TWI827346B - 可提升具調節過敏免疫激素的優化鼠李糖乳桿菌菌株mp108及其取得方法 - Google Patents
可提升具調節過敏免疫激素的優化鼠李糖乳桿菌菌株mp108及其取得方法 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提出一種優化鼠李糖乳桿菌菌株MP108的培養基，培養基以其總重量計包括：2wt％碳源與3至5wt％氮源，其中菌株MP108的寄存編號為BCRC910483，碳源為葡萄糖，氮源為FNI 800酵母蛋白腖。
Description
本發明關於一種優化乳酸菌菌株的培養基，特別攸關一種優化鼠李糖乳桿菌菌株MP108的培養基，其除了可提升菌量、耐酸耐膽鹽性、與環境安定性外，更可調節個體分泌免疫激素，藉以提升預防或改善過敏症狀的效果。
過敏性疾病屬於全球常見問題。隨著醫療技術發展與衛生環境改善，過敏案例卻有增無減，其中又以先進國家更為嚴重。於所有過敏性疾病中，第1型過敏佔多數，包含：皮膚炎、氣喘、鼻炎、結膜炎，為常見的臨床慢性疾病。主要病因為第2型輔助T細胞（Th2）受抗原刺激，誘發一連串免疫反應導致細胞激素IL-4、IL-5與IL-13及免疫球蛋白IgE產生，以抑制第1型輔助T細胞（Th1）活性並促進發炎反應。Th1/Th2的平衡受轉錄因子GATA-3與T-bet的表現控制。調節型T細胞（Treg）的數量與功能下降亦與免疫反應的失衡及降低有關。以上可能受腸道微生物的組成結構影響。
益生菌能調節先天或後天免疫系統，啟動黏膜或全身免疫反應。具體而言，益生菌於腸道內定殖，誘導腸道菌群發生變化並調節細胞因子分泌。益生菌亦可透過刺激細胞產生細胞激素來調節Th1/Th2/Treg的平衡，啟動體內強化Th1與Treg的免疫路徑，產生細胞激素IFN-γ、IL-10、TGF-β來抑制Th2反應，達到緩解過敏。益生菌更可增加腸道短鏈脂肪酸含量，其中丁酸鹽與降低發炎有關。降低血清中的嗜酸性粒細胞數量與金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）的表現也有助改善過敏性疾病的症狀。
多數益生菌屬於乳酸菌（lactic acid bacterium，LAB）。乳酸菌為安全且廣泛存在的，可使用或添加於食品或保健品。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）將多數乳酸菌列為安全食品添加（qualified presumption of safety，QPS）微生物。我國衛福部食品藥物管理署亦將乳酸菌中的7個菌屬與38個菌種列為食用原料，包含：鼠李糖乳桿菌（
Lactobacillus rhamnosus）、乾酪乳桿菌（
Lactobacillus casei）、副乾酪乳桿菌（
Lactobacillus paracasei）、動物雙歧桿菌（
Bifidobacterium animalis）、嗜熱鏈球菌（
Streptococcus thermophilus）。
益生菌會強化人體的吞噬作用並抑制促炎細胞因子生成，故可視為過敏調節劑，用於過敏性疾病的治療與預防。CRS Prakoeswa等人於2020年以胚芽乳酸菌（
Lactobacillus plantarum）菌株IS-10506對成人異位性皮膚炎進行8周臨床測試，結果顯示益生菌可顯著改善受試者的嚴重度分數（scoring of atopic dermatitis，SCORAD）。益生菌組的IFN-γ表現量明顯增加，IL-4表現量明顯減少，CD4+細胞數顯著增加。雖然IgE含量變化未達統計差異，但平均值仍有下降趨勢。
益生菌對宿主的健康有益，但絕非攝取量越多越好。益生菌須於腸道內定殖至一定數量始能發揮效果。然而，益生菌攝取後會遇到人體許多防禦機制，如：胃酸與膽鹽均不利益生菌存活，故其耐胃酸膽鹽的能力尤其重要。
微生物培養基為菌株生長及代謝的必要養分來源，配方組成均有其目的性，不同菌株適合的培養基亦不同。近年許多研究利用篩選微生物培養基來產生特定代謝產物或增加生產量。適當比例的碳源及氮源亦會影響微生物生長。例如，溫度與蛋白腖（peptone）及甘蔗糖蜜（molasses）的濃度可提升副乾酪乳桿菌堅韌亞種（
Lactobacillus paracaseisubsp.
