій піУу Ткгробег Аа Гей Рус Бей сек Аіа ще яд пт ше -щЗ 2 нен таею о їсте В до лик її Доник Винні Та аю т тя Тема дош 2-2 ЕКО 5 са У АБ Аід бер пі У АБО ЕшОо Бей ооет сопе ей дл ів зп зо 315 зго АвроБбезч бек о Тух Ап о бій т11іе піц іец тів Ро Авробает Ба о Баепосій І У Е 325 330 55 я а тод б іяя Є дуян Торля гля: Чи Товт нні ох нік дян Док, гля Ж нт па Бяейл пров бБєйІ У Епе опецй Ап оїєц бек АБо Аа Мч фєт дО гул дл А зай за 25 пня т 1: для Аня та 2Тл дя - тах при тт т т пет шк т Тпкх о Рпе бій Аа АкчЧ Ага Бей осСіу бек цей РІЗ Сувз Белл мет збенвокецй 355 зей 3655 ота. пани рада т Щи Торо з С 1431 поті х щ 115 т їг ох ус Тези от авр їз оег пів вп під Бецозліц Так о бейп о бій ПейпобіУу Аїв Апутвд Аді а 375 зво пора А я и ан, пн КАН п, а, о ок ПАК ми М М о ни, «ма ОК, НКИ ів; бпіУу бек о йей Ага тбВкопец о йей інь сбіп біу Ап о Аїа ви АгуЧ Авр зв зао зЗ95 00 -ут таня тр спутля бан ТИ тло тс жо ді» чі - Жонуя ї ток щдеур-олІі ТМах іеип о вгкКо Бко Тук Тахо Бпе АРга Авп о їечзч Аза бек Беач о біп Ага Гей АБп яп ал 415 45 41о 415 13 1-71 - хх Ме Длечч лі Си ян нту їхх зх тях Трвуяу Дону 3113 трину 117155 Бен обіп Зі У Авп о диз Уа! бек ро Оу зу міу го але сіро КО су дл пл дп зо ай 430 в Свої от х7-ї кт я тон, он ни ни їряє о Сію сет ян. зе тет: го бек опі був ді Ага Впе бек о піу т1іє Тат бек Геч Ака бек Бец ДЕ, ле ЛАБ, 435 440 445 т тот йти ди ля т грн не ма у и я Че ШКО їх АТ ті тот Бет їй Ха! Аз» Ап бій 11е піц їз Без Ага йіа сі АТа Рада о Ге оо я ц Р; ж ав 455 4ЯБ5О да я тво Ватт он:їі Тьк й 134 тії Аз Тані вк буде Грн тт т 3 133 пів Бак о еКоО Їей Тако Бей дво іїецп рев шевр авп ого 5 у ідемо ла 65 370 35 40о хтАл Еш пу» ут Тоня й хх й жо ет т о-охе ї 13 хт АТ т - чаі Аза Тк обіу Аїв ПЦецй пі дім їв піп дід баг Теплі Уві Гей на 4198 4а5 ді пейп о пів піч дар й11іУу Тєн Ме Ууді Безп ців о Уді Ар о цей Бко бу тптаа пи іп мМ в ошіУ зей мас УЯІ п зго Ууяа вл зей го уд Зоо ВО піс Т-нть Жора от Т я Доти т з Ва Ж она РІшИ ж бус ре Тозеи т 7 7 я ТЯ БпвоБів бу Бей у Аке о пей Авп ій Аа зій Ап о Акоп Бе бек НІ і; у З з: ца - -- 7 Ж, зЕЗз пе Зо ті Ті х що ППвжжу Пьм їз хл-щщ о тя 27131 7-1 а шт яооблент бен РКО АБа ТІ Тахо піп