TWI841156B - 專一性地結合甲基化dna片段的dna適體及其篩選方法與應用 - Google Patents

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TWI841156B
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李國賓
王志宏
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國立清華大學
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本發明揭示會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體(DNA aptamer)及其篩選方法。本發明亦揭示使用該等DNA適體來偵測一樣品中的甲基化DNA片段的方法。

Description

專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體及其篩選方法與應用
本發明是有關於一種會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體(DNA aptamer)及其篩選方法。本發明亦有關於使用該DNA適體來偵測一樣品中的甲基化DNA片段的方法。
DNA甲基化(DNA methylation)是一種體內重要的表觀基因調節(epigenetic regulation),可透過將甲基添加至DNA分子[常見的是啟動子的CpG島(CpG islands)]上來調節基因的表現情形。許多的疾病發生已被發現與不正常的DNA甲基化有關,例如,腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes)的啟動子之異常的高度甲基化(hypermethylation)已被認為在癌症發生(carcinogenesis)中扮演重要的角色。因此,若能將諸如病患血液等樣品中所存在的甲基化DNA片段快速地捕捉並偵測,將有利於致病機轉以及治療標的之研究。
甲基化DNA免疫沉澱法(methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)是一種大規模純化甲基化DNA片段的技術,主要是藉由對抗5-甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine)的抗體來捕捉存在於待測樣品中的各種甲基化DNA片段,並且可藉由諸如DNA擴增反應(DNA amplification)、微陣列晶片(microarray chip)以及次世代定序(next-generation sequencing)等偵測方式來偵測在所捕捉的甲基化DNA片段中是否存在感興趣的基因。然而,此方法需要使用抗體較為昂貴且可能存在非專一性結合的問題。
DNA適體(DNA aptamer)是能夠藉由複雜的三級結構而專一性結合至特定目標分子(例如重金屬、蛋白質以及細胞等)之短鏈的單股DNA (single-strand DNA, ssDNA),可藉由系統性配體指數富集演繹(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術從ssDNA庫(ssDNA library)中來嘗試篩選出。
然而,就申請人所知,迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示DNA適體可被用來捕捉或偵測甲基化DNA片段。
發明概要
在本發明中,申請人意外地發現,含有一如序列辨識編號:7與序列辨識編號:9所示的核苷酸序列的DNA適體(DNA aptamer)對於甲基化DNA片段皆具有高度的專一性與靈敏度,而可用於捕捉存在於一樣品中的各種甲基化DNA片段,並且可藉由諸如DNA擴增反應的方式來偵測在所捕捉的甲基化DNA片段中是否存在感興趣的基因(例如腫瘤抑制基因的啟動子),藉此確認在該樣品中感興趣的DNA基因的甲基化與否。
於是,在第一個方面,本發明提供一種會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體,其含有一如序列辨識編號:7或序列辨識編號:9所示的核苷酸序列。
在第二個方面,本發明提供一種用於偵測一樣品中的甲基化DNA片段的方法,其包括: 令一如上所述的DNA適體與該樣品接觸;以及 偵測由該DNA適體與甲基化DNA片段所形成的複合物。
在第三個方面,本發明提供一種用於篩選會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體之方法,其包括: 提供一單股DNA庫(single strand DNA library); 在下列條件的至少一者下令該單股DNA庫與複數個甲基化DNA片段接觸,以篩選出會與甲基化DNA片段形成複合物的單股DNA:(a) 25-37℃;(b) pH 5.5-7.4;(c)在10-50 mM乳酸的存在下;以及(d)在血液的存在下;以及 擴增出所篩選出的單股DNA。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點,在參照以下的詳細說明與較佳實施例後,將變得明顯。