tolerans）菌株N2分泌抗菌化合物。酵母萃取物、葡萄糖與維生素的比例亦會影響鼠李糖乳桿菌生長。
中華民國發明專利公告號I429444提及鼠李糖乳桿菌菌株MP108及副乾酪乳桿菌菌株MP137可調節免疫功能、提升腸道免疫力及減低過敏反應。然而，上述菌株的發酵培養基為MRS肉湯培養基，為實驗室用且高成本的，故造成商業生產上有諸多限制。
本發明之目的在於透過碳源與氮源的篩選調配出適當的培養基，以用於鼠李糖乳桿菌（
Lactobacillus rhamnosus）菌株MP108的培養，使菌株培養後可用於緩解過敏症狀。
是以，本發明提出一種優化鼠李糖乳桿菌菌株MP108的培養基，培養基以其總重量計包括：2wt％碳源與3至5wt％氮源，其中菌株MP108的寄存編號為BCRC910483，碳源為葡萄糖，氮源為FNI 800酵母蛋白腖（yeast peptone）。
示例地，培養基以其總重量計更包括：0.05至0.2wt％磷酸氫二鉀（dipotassium phosphate）、0至0.1wt％（但不為0）檸檬酸鈉（sodium citrate）、0至0.1wt％（但不為0）硫酸錳（manganese(II) sulfate）、及0.05至0.2wt％聚山梨醇酯80（Tween 80）。
本發明另提供一種優化鼠李糖乳桿菌菌株MP108的方法，其包括：培養鼠李糖乳桿菌菌株MP108於上述培養基中，菌株MP108的寄存編號為BCRC910483。
示例地，培養溫度為35至42℃，培養環境包含1至10％二氧化碳，培養時間為16至40小時，培養起始菌量為每毫升培養基4x10
7至8x10
8CFU的菌株MP108。
本發明所提的培養基可提升菌株量、耐酸耐膽鹽特性、與37℃環境安定性，並可強化菌株調節個體分泌免疫激素的能力，藉此優化菌株。
基於此，本發明尚提供一種優化菌株，其為將鼠李糖乳桿菌菌株MP108培養於上述培養基中形成，菌株MP108的寄存編號為BCRC910483。
本發明更提供一種緩解過敏症狀的組合物，其包括上述的優化菌株以及賦形劑、稀釋劑或載體。
示例地，每克組合物含有1.5x10
11至8.3x10
11CFU的優化菌株。
本發明又提供一種上述組合物的用途，其為用於製備治療或預防過敏症狀的組合物。
示例地，製備的組合物用於投予至個體以治療或預防過敏症狀，投予劑量為每日個體每公斤體重10
6至10
10CFU的優化菌株。
示例地，製備的組合物用於刺激個體產生IL-10及/或TGF-β以治療或預防過敏症狀。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：
本文所述的菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，地址為新竹市食品路331號、或中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，詳細寄存資訊如表1。
表1、寄存資訊
| 菌株 | 寄存編號 | 寄存日期 |
| 鼠李糖乳桿菌 （ Lactobacillus rhamnosus）菌株MP108 | BCRC910483 | 2010年09月06日 |
| CGMCC21225 | 2020年11月23日 |
本發明第一實施樣態提出一種優化鼠李糖乳桿菌菌株MP108的培養基，此培養基可提升菌株生物量、耐酸耐膽鹽特性、與37℃環境安定性，並可強化菌株調節個體分泌免疫激素的能力。基於上述特性，本實施樣態的培養基可達到優化菌株MP108的功效。本實施樣態的培養基以其總重量計包括：2wt％碳源與3至5wt％氮源，碳源為葡萄糖，氮源為FNI 800酵母蛋白腖。
為供給其他營養來源，培養基以其總重量計更可包括：0.05至0.2wt％磷酸氫二鉀、0至0.1wt％（但不為0）檸檬酸鈉、0至0.1wt％（但不為0）硫酸錳、及0.05至0.2wt％聚山梨醇酯80。
本發明第二實施樣態提出一種優化鼠李糖乳桿菌菌株MP108的方法，其包括：培養鼠李糖乳桿菌菌株MP108於第一實施樣態所提的培養基。
培養溫度可為35至42℃，但不限於此；較佳地為37℃。培養環境可包含1至10％二氧化碳，但不限於此；較佳地包含5％二氧化碳。培養時間可為16至40小時，但不限於此；較佳地為24小時。培養起始菌量可為每毫升培養基4x10
7至8x10
8CFU的菌株MP108，但不限於此；較佳地為每毫升培養基8x10
7CFU的菌株MP108。
本發明第三實施樣態提出一種優化菌株，其為將鼠李糖乳桿菌菌株MP108培養於第一實施樣態所提的培養基中形成。如前所述，本實施樣態所提的優化菌株具備高菌株量、高耐酸耐膽鹽特性、與高37℃環境安定性，並具有調節個體分泌免疫激素的活性。
本發明第四實施樣態提出一種緩解過敏症狀的組合物，其包括第三實施樣態所提的優化菌株以及賦形劑、稀釋劑或載體。
每克組合物可含有1.5x10
11至8.3x10
11CFU的優化菌株，但不限於此；較佳地含有6.5x10
11CFU的優化菌株。
賦形劑、稀釋劑或載體可為生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，使組合物製作成食品組合物。於食品組合物的條件下，生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可為食品，如：乳製飲品、茶、咖啡、糖果（如：口含片、咀嚼錠、或軟糖）、機能性飲品或以上任意組合，乳製飲品可為發酵乳、優格、乳酪、或乳粉。