Аза Уві бек Бей піп Маії Без Ар о Гео Аго ли ще пах и за ла па да брюк В ше Точал Товії Паннту 011 Чем А що Ма пі, (137 т 3 114 Авп о Авпобек Рпе дет ПЦецйп о їіецп Рго піу Бек Аїд Мет пі б їу із сій ле я вве 2 за5 Бо ьо а Тапт свт ойев Ата Ак о Пебй Тук Дей осзіп ціУу Ап оРтО Гей бек Пух ств веа зі 75 сх Аж, З сто Пан т т т 7 - лАНИ ті. хлІш він Тл хх й у З - булу тт сіу Авпобвіу Тр обев Аза АвРа о біп їез Ні 5іп о 5іУу Аг Уді АхроуУді ЗВО АВ ща
    Фужені КО що ян ї поши -ї тої тв ун туї т сива и лан льше кн ам я 37-17 АнроАіа тТВКЕ бів Апроїац їІ1а Суз АхЯ о Рпе сбек бек бій бів біз Ууді пав дай дпа вч и 0 ам оте т Ці х7АЗ йкик пк 1134 кі тт 135 Тулі 07 я я То, т олв зетї цей озетї пів Уа АКЕЧ РКО само оАЛЮ СУБ слім пуш ші у ау іє; о пус щи ячЕ як ва віп що че тел Щек Тоня тлу т ; тру іч т тод 15-1 п -А Ж що Адп оті Ащпоїей ї11ів тів Тів о їбейп Так о РПЄ Ті іє Уві бек дід тів ся стук пе сяк пе зи 635 6бЯо Тела тав ть тпькво тв п дод що їтяткі гля тяг ану дн 77 Толя В іїевц пев ТІ ТЕ їейп діа дід Суд Сул о Суд Уаї АгУу Акшобіп Буг Бе А до ОБО ай пою оо б ТЛ но ж тд ода ло ав осзіп о оіп ут У ліц Би ТР для та А аз сит ЗОп чі БІДОК ми лиш Е тут се «135 Ношто здрівнп: яти чи ча за а ник зт дн 1 птучо возчех т тя Тит тую т : т дя шал ки Тато тищ1 Мас Бка РкЕсбо бет спіу Бей Акб Бей їецп РКО Ббецп обец Бей Рго Бей оіїієц я с а 2 ї З 1 15 та тв: тора Ат т оддя б но Тіла я 71570 Те Ат АЛ й тт тва тго вп обебв оУді Бей Тк оБкКо 51 Ата Рто Ага Аївз піУу Бе осбек ТНг ри рія гл 20 а З тя Тоді пня ТТ Дон я ія тоятя ЗАТ зе доня т ху ни тд 17131 В З бут БУ ТВтІ ї1із Ар Мат пій їй Уві Був Аку УЗ Ак 112 бій Ата -к ле Кн 35 о 45 - - сет - Фе тт Ті т 11 АЛ го я те пак ті АкпП о біУу бій ті Гц бек Буд їй Ак о ген Аїа Хек Рто бро бевг ай бо же пі» (1345: 15 тн и ТЕ лк пу тота ня іт а пу 371 - -о АТ - тощо їдіпрізіч ій Ма го Рхо сі У БЕБО Пе РЕ бів Аа Удаі Гейл Аїд газ 5 НЕ ів а чуми А лу є опару Ву ди щі АЛ гл т рн АТ п Приту 734 їут дп озеїІ 1пЕ о овІЧ два АБЧ о УВі від осі сім оовг діа са РЕ Сіц з Зп 5 тні 1. ян (я те довж тт лу д Тотех іт 14 Ро пк дя й вит т тот РЕто піз РКО зії дів Адо оТук Ту Ата Був Біб Уді ТЕ Ага У ві Бе паб и, ен НВ; їп5 10 ло хв їз тв тк Де 31 що чт дату Тіт ДВ. лк 7 брак пла Мет Уаі біб ТБЕ Ні Азпобіч ї1іе Туг Ав оБуд Раз Був біп Севк тб чт от я пз 0 РІЗ 1 що
