UA103483C2 - Спосіб індукування загибелі клітин - Google Patents

Abstract

Винахід належить до медицини і стосується способу індукування загибелі клітин, який передбачає інгібування адаптивної реакції теплового шоку в клітині та наступне індукування в ній реакції теплового шоку, де інгібітором реакції теплового шоку є аміноакридин або карбазол.

Description

Перехресні посилання на попередні заявки

ІО001) Ця заявка грунтується на попередніх патентних заявках США Моеб1/054,785, що була подана травня 2008 р., Моб1/102,913, що була подана 6 жовтня 2008 р., та Моб1/179,674, що була подана 19 травня 2009 р., зміст яких повністю включений сюди шляхом посилань.

Галузь техніки

І0002| Винахід стосується способу індукування загибелі клітин індукуванням реакції теплового шоку в клітині в комбінації з інгібуванням адаптивної реакції теплового шоку.

Попередній рівень техніки

І0003| Рак є гострою проблемою охорони здоров'я людей. Він спричиняє приблизно чверть всіх смертей в США і є головною причиною загибелі чоловіків і жінок старше за 85 років. Імовірність виникнення раку протягом життя дорівнює 4695 у чоловіків і 3895 у жінок. Більшість засобів антибластомної терапії має побічні ефекти, включаючи нудоту, блювання, втрату волосся, лихоманку і риск інфікування. Хіміотерапія і радіаційна терапія швидко призводять до запалення слизових оболонок порожнини рота і шлунково-кишкового тракту у пацієнтів, й ці ефекти можуть бути критеріями обмеження доз токсичних препаратів в деяких процесах лікування.

І0004) Ракові клітини виявляють високий рівень адаптивної реакції теплового шоку. Ця реакція є адаптивним механізмом, який застосовують всі живі організми, які мають клітинну структуру, для виживання в умовах так званого протеотоксичного стресу, тобто фактору, що призводить до накопичення погано структурованих протеїнів, котрі схильні до агрегатування, і наступної загибелі клітин внаслідок повної денатурації протеїнів, що викликана таким агрегатуванням. Клітини можуть активізувати зазначений захисний механізм, індукуючи синтез комплементарних протеїнів (шаперонів), які відомі як протеїни теплового шоку (далі в абревіатурі НОР від англійських слів "пеаї 5поск ргоївіп5"). 0005) Життєздатність ракових клітин може бути залежною від реакції теплового шоку, оскільки вони мають більш високий рівень порушень структури протеїнів. Проте ефективність способів термічної терапії раку обмежена індукуванням адаптивної реакції теплового шоку, яка суттєво зменшує чутливість ракових клітин до терапевтичного втручання і можливість застосування термічної терапії й інших способів модулювання теплового шоку. Відповідно, потрібне удосконалення методів індукування загибелі клітин.

Короткий виклад суті винаходу

ЇО00О6| Тут запропонований спосіб індукування загибелі клітин, що складається з інгібування адаптивної реакції теплового шоку в клітині та наступного індукування в ній реакції теплового шоку (далі в абревіатурі Н5Е від англійських слів "пеаї 5посК гезропзе"). Така реакція може бути індукована уведенням індуктора теплового шоку в клітину. Цим індуктором може бути гелданаміцин (далі

ОМАС17 або 17-ОМАС або ОМ), інгібітор протеасом, арсеніт або етанол. Реакція теплового шоку може бути також індукована шляхом підвищення внутрішньої температури клітини за допомогою нагрівального засобу. Температура може бути підвищена до щонайменше 39-60 С, зокрема застосуванням інфрачервоного випромінювання. Це випромінювання може мати довжину хвиль в інтервалі 5-15 мкМ. Температура може бути також підвищена джерелом тепла, яке вибране з групи, яка складається з електролюмінесцентного пристрою, лазерного діоду, емісійного лазеру з вертикальною резонаторною поверхнею, світлодіоду та резистивної лампи накалювання. Інгібітором реакції теплового шоку може бути 9-аміноакридин (далі 9АА) або карбазол (далі С7 або СКВ2 або

СВІ з номером).

ЇО007| Клітиною може бути ракова клітина, причому рак може бути вибраний з групи, яка складається з метастатичного раку грудей, раку сечового міхура, карциноми легень, раку стравоходу, базаліоми, злоякісної меланоми, пухлини ока і раку голови та шиї. Другій спосіб може включати індукування реакції теплового шоку в клітині. Для цього застосовують антибластомний агент.

Короткий опис креслень

ІО0О8) Фіг. 1 показує, що акрихін (ОС) та 9-аміноакридин (9ЗАА) перешкоджають синтезу протеїнів теплового шоку Н5ОР70 в клітині, що оброблена інгібіторами протеасом.

ІО009| Фіг. 2 показує, що ОС та 9АА інгібують транскрипцію гена НОР7О у відповідь на інгібітори протеасом.

ІОО10) Фіг. З показує, що синтез НЗР70О, індукований ОМАС17, є чутливим до дії ОС та 9АА.

ІЇОО11| Фіг. 4 показує, що ОС та 9АА пригнічують транскрипцію гена Н5Р7ОА1/В', індуковану рМАСІ17 та інгібітором протеасом МО132. 00121 Фіг. 5 показує токсичну дію ОМАСІ17 в комбінації із ОС на клітини Неї! а.

ІОО13) фіг. 6 показує токсичну дію теплового шоку (43 "С, 30 хвилин) в комбінації із ОС. 00141) Фіг. 7 показує, що чутливість ракових (тобто не нормальних) клітин до нагрівання зростає під дією ОС та С (сполука СВІ 0137).

ІОО0О15) Фіг. 8 показує, що опосередковане 5І-РНК зменшення ЕАСТ-нуклеарного комплексу, З5РТ1 та ЕАСсТ-кінази СКІЇ підвищує чутливість клітин до нагрівання.

0016) Фіг. 9 показує, що акрихін та ЗАА перешкоджають синтезу НЗР7О в клітинах, оброблених інгібіторами протеасом. Фіг. ЗА показує результати імуноблоттінгу протеїнового екстракту із клітин

Нега, що були оброблені протягом 5 годин інгібітором протеасом МО132 (МО, 5 мкМ) в комбінації із протималярійними препаратами "еметин" (далі ЕМ, 1 мкМ), "хлорохін" (далі СО), 20 мкМ), "хінін" (далі

О, 20 мкМ) або "акрихін" (ОС, 20 мкМ), з застосуванням антитіла анти-НЗР7О. Смужка 1 містить екстракт з необроблених клітин Неї а. Експресія пірину була досліджена як перевірка навантаження (Г.с.). Фіг. 9В показує протеїнові екстракти з клітин НеГа, оброблені протягом 5 годин інгібітором протеасом МО132 (5 мкМ) як таким або в комбінації із 20 мкМ ОС або 9АА, після імуноблоттінгу з застосуванням антитіла анти-НеР70. Негативні контролі включають необроблені клітини Неї! а (смужка 1) ї клітини, оброблені ОС або 9АА за відсутності МО132 (смужки 6 та 7). Пірин був досліджений як перевірка навантаження (І..с.). Фіг. 9С показує, що еметин (але не ОС або 9АА) інгібує в цілому синтез протеїнів. З55-мічені протеїни з необроблених клітин НеГа (смужка 1 зліва) і клітин, оброблених ОС (20 мкМ), 9АА (20 мкМ), або ЕМ (1 мкм), були досліджені методами електрофорезу та ауторадіографії.

Фіг. 90 показує, що аміноакридини не погіршують інгібування протеасом агентом МО132, як це показують результати тестування активності протеасом іп міго з використанням екстрактів з клітин

Нега, оброблених протягом 4 годин зазначеною комбінацією інгібітору протеасом МО132 (5 мкм), ОС (20 мкМ) і 9АА (20 мкМ). Активність протеасом показана відносно до її прийнятого за 100 95 значення в необроблених клітинах. Фіг. 9Е показує, що ОС інгібує в клітинах Не! а активацію транскрипції

Н5ЗР7ОА1 інгібіторами протеасом. 10 мкг від сумарної РНК, виділеної з необроблених клітин Неї а (смужка 1), та клітин, оброблених протягом 5 годин 0,1 мкМ бортезомібу (далі В) або 5 мкМ Мо132 (МО), узятого окремо чи в комбінації із 20 мкМ ОС були досліджені шляхом Нозерн-блоттінгу зі зразками НЗР7ОАТ (верхня панель) та САРОН (нижня панель) СЗАРОН був використаний для перевірки специфічної активності ОС як інгібітору та навантаження РНК. Фіг. 9Е показує, що аміноакридини не перешкоджають експресії гена металотіонеїну під дією 2псСі2. Клітин Неї а були необроблені (смужка 1 зліва) або оброблені протягом 5 годин 200 мкМ 7псІі2 (2п) як таким або в комбінації із 20 мкМ ОС або 9АА. 10 мкг від загальної маси РНК були досліджені шляхом Нозерн- блоттінгу зі зразками металотіонеїну (далі МТ), НЕР7ОАТ та САРОН. 0017) Фіг. 10 показує, що індукування реакції теплового шоку НОК із застосуванням МО132,

ОМАСІ17 або теплового шоку як такого є чутливим до аміноакридинів. Фіг. 10А показує результати імуноблоттінгу протеїнового екстракту (10 мкг) клітин НеГа, оброблених протягом 5 годин 5 мкм

МО132 (МО) або 1 мкм 17-ОМАС (ОМ) як таким або в комбінації із 20 мкМ ОС або 9АА, із застосуванням антитіла анти-НОР7О. Смужка 1 містить екстракт з необроблених клітин Неїа. Для перевірки навантаження протеїнів (І..с.) була досліджена експресія К18. Фіг. 108 показує, що ОС або 9АА пригнічують транскрипцію гена НОР7ОА1, індуковану 17-ОМАС або МОо132. Нозерн-гібридизація

РНК з необроблених клітин Неї! а (смужка 1) й таких же клітин, оброблених протягом 5 годин 1 мкМ 17-

ОМА (ОМ) або 5 мкм МоО132 (МО) окремо або в комбінації із 20 мкМ ОС або 9АА. САРОН мРНК був використаний для перевірки специфічності інгібітору та навантаження РНК. Фіг. 10С показує, що ОС та 9АА не змінюють акумулювання генів мРНК, які не були індуковані під дією 17-ОМАС, як це показала

Нозерн-гібридизація РНК з клітин Неї а, оброблених протягом 5 годин 1 мкМ 17-ЮОМАО (СМ) окремо або в комбінації із 20 мкМ ОС або 9АА. САРОН, рбокеїА і СЕРОА4 є генами, експресія яких не була придушена дією 17-ОМАС. НОР7ОА1 був включений як позитивний контроль для генів, що індукує 17-

ОМА. Фіг.100О0 показує, що ОС пригнічує НОЕ1-специфічну експресію генератора ЕСЕР, що індукована протеотоксичним стресом (тут і далі абревіатура Н5НЕ1 від англійського терміну "пеаї 5поскК

Тасіог" позначає "фактор теплового шоку"). Клітини Нега, які є носіями комплексу генераторів Н5Е1-

ЕСЕР, були необроблені (смужка зліва), або оброблені 0,1 мкМ бортезомібу (82), 1 мкМ 17-ОМАа (ОМ), або протягом 1 години тепловим шоком (Н5) при 43 "С як таким чи в комбінації із 20 мкМ ОС.

Експресію ЕСЕР після 8 годин витримки досліджували флуоресцентним мікроскопом.

ІОО18) Фіг. 11 показує, що аміноакридини пригнічують активацію Н5ЕЇ1 і його транслокацію в ядра.

Фіг. 11А показує, що дія на клітини Не а МОе132, 17-ОМАС або теплового шоку індукує активність зв'язування НОТ ДНК. Цитоплазматичні екстракти із клітин Неіа були досліджені тестом електрофоретичної рухливості на зсув (англійська абревіатура "ЕМ5А"), причому ці клітини були або необроблені (смужка зліва), або оброблені 5 мкМ Мо132 (Мо) чи 1 мкМ 17-ОМАС (СМ) протягом 4 годин, або піддані тепловому шоку (43 "С) протягом 1 години. Утворення комплексу між НЗЕ1 та 32рР- міченим зразком олігонуклеотиду, що має сайт для зв'язування Н5Е1, пригнічували 50х надлишком того ж самого, але не поміченого олігонуклеотиду, що має сайт для зв'язування МЕКВ (смужка 4).

Специфічність винайденого комплексу була надалі підтверджена його супер-зсувом в присутності антитіла анти-Н5Е1 (смужка 7). Фіг. 118 показує, що ОС не знижує активність зв'язування Н5Е1 ДНК в ядрі, індуковану протеотоксичним стресом. ЕМ5БА був проведений, як описано в поясненнях до

Фіг. 11А, з міченим зразком олігонуклеотиду та екстрактами з ядер необроблених клітин Неї! а (смужка 1 зліва), або оброблених протягом 4 годин 5 мкМ Мо132 (Мо), або 1 мкм 17-ОМАС (СМ) як таким чи в комбінації із 20 мкМ ОС. Фіг. 11С показує, що бафіломіцин підвищує концентрацію ОС в ядрах. Клітини

Нега були оброблені 5 мкМ ОС як таким або в комбінації із 0,5 мкМ бафіломіцину протягом 1 години.

Внутрішньоклітинна локалізація ОС була досліджена з використанням ультрафіолетового мікроскопу та блакитного фільтру. Фіг. 110 показує, що бафіломіцин (далі Ваї) підвищує активність ОС як інгібітору дії теплового шоку. Клітини Неї а були необроблені (смужка 1 зліва), або оброблені протягом годин зазначеними комбінаціями 5 мкіМ МО132 (МО), 0,5 мкМ бафіломіцину (Ва) та ОС в різних концентраціях. Збірні екстракти клітинного протеїну були досліджені Вестерн-блоттінгом з застосуванням антитіла анти-НОЗЕ1. Експресія пірину була досліджена як перевірка навантаження (.с.).

Ї0О0О19| Фіг. 12 показує, що ОС підсилює цитотоксичність індукторів протеотоксичного стресу.

Фіг. 12А показує токсичність комбінацій ліків, виміряну тестуванням життєздатності клітин. Клітини

НеГга були оброблені протягом 4 годин зазначеними комбінаціями 17-ОМАС (1 мкМ) та ОС (10 або мкМ). Життєздатність клітин визначали після їх 72-годинної витримки фарбуванням метиленовим синім. Наведені дані є середніми для трьох експериментів. Фіг. 128 показує токсичність комбінації бортезоміб/0С, визначену по життєздатності клітин, як зазначено для Фіг. 12А. Клітини Не а були оброблені протягом 4 годин 0,1 мкМ бортезомібу як такого або в комбінації із 10 мкМ ОС. Наведені дані є середніми для двох експериментів. Фіг. 12С показує визначені імуноблоттінгом дані про апоптоз клітин НеГа, оброблених комбінацією бортезомібу (87) (0,1 мкм), 17-ОМАС (СМ) (1 мкМ) та ОС (10 мкМ). Ознаками були такі апоптозо-специфічні протеолітичні фрагменти, як повний протеїн РАКР та протеїн К-18 (РАКР/арорі та К18/арорі). Фіг. 120 показує, що опосередковане 5і-РНК падіння Н5Р7О0 сенсибілізує клітини до бортезомібу та 17-ОМАС, як встановлено імуноблоттінгом протеїнів з НОР7О 5і-РНК клітин Нега, які оброблені зазначеними концентраціями 0,1 мкМ бортезомібу (82), 20 мкМ ОС та 1 мкМ 17-ОМАС (СМ) і експресують 5і-РНК. Протеїнові екстракти були видобуті з клітин через 24 години після їх трансфекції НОР70 і оброблені на ніч бортезомібом та 17-ОМАС. Експресію Н5ОР7О і апоптозо-специфічне розщеплення К18 ідентифікували відповідними антитілами. Контрольні клітини

Нега були необроблені ліками (смужка 1) або оброблені на ніч ліками в зазначених вище кількостях (смужки 5-9). Фіг. 12Е показує, що каспас-інгібітор, 2МАО-РМК захищає клітини від апоптозу, індукованого комбінацією протеотоксичного стресу і аміноакридинів, як це було виявлено імуноблоттінгом рівнів протеїну НОР70 і апоптозо-специфічного розщеплення К18 в клітинах Неї! а, які були оброблені на ніч зазначеними комбінаціями 1 мкМ 17-ОМАС (СМ), 0,1 мкМ бортезомібу (В2), 20 МКМ ОС та 20 мкм 2МА0-ЕМК (2МАБ). Обробка клітин анти-Ра5 антитілом (Ра5, смужка 9) та комбінацією анти-Бах антитіла й 2МАО-ЕМК (смужка 10) забезпечує відповідно позитивні контролі апоптозу і захисний ефект 2МАО-ЕМК.

І0020) Фіг. 13 показує вплив 17-ОМАС і акрихіну на зростання ракових клітин іп міго та іп мімо.

Фіг. 13А показує, що ОС пригнічує синтез Н5Р7О у відповідь на протеотоксичний стрес клітин МСА2О5 та В-16. РНК із контрольних клітин і клітин, оброблених протягом п'яти годин розчином 1 мкМ 17-

РМАС (ОМ) в присутності або без 20 мкМ ОС, були проаналізовані Нозерн-гібридизацією в пробах з

НБЗР7ОАТ та сАРОН. Фіг. 138 показує результати тестів на виживання клітин МСА20О5 та В-16, оброблених протягом чотирьох годин розчином 1 мкМ 17-ЮОМАСЄ (СМ) в комбінації із 20 мкм ОС.

