TWI843749B - ＰａＣａｓ９核酸酶 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及生物技術、分子生物學和醫學領域，特別是涉及核酸酶及其應用。更具體地說，本發明涉及PaCas9核酸酶。本發明還涉及編碼所述核酸酶的核酸；包含所述核酸的基因構建體、表達載體、遞送載體；包含所述核酸酶或編碼所述核酸酶的核酸的脂質體；用於產生核酸酶的方法；遞送方法；以及包含編碼所述核酸酶的核酸的宿主細胞。

Description

ＰａＣａｓ９核酸酶
本發明涉及生物技術、分子生物學和醫學領域，特別是涉及核酸酶及其應用。更具體地說，本發明涉及PaCas9核酸酶。本發明還涉及編碼所述核酸酶的核酸；包含所述核酸的基因構建體、表達載體、遞送載體；包含所述核酸酶或編碼所述核酸酶的核酸的脂質體；用於產生核酸酶的方法；遞送方法；以及包含編碼所述核酸酶的核酸的宿主細胞。
在2007年，首次證明CRISPR-Cas在許多細菌和大多數古細菌中是一種適應性免疫系統(Barrangou et al.,2007,Science 315：17091712,Brouns et al.,2008,Science 321：960-964)。基於功能和結構標準，到目前為止，已經表徵了三種類型的CRISPR-Cas系統，其中大部分使用小RNA分子作為引導以靶向互補DNA序列(Makarova et al.,2011,Nat Rev Microbiol 9：467-477,Van der Oost et al.,2014, Nat Rev Microbiol 12：479-492)。
在Doudna/Charpentier實驗室的最近一項研究中，對II型CRISPR-Cas系統(Cas9)的效應酶進行了充分的表徵，包括證明設計的CRISPR RNA引導(帶有特定間隔序列)的引入靶向質粒上的互補序列(前間區序列)，導致該質粒的雙鏈斷裂(Jinek et al.,2012,Science 337：816-821)。後來，Jinek et al.,2012使用Cas9作為基因組編輯的工具。
Cas9已被用於改造一系列真核細胞(例如魚、植物、人)的基因組(Charpentier和Doudna,2013,Nature 495：50-51)。
此外，通過選擇專用重組事件，Cas9已被用於提高細菌中的同源重組的產率(Jiang et al.,2013,Nature Biotechnol 31：233-239)。為了實現這一點，毒性片段(靶向構建體)與攜帶所需改變的拯救片段(編輯構建體，攜帶點突變或缺失)共轉染。靶向構建體由Cas 9與設計CRISPR和抗生素抗性標記(限定了宿主染色體上所需重組的位點)的組合組成；在相應抗生素的存在下，選擇在宿主染色體中靶向構建體的整合。只有當編輯構建體與宿主染色體上其它地方的CRISPR靶位點發生另外的重組時，宿主才能逃脫自身免疫問題。因此，在抗生素的存在下，只有所需的(無標記的)突變體才能存活和生長。還提出了選擇隨後從染色體去除整合的靶向構建體的相關策略，產生真正的無標記突變體。
近年來已經確立，CRISPR-Cas介導的基因組編輯構 成基因工程改造的有用工具。已經確立，原核CRISPR系統作為適應性免疫系統供給它們的宿主(Jinek et al.,2012,Science 337：816-821)，並且可用於快速和有效的基因工程改造(例如，Mali et al.,2013,Nat Methods 10：957-963)，僅需要改變引導序列以靶向感興趣的序列。
然而，繼續需要開發在多種實驗條件下具有改進的序列-特異性核酸檢測、切割和操作的試劑，以供基因研究和基因組編輯領域中的應用。
本發明涉及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶。
在一個方面，本發明涉及一種編碼PaCas9核酸酶的分離的核酸分子，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在一個方面，本發明涉及一種包含具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸的表達載體。
在一些實施方案中，表達載體是如圖1所示的基因構建體，PpCas9-T2A-GFP-sgRNA1-MCS-sgRNA2-MCS。
在一個方面，本發明涉及一種遞送治療劑的載體，所述治療劑包含具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸。
在本發明的一個實施方案中，載體將治療劑遞送到目標細胞或目標群組織。
在一個方面，本發明涉及一種遞送治療劑的脂質體，所述治療劑包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9 核酸酶或具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸。