    : : пі тот ву (111 Ал до дді 34 с т с ре т Дт ТьвЕ о бек о пі); ти Ат 514 ід Уві Нів Бет ї11е Тк Ме Рье о РБе Авп Ту бек бБіц Бей Акз Сі Аа й ах аг 35 ТА 138 135 140 т т т З - ми НН ій р; хі ї 1 ек Арт Аді тиші де 21 е Ам і го сій Рко Уваі Пев оБец бек Ака Аз бій іїєц Ак Бей оБев З Бех
    145. 1щ 158 155 145 по 155 т НК тліє Пе ве т т хт-»1 1 м 4-х ух - Поу її чув оТиук ет дед Буд Бев був уаі зЗіб біп Нівз Уві біб Бей о Тук пів Був Ту шо Й т а те ї пл я те 1 А 41о т - А не р ядер овЕ ТЕр АК УК Бей Бек Авп о АкФ ої) Без Аів о РЕо бек Аню обех Азпозек ТЕр Ак Тут Бей пек о Авп о Ак Ге Гел ді реє Е пл тд щи но 19 о о Же АН т т Срдую о бчто дошку 374 СТ и зв ді дко ї51вп тТЕт теги Бо біз о Ткроіен о бЗех Бе Алроуаі їпЕ о біу Мві Мді Акоа ї іп за зве ниж яАО а, ой А Є іх : т1іе біц бі Ре Аг бейп бек А1а Ніз Суз бек Ага біу зі бій тіе бід ЧУ Епа сеча ТТ під пІЗ ух г Бех Атгу біу біу бій зів біз бі Ре Ага гей Бек у вів ЛЬ, гг 4 шо с А В Аг ТЕ тей пів Уві Аз ті Ап піс вне тьк був Аво» Бех АкЧ Авто Ап оТВх Бей о сіп Уві Авзроїі5 Авпосіу тв Е Й Й а 27 та 5 и шва Бу ідоли м ще дови 2 ж твщтяї вл до тк тт 118 іє Мев Ап Ака БК тТвЕ сСіУ Ак Ак о біу Ащо Бе) Аїя ТК оїіе Ніз бі МеЄ Ап Ако у Що Ше й яв й ЗА лаки зах БО 255 В т тія суто Ра В т пе. Т п Аа 5 3 з ті то Вл є зе-рсдІ Д А їавц обец Бей Мет Аіїа 1 ОБЖ Оо ій іхі соя зіщ їхіпй пі у В Ра їец о їец Гей Меї Атїа ТБх Рез їеб БЦ АгУ А ні: Би 270 к т те Фагот БЬн: пит Сл е - сгрНія ву Акт дід Талі де ть дк УК уд нЕпе рює цар ак сет Ак Ні Ако Акта діа Гезп Азо ТпПго АБИ ТУук Су - --Е й пат 75 пт ІН В що пакожя; - т хх -. 1 вх Теж тів даю нь» о дкг тод Так біч Буш Авпопув Суз Уві Аку біп оБшй) Тук тів АБровбпа Акпоїуз Й паї й Й 235 зпо ап я ьжеке т т14 ВН ня Тв «АТ лк пк 114 Ата дар Е Зі 1 пі ТЕ Бу ТЕО 1т1е нів сі го шу -і1У ЕУК піл вна АГ Авробем піУу Ткр обу Ттротїіе нів сід БЕ: вух Б1У Ту ща зпе 313 515 зго 5 А зо щі щ по Тут сін 87 плаття» і й Н г: кобзи бек тек тів Тк КХеву Бе Ат ТвВкобів о тУк РЕП був бецп осіб Рко Суш РКО Тк 1ї1їа