TWI804133B

TWI804133B - 具有ｎｍｎ延緩老化功效的發酵組合物

Info

Publication number: TWI804133B
Application number: TW110148781A
Authority: TW
Inventors: 黃檉; 賴怡君; 賴柏儒
Original assignee: 大漢酵素生物科技股份有限公司
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-06-01
Also published as: TW202325324A

Abstract

一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物，該發酵組合物將一蔬果原料，透過一特殊發酵製備方法取得一發酵組合物，其中該蔬果原料包含松露、菇蕈類子實體、酪梨、番茄或毛豆，該發酵組合物具有抗老化之功效。

Description

具有NMN延緩老化功效的發酵組合物

本發明提供一種發酵組合物，可以有效的延緩老化相關基因表達、提高抗氧化物指標SOD及GSH含量、降低組織器官氧化物濃度，達到抗老化的效果。

NMN(煙醯胺單核苷酸)是維生素B3(菸酸)的衍生物之一，也是NAD+生物合成的中間產物，是由磷酸基團和含有核糖(ribose)和煙醯胺(nicotinamide)的核苷反應形成的生物活性核苷酸。

NMN目前已被日本核准可使用於食品添加物中，日本是以發酵技術產生出NMM後，以純化方式得到高濃度NMN物質，但至今除日本外，尚無其他國家核准NMN使用於食品中，目前是受保健品訴求之NMN皆為添加維生素B3仿造NMN物質，維生素B3雖為NMN前驅物質，但在發揮作用前仍需要體內的酵素進行轉換，生成NAD+後才具有活性。

然而，市售NMN訴求的保健品，實際上皆為添加維生素B3，在老化的族群中，其體內的代謝率並無法完整的將維生素B3轉化為NAD+，因此攝取維生素B3很難達到如同NMN的延緩老化作用，另外在一些醫師的研究中，NMN主要能提高細胞的再生能力，但對於癌細胞是否有相同作用，並無完整研究證實，因此可能存在食用上的風險。

有鑑於此，相關領域亟需開發一種類似NMN成分且具有延緩老化的潛力的組合物。

為解決上述問題，本發明提供一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，包含：

(1)蔬果萃取步驟：將不同蔬果分別以物理方式壓榨蔬果至果實或子實體呈碎塊狀，同時保留汁液與果渣或子實體，以取得複數個第一萃取物；

(2)負壓破壁工法：添加0.15~1.5%一有機黑糖，以提高該些第一萃取物等滲透壓，並同時以負壓萃取方式在35cmHg~45cmHg近真空環境中，持續萃取3~15天，使蔬果細胞壁破裂，釋放出細胞內營養成分及胞內多醣，以取得複數個第二萃取物；

(3)低溫發酵階段：以一酵母菌，以比例0.5~1.5%(107CFU/ml)植入該些第二萃取物中，發酵溫度控制在2~12℃，持續發酵3~15天，在此階段菌種處於低活性、讓酵素作用大於菌種作用，減緩糖類的消耗，在發酵過程中防腐，提高纖維聚糖的分解作用，促進細胞壁分解，以取得複數個第一發酵物；

(4)深層發酵階段：以一乳酸菌，以比例0.5~1.5%(107CFU/ml)；0.15~0.25%一異麥芽寡糖植入該些第一發酵物中，發酵溫度控制在20~35℃，持續發酵5~25天，在此階段乳酸菌消耗糖類生成乳酸，降低pH值達到防腐作用，且提高酸度降低黏稠度，以取得複數個第二發酵物；

(5)螯合發酵階段：以一醋酸菌，以比例0.5~1.5%(107CFU/ml)；2.5~5.5%一D-山梨醇植入該些第二發酵物中，發酵溫度控制在10~25℃，持續發酵5~20 天，在此階段耗氧環境消耗葡萄糖產生醋酸，消耗乙醇且提高酸度降低黏稠度，以取得複數個第三發酵物；以及

(6)乾燥造粒步驟：將通過(1)-(5)步驟發酵完成之該些第三發酵物，進行過濾以取得複數個發酵液並保留該些發酵液，再將該些發酵液以等比例混合後，以噴霧乾燥造粒，取得該發酵組合物。

本發明另提供一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物，包含一蔬果原料，該蔬果原料包含松露、菇蕈類子實體、酪梨、番茄或毛豆，並透過一特殊發酵製備方法取得一發酵組合物。

在本發明一實施例中，該具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該蔬果萃取步驟進一步包含將該些蔬果與水混合的步驟。

在本發明一實施例中，該具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該蔬果包含松露、菇蕈類子實體、酪梨、番茄或毛豆。

在本發明一實施例中，該具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該蔬果萃取步驟之蔬果為松露或菇蕈類子實體時，在以物理方式壓榨前，進一步包含以65~100℃熱水淨泡25~35分鐘軟化之步驟。

在本發明一實施例中，該具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該些蔬果與水混合的比例分別為松露或菇蕈類子實體比水1：40；酪梨比水1：25；番茄比水1：1；毛豆比水1：30。

在本發明一實施例中，該具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該些第二萃取物pH值介於5.5~7；該些第一發酵物pH值介於5~6.5；該些第二發酵物pH值介於4.5~5.5；該些第三發酵物pH值介於3~3.5。

在本發明一實施例中，該具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該些第二萃取物糖度介於21~28°Brix；該些第一發酵物糖度介於15~34°Brix；該些第二發酵物糖度介於15~38°Brix；該些第三發酵物糖度介於10~50°Brix。

