KR20200027469A - GARP-TGF-β 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GARP와 TGF-β1의 복합체, 특히, 사람 GARP와 사람 TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편은 높은 친화성 항원 결합 및 조절 T-세포로부터 활성 TGF-β의 방출을 억제하는 능력을 비롯한 유리한 특성들의 조합을 나타낸다. 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 탈아미드화, 이성질체화 및 산화에 대해 비교적 저항성이 있어 개선된 안정성을 나타낸다.

Description

GARP-TGF-β 항체
관련 출원
본 출원은 2017년 5월 11일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/1707561.5호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용 전체는 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전체가 참조에 의해 삽입된다.
본 발명은 당단백질 A 반복 우세인자 (Glycoprotein A Repetitions Predominant: GARP)와 TGF-β1의 복합체, 특히, 사람 GARP와 사람 TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편은 높은 친화성 항원 결합 및 조절 T-세포로부터 활성 TGF-β의 방출을 억제하는 능력을 비롯한 유리한 특성들의 조합을 나타낸다. 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 GARP와 TGF-β1의 복합체에 결합하는 종래의 항체와 비교하여 개선된다. 특히, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 종래 기술에 기재된 GARP-TGF-β1 항체와 비교하여, 탈아미드화, 이성질체화 및 산화에 대해 비교적 저항성이 있어 개선된 안정성을 나타낸다.
조절 T-세포 (다르게는 "Treg" 또는 Foxp3+ T-조절 세포로도 공지됨)는 면역계의 중요한 구성요소이다. 특히, Treg는 면역 반응의 다양한 양태를 억제함으로써 면역 항상성에 중요한 역할을 한다. 면역 반응을 조정하는데 있어 이들의 역할의 결과로서, Treg 활성의 조절 이상은 다양한 질환 및 병태의 발달을 초래할 수 있다. 특히, 불충분한 Treg 기능은 자가 면역 병리를 초래할 수 있는 반면, 과도한 Treg 활성은 암 환자에서 항종양 반응의 억제와 관련되어 있다.
단백질 GARP는 Treg, 특히, 활성화된 Treg의 표면 상에서 고도로 발현된 마커로서 확인되었다. GARP는 20개의 류신-풍부 반복체를 포함하는 세포외 영역을 갖는 80 kDa의 막 관통 단백질이다. 이것은 또한 LRRC32로도 공지되어 있다. GARP는 TGF-β, 특히, 잠재적인 형태의 TGF-β에 대한 수용체의 역할을 하며, Treg 세포 상에서 잠재적 TGF-β의 발현에 필요하다 (문헌 [EM Shevach. Expert Opin Ther Targets (2016) 21(2), 191-200]).
TGF-β는 세포 증식 및 분화, 조직 형태 형성, 염증 및 아폽토시스를 비롯한 복수의 과정에서 역할을 하는 것으로 공지된 사이토카인이다. 이것은 또한 암 발달에 연루된 중요한 성장 인자로서 확인되었으며, 다소 특이하게는 종양 촉진 및 종양 억제 특성을 갖는 사이토카인으로서 확인되었다.
TGF-β의 생산 및 활성화는 상이한 수준으로 조절되는 다단계 공정이다. TGF-β는 프로-TGF-β 이량체 전구체로서 합성되며, 각 폴리펩타이드 쇄는 잠재성 관련 펩타이드 (latency-associated peptide: LAP) 및 성숙 TGF-β 영역으로 이루어진다. 프로-TGF-β는, 효소 푸린에 의해 절단되어, LAP가 각 폴리펩타이드 쇄의 성숙 TGF-β 영역과 비공유적으로 연결된 상태로 존재하는 비활성 형태인 "잠재적 TGF-β"를 형성한다 (도 1 참조). 막-국소화된 GARP는 잠재적 TGF-β를 Treg의 세포 표면으로 운반하고 고정시키는 역할을 하며, 이것은 활성 형태의 TGF-β가 방출되는 이러한 막-결합된 GARP-잠재적 TGF-β 복합체로부터 유래된다. 활성 TGF-β가 Treg의 표면 상의 GARP-잠재적 TGF-β 복합체로부터 어떻게 방출되는지를 설명하기 위한 다양한 메커니즘이 제안되었다. 그러나, 인테그린, 특히, αvβ6 및 αvβ8은 현재 성숙 TGF-β 이량체의 방출에 필요한 전단력을 구동하는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
일단 방출되면, 활성 TGF-β 이량체는 다운스트림 신호 전달 경로의 자가분비 또는 주위분비 매개체로서 작용할 수 있다. 면역계의 맥락에서, Treg 세포로부터의 TGF-β 방출은 다양한 T-효과기 세포 및 또한 Treg 자체에 영향을 미치는 것으로 생각된다 (도 1 참조). Treg는 면역 억제에 있어 중요한 역할을 하기 때문에, Treg로부터 방출되고 자가분비 방식으로 작용하는 TGF-β는 Treg 억제를 매개하는데 관여할 수 있는 것으로 생각된다. 특히, Treg-유래된 TGF-β1은 종양 면역의 Treg-매개성 억제에 있어 상당한 역할을 하는 것으로 생각된다.
종양 미세환경에서 면역 반응을 억제하는데 있어서 Treg-유래된 TGF-β의 역할을 고려해 볼 때, 암 면역 요법에 대한 대안적 접근법으로서 이러한 경로를 표적화하는데 관심이 있었다. 예를 들어, 이러한 경로를 약화시킬 수 있는 치료제는 암 백신의 효능 또는 암을 치료하는 신체 면역계의 힘을 이용하도록 디자인된 다른 암 면역 요법 전략을 개선시키는 유용한 도구로서 작용할 수 있다.
문헌 [Cuende et al., Sci Transl Med. 2015 Apr 22;7(284):284ra56]은 Treg 상에서 GARP-TGF-β 복합체에 결합하고 TGF-β 생산을 억제하는 2개의 단클론 항체 (MHG-8 및 LHG10)의 생산 및 특성화를 기재하고 있다. 이러한 2개의 항체는 또한 국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에 기재되어 있고 특성화되어 있다. 이들 항체는 이종 이식편 대 숙주 질환 마우스 모델에서 사람 Treg의 면역 억제 활성을 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 연구는, Treg 기능을 조절하고 결과적으로 Treg 활성의 수준이 중요한 역할을 하는 암 및 자가 면역 질환과 같은 질병을 치료하기 위한 관심 치료 표적으로서 GARP-TGF-β 복합체를 검증하는 역할을 한다. 그러나, TGF-β 방출을 억제하여 Treg 활성을 변형시킬 수 있는 개선된 GARP-TGF-β 항체에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 본 출원에서 기재된 바와 같은 이러한 문제를 다룬다.
발명의 개요
본 발명은 사람 GARP-TGF-β1 복합체에 결합하는 신규한 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공함으로써 최신 기술을 개선시킨다. 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에 기재된 GARP-TGF-β1 항체 "LHG-10"으로부터 유래된다. LHG-10의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열은 각각 서열 번호 1 및 2에 나타나 있으며, 쇄-셔플링된 변이체 LHG-10.6의 경쇄 가변 도메인 (국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에서도 또한 기재됨)은 서열 번호 3에 나타나 있다. 본 발명의 항체는 LHG-10 및 LHG-10.6과 비교하여 특정 CDR 서열에 대해, 구체적으로는 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3 서열에 대해 특히 상이하다. LHG-10 및 LHG-10.6 GARP-TGF-β 항체는 중쇄 CDR2 서열: RIDPED G GTKYAQKFQG (서열 번호 5); 및 중쇄 CDR3 서열: N EWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 6)을 보유하는 반면, 본 발명의 항체는 중쇄 CDR2 서열: RIDPED A GTKYAQKFQG (서열 번호 12); 및 중쇄 CDR3 서열: Y EWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)을 포함한다.
본 출원에서 보고된 중쇄 CDR2 및 CDR3 서열의 차이는 개선된 안정성으로 인해 종래 기술의 항체와 비교하여 개선된 항체를 초래한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체는 탈아미드화, 이성질체화 및 산화에 대해 비교적 저항성이 있어 증진된 안정성을 나타낸다. 놀랍게도, 개선된 안정성을 초래하는 중쇄 CDR2 및 CDR3 영역에서의 이러한 특정 치환은 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 항체의 결합 친화성을 유의하게 감소시키지 않는다. 높은 친화성 표적 결합과 조합된 개선된 안정성은 본 발명의 항체를 치료제, 예를 들어, 암 치료제로서 임상 개발에 특히 적합하도록 한다.
제1 양태에서, 본 발명은 사람 GARP-TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3은 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR1은 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 사람 GARP-TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3은 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR2는 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR1은 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
VL CDR3은 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)을 추가로 포함할 수 있고, 여기서,
VL CDR3은 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR2는 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR1은 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
중쇄 가변 도메인 (VH), 여기서,
VH CDR3이 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2가 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR1이 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 도메인 (VH); 및
경쇄 가변 도메인 (VL), 여기서,
VL CDR3이 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2가 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1이 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 도메인 (VL)
을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
중쇄 가변 도메인 (VH), 여기서,
VH CDR3이 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR2가 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR1이 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열로 이루어지는, 중쇄 가변 도메인 (VH); 및
경쇄 가변 도메인 (VL), 여기서,
VL CDR3이 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR2가 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR1이 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타 유래의 VH 또는 VL 도메인의 사람화, 생식 세포화 또는 친화성 변이체인 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 사람 GARP와 사람 TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다:
(i) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH; 또는
(ii) 서열 번호 14와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH.
대안적으로 또는 추가로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다:
(i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL; 또는
(ii) 서열 번호 15와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 도메인이 기준 서열과의 특정 백분율의 서열 동일성에 의해 정의되는 실시형태의 경우, 상기 VH 및/또는 VL 도메인은 변이가 프레임워크 영역 내에서만 존재하도록 기준 서열 내에 존재하는 것과 동일한 CDR 서열을 보유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 중쇄 가변 도메인 (VH)은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 경쇄 가변 도메인 (VL)은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 사람 항체, 특히, 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 사람 IgG4의 CH3 영역을 포함하며, 상기 CH3 도메인에서 치환 S228P를 포함한다.
상기 GARP-TGF-β1 복합체에 결합하는 항체는 적어도 하나의 전장 면역글로불린 중쇄 및/또는 적어도 하나의 전장 람다 또는 카파 경쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 16으로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 17로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 16으로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및 서열 번호 17로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다.
상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄가 기준 서열과의 특정 백분율의 서열 동일성에 의해 정의되는 실시형태의 경우, 상기 중쇄 및/또는 경쇄는 변이가 CDR 영역 외에서만 존재하도록 기준 서열 내에 존재하는 것과 동일한 CDR 서열을 보유할 수 있다.
본 출원에서 달리 명시되지 않는다면, 2개의 아미노산 서열들 사이의 % 서열 동일성은 최적의 방식으로 정렬된 이들 2개의 서열을 비교함으로써 결정될 수 있으며, 비교되는 아미노산 서열은 이들 2개의 서열들 사이의 최적 정렬을 위해 기준 서열에 대해 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 잔기가 2개의 서열들 사이에서 동일한 동일 위치의 수를 결정하고, 이러한 동일 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총 수로 나누고, 수득된 결과에 100을 곱하여 이들 2개의 서열들 사이의 동일성의 백분율을 수득함으로써, 동일성의 백분율을 계산한다. 예를 들어, BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (문헌 [Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250])을 사용하는 것이 가능하며, 여기서, 사용되는 파라미터는 디폴트로서 제공된 것이며 (특히, 파라미터 "개방 갭 페널티": 5 및 파라미터 "연장 갭 페널티": 2의 경우; 선택된 매트릭스는, 예를 들어, 상기 프로그램에 의해 제안된 매트릭스 "BLOSUM 62"임), 비교되는 2개의 서열들 사이의 동일성의 백분율은 상기 프로그램에 의해 직접 계산된다.
본 출원에서 제공된 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 하기 특성/특징 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시노몰구스 (cynomolgus) 기원의 GARP-TGF-β 복합체와 교차 반응할 수 있으며;
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 GARP-TGF-β1에 높은 친화성으로 결합할 수 있으며;
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, Fab 단편으로서 시험될 때 5 × 10-4 s-1 미만의 사람 GARP와 TGF-β1의 복합체에 대한 오프-레이트 (off-rate) (k오프)를 나타내는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며;
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, Fab 단편으로서 시험될 때 1 × 10-6 s-1 내지 5 × 10-4 s-1 범위의 사람 GARP와 TGF-β1의 복합체에 대한 오프-레이트 (k오프)를 나타내는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며;
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 mAb로서 시험될 때 1.7 × 10-9 미만의 KD를 나타내는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며;
- 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조절 T-세포로부터 활성 TGF-β1의 방출을 차단하거나 억제할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포 및 본 출원에서 기재된 항체의 재조합 발현/생산의 방법에 추가하여, 상기에서 열거된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 또한 제공한다.
더 추가의 양태에서, 본 발명은 본 출원에서 기재된 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 더 추가의 양태는, 특히 TGF-β 관련 장애의 예방 및/또는 치료에서, 상기에서 열거된 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 의학적 치료 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 상기 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 치료 방법에 관한 것으로, 여기서, 치료되는 상기 질환 또는 병태는 염증성 질환, 만성 감염, 암, 섬유증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조합 요법의 일부로서 또 다른 치료와 조합하여 투여된다. 예를 들어, 상기 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 치료제, 임의로 면역 자극 항체 또는 종양 백신과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 이러한 실시형태들 및 다른 실시형태들은 하기 설명 및 첨부된 도면들과 함께 고려될 때 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 그러나, 하기 설명은, 본 발명의 다양한 실시형태 및 이의 다수의 특정 세부 사항을 나타내지만, 예로서 제공되는 것이지 한정하기 위한 것이 아니다는 것을 이해해야 한다. 다수의 치환, 변형, 추가 및/또는 재배열이 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있으며, 본 발명은 이러한 모든 치환, 변형, 추가 및/또는 재배열을 포함한다.
도 1은 조절 T-세포의 표면 상의 GARP에 대한 잠재적 TGF-β의 결합을 도시하는 개략도이다. TGF-β는 전구체인 "프로-TGF-β"로서 생성되며, 성숙 TGF-β 이량체가 각 폴리펩타이드의 잠재성 관련 펩타이드 (LAP) 영역과 비공유적으로 연결된 상태로 존재하는 형태인 "잠재적-TGF-β"를 생성하기 위해 절단을 거친다. Treg 세포의 표면 상의 GARP에 결합하는 것이 이러한 잠재적 형태이다. 인테그린 αvβ6 및 αvβ8은 세포 표면으로부터 성숙 또는 "활성 TGF-β"의 방출을 매개하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 이러한 활성 형태는 다양한 표적 세포에서 효과를 유발하기 위해 주위분비 방식으로 작용할 수 있거나, Treg 세포 상의 TGF-β 수용체에 결합함으로써 자가분비 매개체로서 작용할 수 있다.
도 2는 PBS 또는 PBSTween (PBSTw) 중에서 20℃, 5℃ 및 37℃에서 저장된 샘플에 대해 56일 기간에 걸쳐 항체인 39B6 IgG1N297Q 및 39B6 IgG4S228P에 대한 BiacoreTM 또는 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR)에 의해 측정된 표적 결합 활성을 도시한 것이다. 기준 샘플 (-20℃)을 각 시점에서 100% 결합 활성으로서 설정하였다.
도 3은 TGF-β 수용체 활성화의 SMAD2 인산화 다운스트림을 모니터링하도록 디자인된 검정에서 39B6-A 항체 변이체를 시험한 결과를 도시한 것이다. SMAD2 인산화는 TGF-β의 수용체에 대한 TGF-β 결합 후 TGF-β 신호 전달 경로의 활성화의 마커로서의 역할을 한다. SMAD2 인산화가 감소되면, TGF-β 활성은 억제된다. 도 3a: 다양한 농도의 GARP-TGF-β 항체인 39B6-A, 39B6-AVE, 39B6-AEE, 39B6-AYE, 39B6-ANR 및 39B6-ANK의 존재하에 SMAD2 인산화의 감소를 도시하는 웨스턴 블롯. 도 3b: 다양한 항체 농도에서 SMAD2 인산화의 억제 백분율을 도시하는 도 3a에서의 데이터의 그래픽 표현.
도 4는 SMAD 프로모터에 컨쥬게이트된 루시퍼라아제 리포터 유전자를 통해 TGF-β 활성을 측정하도록 디자인된 검정에서 39B6-A 항체 변이체를 시험한 결과를 도시한 것이다. 그래프는 다양한 농도의 GARP-TGF-β 항체인 LHG-10, 39B6-A, 39B6-AVE, 39B6-AEE, 39B6-AYE, 39B6-ANR 및 39B6-ANK의 존재하에 발광 신호의 억제 백분율을 도시한 것이다.
도 5는 5℃ 및 37℃에서 저장된 항체인 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 의한 56일 기간에 걸친 응집체 형성 백분율을 도시한 것이다. 응집체 형성은 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 모니터링되었다.
도 6은 37℃에서 저장된 항체인 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 의한 56일 기간에 걸친 단편 형성 백분율을 도시한 것이다. 단편 형성은 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 모니터링되었다.
도 7은 5℃ 및 37℃에서 저장된 항체인 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 의한 56일 기간에 걸친 단량체 영역 백분율을 도시한 것이다. 단량체 영역은 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 모니터링되었다.
도 8은 기준 온도 (-20℃), 5℃ 및 37℃에서 56일 동안 저장된 항체 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한 것이다.도 8a: 39B6-AVE. 도 8b: 39B6-AYE. 도 8c: 39B6-ANK. 도 8d: 39B6-ANR. 마커는 각 겔의 중앙에서 나타난다. 마커의 좌측에서, 3개의 샘플은 비환원 조건하에 시험된 (i) 기준 (Ref); (ii) 5℃; 및 (iii) 37℃ 샘플이며, 마커의 우측에서, 3개의 샘플은 환원 조건하에 시험된 (i) 기준 (Ref); (ii) 5℃; 및 (iii) 37℃ 샘플이다.
도 9는 -20℃, 5℃ 및 37℃에서 저장된 샘플에 대해 56일 기간에 걸쳐 항체인 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대한 BiacoreTM 또는 SPR에 의해 측정된 표적 결합 활성을 도시한 것이다. 기준 샘플 (-20℃)을 각 시점에서 100% 결합 활성으로서 설정하였다.