發明的詳細說明
要被瞭解的是:若有任何一件前案刊物在此被引述,該前案刊物不構成一個下述承認:在台灣或任何其他國家之中,該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的,將被清楚地瞭解的是:文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”,以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義,在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料,它們可被用於實施本發明。當然,本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚,下面的界定被使用於本文中。
如本文中所使用的,“核酸”、“核酸序列”、“核酸片段”或“核苷酸序列”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列,且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造的化學仿效物(artificial chemical mimics)。如本文中所使用的,“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。
如本文中所使用的,術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用,並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer),該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component),其可以是衍生自經分離的DNA (isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。
除非另有指明,一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外,亦涵蓋其互補序列(complementary sequences),以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。
除非另有指明,每當表示一核酸序列時,將被瞭解的是,核苷酸從左到右是呈5’至3’的順序,而“A”表示去氧腺苷(deoxyadenosine)或其類似物,“C”表示去氧胞苷(deoxycytidine)或其類似物,“G”表示去氧鳥苷(deoxyguanosine)或其類似物,以及“T”表示去氧胸苷(deoxythymidine)或其類似物。
如本文中所使用的,術語“啟動子(promoter)”意指一DNA序列,它通常是位在一DNA聚合物內所存在的一個基因的上游處,而且它提供一用於起始該基因的轉錄以生成mRNA的位址(site for initiation of the transcription of said gene into mRNA)。
如本文中所使用的,術語“DNA適體(DNA aptamer)”意指一種具有特定三級結構之短鏈的單股DNA (single-strand DNA, ssDNA),對於標的分子可展現高度的專一性。
本發明提供一種會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體,其含有一如序列辨識編號:7或序列辨識編號:9所示的核苷酸序列。較佳地,該DNA適體具有一如序列辨識編號:6或序列辨識編號:8所示的核苷酸序列。
依據本發明的DNA適體可使用熟習此技藝者所熟知的技術而被固著於一固體支撐物(solid support)上,而使得所專一性地結合的甲基化DNA片段可被捕捉出。適用於本發明的固體支撐物包括,但不限於:盤(plate)、管(tube)、膜(membrane)、樹脂(resin)以及珠粒(bead)。較佳地,該固體支撐物是一選自於由下列所構成之群組中的珠粒:磁珠(magnetic bead)、瓊脂珠(agarose bead)、葡萄糖凝膠珠(sephadex bead)、玻璃珠(glass bead),以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中,該固體支撐物是帶有羧酸基團的磁珠。
本發明亦提供一種用於偵測一樣品中的甲基化DNA片段的方法,其包括: 令一如上所述的DNA適體與該樣品接觸;以及 偵測由該DNA適體與甲基化DNA片段所形成的複合物。