賦形劑、稀釋劑或載體可為醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，使組合物製作成醫藥組合物。於醫藥組合物的條件下，醫藥組合物可呈口服劑型或皮膚外用劑型，口服劑型如為錠劑、膠囊、溶液劑、或粉劑。
本發明第五實施樣態提出一種第四實施樣態所提之組合物的用途，其為用於製備治療或預防過敏症狀的組合物。製備的組合物可投予至有治療或預防過敏症狀需求的個體以實現效果。投予劑量可為每日個體每公斤體重10
6至10
10CFU的優化菌株，但不限於此；較佳地為每日個體每公斤體重3.33x10
8CFU的優化菌株。更具體而言，製備的組合物可透過刺激個體產生IL-10及/或TGF-β來達到治療或預防過敏症狀的效果。
茲以下列實施例，例示說明本發明：
＜實施例1：材料與統計方法＞
以下實施例所用的碳源有：葡萄糖（購自三福化工股份有限公司）、海藻糖（購自仕琦股份有限公司）、乳糖（購自欣宏生化科技股份有限公司）、阿拉伯糖（購自新糖城科研企業股份有限公司）、GOS-半乳寡糖（購自綠立生醫國際股份有限公司）、FOS-果寡糖（購自綠立生醫國際股份有限公司）、果糖（購自美食家食材通路股份有限公司）、蔗糖（購自美食家食材通路股份有限公司）、菊糖（購自新和食品股份有限公司）、水蘇糖（購自新糖城科研企業股份有限公司）。
以下實施例所用的氮源有：X-SEED KAT（購自碧寬實業有限公司）、X-SEED Nucleo MAX（購自碧寬實業有限公司）、X-SEED Nitroboost（購自碧寬實業有限公司）、Leiber-Bouillon N, LS（購自欣宏生化科技股份有限公司）、FNI 800（購自上鼎生技有限公司）、HSP349（購自統園企業股份有限公司）、FM505（購自德恩生醫股份有限公司）、酵母抽出物588MG（購自振芳股份有限公司）、酵母抽出物786MG（購自振芳股份有限公司）、X-SEED Peptone（購自碧寬實業有限公司）、X-SEED Nucleo Advanced（購自碧寬實業有限公司）。
以下實施例的培養基基礎配方有：磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳、聚山梨醇酯80（購自Sigma-Aldrich）。
以下實施例所用的MRS購自Difco。
以下實施例的實驗重複進行3次。實驗結果以「平均值」表示，並以雙尾史徒登氏t-試驗（two-tailed Student’s t-test）確認結果差異性。
＜實施例2：碳源與氮源的種類選擇＞
本實施例採用單因素測驗（single factor experiment）來決定培養基的適當碳源與氮源。如表2所列，陳列含不同碳源與氮源的配方，每一配方與含磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳、與聚山梨醇酯80的基礎配方混合並調整pH至6.8至7.0，以取得培養基。另外，以MRS肉湯培養基作為對照組。
表2、碳源與氮源的組合配方
| 組別 | 碳源 | 氮源 |
| 配方1 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED KAT（1.5wt％） |
| 配方2 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Nucleo MAX（1.5wt％） |
| 配方3 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Nitroboost（1.5wt％） |
| 配方4 | 葡萄糖（2wt％） | Leiber-Bouillon N, LS（1.5wt％） |
| 配方5 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方6 | 海藻糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方7 | 乳糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方8 | 葡萄糖（2wt％） | HSP349（1.5wt％） |
| 配方9 | 半乳寡糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方10 | 果寡糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方11 | 葡萄糖（2wt％） | FM505（1.5wt％） |
| 配方12 | 葡萄糖（2wt％） | 酵母抽出物588MG（1.5wt％） |
| 配方13 | 阿拉伯糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方14 | 果糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方15 | 蔗糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方16 | 葡萄糖（2wt％） | 酵母抽出物786MG（1.5wt％） |
| 配方17 | 菊糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方18 | 水蘇糖（2wt％） | FNI 800（1.5wt％） |