도 10은 -20℃ (기준), 5℃ 및 37℃에서 저장된 샘플에 대해 56일 기간에 걸친 항체인 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR의 샘플에 대한 단백질 농도 (mg/ml)를 도시한 것이다.
도 11은 10회의 냉동-해동 주기 후 항체 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한 것이다. 마커는 겔의 중앙에서 나타난다. 마커의 좌쪽에서, 4개의 샘플은 비환원 조건하에 분석된 샘플이다: (i) 39B6-AVE에 대한 기준 (Ref); (ii) 39B6-AVE에 대한 냉동-해동 샘플; (iii) 39B6-AYE에 대한 기준 (Ref); 및 (iv) 39B6-AYE에 대한 냉동-해동 샘플. 마커 우측에서, 4개의 샘플은 환원 조건하에 분석된 샘플이다. (i) 39B6-AVE에 대한 기준 (Ref); (ii) 39B6-AVE에 대한 냉동-해동 샘플; (iii) 39B6-AYE에 대한 기준 (Ref); 및 (iv) 39B6-AYE에 대한 냉동-해동 샘플.
도 12는 항체인 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 10회의 냉동-해동 주기 후 BiacoreTM 또는 SPR에 의해 측정된 표적 결합 활성을 도시한 것이다. 기준 샘플 (-20℃)을 각 시점에서 100% 결합 활성으로서 설정하였다.
도 13은 10회 냉동-해동 주기 후 항체인 39B6-AVE 및 39B6-AYE의 샘플에 대한 단백질 농도 (mg/ml)를 도시한 것이다.
도 14는 항체인 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대해 54.6℃ 내지 71.4℃ 범위의 온도에서 열 안정성 시험 후 BiacoreTM 또는 SPR에 의해 측정된 표적 결합 활성을 도시한 것이다. 기준 샘플을 100% 결합 활성으로서 설정하였다.
도 15는 96시간의 회전 후 항체 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한 것이다. 마커는 겔의 중앙에서 나타난다. 마커의 좌쪽에서, 4개의 샘플은 비환원 조건하에 분석된 샘플이다: (i) 39B6-AVE에 대한 기준 (Ref); (ii) 39B6-AVE에 대한 회전 샘플; (iii) 39B6-AYE에 대한 기준 (Ref); 및 (iv) 39B6-AYE에 대한 회전 샘플. 마커 우측에서, 4개의 샘플은 환원 조건하에 분석된 샘플이다. (i) 39B6-AVE에 대한 기준 (Ref); (ii) 39B6-AVE에 대한 회전 샘플; (iii) 39B6-AYE에 대한 기준 (Ref); 및 (iv) 39B6-AYE에 대한 회전 샘플.
도 16은 mAb인 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 회전 안정성 시험 후 BiacoreTM 또는 SPR에 의해 측정된 표적 결합 활성을 도시한 것이다. 기준 샘플을 100% 결합 활성으로서 설정하였다.
도 17은 회전 안정성 시험 후 mAb인 39B6-AVE 및 39B6-AYE의 샘플에 대한 단백질 농도 (mg/ml)를 도시한 것이다.
도 18은 56일 기간에 걸친 항체인 39B6-ANE, 39B6-ANR 및 39B6-ANK에서 N95 위치의 탈아미드화 및 이성질체화의 상대량을 도시한 것이다. 항체인 39B6-AVE 및 39B6-AYE는, 이들 항체가 CDR3으로부터 제거된 "N95" 잔기를 갖기 때문에, 포함되지 않는다. 37℃에서 저장된 샘플에 대한 56일의 시간 경과에 따른 mAb인 39B6-ANE, 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대한 상대적 결합 활성도 또한 도시된다.
도 19는 GARP-TGF-β 복합체에 대한 39B6-AYE (ARGX-115)의 결합에서 성숙 TGF-β에 대한 요건을 도시한 것이다. ELISA 플레이트를 GARP 또는 항-GARP Ab ARGX-115로 코팅하였다. GARP로 코팅된 ELISA 플레이트의 경우, 전장 잠재적 TGF-β (LAP 및 성숙 TGF-β 영역 둘 다 포함)와의 복합체 또는 재조합 LAP와의 복합체는 관련 재조합 단백질의 첨가에 의해 형성되도록 하였다. ARGX-115로 코팅된 ELISA 플레이트의 경우, GARP를 첨가한 후, 전장 잠재적 TGF-β 또는 LAP를 첨가하였다. ARGX-115는 전장 TGF-β의 존재하에서만 GARP에 결합할 수 있었다. GARP-LAP 복합체에 대한 ARGX-115의 결합은 발생하지 않았다. 대조적으로, 항-LAP 항체는 GARP-LAP 복합체에 결합할 수 있었다. 이것은 GARP-TGF-β 복합체에 대한 ARGX-115의 결합을 위한 성숙 TGF-β에 대한 요건을 입증한다.
도 20은 다양한 돌연변이 형태의 TGF-β를 갖는 GARP-TGF-β 복합체에 의한 TGF-β 활성화를 중화시키는 항체의 능력을 도시한 것이다. ARGX-115의 중화 활성은 성숙 TGF-β의 LAP 및 K338에서 R58의 돌연변이에 의해 제거되었다.
A. 정의
"GARP" - 단백질 당단백질 A 반복 우세인자 (Glycoprotein A Repetitions Predominant: GARP)는 류신-풍부 반복체 단백질 계열의 구성원이다. 이것은 또한 류신 풍부 반복체 함유 32 (Leucine Rich Repeat Containing 32: LRRC32)로도 호칭된다. GARP는 20개의 류신-풍부 반복체로 주로 구성된 세포외 영역을 갖는 80 kDa의 막 관통 단백질이다. 사람 GARP 단백질 전사체 변이체 2 (GenBank 수탁 번호 NP_001122394.1)의 완전한 아미노산 서열은 다음과 같다:
MRPQILLLLALLTLGLAAQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDTETLDLSGNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNRLAMATALSAGGLGPLPRVTSLDLSGNSLYSGLLERLLGEAPSLHTLSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDLHSNVLMDIEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLRVLDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKLLHFPDLAALPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKGIHAPSEGWSALPLSAPSGNASGRPLSQLLNLDLSYNEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRNCLRTFEARRLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRTLLLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPCGGPDEPGPSGCVAFSGITSLRSLSLVDNEIELLRAGAFLHTPLTELDLSSNPGLEVATGALGGLEASLEVLALQGNGLMVLQVDLPCFICLKRLNLAENRLSHLPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSAMGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDATQDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNINLIIILTFILVSAILLTTLAACCCVRRQKFNQQYKA (서열 번호 33).
"TGF-β" - TGF-β는 성장 인자의 상위 계열에 속하는 사이토카인이다. 3개의 독특한 유전자에 의해 암호화된 TGF-β의 3개의 독특한 이소형 (TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3)이 있지만, TGF-β 이소형의 전체 구조는 매우 유사하며, 상동성은 대략 70~80%이다. 본 출원에서 사용되는 TGF-β라는 용어는, 문맥이 달리 명시하지 않는다면, 전형적으로 TGF-β 사이토카인의 3개의 모든 상이한 이소형을 포괄하기 위해 사용된다.
3개의 모든 TGF-β 이소형은 대형 단백질 전구체로서 암호화되어 있으며; TGF-β1 (GenBank 수탁 번호 NM_000660)은 390개의 아미노산을 함유하고, TGF-β2 (GenBank 수탁 번호 NM_001135599 및 NM_003238) 및 TGF-β3 (GenBank 수탁 번호 XM_005268028)은 각각 412개의 아미노산을 함유한다. 이들 각각은 세포부터의 분비에 필요한 20~30개의 아미노산의 N-말단 신호 펩타이드, 프로-영역 (pro-region) (잠재성 관련 펩타이드 또는 LAP로 호칭), 및 단백질 가수분해적 절단에 의해 프로-영역으로부터 이의 방출 후 성숙 TGF-β 분자로 되는 112~114 아미노산 C-말단 영역을 갖고 있다. 단백질 가수분해적 절단 후, LAP 및 성숙 TGF-β는 비공유적으로 연결된 상태로 존재하며 "잠재적 TGF-β" 분자를 형성한다. 이러한 잠재적 형태에서, 성숙 TGF-β는 LAP에 의해 TGF-β 수용체에 결합하는 것이 방지된다. 신호를 발휘하기 위해서, 성숙 TGF-β를 LAP로부터 방출해야 한다. LAP에 결합되지 않는 성숙 TGF-β는 TGF-β 수용체에 결합하여 신호를 전달할 수 있기 때문에 활성 TGF-β로 호칭된다.
전장 TGF-β1은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
MPPSGLRLLPLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (서열 번호 34).
LAP는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRR (서열 번호 35).
성숙 TGF-β1은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (서열 번호 36).
"GARP-TGF-β 복합체" - 본 출원에서 사용되는 GARP-TGF-β 복합체는, 잠재적 TGF-β가 GARP, 특히, Treg 세포의 표면 상에 위치한 GARP에 결합할 때 형성되는 본래의 복합체를 의미한다. 전체에 걸쳐 명시되지는 않지만, 본 출원에서 사용되는 "GARP-TGF-β 복합체" 또는 단순히 "GARP-TGF-β"는 GARP와 잠재적 TGF-β 사이의 복합체를 의미하는 것으로 의도된다. TGF-β, 보다 구체적으로는 잠재적 TGF-β에 대한 GARP의 결합은, 예를 들어, 문헌 [Wang et al. Mol Biol Cell. 2012 Mar;23(6):1129-39]에서 보고된 바와 같이, 분자 수준에서 특성화되었다. GARP는 잠재적 TGF-β의 Cys4에 대해 이황화 결합을 형성하며, 또한 비공유 상호 작용을 통해 잠재적 TGF-β와 결합한다. GARP의 세포외 도메인에는 15개의 Cys 잔기가 있으며, GARP는 Cys-192 및 Cys-331을 사용하여 잠재적 TGF-β의 2개의 Cys4 잔기에 대해 이황화 결합을 형성한다. 1개의 GARP 단백질은 1개의 잠재적 TGF-β 이량체와 결합한다는 결론이 나온다.
"항체" 또는 "면역글로불린" - 본 출원에서 사용되는 "면역글로불린"이라는 용어는 임의의 관련 특정 면역반응성을 가지든지 여부와 관계없이 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 조합을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. "항체"는 관심 대상 항원 (예를 들어, GARP와 TGF-β의 복합체)에 대해 유의하게 공지된 특정 면역 반응 활성을 갖는 이러한 조립체를 지칭한다. "GARP-TGF-β 항체"라는 용어는 GARP와 TGF-β1의 복합체, 특히, 사람 GARP-TGF-β1 복합체 및 일부 경우에는 이의 종 동족체에 대한 면역학적 특이성을 나타내는 항체를 지칭하기 위해 본 출원에서 사용된다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 이들 사이에는 쇄간 공유 결합이 있거나 없다. 척추 동물계에서의 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
"면역글로불린"이라는 일반 용어는 생화학적으로 구별될 수 있는 5개의 독특한 항체 부류 (IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE)를 포함한다. 5개의 모든 항체 부류는 본 발명의 범위 내에 있다. 하기 논의는 일반적으로 IgG 부류의 면역글로불린 분자에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 전형적으로 분자량 약 23,000 달톤인 2개의 동일한 폴리펩타이드 경쇄 및 분자량 53,000~70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 상기 4개의 쇄는 "Y" 배열 형태의 이황화 결합에 의해 연결되며, 여기서, 경쇄들은 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 감싼다.
항체의 경쇄는 카파 (κ) 또는 람다 (λ)로서 분류된다. 각 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되어 있으며, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 공학에 의해 생성된 숙주 세포에 의해 생산될 때 공유적 이황화 결합 또는 비공유 결합으로 서로 결합되어 있다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열 형태의 갈라진 말단 부분에서의 N 말단으로부터 각 사슬의 하단에서의 C 말단으로 진행한다. 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로서 이들 중 몇몇 하위 부류 (예를 들어, γ1~γ4)와 함께 분류된다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로서 결정하는 것은 이러한 쇄의 성질이다. 면역글로불린 하위 부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특성화되어 있으며, 기능적 전문성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이들 부류 및 이소형의 각각의 변형된 버전은 본 개시 내용을 고려하여 통상의 기술자에게 용이하게 인식 가능하며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 있다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 항체의 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이에 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 결합하여 3차원적 항원 결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 아암 (arm) 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 상기 항원 결합 부위는 각각의 VH 및 VL 쇄 상의 3개의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)에 의해 정의된다.
"결합 부위" - 본 출원에서 사용되는 "결합 부위"라는 용어는 관심 대상의 표적 항원에 선택적으로 결합하는 역할을 하는 폴리펩타이드의 영역을 포함한다. 결합 도메인은 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 항체 가변 도메인을 포함한다. 본 발명의 항체 분자는 단일 결합 부위 또는 다중 (예를 들어, 2, 3 또는 4개) 결합 부위를 포함할 수 있다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인" - "가변 영역" 및 "가변 도메인"이라는 용어는 본 출원에서 상호교환적으로 사용되며 동등한 의미를 갖는 것으로 의도된다. "가변"이라는 용어는, 가변 도메인 VH 및 VL의 특정 부분이 항체들 사이에서 광범위하게 상이하다는 것을 나타내며, 이의 표적 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되어 있지는 않다. 이것은, 항원 결합 부위의 일부를 형성하는 VL 도메인 및 VH 도메인의 각각에서의 "초가변 루프 (hypervariable loop)"로 호칭되는 3개의 분절에 집중되어 있다. V람다 경쇄 도메인의 제1, 제2 및 제3 초가변 루프는 본 출원에서 L1(λ), L2(λ) 및 L3(λ)로서 지칭되며, VL 도메인에서 잔기 24~33 (L1(λ), 9, 10 또는 11개의 아미노산 잔기로 이루어짐), 49~53 (L2(λ), 3개의 잔기로 이루어짐) 및 90~96 (L3(λ), 5개의 잔기로 이루어짐)을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다 (문헌 [Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)]). V카파 경쇄 도메인의 제1, 제2 및 제3 초가변 루프는 본 출원에서 L1(κ), L2(κ) 및 L3(κ)로서 지칭되며, VL 도메인에서 잔기 25~33 (L1(κ), 6, 7, 8, 11, 12 또는 13개의 잔기로 이루어짐), 49~53 (L2(κ), 3개의 잔기로 이루어짐) 및 90~97 (L3(κ), 6개의 잔기로 이루어짐)을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다 (문헌 [Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)]). VH 도메인의 제1, 제2 및 제3 초가변 루프는 본 출원에서 H1, H2 및 H3으로서 지칭되며, VH 도메인에서 잔기 25~33 (H1, 7, 8 또는 9개의 잔기로 이루어짐), 52~56 (H2, 3 또는 4개의 잔기로 이루어짐) 및 91~105 (H3, 길이가 매우 가변적임)을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다 (문헌 [Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)]).
달리 명시되지 않는다면, L1, L2 및 L3이라는 용어는 각각 VL 도메인의 제1, 제2 및 제3 초가변 루프를 지칭하며, V카파 및 V람다 이소형 둘 다로부터 수득되는 초가변 루프를 포괄한다. H1, H2 및 H3이라는 용어는 각각 VH 도메인의 제1, 제2 및 제3 초가변 루프를 지칭하며, γ, ε, δ, α 또는 μ를 비롯한 임의의 공지된 중쇄 이소형으로부터 수득되는 초가변 루프를 포괄한다.
초가변 루프인 L1, L2, L3, H1, H2 및 H3은 하기에서 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 일부를 각각 포함할 수 있다. "초가변 루프" 및 "상보성 결정 영역"이라는 용어는 엄격하게 동의어가 아닌데, 이는 초가변 루프 (HV)가 구조에 기초하여 정의되는 반면, 상보성 결정 영역 (CDR)이 서열 가변성에 기초하여 정의되기 때문이며 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983]), 상기 HV 및 CDR의 한계는 일부 VH 및 VL 도메인에서 상이할 수 있다.
VL 및 VH 도메인의 CDR은 전형적으로 다음 아미노산을 포함하는 것으로 정의될 수 있다: 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 24~34 (LCDR1), 50~56 (LCDR2) 및 89~97 (LCDR3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 잔기 31~35 또는 31~35b (HCDR1), 50~65 (HCDR2) 및 95~102 (HCDR3); (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 따라서, 상기 HV는 상응하는 CDR 내에 포함될 수 있으며, VH 및 VL 도메인의 "초가변 루프"에 대한 본 출원에서의 언급은, 달리 명시되지 않는다면, 상응하는 CDR을 포괄하는 것으로서 해석되어야 하고, 그 반대도 마찬가지이다.
가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 하기에서 정의된 바와 같이 프레임워크 영역 (framework region: FR)으로 호칭된다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 루프에 의해 연결된, β-시트 배열 형태를 주로 채택하는 4개의 FR (각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각 쇄에서의 초가변 루프는 FR에 근접하여 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 초가변 루프와 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 항체의 구조 분석에 의해, 서열과 상보성 결정 영역에 의해 형성된 결합 부위의 형태 사이의 관계가 밝혀졌다 (문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)] 및 [Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)]). 이들의 높은 서열 가변성에도 불구하고, 6개의 루프 중 5개는 "표준 구조 (canonical structure)"로 호칭되는 주쇄 형태의 작은 레퍼토리를 채택한다. 이러한 형태는 우선 루프의 길이에 의해, 그리고 다음에 루프에서 및 이들의 팩킹, 수소 결합 또는 특이한 주쇄 형태를 취하는 능력을 통해 형태를 결정하는 프레임워크 영역에서의 특정 위치에서 중요한 잔기의 존재에 의해 결정된다.
"CDR" - 본 출원에서 사용되는 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접 항원 결합 부위를 의미한다. 이러한 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)], [Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)], [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 및 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있으며, 여기서, 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위 세트를 포함한다. 상기에서 인용된 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 제시된다. 바람직하게는, "CDR"이라는 용어는 서열 비교에 기초하여 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR이다.