在本發明的一個實施方案中，脂質體將治療劑遞送到目標細胞或目標群組織。
在一個方面，本發明涉及一種使用上述載體或上述脂質體將治療劑遞送到目標細胞或目標群組織的方法。
在該方法的一個實施方案中，通過將上述載體或上述脂質體給予哺乳動物體內，將治療劑遞送到目標細胞或目標群組織。
在一個方面，本發明涉及一種產生宿主細胞的方法，所述宿主細胞產生具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，所述方法包括使用任何上述載體轉化所述細胞。
在一個方面，本發明涉及一種產生PaCas9核酸酶的方法，其包括在足以產生所述PaCas9核酸酶的條件下，在生長培養基中培養上述宿主細胞，如有必要，隨後分離和純化得到的PaCas9核酸酶。
圖1. 意圖用於在哺乳動物細胞中產生PpCas9核酸酶的質粒PpCas9-T2A-GFP-sgRNA1-MCS-sgRNA2-MCS的環狀圖。
AmpR是提供對氨苄青黴素的抗性的β-內醯胺酶基因，CMV啟動子是巨細胞病毒早期基因的啟動子， Kozak序列意圖提高蛋白質的翻譯效率，START密碼子是起始密碼子，NLS是指核定位元信號(NLS)，PaCas9是SEQ ID NO：1的核苷酸序列，其編碼具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，FLAG是用於蛋白質檢測的FLAG表位序列，GFP是修飾的綠色螢光蛋白，TK pA指用於增加mRNA穩定性的胸苷激酶多聚-A信號序列，F1 ori是複製起點，在與輔助噬菌體共轉化時，其允許將噬菌粒包裝成噬菌體顆粒，polIII終止子+U6啟動子是指用於小RNA分子表達的盒，每個盒包含U6啟動子和RNA聚合酶Ⅲ轉錄終止子。
pUC起點是細菌中的pUC複製起點。
圖2. 具有結構域分佈的PaCaS9核酸酶的氨基酸序列。
定義和通用方法
除非另外定義，此處使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同含義。
此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，和複數術語應包括單數。通常，本文所述的細胞培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、有機 合成化學、醫學和藥物化學的分類和方法，以及蛋白質和核酸的雜交和化學是眾所周知的，並被本領域技術人員廣泛使用。酶反應和純化方法按照製造商的指示，如本領域中常見的，或者如本文所描述的進行。
"哺乳動物"指任何被分類為哺乳動物的動物，包括靈長類、人類、齧齒類、狗、貓、牛、小牛、馬、豬等。
核酸酶
核酸酶是一類廣泛的酶，它水解核酸亞基之間的磷酸二酯鍵。
根據其特異性和活性，核酸酶可具有以下類型：核酸外切酶和核酸內切酶、核糖核酸酶和去氧核糖核酸酶、限制性酶等。限制性酶是應用分子生物學中的一個重要要素。
PaCas9核酸酶涉及去氧核糖核酸酶的類型。
PaCas9核酸酶當與至少一個識別目標核酸序列的RNA分子結合時，能夠切割包含所述目標序列的DNA。
PaCas9核酸酶包含兩個核酸內切酶結構域，它們依次造成單鏈斷裂，並且當一起作用時造成雙鏈斷裂。
PaCas9核酸酶是II型CRISPR-Cas系統的效應酶(2型核酸酶)。
PaCas9核酸酶能夠造成具有高度特異性識別位點(16-20個字母)的雙鏈DNA斷裂。
PaCas9核酸酶的DNA以SEQ ID NO：1表示。
PaCas9核酸酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。
圖2顯示了具有結構域分佈的PaCas9核酸酶的氨基酸序列。
PaCas9核酸酶與規律成簇間隔短回文重複序列(CRISPR)以及CRISPR-Cas系統的其它相鄰組分：crRNA和tracrRNA序列締合。
編碼tracrRNA的核苷酸序列以SEQ ID NO：3表示。
編碼直接重複序列DR的核苷酸序列以SEQ ID NO：4表示。
crRNA由目標依賴性可變部分和SEQ ID NO：4表示的直接重複序列DR組成。
術語"治療劑"在此指具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，或指編碼PaCas9核酸酶並具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的分離的核酸分子。
tracrRNA(反式-啟動crRNA)是一種小的反式-編碼RNA。
CRISPR(規律成簇間隔短回文重複序列)是特別的細菌和古細菌基因座，由用獨特的序列(間隔區)間隔的直接重複序列組成。
核酸分子