依據本發明,該甲基化DNA片段可以衍生自任何感興趣的基因,而可藉以瞭解該基因在該樣品中的表觀基因調節(epigenetic regulation)之情形。較佳地,該甲基化DNA片段是衍生自一選自於由下列所構成之群組中的腫瘤抑制基因的啟動子: BRCA1( breast cancer gene 1)啟動子、 BRCA2( breast cancer gene 2)啟動子、 RASSF1A( Ras association domain family member 1A)啟動子、 OPCML( opioid binding protein/cell adhesion molecule-like)啟動子、 P16INK4α啟動子、 KLF11( Krüppel -like transcription factor 11)啟動子、 ADPRH( ADP-ribosylhydrolase)啟動子、 GBGT1( globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1)啟動子 PDLIM2( PDZ and LIM domain protein 2)啟動子,以及它們的組合。較佳地,該腫瘤抑制基因的啟動子是 BRCA1啟動子或 BRCA2啟動子。
依據本發明,該樣品可以是生物樣品(biological sample)。較佳地,該樣品是得自於具有或被懷疑具有癌症的個體之生物樣品。如本文中所使用的,“生物樣品”是一得自於一生物體(organism)(諸如,動物個體)或該生物體的組分(components)(諸如,細胞以及組織)的樣品。該生物樣品的實例包括,但不限於:一血液樣品(blood sample)、一血漿樣品(plasma sample)、一血清樣品(serum sample)、一淚液樣品(tear sample)、一唾液樣品(saliva sample)、一腦脊髓液樣品(cerebrospinal fluid sample)、一糞便樣品(feces sample)、一活體組織切片(tissue biopsy)、一尿液樣品(urine sample),以及它們的組合。
依據本發明,該樣品在與該DNA適體接觸之前,可先進行一選於由下列所構成之群組中的前處理:總基因組DNA萃取(genomic DNA extraction)、DNA片段化(DNA fragmentation),以及它們的組合。有關總基因組DNA萃取的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明,一個可偵測的標記(detectable label)可使用熟習此技藝者所熟知的技術而被附接或結合至依據本發明的DNA適體,以供由該DNA適體與甲基化DNA片段所形成的複合物之偵測。適用於本發明之可偵測的標記包括,但不限於:半抗原標記(hapten labels),例如,生物素(biotin)以及地高辛(digoxigenin, Dig);化學螢光標記(chemiluminescent labels);螢光標記(fluorescent labels),例如,螢光素(fluorescein)、玫瑰紅(rhodamine)、FAM、TET、HEX、JOE、TAMA、NTB、TAMRA、ROX、VIC、NED、雅基馬黃(Yakima Yellow)、BHQI、BHQ2、BHQ3、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、DABCYL、DABSYL、ElleQuencher、Eclipse Dark Quencher、甲基紅(Methyl Red)、德州紅(Texas Red)、孔雀綠(malachite green)、分散藍3 (DisperseBlue3)、Bodipy 493/503、花青基苷(cyanin, Cy)染料[諸如,Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5與Cy7]、AlexaFluor染料[諸如,AlexaFluor 488、532、546、555、568、594、610、647以及680]、PromoFluor染料[諸如,PromoFluor 488、555、590、633、647以及680]以及LC-Red染料[諸如,LC-Red610、640、670以及705];酵素標記;放射性標記(例如, 32P);顆粒標記(particle labels),例如,金膠體(gold colloids)以及量子點(quantum dot);以及比色標記(colorimetric labels),例如,染劑以及有色的玻璃或塑膠珠粒(colored glass or plastic beads)。
依據本發明,該複合物的偵測可藉由使用DNA擴增反應而被進行,而所使用的引子對則可依據所感興趣的基因來選用針對該基因的任何習知引子對或自行設計的引子對。較佳地,該DNA擴增反應是使用針對如上所述之腫瘤抑制基因的啟動子的引子對。
依據本發明,該DNA擴增反應可藉由使用下列方法學之至少一者而被進行:聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、即時定量聚合酶鏈反應(real time quantitative PCR)、巢式聚合酶鏈反應(nested PCR)、熱啟動聚合酶鏈反應(hot-start PCR)、原位聚合酶鏈反應(in-situ PCR)、微聚合酶鏈反應(micro PCR)以及多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)。有關這些方法學的操作條件的設定是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明,該DNA擴增反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行:微流體晶片(例如,樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。