Figure pct00001
"프레임워크 영역" - 본 출원에서 사용되는 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"이라는 용어는, 가변 영역의 일부이지만 CDR의 일부가 아닌 아미노산 잔기를 포함한다 (예를 들어, CDR의 Kabat 정의를 사용함). 따라서, 가변 영역 프레임워크는 약 100~120개의 아미노산 길이 사이이지만, CDR 외부의 아미노산만을 포함한다. 중쇄 가변 도메인의 특정 예 및 Kabat 등에 의해 정의된 바와 같은 CDR의 경우, 프레임워크 영역 1은 아미노산 1~30을 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 영역 2는 아미노산 36~49를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하며; 프레임워크 영역 3은 아미노산 66~94를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 4는 아미노산 103에서부터 가변 영역의 말단까지의 가변 영역의 도메인에 상응한다. 경쇄에 대한 프레임워크 영역은 유사하게 경쇄 가변 영역 CDR 각각에 의해 분리된다. 유사하게, Chothia 등 또는 McCallum 등에 의한 CDR의 정의를 사용하면, 상기 프레임워크 영역의 경계는 상기에서 기재된 바와 같이 각각의 CDR 말단에 의해 분리된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 CDR은 Kabat에 의해 정의된 바와 같다.
자연 발생 항체에서, 각 단량체 항체 상에 존재하는 6개의 CDR은, 항체가 수성 환경에서 이의 3차원 배열 형태를 취함에 따라, 항원 결합 부위를 형성하도록 특이적으로 위치되는 아미노산의 짧은 비연속적인 서열이다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열에서 더 적은 분자간 가변성을 나타내며 프레임워크 영역으로 호칭된다. 상기 프레임워크 영역은 주로 β-시트 형태를 채택하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 이들 프레임워크 영역은 쇄간의 비공유적 상호 작용에 의해 6개의 CDR을 정확한 배향으로 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위는 면역 반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이러한 상보적인 표면은 면역 반응성 항원의 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진시킨다. CDR의 위치는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
"불변 영역" - 본 출원에서 사용되는 "불변 영역"이라는 용어는 가변 도메인 또는 가변 영역의 외부의 항체 분자 부분을 지칭한다. 면역글로불린 경쇄는, 전형적으로 "CL 또는 CL1 도메인"으로 지칭되는 단일 도메인 "불변 영역"을 갖는다. 이러한 도메인은 VL 도메인에 대한 C 말단에 있다. 면역글로불린 중쇄는 면역글로불린 (γ, μ, α, δ, ε)의 부류에 따라 이의 불변 영역에서 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 CH1 및 CH2 도메인을 분리하는 가요성 힌지 영역을 갖는 3개의 면역글로불린 도메인 (CH1, CH2 및 CH3으로 지칭됨)으로 이루어진 불변 영역을 갖는다. 중쇄 μ 및 ε은 4개의 도메인 (CH1~CH4)으로 이루어진 불변 영역을 갖는다. 중쇄의 불변 도메인은 VH 도메인에 대해 C 말단에 위치한다.
면역 글로불린 중쇄 및 경쇄에서의 아미노산의 넘버링은 Y 배열 형태의 갈라진 말단에서의 N-말단에서부터 각 쇄의 하단에있는 C-말단까지 진행한다. 상이한 넘버링 방법이 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 정의하기 위해 사용된다. EU 넘버링 방법에 따르면, IgG 분자의 중쇄 불변 도메인은 다음과 같이 확인된다: CH1 - 아미노산 잔기 118~215; CH2 - 아미노산 잔기 231~340; CH3 - 아미노산 잔기 341~446. Kabat 넘버링 방법에 따르면, IgG 분자의 중쇄 불변 도메인은 다음과 같이 확인된다: CH1 - 아미노산 잔기 114~223; CH2 - 아미노산 잔기 244~360; CH3 - 아미노산 잔기 361~477. "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 상기 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하며, 가요성이어서 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있도록 한다. 힌지 영역은 3개의 독특한 도메인, 즉, 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (문헌 [Roux K.H. et al. J. Immunol. 161:4083-90 1998]). "완전한 사람" 힌지 영역을 포함하는 본 발명의 항체는 하기 표 2에 나타낸 힌지 영역 서열 중 하나를 포함할 수 있다.
Figure pct00002
"단편" - 본 발명의 항체의 맥락에서 사용되는 "단편"이라는 용어는, 온전하거나 완전한 항체 또는 항체 쇄보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 일부 또는 부분을 지칭한다. "항원-결합 단편"이라는 용어는 항원 결합 (즉, GARP-TGF-β 복합체에 대한 특이적 결합)을 위해 항원에 결합하거나 온전한 항체와 (즉, 이들이 유래된 온전한 항체와) 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 항체 분자의 "단편"이라는 용어는 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어, 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 단일 쇄 항체 (scFv ), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 1개의 아암의 (1가의) 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 이러한 항원 결합 단편의 조합, 조립 또는 컨쥬게이트화에 의해 형성된 임의의 항원 결합 분자를 포함한다. 본 출원에서 사용되는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 추가로 유니바디, 도메인 항체 및 나노바디로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 단편을 포괄하는 것으로 의도된다. 단편은, 예를 들어, 온전하거나 완전한 항체 또는 항체 쇄에 화학적 또는 효소적 처리를 통해 또는 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환" - "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은, 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신,아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴,글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 비롯하여, 당해 분야에 정의되어 있다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드에서의 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열 유래의 또 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산의 스트링은, 측쇄 계열 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있다.
"키메라" - "키메라" 단백질은, 자연에서 자연적으로는 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 일반적으로 융합 폴리펩타이드에서 함께 결합하는 별도의 단백질에 존재할 수 있거나, 동일한 단백질에서 존재할 수 있지만 융합 폴리펩타이드에서 새로운 배열로 위치한다. 키메라 단백질은, 예를들어, 화학 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 목적하는 관계로 암호화되는 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 번역함으로써 생성될 수 있다. 본 발명의 예시적인 키메라 항체로는 사람 항체, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변 도메인에 융합된, 낙타 유래의 VH 및 VL 도메인, 또는 이들의 사람화 변이체를 포함하는 융합 단백질이 포함된다.
"결합가" - 본 출원에서 사용되는 "결합가"라는 용어는 폴리펩타이드 내의 잠재적 표적 결합 부위의 수를 지칭한다. 각각의 표적 결합 부위는 1개의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 부위와 특이적으로 결합한다. 폴리펩타이드가 1개 초과의 표적 결합 부위를 포함하는 경우, 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자와 특이적으로 할 수 있다 (예를 들어, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다).
"특이성" - "특이성"이라는 용어는 주어진 표적, 예를 들어, GARP-TGF-β1의 복합체와 결합하는 (예를 들어, 면역 반응하는) 능력을 지칭한다. 폴리펩타이드는 단일 특이적이며 표적과 특이적으로 결합하는 1개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있거나, 다중 특이적이며 동일하거나 상이한 표적과 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다.
"합성" - 폴리펩타이드와 관련하여 본 출원에서 사용되는 "합성"이라는 용어는 비자연 발생 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 상기 비자연 발생 아미노산 서열은 자연 발생 폴리펩타이드의 변형된 형태 (예를 들어, 부가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이 포함)이거나, 자연에서 자연적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 서열 (자연 발생일 수 있거나 자연 발생일 수 없음)에 선형 아미노산 서열로 연결되는 제1 아미노산 서열 (자연 발생일 수 있거나 자연 발생일 수 없음)을 포함한다.
"공학에 의해 생성된" - 본 출원에서 사용되는 "공학에 의해 생성된"이라는 용어는 합성 수단 (예를 들어, 재조합 기술, 시험관내 펩타이드 합성, 펩타이드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술들의 일부 조합)에 의한 핵산 또는 폴리펩타이드 분자의 조작을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 공학에 의해 생성되며, 예를 들어, 사람화 및/또는 키메라 항체, 및 항원 결합, 안정성/반감기 또는 효과기 기능과 같은 하나 이상의 특성을 개선하도록 공학에 의해 생성된 항체를 포함한다.
"사람화 치환" - 본 출원에서 사용되는 "사람화 치환"이라는 용어는, 항체 (예를 들어, 낙타 유래의 GARP-TGF-β1 항체)의 VH 또는 VL도메인의 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 기준 사람 VH 또는 VL 도메인의 동등한 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 지칭한다. 상기 기준 사람 VH 또는 VL 도메인은 사람 생식 세포에 의해 암호화되는 VH 또는 VL도메인일 수 있다. 상기 사람화 치환은 본 출원에서 정의된 항체의 프레임워크 영역 및/또는 CDR에서 이루어질 수 있다.
"사람화 변이체" - 본 출원에서 사용되는 "사람화 변이체"라는 용어는, 기준 항체와 비교하여 하나 이상의 "사람화 치환"을 포함하는 변이체 항체를 지칭하며, 여기서, 상기 기준 항체의 일부 (예를 들어, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 또는 이들의 일부)는 비-사람 종으로부터 유래된 아미노산을 가지고, 상기 "사람화 치환"은 비-사람 종으로부터 유래된 아미노산 서열 내에서 발생한다.
"생식 세포화 변이체" - "생식 세포화 변이체"라는 용어는, "사람화 치환"이 항체 (예를 들어, 낙타 유래의 GARP-TGF-β1 항체)의 VH 또는 VL 도메인의 특정 위치(들)에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람 생식 세포에 의해 암호화된 기준 사람 VH 또는 VL 도메인의 동등한 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 대체하는 "사람화 변이체"를 구체적으로 지칭하기 위해 본 출원에서 사용된다. 임의의 주어진 "생식 세포화 변이체"에서, 생식 세포화 변이체로 치환된 대체 아미노산 잔기는 사람 생식 세포-암호화된 단일 VH 또는 VL 도메인으로부터 독점적으로 또는 우세하게 수득되는 것이 전형적이다. "사람화 변이체" 및 "생식 세포화 변이체"라는 용어는 종종 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 하나 이상의 "사람화 치환"을 낙타 유래의 (예를 들어, 라마 유래의) VH 또는 VL 도메인 내에 도입하면, 낙타 (라마) 유래의 VH 또는 VL 도메인의 "사람화 변이체"가 생성된다. 치환되는 아미노산 잔기가 사람 생식 세포-암호화된 단일 VH 또는 VL 도메인 서열로부터 우세하게 또는 독점적으로 유래되는 경우, 그 결과는 낙타 (라마) 유래의 VH 또는 VL 도메인의 "사람 생식 세포화 변이체"일 수 있다.
"친화성 변이체" - 본 출원에서 사용되는 "친화성 변이체"라는 용어는 기준 항체와 비교하여 아미노산 서열에서 하나 이상의 변화를 나타내는 변이체 항체를 지칭하며, 여기서, 상기 친화성 변이체는 기준 항체와 비교하여 표적 항원에 대해 변경된 친화성을 나타낸다. 예를 들어, 친화성 변이체는 기준 항체인 GARP-TGF-β 항체와 비교하여 GARP-TGF-β에 대해 변화된 친화성을 나타낼 것이다. 바람직하게는, 상기 친화성 변이체는 기준 항체와 비교하여 표적 항원에 대해 개선된 친화성을 나타낼 것이다. 친화성 변이체는 전형적으로 기준 항체와 비교하여 CDR 내의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 변화를 나타낸다. 이러한 치환은 CDR 내의 주어진 위치에 존재하는 원래의 아미노산을 자연 발생 아미노산 잔기 또는 비자연 발생 아미노산 잔기일 수 있는 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 상기 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다.
B. GARP-TGF-β1 항체
본 발명은 GARP와 TGF-β1의 복합체, 특히, 사람 GARP와 사람 TGF-β1의 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 본 출원에서 기재된 바와 같은 구조적 및 기능적 특징과 관련하여 정의될 수 있다.
중요하게는, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는, 개선된 안정성을 나타내기 때문에, 이전에 기재된 GARP-TGF-β1 항체와 비교하여 개선된다. 특히, 본 출원에서 기재된 GARP-TGF-β1 항체의 안정성은 국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에서 기재된 GARP-TGF-β1 기준 항체인 LHG-10 및 LHG-10.6의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체와 비교하여 개선된다. 이러한 안정성 개선은 기준 항체인 LHG-10 및 LHG-10.6 항체와 비교하여 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 항체의 결합 친화성의 유의한 감소 없이 달성된다.
본 발명의 항체는 특히 중쇄 CDR2 및 CDR3 서열의 서열과 관련하여 이전에 기재된 LHG-10 및 LHG-10.6 GARP-TGF-β1 기준 항체와 상이하다. 보다 구체적으로, 상기 LHG-10 및 LHG-10.6 GARP-TGF-β1 항체는 중쇄 CDR2 서열: RIDPED G GTKYAQKFQG (서열 번호 5) 및 중쇄 CDR3 서열: N EWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 6)을 보유하는 반면, 본 발명의 항체는 중쇄 CDR2 서열: RIDPED A GTKYAQKFQG (서열 번호 12) 및 중쇄 CDR3 서열: Y EWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호13)을 보유한다. 본 출원에서 기재되고 예시된 바와 같이, 중쇄 CDR2 및 CDR3 서열 각각에서의 G55A 및 N95Y 아미노산 치환은 기준 항체와 거의 동등한 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 결합 친화성을 달성하면서 탈아미드화, 이성질체화 및 산화를 감소시킴으로써 항체 안정성을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
제1 양태에서, 본 발명은 GARP와 TGF-β1의 복합체에 결합하고 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것으로서, 여기서,
VH CDR3이 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VH CDR2가 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VH CDR1이 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)을 추가로 포함하고, 여기서,
VL CDR3이 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고 이로 이루어지고,
VL CDR2가 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VL CDR1이 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3이 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VH CDR2가 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VH CDR1이 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VL CDR3이 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고 이로 이루어지고,
VL CDR2가 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VL CDR1이 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3이 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR2가 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR1이 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR3이 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR2가 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR1이 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합체이다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론이다.
본 출원에서 사용되는 "항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, GARP-TGF-β1 복합체에 대한 적절한 면역학적 특이성을 나타내는 한, 단클론 항체 (전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체 및 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체)를 포괄하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 출원에서 사용되는 "단클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 구성하는 각각의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이어서 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 항원 상의 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자 또는 에피토프에 지시된다.
본 발명은 또한 항체의 "항원 결합 단편"을 포함하며, 이러한 단편은 본 출원의 다른 곳에서 정의되어 있다. 항체 단편은 전형적으로 전장 항체의 일부, 일반적으로는 이의 항원 결합 또는 가변 도메인을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 이중 특이적 Fab's, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중 특이적 항체가 포함된다 (문헌 [Holliger and Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-36 (2005)] 참조).
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 높은 사람 상 동성을 나타낼 수 있다. 사람 서열과의 상동성 수준은 중쇄 가변 도메인 (VH)의 길이 전체에 걸쳐 및/또는 경쇄 가변 도메인 (VL)의 길이 전체에 걸쳐 평가될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체는, 상기 VH 및 VL 도메인이 함께 가장 일치하는 사람 생식 세포 VH 및 VL 서열과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94% 또는 적어도 96%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다면, 높은 사람 상동성을 갖는 것으로 간주될 수 있다 . 하나의 실시형태에서, 높은 사람 상동성을 갖는 항체의 VH 도메인은 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전체에 걸쳐 하나 이상의 사람 VH 도메인과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94% 또는 적어도 96%의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 수 있다. 하나의 실시형태에서, 높은 사람 상동성을 갖는 항체의 VH 도메인은, 가장 가깝게 일치하는 사람 VH 서열과 비교하여, 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전체에 걸쳐 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 10개)의 아미노선 서열 불일치를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 높은 사람 상동성을 갖는 항체의 VL 도메인은 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전체에 걸쳐 하나 이상의 사람 VL 도메인과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94% 또는 적어도 96%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 수 있다. 하나의 실시형태에서, 높은 사람 상동성을 갖는 항체의 VL 도메인은, 가장 가깝게 일치하는 사람 VL 서열과 비교하여, 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전체에 걸쳐 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 10개)의 아미노선 서열 불일치를 포함할 수 있다.
높은 사람 상동성을 갖는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 생식 세포 서열에 대해 충분히 높은 % 서열 동일성을 나타내는 본래의 비-사람 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 원래 항체의 사람화 또는 생식 세포화 변이체가 되도록 조작된 비-사람 항체, 예를 들어, 낙타의 통상적인 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체의 사람화 또는 생식 세포화 변이체이다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 임의로 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열 번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 제공되며, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 14로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함하고/하거나, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 15로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 도메인이 기준 서열과의 특정 백분율의 서열 동일성에 의해 정의되는 실시형태의 경우, 상기 VH 및/또는 VL 도메인은 변이가 프레임워크 영역 내에서만 존재하도록 기준 서열 내에 존재하는 것과 동일한 CDR 서열을 보유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 14 및 15와의 특정 백분율의 동일성을 갖는 것으로 정의되는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 CDR 서열을 가질 것이다:
YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH CDR3,
RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH CDR2,
SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH CDR1,
QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL CDR3,
GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL CDR2,
QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL CDR1.
비제한적인 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 아미노산 서열이 완전한 또는 실질적인 사람인 CH1 도메인 및/또는 CL 도메인 (각각 중쇄 및 경쇄로부터 유래함)을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 사람의 치료학적 용도로 의도된 항체인 경우, 상기 항체의 전체 불변 영역 또는 적어도 이의 일부는 완전한 또는 실질적인 사람 아미노산 서열을 갖는 것이 전형적이다. 그러므로,상기 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CL 도메인 (및 존재한다면 CH4 도메인) 중 하나 이상 또는 이들의 임의의 조합은 이의 아미노산 서열에 대하여 완전한 또는 실질적인 사람일 수 있다.
유리하게는, 상기 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CL 도메인 (및 존재한다면 CH4 도메인)은 모두 완전한 또는 실질적인 사람 아미노산 서열을 가질 수 있다. 사람화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편의 불변 영역의 맥락에서, "실질적인 사람"이라는 용어는 사람 불변 영역과 적어도 90% 또는 적어도 92% 또는 적어도 95% 또는 적어도 97% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 지칭한다. 이러한 맥락에서의 "사람 아미노산 서열"이라는 용어는 생식 세포, 재배열된 및 체세포 돌연변이된 유전자를 포함하는 사람 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명은, "완전한 사람" 힌지 영역의 존재가 명시적으로 요구되는 이들의 실시형태를 제외하고, 사람 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 변경된 "사람" 서열의 불변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 또한 고려한다.