Клітини були зібрані, розбавлені 1:50 і досліджені на виживання з метиленовим синім після 72 годин витримування. Числові показники є середніми величинами для двох експериментів. Фіг. 13С показує, що внутрішньо-пухлинна ін'єкція ОС блокує синтез НЗР7О, індукований 17-ОМАС. Миші лінії С57ВІ /6 як носії пухлин МСА205 були піддані одноразовій внутрішньо-пухлинній ін'єкції фосфатно-сольового буферного розчину (контроль), 25 мкг 17-ОМАС (СМ) або 1,25 мкг ОСя25 мкг 17-ОМАО. П'ятьма годинами пізніше миші були забиті. Видобуту із пухлин РНК проаналізували Нозерн-гібридизацією в пробах з НБ5Р7ОА1. Гібридизацію в пробах з ЗАРОН використали як перевірку навантаження (ї..с.).

Результати, отримані в двох експериментах, показані окремо для кожної пухлини при кожній обробці.

Фігури 130 та 13Е показують результати ін'єкцій мишам лінії С57ВІ /6 з пухлинами МСА20О5 (130) та В- 16 (13Е). Також показані середні об'єми пухлин для кожної з груп мишей.

І0021) Фіг. 14 показує на мишах як моделях антибластомні ефекти комбінування неефективних доз акрихіну і локальної гіпертермії. 00221 Фіг. 15 показує вплив карбазолу на експресію гена НОР70 у відповідь на протеотоксичний стрес, як це встановлено шляхом Нозерн-гібридизації РНК, виділеної із контрольних клітин Неї/ а, клітин, оброблених протягом п'яти годин окремо МО132, комбінацією МО132 із 10 мкМ 9АА, або 1 мкм карбазолів (СКВІ) 159, 188 ї 198 зі зразком гена Н5Р70. Для перевірки навантаження застосували

САРОН.

ІОО23) Фіг. 16 показує, що СКВ2А198 пригнічує Н5Е1-специфічну експресію генератора СЕР. Клітини

Нега, інфіковані лентивірусом, що експресує генераторний ген, були оброблені 0,1 мкМ бортезомібу (Вгі7) окремо або у комбінації із 1 мкМ СКВ2188 (неактивного) та СКВ2198 (активного). Експресію СЕР визначали через 10 годин після експерименту, застосовуючи мікроскоп.

І0024| Фіг. 17 показує вплив теплового шоку (Н5) та комбінації АА/СКВЯ на НЗЕ1-специфічну експресію СЕР. Клітини Нега, інфіковані лентивірусом, що експресує НОЕ1-специфічний СЕР, були піддані Н5 при 43 "С протягом 30 хвилин, або Н5 в комбінації із 20 мкМ 9АА, або 1 мкМ СКВ2198 чи

САВ159 (позначка ш/, тобто "ипігеаїєйд", вказує на необроблені клітини Не а). СЕР був виявлений через 12 годин при 37 "С.

Детальний опис винаходу 0025) Винахідники зробили неочікуване відкриття того, що індукування реакції теплового шоку в комбінації із інгібуванням адаптивної реакції теплового шоку може викликати загибель клітин. Хоча це й не пов'язано з теорією, інгібітори адаптивної реакції теплового шоку можуть перешкоджати клітині виявити здатність переносити індукування реакції теплового шоку внаслідок пригнічення фактору теплового шоку Н5ЕТ1, який є головним посередником в транскрипції, що індукована тепловим шоком.

Протеїни теплового шоку є шаперон-протеїнами, які різним чином попереджають фатальні наслідки дії шкідливих стимулів шляхом дезагрегатування, реструктуризації та ренатурації пошкоджених протеїнів.

Захисна дія протеїнів теплового шоку полягає також в їх здатності пригнічувати деякі форми загибелі клітин, включаючи апоптоз. За умови відсутності протеїнів теплового шоку клітини менш здатні до відповіді на хімічні, екологічні та фізіологічні стреси. Зокрема, ракові клітини можуть бути більш чутливими до інгібування адаптивної реакції теплового шоку, бо вони зазвичай виявляють вищі рівні протеїнів теплового шоку і можуть залежати від тих підвищених рівнів як механізму придушення впливу кумулятивних мутацій, що відбуватимуться внаслідок експресії шкідливих протеїнів.

Відповідно, комбінація інгібування адаптивної реакції теплового шоку й індукування реакції теплового шоку створюють простий і гнучкий спосіб індукувати загибель клітин. 1. Визначення термінів 0026) Використана тут термінологія призначена лише для описування окремих втілень винаходу і не пов'язана з намірами щось обмежувати. Зокрема, терміни, вживані в описі і пунктах формули винаходу в однині, позначають також і множину, якщо з контексту не випливає явно протилежне.

І0027| Для зазначення тут числових інтервалів кожний числовий параметр проміж іншими, що мають одну і ту ж точність вимірювання, представлений явно. Наприклад, в інтервалі 6-9 числа 7 і 8 слід розглядати поряд з числами 6 і 9, а в інтервалі 6,0-7,0 такими числами є6,0:6,1;6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6;6,7; 6,8; 6,9 та 7,0. а. акрил

І0028| Використаний тут окремо або в комбінаціях термін "акрил" може стосуватися радикалу

СнН2г-С(О)С(О)0-, де О є аліфатичною або ароматичною групою. р. ацил (0029) Термін "ациламіно" може означати К(-О)М-, де К є алкілом або арилом. с. уведення

ІООЗО| Використаний тут термін "уведення" стосовно дозування препаратів може означати як окрему дозу, так і певну кількість доз визначеного препарату. й. аліфатичний

ІЇОО31| Використаний тут термін "аліфатичний" може означати нерозгалужені, розгалужені або циклічні вуглеводневі радикали, які можуть бути заміщеними або не заміщеними, насиченими або ненасиченими, але не можуть бути ароматичними. Далі термін "аліфатичний" може включати аліфатичні групи, що містять атоми оксигену, нітрогену, сірки або фосфору замість одного або більше атомів карбону в вуглеводневому ланцюгу. е. алкоксил

ІЇ0032| Використаний тут окремо або в комбінації термін "алкоксил" може стосуватися алкілу, алкенілу або алкінілу, що приєднаний простим кінцевим етерним зв'язком. Прикладами алкоксильних груп можуть бути метоксил, етоксил, н-пропоксил, ізопропоксил, н-бутоксил, 2-бутоксил, трет- бутоксил, н-пентоксил, 2-пентоксил, З-пентоксил, ізопентоксил, неопентоксил, н-гексоксил, 2- гексоксил, З-гексоксил, З-метилпентоксил, рфлуорометоксил, дифлуорометоксил, трифлуорометоксил, хлорометоксил, дихлорометоксил та трихлорометоксил. Термін "алкоксил" означає також -ОК, де К є алкіл.

Ї. алкоксіалкіл

І00О33) Термін "алкоксіалкіл" означає алкільну групу, в якій атом гідрогену заміщений алкоксильною групою. 9. алкеніл

І0034| Використаний тут окремо або в комбінації термін "алкеніл" може стосуватися розгалуженої або нерозгалуженої ненасиченої аліфатичної групи, що містить щонайменше один подвійний карбон- карбон зв'язок на визначеному місці вздовж ланцюгу. Типовими прикладами алкенільної групи можуть бути етеніл, Е та 7 пентеніли, деценіл тощо.

Й. алкіл 0035) Використаний тут окремо або в комбінації термін "алкіл" може стосуватися прямоланцюгової або розгалуженої вуглеводневої групи, що містить певну кількість атомів карбону, наприклад: метил, етил, нормальний або розгалужений пропіл чи бутил. і. алкілтіо

І0ООЗ6) Термін "алкілтіо" може означати -9К, де К є алкіл.

). алкініл

І0037| Використаний тут окремо або в комбінації термін "алкініл" може стосуватися розгалуженої або нерозгалуженої ненасиченої аліфатичної групи, що містить щонайменше один потрійний карбон- карбон зв'язок на визначеному місці вздовж ланцюгу. Типовими прикладами алкенільної групи можуть бути етиніл, пентиніл, пропаргил тощо.

К. аміно

ІЇОО38| Використаний тут окремо або в комбінації термін "аміно" може стосуватися групи, що містить в ланцюгу атом нітрогену. Типовими (але не обмежуючими) зразками аміногруп слугують алкіламіно-, диалкіламіно-, ариламіно-, диариламіно-, алкілариламіно-, алкілкарбоніламіно-, карбамоїл, уреїдо- тощо. Термін "аміно" як такий означає -МНаІ2, а термін "алкіламіно-" означає -МН2, де один К алкіл, а другий К є алкіл або атом гідрогену.

І. ароматичний

ЇО0О39| Використаний тут окремо або в комбінації термін "ароматичний" може стосуватися ненасиченої вуглеводневої групи, що має 4п-2 не локалізованих р(рі) електронів і може бути заміщеною або незаміщеною. Далі, термін "ароматичний" може стосуватися ароматичних груп, що містять щонайменше один атом нітрогену замість одного або більше атомів карбону в структурі вуглеводню. Типовими прикладами ароматичної групи можуть бути феніл, нафтил, тієніл, фураніл, піридиніл, (із)оксазоїл тощо. т. алкілсульфініл 00401 Термін "алкілсульфініл" означає К-502-, де Е є алкіл. п. алкілсульфоніл 00411 Термін "алкілсульфоніл" означає К-503-, де Е є алкіл. о. морфолінова група о (0042) Термін "морфолінова група" означає з . р. тетрагідрофурилова група ї 0043) Термін "тетрагідрофурилова група" означає щ а. піперидинілова група ' (0044) Термін "піперидинілова група" означає С г. арил 0045) Використаний тут окремо або в комбінації термін "арил" може стосуватися заміщеної або не заміщеної ароматичної групи, що за бажанням з'єднана із іншою ароматичною або неароматичною циклічною групою. Типовими прикладами арильної групи можуть бути феніл, метилфеніл, нафтил, фенілен, феніліден, ксиліл, стиріл, фенетил, бензтриїл і тому подібні. 5. арилоксил

І0046| Використаний тут окремо або в комбінації термін "арилоксил" може стосуватися арильної групи, що приєднана простим кінцевим етерним зв'язком.

І. розгалужений

І0047| Використаний тут окремо або в комбінації термін "розгалужений" може стосуватися групи, що містить від одного до 24 зв'язаних атомів і має в головному ланцюгу щонайменше один або більше підпорядкованих ланцюгів. Відгалужена група може містити від одного до 12 основних атомів.

Приклади розгалужених груп: ізобутил, трет-бутил, ізопропіл, -«СН2гСН2СнН(СНЗІСН2СН2-, -СН2 сн(існ2генЗСн2еСНО-, -СН2ІСН2гС(СНЗ)З. и. рак

І0048| Використаний тут термін "рак" може означати будь-який стан стійкості до апоптичних стимулів. м. терапія раку

І0049| Використаний тут термін "терапія раку" може означати будь-який спосіб лікування раку, відомий із рівня техніки, включаючи хіміотерапію і радіаційну терапію. м. карбоніл

І0О50| Використаний тут термін "карбоніл" або "карбоксил" може означати будь-яку групу, що містить подвійний зв'язок карбон-оксиген. Типовими (але не обмежуючими) зразками карбоніловмісних груп слугують альдегіди (тобто формалі), кетони (тобто ацили), карбонові кислоти

(тобто карбоксили), аміди (тобто сполуки з амідогрупами), іміди (тобто сполуки з імідогрупами), естери, ангідриди і тому подібні сполуки. х. комбінування

ІЇ0ОО51| Використаний тут термін "комбінування із" або "сумісне застосування" для описування застосування аміноакридину і додаткової терапії може означати, що аміноакридин уводять до, під час, або після додаткової терапії, або їх комбінацію. у. ціан

Використаний тут окремо або в комбінаціях термін "ціан", "ціанат" або "ціанід" може стосуватися подвійного зв'язку карбон-нітроген. Типовими (але не обмежуючими) зразками ціаногруп є ізоціанати, ізотіоціанати і тому подібні. Термін "ціан" означає -СМ. 7. циклічний

Ї0052| Використаний тут окремо або в комбінаціях термін "циклічний" або "цикло" може стосуватися радикала, що має одне або декілька замкнених насичених або ненасичених кілець, які сформовані із 3-12 (або із 3-7) основних атомів. аа. ефективна кількість

І0053)| Термін "ефективна кількість", застосований, як тут передбачено, відносно сполуки, продукту або композиції, може означати таку ефективну кількість сполуки, продукту або композиції, яка забезпечує досягнення бажаного результату. Точна потрібна кількість буде варіюватися залежно від конкретно використаних сполуки, продукту або композиції, способу їх уведення тощо. Таким чином, завжди неможливо точно визначити "ефективну кількість" заздалегідь. Однак прийнятна ефективна кількість може бути визначена одним з відомих фахівцям методів шляхом лише рутинних експериментів. рр. галогеноалкіл (0054) Термін "галогеноалкіл" означає алкіл, заміщений одним або більше, наприклад від 1 до 3, атомом галогену, зокрема флуором, хлором, бромом, йодом або їх комбінаціями. Аналогічно, "галогеноциклоалкіл" є циклоалкільною групою, що містить один або більше галогенів-замісників. 0055) Термін "арил" окремо або в комбінації означає моноциклічну або поліциклічну (переважно моноциклічну або біциклічну) ароматичну групу, наприклад, феніл або нафтил. Якщо це не зазначено інакше, "арил" може бути незаміщений або заміщений, наприклад, одним або більше, зокрема від одного до трьох атомів галогену, алкілами, гідроксиалкілами, алкоксилами, алкоксилалкілами, галогеноалкілами, нітро-, аміно-, алкіламіно-, ациламіно-, алкілтіо-, алкілсульфініл- і алкілсульфоніл- групами. Прикладами арильних груп є феніл, нафтил, тетрагідронафтил, 2-хлорфеніл, З-хлорфеніл, 4- хлорфеніл, 2-метилфеніл, 4-метоксилфеніл, З-трифлуорметилфеніл, 4-нітрофеніл і тому подібні. сс. галоген 0056) Використаний тут окремо або в комбінації термін "галоген", "галід" або "гало" означає флуор "Б", хлор "СІ", бром "Ві", йод "І", ії астат "А. Типовими прикладами галогеновмісних груп є хлорацетамід, бромацетамід, йодацетамід і тому подібні. аа. гетеро

І0057| Використаний тут в комбінаціях термін "гетеро" означає один або декілька атомів будь-якого елементу, відмінного від карбону або гідрогену. Типовими прикладами є гетерогрупи, що містять як гетероатоми нітроген, оксиген, сірку і фосфор. ее. гетероарил (0058) Термін "гетероарил" означає моноциклічну або біциклічну кільцеву систему, яка має одне або два ароматичних кільця і містить щонайменше один атом нітрогену, оксигену або сірки в ароматичному кільці і яка може бути незаміщеною або заміщеною, наприклад, з одним або більше, зокрема, одним або трьома замісниками типу галогену, алкілу, гідроксилу, гідроксиалкілу, алкоксилу, алкоксилалкілу, галогеноалкілу, нітро-, аміно-, алкіламіно-, ациламіно-, алкілтіо-, алкілсульфініл-, і алкілсульфоніл- груп. Типовими (але не обмежуючими) зразками гетероарильних груп є тієніл, фурил, піридил, оксазоліл, хіноліл, ізохіноліл, індоліл, триазоліл, ізотіазоліл, ізоксазоліл, імідізоліл, бензотіазоліл, піразиніл, пірімідиніл, тіазоніл і тіадіазоліл.

І0О59| Термін "алкілен" означає алкільну групу, що має замісник. Наприклад, термін "Сі-

Залкіленарил" стосується алкільної групи, що містить від одного до трьох атомів карбону і заміщена арильною групою. її. гетероцикл

І0ОО60) Використаний тут термін "гетероцикл" може означати циклічну групу, що містить гетероатом.

Типовими (але не обмежуючими) зразками гетероциклів можуть бути піридин, піперидин, піримідин, піридазин, піперазин, пірол, піролідин, піролідинон, морфолін, тіоморфолін, індол, ізоіїндол, імідазол, триазол, тетразол, фуран, бензофуран, дібензофуран, тіофен, бензотриазол, бензоксазол, бензтіофен, хінолін, ізохінолін, азапін, нафтопіран, фуранобензопіранон і тому подібне. да. гетероциклоалкіл

І0061| Термін "гетероциклоалкіл" означає моноциклічну, біциклічну та трициклічну циклоалкільну групу, що містить в кільці один або більше гетероатомів, вибраних з групи, що складається з оксигену,

нітрогену і сірки. Гетероциклоалкільна група може також мати оксогрупу (0), що приєднана до кільця.

Типовими (але не обмежуючими) зразками гетероциклоалкілів є 1,3-диоксолан, 2-піразолін, піразолідин, піролідин, піперазин, піролін, 2Н-піран, 4Н-піран, морфолін, тіофолін, піперидин, 1,4- дитіан і 1,4-диоксан.

ПА. гідроксил 00621 Термін "гідроксил" означає -ОН. іі. гідроксиалкіл

І00О63) Термін "гідроксиалкіл" означає алкільну групу, в якій гідроген заміщений гідроксилом. ). нижчий

І0064| Використаний тут термін "нижчий" може означати групу, що має від 1 до 6 основних атомів.

КК. нітро

І0065| Термін "нітро" означає -МО2.

