TWI822445B - 可提升具調節過敏免疫激素的優化副乾酪乳桿菌菌株mp137及其取得方法 - Google Patents
可提升具調節過敏免疫激素的優化副乾酪乳桿菌菌株mp137及其取得方法 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提出一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的培養基，培養基以其總重量計包括：3wt％碳源與2.5至3.5wt％氮源，其中菌株MP137的寄存編號為BCRC910484，碳源為葡萄糖，氮源為大豆蛋白腖。
Description
本發明關於一種優化乳酸菌菌株的培養基，特別攸關一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的培養基，其除了可提升菌量、耐酸耐膽鹽性、與環境安定性外，更可調節個體分泌免疫激素，藉以提升預防或改善過敏症狀的效果。
腸道微生物大多聚集於迴腸與大腸，腸道菌群（gut microbiota）的平衡與宿主健康息息相關。「益生菌」一詞起源於希臘語，指活的微生物且對宿主健康有益，常見的益生菌如：乳酸桿菌屬（
Lactobacillusspp.）及雙歧桿菌屬（
Bifidobacteriumspp.）。益生菌及相關乳製品對人體為安全的並有悠久歷史，益生菌菌株的特異性與其功效有關，並非每株菌株皆有相同功效，常見功效如：改善乳糖不耐症、抑制幽門螺旋桿菌感染、減緩腸道障礙、調節免疫與改善過敏。
乳酸桿菌（
Lactobacillusspp.）為桿狀不具運動性的革蘭氏陽性菌，可發酵碳水化合物產生乳酸，進而抑制病原菌。不同的乳酸桿菌可定殖於人體不同部位，多數定殖於腸胃道與泌尿生殖道，例如：嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌及植物乳桿菌為腸胃道內的主要乳酸菌。由於基因片段的差異，相同菌種但不同菌株造成的生理功效亦不相同，例如：副乾酪乳桿菌（
Lactobacillus paracasei）菌株LP-33能減緩五歲以下兒童的過敏性鼻炎症狀，副乾酪乳桿菌菌株NTU 101可改善藥物引起的便秘並改善腸胃道功能。益生菌對宿主健康有益，但並非攝取量越多越好，須於腸道內定殖至一定數量後得以發揮效用。菌株經攝取後，會遇到許多人體的防禦，如：胃酸及膽鹽等皆不利菌株存活，故其耐胃酸膽鹽能力尤其重要。
微生物培養基為菌株生長及代謝的必須養分來源，其配方組成均有其目的性，不同菌株適合的培養基亦不相同。近年許多研究利用篩選微生物培養基來產生特定代謝產物或增加生產量。適當比例的碳源及氮源會影響微生物生長，例如：溫度與蛋白腖及甘蔗糖蜜的濃度可提升副乾酪乳桿菌堅韌亞種（
Lactobacillus paracaseisubsp.
tolerans）菌株N2分泌具抗菌活性的化合物，酵母萃取物、葡萄糖與維生素的比例亦會影響鼠李糖乳桿菌生長。
近年世界衛生組織將過敏列為重點研究的疾病之一。據統計全球約40％人口有過敏問題。益生菌除了可改善腸道菌叢外，亦可調節免疫及代謝相關病症。研究證實益生菌可活化調節型T細胞（regulatory T cell），使其分泌細胞激素IL-10與TGF-β以抑制TH2過度活化反應，並平衡TH1及TH2活性，進而減緩過敏反應。
中華民國發明專利公告號I429444提及鼠李糖乳桿菌菌株MP108及副乾酪乳桿菌菌株MP137可調節免疫功能、提升腸道免疫力及減低過敏反應。然而，上述菌株的發酵培養基為MRS肉湯培養基，為實驗室用且高成本的，故造成商業生產上有諸多限制。
本發明之目的在於透過碳源與氮源的篩選調配出適當的培養基，以用於副乾酪乳桿菌（
Lactobacillus paracasei）菌株MP137的培養，使菌株培養後可用於緩解過敏症狀。
是以，本發明提出一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的培養基，培養基以其總重量計包括：3wt％碳源與2.5至3.5wt％氮源，其中菌株MP137的寄存編號為BCRC910484，碳源為葡萄糖，氮源為大豆蛋白腖（soya peptone）。
示例地，培養基以其總重量計更包括：0.05至0.2wt％磷酸氫二鉀（dipotassium phosphate）、0至0.1wt％（但不為0）檸檬酸鈉（sodium citrate）、0至0.1wt％（但不為0）硫酸錳（manganese(II) sulfate）、及0.05至0.2wt％聚山梨醇酯80（Tween 80）。
本發明另提供一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的方法，其包括：培養副乾酪乳桿菌菌株MP137於上述培養基中，菌株MP137的寄存編號為BCRC910484。
示例地，培養溫度為35至42℃，培養環境包含1至10％二氧化碳，培養時間為16至40小時，培養起始菌量為每毫升培養基4x10