본 발명의 GARP-TGF-β1 항체에서 "완전한 사람" 힌지 영역의 존재는 면역원성을 최소화하고 항체의 안정성을 최적화하는 데 유리할 수 있다.
본 출원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역 내에서, 특히, Fc 영역 내에서 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 아미노산 치환은 치환된 아미노산을 상이한 자연 발생 아미노산으로 또는 비-천연 또는 변형된 아미노산으로 대체시킬 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 패턴의 변화 (예를 들어, N- 또는 O-연결된 글리코실화 부위의 부가 또는 결실에 의함)와 같은 다른 구조적 변형도 또한 허용된다.
GARP-TGF-β1 항체는 신생아 수용체 FcRn에 대한 결합 친 화성을 증가시키기 위해 Fc 영역 내에서 변형될 수 있다. 증가된 결합 친화성은 산성 pH (예를 들어, 약 대략 pH 5.5 내지 대략 pH 6.0)에서 측정될 수 있다. 증가된 결합 친화성은 또한 중성 pH (예를 들어, 대략 pH 6.9 내지 대략 pH 7.4)에서 측정될 수 있다. "증가된 결합 친화성"이란, 비변형된 Fc 영역에 비해 FcRn에 대한 증가된 결합 친화성을 의미한다. 전형적으로, 상기 비변형된 Fc 영역은 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 야생형 아미노산 서열을 보유할 것이다. 이러한 실시형태에서, 변형된 Fc 영역을 갖는 항체 분자의 증가된 FcRn 결합 친화성은 FcRn에 대한 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 결합 친화성에 대해 측정될 것이다.
특정 실시형태에서, Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 FcRn에 대한 결합을 증가시키기도록 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. FcRn 결합을 증가시켜 항체 약동학을 개선시키는 몇몇 Fc 치환이 보고되었다. 이러한 치환은, 예를 들어, 문헌 [Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28(2):157-9], [Hinton et al. (2006) J Immunol. 176:346-356], [Yeung et al. (2009) J Immunol. 182:7663-7671], [Presta LG. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460-470] 및 [Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23(10):1283-88]에서 보고되며, 이들 문헌의 전문은 본 출원에 포함된다.
특정 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 항체는 아미노산 치환 H433K 및 N434F를 포함하거나 이들로 이루어진 변형된 사람 IgG Fc 도메인을 포함하며, 상기 Fc 도메인 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 추가의 실시형태에서, 본 출원에서 기재된 GARP-TGF-β1 항체는 아미노산 치환 M252Y, S254T, T256E, H433K 및 N434F를 포함하거나 이들로 이루어진 변형된 사람 IgG Fc 도메인을 포함하며, 상기 Fc 도메인 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
특정 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 항체는 상응하는 야생형 IgG 서열에 대해 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 10개 이하, 12개 이하, 15개 이하, 20개 이하의 치환으로 이루어진 변형된 사람 IgG Fc 도메인을 포함한다.
항체의 의도된 용도에 따라, Fc 수용체에 대한 이의 결합 특성에 대하여, 예를 들어, 효과기 기능을 조절하기 위해 본 발명의 항체를 변형시키는것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역에 도입되어, 이 영역에서 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개성 세포 사멸및 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC)을 가질 수 있다 문헌 [Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191 -1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 본 발명은 또한 화학 요법제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위 원소 (즉, 방사성 컨쥬게이트)와 같은 세포 독성제에 컨쥬게이트된 본 출원에서 기재된 바와 같은 항체를 포함하는 면역 컨쥬게이트를 또한 고려한다. Fc 영역은 또한 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Chan and Carter, Nature Reviews: Immunology, Vol.10, pp301-316, 2010]에 의해 기재된 바와 같이, 반감기 연장을 위해 공학에 의해 생성될 수 있다.
더 또 다른 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)을 조정하고/하거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키는 항체의 능력을 증가시키도록 변형된다.
특정 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 효과기 기능이 존재하지 않도록 공학에 의해 생성될 수 있다. Fc 효과기 기능을 갖지 않는 GARP-TGF-β1 항체는 수용체 차단제로서 특히 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 감소된 효과기 기능을 갖는 자연 발생 IgG 이소형, 예를 들어, IgG4로부터 유래된 Fc 영역을 가질 수 있다. IgG4로부터 유래된 Fc 영역은, 예를 들어, 생체내에서 IgG4 분자들 사이의 아암의 교환을 최소화하는 변형의 도입에 의해 치료학적 유용성을 증가시키도록 추가로 변형될 수 있다. IgG4로부터 유래된 Fc 영역은 S228P 치환을 포함하도록 변형될 수 있다.
더 또 다른 실시형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 무글리코실화 (aglycosylated) 항체가 만들어질 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여된다). 글리코실화는, 예를 들어, 표적 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크의 글리코실화 부위를 제거하여 당해 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 무글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다.
감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화 항체 또는 완전한 또는 부분적 탈푸코실화 항체와 같은 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 변이체 GARP-TGF-β1 항체 (문헌 [Natsume et al., Drug Design Development and Therapy, Vol.3, pp7-16, 2009]에 의해 기재된 바와 같음) 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체가 또한 예상된다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시켜 전형적으로는 "본래의" 사람 Fc 도메인을 포함하는 등가 항체에 비해 ADCC의 10배 증진을 초래하는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 효소 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Yamane-Ohnuki and Satoh, mAbs 1:3, 230-236, 2009]에 의해 기재된 바와 같음). 강화된 ADCC 기능을 갖는 비-푸코실화 항체의 예는 BioWa Inc.의 Potelligent® 기술을 사용하여 제조된 것들이다.
사람의 치료학적 용도로 의도된 항체는 전형적으로 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 유형, 빈번하게는 IgG 유형이며, 이 경우에는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4의 4가지 하위 부류일 수 있다. 이들 하위 부류 각각 내에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 Fc 부분 내에 만들거나, 예를 들어, Fc 의존성 기능성을 강화 또는 감소시키기 위한 다른 구조적 변형을 만드는 것이 허용된다.
특정 실시형태에서, GARP-TGF-β1에 특이적으로 결합하는 항체는 적어도 하나의 전장 면역글로불린 중쇄 및/또는 적어도 하나의 전장 람다 또는 카파 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 경쇄는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, GARP-TGF-β1에 특이적으로 결합하는 항체는 적어도 하나의 전장 면역글로불린 중쇄 및/또는 적어도 하나의 전장 람다 또는 카파 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, GARP-TGF-β1에 특이적으로 결합하는 항체는 적어도 하나의 전장 면역글로불린 중쇄 및/또는 적어도 하나의 전장 람다 또는 카파 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호 16의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄는 서열 번호 17의 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 서열 번호 16으로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 서열 번호 17로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 서열 번호 16으로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 17로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 16으로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및 서열 번호 17로서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 단클론 항체가 본 출원에서 제공된다.
상기 항체의 쇄가 기준 서열과의 특정 백분율의 서열 동일성에 의해 정의되는 실시형태의 경우, 상기 중쇄 및/또는 경쇄는 변이가 CDR 영역 외에서만 존재하도록 기준 서열 내에 존재하는 것과 동일한 CDR 서열을 보유할 수 있다. 특히, 서열 번호 16 및 17과의 특정 백분율의 동일성을 갖는 것으로 정의되는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 CDR 서열을 가질 수 있다:
YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH CDR3,
RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH CDR2,
SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH CDR1,
QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL CDR3,
서열 번호 10 [GASRLKT]을 포함하거나 이로 이루어진 VL CDR2 서열, 및
QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL CDR1.
GARP-TGF-β1에 대한 결합
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GARP와 TGF-β1의 복합체, 특히, 사람 GARP와 사람 TGF-β1의 복합체에 결합한다. 본 출원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, GARP는 조절 T-세포의 표면 상에서 발현되는 막 관통 단백질이며, TGF-β의 잠재적 형태에 대한 수용체로서 작용한다. 도 1은 조절 T-세포의 세포 표면에서 GARP와 잠재적 TGF-β 사이에 형성되는 복합체의 개략도를 포함하는 것이다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편이 결합하는 GARP-TGF-β1 복합체는 GARP와 TGF-β1 사이의 세포 표면에서 형성되는 본래의 GARP-TGF-β1 복합체이다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 이들이 GARP-TGF-β1의 복합체에 결합하지만 TGF-β1 또는 잠재적 TGF-β의 부재하에 GARP에 결합하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편은 TGF-β1의 존재하에서만 GARP에 결합한다. 특히, 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편은 잠재적 TGF-β1의 존재하에서만 GARP에 결합한다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Treg 세포로부터 활성 TGF-β의 방출을 차단하거나 억제할 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편에 대한 표적 항원은 2개의 개별 단백질을 포함하는 복합체이기 때문에, 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프는 선형과는 대조적인 입체 형태의 에피토프이다. 상기 입체 형태의 에피토프는 GARP로부터의 적어도 하나의 잔기 및 잠재적 TGF-β1로부터의 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 입체 형태의 에피토프는 GARP로부터의 적어도 하나의 잔기, 잠재적 TGF-β1의 잠재성 관련 펩티드 (LAP)로부터의 적어도 하나의 잔기, 및 성숙 TGF-β1의 적어도 하나의 잔기를 포함한다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 사람 GARP 및 사람 TGF-β1에 의해 형성된 복합체의 에피토프에 결합할 수 있으며, 여기서, 상기 에피토프는 Y137, S138, G139, T162 및 R163으로부터 선택된 GARP로부터의 적어도 하나의 잔기 (서열 번호 33 참조) 및 TGF-β1로부터의 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 에피토프는 GARP의 적어도 잔기 Y137, S138, G139, T162 및 R163을 포함한다 (서열 번호 33 참조).
싱기 에피토프는 TGF-β1 폴리펩타이드 (서열 번호 34)로부터의 적어도 하나의 잔기를 포함 할 수 있으며, 임의로 상기 적어도 하나의 잔기는 K338이다. 상기 에피토프는 TGF-β1의 잠재성 관련 펩티드 (LAP)로부터의 적어도 하나의 잔기 및 성숙 TGF-β1으로부터의 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 상기 에피토프는 LAP의 R58 및 성숙 TGF-β1 (서열 번호 34 참조)의 K338을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 GARP와 TGF-β1의 복합체에 결합한다. 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 사람 GARP와 사람 TGF-β2의 복합체 및/또는 사람 GARP와 사람 TGF-β3의 복합체에 추가로 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 GARP와 TGF-β1의 복합체에 높은 친화성으로 결합한다. 본 출원에서 사용되는 "친화성" 또는 "결합 친화성"이라는 용어는 항체 결합의 맥락에서 당해 분야의 일반적인 의미에 기초하여 이해되어야 하며, 항원과 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 부위 사이의 결합의 강도 및/또는 안정성을 반영한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편의 이의 각각의 항원에 대한 결합 친화성은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, BiacoreTM와 같은 SPR 기기는 상기 항체 또는 항체 단편이 특정 유동 조건하에 고정화된 표적을 통과하는 동안 바이오 센서 칩 상에 표적 단백질 또는 항원의 고정화에 기초하여 친화성을 측정한다. 이들 실험에 의해, KD 값으로 변환될 수 있는 k온 및 k오프 측정치가 산출되며, 여기서, KD는 항원과 항체 또는 이의 단편의 해리에 대한 평형 상수이다. KD 값이 작을수록, 항체와 이의 표적 항원 사이의 결합 상호 작용이 강해진다.
상기에서 언급한 바와 같이, 항체의 친화성은, 예를 들어, 본 출원의 다른 곳에서 기재된 프로토콜을 사용하여 BiacoreTM 또는 SPR에 의해 결정될 수 있다. BiacoreTM 또는 SPR에 의해 측정된 바와 같은 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 친화성은, 예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이 재조합적으로 발현된 GARP-TGF-β1 복합체를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab로서 시험될 때 7 × 10-4 s-1 미만, 5 × 10-4 s-1 미만, 3 × 10-4 s-1 미만, 1.5 × 10-4 s-1 미만의 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 오프-레이트 (k오프)를 나타낼 수 있다. 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 × 10-6 s-1 내지 5 × 10-4 s-1 범위, 바람직하게는 1 × 10-6 s-1 내지 3 × 10-4 s-1 범위, 보다 바람직하게는 1 × 10-5 s-1 내지 1.5 × 10-4 s-1 범위의 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 오프-레이트 (k오프)를 나타낼 수 있다.
본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는 5 × 10-9 M 미만, 2 × 10-9 M 미만의 KD 값을 나타낼 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는 1.7 × 10-9 M 미만의 KD 값을 나타낸다.
특정 실시형태에서, GARP와 TGF-β1의 복합체에 결합하는 본 출원에서 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GARP 및 TGF-β의 하나 이상의 종 동족체, 예를 들어, 비-사람 영장류 기원의 GARP 및 TGF-β 동족체와 교차 반응할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥐과 동물 기원의 GARP와 TGF-β1의 복합체와 교차 반응하지 않는다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비-사람 영장류 기원의 GARP-TGF-β 복합체, 특히, 시노몰구스 기원의 GARP-TGF-β 복합체에 결합할 수 있다. 다른 종 동족체와의 교차 반응성은 치료용 항체의 개발 및 시험에서 특히 유리할 수 있다. 예를 들어, 치료용 항체의 전임상 독성학 시험은 시노몰구스 원숭이를 비롯한 영장류 종에서 빈번하게 수행되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이들 종 동족체와의 교차 반응성은 임상 후보로서 항체의 개발에 특히 유리할 수 있다.
개선된 안정성
본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는, 개선된 안정성을 나타내기 때문에, 이전에 기재된 GARP-TGF-β1 항체와 비교하여 개선된다. 특히, 상기 GARP-TGF-β1 항체의 안정성은 국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에서 기재된 GARP-TGF-β1 기준 항체 LHG10.6의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체와 비교하여 개선된다.
상기 GARP-TGF-β 항체 LHG10.6은 하기 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 CDR 서열의 조합을 보유한다:
NEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 6)로 이루어진 중쇄 CDR3,
RIDPEDGGTKYAQKFQG (서열 번호 5)로 이루어진 중쇄 CDR2,
SYYID (서열 번호 4)로 이루어진 중쇄 CDR1,
QQYASVPVT (서열 번호 11)로 이루어진 경쇄 CDR3,
GASRLKT (서열 번호 10)로 이루어진 경쇄 CDR2, 및
QASQSISSYLA (서열 번호 9)로 이루어진 경쇄 CDR1.
본 출원의 다른 곳에서 보고된 바와 같이, LHG10.6의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 GARP-TGF-β1 항체는 안정성이 결여되어 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, LHG10.6의 생식 세포화 단클론 항체 변이체 (본 출원의 다른 곳에서 mAb 39B6 IgG4 및 39B6 IgG1로 지칭됨)는 PBS와 PBS/Tween 둘 다에서 37℃에서 저장될 때 보다 낮은 표적 결합 활성의 경향을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 도 2 참조). 이러한 불안정성은 HCDR3의 N95 위치, 즉, 중쇄 CDR3의 제1 잔기에서의 이성질체화 및 탈아미드화에 적어도 부분적으로 기인하였다.
본 발명의 GARP-TGF-β1 항체 및 이의 항원 결합 단편은 이들의 CDR 서열, 특히, 이들의 중쇄 CDR 서열에 대하여 상이하여, 이들의 안정성은 개선된다. 특히, 상기 중쇄 CDR2 (HCDR2 또는 VH CDR2) 서열은 G55A 치환을 포함하도록 변형되어, 본 발명의 항체의 HCDR2 서열은 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)로 표시되는 HCDR2를 포함한다. 또한, 상기 중쇄 CDR3 (HCDR3 또는 VH CDR3) 서열은 N95Y 치환을 포함하도록 변형되어, 본 발명의 항체의 HCDR3 서열은YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)로 표시되는 HCDR3을 포함한다. 본 발명의 항체는 탈아미드화 또는 이성질체화를 거치지 않는다. 또한, 놀랍게도 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는 산화에 대해 비교적 저항성이 있는 것으로 밝혀졌다. 탈아미드화, 이성질체화 및 산화에 대한 이러한 저항성은 본 발명의 항체의 개선된 안정성, 특히, 37℃의 온도에서 측정된 개선된 안정성과 상관 관계가 있다.
더욱이, 상기 중쇄 CDR2 및 CDR3 서열에 대한 변형은 기준 항체 LHG10.6과 비교하여 표적 결합 활성을 유의하게 감소시키지 않기 때문에, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 놀랍게도 유리하다. 본 출원에서 예시된 바와 같이, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는 37℃에서 비교적 안정적이며, 기준 항체 LHG10.6과 비교하여 GARP-TGF-β1 복합체 또는 이의 생식 세포화 변이체 (39B6)에 대한 결합 친화성에서 유의한 감소를 나타내지 않는다. 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체는 1.7 × 10-9 M 미만의 KD 값을 나타낸다.
본 출원에서 보고된 바와 같이, Asn (N) 잔기를 제거하는 HCDR3의 N95 위치에서의 모든 치환이 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 결합 친화성을 유지하면서 항체 안정성을 개선시킬 수 있는 것은 아니다. N95V 치환을 갖는 생식 세포화 단클론 항체 변이체 (본 출원에서 39B6-AVE로서 지칭됨)는 탈아미드화 및 이성질체화에 대해 저항성이 있는 것으로 밝혀졌지만, 37℃에서 28일 동안 저장시 유의한 산화를 겪었다. 이러한 N95V 항체 변이체의 결합 활성은 또한 37℃에서 56일의 저장 기간에 걸쳐 유의하게 감소하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 또한 중쇄의 인접한 96 위치 (즉, HCDR3의 제2 잔기)에서의 벌크 치환이 안정성을 개선하고 높은 친화성 항원 결합 활성을 유지할 수 없다는 것을 밝혀냈다. 본 출원에서 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 HCDR3 도메인에서 치환 E96K 및 E96R을 포함하는 2개의 생식 세포화 단클론 항체 변이체를 시험하였다. E96K 변이체 (본 출원에서 39B6-ANK로서 지칭됨)는 산화를 겪지 않았지만, 37℃에서 28일 기간에 걸쳐 탈아미드화 및 이성질체화를 겪었으며, 56일 기간에 걸쳐 결합 활성에서 유의한 감소를 겪었다. E96R 변이체 (본 출원에서 39B6-ANR로서 지칭됨)는 37℃에서 28일 기간에 걸쳐 유의한 산화 및 탈아미드화를 겪었으며, 56일 기간에 걸쳐 결합 활성에서 감소를 겪었다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3은 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VH CDR2는 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VH CDR1은 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VL CDR3은 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고 이로 이루어지고,
VL CDR2는 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
VL CDR1은 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3은 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR1은 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR3은 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
VH CDR3은 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR2는 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VH CDR1은 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR3은 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR2는 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열로 이루어지고,
VL CDR1은 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열로 이루어진다.