І. за бажанням 0066) Використаний тут термін "за бажанням" або "бажано" може означати, що наступний за нею опис випадків включає різні можливі варіанти, які розрізняються наявністю або відсутністю деякої ознаки. Наприклад, фраза "за бажанням заміщений алкіл" може означати, що алкільна група може бути як заміщеною, так і незаміщеною, і що таке визначення включає обидва варіанти. тт. пептид

ІЇ0067| "Пептид" або "поліпептид" є ланцюговою послідовністю амінокислот і може бути натуральним чи синтетичним або комбінацією натурального із синтетичним. пп. фосфатовмісна група

ІОО68| Використаний тут термін "фосфатовмісна група" може означати групу, що містить щонайменше один атом фосфору в окисленому стані. Типовими (але не обмежуючими) зразками сполук з такими групами є фосфонова кислота, фосфінова кислота, фосфатні естери, фосфініден, фосфін, фосфініл, фосфініліден, фосфораніл, фосфораніліден, і тому подібне. ово. насичений

І0069| Використаний тут термін "насичений" може означати групу, в якій всі доступні валентності основних атомів замкнені на інші атоми. Типовими прикладами насичених груп є бутил, циклогексил, піперидин і тому подібне. рр. заміщений

І0070| Використаний тут термін "заміщений" може означати групу, що має один або більше атомів гідрогену, видалених від атома карбону або гетероатома і заміщених іншими групами. Заміщені групи можуть мати від одного до п'яти або від одного до трьох замісників. Атом із двома замісниками позначають "ді" або "ди", тоді як атом з більшою кількістю замісників позначають "полі" Типовими прикладами таких замісників є аліфатичні групи, ароматичні групи, алкіл, алкеніл, алкініл, арил, алкоксил, галоген, арилоксил, карбоніл, акрил, ціан, аміно-, нітро-, фосфатовмісні групи, сірковмісні групи, гідроксил, алкілкарбонілоксил, арилкарбонілоксил, алкоксилкарбонілоксил, арилоксикарбонілоксил, алкілкарбоніл, арилкарбоніл, алкоксилкарбоніл, амінокарбоніл, алкіламінокарбоніл, диалкіламінокарбоніл, алкілтіокарбоніл, ациламіно, амідино, іміно, алкілтіо, арилтіо, тіокарбоксилат, алкілсульфініл, трифлуорметил, азидо, гетероцикліл, алкіларил, гетероарил, семикарбазид, тіосемикарбазид, малеїмід, оксіміно, імідат, циклоалкіл, циклоалкілкарбоніл, діалкіламіно, арилциклоалкіл, арилкарбоніл, арилалкілкарбоніл, арилциклоалкілкарбоніл, арилфосфініл, арилалкілфосфініл, арилциклоалкілфосфініл, арилфосфоніл, арилалкілфосфоніл, арилциклоалкілфосфоніл, арилсульфоніл, арилалкілсульфоніл, арилциклоалкілсульфоніл або їх комбінації і замісники для них. да. сірковмісна група

І0071) Використаний тут термін "сірковмісна група" може означати групу, що містить атом сірки.

Типовими (але не обмежуючими) зразками є сульфгідрил, сульфен, сульфін, сульфініл, 5ціо-, сульфоніл, тіо-, тіоксо- і тому подібні групи. гг. обробка і лікування 00721) Використані тут терміни "обробка" і "лікування", коли вони стосуються захисту ссавців від ушкоджень, можуть означати запобігання, придушення, репресію або виключення шкідливих чинників.

Запобігання означає профілактичну обробку ссавців до початку дії шкідливих чинників. Придушення означає лікування ссавців після початку дії шкідливих чинників, але до виникнення клінічних прояв захворювання. Репресія означає лікування ссавців після виникнення клінічних прояв захворювання з метою послаблення або стабілізації дії шкідливих чинників. Виключення дії шкідливих чинників означає лікування ссавців після виникнення клінічних прояв захворювання для позбавлення їх від страждань. 55. трифлуорметоксил

І0073| Термін ""трифлуорметоксил" означає -ОСЕЗ.

НЯ. трифлуорметил

І0074| Термін "трифлуорметил" означає -СЕЗ.

ци. ракова клітина

І0075| Використаний тут термін "ракова клітина" може означати будь-яку клітину, що стійка до апоптичних стимулів. мм. нерозгалужений

І0076| Використаний тут термін "нерозгалужений" може означати групу, що має від 1 до 24 основних атомів, де основний ланцюг або основа поширюється по прямій. Нерозгалужена група може містити від 1 до 12 основних атомів. мл. ненасичений

І0077| Використаний тут термін "ненасичений" може означати групу, де щонайменше одна доступна валентність, що зв'язує два суміжних головних атоми, не замкнена на інший атом. Типовими прикладами ненасичених груп є -«СНЕСН.СН-СН», феніл, пірол і тому подібні. хх. незаміщений

І0078| Використаний тут термін "незаміщений" може означати групу, що не має будь-якої приєднаної до неї або замісної групи. 2. Спосіб індукування загибелі клітини

Ї0079| Тут запропонований спосіб індукування загибелі клітини. Така загибель може бути індукована інгібуванням адаптивної реакції теплового шоку в комбінації із індукуванням цієї реакції в клітині. Реакція теплового шоку може бути індукована уведенням в клітину придатного агента- індуктора або підвищенням внутрішньої температури клітини нагрівальним засобом. а. Інгібування адаптивної реакції теплового шоку

І0ОО801 Інгібітором адаптивної реакції теплового шоку може бути здатний до включення в ДНК негенотоксичний агент, який придушує опосередковану Н5ЗЕ-1 транскрипцію. Цим інгібітором адаптивної реакції теплового шоку може бути аміноакридин, карбазол, або його похідні. (1) Аміноакридин

І0081)| Аміноакридин може мати таку формулу:

Нори

СЕ «В. ові

В; МО В. (Сполука 1) де

В: є Н або галоген;

Ве є Н або, за бажанням, алкоксил;

Аз є Н або, за бажанням, бажанням алкоксил; і

КА є Н або, за бажанням, аліфатична група, арил, або гетероцикл.

І0082| Аміноакридином може бути 9-аміноакридин або Мерасгіпе, який також відомий як акрихін.

Аміноакридин може бути таким, як описано в УМО/06/12419, зміст якої включений тут шляхом посилання. (2) Похідні карбазолу 0083) Інгібітором реакції адаптивного теплового шоку можуть бути карбазол або його похідні.

Карбазол або його похідні можуть бути такими, як це описано в Ш.5. Ргомізіопа! Арріїсайоп 61/102,913 від б жовтня 2008,зміст якої включений тут шляхом посилання. (0084) Карбазол або його похідні можуть мати формулу (1): о в во

Д ТЕ

В" М В

Е 1 І. Е й

Вл (снвК несе" ве В. ві є)

де

Ве обраний з групи, що містить гідроген, С:-валкіл, С:-вєгалогеноалкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, ОБ8, М(Ве)2 та ЗКУ, або Ка та В" чи МЕ? та КК" разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне карбоциклічне чи гетероциклічне кільце;

В? обраний з групи, що містить гідроген, С:-валкіл, Сі-вгалогеноалкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, ОКе, М(Ве)2, та ЗК, або К? та К5 чи МК: та Ке разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне карбоциклічне або гетероциклічне кільце;

АВ: обраний з групи, що містить гідроген, Сі- алкіл, Сі- гідроксиалкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, і С(-О)В2, або ВЕ: та РУ, які разом створюють п'яти-, шести-, або семиланкове аліфатичне кільце, що містить, за бажанням, атом оксигену;

ВУ обраний з групи, що містить гідроген, С.-валкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, і С(5О)В», або ВЗ та В" разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне кільце;

Ве незалежно обраний з групи, що містить гідроген, Сі-валкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, і гетероарил, або дві НК: групи, які разом з атомом нітрогену, до якого вони приєднані, створюють п'яти-, або шестиланкове аліфатичне кільце;

В', Ве, ВАЗ, В, Р»та КУ вибрані незалежно з групи, що містить гідроген, С:-валкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, галоген, ОК. Сб(-0)Не, Сб(-0)0Не, "С(-О)Ке, С(-О)М(Вг)»,

Сб(-О0)МАеБОгве, М(Не)», МАеС(-О)Не, МАеС(-О)М(Не)», СМ, МО», СЕз, ОСЕз, 5Не, 5ОВе, 5022,

ЗО2М(Ве)», і О5О»СЕ з;

А" обраний з групи, що містить гідроген, Сі-валкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил і гетероарил; пеє0,1,2,3,4, або 5, або його фармацевтично прийнятні сіль чи гідрат. 0085) Карбазол або його похідні можуть мати загальну структурну формулу (Іа): о ЕЕ о

Ц й в і Ще Ср

В М Во в ! ві (Сніп 1 й не вве (а) де

Ве є Сі-залкіл, Сі.«галогеноалкіл, Сз-«циклоалкіл, М(К-)2, або ОКУ, або Кг і 2! разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне карбоциклічне кільце;

Ве є Сз.-лалкіл, Сі.«галогеноалкіл, Сз-«циклоалкіл, М(К-)2, або ОК, або ЕК? ї РЕЯ разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне карбоциклічне кільце чи п'яти- або шестиланкове аліфатичне карбоциклічне кільце, що містить атом нітрогену;

В: є Сі-валкіл, Сз«циклоалкіл, або С. -згідроксиалкіл;

ВУ є гідроген, С:-4алкіл, або Сз«циклоалкіл, або КУ і В" разом із атомами, до яких вони приєднані і створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне кільце, що містить атом нітрогену, або Б: і РУ, які разом створюють шести- або семиланкове аліфатичне кільце, що містить, за бажанням, атом оксигену;

Ве є незалежно гідроген або С. -залкіл;

В" є гідроген або С залкіл;

Е є гідроген, гідроксил, або С.і-залкоксил;

ВЗ і 87 є незалежно гідроген або С.-залкіл;

В? є гідроген, гідроксил, С: залкоксил, або галоген;

Ве є гідроген, Сі-залкіл, Сі-залкоксил, або галоген;

В" є гідроген або С залкіл; пеє0,1,2,3,4, або 5,

або його фармацевтично прийнятні сіль чи гідрат. (0086) Карбазол або його похідні можуть мати загальну структурну формулу (ІБ):

Ов о

Н ц

В М во га | В (сно)а нет ве "ві чу де

Ве є метил, етил, н-пропіл, циклопропіл, МН(СН»з), або ОСН», або Ваг і Е! разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'ятиланкове аліфатичне карбоциклічне кільце;

Ве є метил, етил, н-пропіл, циклопропіл, МН(СНз), або ОСН», або Р? і Ре разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'ятиланкове аліфатичне суто карбоциклічне кільце або п'ятиланкове аліфатичне карбоциклічне кільце, що містить атом нітрогену;

В: є метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, циклобутил, або 2-гідроксилетил;

ВУ є гідроген, метил, етил, або циклобутил, або КУ і В" разом із атомами карбону, до яких вони приєднані і створюють п'ятиланкове аліфатичне карбоциклічне кільце, що містить атом нітрогену, або

В: ії КУ, які разом створюють морфолінову групу, тетрагідрофурилову групу, або піперидинілову групу к або групу ;

В" є гідроген;

В: є гідроген, гідроксил, або метоксил;

ВЗ є гідроген;

В: є гідроген, гідроксил, метоксил, або флуор;

Ве є гідроген, метил, метоксил, або флуор;

В" є гідроген; п є 1 або 2, або його фармацевтично прийнятні сіль чи гідрат.

І0087| Карбазол або його похідні можуть мати структурну формулу (І): да др

ОМ ик ї-. МО» до (А М (А в й Ї в ди (СН в'я

І фе їх щі "на , Фо де

В обраний з групи, що містить гідроген, Сі-валкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил і

С(-О)В", або В/ ї 5, які разом створюють п'яти-, шести- чи семиланкове аліфатичне кільце, що містить, за бажанням, атом оксигену;

Ве обраний з групи, що містить гідроген, Сі-є алкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил і С(5О)В", або з і КЕ", які разом із атомами, до яких вони приєднані, створюють п'яти-, шести- чи семиланкове аліфатичне кільце;

В" незалежно обраний з групи, що містить гідроген, С.-вє алкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил і гетероарил, або два Р", які разом з атомом нітрогену, до якого вони приєднані, створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне кільце;

ВУ, ВО, ВА", Ве, А, ії В"? незалежно обрані з групи, що містить гідроген, С:-валкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, галоген, ОК", С(-0)8", С(-0)ОВА", С(О)в С(-ОМ(В»,

С(-О)МА"БО»А", М(ВГ)2, МА"С(-О)А8", МА"С(-О)М(А")», СМ, МО», СЕз, ОСЕз, 58", БОВ", 502",

ЗОВ)» і О5ОСЕ:.;

ВАЗ обраний з групи, що містить гідроген, Сі-алкіл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил і гетероарил; реб,1,2,3,4, або 5 за умови, що коли р є 2, один з В. і 29 є відмінним від етилу, або його фармацевтично прийнятні сіль чи гідрат. (0088) Карбазол або його похідні можуть мати загальну структурну формулу (Па): да дз

Сем, : МО до (Я м г дз ; | , «Шен Ше щи шИ

М

Но й шу «Шо де

В' є С. валкіл;

В» є гідроген або Сз-залкіл, або Кз і Е8 які разом з атомами, до яких вони приєднані, створюють п'яти- або шестиланкове аліфатичне кільце, що містить один атом нітрогену;

В" є гідроген або С залкіл;

В" є гідроген, гідроксил, або С:-залкоксил;

А" їі В": незалежно є гідроген або С -залкіл;

В"З є гідроген, гідроксил, С: залкоксил, або галоген;

В": є гідроген, Сі-залкіл, або С: залкоксил;

ВУ є гідроген або С залкіл; ред,1,2, 3,4, або 5, за умови, що коли р є 2, один з В! і ЕК: є відмінним від етилу, або його фармацевтично прийнятні сіль чи гідрат. 0089) Карбазол або його похідні можуть мати структурну формулу (ПІБ):

СМ. В В и МС

Її в вдо - НВ де

В' є метил або етил;

Ве є гідроген або метил, або Кз і КУ, які разом з атомом, до якого вони приєднані, створюють п'ятиланкове аліфатичне кільце, що містить один атом нітрогену;

В є гідроген; р є 1 або 2, або його фармацевтично прийнятні сіль чи гідрат.

І0090| Карбазол або його похідні можуть мати структурну формулу, яка вибрана із групи, що складається з: ск , -д-О м ; с СНаз. ї ач М

СькМ | МО сь МО» щ с дк МН

СНУ і ж сг ри по, о ах м ї сов / а и ще ще о ЦО го; 7 і Ї Її й ЦІ ЕХ що? о Е Ех я / : / ще Ще с | сом. тки МО рочоя у

В щ : о го: ї і Ух !

АД Е Її. ; й ці ра: . й - т 4 : о / о /

И" МН

СН я з Сн о го: о (о і ! у. ї да Й ч І о до че - я мае до Й / - но / Ше а:

МА УНН и що

Щщ о о о

Я Ї С її уд - ї сое у й | За о

М ЕК

ЩІ щ

СН о З о о;

У. в Н

Усегух осту» / й с МЕ Ф м Ф о НІВ: що і (А щі я тм ( « й З М. й «/

З З с о ї ї її ї що | тех и шві Ф рі ак ва ще о; о в. а ї ї її Ї

Со реа г» г ен

М Ми

Ох он

С

. о З о о Її Ї

Я й ре пи й (Я 7 « «

М К- и щі

З о о а : М й о о, о о о о їх | й

На позодаововоной

Х я 4 щі лій | я і АЛ а шк ї з мод шо потоне онов ши шо сш пт,

Усе Удоо о це | бе | Іо ооо о о

Ге) й з о ї Ї ше ва Ж пло ре Ж 7 Б (л чо м В - ї сн ч | Я ше, т ях ї ч не йо з іч С ! з | з. х а (ФІ о й прочее чн: о аа і ваше їх не С ща Но х НС ь ї що тт - г

АЖ . І й то, а о о З

Ї ще , ч і а у у й: х г ст Б й з «А особової еотня ши ше сівби не ; ної і

З й ге ї я р а т

Х ї Ї Ї ї ра а Е З і п а ; вай - пар чн пет. ще пов 3 пово дово; свиня : вах ми ще:

Ь ще З

Як щк ще ,

З г ; З о ут ї і . ща 3 г ! б ж Шк ща в й з у у о о о о ГІ о І в) ї ; ї

Нам х. ч. ши шо шо М

І

; ; й

Е це Я Ше сна сн пу о о я пцео

С | т се з і 7 СН Н

ОН 4 пб І і і Ї і

ІЙ м і х о / шо я

М М и с ( ще сь Й сн і Сма Не ,

На сне й йкнх , о у з х х | нет

КАХ ра А С й - й ( / це Ї й шк ай НО, дн й сне | ня , сн ,

сі со ; г о о боро ака оман 4 ом тн оме

Ще і і

М ща г й з | Ж І .е гав) а ; о ко м

М М я що У, Ми

Мне й Мне . Г » см МО

СО есуту" сом МО От

З

; я сну

М й | щ нє

М я,

ОМ си МО

Соми щу м с Ї /

М с м о, | йз г сна о ач о Іа 8 -щй би би єррор'усю Су ще .

Ко) о о з її і ще ; | М ! М / / МН " ( г З , сне гав; о іч Ї г ро ч її о, а Ащще С - М йо Ибф» - у п лк |. ре / Іо ! НУ М й Ся

М

МН ;

Сн . Ж й м . г с

ГУ хо ит, ; ко Г) С) /й з У НН о о т ух ша: ЧИ щ м зе І

З сс / ) у

МН й

МО

: МЕ сн: ши шо ; з з сині Г Мо ії: з З ІФ ї ! . ; «о -- ! всех ; ж я ! й | й З Бе А МЕ шин ; І / х що в

М т ЗІ й З «фо --с , ОН й Сх , о І І о І - ї їі шу Її й вах к о а Со. о

Й Й ІЗ | й

Шо (Я со 0007 | ше: й її Фі С : м си ре С М ч (А чо С «

М М

, ин, С , о о : і

Й ще ї

НМ ще .