7至4x10
8CFU的菌株MP137。
本發明所提的培養基可提升菌株量、耐酸耐膽鹽特性、與37℃環境安定性，並可強化菌株調節個體分泌免疫激素的能力，藉此優化菌株。
基於此，本發明尚提供一種優化菌株，其為將副乾酪乳桿菌菌株MP137培養於上述培養基中形成，菌株MP137的寄存編號為BCRC910484。
本發明更提供一種緩解過敏症狀的組合物，其包括上述的優化菌株以及賦形劑、稀釋劑或載體。
示例地，每克組合物含有1.2x10
11至8.2x10
11CFU的優化菌株。
本發明又提供一種上述組合物的用途，其為用於製備治療或預防過敏症狀的組合物。
示例地，製備的組合物用於投予至個體以治療或預防過敏症狀，投予劑量為每日個體每公斤體重10
6至10
10CFU的優化菌株。
示例地，製備的組合物用於刺激個體產生IL-10及/或TGF-β以治療或預防過敏症狀。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：
本文所述的菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，地址為新竹市食品路331號、或中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，詳細寄存資訊如表1。
表1、寄存資訊
| 菌株 | 寄存編號 | 寄存日期 |
| 副乾酪乳桿菌 （ Lactobacillus paracasei）菌株MP137 | BCRC910484 | 2010年09月06日 |
| CGMCC21224 | 2020年11月23日 |
本發明第一實施樣態提出一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的培養基，此培養基可提升菌株生物量、耐酸耐膽鹽特性、與37℃環境安定性，並可強化菌株調節個體分泌免疫激素的能力。基於上述特性，本實施樣態的培養基可達到優化菌株MP137的功效。本實施樣態的培養基以其總重量計包括：3wt％碳源與2.5至3.5wt％氮源，碳源為葡萄糖，氮源為大豆蛋白腖。
為供給其他營養來源，培養基以其總重量計更可包括：0.05至0.2wt％磷酸氫二鉀、0至0.1wt％（但不為0）檸檬酸鈉、0至0.1wt％（但不為0）硫酸錳、及0.05至0.2wt％聚山梨醇酯80。
本發明第二實施樣態提出一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的方法，其包括：培養副乾酪乳桿菌菌株MP137於第一實施樣態所提的培養基。
培養溫度可為35至42℃，但不限於此；較佳地為37℃。培養環境可包含1至10％二氧化碳，但不限於此；較佳地包含5％二氧化碳。培養時間可為16至40小時，但不限於此；較佳地為24小時。培養起始菌量可為每毫升培養基4x10
7至4x10
8CFU的菌株MP137，但不限於此；較佳地為培養起始菌量為每毫升培養基8x10
7CFU的菌株MP137。
本發明第三實施樣態提出一種優化菌株，其為將副乾酪乳桿菌菌株MP137培養於第一實施樣態所提的培養基中形成。如前所述，本實施樣態所提的優化菌株具備高菌株量、高耐酸耐膽鹽特性、與高37℃環境安定性，並具有調節個體分泌免疫激素的活性。
本發明第四實施樣態提出一種緩解過敏症狀的組合物，其包括第三實施樣態所提的優化菌株以及賦形劑、稀釋劑或載體。
每克組合物可含有1.2x10
11至8.2x10
11CFU的優化菌株，但不限於此；較佳地含有5.0x10
11CFU的優化菌株。
賦形劑、稀釋劑或載體可為生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，使組合物製作成食品組合物。於食品組合物的條件下，生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可為食品，如：乳製飲品、茶、咖啡、糖果（如：口含片、咀嚼錠、或軟糖）、機能性飲品或以上任意組合，乳製飲品可為發酵乳、優格、乳酪、或乳粉。
賦形劑、稀釋劑或載體可為醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，使組合物製作成醫藥組合物。於醫藥組合物的條件下，醫藥組合物可呈口服劑型或皮膚外用劑型，口服劑型如為錠劑、膠囊、溶液劑、或粉劑。
本發明第五實施樣態提出一種第四實施樣態所提之組合物的用途，其為用於製備治療或預防過敏症狀的組合物。製備的組合物可投予至有治療或預防過敏症狀需求的個體以實現效果。投予劑量可為每日個體每公斤體重10
6至10
10CFU的優化菌株，但不限於此；較佳地為每日個體每公斤體重3.33x10
8CFU的優化菌株。更具體而言，製備的組合物可透過刺激個體產生IL-10及/或TGF-β來達到治療或預防過敏症狀的效果。
茲以下列實施例，例示說明本發明：
＜實施例1：材料與統計方法＞