То Сет їм АзротвЕ Біпоту що 7 Щ т Щ ї ле, зай 330 335 З- -Ах 7 114 7 тіж я іл Від пев АТ З 1 їаї 51 ді: їні Тух дини біп Нів Авп о Бко спіу Аїд бег Аа бек обу Уаї Бей Аа їз Тухк Алі бій Нів Азп о БЕс у ві й зді зах ЗІ За з4х діа г Сув був чаї Рго бБіп Аід їевбв обі Рхо Пцейп Рко їі Уді Тук діа Ето СУув о Суд ді го біподіа їіевий бу То їй У льОд лим це Дак 358 350 365 по ку що шк фо ТТ янг тк Туш тя -» 22114 ті їордухт па о Ж тла х5-- гук Уві біу Акч о БУВ РКО ПУБ о Маії бій о бпіп Бей бет Ап оМЕБ і1іе уві тт в» Заг зи Не 5 кн не зго Ж ут бика С - пло стни Су щем Ат ог ЗВ зай пеЕї10» 35 плучою пат сезі1іР» еВ лютому ретголузеи вали ВААКу БЕК ие р щ Оливи Нате валах каната ле «405 за Ток Суддю ною Тон пня лоно те зд-- т нако чи Ток Теж жк Дня Пец йекЕ ТВБкобУув Був ТВ тів АзроМес Сів беб Уві БУВ Ака ГПупс Аква Н 5 ІН 1В ї я и 15 ті 13 ді ті. ето т ху 171 тА тера я Тоді Тоня Волт ду діш шах ї1іеввсій дід лів дО о біуУ зіп о іїе іш пек Буш пс АЕд іга Аїд бег ЗА тт ляже М о з ех вв а НИ АНН тля 7131 17-00 гуяяину пр» піт пні тот танні іт діт лід Рко Рко бек обіп б5іу під Уді Рез РеЕо біу РкЕо Бе) Рко Бі Аїд о Уді 35 42 45 Таз АЗОТ Філ вт Ст Ве йно дяну Доник 7-1 ДІ пт х; 3, Пбнюю до о- їі! під і-й тут дп ог ууезашванн ввроагу тав вів іш Бій ов ві о 5 па
    1. сік 13 з, 1131 бант ПІ я АТ я псю т об дтяи В що то ля (7 хи твою піц Еко біз Рео бій ргкоз о зій Аа АБО БУК зу вів пу бід у ві Тік дк тая ча по бо о го що та що тут Ки тиші и 3 ян 14 Тбеш 1, т спот дош зтш заз Токтае АксоУаі ТБТец Мев Уві біз ТтТЬБх Бі Ав осій ТІїе Тут Аво Гу Рпе Гу зо 5 піт ла ть що єть т тяж Мн гя тТнв о дея ть г - т, Тиша Авт піп дет ТБі о Нішвї беї їі Ту Ме Ре Роз Асп отак бет бій Гей Ако зді тпа та по 105 110 іч дід Уді зве б. Баки ла Тр Ті еко А кг ДІ 144 я-ия йон Тоді Зі дід Уаі Рко біб Рго Уві Мей о іїец век Аку Аїа бій Бей Акоб о Бец чат що ця 115 120 175 тону прання Толя Т хто Тоня тва хх щ 114 тт я ад 17-11 35т ет гру лот іш-щ-щь Ас ей 29 1 Гу а хай зі сій пі Уйлі а ін Ух піп У Зх 140 ті Сак Ду Даг Сб яєчню Пігу пут деет о тодя - Ат пт їЖг о оеК АдЕТ АВ от 1 про УЮ ім сб АаподЕб Ов їде дія ко 145 15 155 160
    Фбезує дону та Тіни ЇїТ1: Фан.