이들 항체는 바람직하게는 1.7 × 10-9 M 미만의 KD 값을 나타낸다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 임의로 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 서열 번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 임의로 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함한다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시형태에서, 상기 GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하고 개선된 안정성을 나타내는 항체는 서열 번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열 번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.
GARP-TGF-β 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 분자, 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 항체 또는 이의 단편의 발현을 허용하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 상기 클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인은 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되며, 여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 서열 번호 18 및 19의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 GARP-TGF-β1 항체의 기능적 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 변이체 서열을 포함할 수 있다. 상기 VH 도메인을 암호화하는 변이체 서열은 서열 번호 18에 대해 최적으로 정렬될 때 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낼 수 있으며, 상기 VL 도메인을 암호화하는 변이체 서열은 서열 번호 19에 대해 최적으로 정렬될 때 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄는 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되며, 여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 서열 번호 20 및 21의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 GARP-TGF-β1 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 변이체 서열을 포함할 수 있다. 상기 중쇄를 암호화하는 변이체 서열은 서열 번호 20에 대해 최적으로 정렬될 때 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낼 수 있으며, 상기 경쇄를 암호화하는 변이체 서열은 서열 번호 21에 대해 최적으로 정렬될 때 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
이러한 맥락에서, 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이의 % 서열 동일성은 최적의 방식으로 정렬된 이들 2개의 서열을 비교함으로써 결정될 수 있으며, 비교되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 이들 2개의 서열들 사이의 최적 정렬을 위해 기준 서열에 대해 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 잔기가 2개의 서열들 사이에서 동일한 동일 위치의 수를 결정하고, 이러한 동일 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총 수로 나누고, 수득된 결과에 100을 곱하여 이들 2개의 서열들 사이의 동일성의 백분율을 수득함으로써, 동일성의 백분율을 계산한다. 예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2에서 이용 가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (문헌 [Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250])을 사용하는 것이 가능하며, 여기서, 사용되는 파라미터는 디폴트로서 제공된 것이며 (특히, 파라미터 "개방 갭 페널티": 5 및 파라미터 "연장 갭 페널티": 2의 경우; 선택된 매트릭스는, 예를 들어, 상기 프로그램에 의해 제안된 매트릭스 "BLOSUM 62"임), 비교되는 2개의 서열들 사이의 동일성의 백분율은 상기 프로그램에 의해 직접 계산된다.
본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는, 예를 들어, 재조합 DNA 분자를 포함한다. "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드 분자"라는 용어는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용되며, 단일 또는 이중 가닥의 임의의 DNA 또는 RNA 분자, 및 단일 가닥인 경우, 이의 상보적 서열의 분자를 지칭한다. 핵산 분자를 논의함에 있어서, 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 5' 에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 통상적인 관례에 따라 본 출원에서 기재될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 "단리된다". 상기 용어는, 핵산 분자에 적용될 때, 이것이 기원되는 유기체의 자연 발생 게놈에서 바로 인접하는 서열로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나 원핵 또는 진핵 세포 또는 비-사람 숙주 유기체의 게놈 DNA에 통합되는 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때, "단리된 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 주로 상기에서 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 암호화되는 RNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 상기 용어는, 이것이 이의 자연 상태에서 (즉, 세포 또는 조직에서) 결합될 다른 핵산으로부터 정제/분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA)는 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생산되어 이의 생산 동안 존재하는 다른 성분으로부터 분리된 분자를 추가로 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 재조합적 생산의 경우, 이를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 (표준 분자 생물학 기술을 사용하여) 제조하고, 선택된 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서의 발현을 위한 복제 가능한 벡터에 삽입할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 세포, 특히, 포유류 세포일 수 있다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주 (293, 또는 현탁 배양 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293개의 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 마우스 골수종 세포 SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) 또는 NS0 (HPA 컬쳐 컬렉션 번호 85110503); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 사람 간세포암 세포(CAP); 및 사람 간세포암 세포주 (Hep G2) 뿐만 아니라, DSM의 PERC-6 세포주가 있다. 이들 숙주 세포의 각각에서 사용하기에 적합한 발현 벡터도 또한 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다.
"숙주 세포"라는 용어는 일반적으로 배양된 세포주를 지칭한다는 것에 유의해야 한다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 발현 벡터가 도입된 전체 사람은 "숙주 세포"의 정의로부터 명시적으로 제외된다.
항체 생산
추가의 양태에서, 본 발명은, 항체의 발현을 허용하는 조건하에 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 발현 벡터)를 하나 이상 함유하는 숙주 세포 (또는 무세포 발현 시스템)를 배양하고, 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 재조합 발현 과정은 사람의 치료학적 용도로 의도된 단클론 항체를 비롯하여 본 발명에 따른 GARP-TGF-β1 항체를 비롯한 항체의 대규모 생산에 사용될 수 있다. 생체내 치료학적 용도에 적합한 재조합 항체의 대규모 제조를 위한 적합한 벡터, 세포주 및 생산 방법은 일반적으로 당해 분야에서 이용 가능하며, 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 범위는 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제형화된, 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들 중 하나 또는 이들의 조합을 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 GARP-TGF-β1 항체들 중 하나 또는 이들의 조합 (예를 들어, 종 이상 상이함)을 포함할 수 있다. 사람의 치료학적 용도를 위한 단클론 항체를 제형화하기 위한 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, pp1-26, 2007]에서 잘 검토되어 있으며, 이 문헌의 전문은 본 출원에 포함된다.
특정 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 피하, 경막외, 비강, 경구, 직장, 국소, 흡입, 협측 (예를 들어, 설하) 및 경피 투여를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 적합한 투여 경로를 통해 환자에게 투여하기 위해 제형화된다.
이들 조성물에서 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제로는 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어, 사람 혈청 알부민, 완충 물질, 예를 들어, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산, 물, 염 또는 전해질의 부분 글리세라이드 혼합물, 예를 들어, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마크네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질 (예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
GARP-TGF-β1 항체의 치료학적 유용성
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 치료 방법에 사용될 수 있으며, 여기서, 이를 필요로 하는 대상체는 치료학적 유효량의 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여받는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 치료 방법에 사용될 수 있으며, 여기서, 이를 필요로 하는 사람 대상체는 치료학적 유효량의 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여받는다. 약제로서 사용하기 위한 사람 GARP와 TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 제공된다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 조절 T-세포 상의 GARP-TGF-β 복합체에 결합하고 활성 TGF-β 생산 또는 방출을 차단 또는 억제할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 추가의 양태에서, TGF-β 관련 장애를 갖거나 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 본 출원에서 제공된다. 이러한 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
예시적인 TGF-β 관련 장애로는 염증성 질환, 만성 감염, 암, 섬유증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중) 및 신경퇴행성 질환이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, TGF-β 관련 장애는 만성 감염이다. 특정 실시형태에서, TGF-β 관련 장애는 암이다.
대상체에 대한 투여에서 사용하기 위해, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이에 의하여, 국소, 직장, 비강, 협측, 질내 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "투여"라는 용어는 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 윤활막내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내, 종양내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 제한 없이 포함한다.
상기 조성물의 멸균 주사 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당해 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 상기 멸균 주사용 제제는 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클과 용매로는, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨을 들 수 있다. 또한, 멸균 고정유도 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 비롯한 임의의 통상적인 고정유가 사용될 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산은 주사제의 제조에 유용하며, 이는 올리브유 또는 피마지유, 특히, 이들의 폴리옥시에틸화 버전과 같은 천연의 약제학적으로 허용되는 오일이다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 유화액과 현탁액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 투여 형태 (dosage form)의 제형 중에 일반적으로 사용된는 카복시메틸 셀룰로오스 또는 이와 유사한 분산제와 같은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제를 또한 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 이러한 Tween, Span 및 기타 유화제 또는 생체 이용률 증진제와 같은 다른 통상적으로 사용되는 계면 활성제도 또한 제형의 목적으로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물 중 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여를 위한 스케줄 및 투약량은, 예를 들어, 제조업자의 설명서를 사용하여, 이들 유형의 제품에 대한 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물에 존재하는 항체는 100 mg (10 mL) 또는 500 mg (50 mL)의 일회용 바이알로 10 mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. 생성물은 정맥내 (IV) 투여를 위해 9.0 mg/mL 염화 나트륨, 7.35 mg/mL 나트륨 시트레이트 디하이드레이트, 0.7 g/mL 폴리소르베이트 80, 및 멸균 주사용수로 제형화될 수 있다. pH는 6.5으로 조정된다.
임상 용도의 경우, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로의 경우, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 용량은, 예를 들어, 약 0.01 내지 약 100 mg/kg 체중일 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 용량은, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 50 mg/kg 체중일 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 용량은, 예를 들어, 약 1 내지 약 20 mg/kg 체중일 수 있다. 반복 투여의 경우, 개별 용량은 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한 반복 투여의 경우, 개별 용량은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 용량 또는 로딩 용량은 후속 용량 초과일 수 있다. 또한, 반복 투여의 경우, 개별 용량은 고정된 스케줄로 또는, 예를 들어, 대상체의 임상 병태 또는 임상 반응에 기초하는 조정 가능하거나 가변적인 스케줄로 투여될 수 있다. 또한, 반복 투여의 경우, 개별 용량은 전형적으로 매일 1회, 격일에 1회, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회, 주 1회, 격주에 1회, 3 또는 4 주마다 1회, 또는 격월에 1회 투여될 수 있다. 다른 스케줄도 또한 본 발명에 의해 고려된다.
이들 용량 및 스케줄은 예시적이며 최적의 스케줄 및 요법은 투여되는 특정 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 치료되는 질환 또는 장애, 치료되는 대상체의 크기, 연령 및 상태, 투여 경로, 대상체에게 투여되는 다른 요법, 및 특정 항체의 친화성 및 내약성과 같은 요인을 고려하여 결정될 수 있는 것으로 인식된다. 이러한 요인 및 투여 고려 사항은 하나 이상의 임상 시험에서 결정될 수있다.
본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역계를 부스터 (booster)하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 사람 Treg의 면역 억제 기능을 억제하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 본 발명의 GARP-TGF-β1 항체 및 이의 항원 결합 단편을 사용하여 암을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법들은 이를 필요로 하는 대상체의 종양 환경에서 면역 억제를 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 실시형태의 경우, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 추가의 암 치료, 예를 들어, 하나 이상의 면역 치료제(들)와 조합하여 투여될 수 있다.
GARP-TGF-β1 항체가 면역 치료제와 조합하여 투여되는 실시형태에서, 상기 면역 치료제는 종양 백신일 수 있다. 대안적으로, 상기 면역 치료제는 면역 자극 항체일 수 있다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 항체는 임의의 면역 억제를 예방 또는 완화함으로써 면역 치료제의 효능을 향상시킬 것이다. 특정 실시형태에서, 면역 치료제와의 조합은 상승 효과를 나타낼 수 있다.
부신피질 암종, 항문암, 방광암, 뇌종양, 신경교종, 유방 암종, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 결장 암종, 자궁내막 암, 식도암, 간외 담관암, 유잉 종양, 두개 외 생식 세포 종양, 안암, 담낭암, 위암, 생식 세포 종양, 임신성 융모 종양, 두경부암, 하인두암, 섬 세포 암종, 신장암, 후두암, 백혈병, 구순 및 구강암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 메르켈 세포 암종, 전이성 편평 두경부암, 골수종, 신생물, 비인두암, 신경모세포종, 구강암, 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 크롬친화세포종, 뇌하수체암, 형질 세포 신생물, 전립선암, 횡문근 육종, 직장암, 신세포 암종, 침샘암, 피부암, 카포시 육종, T-세포 림프종, 연조직 육종, 위장암, 고환암, 흉선종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 외음부암 또는 윌름스 종양을 포함하거나 이에 한정되지 않는 각종 암은 본 출원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있다.
당해 분야에 공지된 종양 백신으로서 사용하기에 적합한 종양 항원으로는, 예를 들어, 다음이 포함된다: (a) 암-고환 항원, 예를 들어, NY-ESO-1, SSX2, SCP1 뿐만 아니라, RAGE, BAGE, GAGE 및 MAGE 계열 폴리펩타이드, 예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 및 MAGE-12 (예를 들어, 흑색종, 폐, 두경부, NSCLC, 유방, 위장관 및 방광 종양을 다루는데 사용될 수 있음), (b) 돌연변이된 항원, 예를 들어, p53 (각종 고형 종양, 예를 들어, 대장암, 폐암, 두경부암과 관련), p21/Ras (예를 들어, 흑색종, 췌장암 및 대장암과 관련), CD 4 (예를 들어, 흑색종과 관련), MUM 1 (예를 들어, 흑색종과 관련), 카스파아제-8 (예를 들어, 두경부암과 관련), CIA 0205 (예를 들어, 방광암과 관련), HLA-A2-R1701, 베타 카테닌 (예를 들어, 흑색종과 관련), TCR (예를 들어, T-세포 비호지킨 림프종과 관련), BCR-abl (예를 들어, 만성 골수성 백혈병과 관련), 트리오스포스페이트 아이소머라아제, IA 0205, CDC-27 및 LDLR- FUT, (c) 과발현된 항체, 예를 들어, 갈렉틴 4 (예를 들어, 대장암과 관련), 갈렉틴 9 (예를 들어, 호지킨 병과 관련), 프로테이나아제 3 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병과 관련), WT 1 (예를 들어, 각종 백혈병과 관련), 탄산 무수화효소 (예를 들어, 신장암과 관련), 알돌라아제 A (예를 들어, 폐암과 관련), PRAME (예를 들어, 흑색종과 관련), HER-2/neu (예를 들어, 유방암, 결장암, 폐암 및 난소암과 관련), 알파-태아 단백질 (예를 들어, 간세포암과 관련), SA (예를 들어, 대장암과 관련), 가스트린 (예를 들어, 췌장암 및 위암과 관련), 텔로머라아제 촉매적 단백질, MUC-1 (예를 들어, 유방암 및 난소암과 관련), G-250 (예를 들어, 신세포 암종과 관련) 및 암배아 항원 (예를 들어, 유방암, 폐암, 및 대장암과 같은 위장관의 암), (d) 공통 항원, 예를 들어, 흑색종-멜라닌 세포 분화 항원, 예를 들어, MART-l/Melan A, gp100, MC1R, 멜라닌 세포 자극 호르몬 수용체, 타이로시나아제, 타이로시나아제 관련 단백질-1/TRPl 및 타이로시나아제 관련 단백질-2/TRP2 (예를 들어, 흑색종과 관련), (e) 전립선 관련 항원, 예를 들어, 전립선암과 관련된, 예를 들어, PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, (f) 면역글로불린 이디오타입 (예를 들어, 골수종 및 B-세포 림프종과 관련), 및 (g) 기타 종양 항원, 예를 들어, (i) 당단백질, 예를 들어, 시알릴 Tn 및 시알릴 Le<x> (예를 들어, 유방암 및 대장암과 관련) 뿐만 아니라 각종 뮤신; 당단백질은 담체 단백질에 커플링될 수 있음 (예를 들어, MUC-1은 LH에 커플링될 수 있음); (ii) 리포폴리펩타이드 (예를 들어, 지질 잔기에 연결된 MUC-1); (iii) 담체 단백질에 (예를 들어, KLH에) 커플링될 수 있는 다당류 (예를 들어, Globo H 합성 육당류), (iv) 담체 단백질 (예를 들어, KLH)에 커플링될 수 있는 강글리오사이드, 예를 들어, GM2, GM12, GD2, GD3 (예를 들어, 뇌종양, 폐암, 흑색종)을 포함하는 폴리펩타이드- 및 당류-함유 항원. 기타 종양 항원으로는 pi 5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH- IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr virus) 항원, EBNA, E6 및 E7을 비롯한 사람 유두종 바이러스 (human papillomavirus: HPV) 항원, 간염 B 및 C 바이러스 항원, 사람 T-세포 림프 친화성 바이러스 항원, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H l, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p 16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 결합 단백질/사이클로필린 C-관련 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS 등이 포함된다.
적합한 면역 자극 항체로는 항-CTLA-4, 항-PD1, 항-PDL1 및 항-KIR 항체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시형태에서, 본 출원에서 기재된 암을 치료하는 방법은 또 다른 항암제 또는 화학요법 치료와 같은 암 치료의 투여 이전에, 이와 동시에 및/또는 이후에 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 백신접종 전략의 효능을 개선시키도록 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여함으로써 감염 질환을 예방하는 방법을 또한 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 HIV, 말라리아 또는 에볼라와 같은 감염 질환에 특별한 백신과 함께 본 출원에서 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합 투여에 의한 이들 질환의 예방을 포함할 수 있다.
키트
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 GARP-TGF-β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
"키트"라는 용어는 적어도 하나의 시약, 예를 들어, GARP-TGF-β1 복합체에 특이적으로 결합하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 제품 (예를 들어, 패키지 또는 용기)을 의미한다. 상기 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉되고, 배포되거나, 판매될 수 있다. 또한, 키트 시약들 중 임의의 시약 또는 모든 시약은 밀봉된 용기에서와 같이 외부적인 환경으로부터 이들을 보호하는 용기내에 제공될 수 있다. 상기 키트는 이의 사용을 위한 키트 및 방법을 설명하는 패키지 삽입물을 또한 포함할 수 있다.
실시예
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 더 이해될 것이다.