本描述中可互換使用的術語"核酸"、"核序列"、"核酸序列"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核苷酸序列"，意指修飾或未修飾的核苷酸的精確序列，其 確定核酸的片段或區域，含有或不含非天然核苷酸，並且是雙鏈DNA或RNA、單鏈DNA或RNA或者所述DNA的轉錄產物。
在此還應包括，本發明不涉及在其自然染色體環境中(即處於自然狀態)的核苷酸序列。本發明的序列已被分離和/或純化，即它們被直接或間接採樣，例如通過拷貝，它們的環境已經至少部分改變。因此，通過重組遺傳學獲得，通過例如宿主細胞的方法，或通過化學合成獲得的分離的核酸，也應在此提及。
"分離的"核酸分子是指從至少一種核酸分子-雜質中識別和分離出來的核酸分子，所述核酸分子在核酸酶核酸的自然來源中與雜質結合。分離的核酸分子不同于在自然條件下發現的其形式或集合。因此，分離的核酸分子不同于在自然條件下存在於細胞中的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括位於正常表達抗體的細胞中的核酸分子，例如，如果核酸分子的染色體定位與其在自然條件下在細胞中的定位不同的話。
術語"核苷酸序列"包含其互補序列，除非另有規定。因此，具有特定序列的核酸應被理解為包含具有其互補序列的其互補鏈的核酸。
術語"控制序列"指在特定宿主生物內表達可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號和增強 子。
當核酸與另一個核酸序列處於功能關係時，它是"可操作地連接"的。例如，如果前序列或分泌前導序列的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白表達，該DNA與多肽的DNA可操作地連接；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與所述序列可操作地連接；如果核糖體結合位點被定位以有利於翻譯，則它與編碼序列可操作地連接。一般來說，"可操作地連接"意指所連接的DNA序列是連續的，和在分泌前導序列的情況下是連續的並且處於閱讀相中。然而，增強子不一定是連續的。
載體
本文所用的術語"載體"意指能夠運輸與之相連的其它核酸的核酸分子。在一些實施方案中，載體是質粒，即環狀的雙鏈DNA片段，可將另外的DNA區段連接到其中。在一些實施方案中，載體是病毒載體，其中另外的DNA區段可被連接到病毒基因組中。在一些實施方案中，載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起始位點的細菌載體和游離哺乳動物載體)。在進一步的實施方案中，載體(例如，非-游離哺乳動物載體)一旦引入宿主細胞中，就可以整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因一起複製。此外，某些載體能夠引導它們可操作地連接的基因的表達。這樣的載體在本文被稱為"重組表達載體"(或簡稱為"表達載體")。
在一個方面，本發明涉及適合於表達本文描述的任何核苷酸序列的載體。
本發明涉及包含編碼PaCas9核酸酶的核酸分子的載體。
在一些實施方案中，本發明的PaCas9核酸酶通過將DNA插入表達載體中來表達，從而使基因在功能上連接到必要的表達控制序列，例如轉錄和翻譯控制序列。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、植物病毒(如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒)、粘粒、YAC、EBV衍生的附加體等。可將DNA分子連接至載體中，使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其調節DNA轉錄和翻譯的預期功能。可以選擇表達載體和表達控制序列，以便與所使用的表達宿主細胞相容。DNA分子可以通過標準方法(例如，PaCas9核酸酶基因片段和載體上互補限制性位點的連接，或者如果不存在限制性位點時的平端連接)，引入到表達載體中。
除了PaCas9核酸酶基因外，本發明的重組載體表達可攜帶控制宿主細胞中PaCas9核酸酶基因表達的調控序列。本領域技術人員將理解，表達載體的設計，包括調控序列的選擇，可能取決於這樣的因素，如要轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表達水準等。哺乳動物中表達宿主細胞的優選的控制序列包括確保哺乳動物細胞中高水準蛋白表達的病毒元件，例如從逆轉錄病毒LTR、巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例 如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(如，腺病毒的主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤病毒衍生的啟動子和/或增強子，和強哺乳動物啟動子例如天然免疫球蛋白啟動子或肌動蛋白啟動子。為了進一步描述病毒控制元件及其序列，見例如，美國專利號5,168,062、4,510,245和4,968,615。在細菌細胞或真菌細胞(如酵母細胞)中表達多肽的方法也是本領域眾所周知的。