本發明亦提供一種用於篩選會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體之方法,其包括: 提供一單股DNA庫(single strand DNA library); 在下列條件的至少一者下令該單股DNA庫與複數個甲基化DNA片段接觸,以篩選出會與甲基化DNA片段形成複合物的單股DNA:(a) 25-37℃;(b) pH 5.5-7.4;(c)在10-50 mM乳酸的存在下;以及(d)在血液的存在下;以及 擴增出所篩選出的單股DNA。
依據本發明,該單股DNA庫可使用熟習此技藝者所熟知且慣用之可用於系統性配體指數富集演繹(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)的操作程序的單股DNA庫。較佳地,該單股DNA庫是由含有20至80個隨機核苷酸之單股DNA所組成,更佳地,30至50個隨機核苷酸。
依據本發明,該甲基化DNA片段可使用熟習此技藝者所熟知的技術而被固著於一如上所述的固體支撐物上,而使得會與甲基化DNA片段形成複合物的單股DNA可被篩選出。
依據本發明,該方法可進一步包括下列負向篩選(negative selection)的步驟: 令所擴增出的單股DNA與一無甲基化DNA片段接觸,以篩選出不會與該無甲基化DNA片段形成複合物的單股DNA;以及 擴增出所篩選出的單股DNA。
依據本發明,該無甲基化DNA片段可使用熟習此技藝者所熟知的技術而被固著於一如上所述的固體支撐物上,而使得會與該無甲基化DNA片段形成複合物的單股DNA可被移除。
依據本發明的方法所篩選出的單股DNA可含有如序列辨識編號:7或序列辨識編號:9所示的DNA適體。較佳地,該DNA適體具有一如序列辨識編號:6或序列辨識編號:8所示的核苷酸序列。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明,但應瞭解的是,該等實施例僅是供例示說明用,而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料: 1. 癌細胞的片段化基因組DNA (fragmeted genomic DNA):
在下面的實施例中所使用之各種癌細胞的片段化基因組DNA是使用QIAamp DNA Mini套組(QIAamp DNA Mini kit)(Qiagen, Cat. 51306)並依據製造商所提供的操作指引來分別對下面表1中所示的細胞株進行萃取,繼而予以進行音波處理(sonication)而被製得。 表1.  不同癌症的細胞株與來源
癌症 細胞株 來源
卵巢癌(ovarian cancer) 人類卵巢癌細胞株A2780 國立成功大學(National Cheng Kung University)
人類卵巢癌細胞株OVCA8
子宮頸癌(cervical cancer) 人類子宮頸癌細胞株HeLa 中山醫學大學(Chung Shan Medical University)
三陰性乳癌(triple negative breast cancer) 人類乳癌細胞株MDA-MB-231
肺癌(lung cancer) 人類肺癌細胞株A549
一般實驗方法: 1. 磁珠固定(immobilization on magnetic beads):
在下面的實施例中,所選用的DNA片段皆是參考C. H. Wang et al., (2011), Biosens . Bioelectron.,Jan 15; 26(5): 2045-52,藉由[N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽][N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride]來固定於帶有羧酸基團的磁珠(Invitrogen Dynabeads TMMyOne TMCarboxylic Acid, Cat. 65011)上。 實施例 1. 針對甲基化 DNA 片段 (methylated DNA fragment) DNA 適體 (DNA aptamer) 的篩選 實驗材料: 1.   單股DNA (ssDNA)庫[single-strand DNA (ssDNA) library]:
用於篩選適體的ssDNA庫是委託波士頓生物科技股份有限公司來合成,每條ssDNA是如下列所示由5’端至3’端依序包含有16個核苷酸(nucleotide, nt)的5’端恆定區(5’ constant region)(序列辨識編號:1)、含有大約40 nt的隨機核苷酸(random nucleotide)的核心區(core region, N),以及16 nt的3’端恆定區(3’ constant region)(序列辨識編號:2)。 5’- ggcaggaagacaaaca-N- tggtctgtggtgctgt-3’ 5’端恆定區              3’端恆定區 2.   甲基化與無甲基化聚GC片段(methylated and unmethylated polyGC fragments):