    Тишат Ск о БМ ни а нн не нан у нь нив у Чи бЗет Ар обек Ека йпій Тгроги; бек Бпе лою Зал о зпЕ осі а ха Аг лшЕ дет я 1655 170 175 бат бан Тихі еко Анни 215; ух («7131 ті п пт Ви пох для Єщ Кд - баповгр ім век дЕФошаМ ізмМ ій ле сі ау пе лак те бек дід 150 185 іа щі блуд ок Вт Сея Дача де твкотТатр тн 81 до 75 дош Нів бух бак був Авродет Акт оАжхр о Ап о Тако Пец осіп Уві Аврот11ів Алл ля --к я -йг ї52 ий ба АН ващоптьа и сту Ану Дачос1535 ле тера дл ть - Мід; ме 51Уу ВНа тк ТтТик пію З!ЕЧ АКор'іза у Ар оївн о Аід тТБж тів Бів'с1Уу Маг зла се за МО) и о Айщту Ден Бан ну ел Товт -ія о Тучат бр щі трі щі Титут 7143350 доня щої тв АвпоАкоа Бко Бпе о Фей оБГеві ГПез Меб АвРд Твк о Рко Гей біб Аку АвРа біг тд сю, ТОК тка гл ко ЗИ ка ай 4 ке гена шко Ана НИЗЬ ша Не ВШ НА те пів Беп обіп бетг сег АгЯ піз АкКз о АгУ «10 З штир р и 112 пра орли «сжіш БЖ молюлолух -, - кал оди вій» Нота вагрлепя апп: зе чапол Зе хі -л де тТвнкодє уж їз Же» Св о бе іа (1151 Тдущо дн (тлі хик Аіїа їец о АвроТпх Ап оТуг Суд Ре о бег беї Тк обі Був Ап оСув був 4 т їй - А не Я 15 кадети т де тт Ак Тло дет Тит дк ту Туя Плачу "а досі о роей су сів ви рпе вягсб зу вшр о еип ЗІ г Був то го 25 Зо тт тя шо 11310 Шон Тоітею 01 3 бла ті ш ді туш Торо благо Тоня ток ану тя Ті пів облій Еко Був йпіУу ТУЮ Нів АРа Авпо Ра осуд о Без пі Рго Є Ух зе ай 45 35 пбе Спутяно Я до Птн пада приз Дошку бю ІТ літр Ср Толі ли т д яти ЕТО БУК гів Ер ЗзвЕ їви алю о їпЕ о біп о Бук шеф ув вна Бей АТтТа Пец ви ве р п й о яхту битві 1 у ер ЛІ ГПачно їх: я дум о ВО - й що Тік уу б'хуто їх; ДА тт Тут Ап осів Ні АспоРго біУу АїЗ бех Аїд вАіа Рко Сув Суз За! Рго що тр тах п в ги ГУ во бін о діщо ти 13; пк пу рат тори Зла о чаю Ті 35 00145 Дону Ті рах іп Аа о іши біз РКО Ееви Ресбо тіє Уді Ту Тукю Уді бЗіУ ддгу вух во по 20 5 товщ такт яті Тома Сбуяя Дозу М ті хтА Дати дія лює Тотем дя був Маї бій біб о пейп Сет Алло Ме ї1іе Уві Акопобек був Ццув Суд бак див дя ч 100 зо іїп нори бот «ситах з. «211 18 сири БІЛОК ч13и Ношо зарівнпа -дпа ж «Ап 5; І щевк оСуз Аво Був Такт о Нів ТЕ пів Б іїУв ек Суз дво Бу ти Сай Его У - 12 - ІН -й «тп» зв ж Аа зай : г дини 7 Ки115 5 п т топрчтх сети» ОБІДОК ЯРА Носто васбіввра «й Ното в аві яд за «Я хв Я З рка око бух Бта Суд Бгто Рко Су Рг Н 5 рт Ж жа Ку Ак сля й хакі З «стаз БІЛОК ни Тит датзекні «513» Ното дварієгв одДгря за «300» 9 2 пек рани, з; Тецйп о Гпаецп о біч піу рі, Аїд Бк біз Бей о пей ЗА шау Аід РЕ З 7 М пло А; кій» 40 «ЕТ» 19 Ж - тн «РИ» БІЛОК ше Нотас датівдпЕ «Віа» Ното дарієпз ДИ ап «апИх дО і Ра шо яп Зі Адоз ТЕЖ Твг о НівВ ТОг пУушВ Так о Бко пез 1 пас опе о ІїП ій Бей Був ТЕ Рко 1 У ще ї Є Ід і З лю Р «си» 41 «ЕР» ва оту ятток Оля БРЕЛОК ше Чеото чпабівпх «ІЗ» Ното шарів: ди й «апа зі т па тан б'є ит доз одну ТьЕ ка го го и 1 Н з ак еп Ав ТВ Ето - Акш оСуш Рко піц Рко Був дек був Ав щи Су РІо і : ше 5 й Щі я ой 4-5 Су ЕКО АФ У в їй Й їх! го пут Ро Ар о тТЬБК о Рго Рго Ртго Сух РЕго пув'вет Суд Аво Тпг о Рго Бко у т б а Ро Був Берг мує пшю що РКО Ага Су Рез бій РЕЗ пу до 5а