除了PaCas9核酸酶基因和調控序列之外，本發明的重組表達載體還可以攜帶另外的序列，例如調節宿主細胞中載體的複製的序列(例如，複製起點)和可選擇標記基因。可選擇標記基因有利於選擇已引入載體的宿主細胞(見例如，美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，可選擇標記基因對已引入載體的宿主細胞賦予對藥物(例如G418、潮黴素或甲氨蝶呤)的抗性。例如，可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在甲氨蝶呤選擇/擴增期間用於dhfr-宿主細胞)、neo基因(用於G418選擇)和谷氨酸合成酶基因。
本文所用的術語"表達控制序列"意指實現其連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。表達控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和多腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高翻譯效率的序列(即，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；和當需要時，增強蛋白質分泌的序列。這樣的控制序列的性質根據宿主生物體 而不同；在原核生物中，這樣的控制序列通常包括核糖體結合位點的啟動子和轉錄終止序列；在真核生物中，通常，這樣的控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語"控制序列"意欲至少包括所有組分，這些組分的存在對於表達和加工是必不可少的；和也可以包括另外的組分，這些組分的存在是有利的，例如，前導序列和融合配偶體序列。
宿主細胞
本文所用的術語"重組宿主細胞"(或簡稱為"宿主細胞")意指已引入重組表達載體的細胞。本發明涉及的宿主細胞可包括例如上述依據本發明的載體。應該理解"重組宿主細胞"和"宿主細胞"不僅意指特定的主題細胞，而且還指這種細胞的後代。因為可能由於突變或者環境影響而在隨後傳代中發生改變，這樣的後代實際上可能與親代細胞不相同，然而，這樣的細胞仍然包括在本文所用的術語"宿主細胞"的範圍內。
本發明的編碼PaCas9核酸酶的核酸分子和包含這些核酸分子的載體可用於轉染合適的哺乳動物或其細胞、植物或其細胞、細菌或酵母宿主細胞。轉化可以通過任何已知的將多核苷酸引入宿主細胞的技術來實現。將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法是本領域熟知的，並包括葡聚糖-介導的轉染、陽離子聚合物-核酸複合物轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺-介導的轉染、原生質體融合、多核苷酸 包封在脂質體中和DNA直接微注射到細胞核中。此外，核酸分子可以通過病毒載體引入哺乳動物細胞。轉染細胞的方法是本領域熟知的。見例如，美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。轉化植物細胞的方法是本領域熟知的，包括例如，農桿菌-介導的轉化、基因槍轉化、直接注射、電穿孔和病毒轉化。轉化細菌和酵母細胞的方法也是本領域熟知的。
用作轉化的宿主的哺乳動物細胞系是本領域熟知的並包括多種可利用的永生化細胞系。這些包括例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、FreeStyle 293細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞和許多其它細胞系。細胞系通過確定哪些細胞系有高表達水準來選擇，並提供所產生的蛋白質的必要特性。其它可供使用的細胞系是昆蟲細胞系，例如Sf9或Sf21細胞。當編碼PaCas9核酸酶的重組表達載體被引入哺乳動物宿主細胞時，PaCas9核酸酶通過將宿主細胞培養足以允許PaCas9核酸酶在宿主細胞中表達的一段時間而產生，或者更優選將PaCas9核酸酶分泌到宿主細胞在其中生長的培養基中。PaCas9核酸酶可以用標準的蛋白質純化技術從培養基中分離出來。植物宿主細胞包括例如，煙草、擬南芥、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括埃希氏桿菌屬和鏈黴菌屬物種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母、釀酒酵母和巴斯德 畢赤酵母。