Ше і-й у он . , о о ш-о р нс

І, у ; М а в) о ее ло-

І0О091| Похідні карбазолу можуть мати таку структурну формулу:

Ж -7 ке ре

ГА, Ф

Е . 0092) Карбазол може бути також вибраний із групи, що складається 3:

СВІ 0137

Он, не

ОЗ о иИжко 7-но мч Шо й сін и"

СН.

СВІ 0197 -4 де ав,

М и СІН у

Ст, сві 0198

Ж

- бе г СІН і не сві 100

ДА и

А ан ще сн, СВ,

СВІ 0159

СЯ, й

М

/й сін що

Сн, сві 0212

СН, Сніка! п-о а "М

Фе 7 ОНь

СВІ 0174

СН. но пре Бех.

М но /й аю ще шт СІН

І. т та СВІ 0175 сн. як

І чи о І " Ф,

КІ я сн. (3) Інгібітор транскрипції або трансляції

І00931| Інгібітор адаптивної реакції теплового шоку може бути також інгібітором транскрипції або трансляції. Наприклад, це може бути актиноміцин О або циклогексімід. р. Агент або фактор, що індукує тепловий шок (1) Агент, що індукує тепловий шок 0094) Реакція теплового шоку в клітині може бути індукована агентом-індуктором теплового шоку.

Цей агент може бути таким інгібітором синтезу протеїнів, як пуроміцин або азетидин. Цей агент може бути також таким інгібітором НОРОО, як гелданаміцин (ОМАС17), радицікол, або 17-ААО. Цей агент може бути також таким інгібітором протеасом, як Мо132, бортезоміб або лактацистин. Цей агент може бути також таким інгібітором серинпротеази, як ОСІС, ТРСК, або ТІ СК. Цей агент може бути таким посередником запалення, як циклопентенон, простагландин, арахідонат або фосфоліпаза А». Цей агент може бути також таким тритерпеноїдом як целастрол. Цей агент може бути таким со-індуктором, як не-стероїдний протизапальний засіб типу саліцилату натрію чи індометацину, або похідне гідроксиламіну типу бімокломол або аримокломол. Цей агент може бути також таким флавоноїдом, як кверцетин або сполука метилфеніліденлактаму типу КМК437. Цей агент може бути також арсенітом або етанолом. (2) Нагрівальні засоби

Ї0095| Реакція теплового шоку в клітині може бути також індукована нагрівальним засобом.

Нагрівальні засоби можуть бути фотоелектричні, механічні або хімічні. Нагрівальні засоби можуть бути здатними до неінвазивного нагрівання клітини, зокрема крізь шкіру. Нагрівальні засоби можуть також містити провід, просвіт, ресивер, зонд або катетер, як описано в ШО.5. Раї. Риб. Ме20070288075.

Нагрівальні засоби можуть містити оптичні волокна, нити, або імплантований прилад. Нагрівальні засоби можуть бути такими, як описано в патенті США Мо5,814,008, зміст якого включений сюди шляхом посилання.

ІО096| Нагрівальні засоби можуть також містити датчик для вимірювання температури клітини або тканини в зоні лікування і, відповідно, генерувати сигнал, що вказує температуру. Температура може бути виміряна термопарою, резистивним термометром або термістором. Датчик може мати форму голки або зонду. Температуру нагрівального засобу можна регулювати згідно з зазначеним сигналом.

Температуру можна регулювати для утримування її на заздалегідь визначеному рівні або для попередження перегрівання оброблюваної клітини або тканини внаслідок перевищення заздалегідь визначеного рівня, змінюючи кількість енергії, що витрачається на живлення нагрівального засобу. (а) Фотоелектричні нагрівачі

І0097| Нагрівач може бути таким джерелом світла як множина твердих світловипромінювальних пристроїв. Наприклад, джерелом світла може бути світлодіод, електролюмінесцентний прилад, лазер, лазерний діод, лазер з вертикальним резонатором, або лампа накалювання. Світло може бути видимим, ближньо-інфрачервоним, або інфрачервоним. Наприклад, довжина хвиль може бути від 750 нм до 1 мм. Довжина хвиль може також бути 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, або 1000 нм. Довжина хвиль може також бути 1;1,151,2:1,351,4:51,5;1,6;51,7;1,8;51,952;2,1;2,2:2,3;52,452,5;52,6;52,752,8;52,9; 3; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,55 3,6; 3,7; 3,8:3,954:541:42:4,3:44:4,5:54,6:4,7:54,8:54,95555,1;5 52:53; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8:55,9:56;6,1;6,2;:6,3:6,4:56,5;56,6;6,756,8:6,9:57571;572:7,3;7,А:57,557,6;7,7;57,8;7,9:58:8,1; 8,2; 8,3; 8,4:8,5:8,6:;8,7:8,8:58,9:59:59,1:592;:9,3:59,4;:9,5:59,6:59,759,8:59,9;10;10,1;102;10,3;10,4;10,5; 10,6; 10,7;10,8;10,9511;11,1;11,2:511,3511,4:511,5511,6;511,7511,8;11,9:512;:12,1;12,2; 12,3; 12,4; 12,5; 12,6; 12,7;12,8;12,9;13;13,1;15,2:13,3;13,4;13,5;13,6;13,7;13,8;13,9;14;14,1;14,2; 14,3; 14,4; 14,5; 14,6; 14,7; 14,8; 14,9; або 15 мкМ. Довжина хвиль може також бути 1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, або 100 мкМ. Довжина хвиль може також бути 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, або 1000 ріп.

І0098| Джерелом світла може бути інтенсивний лазер, зокрема із застосуванням двофотонного методу. Лазер може випускати добре колімований промінь. Джерело світла може бути також малопотужним і некогерентним. Світло може випромінюватися, починаючи від декількох фотонів на квадратний метр (тобто мати низьку густину потужності у порівнянні з високо інтенсивним лазером).

Наприклад, енергія може бути 30-25000 Дж, а густина потужності може бути менша за 500 мВт/см.

І0099| Нагрівальні засоби можуть випромінювати мікрохвильову або радіочастотну енергію, як це описано в патентах США Моб,904,323 та Ме5,549,638, зміст яких включений тут шляхом посилань.

Нагрівальні засоби можуть мати антену, зокрема у вигляді решітки. Нагрівальні засоби можуть також мати ультразвуковий передатчик. (р) Механічні нагрівачі

ІОТО0І| Нагрівальні засоби можуть мати елемент опору. Цей елемент опору може бути лампою накалювання. Нагрівальні засоби можуть також мати нагрівальну рідину або газ, розміщений в балоні, як це описано в Ш.5. Раї. Рир. Мо 2007/0288075, зміст якої включений тут шляхом посилання. (с) Хімічні нагрівачі

ІО101|) Нагрівальний засіб може містити хімреагент, здатний підвищувати внутрішню температуру клітини. Наприклад, хімреагент може містити частинки оксигідроксиду заліза з декстраном або комплекс заліза. Хімреагентом може також бути галій, індій, технецій, стронцій, йод або інший матеріал, сумісний з живою клітиною. Хімреагент може підвищувати внутрішню температуру клітини прискоренням метаболізму або власним окисленням в клітині з підвищенням рівнів оксигенації крові, як це описано в патенті США Мо4,569,836, зміст якого включений тут шляхом посилання. (4) Температура

ІО102| Внутрішня температура клітини може бути підвищена щонайменше до 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, або 100 "С. Внутрішня температура клітини може бути також підвищена в інтервалі 1-38 "С, 39-45 "С, 45- 60 "С, 60-85 С, або 85-100 "С. Температура повинна бути достатньою, щоб пошкодити або вбити оброблену аміноакридином клітину, але нижче рівня, за яким починається пошкодження або загибель здорової клітини, що не була оброблена. Температура також повинна бути достатньою, щоб індукувати тепловий шок. Внутрішня температура клітини може бути підвищена щонайменше на час 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19,20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 чи 60 хвилин, або на час 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 чи 72 години. с. Уведення

ІО103) Описані тут сполуки, хімреагенти і агенти можуть бути уведені в клітину шляхом абсорбції і дифузії усередину серцево-судинної системи пацієнта. Уведення може бути оральним, парентеральним, трансдермальним або з використанням супозиторіїв. Уведення в клітину може бути зроблено голкою, що приєднана до шприца, або катетером, приєднаним до системи внутрішньовенного вливання, або локально. 3. Лікування пацієнта 0104 Передбачений тут спосіб може бути застосований для лікування захворювання або усунення дії шкідливого чинника у пацієнта, який цього потребує. Інгібітор реакції адаптивного теплового шоку може бути уведений пацієнту і реакція теплового шоку може бути індукована у пацієнта локально або в цілому. Наприклад, агент, здатний індукувати реакцію теплового шоку, може бути уведений в таку клітину, як ракова або інфікована клітина. Агент-індуктор реакції теплового шоку може бути уведений пацієнту в цілому. Внутрішня температура клітини може бути підвищена локальною дією нагрівального засобу на клітину. Також може бути підвищена температура тіла пацієнта в цілому, але лише до фізіологічно припустимої гіпертермії. а. Рак

ІЇО105| Рак або передраковий стан можна лікувати розкритим тут способом. Рак може бути пухлиною, що розташована підшкірно або на шкірі. Пухлина може мати малі або великі розміри.

Можливий рак мозку, зокрема гліома, гліобластома, астроцитома, анапластична астроцитома, астроцитома-олігодендрогліома, аденома гіпофізу. Можливий також такий пульмональний або плевральний мезотеліальний рак, як рак легень, карцинома легень, немілкоклітинна карцинома легень, трахеобронхіальний рак, початкова стадія раку легень, ендобронхіальний метастатичний рак, периферичний рак легень або злоякісна плевральна мезотеліома.

ІО106| Можливий також такий гастроентерологічний рак, як пре-злоякісне або злоякісне утворення, що розташоване всередині стравоходу, жовчного протоку або колоректуму. Можливий також рак голови і шиї, рак стравоходу, початкова стадія раку стравоходу, виразка стравоходу Баррета, прикоренева холангіокарцинома, отвердіння печінки або підшлункової залози, печінкові метастази колоректального раку або панкреатичний рак.

ЇО107| Рак може також бути таким урологічним захворюванням, як рецидивна папілома, рак сечового міхуру, поверхневий рак сечового міхуру, рак простати або доброякісна гіперплазія простати.

Можливий також такий гінекологічний рак, як карцинома або дисплазія шийки матки, цервікальний рак, або цервікальна внутрішньоепітеліальна неоплазія.

ІЇО108| Можливий також такий рак шкіри, як плоскоклітинна карцинома (5СС), епідермоцитальна карцинома (ВСС), злоякісна меланома, ВІЛ-індукована саркома Капоші, Медіїетапеап-геїаієд саркома

Капоші, базалоїдна фолікулярна гамартома, хвороба Боуена, шкірна Т-клітинна лімфома або гіперплазія сальної залози. Рак може також бути пре-злоякісним або злоякісним шкірним утворенням.

Можливий також такий рак молочної залози, як метастатичний рак молочної залози, рак товстої кишки, ендометриальний рак, пухлина ока або такий рак голови і шиї, як рак ротової порожнини, рак глотки, карцинома губ, рак носової порожнини або гортані. (1) Комбіноване лікування

ІЇО109| Спосіб лікування раку або передракового стану, сполука або розкрита тут композиція можуть бути комбіновані або сумісно застосовані в антибластомній терапії. Ця антибластомна терапія може бути застосуванням антибластомного препарату, радіаційною терапією, хірургією або фотодинамічною терапією (далі ФДТ). (а) Протиракове лікування

ІЇО110| Протиракове лікування може бути такою радіаційною терапією, як рентгенівське опромінювання, використання радіочастот або мікрохвильової енергії, ультразвук, радіоізотопна терапія, іонізуюча радіація, зовнішня або променева дистанційна терапія, брахитерапія або радіотерапія від герметизованого чи негерметизованого джерела. Протиракове лікування може також бути такою хірургією, як зменшення маси, кріотерапія або хірургічне видалення пухлин. (2) Фотодинамічна терапія 0111) ФДТ може включати опромінення видимим світлом обробленої аміноакридином клітини, яка може також бути оброблена фотосенсибілізуючим агентом. Світло може мати специфічну довжину хвилі і може активувати фотосенсибілізуючий агент. Активований фотосенсибілізуючий агент може генерувати синглетний оксиген або радикал, який здатний пошкодити або вбити клітину. ФДТ може бути такою, як це описано в патентах США Моб,899,723 та Моб,693,093, зміст яких включений тут шляхом посилання. р. Лікування не-злоякісних проявів 0112) Не-злоякісні прояви у пацієнта, що страждає ними, можуть бути вилікувані із застосуванням способу. Лікування показане у випадках таких шкірних розладів, як псоріаз, звичайна бородавка або випадіння волос. Можливі й такі офтальмологічні розлади, як стареча макулодегенерація, субфовеальна хороїдальна васкуляризація, патологічна міопія, ретикулоендотеліальний цитомікоз або хороїдальна неоваскуляризація. Показаннями можуть бути також такі серцево-судинні розлади, як атеросклеротична бляшка, інтимальна гіперплазія, атеросклероз, або гемолітичні ушкодження, або рестеноз. с. Лікування інфекції

ІО113| Інфекція у пацієнта, що страждає нею, може бути вилікувана із застосуванням способу. Це може бути така вірусна інфекція, як герпес, грип, вірус імунодефіциту людини, або гепатити А, В та С.

Це також може бути така бактеріальна інфекція, як хламідіоз, туберкульоз або мікоплазмоз. 01141 Інфекція може бути також спричинена такими еукаріотичними паразитами, як цвіль, лямблії, токсоплазми або трипаносоми. Цвіль може бути дріжджами. Трипаносоми можуть спричиняти малярію і можуть бути плазмодіями чи лейшманіями. а. Лікування хвороб, пов'язаних з запаленням

ЇО115| Пов'язані з запаленням хвороби або обставини також можуть бути вилікувані із застосуванням способу. Запалення може бути хронічним, обумовленим аутоїмунною хворобою, алергією, астмою, септичним шоком, реакцією "трансплантат проти господаря", хірургічною раною, опіком, або ішемічним порушенням. 4. Спосіб скринінгу

ЇО116| Тут також передбачений спосіб скринінгу сполук, що здатні модулювати реакцію адаптивного теплового шоку в клітині, коли така сполука застосована в комбінації із індукуванням реакції теплового шоку. Цей спосіб може включати індукування реакції теплового шоку в популяції клітин і уведення цієї популяції в контакт із тест-сполукою. Кількість загиблих клітин з популяції у порівнянні з контролем може бути індикатором здатності сполуки модулювати реакцію адаптивного теплового шоку.

ІО117| Клітини в популяції можуть також містити генератор індукованого теплового шоку. Крім того, зазначений спосіб може включати вимірювання концентрації генератора. Ця концентрації генератора у порівнянні з контролем може бути індикатором здатності сполуки модулювати реакцію адаптивного теплового шоку. Зазначений генератор може містити таку копію гена НЗР70О, як НЗР7ОА1 або

НЗР7ОВ. Зазначений генератор може містити також протеїн Н5Р70. Зазначений генератор може також включати вектор, що містить промотор реакції теплового шоку, оперативно пов'язаний з геном генератора. Цей ген генератора може кодувати розпізнаваний маркер, яким може бути люцифераза, протеїн зелений флуоресцентний, протеїн жовтий флуоресцентний, протеїн червоний флуоресцентний, або хлорамфеніколацетилтрансфераза. 5. Композиція 0118) Цей винахід стосується композиції, що може містити інгібітор адаптивної реакції теплового шоку. Ця композиція може також містити індуктор реакції теплового шоку. Ця композиція може також містити терапевтичний агент, який може бути антибластомним агентом або фотосенсибілізуючим агентом. Ця композиція може бути застосована в лікуванні шляхом індукування реакції теплового шоку в обробленій композицією клітині, яка може пошкодити або вбити клітину. а. Антибластомний агент

І0О119| Антибластомним агентом може бути будь-який фармакологічний агент або сполука, що індукує апоптоз. Фармакологічним агентом може бути, наприклад, низькомолекулярна сполука, пептид, поліпептид, нуклеїнова кислота або антитіло.

ІО120| Антибластомним агентом може бути цитотоксичний агент або цитостатичний агент, або їх комбінація. Цитотоксичні агенти перешкоджають розмноженню ракових клітин: (1) порушуючи здатність клітин до реплікації ДНК і (2) індукуючи загибель клітин і/або апоптоз ракових клітин.

Цитостатичні агенти діють шляхом модуляції, інтерференції або інгібування процесів трансдукції клітинних сигналів, що регулюють проліферацію клітин і, інколи, при низькому пласкому рівні.

ІО121| Цитотоксичним агентом може бути алкільований агент (включаючи азотистий іприт, похідні етиленіміну, алкілсульфонати, нітрозоаміни або триазен), а саме: урацилова гіркота, хлорметин, циклофосфамід (Суїохапфб), іфосфамід, мелфалан, хлорамбуцил, піпоброман, триетиленмеламін, триетилентіофосфорамін, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин або темозоломід, антиметаболіти (включаючи антагоніст фолієвої кислоти, аналог піримідину, аналог пурину і інгібітор аденозиндеамінази): метотрексат, 5-флуорурацил, флоксуридин, цитарабин, 56- меркаптопурин, 6-тіогуанін, фосфат флударабина, пентостатин і гемцитабин; природні продукти або їх похідні (наприклад, алкалоїд барвінку (Міпса), антибластомні антибіотики, ензими, лімфокіни або епіподофілотоксин): вінбластин, вінкристин, віндезин, блеоміцин, дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин, ара-с, паклітаксель (ТахоїФ), мітраміцин, дезоксикоформіцин, мітоміцин-с, 1-аспарагіназа, інтерферон (переважно ІЄМ-а), етопосид або теніпосид. Цитотоксичним агентом може також бути навельбене, СРТ-11, анастразол, летразол, капецитабин, релоксафін, циклофосфатамід, іфосамід або дролоксафін.