以下實施例所用的碳源有：葡萄糖（購自三福化工股份有限公司）、海藻糖（購自仕琦股份有限公司）、乳糖（購自欣宏生化科技股份有限公司）、阿拉伯糖（購自新糖城科研企業股份有限公司）、GOS-半乳寡糖（購自綠立生醫國際股份有限公司）、FOS-果寡糖（購自綠立生醫國際股份有限公司）、果糖（購自美食家食材通路股份有限公司）、蔗糖（購自美食家食材通路股份有限公司）、異麥芽寡糖（購自詮亞股份有限公司）、菊糖（購自新和食品股份有限公司）。
以下實施例所用的氮源有：X-SEED KAT（購自碧寬實業有限公司）、X-SEED Nucleo MAX（購自碧寬實業有限公司）、X-SEED Nitroboost（購自碧寬實業有限公司）、Leiber-Bouillon N, LS（購自欣宏生化科技股份有限公司）、FNI 800（購自上鼎生技有限公司）、HSP349（購自統園企業股份有限公司）、FM505（購自德恩生醫股份有限公司）、酵母抽出物588MG（購自振芳股份有限公司）、酵母抽出物786MG（購自振芳股份有限公司）、X-SEED Peptone（購自碧寬實業有限公司）、Soya peptone（購自豐煜貿易股份有限公司）。
以下實施例的培養基基礎配方有：磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳、聚山梨醇酯80（購自Sigma-Aldrich）。
以下實施例所用的MRS購自Difco。
以下實施例的實驗重複進行3次。實驗結果以「平均值」表示，並以雙尾史徒登氏t-試驗（two-tailed Student’s t-test）確認結果差異性。
＜實施例2：碳源與氮源的種類選擇＞
本實施例採用單因素測驗（single factor experiment）來決定培養基的適當碳源與氮源。如表2所列，陳列含不同碳源與氮源的配方，每一配方與含磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳、與聚山梨醇酯80的基礎配方混合並調整pH至6.8至7.0，以取得培養基。另外，以MRS肉湯培養基作為對照組。
表2、碳源與氮源的組合配方
| 組別 | 碳源 | 氮源 |
| 配方1 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED KAT（1.5wt％） |
| 配方2 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Nucleo MAX（1.5wt％） |
| 配方3 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Nitroboost（1.5wt％） |
| 配方4 | 葡萄糖（2wt％） | Leiber-Bouillon N, LS（1.5wt％） |
| 配方5 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方6 | 葡萄糖（2wt％） | HSP349（1.5wt％） |
| 配方7 | 葡萄糖（2wt％） | FM505（1.5wt％） |
| 配方8 | 葡萄糖（2wt％） | 酵母抽出物588MG（1.5wt％） |
| 配方9 | 葡萄糖（2wt％） | 酵母抽出物786MG（1.5wt％） |
| 配方10 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Peptone（1.5wt％） |
| 配方11 | 葡萄糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方12 | 海藻糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方13 | 乳糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方14 | 阿拉伯糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方15 | 半乳寡糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方16 | 果寡糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方17 | 果糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方18 | 蔗糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方19 | 異麥芽寡糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方20 | 菊糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| MRS | 葡萄糖（2wt％） | 牛肉與酵母萃取物（1.5wt％） |