此外，本發明的PaCas9核酸酶從生產細胞系中產生的水準可以使用許多已知的技術來提高。例如，谷氨醯胺合成酶基因表達系統(GS系統)是在某些條件下提高表達的常用方法。GS系統與EP號0216846、0256055、0323997和0338841結合整體或部分地進行論述。
可能的是，從不同的細胞系或從轉基因動物獲得的PaCas9核酸酶當彼此比較時具有不同的糖基化特徵。然而，不管糖基化狀態如何，並且一般而言，不管翻譯後修飾的存在或不存在，由本文描述的核酸分子編碼的PaCas9核酸酶是本發明的一部分。
脂質體
在一個方面，本發明涉及脂質體，其包封具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，或編碼PaCas9核酸酶且具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的分離的核酸分子。
脂質體是微小閉合囊泡，其具有被一個或多個脂質雙層包圍的內相，並具有保持水溶性物質在內相中和油溶性物質在磷脂雙層中的能力。在脂質體中包埋活性化合物並將其遞送給目標群組織時，如何高效地將活性化合物包埋在脂質體中，以及如何保證活性化合物被脂質體穩定保留，構成了重要的問題。
通常，脂質體被認為是具有幾十納米至十分之一微米的主要尺寸的顆粒，它的殼容納另一種物質的分子。脂質 體殼對於水分子和離子是"半滲透的"。
含有和保留不同性質的物質的能力是脂質體的特點。摻入脂質體中的物質的範圍相當寬泛，範圍從無機離子和低分子量有機化合物到大的蛋白質和核酸。
脂質體提供摻入載體中的物質的延長釋放。
脂質體可由磷脂，特別是磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油、磷脂酸、鞘磷脂、卵/大豆磷脂或其混合物製成。
實施例
為了更好地理解本發明，提供了以下實施例。這些實施例僅用於說明的目的，而不應被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。
本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請均通過引用併入本文。雖然為理解清楚的目的，前面的發明已經通過說明和實例的方式進行了相當詳細的描述，但對於本領域普通技術人員而言，根據本發明的教導將顯而易見的是，在不偏離所附實施方案的精神或範圍的情況下，可以對其進行某些變化和修改。
材料和通用方法 重組DNA技術
如在Sambrook,J.et al,Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York,1989中所述，使用標準方法操作DNA。分子生物試劑按照製造商的指示使用。
基因合成
所需的基因片段由通過化學合成制得的寡核苷酸製備。300-4000kb長的基因片段，其側接有單個限制性位點，通過退火和連接寡核苷酸(包括PCR擴增)進行組裝，隨後通過指定的限制性位點進行克隆。亞克隆基因片段的DNA序列經DNA測序證實。
DNA序列測定
DNA序列採用Sanger測序法測定。
DNA和蛋白序列分析和序列資料管理
Infomax's Vector NTI Advance套件版本8.0被用於序列創建、作圖、分析、注釋和說明。
表達載體
為了表達PaCas9核酸酶，使用意欲在原核細胞(大腸桿菌)中表達、在真核細胞(例如，CHO細胞)中暫態表達的表達質粒變體。除了PaCas9核酸酶表達盒外，載體還包含：允許在大腸桿菌中複製所述質粒的複製起點、在大腸桿菌中賦予對各種抗生素(例如氨苄青黴素和/或卡那黴素)的抗性的基因。
實施例1 PaCas9核酸酶的製備方法
為了製備宏基因組序列，從白海地區採集了Homoeodictya palmata海綿動物的樣品，該材料經離心分級，然後分離總DNA並隨後對其測序。
利用生物資訊學方法，在巨集基因組序列中檢測了PaCas9蛋白的開放閱讀框，以及CRISPR-Cas系統的相鄰組分(CRISPR盒，以及crRNA和tracrRNA序列)。
PaCas9核酸酶的DNA以SEQ ID NO：1表示。
PaCas9核酸酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。
編碼tracrRNA的核苷酸序列以SEQ ID NO：3表示。
編碼直接重複序列DR的核苷酸序列以SEQ ID NO：4表示。
實施例2 克隆描述
PaCas9核酸酶基因序列通過生物資訊搜索得到。對該序列進行密碼子優化，以確保在哺乳動物細胞中的最佳表達，然後利用Gibson方法從化學合成的寡核苷酸重新組裝。合成的PaCas9基因在基因構建體中從CMV啟動子的3’-端被克隆。從基因的5’-端添加Kozak序列和核定位元信號(NLS)，並從3’-端添加FLAG表位序列以供蛋白質檢測。在上面列出的PaCas9序列及其締合的元件之後，將 T2A元件和作為表達標記的綠色螢光蛋白(EGFP)的開放閱讀框在同一個閱讀框中置於構建體中。