| 配方19 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Peptone（1.5wt％） |
| 配方20 | 葡萄糖（2wt％） | X-SEED Nucleo Advanced（1.5wt％） |
| MRS | 葡萄糖（2wt％） | 牛肉與酵母萃取物（1.5wt％） |
取適量的鼠李糖乳桿菌菌株MP108種植於培養基，並於培養箱（37℃，二氧化碳濃度5％）內培養24小時。接著，冷凍乾燥取得菌粉。最後，進行以下測試：（1）平板計數檢測菌數；（2）將菌粉置於37℃環境一個月後，平板計數檢測菌數；（3）將菌粉置於pH3.5的酸化培養基3小時後，先清洗再置於0.3％膽鹽的培養基4小時，最後平板計數檢測菌數。
請參照圖1，含配方5、配方6與配方13的培養基可使菌株量於培養後分別達6.50x10
11CFU/g、5.55x10
11CFU/g、5.06x10
11CFU/g，均優於MRS肉湯培養基的2.91x10
9CFU/g。請再參照圖1，含配方5、配方6與配方13的培養基可使菌株量於置放一個月後分別下降至5.41x10
10CFU/g、3.34x10
10CFU/g、2.91x10
10CFU/g，仍均優於MRS肉湯培養基的2.06x10
6CFU/g。比較培養後與置放一個月後的菌株量，可知含配方5、配方6與配方13的培養基可使菌株量的降幅低於MRS肉湯培養基。以上證實含配方5、配方6與配方13的培養基可提升菌株的數量與37℃環境安定性。
請參照圖2，含配方5、配方6與配方13的培養基可使菌株經酸與膽鹽處理後的存活率分別為54.43％、37.08％、38.82％，均高於30％。以上證實含配方5、配方6與配方13的培養基可提升菌株耐酸膽鹽特性。
將人類單核球細胞THP1種植於含10％FBS的培養液RPMI-1640。培養後，以相同的菌量將菌粉與人類單核球細胞THP1共同培養。最後，利用ELISA套組檢測培養液中的細胞激素IL-10與TGF-β含量。
請參照圖3、4，含配方5的培養基可使菌株刺激人類單核球細胞THP1產生的IL-10與TGF-β含量高於其他培養基。以上證實含配方5的培養基可調節個體產生細胞激素IL-10與TGF-β。
＜實施例3：最適化的比例選擇＞
根據上述結果，調配FNI 800的比例製作不同配方，陳列於表3。每一配方與含磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、硫酸錳、與聚山梨醇酯80的基礎配方混合並調整pH至6.8至7.0，以取得培養基。另外，以MRS肉湯培養基作為對照組。
表3、碳源與氮源的組合配方
| 組別 | 碳源 | 氮源 |
| 配方5-1 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（0.1wt％） |
| 配方5-2 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（0.5wt％） |
| 配方5-3 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（1.0wt％） |
| 配方5-4 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（3.0wt％） |
| 配方5-5 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（5.0wt％） |
| 配方5-6 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（7.0wt％） |
| 配方5-7 | 葡萄糖（2wt％） | FNI 800（9.0wt％） |
| MRS | 葡萄糖（2wt％） | 牛肉與酵母萃取物（1.5wt％） |
取適量的鼠李糖乳桿菌菌株MP108種植於培養基，並於培養箱（37℃，二氧化碳濃度5％）內培養24小時。接著，冷凍乾燥取得菌粉。最後，進行以下測試：（1）平板計數檢測菌數；（2）將菌粉置於37℃環境中一個月後，平板計數檢測菌數；（3）將菌粉置於pH3.5的酸化培養基3小時後，先清洗再置於0.3％膽鹽的培養基4小時，最後平板計數檢測菌數。
請參照圖5，含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可使菌株量於培養後分別達3.69x10
11CFU/g、6.80x10
11CFU/g、4.55x10
11CFU/g，均優於MRS肉湯培養基的2.91x10
9CFU/g。請再參照圖5，含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可使菌株量於置放一個月後分別下降至1.77x10
10CFU/g、5.66x10
10CFU/g、2.74x10
10CFU/g，仍均優於MRS肉湯培養基的2.06x10
6CFU/g。比較培養後與置放一個月後的菌株量，可知含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可使菌株量的降幅低於MRS肉湯培養基。以上證實含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可提升菌株的數量與37℃環境安定性。