실시예 1 항체 LHG-10.6의 생식 세포화
항체 "LHG-10"의 생산 및 특성화는 국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에 기재되어 있으며, 이들 공보의 전문은 본 출원에 포함된다. 사람 GARP-TGF-β1 복합체를 과발현하는 HEK293E 세포로 라마를 면역화함으로써 항체 LHG-10을 생성하고, GARP-TGF-β1 Fab를 선별하고 스크리닝함으로써 확인하였다. 단클론 항체 LHG-10의 친화성을 개선시키기 위해 경쇄 셔플링 접근법 (예를 들어, 국제공개공보 WO 2014/033252에 기재된 바와 같음)을 사용하였으며, 변이체 "LHG-10.6" (본 출원에서 17H5로도 또한 지칭됨)은 개선된 결합 특성을 갖는 것으로서 확인되었다. LHG-10 및 Vκ 셔플링된 변이체 LHG-10.6의 VH 및 VL 서열은 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00003
17H5 항체는 VH 도메인 전체에 걸쳐 가장 가까운 사람 생식 세포 서열 (X92343|IGHV1-46*01)과 88.5%의 동일성 및 VL 도메인 전체에 걸쳐 가장 가까운 사람 생식 세포 서열 (X59315|IGKV1-39*01)과 86.2%의 동일성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 3 단계 방법에 따라 생식 세포화를 이 항체에 실시하였다:
1- PCR을 통해 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 암호화 유전자를 합성적으로 생성하기 위해 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 유전자 라이브러리의 조립.
2- 이러한 유전자 라이브러리의 사람 불변 중쇄 (CH1) 및 불변 카파 (Cκ) 경쇄 암호화 유전자를 포함하는 벡터 (pCB13)로의 클로닝 (라이브러리 구축).
3- 파지 디스플레이 및 친화성 선택을 이용한 기능성 Fab의 선택.
1. 라이브러리 작제
17H5의 VH를 가장 가까운 사람 생식 세포 서열과 비교하고, 사람 생식 세포를 벗어나는 프레임워크 잔기를 확인하였다. 이들 프레임워크 잔기를 사람 V-영역에 존재하는 잔기로 돌연변이시키도록 허용하면서 또한 라이브러리에서 원래의 잔기를 유지시켰다. 사람 대응물로 돌연변시키도록 허용된 12 VH 잔기는 하기 표에 나타나 있다. 이들 생식 세포화 돌연변이에 추가하여, CDR2 내의 이성질체화 부위 (D54; D55) 및 CDR3의 산화 부위 (M100f)를 돌연변시키도록 허용하였다. 이들 부위는 또한 하기 표에 나타나 있다.
Figure pct00004
17H5의 Vk의 경우, 가장 가까운 사람 생식 세포 서열과 프레임워크 서열 사이의 비교는 표적화되는 11개의 잔기를 확인으로 이어졌다. 이들 부위는 하기 표에 나타나 있다.
Figure pct00005
17H5 생식 세포화 라이브러리의 이론적 크기는 표 6에 나타나 있다.
Figure pct00006
2. 유전자 라이브러리의 작제
생식 세포화 라이브러리를 유전자 조립에 의해 생성하였다. 이러한 디자인에 기초한 VH 및 VL (2개의 세트)에 대한 합성 유전자를 PCR 기반 어셈블리에 의해 생성하였다 (문헌 [Stemmer et al., Gene (1995) 164: 49 - 530]). 특정 위치에서 특정 돌연변이를 갖는 중첩 올리고뉴클레오타이드를 PCR에 의해 조립하였다. 뉴클레오타이드는 사람 및 라마 아미노산을 암호화하도록 축퇴되었다. 이것은 라마 잔기가 안정성, 폴딩 또는 높은 친화성 결합에 중요한 경우에 결합의 완전한 손실을 방지하기 위해 수행되었다.
사람 Ck 및 CH1 도메인을 갖는 파지미드 벡터인 pCB13-CK1 내에 각각 17H5 Vκ 및 VH 라이브러리의 합성 유전자를 먼저 클로닝하였다. 이들 VkCk 및 VHCH1 서브 라이브러리의 작제 후, 중쇄 삽입물을 경쇄 라이브러리에 연결시켜 최종 라이브러리를 제조하였다. 삽입 백분율을 결정하기 위해 콜로니 PCR을 수행하고, 서열 분석하기 위해 클론을 보내어 목적하는 모든 돌연변이가 라이브러리에 존재한다는 것을 보장하였다. 다른 라이브러리의 특징은 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00007
생식 세포화 라이브러리는 품질이 우수하며 선택을 위해 사용될 수 있다.
3. 높은 사람 동일성을 갖는 Fab의 선택
파지 디스플레이를 사용하여 국제공개공보 WO 2015/015003에서 이전에 기재된 바와 같이 사람 GARP-TGF-β1 복합체에 대해 높은 친화성을 갖는 Fab를 선택하였으며, 이 특허의 전문은 본 출원에 포함된다. 요약하자면, 마이크로타이터 플레이트를 GARP-TGF-β1 복합체로 4℃에서 O/N 코팅하고, 그 다음날 Fab 발현 파지를 상이한 농도의 복합체로 코팅된 웰에서 2시간 동안 인큐베이션 처리하였다. 플레이트를 세척하고, 특정 파지를 트립신으로 용리시켜 TG1 세포의 감염에 사용하였다. 선택 조건의 세부 사항은 표 8에 나열되어 있다.
Figure pct00008
제1 라운드의 선택 후, 농축은 10 μg/ml에서 관련이 없는 단백질의 코팅에 대해서만 관찰되었다. 라운드 2에서, 농축은 10배 더 높았지만, 투입 파지의 양은 10배 더 낮았다. 라운드 3에서 시작하여, 세척 기간을 증가시키고 용액에 과량의 표적을 첨가함으로써 엄격성을 증가시켰다. 해리된 파지의 재결합을 방지하기 위해 과량의 가용성 표적을 용액에 첨가하였다. 제6 라운드 후에도, 1주 오프-레이트 세척 및 100배 과량의 가용성 표적에 의해, 농축이 여전히 관찰되었다.
4. 높은 사람 동일성을 갖는 Fab의 스크리닝
마스터플레이트를 선택 라운드 2, 3, 4, 5 및 6 (각 라운드 당 48개의 클론)으로부터 선택하였다. 원형질막 주위공간 추출물을 제조하고, SPR (Biacore 사용)에 의해 오프-레이트를 결정하였다. 모든 클론을 DNA-서열 분석하고 이로부터 아미노산 서열을 추론하였다. 사람 생식 세포 Ig V-영역과 92% 초과의 동일성을 갖는 클론은 표 9에 요약되어 있다. 이들 클론의 오프-레이트를 SPR (Biacore 사용)에 대한 원형질막 주위공간 추출물로서 측정하고, Fab 17H5의 오프-레이트와 비교하였다.
Figure pct00009
> 93%의 전체 사람 동일성 및 모 17H5 Fab의 것에 필적하는 오프-레이트를 나타내는 5개의 클론을 완전한 사람 IgG1 항체로서 재클로닝하였다. 이들 항체의 CDR, VH 및 VL 서열은 표 10, 11 및 12에 나타나 있다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
5. 높은 사람 프레임워크 잔기 동일성을 갖는 mAb의 시험관내 특성화
사람 IgG1로 재포맷된 5개의 생식 세포화 클론을 HEK 293E 세포에서 일시적 형질 감염에 의해 생산하였다. 모든 항체는 SPR에 의해 사람 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 결합에 대해 시험되었으며, 비-생식 세포화 모 클론과 유사한 결합 친화성 (17H5 보다 2~5배 낮은 KD)을 나타냈다. CDR3에서의 잔기 M100f를 트레오닌으로 변화시키면, KD는
Figure pct00013
5배 감소하였다. 생식 세포화 17H5 Ab의 결합 특성 및 특징은 표 13에 나열되어 있다.
Figure pct00014
6. 생식 세포화 mAb 39B6의 안정성
클론 39B6을 이의 결합 특성에 기초하여 리드 생식 세포화 클론으로서 선택하였다. 이러한 항체를 2개의 효과기 기능 결핍 포맷인 hIgG1N297Q 및 hIgG4S228P로 생산하였으며, 안정성 시험을 수행하였다. 안정성 시험 전에, GARP-TGF-β1에 대한 효과기 결핍 39B6 항체의 친화성을 750RU에서 GARP-TGF-β1 복합체 (표 14)로 코팅되거나 1000RU에서 항체 (표 15)로 코팅된 CM5 칩을 사용하여 BiacoreT200에 의해 시험하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
하기 설정을 사용하여 39B6 항체의 내열성을 시험하였다.
● mAb 샘플 제조: 새롭게 제조된 저장 용액 (5 mg/ml)인 1 ml의 mAb (39B6-IgG1 및 39B6-IgG4)를 2 ml의 유리 스크류 캡 유리 바이알에 넣고 5℃ 및 37℃에서 저장하였다. 바이알을 입자의 부재에 대해 즉시 점검하였다.
● PBS 음성 대조군: 1 ml의 여과된 Dulbecco의 PBS의 분취량을 PBST 음성 대조군으로서 2 ml의 유리 바이알에서 제조하였다. 바이알을 입자의 부재에 대해 즉시 점검하였다.
● PBSTw 음성 대조군: 0.02% Tween80 (Sigma)을 함유하는 1 ml의 여과된 Dulbecco의 PBS의 분취량을 PBSTw 음성 대조군으로서 2 ml의 유리 바이알에서 제조하였다. 바이알을 입자의 부재에 대해 즉시 점검하였다.
● 높은-응집 대조군: 내부 항체의 1ml 분취량을 2ml의 유리 바이알에서 풍부한 육안 응집으로 제조하였다.
● 기준 샘플: 각각의 항체에 대해, 60 μl의 mAb 분취량을 500 μl의 멸균 PCR 튜브에서 제조하고, 라벨링하고, -20℃에서 저장하였다.
다양한 온도 및 다양한 조건하에 저장된 항체 (PBS 대 PBSTw)의 안정성을 56일의 시간 경과에 따라 모니터링하였다. SPR (BiacoreTM)에 의해 측정된 표적 결합 활성에 대한 저장 효과는 도 2에 도시되어 있다. 제시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 39B6 항체 (2개의 효과기 결핍 포맷)는 37ㅍ에서 저장될 때 PBS와 PBS/Tween 둘 다에서 더 낮은 표적 결합 활성으로의 경향을 나타냈다. 대조적으로, 5℃에서 저장된 샘플은 시간 경과에 따른 표적 결합 활성에서 유의한 손실을 나타내지 않았다.
실시예 2 개선된 안정성을 갖는 GARP-TGF-β1 항체의 개발
2.1 39B6 변이체의 제조
항체 39B6에 대해 상기에서 언급된 표적 결합 활성의 감소는 VH CDR3의 95~96 위치에서 발생하는 탈아미드화와 관련되는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, 39B6의 안정성을 개선시키기 위해 추가 작업을 수행하였다.
먼저, CDR2 영역에서의 VH 쇄의 변형을 이 클론에 실시하여 G55A 치환 (39B6-A)을 도입하였다. 39B6-A의 VH 및 VL 영역을 사람 IgG4S228P 골격, 즉, 효과기 기능 결핍 사람 항체 포맷으로 재클로닝하였다.
항체 39B6-A IgG4S228P의 안정성을 개선하려는 시도에서, VH 도메인의 CDR3의 95 또는 96 위치에서 돌연변이를 갖는 5개의 변이체를 생성하였다. 이러한 변이체는 하기에 나타나 있다. 모든 변이체를 효과기 기능 결핍 포맷 IgG4S228P로 생성하였다.
Figure pct00017
항체를 여과하고, 5 mg/ml로 농축시키고, 0.02% Tween80 (Sigma)에 의해 Dulbecco의 PBS에 저장하였다. Tween80은 항체 제형을 안정화시키기 위해 필요하였다.
GARP-TGF-β1에 대한 모든 항체 (39B6-A 포함)의 친화성을 150RU에서 GARP-TGF-β1 복합체 (표 17)로 코팅되거나 200RU에서 항체 (표 18)로 코팅된 CM5 칩을 사용하여 BiacoreT200에 의해 시험하였다.
Figure pct00018
Figure pct00019
mAb의 존재하에 CD3/CD28 자극된 사람 Treg의 SMAD2 인산화의 수준을 측정함으로써 사람 Treg에 의한 활성 TGF-β의 방출을 차단하는 효능을 모든 변이체로 분석하였다. 도 3에서 도시된 바와 같이, 항체 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR은 원래의 39B6-A와 비교하여 SMAD2 인산화 검정에서 유사한 효능을 나타냈다. 변이체 39B6-AEE 및 39B6-AVE는 명백한 효능 손실을 나타냈다.
반딧불이 루시퍼라아제가 SMAD 반응 프로모터 (GAGA-luc)의 제어하에 있는 리포터 플라스미드에 의해 293T-hGARP 세포를 일시적으로 형질 감염시킨 GAGA-luc 검정을 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. 항체 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR은 원래의 39B6-A와 비교하여 루시퍼라아제 검정에서 유사한 효능을 나타냈다. 변이체 39B6-AEE 및 39B6-AVE는 명백한 효능 손실을 나타냈다 (도 4 참조).
2.2 안정성 연구
39B6-AEE를 제외하고, 하기에 기재된 바와 같은 다양한 접근법을 사용하여 변이체를 안정성에 대해 시험하였다.
다양한 안정성 연구 각각의 경우, 하기 기술 중 하나 이상을 사용하여 항체를 시험하였다:
- 육안 검사
- 크기 배제-HPLC
- SDS-PAGE (환원 및 비환원)
- SPR에 대한 표적 결합 친화성
- 단백질 농도
이들 기술에 대한 프로토콜은 하기에 기재되어 있다.
육안 검사에 대한 프로토콜
3명의 분석가에 의한 바이알의 육안 검사에 의해 샘플을 맹검하여 가시적 입자의 존재에 대해 스코어를 매겼다. 검사 전에 샘플을 30분 동안 실온에 도달시켰다. 하기 스코어링 시스템을 평가에 사용하였다.
A: 샘플이 맑고, 어떠한 입자도 보이지 않음
B: 매우 적은 입자
C: 입자의 중간 정도의 존재
D: 풍부한 입자 관찰
f: 섬유
크기-배제 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 대한 프로토콜
시스템, 컬럼 및 샘플 제조
연구 전체에 걸쳐 사용된 컬럼은 20% EtOH에 일상적으로 저장되는 Xbridge Protein BEH SEC 200A (3.5 μm, 7.8*30 mm, Waters)이었다. Xbridge Protein BEH 200A 프리-가드 컬럼을 분석용 컬럼 (3.5 μm, 7.8*3 mm, Waters)에 커플링시켰다. 각각의 사용 전에, 상기 컬럼을 적어도 5CV 동안 Dulbecco의 PBS로 평형화시키고, 시스템으로부터 제거하기 전에, 이를 5CV의 LC 등급수로 세정하였다. 모든 용매를 사용 전에 여과 및 탈기시켰다.
사용된 크로마토그래피 시스템은 4개의 펌프 (quaternary pump), 자동 주입기, 온라인 탈기 장치 및 DAD 검출기가 장착된 Agilent 1260 Infinity이었다. 상기 컬럼을 온도 조절 구획에 유지하지 않고 샘플을 실온에서 분석하였다. 검출기를 파장 280 및 214 nm로 동시에 설정하였다 (100 nm의 컷오프를 갖는 360 nm에서의 기준 파장). 채널 214 nm에서 응집 모니터링을 수행하였다. 데이터 수집을 Chemstation 소프트웨어 (Agilent)로 수행하였다.
무균 조건하에 5 mg/ml 농도로부터 25 μl의 원래의 모든 샘플을 직접 이동시켜 샘플 분석을 수행하였다. 이들을 2000　rcf에서 1분 동안 회전시키고. 20 μl를 스크류 캡의 호박색 유리 바이알에 조심스럽게 옮겼다. 각 조건에 대한 주입 부피는 25분 동안 0.7 ml PBS/분의 유속으로 5 μl (25 μg)이었다. 각각의 주입은 LC 등급수에 의한 바늘 세척을 수반하였으며, 밀봉 세척을 각 샘플의 끝에서 수행하였다.
모든 시점마다, 순서를 2x PBS 주입 (블랭크; 5 μl의 주입 부피)에 이어서 2 μl의 BEH 200 Standard Protein 혼합물 주입 (Waters) 및 공지된 응집 mAb 샘플로 개시하였다. 분석된 12개의 샘플마다, 블랭크 주입을 수행하였다. 각각의 분석 순서는 개시되었지만 역순으로 종결되었다 (공지된 응집 대조군 mAb, BEH 표준 단백질 혼합물 및 2x 블랭크).
응집 % 및 단량체 영역 %의 결정에 사용된 방법
하기 프로토콜을 사용하였다:
- 방법 ARGX-115 (기본 기술 파라미터: 탄젠트 스킴 표준 모드, 기울기 감도 2.0, 최소 피크 높이 1.7, 최소 피크 면적 1.0, 피크 폭: 0.02)에 의한 모든 크로마토그램을 통합한다.
- 모든 피크가 수득된 이전 분석과 일치하는 방식으로 통합되어 있는지 확인한다.
- 통합 결과를 PDF 및 Excel 파일로 내보낸다.
- 단량체 피크 이전에 용출되는 모든 피크의 면적을 주입의 총 면적으로 나누고 100을 곱한 값의 요약으로 총 응집 %를 계산한다.
- 또한, 단량체 영역을 총 면적으로 나누고 100을 곱하여 단량체 영역 %를 계산한다. 이러한 단량체 영역 %은 불용성 응집체가 샘플에 존재하는지를 반영한다.
- 분석용 컬럼의 성능, 효율성 및 분해능 (즉, 피크 대칭, 단량체 영역, 총 면적, 체류 시간의 재현성 등)을 모니터링하기 위해 상세한 기록을 유지한다.