    АкчоСув Бхо Пій БРко був Бах Суд АвротТБк Бко Рго Бко Сув РКО Ахд аа 45 Тіто та УВО за сід» ай «ЕТ» В «18» БІЛОК ель ця хезтзї - «кі» Ното с5арівнпа «асо» 49 ді Вв-ин 01310531 Тра 1 а и піаровгкго слі і ін сі піУ РО ЩІ - -- - «210» 45 оп т ші Н сх Пити єдину ріких «13» Нопюо зарієпіз «ап» 43 біз бек Був Тук біу Рто БЕ і 2 «10» 44 «2112 5 «вій БІДОК пе ження Трос тдиутюкт и Поп зара «по» 44 рія и Ше (Тіто Поки СУ ЕКО ов СУД єго «кві» аз ОНИ «2182» БІЛОК «Кіа» Ното харівнпх «апох аа відо тіки (7113 ТИНА ОО Тіра ТТ пр Пи діа голій грпе гей осі піУ РГОУ 1 5 210» 45 сЕРІх З «та» БІЛОК ли нь ІЗ т шоку т - сві139 Ното їарівпї
    «4005 45 біс Ага Буз «сто» 47 «112» 10 дій БІЛОК каз БНото заврівпв5 «по» 47 Сув Суш Уві біз Сув Рка РКО Бк о Суз РКО і в та «Ето» 48 «вті свій БІЛОК кха13з Ното заврівпе ча» 4 Аза Рго Рго Уві Ата бі Ро 1 2
UAA201911783A 2017-05-11 2018-05-11 АНТИ-GARP-TGF-<font face="Symbol">b</font>-АНТИТІЛО UA125534C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1707561.5A GB201707561D0 (en) 2017-05-11 2017-05-11 GARP-TGF-beta antibodies
PCT/EP2018/062251 WO2018206790A1 (en) 2017-05-11 2018-05-11 GARP-TGF-β ANTIBODIES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125534C2 true UA125534C2 (uk) 2022-04-13

Family

ID=59201573

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201911783A UA125534C2 (uk) 2017-05-11 2018-05-11 АНТИ-GARP-TGF-<font face="Symbol">b</font>-АНТИТІЛО

Country Status (32)

Country Link
US (4) US10479829B2 (uk)
EP (3) EP4086286A1 (uk)
JP (2) JP7118135B2 (uk)
KR (2) KR20240065192A (uk)
CN (1) CN110945027B (uk)
AU (2) AU2018265241B2 (uk)
BR (1) BR112019023735A8 (uk)
CA (1) CA3061841C (uk)
CL (1) CL2019003211A1 (uk)
CO (1) CO2019013669A2 (uk)
CR (1) CR20190561A (uk)
DK (1) DK3606961T3 (uk)
DO (1) DOP2019000285A (uk)
EC (1) ECSP19087742A (uk)
ES (1) ES2921015T3 (uk)
GB (1) GB201707561D0 (uk)
HR (1) HRP20220787T1 (uk)
HU (1) HUE059237T2 (uk)
IL (2) IL270236B2 (uk)
LT (1) LT3606961T (uk)
MX (1) MX2019013490A (uk)
NZ (1) NZ758647A (uk)
PE (1) PE20200618A1 (uk)
PH (1) PH12019502526A1 (uk)
PL (1) PL3606961T3 (uk)
PT (1) PT3606961T (uk)
RS (1) RS63361B1 (uk)
RU (1) RU2767784C2 (uk)
SG (1) SG10201914130VA (uk)
SI (1) SI3606961T1 (uk)
UA (1) UA125534C2 (uk)
WO (1) WO2018206790A1 (uk)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002362197A1 (en) * 2001-12-28 2003-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of stabilizing protein
WO2017173091A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Musc Foundation For Research Development Methods for treatment and diagnosis of cancer by targeting glycoprotein a repetitions predominant (garp) and for providing effective immunotherapy alone or in combination
AU2020340176A1 (en) 2019-08-28 2022-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cross-species anti-latent TGF-beta 1 antibodies and methods of use
TW202128761A (zh) 2019-10-25 2021-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗garp抗體與免疫調節劑之組合