請參照圖6，含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可使菌株經酸與膽鹽處理後的存活率分別為45.05％、54.98％、48.88％，均高於30％。以上證實含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可提升菌株耐酸膽鹽特性。
將人類單核球細胞THP1種植於含10％FBS的培養液RPMI-1640。培養後，以相同的菌株量將菌粉與人類單核球細胞THP1共同培養。最後，利用ELISA套組檢測培養液中的細胞激素IL-10與TGF-β含量。
請參照圖7、8，含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可使菌株刺激人類單核球細胞THP1產生的IL-10與TGF-β含量高於其他培養基。以上證實含配方5-3、配方5-4與配方5-5的培養基可調節個體產生細胞激素IL-10與TGF-β。
綜上所述，本發明透過特定比例的葡萄糖與FNI 800分別作為培養基的碳源與氮源來提升菌株的生物量、耐酸耐膽鹽特性、37℃環境安定性、與調節個體分泌免疫激素的活性。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
圖1為一統計圖，比較菌株MP108於不同碳源與氮源之培養基培養後以及之後於37℃置放一個月後的菌量；
圖2為一統計圖，比較菌株MP108先於不同碳源與氮源之培養基培養，再依序置放於酸化培養基及含膽鹽之培養基後的菌株存活率；
圖3為一統計圖，比較菌株MP108於不同碳源與氮源之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素IL-10的量；
圖4為一統計圖，比較菌株MP108於不同碳源與氮源之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素TGF-β的量；
圖5為一統計圖，比較菌株MP108於不同濃度FNI 800酵母蛋白腖之培養基培養後以及之後於37℃置放一個月後的菌量；
圖6為一統計圖，比較菌株MP108先於不同濃度FNI 800酵母蛋白腖之培養基，再依序置放於酸化培養基及含膽鹽之培養基後的菌株存活率；
圖7為一統計圖，比較菌株MP108於不同濃度FNI 800酵母蛋白腖之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素IL-10的量；以及
圖8為一統計圖，比較菌株MP108於不同濃度FNI 800酵母蛋白腖之培養基培養後誘發免疫細胞分泌細胞激素TGF-β的量。
TW中華民國 食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 2010/09/06 BCRC910483。
Claims (10)
- 一種優化鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株MP108的培養基，以其總重量計包括：2wt%碳源；以及3至5wt%氮源；其中該菌株MP108的寄存編號為BCRC910483，該碳源為葡萄糖，該氮源為FNI 800酵母蛋白腖(yeast peptone)。
- 如請求項1所述之培養基，以其總重量計更包括：0.05至0.2wt%磷酸氫二鉀(dipotassium phosphate)、0至0.1wt%(但不為0)檸檬酸鈉(sodium citrate)、0至0.1wt%(但不為0)硫酸錳(manganese(II)sulfate)、及0.05至0.2wt%聚山梨醇酯80(Tween 80)。
- 一種優化鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株MP108的方法，係包括：培養鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株MP108於如請求項1所述之培養基中，該菌株MP108的寄存編號為BCRC910483。
- 如請求項1所述之優化方法，其中培養溫度為35至42℃，培養環境包含1至10%二氧化碳，培養時間為16至40小時，培養起始菌量為每毫升培養基4x107至8x108CFU的菌株MP108。
- 一種優化菌株，係將鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株MP108培養於如請求項1所述之培養基中形成，該菌株MP108的寄存編號為BCRC910483。
- 一種緩解過敏症狀的組合物，係包括： 如請求項5所述之優化菌株；以及賦形劑、稀釋劑或載體。
- 如請求項6所述之組合物，其中每克該組合物含有1.5x1011至8.3x1011CFU的優化菌株。
- 一種如請求項6所述之組合物的用途，係用於製備治療或預防過敏症狀的組合物。
- 如請求項8所述之用途，其中該製備的組合物用於投予至個體以治療或預防過敏症狀，投予劑量為每日個體每公斤體重106至1010CFU的該優化菌株。
- 如請求項9所述之用途，其中該製備的組合物用於刺激該個體產生IL-10及/或TGF-β以治療或預防過敏症狀。
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