SDS-PAGE에 대한 프로토콜
샘플 제조
SDS-PAGE (환원 및 비환원), SPR에 대한 결합 친화성 및 단백질 농도 평가에 대해 1 mg/ml의 중간 농도를 생성하기 위해 무균 조건하에 100　μl PBS/0.02% Tween80 (본 연구 전체에 걸쳐 PBSTw로서 약칭함) 중의 5 mg/ml로 25 μl의 본래의 모든 샘플을 이동시켜 샘플 분석을 수행하였다. 4~20% 트리스 글리신, Mini-Protean, 염료 무함유, Pre-Cast Gel을 샘플 (Biorad)의 SDS-PAGE 분석에 사용하였다. 환원제 DTT를 함유하거나 함유하지 않는 4배 농축 로딩 염료의 배치를 제조하고, -20℃로 분취하였다. 일상적으로, 1 mg/ml의 중간 희석물로부터 5 μl를 취한 다음, 5 μl의 4배 농축 로딩 염료 (+/- DDT)를 10 μl의 mQ와 함께 첨가하였다. 각 조건의 최종 양은 5 μg이었다. 샘플을 95℃에서 10분 동안 비등시킨 다음, Pre-Cast Gel에 로딩하였다 (20　μl). 200 V의 일정한 전압하에 트리-글리신 완충 시스템에서 35분 동안 전기 영동을 수행하였다. 청색 염색 (Gentaur)을 1시간 동안 수행하였다. 모든 겔을 적어도 1시간 동안 mQ 물로 탈염색하였다.
전장 Ab %의 결정
다음 설정값하에 단백질 겔을 1-채널 검출 (700 nm)로 스캔하여 다양한 밴드의 강도를 Odyssey v3.0 Li-Cor 시스템 상에서 측정하였다: 초점 오프셋 0.5 mm 및 "고" 품질. 각 분석에 대한 명도 및 콘트라스트를 5의 선형 수동 파라미터로 50%로 설정하였다.
방법은 다음과 같았다:
- 젤을 스캔하고, 젤 상의 모든 밴드가 단단한 사각형으로 둘러싸여 있는지를 확인한다.
- 모든 밴드의 원 강도를 Excel 형식으로 수득하기 위해 설정값에서 "내보내기"를 선택한다.
- 밴드의 원 강도를 레인의 총 원 강도로 나누고 100을 곱함으로써 레인에 존재하는 각 밴드의 원 강도 %를 계산한다.
- 비환원 조건의 경우, 전장 Ab %는 약 100 kD 밴드에 상응하는 밴드의 원 강도 %로서 정의된다.
- 환원 조건의 경우, 전장 Ab %는 약 25~35 kD 및 약 55 kD 밴드에 상응하는 밴드의 원 강도 %의 요약으로서 정의된다.
Biacore 3000에서 표적 결합 활성 측정에 대한 프로토콜
샘플 제조
상기에서 기재된 1 mg/ml의 모든 샘플의 중간 농도로부터, SPR 분석을 위해 추가의 1/250의 희석을 수행하여 4 μg/ml의 최종 농도를 수득하였다. 이러한 1/250 희석은 모든 조건에 대해 두 단계로 이루어졌다: a) 5 μl (1 mg/ml) + 120 μl HBS-EP (SPR 완충액) 및 b) 추가의 10배 희석 (15 μl + 135 μl HBS-EP). 각각의 항체 및 각각의 시점의 경우, -80℃ 냉동 샘플로부터 출발하여 별도의 표준 곡선을 제조하였다. 표준물의 일반적인 피팅 후 각 곡선의 기울기를 결정하기 위해 이것을 안정성 샘플과 함께 분석하였다. 이들 기울기를 사용하여 기준 샘플을 100%로 설정함으로써 안정성 샘플의 활성 백분율을 계산하였다.
Biacore에 대한 활성 %의 결정
Biacore에서 표적 결합 활성을 결정하기 위해, CM5 칩을 약 4000 RU 사람 GARP-TGF-β 복합체로 코팅하였다. 5분 간격으로 "kinject" 주사 모드 및 2회의 재생 주사 (1 mM NaCl, 2.5 mM 글리신 pH 1.5)에 의해 흐름을 30 μl/분으로 설정하였다.
방법은 다음과 같이 수행하였다:
- BIAEVAL 프로그램으로 곡선을 열고, 값 '2-1' (1: 블랭크, 2 hGARP-TGF-β1)을 선택한다.
- 플롯 오버레이를 위해 한 번에 하나의 곡선을 선택한다.
- 곡선의 재생 부분을 삭제한다.
- 주사 직전의 기준선을 선택하고, 선택 중앙값에서 Y축을 '0'으로 변형시킨다.
- 주사 후 120초에서 시작하여 155초에서 종결하는 '일반적인 피팅 (General Fit)'을 선택한다.
- 표준물을 Excel로 플롯팅하고, 각각의 항체에 대한 곡선의 기울기를 결정한다.
- 이들 값은 기준 (-20℃에 저장된 샘플)을 100%로 설정함으로써 활성 백분율으로 변환된다.
단백질 농도에 대한 프로토콜
각 조건의 단백질 함량을 측정하기 위해, NanoDrop 시스템을 사용하여 각 샘플 (2 μl)의 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시스템을 PBS로 블랭크 처리하고, 각 샘플 (1 mg/ml의 중간 희석)의 280 nm에서 흡광도를 3회 측정함으로써 단백질 결정을 수행하였다. 280 nm에서 수득된 모든 값을 계수 1.51로 나누었다. 각각의 다양한 조건 후에 PBS 블랭크 측정을 수행하였다. 모든 데이터를 각 조건에 대한 3가지 측정의 평균값으로서 보고하였다.
2.2.1 온도 안정성 연구
다양한 온도 저장 조건하에 항체의 안정성을 모니터링하기 위해, 설정을 하기와 같이 수행하였다:
· mAb 샘플 제조: 새롭게 제조된 저장 용액 (5 mg/ml)인 1 ml의 mAb (39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR)를 2 ml의 유리 스크류 캡 유리 바이알에 넣고 5℃ 및 37℃에서 저장하였다. 바이알을 입자의 부재에 대해 즉시 점검하였다.
● PBSTw 음성 대조군: 0.02% Tween80 (Sigma)을 함유하는 1 ml의 여과된 Dulbecco의 PBS의 분취량을 PBSTw 음성 대조군으로서 2 ml의 유리 바이알에서 제조하였다. 바이알을 입자의 부재에 대해 즉시 점검하였다.
● 높은-응집 대조군: 내부 항체의 1ml 분취량을 2ml의 유리 바이알에서 풍부한 육안 응집으로 제조하였다.
● 기준 샘플: 각각의 항체에 대해, 60 μl의 mAb 분취량을 500 μl의 멸균 PCR 튜브에서 제조하고, 라벨링하고, -20℃에서 저장하였다.
다양한 시점에서, mAb의 샘플을 저장 조건으로부터 취하여 다음에 대해 시험하였다:
- 육안 검사
- SE-HPLC
- SDS-PAGE (환원 및 비환원)
- SPR에 대한 표적 결합 친화성
- 단백질 농도
육안 검사
육안 검사에 대한 결과는 하기 표 19에 나타나 있다. 모든 mAb는 안정화 효과를 제공해야 하는 PBSTw 중에 존재하였다.
Figure pct00020
5℃ 조건의 경우, 56일 후 mAb에 대한 평균 스코어는 다음과 같았다:
39B6-AYE: '샘플이 맑고, 어떠한 입자도 보이지 않음'
39B6-AVE 및 39B6-ANK: '매우 적은 입자'
39B6-ANR: '입자의 중간 정도의 존재'
PBSTw 완충액은 5℃에서 '샘플이 맑고, 어떠한 입자도 보이지 않음'으로 스코어를 받았으므로, 이는 관찰된 입자가 단백질과 관련된다는 것을 나타낸다.
37℃ 저장 조건의 경우, 56일 후 mAb에 대한 평균 스코어는 다음과 같았다:
39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR: '매우 적은 입자'
39B6-AVE: '샘플이 맑고, 어떠한 입자도 보이지 않음'
PBSTw 완충액은 37℃에서 '샘플이 맑고, 어떠한 입자도 보이지 않음'으로 스코어를 받았으므로, 이는 관찰된 입자가 단백질과 관련된다는 것을 나타낸다.
SE-HPLC에 의한 분석
단백질 응집 및 단편화를 SE-HPLC에 의해 측정하였다.
SE-HPLC에 의해 측정된 mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대한 단백질 응집 결과는 하기 표 20에 요약되어 있으며, 도 5에 도시되어 있다.
Figure pct00021
5℃에서 저장한 경우, 56일 시간에 걸친 mAb 39B6-AYE, 39B6-AVE 및 39B6-ANK에 대한 응집체 수준 %에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 관찰된 응집체 수준 %는 0.9% 내지 1.1%로 낮았다. mAb 39B6-ANR에 대한 응집체 수준의 경미한 증가는 1.1% 내지 1.4%로 관찰되었다.
37℃에서, mAbs 39B6-AYE 및 39B6-ANK에 대한 응집체 수준 %에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 39B6-ANR의 경우, 0일의 1.1%에서부터 56일의 1.5%까지의 경미한 증가가 관찰되었다. 39B6-AVE의 경우, 0일의 1.0%에서부터 56일의 4.4%까지의 응집체 %의 증가가 관찰되었다.
SE-HPLC에 의해 측정된 mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대한 단편화 피크의 존재는 표 21 및 도 6에 도시되어 있다. 단편화 피크는 56일 후 37℃에서만 관찰되었기 때문에, 이들 결과만 제시되어 있다.
Figure pct00022
mAb 39B6-AVE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR의 경우에는 단편 피크의 백분율이 56일 후 0.2% 내지 0.3%이며, mAb 39B6-AYE의 경우에는 단편 피크의 백분율이 5.7%이다.
모든 mAb에 대한 단량체 피크 %의 결과는 표 22에 요약되어 있다.
Figure pct00023
SDS-PAGE
모든 항체의 분석에 대한 SDS-PAGE 결과는 표 23 및도 8에 제시되어있다.
Figure pct00024
환원 및 비 환원 조건 모두에서 5℃ 온도 조건에 대해 mAb 중 어느 것에 대해서도 분해 경향이 관찰되지 않았다.
37℃에서, 모든 mAb는 mAb 39B6-AYE를 제외하고 비환원 조건에 대해 유사한 분해 속도를 나타냈다. 이러한 mAb는 최대 28일까지 유사한 분해 속도를 나타내지만, 다른 mAb와 비교하여 28일 내지 56일에서 더 빠른 분해 속도를 나타낸다. 환원 조건의 경우, 모든 mAb는 유사한 분해 속도를 나타낸다.
Biacore에 대한 표적 결합 친화성
각각의 시점에서 기울기를 측정함으로써 샘플을 Biacore에서 이의 표적 결합 활성에 대해 시험하였다. 기준 샘플을 100% 활성으로서 설정하였다. 모든 mAb에 대한 결과는 표 24 및 도 9에 요약되어 있다.
Figure pct00025
37℃에서 저장된 mAb 샘플의 경우, 항체 39B6-AYE만이 전체 56일 기간에 걸쳐 표적 결합 활성을 유지하였다. 다른 모든 항체는 37℃에서 저장할 때 56일 기간에 걸쳐 표적 결합 활성에서 유의한 감소를 나타냈다.
단백질 농도
모든 샘플의 단백질 농도를 NanoDrop 상에서 각각의 조건에 대해 측정하였다.
표 25 및 도 10에서, 모든 mAb에 대해 측정된 단백질 농도가 나타나 있다.
Figure pct00026
온도 안정성 연구의 요약 및 결론
온도 안정성 연구에 의하면, 시험된 4개의 mAb 사이에 몇가지 유의차가 나타났다: 4.4%의 응집이 37℃에서 56일 후 mAb 39B6-AVE에 대해 SE-HPLC 상에서 관찰되었으며, 5.7%의 단편화가 mAb 39B6-AYE에 대해 관찰되었다. 그러나, mAb 39B6-AYE에 대한 이러한 단편화는 Biacore에 대한 37℃에서의 표적 결합 활성에 영향을 미치지 않았으며; 56일 후, 이것은 여전히 기준 샘플만큼 우수하였다. 한편, mAb 39B6-AVE, 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대한 보다 낮은 표적 결합 활성이 56일 후 37℃에서 명백히 관찰되었다.
2.2.2 냉동-해동 안정성 연구
냉동-해동 조건하에 항체의 안정성을 모니터링하기 위해, 설정을 하기와 같이 하였다. 1 ml 분취량의 mAb (5 mg/ml)을 -20℃에서 적어도 6시간 동안 냉동시키고 실온에서 1시간 동안 해동시켰다. 이러한 주기를 9회 반복하였다 (총 10회의 냉동-해동 주기). 샘플을 육안 검사, SE-HPLC, SDS-PAGE, Biacore에 대한 표적 결합 활성 및 단백질 농도에 의해 분석하였다. -20℃에서 저장된 기준 샘플을 모든 분석에 병행하여 사용하였다. mAb 39B6-ANR 및 39B6-ANK는 가능한 탈아미드화 부위를 갖고 있기 때문에, 이들에 대해 육안 검사로만 분석을 실시하였다.
육안 검사
냉동-해동 안정성 연구에서의 육안 검사에 대한 결과는 표 26에 나타나 있다. 모든 mAb는 안정화 효과를 제공해야 하는 PBSTw 중에 존재하였다.
Figure pct00027
mAb에 대한 평균 스코어는 다음과 같았다:
39B6-AVE, 39B6-AYE 및 39B-ANK: '매우 적은 입자'; 및
39B6-ANR: '샘플이 맑고, 어떠한 입자도 보이지 않음'
PBSTw 완충액은 2명의 사람에 의해 '매우 적은 입자'로 스코어를 받았고, 그러므로, 39B6-AVE, 39B6-AYE 및 39B-ANK 샘플에서 보이는 입자는 단백질과 관련될 수 없다. 모든 mAb는 10회의 냉동-해동 주기 후에도 변화가 없는 것으로 결론지을 수 있다.
SE-HPLC에 의한 분석
단백질 응집 및 단편화를 SE-HPLC에 의해 측정하였다.
mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE의 냉동-해동 안정성 연구에 대한 단백질 응집 결과는 표 27에 요약되어 있다.
Figure pct00028
기준 샘플과 비교하여, 10회의 냉동-해동 주기 후 mAb에 대한 응집체 수준 백분율의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
다양한 모든 주입에 대한 단량체 피크의 면적을 또한 조사하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 단량체 영역 % 결과는 표 28에 요약되어 있다.
Figure pct00029
기준 샘플과 비교하여, 10회의 냉동-해동 주기 후 2개의 mAb에 대한 단량체 영역 %의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
SDS-PAGE에 의한 분석
냉동-해동 샘플을 비환원 및 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 이의 완전성에 대해 분석하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 결과는 표 29 및 도 11에 나타나 있다.
Figure pct00030
10회의 냉동-해동 주기 후 2개의 mAb에 대한 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
Biacore에 의한 표적 결합의 분석
10회의 냉동-해동 주기 후 기울기를 측정함으로써 샘플을 Biacore에서 이의 표적 결합 활성에 대해 시험하였다. 기준 샘플을 100% 활성으로서 설정하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE 모두에 대한 결과는 도 12에 도시되어 있다.
결과는 10회의 냉동-해동 주기 후 표적 결합 활성의 어떠한 변화도 관찰되지 않는다는 것을 입증한다.
단백질 농도의 분석
냉동-해동 샘플의 단백질 농도를 NanoDrop 상에서 측정하였다.
표 30에서, 10회의 냉동-해동 주기 후 mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 측정된 단백질 농도가 나타나 있다. 또한, 도 13은 2개의 mAb에 대한 이들 결과를 도시한 것이다.
Figure pct00031
결론
냉동-해동 안정성 연구는 시험된 mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대해 어떠한 유의차도 나타내지 않았다.
2.2.3 열 안정성 연구
용융 곡선을 분석하기 위해, mAb를 하기 식에 따라 가열하였다. PCR 장치에서 열 주기의 완료 후, 샘플을 Biacore에 대한 친화성에 대해 시험하였다.
사용된 프로토콜은 다음과 같았다:
1) 각각의 mAb에 대한 1 ml의 분취량을 연구 시작시 -20℃에서 유리 바이알에 저장하였다.
2) 1주일의 저장 후, 이들을 1회 해동하였다.
3) mAb를 평소와 같이 1 mg/ml로 희석한 다음, 100 μg/ml로 추가로 희석하였다 (10x 희석: 200 μl + 1800 μl PBSTw).
4) 희석된 mAb를 PCR 플레이트 (50 μl/웰)에 분취하였다.
5) 병행하여 분석되는 기준물로서 충분한 샘플 및 추가 샘플을 5℃에서 유지한다.
6) 하기에 주어진 온도에서 노출된 PCR 장치에서의 1시간
7) PCR 장치에서 25℃에서 2시간
8) PCR 장치에서 4℃에서
9) 분석을 위한 샘플 및 기준물을 4 μg/ml (25배 희석: 168 μl의 Biacore 완충액 + 7 μl의 샘플)로 제조한다.
구배 PCR 장치에서 하기 프로그램을 실행한다:
Figure pct00032
Biacore 분석에 대한 프로토콜:
- 약 4000 RU 사람 GARP-TGF-β 복합체로 코팅된 동일한 CM5 칩을 사용하였다.
- BIAEvaluation 프로그램으로 곡선을 열고, 값 '2-1' (1: 블랭크, 2 hGARP-TGF-β)을 선택한다.
- 플롯 오버레이를 위해 한 번에 하나의 곡선을 선택한다.
- 곡선의 재생 부분을 삭제한다.
- 주사 직전의 기준선을 선택하고, 선택 중앙값에서 Y축을 '0'으로 변형시킨다.
- 주사 후 120초에서 시작하여 155초에서 종결하는 '일반적인 피팅'을 선택한다.
- IC50의 계산의 경우: 5℃ 기준물에 대한 기울기는 100%에서 평평하다. 다른 온도 (X축)의 백분율 (Y축)을 계산할 수 있다.
4개의 mAb의 내열성을 측정하였으며, 그 결과는 도 14에 요약되어 있다. 용융 온도를, 항체의 50%가 여전히 기능성인 온도로서 계산하였다. 5℃에서 유지된 기준 샘플을 100%의 활성으로 설정하였다. 상기 용융 온도는 표 31에 나타나 있다.
Figure pct00033
mAb 39B6-ANK 및 39B6-ANR은 다음과 같은 최대 용융 온도를 나타냈다: 각각 69.13℃ 및 68.55℃. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE도 또한 각각 우수한 용융 온도 66.99℃ 및 66.53℃를 제공하였다. 모든 mAb의 모든 용융 온도는 높은 것으로 간주될 수 있다.
열 안정성 연구의 결론
4개의 mAb는 우수한 내열성을 입증하였다. 용융 온도는 이전 안정성 연구에서의 원래의 39B6-A mAb의 66.8℃에 필적하였다.