ІО122| Цитостатичним агентом може бути агент, що уражає мікротрубки і перешкоджає мітозу клітин. Агентом, що уражає мікротрубки, може бути: алоколхіцин (МЗС 406042), галіхондрин В (МЗС 609395), колхіцин (МС 757), похідні колхіцину (е.9., МС 33410), доластатин 10 (МС 376128), майтанзин (МЗС 153858), різоксин (МЗС 332598), паклітаксель (Тахо, МЗС 125973), похідні Тахоко

(наприклад, М5С 608832), тіоколхіцин (МС 361792), трифенілметилцистеїн (МЗС 83265), сульфат вінбластину (М5С 49842), сульфат вінкристину (МЗС 67574), такий природний або синтетичний епотілон, як епотілон А, епотілон В або діскодермолід (див. бегмісе, (1996) Зсіепсе, 274:2009), естрамустин, нокодазол, МАРА або ним подібні. Агент, що уражає мікротрубки, може також бути таким як це описано в статтях: Виїйп5Кі (1997) У). Сеї!Ї сі. 110:3055 3064; Рапаа (1997) Ргос. Маї). Асай. 5сі.

БА 94:10560-10564; Мипйігайі (1997) Сапсег Нев. 57:3344-3346; Місоїаои (1997) Маїште 387:268-272;

Маздие? (1997) Мої. Віої. СеїІ. 8:973-985; Рапаа (1996) 9. ВіоІ. Спет 271:29807-29812.

ІО123| Цитостатичним агентом може бути також: епідофілотоксин; антинеопластичний ензим; інгібітор топоіїзомерази; прокарбазин; мітоксантрон; така координаційна комплексна сполука платини, як о цис-платина або карбоплатина; модифікатор біологічних реакцій; інгібітор зростання; антигормональний терапевтичний агент; лейковорин (фолінова кислота); тегафур; або фактор гематопоетичного зростання. (01241 Цитостатичним агентом може бути гормон або стероїд (включаючи синтетичні аналоги), а саме: 17-а-етинілестрадіол, диетистильбестрол, тестостерон, преднізон, флуоксиместерон, пропіонат дромостанолону, тестолактон, мегестролацетат, метилпреднізолон, метилтестостерон, преднізолон, триамцинолон, хлортриазен, гідроксилпрогестерон, аміноглютетимід, естрамустин, медроксипрогестеронацетат, леупролід, флутамід, тореміфен або золадекс.

ІО125)| Цитостатичним агентом може бути також такий антиангіогенний агент, як інгібітор матричної металопротеїнази, або такий інший МЕСЕ-інгібітор, як анти-МЕСЕ антитіло, або такі низькомолекулярні сполуки, як 206474 і 506668. Цитостатичним агентом може також бути анти-Нег2 антитіло фірми

Сепепіесії, такий ЕСЕК-інгібітор, як ЕКВ-569 (нереверсибельний інгібітор), або Ітсіопе антитіло С225, що може бути імуноспецифічним відносно ЕСЕБК, або а 5го-інгібітор.

ІО126)| Цитостатичним агентом може бути також Сазодехфб (бікалутамід, Авіга 7епеса), який може гальмувати проліферацію андроген-залежної карциноми; антиестроген Татохіїеп?, який може гальмувати проліферацію або зростання естроген-залежного раку молочної залози; або такий інгібітор трансдукції сигналу клітинної проліферації, як інгібітор епідермального ростового фактору, інгібітор

Не!-2, інгібітор МЕК-1-кінази, інгібітор МАРК:-кінази, інгібітор РіЗ-кінази, інгібітор 5го-кінази, або інгібітор РОСРЕ. Антибластомними агентами можуть також бути сполуки, зазначені в Таблиці 1 з Ш.5.

Ргомізіопа! Арріїсайоп Моб1/102,913 від 6 жовтня 2008 р., зміст якої включений тут шляхом посилання. р. Фотосенсибілізуючий агент

І0127| Фотосенсибілізуючий агент може бути сполукою, що абсорбована клітиною і що під час опромінювання світлом активується й спричиняє синтез речовини, яка здатна пошкодити або вбити клітину. Речовина може бути синглетним оксигеном або радикалом. Фотосенсибілізуючий агент може поглинати світло з довжиною хвиль від 500 нм до 1,1 мкМ. Фотосенсибілізуючий агент може бути одним з тих, що розкриті в патентах США Моб,693,093 та Ме7,018,395, зміст яких включений тут шляхом посилань.

ІО128| Наприклад, фотосенсибілізуючим агентом може бути зелений порфірин; поліпірольна гідрофобна макроциклічна світлочутлива сполука; ангеліцин; ліпофусцин; реакційний центр фотосистеми ІІ; БІ-02-суї Б-559 реакційний центр фотосистеми ІІ; халькоген-піриліумний барвник; хлор; хлорофіл; кумарин; ціанін; така ДНК-споріднена сполука, як аденозин, цитозин, 2'- дезоксигуанозин-5'монофосфат, дезоксирибонуклеїнова кислота, гуанін, 4-тіоурідин; 2'-тимідин-5'- монофосфат, тиміділіл(3'-5')-2'--дезоксиаденозин, тиміділіл(3'-5')-2'-дезоксигуанозин, тимін або урацил; такий лікарський препарат, як адріаміцин; афлоквалон, дигідрохлорид амодиахіна, дифосфат хлорохіну, гідрохлорид хіопромазину, дауноміцин, дауноміцинон, 5-імінодауноміцин, доксициклін, фуросемід, гільвокарцин М, гільвокарцин М, сульфат гідроксилхлорохіну, люмидоксициклін, гідрохлорид мефлохіну, меквітазин, мербромін (меркурохром), дифосфат примакіна, сульфат хініна або гідрохлорид тетрацикліну; флавін або таку відповідну сполуку, як алоксазин, флавіновий мононуклеотид, З-гідроксилфлавон, ліміхром, ліміфлавін, б-метилалоксазин, 7-метилаллоксазин, 8- метилаллоксазин, 9-метилаллоксазин, 1-метилліміхром, метил-2-метоксилбензоат, 5-нітросаліцилову кислоту, профлавін або рібофлавин; фуллерен, металопорфірин; металофталоціанини; похідні метиленового синього; нафтамід; нафтгалогенціанін; таку природну сполуку, як біс(4-гідроксил-3- метоксилфеніл)-І, б-гептадієн-3,5-діон, 4-(4-гідроксил-З3-метоксилфеніл)-3-бутен-2-он, М- формілкинуренін, кинуренову кислоту, кинуренін, З-гідроксилкинуренін, БІ -3-гідроксилкинуренін, сангвінарин, берберин, кармін, або 5;7;9(1);22-ергостатетрен-ЗР-ол; похідні нільського блакитного;

М5ЗАЇЮ (нестероїдний протизапальний препарат); апериленхінон; фенол; феофорбід; феофітин; фотосенсибілізуючий димер або кон'югат; фталоціанін; порфіцен; порфірин; псорален; пурпурін; хінон; ретіноїд; родамін; тіофен; вердінс; деякий вітамін; або ксантеновий барвник (Кейтопа і Сатіїйп,

Рпотоспет. Рпоїобіої, 70(4):391-475 (1999)). с. Приготування лікарських засобів

І0129| Поряд з зазначеними вище композиції можуть також містити щонайменше один такий фармацевтичне прийнятний інгредієнт, як алюмокалієві галуни, стабілізатори, антимікробні агенти, буфер, барвники, ароматизатори, ад'юванти тощо.

0130) Композиція може бути у вигляді таблеток або коржиків, які сформовані відомими способами.

Наприклад, таблетки і капсули для перорального застосування можуть містити звичайні формоутворювачі, не обмежуючими прикладами яких є зв'язуючи агенти, наповнювачі, змащуючи речовини, дезінтегранти і зволожуючи агенти. Не обмежуючими прикладами зв'язуючих агентів є сироп, гуміарабік, желатин, сорбіт, трагакант, крохмальний клейстер і полівінілпіролідон. Не обмежуючими прикладами наповнювачів є лактоза, сахароза, мікрокристалічна целюлоза, кукурудзяний крохмаль, фосфат кальцію і сорбіт. Не обмежуючими прикладами змащуючих речовин є стеарат магнію, стеаринова кислота, тальк, поліетиленгліколь і диоксид кремнію. Не обмежуючими прикладами дезінтегрантів є картопляний крохмаль і крохмальний гліколят натрію. Не обмежуючими прикладами зволожуючих речовин є лаурилсульфат натрію. Таблетки можуть мати оболонки, нанесені відомими з рівня техніки способами. 01311) Композиція може бути також рідкою, не обмежуючими прикладами якої можуть бути водяні або олійні суспензії, розчини, емульсії, сиропи і еліксири. Композиція може бути також вироблена як сухий продукт для компонування з водою або іншим придатним носієм перед застосуванням. Такі рідкі препарати можуть містити добавки, не обмежуючими прикладами яких є засоби суспендування, емульсифікатори, не-водяні середовища і захисні засоби. Не обмежуючими прикладами засобів суспендування є сироп сорбіту, метилцелюлоза, сироп глюкози чи сахарози, желатин, гідроксиетилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, гель стеарату алюмінію і гідрогенізовані харчові жири. Не обмежуючими прикладами емульсифікаторів є лецитин, сорбітмоноолеат і гуміарабік. Не обмежуючими прикладами не-водяних середовищ є харчові олії, мигдальна олія, фракціонована кокосова олія, естери на основі жирних кислот, пропіленгліколь і етиловий спирт. Не обмежуючими прикладами захисних засобів є метил- або пропіл-пара-гідроксибензоат і сорбінова кислота.

І0132| Композиція може бути також приготовлена як супозиторії, які можуть містити основи, не обмежуючими прикладами яких є кокосова олія або гліцериди. Композиція може бути також приготовлена як засоби для інгаляцій, не обмежуючими прикладами яких є розчин, суспензія або емульсія, які можуть бути уведені як сухий порошок або в формі аерозолю з використанням такого пропеленту, як дихлодифлуорметан або трихлорфлуорметан. Композиція може бути також приготовлена для трансдермального уведення у вигляді препаратів, які містять водяні або не-водяні середовища і не обмежуючими прикладами яких є креми, мазі, лосьйони, пасти, лікувальні пластирі, накладки або плівки.

ЇО133| Композиція може бути також приготовлена для парентерального уведення, не обмежуючими прикладами якого є ін'єкція або довготривале вливання. Композиції для ін'єкції можуть бути в формі суспензії, розчину або емульсії в олійному або водяному середовищі і можуть містити технологічні інгредієнти, не обмежуючими прикладами яких є засоби суспендування, стабілізатори і диспергатори. Композиція може бути також приготовлена в вигляді порошку для подальшого змішування з придатним середовищем, не обмежуючим прикладом якого є стерильна апірогенна вода.

І0134| Композиція може бути також приготовлена для формування депо із препаратів шляхом імплантації або внутрішньом'язових ін'єкцій. Ця композиція може бути створена (наприклад, в формі емульсії в прийнятній олії) з використанням таких придатних полімерних або гідрофобних матеріалів, як іонообмінні смоли або як погано розчинні речовини (наприклад, погано розчинні солі). 01351) Композиція може бути також приготовлена у вигляді ліпосомних препаратів. Ці ліпосомні препарати можуть містити ліпосоми, які проникають в потрібні клітини або в в5ігайшт согпеит, з'єднуються з клітинними мембранами і таким чином доставляють свій вміст у клітину. Наприклад, можуть бути використані такі ліпосоми, які описані в патентах США Мо5,077,211, Мо4,621,023 та

Мо4,508,703, зміст яких включений тут шляхом посилань. Композиція, що призначена для лікування ушкоджень шкіри може бути уведена до, протягом або після експозиції шкіри молочних залоз під ультрафіолетовим випромінюванням або дії агентів, здатних спричинити окислювальне ураження.

Іншими придатними препаратами можуть слугувати ніосоми. Ніосоми е ліпідними утвореннями, що подібні до ліпосом і мають мембрани, що складаються з множини неіонних жирів, форми частинок яких ефективні для перенесення сполук крізь зігашт согпеит. а. Дозування

ІО136| Терапевтично ефективна кількість агента, потрібного для терапії, змінюється залежно від природи обставини, що потребує лікування, тривалості часу, коли потрібна бажана активність, та віку і самопочуття пацієнта, і визначається лікарем, що веде пацієнта. Бажану граничну дозу зручно уводити одноразово, або поділити на дві, три, чотири або більше субдози на день, які уводять через відповідні інтервали. Багаторазове дозування нерідко бажане або потрібне.

І0137| Коли композицію уводять в комбінації із іншими терапевтичними засобами, її дози можуть бути відносно зменшені. Зокрема, застосування "засобів прицілювання" надає можливість зробити потрібні дозі відносно низькими. Але деякі композиції можуть бути уведені у відносно високих дозах завдяки таким (але не обмежуючим) факторам, як низька токсичність, високий коефіцієнт очищення крові, низький коефіцієнт розщеплення третинних амінів. Відповідно, дози композиції можуть бути від приблизно 1 нг/кг до приблизно 200 мг/кг, від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг, або від приблизно 1 мг/кг до приблизно 50 мг/кг. Дози композиції можуть бути вибрані в зазначених далі, але не обмежуючих інтервалах приблизно 1 мкг/кг - 1 мг/кг, або 1 мг/кг -100 мг/кг. 0138) Запропонований винахід має багато аспектів, які ілюстровані наступними не обмежуючими прикладами.

Приклад 1

Інгібування адаптивної реакції теплового шоку в комбінації із індукуванням цієї реакції може спричиняти загибель клітин

І0139| Цей приклад показує, що ефективність терапії, націленої на тепловий шок, можна суттєво підвищити застосуванням агентів, які блокують індукування реакції адаптивного теплового шоку, тобто запобігають запуску в ракових клітинах природного захисного механізму індукування шаперонів.

Адаптивна реакція теплового шоку може бути селективне блокована придушенням НЗЕ-1, що є головним посередником транскрипції, яку індукує тепловий шок. Інгібітори реакції адаптивного теплового шоку слід застосовувати в комбінації із сполуками або факторами індукування теплового шоку, які будуть підвищувати їх цитотоксичність. Ця цитотоксичність більш вірогідна і явно виражена для раку, оскільки ракова клітина у порівнянні з нормальними клітинами більш залежна від шаперонів. 0140) Цей приклад також показує, що протималярійний препарат акрихін (ОС), відповідна йому сполука 9-аміноакридин (9АА) й інші хімікалії, які належать до карбазолів (С2), діють як негенотоксичні вставки в ДНК, придушуючи функціонування деяких класів промоторів генів, індукування яких є наслідком активації сигналу трансдукції метаболічних шляхів. Дослідження реакції теплового шоку клітини в присутності цих сполук показує, що вони можуть придушувати опосередковану НЗЕ-1 транскрипцію в дозі, що практично незалежна від способу або агенту, використаного для індукування реакції теплового шоку.

ІО141|| Акрихін і 9АА були додані до культивованих ракових клітин для випробування дії цих сполук на активацію п5р70 у відповідь на обробку з метою індукування реакції теплового шоку. Ця реакція теплового шоку була індукована застосуванням відомих інгібіторів протеасом МО132 і бортезомібу,

РМАСІ17 (гелданаміцину) як інгібітору Н5РОО та теплової обробки (42-45 "С, 10-60 хвилин). Для відстеження реакції теплового шоку індукована ізоформа Нер/70 була виявлена Вестерн- імуноблоттінгом із застосуванням антитіла, яке розпізнає індуковану форму протеїну НОР70, і Нозерн- гібридизацією із застосуванням тест-препарату, що специфічно розпізнає мРНК індукованих генів

НЗР7ОАТ їі НЗР7ОВ'", але не розпізнає мРНК, що кодує нормально експресований НЗС70 протеїн. ОС і 9АА придушують індукування протеїну НОР7О (Фіг. 1А). Акрихін і ЗАА не знижували здатність МО132 або бортезомібу інгібувати активність протеасом (Фіг. 18), що свідчить про те, що дія ОС і 9АА не асоційована із інактивацією засобів індукування теплового шоку. Більш того, індуковані дублікати

Н5Р7О накопичуються в клітині, обробленій засобами індукування теплового шоку, але присутність акрихіну чи 9АА блокує транскрипцію (Фіг. 2). Поряд з аміноакридинами подібний ефект можна спостерігати при обробці клітини еметином, який є неспецифічним інгібітором трансляції (Фіг. 2). Це підтверджує, що спостережувана дія СС і 9АА є наслідком недостатності індукування протеїнів теплового шоку. 0142) Фіг. 1 показує, що акрихін (9С) та 9ЗАА перешкоджають синтезу протеїнів теплового шоку

Н5Р?ТО в клітині, яка оброблена інгібіторами протеасом. Екстракти протеїну з клітин НеГа, оброблені протягом 8 годин 5 мкМ інгібітору протеасом МО132 окремо або в комбінації із ОС чи 9АА, були досліджені із застосуванням антитіла до індукованої форми НЗР7О і до пірину (перевірка навантаження гелю) (Фіг. ТА). Результати дослідження іп міо активності протеасом екстрактів з клітин, оброблених МО132 окремо або в комбінації із акрихіном і 9АА, показують, що ОС і 9АА не впливають на інгібування протеасом під дією МО 132 (Фіг. 18). 01431 Фіг. 2 показує, що ОС і 9АА інгібують транскрипцію гена НЗР70 у відповідь на дію інгібіторів протеасом. 10 мкг сумарної РНК з клітин Неї! а були оброблені протягом 5 годин 0,1 мкМ бортезомібу (Вгі7), або 5 мм МОо132 (МО) окремо або в комбінації із 20 мМ ОС (Оціп), 20 мкМ 9АА або І мкм еметину (ЕМ). Результати були досліджені Нозерн-блоттінгом із тест-препаратом, специфічним щодо гібридизації НОР7ОАІИВ СЗАРОН слугував контролем навантаження РНК. Негр70(х) відображає індукування транскрипції Н5Р 70. 01441 Фіг. З показує, що синтез НОР70, індукований ОМАСІ17, був чутливим до дії ОС та 9АА. 10 мкг протеїнових екстрактів з клітин НеГа, оброблених протягом 5 годин 5 мкМ МОо132 (МО) або ОМАС- 17 окремо або в комбінації із акрихіном (Оціп) чи 9АА, піддали імуноблоттінгу із використанням антитіл до Н5Р70. Було знайдено відносне індукування експресії НеР 70 (іпа) (шляхом денситометрії).