甲基化與無甲基化的聚GC片段皆是委託波士頓生物科技股份有限公司來合成,每條聚GC片段是如下列所示由5’端至3’端依序包含有10 nt的聚T區以及24 nt的聚GC區。在進行實驗前,將聚GC片段透過其聚T區來固定於磁珠上。 5’- tttttttttt- gcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgc-3’(序列辨識編號:3) 聚T區             聚GC區 實驗方法:
針對甲基化DNA片段的DNA適體是依據下面表2所示來進行多輪(rounds)的系統性配體指數富集演繹(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)而被獲得。在第1輪SELEX中,將10 µL的ssDNA庫(100 µM)、10 µL之甲基化聚GC片段-固定的磁珠(10 5顆/µL)以及80 µL PBS (pH 7.4)予以混合,並於25℃與20 rpm下進行培育歷時30分鐘。接著,藉由磁力座(magnetic stand)(Invitrogen)來收集結合有ssDNA的磁珠並以200 µL PBS (pH 7.4)予以洗滌2次,然後將該等磁珠懸浮於50 µL的去離子水中,繼而取出10 µL並以如下面表3中所示之引子對來進行使用下面表4所示的反應條件之PCR,以擴增可結合至甲基化聚GC片段的ssDNA,而所得到的擴增產物作為用於下一輪SELEX的ssDNA庫。 表2.  各輪SELEX所使用的磁珠及其培養環境與溫度
固定於磁珠上的DNA片段 培養環境 培養溫度
1 甲基化聚GC片段 PBS (pH 7.4) 25℃
2 無甲基化聚GC片段 PBS (pH 7.4) 25℃
3 甲基化聚GC片段 PBS (pH 7.4) 37℃
4 甲基化聚GC片段 血液 a 25℃
5 甲基化聚GC片段 PBS (pH 6.5) b 25℃
6 甲基化聚GC片段 PBS (pH 5.5) b 25℃
7 甲基化聚GC片段 50 mM乳酸 c 25℃
8 甲基化聚GC片段 10 mM乳酸 c 25℃
a:得自於國立成功大學附設醫院(National Cheng Kung university hospital)的婦產科。 b:pH值是使用0.1N HCl 與1N NaOH來進行調整。 c:配於PBS (pH 7.4)中。 表3.  用於擴增ssDNA的引子對
引子 對應於ssDNA 的區域 核苷酸序列(5’→3’) PCR產物大小(bp)
前向引子 5’端恆定區 ggcaggaagacaaaca (序列辨識編號:4) 72
反向引子 3’端恆定區 acagcaccacagacca (序列辨識編號:5)
表4.  PCR的反應條件
內容物 體積(µL)
待擴增ssDNA的樣品 10
前向引子(10 µM) 0.3
反向引子(10 µM) 0.3
2X GoTaq® Green Master Mix(Promega) 12.5
無菌水 1.9
操作條件:在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時5分鐘;接而進行35個循環如下:在95℃下進行變性反應歷時20秒、在56℃下進行引子黏合(primer annealing)歷時15秒、在72℃下進行延伸反應(extension)歷時15秒;最後,在72℃下進行延長反應(elongation)歷時10分鐘。
第2輪SELEX大體上是依照第1輪SELEX的操作步驟來進行,不同之處在於:以磁力座移除磁珠,繼而將剩餘的溶液取出10 µL並以如上面表3中所示之引子對來進行使用上面表4所示的反應條件之PCR,以擴增出不會結合至無甲基化聚GC片段的ssDNA,而所得到的擴增產物作為用於下一輪SELEX的ssDNA庫。
第3輪至第8輪SELEX大體上是依照第1輪SELEX的操作步驟來進行,不同之處在於:依照上面表1來更改培養環境或培養溫度。最後所得到的擴增產物是委託基龍米克斯生物科技股份有限公司(Genomics Biosci & Tech Co., Ltd.)來進行定序,藉此而得到數條DNA適體的序列。申請人從中挑選出74 nt的適體MeLW1 (序列辨識編號:6)(核心區的序列如序列辨識編號:7所示)與72 nt的適體MeLW2 (序列辨識編號:8)(核心區的序列如序列辨識編號:9所示),並將這兩種適體分別固定於磁珠上來進行下面的實驗。 實施例 2. 本發明的 DNA 適體在偵測甲基化 DNA 片段上的專一性 (specificity) 以及靈敏度 (sensitivity) 的分析:
在本實施例中,申請人選用甲基化的 BRCA啟動子( BRCApromoter)的片段以及含有此的卵巢癌細胞的片段化基因組DNA來評估本發明的DNA適體在偵測甲基化DNA片段上的專一性與靈敏度。 實驗材料 1. 甲基化與無甲基化 BRCA啟動子片段:
甲基化與無甲基化的 BRCA1啟動子片段(對應於NCBI登錄編號NG_056086.1當中所示的核苷酸殘基位置992至913處)以及 BRCA2啟動子片段(對應於NCBI登錄編號NG_044973.1當中所示的核苷酸殘基位置1139至885處)皆是委託波士頓生物科技股份有限公司來合成。 實驗方法 A 專一性試驗:
針對適體MeLW1的專一性試驗被進行如下。將甲基化的 BRCA1啟動子片段、無甲基化的 BRCA1啟動子片段、甲基化的 BRCA2啟動子片段、無甲基化的 BRCA2啟動子片段以及A2780細胞的片段化基因組DNA作為試驗樣品(10 µL),分別添加以10 µL適體MeLW1-固定的磁珠(10 5顆/µL),繼而於25℃與20 rpm下進行培育歷時30分鐘。接著,藉由磁力座來收集磁珠並以PBS予以洗滌,然後將該等磁珠懸浮於50 µL的去離子水,繼而取出10 µL並以如下面表5中所示之引子對來進行使用下面表6所示的反應條件之PCR。 表5.  用於擴增 BRCA啟動子片段的引子對
標的 基因 引子 核苷酸序列(5’→3’) PCR產物大小(bp)
BRCA1啟動子片段 BRCA1F1 actgcgactgcgcggcgtga (序列辨識編號:10) 79
BRCA1R1 gggcccagttatctgagaaa (序列辨識編號:11)
BRCA2啟動子片段 BRCA2F1 cccctcacgcttctccc (序列辨識編號:12) 254
BRCA2R1 gacggttgggatgcct (序列辨識編號:13)
表6.  PCR的反應條件
內容物 體積(µL)
待擴增 BRCA啟動子片段的樣品 10
前向引子(10 µM) 0.3
反向引子(10 µM) 0.3
2X GoTaq® Green Master Mix(Promega) 12.5
無菌水 1.9
操作條件:在95℃下進行變性反應歷時5分鐘;接而進行35個循環如下:在95℃下進行變性反應歷時20秒、在56℃下進行引子黏合歷時15秒、在72℃下進行延伸反應歷時15秒;最後,在72℃下進行延長反應歷時10分鐘。
於完成PCR之後,所得到的PCR擴增產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析,俾以確認是否可得到既定大小的PCR產物。
另外,針對適體MeLW2的專一性試驗大體是依照針對適體MeLW1的操作步驟來進行,不同之處在於:適體MeLW1-固定的磁珠被替換為適體MeLW2-固定的磁珠,引子對BRCA1F1/BRCA1R1被替換為如下面表7所示的BRCA1F2/BRCA1R2。 表7.   用於擴增 BRCA1啟動子片段的引子對
標的 基因 引子 核苷酸序列(5’→3’) PCR產物大小(bp)
BRCA1啟動子片段 BRCA1F2 gcagactgggtggccaat (序列辨識編號:14) 104
BRCA1R2 aagcagcagcctctcagaat (序列辨識編號:15)
於完成PCR之後,所得到的PCR擴增產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析,俾以確認是否可得到既定大小的PCR產物。 B 靈敏度試驗:
首先,將A2780細胞的片段化基因組DNA進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)而得到具有不同濃度(10 ng/µL、1 ng/µL以及0.1 ng/µL)的稀釋溶液作為待測樣品(10 µL),分別添加以10 µL適體MeLW1-固定的磁珠(10 5顆/µL),繼而於25℃與20 rpm下進行培育歷時30分鐘。接著,藉由磁力座來收集磁珠並以PBS予以洗滌,然後將該等磁珠懸浮於50 µL的去離子水,繼而取出10 µL並以如上面表5中所示之引子對BRCA1F1/BRCA1R1來進行使用上面表6所示的反應條件之PCR。
於完成PCR之後,藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到大小約為79 bp的PCR產物。 結果: A 專一性試驗:
經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現,當使用本發明的適體MeLW1,甲基化的 BRCA1啟動子片段與 BRCA2啟動子片段皆可被捕捉,而分別被引子對BRCA1F1/BRCA1R1與BRCA2F1/BRCA2R1擴增出大小約為79 bp以及254 bp的PCR產物,A2780細胞的片段化基因組DNA亦可得到相同的PCR產物,至於無甲基化的 BRCA1啟動子片段與 BRCA2啟動子片段則無得到PCR產物。當使用本發明的適體MeLW2,甲基化的 BRCA1啟動子片段與 BRCA2啟動子片段皆可被捕捉,而分別被引子對BRCA1F2/BRCA1R2與BRCA2F1/BRCA2R1擴增出大小約為104 bp以及254 bp的PCR產物,A2780細胞的片段化基因組DNA亦可得到相同的PCR產物,至於無甲基化的 BRCA1啟動子片段與 BRCA2啟動子片段則無得到PCR產物。
這個實驗結果顯示:本發明的適體可以專一性地結合甲基化DNA片段。 B、 靈敏度試驗:
經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現,從10 ng/µL至1 ng/µL的濃度的稀釋溶液皆可得到大小約為79 bp的PCR擴增產物,這表示本發明的適體MeLW1對於甲基化DNA片段的偵測極限(limit of detection, LOD)可以達到1 ng。