取適量的副乾酪乳桿菌菌株MP137種植於培養基，並於培養箱（37℃，二氧化碳濃度5％）內培養24小時。接著，冷凍乾燥取得菌粉。最後，進行以下測試：（1）平板計數檢測菌數；（2）將菌粉置於37℃環境一個月後，平板計數檢測菌數；（3）將菌粉置於pH3.5的酸化培養基3小時後，先清洗再置於0.3％膽鹽的培養基4小時，最後平板計數檢測菌數。
請參照圖1，含配方10、配方11與配方18的培養基可使菌株量於培養後分別達4.07x10
11CFU/g、4.27x10
11CFU/g、4.17x10
11CFU/g，均優於MRS肉湯培養基的5.89x10
10CFU/g。請再參照圖1，含配方10、配方11與配方18的培養基可使菌株量於置放一個月後分別下降至3.02x10
9CFU/g、4.57x10
9CFU/g、1.70x10
9CFU/g，仍均優於MRS肉湯培養基的1.29x10
7CFU/g。比較培養後與置放一個月後的菌株量，可知含配方10、配方11與配方18的培養基可使菌株量的降幅低於MRS肉湯培養基。以上證實含配方10、配方11與配方18的培養基可提升菌株的數量與37℃環境安定性。
請參照圖2，含配方10、配方11與配方18的培養基可使菌株經酸與膽鹽處理後的存活率分別為9.38％、10.97％、9.94％，高於其他配方（約2％）與MRS肉湯培養基（1.41％）。以上證實含配方10、配方11與配方18的培養基可提升菌株耐酸膽鹽特性。
將人類單核球細胞THP1種植於含10％FBS的培養液RPMI-1640。培養後，以相同的菌量將菌粉與人類單核球細胞THP1共同培養。最後，利用ELISA套組檢測培養液中的細胞激素IL-10與TGF-β含量。
請參照圖3、4，含配方11的培養基可使菌株刺激人類單核球細胞THP1產生的IL-10含量為129.89±13.33pg/mL與TGF-β含量為68.63±4.71pg/mL，均高於其他培養基。以上證實含配方11的培養基可調節個體產生細胞激素IL-10與TGF-β。
＜實施例3：最適化的比例選擇＞
根據上述結果，調配葡萄糖與Soya peptone的比例製作不同配方，陳列於表3。每一配方與含磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳、與聚山梨醇酯80的基礎配方混合並調整pH至6.8至7.0，以取得培養基。另外，以MRS肉湯培養基作為對照組。
表3、碳源與氮源的組合配方
| 組別 | 碳源 | 氮源 |
| 配方11-1 | 葡萄糖（1wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方11-2 | 葡萄糖（2wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方11-3 | 葡萄糖（3wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方11-4 | 葡萄糖（4wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方11-5 | 葡萄糖（5wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方11-6 | 葡萄糖（6wt％） | Soya peptone（1.5wt％） |
| 配方11-7 | 葡萄糖（3wt％） | Soya peptone（2.5wt％） |
| 配方11-8 | 葡萄糖（3wt％） | Soya peptone（3.5wt％） |
| MRS | 葡萄糖（2wt％） | 牛肉與酵母萃取物（1.5wt％） |
取適量的副乾酪乳桿菌菌株MP137種植於培養基，並於培養箱（37℃，二氧化碳濃度5％）內培養24小時。接著，冷凍乾燥取得菌粉。最後，進行以下測試：（1）平板計數檢測菌數；（2）將菌粉置於37℃環境中一個月後，平板計數檢測菌數；（3）將菌粉置於pH3.5的酸化培養基3小時後，先清洗再置於0.3％膽鹽的培養基4小時，最後平板計數檢測菌數。
請參照圖5，含配方11-3、配方11-7與配方11-8的培養基可使菌株量於培養後分別達4.47x10
11CFU/g、5.01x10
11CFU/g、4.27x10
11CFU/g，均優於MRS肉湯培養基的5.89x10
10CFU/g。請再參照圖5，含配方11-3、配方11-7與配方11-8的培養基可使菌株量於置放一個月後分別下降至4.37x10
9CFU/g、6.46x10
9CFU/g、3.80x10
9CFU/g，仍均優於MRS肉湯培養基的1.29x10
7CFU/g。比較培養後與置放一個月後的菌株量，可知含配方11-3、配方11-7與配方11-8的培養基可使菌株量的降幅低於MRS肉湯培養基。以上證實含配方11-3、配方11-7與配方11-8的培養基可提升菌株的數量與37℃環境安定性。