ІО145| Фіг. 4 показує, що ОС та 9АА пригнічують транскрипцію гена Н5Р7ОА1/В", індуковану

РМАСІ17 та МО132, як це було встановлено Нозерн-гібридизацією 10 мкг сумарної РНК з клітин Нега, оброблених 1 мкм ОМАС17 протягом 5 годин окремо або в комбінації із 9АА. САРОН був використаний як контроль навантаження РНК. Неор7О(х) відображає індукування транскрипції НОР 70. 0146) Фіг. 5 показує, що токсична дія комбінації препаратів на клітини НеїЇа, як показали результати дослідження утворення колоній клітинами Неіа, що були оброблені протягом 6 годин протеотоксичним препаратом ОМАСІ17 (1 мкМ) в комбінації із різними концентраціями акрихіну (10 або мкМ). Клітини були зібрані, розбавлені 1:50 і досліджені щодо утворення колоній. Кількості колоній оцінювали після 7 днів зростання з використанням бромфенолового синього для фарбування і 10 95 формальдегіду для фіксації. Наведені дані є середніми для трьох експериментів. Індуктори теплового шоку ї ОС показали синергетичну цитотоксичність.

ІО147| Фіг. 6 показує результати експерименту, подібного до експерименту, ілюстрованого на фіг. 5, але обробка тепловим шоком (43"С, 30 хвилин) була замінена ОМАС17. Синергетична цитотоксичність була виявлена, коли ОС комбінували з нагріванням.

ІО1481 Фіг. 7 показує, що чутливість ракових (тобто не нормальних) клітин до нагрівання зростає під дією СОС та С (сполука СВІ 0137). КСС45 (карциномні клітини ниркового епітелію) і МКЕ-пТЕНТ (клітини нормального ниркового епітелію, імморталізовані трансдукцією теломерази) були суспендовані в культуральному середовищі, оброблені різними концентраціями ОС або сполуки

СВІ 0137 їі потім негайно нагріті на водяній бані при 45 "С. Тривалість інкубації на водяній бані показана на фігурі різними відтінками. Після нагрівання клітини були внесені в 96-комірковий планшет і інкубовані протягом 24 годин в присутності ліків, а потім додатково витримані 48 годин в вільному від ліків середовищі. Життєздатність клітин була досліджена з використанням тесту Сеї! Тег Віне (АІатаг

ВіІсе, фірма Рготеда). 0149) Фіг. 8 показує, що опосередковане 5іРНК зменшення компоненту нуклеарного комплексу

ЕАСТ, 55РТ1, і РАСТ-кінази СКІ! підвищило чутливість клітин до теплового шоку. Клітини НТ1080 були трансфековані пулами 5іРНК, створеними проти протеїн-казеїнкінази ІІ (СКІІ), 55РТТ1 і (для контролю)

САРОН (фірми ОПагтасоп) згідно з протоколом виробника. Після 24 годин всі клітини були внесені в б-комірковий планшет. Після додаткових 24 годин клітини в планшеті були нагріті на водяній бані до "С протягом 10, 15 і 20 хвилин. Життєздатність клітин була досліджена через 48 годин після нагрівання з використанням тесту СеїЇ Тег Віше (Рготеда).

ІЇО150| Ці результати показали, що комбінована обробка ракової клітини нетоксичними або слаботоксичними індукторами реакції теплового шоку за присутності в нетоксичних або помірковано токсичних концентраціях інгібіторів опосередкованої НОЕ-1 транскрипції забезпечує синергетичну цитотоксичність, яка є переважною для раку у порівнянні з нормальною клітиною. Молекулярний механізм інгібування опосередкованої НОЕ-1 транскрипції препаратами ОС, 9АА їі С7 асоційований із їхньою здатністю інгібувати активність нуклеарного хроматин-реконструктивного комплексу ЕГАСТ, який можливо є суттєвим для транскрипції, якою керують У5Е-1 і МЕ-КВ (Фіг. 8).

Приклад 2

Аміноакридини перешкоджають активації НОР 70 у відповідь на інгібування протеасом 0151) Цей приклад свідчить, що аміноакридини перешкоджають активації п5р70 у відповідь на інгібування протеасом. Порушення регулювання індукованих форм йп5р70 є характерною ознакою реакції теплового шоку на наступний протеотоксичний стрес, який є наслідком інгібування протеасом.

Дія деяких протималярійних препаратів на синтез п5р70, активований інгібуванням протеасом низькомолекулярним препаратом МО132, була досліджена в культивованих клітинах Неї а. Еметин і акрихін (92) придушували синтез п5р70 у відповідь на дію МО132 (Фіг. 9А). Суттєво подібний по структурі до ОС 9-аміноакридин (9АА) має подібний інгібіторний ефект на індуковану дією МО132 експресію Н5р70 (Фіг. 98).

ІО152| Еметин є інгібітором генетичної трансляції в цілому; тому його здатність придушувати індукований синтез п5р70 є, можливо, відображенням цієї властивості. Проте ОС і 9АА (як показано інкорпорацією мічених 355-метіонина і 355-цистеїна) не діють на синтез протеїнів в цілому в концентраціях, які достатні для повного придушення індукування п5р7о0 (Фіг. 9С). Це свідчить про те, що сполуки на основі аміносакридину придушують індукований синтез п5р70 внаслідок дії іншого, більш специфічного механізму. Як ОС, так і 9АА погіршували здатність МО132 інгібувати активність протеасом (Фіг. 90). Таким чином, ці препарати не здатні блокувати індукування п5р70, лише заважаючи розвитку протеотоксичного стресу із-за інгібування протеасом.

ІО1531| Інгібіторна дія ОС на індукцію п5р70 була розпізнавана на рівні мРНК, як показано Нозерн- гібридизацією РНК з клітин НеГа, оброблених МО 132 або іншим інгібітором протеасом - бортезомібом - у присутності або без ОС (Фіг. 9УЕ). Використаний в цьому експерименті тест-препарат гібридизації був специфічним до індукованого мРНК й5р7бАЇї і не розпізнавав мРНК, що кодує конститутивний протеїн п5с70. Ці дані свідчили про те, що ОС придушував акумулювання п5р/0 мРНК за умови інгібування протеасом. Цей ефект був наслідком скоріше репресії транскрипції ніж стимулювання деградації п5р70 мРНК, бо додавання ОС після індукування НЗК не діє за умови надлишку п5р7о

МРНК. Інгібіторна дія ОС і 9АА на експресію гена не була універсальною. Наприклад, індукована 7псСіг активація транскрипції гена металотіонеїну не порушувалася цими сполуками за умови, що вони не відміняють індукування п5р70 мРНК (Фіг. 9Е). Крім того, ОС і 9АА обидва спричиняють потужне індукування транскрипції цільових генів роз.

Приклад З

Акрихін блокує індукування реакції теплового шоку шляхом інгібування НОРОО або гіпертермії

ІЇ0154| Цей приклад показує, що акрихін блокує реакцію теплового шоку (НЗК), індуковану інгібуванням йп5ро0 або гіпертермією. Функціональна інактивація п5ро0 гелданаміцином або його похідним 17-ОМАСЄ індукує протеотоксичний стрес і активує НОК, включаючи синтез п5р70. Як показано на Фіг. У щодо протеотоксичного стресу, індукованого інгібіторами протеасом, ОС і 9АА також придушують індукування п5р70 у відповідь на інгібування п5роо, і це видно на рівні транскрипції (Фігури 10А ії В). Оскільки ОС ії ЗАА ефективно придушують активовану 17-ОМАС транскрипцію гена п5р70ОАЇ, вони не впливають на рівні деяких інших (не індукованих 17-ОМАСЄ) мРНК, включаючи контролі ЗАРОН, рб5омеїА, і СКРОА (Фіг. 100).

ІО155| ОС був також ефективним в блокуванні індукованої гіпертермією НУК, як це ілюстровано

Фіг. 100. В цьому експерименті активність фактору транскрипції НЕЇ, який визнаний суттєво важливим для індукування експресії п5р70 протягом Н5Е, була безпосередньо досліджена. Клітинні генератори Н5РЇ були запущені інфікуванням клітин Не а лентивірусним генераторним конструктом, що містить ЕСЕР сДНК, під управлінням промотору, чутливого до Н5Е. Після обробки бортезомібом, 17-ОМАС або гіпертермією, був індукований виявлений з використанням флуоресцентного мікроскопу залежний від Н5РІ синтез ЕСЕР. Сумісна обробка генеруючих клітин ОС та одним з трьох інших різних індукторів протеотоксичного стресу блокує акумулювання ЕСЕР. Ці результати показують, що протималярійний препарат ОС є потужним інгібітором НЗК.

Приклад 4

Акрихін пригнічує функцію нуклеарної транслокації Н5Е1 і зв'язування ДНК

І0156| Цей приклад показує, що акрихін пригнічує функцію нуклеарної транслокації Н5Е1 і зв'язування ДНК. Активація опосередковуваної НЗЕ1 транскрипції потребує вивільнення Н5Е1 з його комплексу із НЗБРОО в цитоплазмі. Це відбувається утворенням гомодимерів і гомотримерів НЗРЇ, які переміщуються в ядро і приєднуються до специфічних сайтів розпізнавання НЗЕЇ всередині промоторів генів, індукованих протягом теплового шоку. Вплив ОС і 9АА на цей процес був досліджений, щоб визначити точку, від якої ці сполуки діють для інгібування функціонування Н5РІ. Для оцінювання внутрішньоклітинної локалізації і здатності ДНК до зв'язування комплексів НОЇ був виконаний тест електрофоретичної рухливості на зсув (далі ЕМ5А) з використанням протеїнових екстрактів, очищених від цитоплазми або ядер клітин і підданих протеотоксичному стресу окремо або в комбінації із ОС або 9АА. Результати цього експерименту показані на Фіг. 11. Обробка клітин Неї а препаратом МО132, тепловим шоком або препаратом 17-ОМАС призводила до специфічної активації

ДНК щодо зв'язування Н5РЇ як в цитоплазматичних (Фіг. 114А), так і в нуклеарних екстрактах (Фіг. 118).

ОС ії 9АА не змогли зменшити або модифікувати виразність цих ефектів за будь-якої випробуваної концентрації (до 100 мМ) (не показані дані і Фіг. 118). Ці результати показали, що інгібування залежної від НОРІ транскрипції застосуванням ОС і 9АА спостерігається нижче точки її цитоплазматичної активації, нуклеарної транслокації і зв'язування ДНК.

І0157| Встановлення того, що ОС і 9АА пригнічують нуклеарну транслокацію Н5БРЇ, наводить на думку, що ці сполуки самі по собі локалізувалися щонайменше в частині ядер клітин. Це підтверджують результати, отримані з використанням експериментальної модуляції їх розподілу всередині клітини.

Бафіломіцин як націлений на лізосоми антибіотик може помітно змінювати внутрішньоклітинне розподілення лізосомотропних сполук, включаючи акрихін і хлорохін, інгібуванням лізосомальної ІН--

АТфФази. Обробка клітин Не а бафіломіцином призводила до зміни у внутрішньоклітинній локалізації

ОС від переважно лізосомальної до переважно нуклеарної (Фіг. 11С), що було встановлено з використанням флуоресцентного мікроскопу (бо ОС і 9АА є природно флуоресцентними сполуками).

Був також досліджений вплив обробки бафіломіцином на чутливість індукування й5р70 до ОС.

Бафіломіцин підвищив ефективність ОС як інгібітору Н5К в клітинах Не а, оброблених МО132, як це показано на фіг. 110. В присутності зазначеного антибіотика 5 мМ ОС інгібували синтез п5р7о ефективніше ніж 20 мМ ОС за його відсутності. Ці результати виявили, що інгібіторна активність ОС відносно транскрипції, опосередкованої Н5БРЇ, залежить від його концентрації в ядрах.

Приклад 5

Комбінація акрихіну з протеотоксичним стресом, що індукує апоптоз

ІЇО158| Цей приклад показує, що комбінування акрихіну із протеотоксичним стресом індукує апоптоз. Реакція теплового шоку (Н5К) є адаптивною для виживання і може захищати клітини від різних токсичних факторів. Швидке акумулювання таких індукованих шаперонів, як п5р70 і п5рг27, є показовим свідченням попередження загибелі клітин під дією теплового шоку або інгібіторів протеасом чи п5р90. Тому здатність ОС і 9АА придушувати індукування протеїнів, кодованих генами Н5РЕЇ, може значно підвищувати цитотоксичність протеотоксичних стресів. Клітини Неї а були оброблені 17-ОМАС або бортезомібом окремо або в комбінації із ОС, і були досліджені ефекти виживання клітин і індукування апоптозу. На фігурах 4А і 48 відповідно показано, що ОС суттєво підвищив токсичність 1 7- рМАС і бортезомібу. Комбіноване застосування ОС в концентраціях, що зменшують виживання клітин менше ніж на 5095 і практично не токсичних концентрацій 17-0ОМАС або бортезомібу викликає драматичне зниження кількості культивованих клітин.

І0О159) Було також досліджене, чи впливає індукування апоптозу на кількість живих клітин після обробки ліками. Апоптоз відстежували по каспас-специфічному розщепленню продуктів кератину 18 і

РАКР. Узгоджені дані про виживання клітин показують, що комбінована обробка ОС та або бортезомібом, або 17-ОМАС потужно активувала каспас-опосередковане розщеплення протеїнів, яке було ледь-ледь розпізнаваним, коли препарати використовували окремо (Фігури 12С і 120). Каспас- інгібітор 2МАЮО-ЕМК облокував цей ефект повністю, що підтверджується випадками каспас- специфічного протеолітичного розщеплення (Фіг. 12Е).

ІО160) Для з'ясування, чи відіграє інгібування індукування п5р70 критичну роль в опосередкованій

ОС сенсибілізації клітин до бортезомібу і 17-ОМАС, були порівняні результати застосування ОС і альтернативного метода придушення йп5р70. Клітини Не а були трансфековані 5іРНК, спеціально створеною проти індукованої форми Пп5р70. Трансфековані клітини були нездатні синтезувати індукований п5р70 після обробки інгібіторами протеасом або п5роо (Фіг. 1203). Нездатність до синтезу пй5р70 за умови протеотоксичного стресу активувала апоптозну реакцію, подібну до реакції, спричиненої комбінованою обробкою ОС і агентами індукування протеотоксичного стресу (Фіг. 120).

Подібність біологічних ефектів падіння й5р70, опосередкованого 5іРНК і викликаного обробкою препаратом ОС, відносно чутливості клітин до бортезомібу і 17-ОМАС наводить на думку, що комбінування токсичності ОС і індукторів протеотоксичного стресу опосередковано придушенням НОК акрихіном ОС.

Приклад 6

Антибластомний ефект від комбінації акрихіну із інгібітором НБ5РОО

ІО161| Цей приклад показує, що комбінування акрихіну із інгібітором п5ро0 має антибластомні ефекти. Виявлення того, що комбінування ОС із препаратами-індукторами протеотоксичного стресу має потужну токсичну дію на клітини Нег/ а іп міго наводить на думку, що такі комбінації можуть мати значний потенціал в протираковій терапії. Для дослідження можливості лікувальної дії комбінації

ОС/17-ОМАС на розвиток пухлин іп мімо були перевірені дві сингенні моделі раку на мишах, а саме: фібросаркома МСА205 і меланома В-16. Як індуктор протеотоксичного стресу був використаний 17-

ОМАС, який показав обмежену монотерапевтичну антибластомну ефективність. Спочатку був досліджений вплив 17-ОМАСЄ і ОС на індукування Н5К (Фіг. 13А) і виживання (Фіг. 138) в клітинах

МСА20О5 і В-16 іп міо. Обидві лінії клітин реагували на ліки подібно до клітин НегГа, показуючи, що ці моделі можна надійно застосовувати для перевірки антибластомної активності комбінації ОС/17-

РОМА. Для підтвердження того, що ці ліки подібним чином впливають на індукування Н5К в пухлинах, що ростуть іп мімо, клітини МСА20О5 імплантували мишам лінії С57ВІ /б, а пухлини, що виникли, були оброблені одноразовою внутрішньо-пухлинною ін'єкцією фосфатно-сольового буферного розчину (контроль), 25 мг 17-ОМАС окремо та 1,25 мг ОС разом з 25 мкг 17-ОМАО. Після чотирьох годин мишей забили і видобуту з ізольованих пухлин РНК дослідили на індукування п5р70. Як показує

Фіг. 13С, обробка 17-0ОМАС індукувала синтез п5р/70 в вирощуваних іп мімо пухлинах, а ОС перешкоджав цьому індукуванню. Для дослідження дії комбінацій ліків на вирощувані іп мімо пухлини мишам-носіям пухлин МСА20О5 (Фіг. 1303) та В-16 (Фіг. 13Е) зробили внутрішньо-пухлинні ін'єкції ОС і 17-ОМАС окремо або в комбінації. Розміри пухлин після ін'єкцій ліків вимірювали регулярно (кожні 2 добиї). В обох експериментальних моделях, де ОС і 17-ОМАС були використані окремо, виявили незначні антибластомні ефекти (в затриманні зростання пухлин), тоді як їх комбінації перешкоджали зростанню пухлин. Розміри пухлин вимірювали протягом 24 діб після ін'єкцій. Пухлини, оброблені ін'єкціями одного препарату, почали переростати пухлини, оброблені ін'єкціями обох препаратів, на 16-ту добу для клітин В-16 і на 18-ту добу для клітин МСА20О05 (фігури 13А і 138). Застосування комбінації ОС/17-ОМАС не тільки перешкоджало зростанню пухлин, а й викликало їх регресію, скорочуючи об'єм від -50 мм? до непридатного для визначення. Ці спостереження показують, що комбінування ОС із індукторами протеотоксичного стресу викликає апоптоз.