JP2023514324A (ja) 2020-02-19 2023-04-05 ナミ セラピューティクス， インコーポレイテッド がんの処置において有用なＴＦＧβアンタゴニストプロドラッグを含有する製剤化および／または共製剤化リポソーム組成物ならびにその方法
WO2021231732A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
KR20230117167A (ko) * 2020-12-02 2023-08-07 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항GARP/TGFβ항체 및 사용 방법
EP4279509A1 (en) * 2021-01-18 2023-11-22 Shanghai Jemincare Pharmaceuticals Co., Ltd. Garp protein antibody and application thereof
WO2023225555A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vestaron Corporation Pesticidal actx peptide variants
WO2024018046A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Garp as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies
US20240042020A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-garp-tgf-beta1/pd-1 combination therapy

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
NZ298145A (en) 1994-12-29 1998-08-26 Yamanouchi Pharma Co Ltd Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
ES2304069B1 (es) * 2003-08-22 2009-08-12 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Peptidos con capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento beta 1 (tgf-b1).
US20070048785A1 (en) 2004-06-09 2007-03-01 Lin Laura L Anti-IL-13 antibodies and complexes
WO2006103639A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Case Western Reserve University Methods and reagents for identifying/isolating t regulatory (treg) cells and for treating individuals
WO2007113301A1 (en) 2006-04-03 2007-10-11 Medizinische Hochschule Hannover Pharmaceuticals for influencing the reaction of the human immune system
WO2009073163A1 (en) 2007-12-03 2009-06-11 American Type Culture Collection (Atcc) Avian influenza antibodies, compositions, and methods thereof
GB2461546B (en) 2008-07-02 2010-07-07 Argen X Bv Antigen binding polypeptides
US8951793B2 (en) 2008-08-21 2015-02-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of making an isolated population of FOXP3+ regulatory T cells
KR101492052B1 (ko) 2012-06-26 2015-02-10 (주)대창솔루션 액화가스 운반용 탱크
US20150203840A1 (en) 2012-08-31 2015-07-23 Argen-X N.V. Method for producing antibody molecules having inter-species, intra-target cross-reactivity
WO2014182676A2 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
MX2016001356A (es) 2013-08-01 2016-10-26 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteina anti-garp y sus usos.
EP2832747A1 (en) 2013-08-01 2015-02-04 Université Catholique de Louvain Anti-GARP protein and uses thereof
EP3253796A1 (en) 2015-02-03 2017-12-13 Université Catholique de Louvain Anti-garp protein and uses thereof
FI3354729T3 (fi) * 2015-09-24 2024-04-23 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-garp-vasta-aine
EP3484499A4 (en) * 2016-07-14 2020-05-13 Scholar Rock, Inc. ANTI-TGFB ANTIBODIES, METHODS AND USES

Also Published As

Publication number Publication date
DOP2019000285A (es) 2020-07-15
CN110945027B (zh) 2023-08-01
RU2019140602A3 (uk) 2021-07-23
PT3606961T (pt) 2022-07-04