2.2.4 회전 안정성 연구
회전 안정성 연구의 경우, 설정을 다음과 같이 하였다. 각각의 mAb에 대한 1 ml의 분취량을 연구 시작시 -20℃에서 유리 바이알에 저장하였다. 1주일의 저장 후, 분취량을 1회 해동하고 실온에서 15 rpm으로 머리 위로 회전시켰다.
샘플을 명시된 시점에서 입자의 존재에 대해 스코어링하였다:
- 시간: 0, 3, 6, 24, 30, 48, 54, 72 및 96
또한 샘플을 SE-HPLC, SDS-PAGE, Biacore에 대한 표적 결합 활성 및 단백질 농도에 의해 96시간 후 분석하였다. -20℃에서 저장된 기준 샘플을 모든 분석에 병행하여 사용하였다. mAb 39B6-ANR 및 39B6-ANK는 여전히 가능한 탈아미드화 부위를 갖고 있기 때문에, 이들을 육안 검사로만 평가하였다.
육안 검사
회전 안정성 연구에서의 육안 검사에 대한 결과는 표 32에 나타나 있다. 모든 mAb는 안정화 효과를 제공해야 하는 PBSTw 중에 존재한다.
Figure pct00034
모든 mAb는 '매우 적은 입자'의 평균 스코어를 가지므로, 이들은 96시간의 회전 후에도 비교적 영향을 받지 않는다. PBSTw 완충액은 임의의 시험된 실험 조건에서 어떠한 입자도 함유하지 않았다. 이는 관찰된 '매우 적은 입자'가 항체 샘플에서 단백질과 관련된다는 것을 나타낸다.
SE-HPLC에 의한 분석
단백질 응집 및 단편화를 SE-HPLC에 의해 측정하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE의 회전 안정성 연구에 대한 단백질 응집 결과는 표 33에 나타나 있다.
Figure pct00035
기준 샘플과 비교하여, 회전 응력 후 mAb에 대한 응집체 수준 %의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
다양한 모든 주입에 대한 단량체 피크의 면적을 또한 조사하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 단량체 영역 % 결과는 표 34에 나타나 있다.
Figure pct00036
기준 샘플과 비교하여, 96시간의 회전 후 mAb에 대한 단량체 영역 %의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
2개의 항체의 경우, 기준 샘플과 비교하여 96시간의 회전 후 SE-HPLC 프로파일의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
SDS-PAGE에 의한 분석
회전 샘플을 비환원 및 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 이의 완전성에 대해 분석하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 결과는 표 35에 요약되어 있다.
Figure pct00037
96시간의 회전 후 2개의 mAb에 대한 SDS-PAGE 겔은 도 15에서 확인될 수 있다.
96시간의 회전 후 항체에 대한 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
Biacore에서 표적 결합에 대한 분석
96시간의 회전 후 기울기를 측정함으로써 샘플을 Biacore에서 이의 표적 결합 활성에 대해 시험하였다. 기준 샘플을 100% 활성으로서 설정하였다. mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE 모두에 대한 결과는 도 16에 도시되어 있다.
단백질 농도에 대한 분석
회전 샘플의 단백질 농도를 NanoDrop 상에서 측정하였다.
표 36에서, 96시간의 회전 후 mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에 대한 측정된 단백질 농도가 나타나 있다. 또한, 도 17은 2개의 mAb에 대한 이들 결과를 도시한 것이다.
Figure pct00038
96시간의 회전 후 2개의 mAb에 대한 어떠한 단백질 손실도 관찰되지 않았다.
회전 안정성 연구의 결론
회전 안정성 연구는 시험된 mAb 39B6-AVE와 39B6-AYE 사이에 어떠한 유의차도 나타내지 않았다.
2.2.5 펩타이드 맵핑에 의한 일차 서열 분석
단백질 (펩타이드) 수준에서 변형 (탈아미드화, 이성질체화 및 산화)을 확인하기 위해 트립신 소화성 펩타이드 맵핑 RP-HPLC-UV-MS 방법을 사용하여 온도, 냉동-해동 및 회전 안정성 연구로부터의 샘플을 분석하였다.
95~96 위치에서의 중쇄의 CDR3 (아미노산 NE)의 탈아미드화는 N95 위치의 돌연변이에 의해 mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에서 공학에 의해 생성되었다. 이러한 탈아미드화 부위는 여전히 mAb 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 존재하며, 온도 안정성 연구 및 냉동-해동 및 회전 안정성 연구에서 5℃와 37℃ 둘 다에서 28일 후에 유의한 탈아미드화/이성질체화를 검출하였다. 탈아미드화는 N95의 다운스트림에 벌크한 양으로 하전된 잔기의 도입에 의해 방지될 수 없다는 결론을 내렸다.
중쇄의 CDR3의 100f 위치에서, 높은 결합 친화성에 필수적인 메티오닌이 존재한다. 온도, 냉동-해동 및 회전 안정성 연구에 의해, M100f의 산화는 mAb 39B6-AYE 및 39B6-ANK에서 발생하지 않는 반면, mAb 39B6-AVE 및 39B6-ANR에 대한 산화는 여전히 관찰되는 것으로 입증되었다. 이는 95 및 96 위치에서의 아미노산이 다운스트림 메티오닌의 산화로의 민감성에 영향을 준다는 것을 입증한다. 표 37은 트립신 소화에 의해 생성 중쇄 CDR3을 덮는 펩타이드의 산화 및 탈아미드화 수준의 개요를 나타낸다.
Figure pct00039
N95의 탈아미드화 및 이성질체화의 상대량, 및 37℃에서 저장된 변이체의 상대적인 결합 활성은 도 18에 도시되어 있다. 또한, 원래의 39B6-A는 도면에 표시되어 있다 (39B6-ANE로 라벨링됨). N95는 mAb 39B6-AVE 및 39B6-AYE에서 돌연변이되었기 때문에, 탈아미드화 및 이성질체화 수준은 0이므로 포함되지 않는다. N95의 탈아미드화와 mAb 39B6-ANK 및 39B6-ANR에 대해 관찰된 낮은 표적 결합 활성 사이의 상관 관계는, N95 탈아미드화가 mAb의 이의 표적에 대한 결합에 부정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다.
결론
GARP-TGF-β1 항체 변이체 39B6-AYE는 하기와 같은 이유로 임상 개발을 위해 특히 우수한 GARP-TGF-β1 항체이다:
- 이의 표적인 GARP-TGF-β1 복합체에 대한 높은 친화성 결합을 유지하고;
- SMAD2 인산화 검정에서 우수한 효능을 나타내고;
- CDR3에서 탈아미드화 또는 이성질체화를 겪지 않고;
- CDR3에서 산화를 겪지 않고;
- 높은 사람 상동성 (95%)을 나타내고;
- 다양한 안정성 검정에 의해 측정된 바와 같이, 39B6-A와 비교하여 개선된 안정성을 나타낸다.
39B6-AYE에 대한 CDR 및 가변 도메인 서열은 하기 표 38 및 39에 나타나 있다. 전장 중쇄 및 경쇄 서열은 표 40에 나타나 있다. VH 및 VL 도메인 및 전장 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표 41에 나타나 있다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
실시예 3 39B6-AYE (ARGX-115)의 배치 시험
ARGX-115의 파일럿 약물 물질 배치를 3개월 기간에 걸쳐 안정성에 대해 시험하였다. 파일럿 약물 물질 배치의 시험 샘플을 -70℃의 의도된 저장 조건, +5℃의 가속 저장 조건 및 +25℃의 스트레스 저장 조건에서 저장하였다. 파일럿 약물 물질은 제형으로 표시되어 있다: pH 6.0의 10 mM 히스티딘/히스티딘 하이드로클로라이드, 200 mM 수크로오스, 40 mM 아르기닌, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, 및 20.0 + 2.0 mg/ml의 단백질 농도.
ARGX-115 파일럿 약물 물질 배치는 -70℃의 의도된 저장 조건에서 저장될 때 3개월 동안 안정한 것으로 확인되었다. SPR 결합 활성은 또한 안정성의 척도로서 결정되었다. 결합 활성은 -70℃에서 유지된 기준 샘플의 결합 활성의 백분율로 표현되었다.
결과는 하기 표 42에 나타나 있다.
Figure pct00046
이들 결과는 ARGX-115가 장기 저장 기간 동안 안정적이다는 것을 확인한다.
실시예 4 GARP-TGF-β 복합체에 대한 ARGX-115 결합의 특성화
4.1 성숙 TGF-β는 ARGX-115 결합에 필수적이다.
사실상, GARP-TGF-β 복합체 (잠재적 TGF-β와 GARP의 복합체)는 GARP와 잠재적 TGFβ 사이의 공유 시스테인 상호 작용 (이황화 브릿지)을 갖는 소포체에서 형성된다. 이러한 복합체는 세포 표면 상에 표시된다. 시험관내에서, GARP-TGF-β 복합체는 재조합 사람 GARP 및 재조합 사람 잠재적 TGF-β (C33S)-3xstrep-tag로부터 형성될 수 있다. 잠재적 TGF-β의 C33S 돌연변이체 형태는 본래의 복합체에 존재하는 것과 같이 GARP (또는 잠재적 TGF-β 결합 단백질 (Latent TGF-β Binding Protein: LTBP))와의 공유 상호 작용을 형성하지 않는다.
시험관내에서 형성된 재조합 GARP와 재조합 잠재적 TGFβ (C33S)의 복합체에 대한 ARGX-115 결합을 입증하기 위해, 재조합 GARP를 ELISA 플레이트 (4℃에서 1 μg/mL 사람 GARP O/N)에 코팅하고, 차단제 (카세인-PBS)로 차단시키고, 코팅된 GARP에 의해 잠재적 TGF-β (5 μg/mL, RT에서 1시간)를 포획하였다. ARGX-115 및 이소형 대조군 항체 (1 μg/mL, RT에서 1시간)를 복합체에 결합하도록 하고, HRP-컨쥬게이트된 항-사람 IgG로 검출하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, ARGX-115는 GARP-잠재적 TGF-β (C33S) 복합체에 결합한 반면, 이소형 대조군은 그렇지 않았다.
검정은 또한 다른 방식으로 작동하는 것으로 밝혀졌다. ELISA 플레이트를 ARGX-115 또는 이소형 대조군 항체 (4oC에서 1 μg/mL ON)로 코팅하고, 차단제 (카세인-PBS)로 차단하였다. 코팅된 ARGX-115 항체로 재조합 GARP (5 μg/mL)를 포획하고, 플레이트를 세척하고, 재조합 잠재적 TGF-β (C33S)-3xstrep-tag (5 μg/mL)를 포획하고, 스트렙타비딘-HRP로 검출하였다. HRP 활성은 ARGX-115의 존재하에서만 검출되었으며, 이소형 대조군으로 코팅된 플레이트의 웰에서는 검출되지 않았다.
GARP와 TGF-β의 잠재성 관련 펩타이드 (LAP)의 복합체에 대한 ARGX-115의 결합을 시험하기 위해, 재조합 GARP와 재조합 LAP 사이의 복합체를 형성하였다. ELISA 플레이트를 재조합 GARP (1 μg/mL, 4oC에서 O/N)로 코팅하고, 차단제 (카세인-PBS)로 차단하고, 코팅된 재조합 GARP 상에서 LAP (5 μg/mL)를 포집하였다. LAP 결합은 항-LAP-HRP로 검출되었다. 항-LAP-HRP의 결합은 GARP-LAP 복합체가 시험관내에서 형성된다는 것을 입증한다. 그러나, ARGX-115는 GARP-LAP 복합체에 어떠한 결합도 나타내지 않았다. 또한, ELISA 플레이트를 ARGX-115 (1 μg/mL, 4oC에서 ON)로 코팅한 경우, 재조합 GARP (5 μg/mL)에 이어서 LAP (5 μg/mL)를 첨가하였으며, 항-LAP-HRP의 어떠한 결합도 측정되지 않았다. 이들 결과는 성숙 TGF-β가 GARP-TGF-β 복합체에 대한 ARGX-115 결합에 필요하다는 것을 확인한다.
4.2 ARGX-115의 중화 활성에 대한 GARP와 hTGF-β의 복합체에서의 돌연변이의 영향
인테그린 αvβ6 (293Tcl.ITGB6)을 안정적으로 발현하는 293T 세포를 다음 3개의 플라스미드의 혼합물 (플라스미드 혼합물)로 일시적으로 형질 감염시켰다: (i) CAGA-luc 리포터 플라스미드; (ii) 사람 GARP (pEF-BOS-푸로-hGARP); 및 (iii) WT 사람 TGF-β 또는 돌연변이체 TGF-β (pDisplay). 인테그린 αvβ6은 2개의 TGF-β 활성화 인테그린 중 하나이다. 293Tcl.ITGB6 세포를 반-컨플루언트 (semi-confluent) 75 cm2 플라스크로부터 분리 및 수거하고, 계수하고, 1E+06개의 세포/mL로 희석하고, 에펜도르프 튜브 당 1mL를 분배 하였다. 형질 감염을 위해 250 μl의 플라스미드 혼합물을 각 튜브에 첨가하였다. 형질 감염 직후, 형질 감염된 세포를, 다양한 시험 mAb (100 μl/mL의 ARGX-115, LHG10.6, 1D11 및 MHG-8)를 함유하는, 웰 당 50 μl (4E+04개의 세포)의 96웰 광학 플레이트에 분배하였다. 1D11은 TGF-β 이소형-1, -2 및 -3의 활성 형태에 대한 mAb이다. MHG-8 및 LHG10.6은 국제공개공보 WO 2015/015003 및 WO 2016/125017에 기재되어 있다. 37oC에서 24시간 동안의 인큐베이션 처리 후, 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 돌연변이체 TGF-β의 형질 감염에 의해 수득된 값을 WT-TGF-β에 대해 수득된 값의 백분율로 표현하였다. 그 결과는 도 20에 도시되어 있다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, R58A 치환을 포함하는 TGF-β 돌연변이체 및 K338E 치환을 포함하는 TGF-β 돌연변이체에 대해 측정된 ARGX-115의 중화 활성은 유의하게 감소하였다. 이는 GARP-TGF-β 복합체에서의 이들 2개의 잔기가 ARGX-115의 중화 활성에 특히 중요하다는 것을 나타낸다.
<110> argenx BVBA <120> GARP-TGF-beta ANTIBODIES <130> N415743WO <140> PCT/EP2018/062251 <141> 2018-05-11 <150> GB1707561.5 <151> 2017-05-11 <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Llama glama <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Glu Trp Glu Thr Val Val Val Gly Asp Leu Met Tyr Glu 100 105 110 Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Llama glama <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 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Cys Cys Cys Val Arg Arg Gln Lys Phe 645 650 655 Asn Gln Gln Tyr Lys Ala 660 <210> 34 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn 165 170 175 Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser 180 185 190 Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu 195 200 205 Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser 210 215 220 Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr 225 230 235 240 Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro 245 250 255 Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln 260 265 270 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser 275 280 285 Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn 305 310 315 320 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr 325 330 335 Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala 340 345 350 Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val 370 375 380 Arg Ser Cys Lys Cys Ser 385 390 <210> 35 <211> 249 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg 1 5 10 15 Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val 35 40 45 Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr 65 70 75 80 Arg Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys 85 90 95 Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg 100 105 110 Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu 115 120 125 Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys 130 135 140 Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg 165 170 175 Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala 180 185 190 His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn 195 200 205 Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met 210 215 220 Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln 225 230 235 240 His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg 245 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210> 41 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro 20 25 30 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 35 40 45 Cys Pro 50 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 46 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Arg Lys 1 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 1 5

Claims (38)

  1. 사람 GARP와 TGF-β1의 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하고, 여기서,
    VH CDR3이 YEWETVVVGDLMYEYEY (서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하고,
    VH CDR2가 RIDPEDAGTKYAQKFQG (서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하고,
    VH CDR1이 SYYID (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서,
    VL CDR3이 QQYASVPVT (서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하고,
    VL CDR2가 GASRLKT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하고,
    VL CDR1이 QASQSISSYLA (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인 (VH)이 높은 사람 상동성을 나타내는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인 (VL)이 높은 사람 상동성을 나타내는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인 (VH)이 낙타 유래의 VH 도메인의 사람화, 생식 세포화 또는 친화성 변이체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인 (VL)이 낙타 유래의 VL 도메인의 사람화, 생식 세포화 또는 친화성 변이체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인 (VH)이 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인 (VL)이 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인 (VH)이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인 (VL)이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 IgG의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 사람 IgG가 IgG1인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 사람 IgG가 IgG4인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 사람 IgG4가 상기 CH3 도메인에서 치환 S228P를 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 16의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 서열 번호 17의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 시노몰구스 (cynomolgus) 기원의 GARP-TGF-β 복합체와 교차 반응하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 GARP와 TGF-β1의 복합체에 높은 친화성으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Fab로서 시험될 때의 상기 VH 도메인 및 VL 도메인이 5 × 10-4 s-1 미만의 GARP와 TGF-β1의 복합체에 대한 오프-레이트 (off-rate) (k오프)를 나타내는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Fab로서 시험될 때의 상기 VH 도메인 및 VL 도메인이 1 × 10-6 s-1 내지 5 × 10-4 s-1 범위의 GARP와 TGF-β1의 복합체에 대한 오프-레이트 (k오프)를 나타내는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, mAb로서 시험될 때의 상기 VH 도메인 및 VL 도메인이 1.7 × 10-9 미만의 KD를 나타내는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 T-세포로부터 활성 TGF-β의 방출을 차단하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제22항에 있어서, 서열 번호 18의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제24항에 있어서, 서열 번호 19의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  27. 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 항체, 이의 항원 결합 단편, 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인의 발현을 허용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  28. 제27항의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템.
  29. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에 제28항의 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 배양하고, 상기 발현된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 것을 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
  30. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제30항에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 TGF-β 관련 장애를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 TGF-β 관련 장애가 염증성 질환, 만성 감염, 암, 섬유증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 TGF-β 관련 장애가 암인, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또 다른 요법과 조합하여 투여되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 면역 치료제, 임의로 면역 자극 항체 또는 종양 백신과 조합하여 투여되는, 방법.
  37. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제30항에 따른 약제학적 조성물.
  38. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
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