這個實驗結果顯示:本發明的適體在偵測甲基化DNA片段上能夠展現出優異的靈敏度。 實施例 3 本發明的 DNA 適體對於生物樣品中的甲基化 DNA 片段的偵測能力之評估: A 使用本發明的 DNA 適體來偵測不同癌細胞中的甲基化 DNA 片段:
首先,將得自於另一卵巢癌細胞OVCA8的片段化基因組DNA作為試驗樣品(10 µL),並參照上面實施例2的第A項當中所述使用適體MeLW1與適體MeLW2來進行甲基化DNA片段的偵測。
經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現,OVCA8細胞的片段化基因組DNA中的甲基化DNA片段可被本發明的適體MeLW1以及MeLW2捕捉,而被引子對BRCA1F1/BRCA1R1與BRCA1F2/BRCA1R2擴增出既定大小的PCR產物。
此外,子宮頸癌、三陰性乳癌以及肺癌的片段化基因組DNA亦被拿來進行相同的實驗,並且可獲致相同的實驗結果。
這個實驗結果顯示:本發明的適體能夠有效地偵測出各種不同癌症細胞中的甲基化DNA片段。 B 使用本發明的 DNA 適體來偵測血液樣品中的甲基化 DNA 片段:
首先,將得於國立成功大學附設醫院婦產科的乳癌患者的血漿(plasma)作為試驗樣品(100 µL),繼而參照上面實施例2的第A項當中所述使用適體MeLW1與適體MeLW2來進行甲基化DNA片段的偵測。
經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現,血漿中的甲基化DNA片段可被本發明的適體MeLW1以及MeLW2捕捉,而被引子對BRCA1F1/BRCA1R1與BRCA1F2/BRCA1R2擴增出既定大小的PCR產物。
這個實驗結果顯示:依據本發明的適體MeLW1以及MeLW2能夠偵測出癌症患者的血液樣品中的甲基化DNA片段,並且而可不用先進行基因組DNA的萃取。
綜合以上的實驗結果可見,依據本發明的DNA適體對於甲基化DNA片段具有高度的專一性與靈敏度,而可用於捕捉存在於一樣品中的各種甲基化DNA片段,並且可藉由諸如DNA擴增反應的方式來偵測在所捕捉的甲基化DNA片段中是否存在感興趣的基因(例如腫瘤抑制基因的啟動子),藉此確認在該樣品中感興趣的DNA基因的甲基化與否。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時,本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述,明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
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Claims (7)

  1. 一種會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體(DNA aptamer),其具有一如序列辨識編號:6或序列辨識編號:8所示的核苷酸序列。
  2. 一種用於偵測一樣品中的甲基化DNA片段的方法,其包括:令一如請求項1所述的DNA適體與該樣品接觸;以及偵測由該DNA適體與甲基化DNA片段所形成的複合物。
  3. 如請求項2的方法,其中該甲基化DNA片段是衍生自一選自於由下列所構成之群組中的腫瘤抑制基因的啟動子:BRCA1啟動子、BRCA2啟動子、RASSF1A啟動子、OPCML啟動子、P16INK4α啟動子、KLF11啟動子、ADPRH啟動子、GBGT1啟動子、PDLIM2啟動子,以及它們的組合。
  4. 如請求項3的方法,其中該腫瘤抑制基因的啟動子是BRCA1啟動子或BRCA2啟動子。
  5. 如請求項2的方法,其中該複合物的偵測是藉由使用DNA擴增反應而被進行。
  6. 一種用於篩選會專一性地結合甲基化DNA片段的DNA適體之方法,其包括:提供一單股DNA庫(single strand DNA library); 在下列條件的至少一者下令該單股DNA庫與複數個甲基化DNA片段接觸,以篩選出會與甲基化DNA片段形成複合物的單股DNA:(a)25-37℃;(b)pH 5.5-7.4;(c)在10-50mM乳酸的存在下;以及(d)在血液的存在下;以及擴增出所篩選出的單股DNA,其中該單股DNA包含有一如請求項1的DNA適體。
  7. 如請求項6的方法,其中該單股DNA庫是由含有20至80個隨機核苷酸之單股DNA所組成。
TW111150673A 2022-12-29 專一性地結合甲基化dna片段的dna適體及其篩選方法與應用 TWI841156B (zh)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017161357A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof

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WO2017161357A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof

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