Приклад 7 Способи 1. Культури клітин, лентивірусні вектори, трансфекція 5іРНК та ліки

ІО162| Клітини Неіа були культивовані в середовищі Юшрессо, модифікованим середовищем

Еадіє5 (Іпийгодеп/зірсо ВК, Сагізрад, СА) з додаванням 10 95 фетальної телячої сироватки. Клітини мишачої меланоми В16 і фібросаркоми МСА205 були вирощені в цілісному середовищі КРМІ-1640 з додаванням 2 мМ І-глютаміну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 100 од./мл пеніциліну, 50 мкг/мл гентаміцину (те ТесппоЇодіеє5, Стгапа Ізіапа, МУ). Експресія ЕСЕР, специфічного щодо Н5ОЕ1, була викликана уведенням у РТК-тСММУ-ЕСЕР лентивірусний вектор зліва від мінімального промотору СММ (цитомегаловірусу) шести копій 5 САСААСОТТСТАС 3 (5ЕО ІО МО: 1) як регуляторних елементів

Н5Е1 (Н5Е). Клітини були на ніч інфіковані лентивірусом МОЇ 10 в присутності 4 мкг/мл полібрену.

Ефективність інфікування визначали по експресії ЕСЕР у відповідь на тепловий шок при 43 "С протягом 60 хвилин. Від 70 до 90 95 клітин були інфіковані вірусом і експресували СЕР у відповідь на тепловий шок.

ІО163)| Клітини Неї а були трансфековані п5р70 5іРНК (Запіа Сти? Віотесппоіоду, Запіа Сти7, СА) на 24 години для інгібування експресії й5р70 після обробки ліками. Контрольні клітини були трансфековані зіРНК-А, неспецифічною до п5р-70 (Запіа Стги?7 Віоїесппоіоду, Запіа Сти7, СА). Клітини були оброблені, як це описано в тексті, інгібіторами протеасом МО132 (СаїІріоспет, Зап Оіедо, СА) і бортезомібом (ІС Іарогагогіе5, УМоригп, МА), інгібітором п5ре0 17-ОМАа (І С І арогаютіевз, Мови,

МА), акрихіном, еметином, хініном, хлорохіном і ЗАА (всі від фірми Зідта, її. ГІоціб5, МО).

Гіпертермію/тепловий шок виконали інкубацією при 43 "С протягом 1 години. 2. Вестерн-імуноблоттінг

І0О164| В КІРА-буфері (150 мМ Масі, 1 95 додецилсульфату натрію, 10 мМ Тгтгі5 (рН 8,0), 1 95 дезоксихолату натрію, 1 95 МР-40) були приготовлені збірні екстракти протеїну з клітин Нега, що містять суміш інгібіторів протеази (Зідта, 5. Гоці5, МО). Протеїнові екстракти були розділені електрофорезом в поліакриламідному гелю з плавним перепадом концентрацій 4-20 95 з добавкою додецилсульфату натрію (Іпмігодеп/Момех, Сагізрай, СА) і потім перенесені на нейлоно- полівініліденфлуоридні мембрани РМОЕ (Атег5йпат, Різсаїаужау, МУ). Мембрани були попередньо інкубовані вночі в 5 95 розчині молока і потім інкубовані протягом 1 години в 1 95 розчині молока з розчинами первинних антитіл 1:1000. Як первинні антитіла були застосовані кроляче антитіло проти індукованих форм п5р7бАЇ (Аззау Юезідп5/5іге55беп, Місііа, ВС, Сапада) і щуряче апіі-Н5ОРІ (Аззау

Оезідп5/5ігез55(сеп, Місіогіа, ВС, Сапада). Контролі навантаження протеїну виконали зі щурячим антипіриновим антитілом (Іпзійшцї 7аг Віоспетіеє дег І пдм/ід-Махітіїйапе-Опімег:йца: Моипспеп, Септапу) і кролячим антикератиновим антитілом К18 (Вигппат гезеагсп Іпбзійше, СА). Апоптоз виявляли по каспас-специфічному розщепленню К18 (Вигпйат гезеагсп Іпзійше, СА) і РАКР (антитіло від Запіа

Сти? Віоїєснпоіоду, Запіа Сти7, СА). НАР-сполучені вторинні протикролячі, протищурячі і протимишіні антитіла були закуплені у бЗапіа Стги7 ВіоїесппоІоду. ЮОеїесіоп геадепі (ЕСІ), що є представником

Режіп ЕіІтег (5пейоп, СТ). 3. Нозерн-блоттінг і гібридизація

ІЇО165| Сумарну РНК (10 мкг) з клітин Неіа, В-16, або МСА205 досліджували Нозерн блот- гібридизацією з тест-препаратами, специфічними щодо генів п5р7бАЇ, МТ, ре5КеїіА, СКРО4 і САРОН.

Фрагмент РСК був створений з п5р7бАЇ СсДНК (Іпмігодеп, Сагізбрайд, СА) з праймерами, специфічними щодо п5р7ОАЇ, який кодує послідовність (АІ5: 5 ССА ССА ТОС ССА ССА дОаС АСА ССЗ (5ЕО І МО: 2);

Аа: 5 САТ БАА ССА ТСС ТСТ ССА ССТ 3)(5БО ІО МО: 3). Всі позосталі тест-препарати для гібридизації були створені рестрикцією травної ендонуклеази з клонів СДНК (ОКІСЕМЕ).

ІО166)| Помічені 355-протеїном клітини Нега іп мімо були оброблені ліками та їх комбінаціями згідно з протоколом експериментів. Нормальне культуральне середовище було замінено на середовище, вільне від метіоніну і цистеїну з додатком 355-метіоніну і з55-цистеїну (50 міллікюрі/мл) (Мем/ Епдіапа

Мисіеаг/Регкіп ЕІтег, 5пейоп, СТ), і клітини були інкубовані додатково на 60 хвилин в присутності ліків.

Екстракти цитоплазматичного протеїну були приготовані згідно з протоколом Оідтап. Помічені протеїни були досліджені електрофорезом в 10 95 гелю поліакриліміду і ауторадіографією. 4. Тестування протеасомної активності іп міго

ІЇО167| Для визначення ефективності інгібіторів протеасом МО132 і бортезомібу окремо і в комбінації із ОС і 9АА, ми обробили клітини Не а зазначеними ліками протягом 4 годин, очистили цитоплазматичні протеїнові екстракти і проаналізували активність протеасом з використанням флуорохромного протеасомного субстрату 1 (СаІБіоспет, Зап Оіедо, СА). 5. Тест електрофоретичної рухливості на зсув (ЕМ5А)

ІО168| Активність ДНК у зв'язуванні Н5ЕЇ була досліджена з використанням ЕМЗА. Коротко, цитоплазматичні і нуклеарні екстракти протеїнів були очищені згідно з протоколом Оідтап від контрольних клітин Нега і клітин НеГа, оброблених МО132 або 17-ОМАС окремо або в комбінації із

ОС або 9АА. Далі 10 мкг кожного протеїнового екстракту були проаналізовані з використанням З2р- міченого дволанцюгового олігонуклеотиду (5 ТтТос-АпО-ТАС-ААС-СТТ-СТА-САА-ЯаСТ-ТСТ-АсС 3)(5БЕО ІО МО: 4), специфічного для зв'язування Н5Е1. Для порівняння 50х надлишок непомічених олігонуклеотидів був доданий до протеїнових екстрактів разом із З"Р-міченими дволанцюговими олігонуклеотидами. Протеїнові екстракти були попередньо інкубовані із специфічними до НЗЕ1 антитілами (А5ззау Оевзідп5/5ігез5беп, Місіопа, ВС, Сапада) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі перед додаванням З"Р-міченого дволанцюгового олігонуклеотиду для виконання ЕМ5А. 6. Тестування життєздатності клітин

ІО169| Для визначення цитотоксичністі ліків та їх комбінацій був застосований тест на виживання клітин. Клітини були вирощені до злиття 75-80 95 і потім оброблені протягом 4 годин різними композиціями 1 мМ 17-ОМАС, 0,1 мМ бортезомібу і 10 мМ або 20 мМ ОС. Клітини були оброблені трипсином, розбавлені 1:50 і посіяні в б-комірковий планшет. Виживання клітин визначали через 72 години після фарбування метиленовим синім і фіксації 10 95 формальдегідом. Метиленовий синій був екстрагований 0,1М розчином НС, і його спектральна поглинальна здатність була виміряна при 560 нм. 7. Тестування іп мімо розвитку пухлин у мишей

0170) Клітини МСА205 ії В-16 були відокремлені від пластикових чашок Петрі за допомогою 0,5 95 розчину трипсину і етилендіамінтетраоцтової кислоти, відмиті і ресуспендовані в стерильних фосфатно-сольових буферних розчинах. Ці клітини були уведені мишам лінії С57ВІ /6 крізьшкірно в оголену абдомінальну зону (3 х 109 клітини в одній ін'єкції на одну мишу). Пухлини були виміряні в двох напрямках та їх об'єм був розрахований по формулі: М мм" - довжина пухлини х (ширина пухлини). На восьму добу після імплантації пухлини типовий об'єм був «50 мм3. Мишей-носіїв пухлин поділили на чотири групи по п'ять тварин кожна і з 9-ї доби піддали внутрішньо-пухлинним ін'єкціям ліків. Контрольна група отримувала ін'єкції лише фосфатно-сольових буферних розчинів на 9, 10, 11 ї 12 добу. Миші в групі 2 отримували ін'єкції 1,25 мг ОС в фосфатно-сольових буферних розчинах на 9 і добу. Миші в групі З отримували ін'єкції 25 мкг 17-ОМАС в фосфатно-сольових буферних розчинах на 9, 10, 11 і 12 добу. Миші в групі 4 отримували ін'єкції 1,25 мг ОС-25 мкг 7-ОМАС на 9 і 10 добу та 25 мкг 17-ОМАС на 11 і 12 добу. ОС був уведений тільки двічі, бо цей препарат є стабільним всередині клітин. Він може бути виявлений в клітинах за 72 години після уведення і заміни середовища. Пухлини вимірювали кожні дві добі після ін'єкцій ліків протягом 24 діб. Тварини з об'ємом пухлин 500 мм3 і більше були піддані евтаназії.

Приклад 8

Комбінування неефективної дози акрихіну і локальної гіпертермії забезпечує антибластомну дію на мишачій моделі

ЇО171| Цей приклад показує, що комбінування неефективної дози акрихіну із локальною гіпертермією виявляє в модельних експериментах на мишах антибластомний ефект. Модельні пухлини з клітин карциноми товстої кишки мишей С26 були сформовані і розвивалися в сингенньх мишах лінії ВаІБ/с. Коли пухлини сягали об'єму 50-150 мм3, мишей лікували орально акрихіном (500 мг/кг), або локальною гіпертермією (1 година при 41,5 "С) або тим та іншим (акрихін уводили за 2 години перед гіпертермією). Після п'яти днів пухлини були виміряні, і ці результати показані на Фіг. 14 з розрахунками статистичної вірогідності спостережуваних розходжень. Комбіноване лікування показало явні переваги в досягненні антибластомного ефекту у порівнянні із роздільним лікуванням.

Приклад 9

Карбазол перешкоджає експресії НОР 70 у відповідь на протеотоксичний стрес (далі ПС)

І0172| Цей приклад показує, що карбазол може перешкоджати експресії п5р70 у відповідь на ПС.

Оскільки аміноакридини (АА) ефективно перешкоджають експресії п5р70 у відповідь на різноманітні індуктори ПС, специфічна активність цих сполук не дуже значна. Вони є активними в мікромольних концентраціях. З метою винайдення реагентів, ефективніших за АА, були досліджені сполуки зі структурою, подібною до АА. З метою перевірки здатності карбазолів (СЕКВ2) зменшувати експресію п5р70 у відповідь на ПС, клітини були оброблені Мо132 і різними кількостями декількох СКВА з наступним аналізом експресії п5р70 шляхом Нозерн-блоттінгу. СКВА Ме159 і Ме198 виявили активність в цьому експерименті. Вибрані сполуки Ме159 і Ме198 були активними, починаючи з концентрації 1 мкм (Фіг. 153. СКВЛ Мо198 був ефективним інгібітором специфічної щодо НЗЕ1 експресії СЕР в клітини, обробленій бортезомібом (Фіг. 16), а СКВ; Мо159 і Мо198 були активні в інгібуванні експресії генератора СЕР у відповідь на гіпертермію (Фіг. 17). Таким чином, СКВ. можуть підвищувати токсичність ПС з кращим терапевтичним індексом, ніж АА.

А.

КО тт т т от пов о шин 12. с п -- 8 ро пишна !

З. ЩІ. 1 -пірин в а М В !

СПИНКИ ПИ АКУЛИ МИ Н

Ме (п) -8 В 8 4 -

ОціпімкМ). - 20. . 20 юю . !

ЗАА(МКМІ. 00000. - а. в.

В

2 МОЗ де ш- ШЕ е и. шщ о 4 щ. ве а. ше. жен ши ше ш ш щ в й 4 4

М (А) Щ й т

Оціп іМмкМІ - -030- 20 -

ЗАА (МКМ - --14 8 - 20

Фіг. 1

УМО я Е о он хо ОО Й 3 шиіп(в)- -5 я -

ЕМВ) - -я 5 я - !

ЗВАНІ 0000-00 - -- З

Нертосхиї 181 55 фіг. 2 че ее нені по є ввото 0 ОБ

ШИНУ - - жи - - З -

ЕЕ: Ше нн ни нн нн : їв ї 25 2 1 Б З їх :

Фіг. З шини ВН ння ни В НН ОН пов ня 0 ща «Берт нн Он не 3 я» ТРЕК

ПЛОФШИЦИї-оКННИ -ТПКТК Ї. ЛАККВНН КК Я х пе КН шо ПЕ

ВН я НЕ ВВ Ко ик ПЕОМ Е в о НВ В ОК У

ПИШЕ ТПУ ТИКИТИ КЕ ШИ ЕОШИИНИМИ У ДИВ ПИТИ ПИШИ ТА ПП ЛПУ МИИНОМИ Я ПИВ КИ

ПОН НМУ - т - - З З З

У Яе т Я - о - - Я

ЗАЛіЦКІ є - - й - - У каві хр Я їі ї і Ії З

Фіг. 4

Е І. Я же 1 кб о І т 1000 ще ; я З Я

ЕЕ ї т ща. КО а В ХХ С .. ММ КОХ КЕ КОХ се нннан ш. щ

ЗО КУ Ко ММК й с оа у ль рах Г.

ОМА 0 чінкМм) Тімкімі 1інкімі -е те

Оціп - - ЦКМ ТФ(нкМЕ 20 кМ) Тотем)

Фіг. 5 лах

ТЯ кумумувов на вн В К ОК К и К КВ К но ки ВвнЕ

ШШЛІЛИЛИ НИК Ки

РОК о В В

ТОБІ ОО КК КК ОК о о КК о

Тем СЕ В я

Кох о В В В НВ В В НЯ

КЕН о В В ПППК МНН й ду КН о ЕМВ ни

ВИ ОЖеМ ОО МОУ ОО ММІМ КК я ООЕКИКО НОВ о в НЯ ПК я

КИ ОКО ОК Ки ОККО ОКУ УКУКоЯ рей ПЛИНИ ПИЛИ ЕНН ни Кеш ПИ ЛИ ИННКШНИВ пи

ВВ ЕД о В НИ у ре ПЕН ПКП ЕНН ОККО Кен ПИЙ

МО ЕНН, ПМ КН НН нн ПИМННИИ В ПКНКНИЙ

ШЕ КИ о я НИК ПЕН

ШЛЕКНН МоМОВния ОО ння оон СИНКООЙ -о МЕНЯ ня о Кен ПИ

ОВ КЕКВ КК КВК КК ЕК СЕК

ПИВ КеОО Я ПКП КК ННХ КМ

ШКО НИДЕ оо я Коониоя ПЕ

ГК ОКУ ОВ РОК БУ тд КЛИН ПАНИ В Ко в ПИКА КК

М ЕК ПАНИ НК КК ОО Со

М КОНЯ МЕМ В ПЕ ПИМНОЇ

ШК Коня ПИ ня Коня ЕКО у КЛЕЩОЙ ЕНН ЕНЕЦКН СО 0 МОЯ Ме СКСШИ дрож ХАН ОХОТИ ПАКТ ДК КВК ІК п щи Оса НЕ сер, и

Б МО Мат ів ОК Ки : несеаз : : Кт коневі : : о В В В КВ : : ОВК Ки ОК Мо : : КУ си : : Ел А В ОН ВН : : - ШИНКИ КК : : - ПО В В : : ли ОК пня : ч- УК ПОКИ КЕН К : й ше 1! : ов в А : 1: : КК и Рнежнно МІ : ОН КВ КК Кв В нс ВУ: : и М : 1: : ООН В ОН : 1: : т о в в : шо НИ

НИ ІННИ ЯН

: ее, КО ОО я В : : - я М в : : нн : : пе в : : - В В Ко ВО : : й ВЕК В КО : : р Кк КК КН ВК В : : « д Кк 4 «жк : : Ч КУ ру В З 15 КУ : ши АН :

КЕПИН ПН :

М :

КОДОМ о :

Фо: ЕН Я : ща ЛО ЗАМКА ня : - ПОВ В В КК Я : і- МОБ НН В КИ : ч- ОК Я : и в НИ щої че ПО КК о и : М

ПО ОН В НОЯ : Не

Нирки ММК НКИИННК хокею МК р ВАК ПДК в : Не

ОО В КВ : шк: т ОВО в ко в о о ВО Я вин ет еВ о и : ще! чинна а (де М НМ М М рин КК и и : о ОВ В : --а В Я :

Я в Я :

ПА о :

ЕОМ БЕК ДИНИ КК : т-а ІОН о о В : їш ЕИКЦИН НН КМ н, :

МО ВЕК, :

На : й ти тя ї - чи їй : г х я. БУ ї 1К хе :

Фф ІГ. ?