請參照圖6，含配方11-3、配方11-7與配方11-8的培養基可使菌株經酸與膽鹽處理後的存活率分別為13.51％、14.52％、13.37％，高於配方11-2（約11.36％）與MRS肉湯培養基（1.56％）。以上證實含配方11-3、配方11-7與配方11-8的的培養基可提升菌株耐酸膽鹽特性。
將人類單核球細胞THP1種植於含10％FBS的培養液RPMI-1640。培養後，以相同的菌株量將菌粉與人類單核球細胞THP1共同培養。最後，利用ELISA套組檢測培養液中的細胞激素IL-10與TGF-β含量。
請參照圖7、8，含配方11-7與配方11-8的培養基可使菌株刺激人類單核球細胞THP1產生的IL-10含量分別為151.60±15.33pg/mL、124.60±14.62pg/mL與TGF-β含量分別為90.18±6.92pg/mL、85.57±10.34pg/mL，均高於其他培養基。以上證實含配方11-7與配方11-8的培養基可調節個體產生細胞激素IL-10與TGF-β。
綜上所述，本發明透過特定比例的葡萄糖與大豆蛋白腖分別作為培養基的碳源與氮源來提升菌株的生物量、耐酸耐膽鹽特性、37℃環境安定性、與調節個體分泌免疫激素的活性。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
圖1為一統計圖，比較菌株MP137於不同碳源與氮源之培養基培養後以及之後於37℃置放一個月後的菌量；
圖2為一統計圖，比較菌株MP137先於不同碳源與氮源之培養基培養，再依序置放於酸化培養基及含膽鹽之培養基後的菌株存活率；
圖3為一統計圖，比較菌株MP137於不同碳源與氮源之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素IL-10的量；
圖4為一統計圖，比較菌株MP137於不同碳源與氮源之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素TGF-β的量；
圖5為一統計圖，比較菌株MP137於不同濃度葡萄糖與不同濃度大豆蛋白腖之培養基培養後以及之後於37℃置放一個月後的菌量；
圖6為一統計圖，比較菌株MP137先於不同濃度葡萄糖與不同濃度大豆蛋白腖之培養基，再依序置放於酸化培養基及含膽鹽之培養基後的菌株存活率；
圖7為一統計圖，比較菌株MP137於不同濃度葡萄糖與不同濃度大豆蛋白腖之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素IL-10的量；以及
圖8為一統計圖，比較菌株MP137於不同濃度葡萄糖與不同濃度大豆蛋白腖之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素TGF-β的量。
TW中華民國 食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 2010/09/06 BCRC910484。
Claims (10)
- 一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的培養基，以其總重量計包括： 3wt％碳源；以及 2.5至3.5wt％氮源； 其中該菌株MP137的寄存編號為BCRC910484，該碳源為葡萄糖，該氮源為大豆蛋白腖（soya peptone）。
- 如請求項1所述之培養基，以其總重量計更包括： 0.05至0.2wt％磷酸氫二鉀（dipotassium phosphate）、0至0.1wt％（但不為0）檸檬酸鈉（sodium citrate）、0至0.1wt％（但不為0）硫酸錳（manganese(II) sulfate）、及0.05至0.2wt％聚山梨醇酯80（Tween 80）。
- 一種優化副乾酪乳桿菌菌株MP137的方法，係包括： 培養副乾酪乳桿菌菌株MP137於如請求項1所述之培養基中，該菌株MP137的寄存編號為BCRC910484。
- 如請求項1所述之優化方法，其中培養溫度為35至42℃，培養環境包含1至10％二氧化碳，培養時間為16至40小時，培養起始菌量為每毫升培養基4x10 7至4x10 8CFU的菌株MP137。
- 一種優化菌株，係將副乾酪乳桿菌菌株MP137培養於如請求項1所述之培養基中形成，該菌株MP137的寄存編號為BCRC910484。
- 一種緩解過敏症狀的組合物，係包括： 如請求項5所述之優化菌株；以及 賦形劑、稀釋劑或載體。
- 如請求項6所述之組合物，其中每克該組合物含有1.2x10 11至8.2x10 11CFU的優化菌株。
- 一種如請求項6所述之組合物的用途，係用於製備治療或預防過敏症狀的組合物。
- 如請求項8所述之用途，其中該製備的組合物用於投予至個體以治療或預防過敏症狀，投予劑量為每日個體每公斤體重10 6至10 10CFU的該優化菌株。
- 如請求項9所述之用途，其中該製備的組合物用於刺激該個體產生IL-10及/或TGF-β以治療或預防過敏症狀。
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