在閱讀框後，從3’-端放置胸苷激酶多聚-A信號序列，以增加mRNA的穩定性。在基因構建體的細菌皮層(cortex)區域，有兩個串聯的盒用於表達小RNA分子。每個盒包含U6啟動子和RNA聚合酶III轉錄終止子。這些盒對於RNA分子的表達是必需的，RNA分子提供PaCas9蛋白與目標DNA分子(細胞基因組)的特異性相互作用。構建體圖如圖1所示。這種構建體允許表達PaCas9蛋白(其通過NLS轉運到細胞核)和引導該蛋白質的RNA分子(引導RNA)二者，以及通過FLAG表位來檢測蛋白質，並通過檢測EGFP來確定基因構建體的遞送效率。
實施例3 PaCas9蛋白的酶活性
通過比較不同Cas9家族蛋白的HNH和RuvC結構域與PaCas9結構域的同源性(結構域分佈如圖2所示)，鑒定了參與DNA/RNA酶促水解的氨基酸。保守氨基酸(先前已顯示其參與Cas9蛋白的酶活性)在PaCas9中被分離。因此，通過分析方法發現，該蛋白質的氨基酸殘基對PaCas9蛋白的酶活性是必需的(氨基酸-位置)：D 9；E 527；H 750；D 753；H 613；N 636。
實施例4 PaCas9蛋白的酶活性的測定
為了確定PAM(前間區鄰近基序)序列，發明人用重組核酸酶蛋白(SEQ ID NO：2)、crRNA(由目標依賴性可變部分和SEQ ID NO：4所示的直接重複序列組成)和tracrRNA(SEQ ID NO：3)進行了切割DNA文庫的體外反應。DNA文庫是包含7個字母隨機序列和可識別序列(即前間區)的PCR片段。
在PaCas9-RNA-蛋白複合物與DNA文庫一起孵育後，將反應產物裝載到凝膠電泳中。從凝膠中提取未切割的片段，並在Illumina平臺上進行測序。將未切割的PaCas9反應產物中包含的PAM序列與對照反應進行比較，將允許確定所討論的蛋白的PAM。
在識別PAM序列後，對體外核酸酶活性進行評估。為此，與RNA引導複合的蛋白質與攜帶前間區序列和鑒定的PAM的DNA片段一起孵育。確定了RNA-蛋白複合物與切割的DNA的最佳比例。核酸酶活性根據PaCas9蛋白的量來評估，該量是200ng的約400個鹼基對長的目標DNA(含有最佳的PAM)的50%切割所需的。
因此，已證實PaCas9核酸酶具有酶活性，並造成DNA中的雙鏈斷裂。
此外，已證實PaCas9核酸酶能夠在具有高度特異性的識別位點(16-20個字母)的DNA中造成雙鏈斷裂。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (12)

  1. 一種具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列之PaCas9核酸酶。
  2. 一種分離之核酸分子，其編碼依據申請專利範圍第1項之PaCas9核酸酶並具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
  3. 一種表達載體，其包含依據申請專利範圍第2項之核酸分子。
  4. 依據申請專利範圍第3項之表達載體，其是包含下述之基因構建體：β-內醯胺酶基因，巨細胞病毒早期基因的啟動子，Kozak序列，起始密碼子，核定位元信號(NLS)，SEQ ID NO：1的核苷酸序列，其編碼具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，FLAG表位序列，修飾的綠色螢光蛋白，胸苷激酶多聚-A信號序列，複製起點， 用於小RNA分子表達的盒，每個盒包含U6啟動子和RNA聚合酶Ⅲ轉錄終止子，細菌中的pUC複製起點。
  5. 一種用於遞送治療劑之載體，該治療劑包含依據申請專利範圍第2項之核酸分子。
  6. 依據申請專利範圍第5項之載體，其中治療劑被遞送到目標細胞或目標群組織。
  7. 一種用於遞送治療劑的脂質體，該治療劑包含依據申請專利範圍第1項之PaCas9核酸酶或依據申請專利範圍第2項之核酸分子。
  8. 依據申請專利範圍第7項之脂質體，其中治療劑被遞送到目標細胞或目標群組織。
  9. 一種依據申請專利範圍第5項之載體或依據申請專利範圍第7項之脂質體於製造將治療劑遞送到目標細胞或目標群組織的藥劑之用途。
  10. 一種生產用於產生依據申請專利範圍第1項之PaCas9核酸酶的宿主細胞之方法，其包括用依據申請專利範圍第3-4項之任一項的載體轉化該細胞。
  11. 一種用於產生依據申請專利範圍第1項之PaCas9核酸酶之宿主細胞，其包含依據申請專利範圍第2項之核酸分子。
  12. 一種產生依據申請專利範圍第1項之PaCas9核酸酶之方法，其包括在足以產生該PaCas9核酸酶的條件下，在生長培養基中培養依據申請專利範圍第11項之宿主細胞，如有必要，隨後分離和純化得到的PaCas9核酸酶。
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