Ге : :

Н рай меле Ми ММ и им МУ Мих Н : М о о о о о Я : ОО Я : МИТО КН ОВ КК КК НЕО : : М щі МОШОНКИ КПК КЕ : : АК о : : НН ОМ КК : : о В Ко : : І- ШЛИМрИИШИ МИ и КН ев НИ Ки Кв и Н : п шк ОО Ку Н : Гі ОО в о ; : ИН мн : ТЛ ВАМ КК : мн : Ж ПО СО Н М Н : о ; : : Ї пі КОКО в А КК Гоа КО : рек и в : й У : ТОБ Кв в : : : М щі ЕК с же Б : КН В В ОН Я Я : Гі й ОО ОО и рон ВЖК : пе в в ї Не НК : їй ПЕН НН нення : Я : : ШЛЕТИМКНИМ НИ в КИ : : т ЩЕ ШВИ ПОМ ШИН КІМН Е НИМИ Н М КМИН МН ШЕ Н : НН В : : и : : - ОО :

Н «ДПИЕЛИМИНИККИНИ ШИ ПК ОО Я Я : ОК НО : : п в Я : щ ЗЕ 54 па Б «2 ї : ш ЕЕ ха ЩЕ я ї з : їх : ЕН НК ЕН НВ Я

Н МИШКИ Я

: т ОККО КВ В В : : Е ЕК в Я : МН М і : а НН : : І- поко РК нене Кен Н

Н п ше МИШКИ е О :

Н | я ПИЛОК в рт : НО ВЕ шо : Ва ВОЛОКОН КН КД пиллефсляло ЦЕ ; : ОО ОК : : : КАК ооо ЗК в о о о : сії : Гл ті ПО КК Я нео ЩЕ ЇЇ : Я : : : Пе В НО : - УНН : ОК В : :

Н її КО і М : я Уч : й судо МА НН ом нн ни В : ев в М Я і :

Н МИПЕТИМИМИНИИ ИН пив МИ ИН М, Калини

Н ОН В в с я ОКА У

Н т ОН Н : г ОБ НН о : : КД НИВКИ КН ї : МЕ о в о Кв в В нев :

Н хх ШИНКИ Ки ери Н : ОО В В : : Га ПК Я : ТУКА : : х пе 4 т -к -е : : й п ГК 5 8 1 1 : " з

Фіг. 7 (продовження тв " Я Я х ! і НТІОЗО0, Я С !

Толя - Е ї :

Рон кЕЛІТННИ НК, Як. :

ШЕ : : НІ В НЯ :

Я ДИКЕ НК нн : : тки ШЕ Не веИШНИАх : : ре ОН КК Кв КК ння : : «З В в Н о же: ОО я и М и :

Н Ге ШОН МОВ ОК я : : КО В В В о о С о В В В : : ОО ОН Я : : ПО о В КО Я : : - з ОН НН В я : : Ф КО В

Н ЕНН КК Ки Кн й о оо в хіли п

Н Ж ОО В В З ана: Ва екентрель: : - ПИ о и т:

Н с о ОО СОН и : ШО ОК В НК иа ВН : воду ВЕЛИ КК КОШИК ТВА НЯ : Шйй оо и о ОНИ НН : КН в и КИ охоакяос, НН : - о М В Кв ОЙ ЗКУ : -- в В о НН : ї- ШК :

Толя х В : : НН КО КВ В В В КВ Ви : : Г- В В В В КН Я : : шЕ ПИЛКИ КВН НН, : : Ко В ес : : ОК ОО :

Н ШО Я Н

: ТД КК КВК КК КЕ : : ШО ЗО Дн, : : о : : Кт ПИПИСИННК НКНКШ : : Ей ШТ НН не : : - КЕКВ, : : іі ШИНИ НПК нини ВИНИ, : : ж Ен : : - 5 х ПОТОМИИИК НТ МІ ЛИ : : - :

Н й ч м «. Н

Н т т й 4 : : щ М НО щ «і : : ". ". ща Н : ї : х КЕ; | ; Н : тривалість нагрівання іхвилиниї :

зд ідкнісьддкіідндідндн вк квь о-ви нн» ох їі ах Їх ях - ГМО о с їв. ОД ене ен

МО рве

СХ

ДОК

ОО В ве СЕ ПОН п ХО КЕ пері о ОО он я

МЕ Х о ОО о в я

ОВ еВ -- ОБ ЗАА - Ос ВАК іс п

СІМ МОМ х п с З

ВВ ин оо во ОК о ово

ППУ МИ МИШКИ МИ ТИ МИТИ

С це жк - ЩО ВАА ЕМ

ІМ п КЕ

ФК МО ОО в

ХК МО КК с с

В

ХО ОО

: ОО МК хо ДЕН

У В ВН НН се ПМ КО МТУ замеї Є - - т ВОК о. У г о. о ЗО зх ПТМ х 5 ИН

МО М я

ВИК МК тя

Фіг. З

В з оо - ще - Й е

МК ни К К - -

ОС -е г: - є: -

ЗАА є хе - К: хе Ж

Е Би МО - - щ ще 0

Е и и ОО ВА ВВ В м нс пет пок в НЕ отв й ОО с. о «ло І В ши шт 70000 ЗАА

Фіг. З (Продовження!)

А Ма ом аддідііі ііі ііі ііі ііі Мій ііі ііі ііі перто нені вен -- ОСОАА - ОС ОАА в ма ЗМ

ЗЕ "ЗА щи

Іще шт г пли пп ОО я шк: - ж Ж ЗАД я СЮ 9АА с СОМ

В нллаллнллалавлнлававлнллавлвлавалввнининий

ШК

. - МК ОО перо г зАРоНіН актія МЕН НВО ОО БЕ рей нн у зро нн - - 05 9АА

Фіг. 10 сб

В; понентів нота яв пото еодононевтютюстнтяннх й за ня

ПО ВО Я

ОН В КОЛОНИ ем ВИН

М М ВО

ОО М

КК ЕК КОМИ МКК КИЙ

М М М М М

ОККО Ко НН Кан о

М. ВМО ЗК

ЕЙ 3 р; Її МО ВО В ВХ

Я: ММ МИ

ООН МВ о 3

ОН КА ВИН я М

ХеОМОМММММММНМН МОМ : М НО о ї ї ЗМ МВ ж С о. 0 і ОН ОК а ВО ОХ ОК Кн М

У Ко о я ХОМ сь з ї ОХ ОК КО

І- Х К. ОО ОХ о

Ї ММ М В

ГІ о БІЛУ ЕМ КЕ ОВК КК

З ДОК МОМ

ЕЕ ОО МО ше Х НН І А НМ М - і ОО НЕ М МО

І МО я ШЕ: МО В ВІ ш Х ІОВ В ВО В В В

Бк ОО ОМ І МІ М М

ЕО МОМ М М

: ОМ М МІ ММ а ПО о В В и: МО ОО І МІ М

ОА І ММ М М у ПО М В на М "ж ЗМ М МОН еЕ КО ЗО М ; А М М МІ ОО М М

СЕ Ь М ММ а» з о КН В ОА АК АК у Ме м ОМ М х М и МОМ М М

Е х М МОМ о, МО ММК М х ОМ М МІОМІ М о ОО І МОМ М

АВК КК ОМ ник: ВОМ М І МІ ММ І В х зе ' т ьнш ол оночь44чяяяя яв ж її шьщ4яьяжяятяттф

С ї ПММ п ак ЗОВ КОВШ МВВ щ ОХ КК - Х ОХ КВ НИК х Хе НІ ІМ г Я у та МО МОМ

З МОМ МІ М М

СН ІІ ще я МОМ ОН КО А , х ОК А М

Ех ОК М п КІСОКМХМ КН ОВ ВК у М МО МОМ

Х ОКО В ОМ у М КОТИК КК

М М о о

Фіг. 10 (продовження!)

Мо НН

С. пли ПВ в в

Еш ПДМ в по

ПЕКИ, ПІШЛА ЛИННИК го ОПІВ ОО З СЯ є

Е не - ОПЛлМУКМ - ї- СОКНя лен Як с хе. По,

Е й й р НН ВО г ь. ПИТНИХ о ППО МОМ Ох

ЕТ 1 звоонм пи В я

Е ПИЛИП ти ПК, МКК

С вне ХЕ ПИТ Я т СИНИ ПЕКИ ЕЕ НЕ пе них й ої я ТИМИ. ЗОАШЛИНЕИИН ПОХФЕШШ ТИ ЛИШ ЗОВ о ння ПЕ ВЯП ТЕО тоВ

Пд ою ПШЕТІЛЯ ту : ях и ет . и НН я

НЕБО яю

МЕКВ(ІБОЮ яю жонноя

НЯ яю вон ше нин нн нн п а

НЕБА - яння нини пиши:

КК Я ші 5. ом о с КН Я

ПОКИ ОН шия ж СС

НН ві п ОО ОХ с я 5. у ОМ М Х ПИШИ МЛМ ОК

ПОН и

М

ВО М НИ

Я о он п п В ОО тяж як сс зх т кю ММ МН ОН

МОМ ОО я 0 КЕ оо КО ОО ОО с В с

М о З ОН

ОО КК ОО

ЗОМ КО КОМ

ОО ОХ ОКО МО що с М

ЗХ ж КК МУ ПИКА 00000 с

МО ПО СХ

ОКО Ка о КК п. ЗМК

ОО о о ех СО КК В

МАК во КК ОККО ОКО

ВОК В ее В 0 о В

І Ї. нн їх ОКУ КО пе аку я 5 МИ ше й я Ех ОО ЗК . ї

ПІТ ВДЕ І Я

ОбіимМму я я 205 5 Д - і в Ь. "-ї з

ВБаї я ща

НН ОН Я її

Е не й її х о М ах 5 о т в в в й

Фіг. 11 (продовження!

не ТО я де

І кн шани

У ЗЕ

Фк у У т ; ще АХ

КО М . шви щ я Я С с. К ТИХ Ж з; І у ! с. ; пре В Ех с.

Е с й . : ХК БУ

М ! я Ки «о 10 2 ї

З СХ а й Е

ОС 20 НЯ ть 2 не 120» ше

Е о.

ЕЕ 80.

Їй З ; - 60 .

Г. С СО З

Е С . "оо . х ХУ Ох ша ш ш. и ше ше

І ИН І оС й . -

Кн за

К: х:

Фіг. 12

С КО ост тисне в ::.00 ж ше ьшш шк. со нн НЕ ШЕ р перо

Ши ов

В

ОН фоворор ее ще Як А А НН се в а НН ШЕ ен в А НЕ и в и НЕ НЕ

Е и а

МАНКНННА КН «фК з

ПП ак віарорі ен нн ж НН пн ех Є поем НЕ В В ов З З НЕ

ЖАВ я я я вон жо ж

Бас я я тт

Фіг. 12 (продовження)

А МСАгО5 вів пофііооіооіоіоічіічічіічічічічіічічііічічіічічічіічічіціціцічі моцічічіціічічііічічіічічічіічічіціічічііічічіічічічіічічічіічічічіічічічіічіціці

НН. нБр7о

Й

СМ - я з - М і 0 НИ пи не НН сАРОН во МСАгО5 вів ї хо май змій х а пе со сн В-ВО. ж 05

ВОМ жо кю ев и и що во

С сне с ВК вто пе

Ще

Фіг. 13 ге ' то ж воді 0777 сопко ще

БО ше

В. 07 оМ що як 4 ї ! 5ОВ ! яниденя ОС ! : жу осв ве че

Е Е 400- -- ОоСьам ть сь ! Еш

Ге НИ ; і ! ж шо 300. лиш ех : т я для Ко

В шк І дай уж

З 1004 джин т ти

КЗ Т 7 Я

З 11 14 іб 18 кількість днів після імплантації

Е Во: --З 5 вв: пере СОПКО -- 500 но

ЕЕ 9001 --озоМ ж

Я в 400 ті

Е 'Є і ха ди ш ж З00- і і ух ! у я - Роб ДА о) | Ж, й

В 100 сту й а Об сенфйвиннння г й

Е ої - Шо -к

З ІВ 14 16 кількість днів після імплантації

Фіг. 13 (продовження)

РкОЛО о пан В і | Р-00061 і 200 4 ; | : ! о ее я А ши и - і і 2 І тане ; І; ї ї | 3 х | | : о 300 нн

Е ї во б

Н і

Зо. 3 200 8 З 2 - - -БФ- (5 -- а ; і Н

Е і 100 вина ! ос Неаї 005 окремо окремо нагрівання

Фіг. 14 о о М и ни не т

Мі - Ен Ж ія Му в

ЗАА(1ОЦМ) - - ж - - -

Схве (1 цМ) - - - 153 і88 ї158

Фіг. 15 зсосс вс сососовсюове опрососос свою ососос осо соя соссює ооововооссо ооо я оово нн Б я в В нн СН и М ВО ОВ

Ко и М М ВХ

ДУ ОО ЕОМ МОМ МОНО

ОККО Кв око ковку МОМ НН ВОМ и НН о М М

ОО оо Бе Є ОК Ох о ВН и ОО У

НН НН М МОМ

ОО Во СО МО и в о и НН КМ ни Ох КЕНЕ

КК о Ве МК

ОКО У ОО МОХ и М МО І МО МО

НН ОН І М ОН В и М МО МОВ и НН ОН МО

ОВЕН МНН НН ОМВО ВКА МИНННННН

Фіг. 16

ОО ВОМ ЗМО ВО фев

Е ОО КОМИ о ОО р ни МНК К НВ ЗК ОВ КОХ п АКТІ иа ши я

ОМС ММ НН ни и МК

ОКО ОХ ВИ НН ВН ЗОВ

У о М а М х МО

ЗХ ООН МО и В Зх п. и Ши Ми МОН

ОК В ОН МІ НН ВОНО

3 КК ОК КОН ЗБК

ВО МО М Ек В

КУ НН ни ВН ВИ ЗВ В

ОКО ВН и нн МНН НН ЗИ НнННия

ОО М МН нн ЗОН 5. ОМ І МОН ВОНО

ОН п В р В и УМО ее ВИТ МОЮ

Фіг. 17

Claims (15)

1. Спосіб іІндукування загибелі клітин, що складається з: (а) інгібування адаптивної реакції теплового шоку в клітині; та (0) індукування реакції теплового шоку в клітині, причому інгібітором реакції теплового шоку є аміноакридин або карбазол, що вибраний з групи, яка складається з СВІ0137, СВІ0197, СВІ.0198, СВІ.0100,

СВІ.0159, СВІ.0212, СВІ,0174 1 СВІ.0175.

2. Спосіб за п. І, в якому реакція теплового шоку індукована шляхом введення індуктора теплового шоку в клітину.

3. Спосіб за п. 2, в якому індуктором теплового шоку є гелданаміцин, інгібітор протеасом, арсеніт або етанол.

4. Спосіб за п. 3, в якому інгібітором протеасом є бортезоміб.

5. Спосіб за п. І, в якому реакція теплового шоку іІндукована шляхом підвищення внутрішньої температури клітини.

б. Спосіб за п. 5, в якому температуру клітини підвищують за допомогою нагрівального засобу.

7. Спосіб за п. 1, в якому аміноакридин вибраний з групи, яка складається з акрихіну та 9-аміноакридину.

8. Спосіб за п. 1, в якому клітина є раковою клітиною.

9. Спосіб за п. 8, в якому рак вибраний з групи, яка складається з метастатичного раку грудей, раку сечового міхура, карциноми легень, раку стравоходу, базаліоми, злоякісної меланоми, пухлини ока 1 раку голови та шиї.

10. Спосіб за п. 1, в якому друга обробка пов'язана з індукуванням реакції теплового шоку в клітині.

11. Спосіб за п. 10, в якому у другій обробці застосовують антибластомний агент.

12. Спосіб за п. 6, в якому температуру підвищують до щонайменше 39-60 С.

13. Спосіб за оп. 6, в якому температуру підвищують інфрачервоним випромінюванням.

14. Спосіб за п. 13, в якому використовують випромінювання з довжиною хвилі 25, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,68, 5,9,6,6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,6, 6,9, 7, 7,1, 72,73, 7,А,7,5,7,6,7,7,7,6,7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6,8,7, 5,8, 8,9,9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12,9, 13, 13,1, 13,2, 13,3, 13,4, 13,5, 13,6, 13,7, 13,8, 13,9, 14, 141, 14,2, 143, 14,4, 14,5, 14,6, 14,7, 14,8, 14,9 або 15 мкм.

15. Спосіб за п. 6, в якому температуру підвищують джерелом тепла, яке вибране з групи, яка складається з: електролюмінесцентного пристрою, лазерного діоду, емісійного лазеру з вертикальною резонаторною поверхнею, світлодіоду та резистивної лампи накалювання.