CR20190561A (es) 2020-04-04
US20210324061A1 (en) 2021-10-21
PE20200618A1 (es) 2020-03-11
EP3606961A1 (en) 2020-02-12
IL305613A (en) 2023-11-01
GB201707561D0 (en) 2017-06-28
RU2767784C2 (ru) 2022-03-21
US20200095311A1 (en) 2020-03-26
NZ758647A (en) 2022-07-29
JP2020519308A (ja) 2020-07-02
SG10201914130VA (en) 2020-03-30
HUE059237T2 (hu) 2022-11-28
EP3606961B8 (en) 2022-07-13
EP4086286A1 (en) 2022-11-09
IL270236A (uk) 2019-12-31
AU2021240255A1 (en) 2021-10-28
US10479829B2 (en) 2019-11-19
KR20200027469A (ko) 2020-03-12
US10875914B2 (en) 2020-12-29
JP7118135B2 (ja) 2022-08-15
US10793627B2 (en) 2020-10-06
CN110945027A (zh) 2020-03-31
AU2018265241A1 (en) 2019-11-21
EP3606961B1 (en) 2022-06-01
BR112019023735A2 (pt) 2020-06-09
PH12019502526A1 (en) 2020-07-20
LT3606961T (lt) 2022-07-11
KR102664663B1 (ko) 2024-05-23
IL270236B2 (en) 2024-02-01
PL3606961T3 (pl) 2022-08-16
MX2019013490A (es) 2021-08-26
ECSP19087742A (es) 2020-05-29
EP4282430A2 (en) 2023-11-29
CA3061841C (en) 2022-08-09
RS63361B1 (sr) 2022-07-29
RU2019140602A (ru) 2021-06-11
CL2019003211A1 (es) 2020-04-24
CO2019013669A2 (es) 2020-04-01
KR20240065192A (ko) 2024-05-14
AU2018265241B2 (en) 2021-11-04
CA3061841A1 (en) 2018-11-15
JP2022169549A (ja) 2022-11-09
WO2018206790A1 (en) 2018-11-15
DK3606961T3 (da) 2022-07-04
HRP20220787T1 (hr) 2022-09-16
US20180327487A1 (en) 2018-11-15
ES2921015T3 (es) 2022-08-16
US20190375832A1 (en) 2019-12-12
SI3606961T1 (sl) 2022-10-28
EP4282430A3 (en) 2024-04-03
IL270236B1 (en) 2023-10-01
BR112019023735A8 (pt) 2023-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125534C2 (uk) АНТИ-GARP-TGF-&lt;font face=&#34;Symbol&#34;&gt;b&lt;/font&gt;-АНТИТІЛО
TWI784322B (zh) 標靶cldn18.2的抗體及其製備方法和應用
EP3604338A1 (en) Anti-ox40 antibody and use thereof
JP6188681B2 (ja) 抗ｆｇｆｒ２抗体
CN110462038A (zh) 抗gprc5d抗体和包含所述抗体的分子
RU2622083C2 (ru) Антитела против notch1
UA120247C2 (uk) Антитіло до ceacam5 і його застосування
AU2012341450A1 (en) Anti-human TROP-2 antibody having antitumor activity in vivo
UA125757C2 (uk) Антитіло до par2 і його застосування
JP6509735B2 (ja) 抗ｆｇｆｒ２抗体と他剤の組合せ
KR20220031738A (ko) 암 치료를 위한 항-fam19a5 항체의 용도
JP6267733B2 (ja) 抗ｒｏｂｏ４抗体
JP7048567B2 (ja) 二重特異性抗原結合ポリペプチド
CN110790839A (zh) 抗pd-1抗体、其抗原结合片段及医药用途
AU2013325443B2 (en) Anti-hDlk-1 antibody having an anti-tumor activity in vivo
US20190300607A1 (en) Composition containing anti-robo4 antibody and other agents
EP3660155A1 (en) Anti-cd147 antibody
CA2515389A1 (en) Monoclonal antibody and gene encoding the same, hybridoma, pharmaceutical compostion, and diagnostic reagent
US11186632B2 (en) Methods of treating cancer using bifunctional molecules that target growth factors
JP2013230115A (ja) 抗ｒｏｂｏ４抗体
WO2018233333A1 (zh) 一种靶向人肿瘤干细胞的单克隆抗体及其应用
US20220056120A1 (en) Methods of treating ocular pathologies using bifunctional molecules that target growth factors
TW202146458A (zh) 一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白
JP2014141434A (ja) 抗ｒｏｂｏ４抗体
WO2015129919A1 (ja) 抗ｓｌｃ６ａ６抗体および当該抗体を含むがん治療用医薬組成物