在本發明一實施例中，具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該乳酸菌係選自由植物乳桿菌(L.plantarum)、保加利亞乳桿菌(L.delbrueckii)、乳酸乳球菌(L.lactis)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和比菲德氏菌(B.bifidum)所組成之群組。

在本發明一實施例中，具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該酵母菌或該醋酸菌係選自由白麴菌(S.fibuligera)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、膜畢赤酵母(P.faciens)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、弱氧化促酸菌(A.hansenii)、木質醋酸菌(A.xylinum)和弱氧化醋酸桿菌(A.suboxydans)所組成之群組。

在本發明一實施例中，具有NMN延緩老化功效的發酵組合物用於製備延緩老化之藥物的用途，其延緩老化係指延緩老化相關基因表達、提高抗氧化物指標SOD及GSH含量、降低組織器官氧化物濃度。

本發明之主要目的另提供一具有NMN延緩老化功效的發酵組合物用於製備延緩老化之一藥物的用途，其中該藥物可以用於延緩心臟、腦部、肝臟的老化。

圖1A-1D顯示溫度梯度發酵技術與傳統發酵技術於糖度、PH值、纖維素、多醣體的差異。

圖2A-2C顯示本發明具有NMN延緩老化功效的發酵組合物對於小鼠血球細胞基因表達量的結果圖。

圖3A-3B為本發明具有NMN延緩老化功效的發酵組合物對於小鼠血液抗氧化物指標濃度的結果圖。

圖4A-4C為本發明具有NMN延緩老化功效的發酵組合物對於小鼠組織器官中氧化物濃度的結果圖。

圖5為本發明具有NMN延緩老化功效的發酵組合物對於延長小鼠壽命試驗各項結果圖。

本發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。

實施例一、類似NMN活性之發酵組合物的製備方法

以一種或多種菌種之乳酸乳球菌(L.lactis)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、比菲德氏菌(B.bifidum)、弱氧化促酸菌(A.hansenii)、木質醋酸菌(A.xylinum)或弱氧化醋酸桿菌(A.suboxydans)，分別與松露、酪梨、番茄、毛豆等不同的蔬果種類進行溫度梯度發酵調控，並將發酵完成之發酵液進行過濾後保留發酵液；發酵組合物的溫度梯度發酵調控步驟包含：

(1)蔬果萃取步驟：將不同蔬果分別以物理方式壓榨蔬果至果實或子實體呈碎塊狀，同時保留汁液與果渣或子實體以取得複數個第一萃取物；

(5)螯合發酵階段：以一醋酸菌，以比例0.5~1.5%(107CFU/ml)；2.5~5.5%一D-山梨醇植該些第二發酵物中，發酵溫度控制在10~25℃，持續發酵5~20天，在此階段耗氧環境消耗葡萄糖產生醋酸，消耗乙醇且提高酸度降低黏稠度，以取得複數個第三發酵物；以及

在一實施例中，蔬果萃取步驟進一步包含將該些蔬果與水混合的步驟。

在一實施例中，該蔬果包含松露、菇蕈類子實體、酪梨、番茄或毛豆。

在一實施例中，該蔬果萃取步驟之蔬果為松露或菇蕈類子實體時，在以物理方式壓榨前，進一步包含以65~100℃熱水淨泡25~35分鐘軟化之步驟。

在一實施例中，該些蔬果與水混合的比例分別為松露或菇蕈類子實體比水1：40；酪梨比水1：25；番茄比水1：1；毛豆比水1：30。

在一實施例中，該些第二萃取物pH值介於5.5~7；該些第一發酵物pH值介於5~6.5；該些第二發酵物pH值介於4.5~5.5；該些第三發酵物pH值介於3~3.5。

在一實施例中，該些第二萃取物糖度介於21~28°Brix；該些第一發酵物糖度介於15~34°Brix；該些第二發酵物糖度介於15~38°Brix；該些第三發酵物糖度介於10~50°Brix。

實施例二、溫度梯度發酵調控實驗

本發明之溫度梯度發酵調控技術與傳統的發酵技術有著很大的區別，本發明之溫度梯度發酵調控技術可以具有更完整的發酵效果，且能保留更多的纖維素及釋放出更多的胞內多醣。

本發明之溫度梯度發酵調控技術對比傳統發酵技術實驗，(T)為溫度梯度發酵技術組；(C)為傳統發酵組(傳統發酵溫度接控制在25~30℃)。

結果如圖1A所示，傳統發酵組糖度變化大，每階段的糖度下降快速，容易造成發酵終點提早達成，且糖度降低無法抑制腐敗菌，可能造成敗槽。溫度梯度發酵將糖度控制在至少15以上，直到螯合發酵階段(醋酸菌)才完整將碳源進行發酵，降低至15°Brix以下。

結果如圖1B所示，傳統發酵組因溫度適合酵母菌株生長，菌種快速生長並消耗碳源，此時pH值快速降低至3.8以下，造成發酵菌株反應快速達到終點，在後續菌株投入後作用無法有效達成生長發酵，以往會在進入下個發酵階段前進行pH值的調整，加入例如碳酸鈣、氫氧化鈉等化合物，對發酵產品來說可能無形增加無機礦物鹽的攝入(如鈉)，運用溫度梯度發酵技術，在酵母發酵階段以低溫處理，使得發酵液在進入後續發酵階段前提供其他菌種良好的生長環境，能確保發酵終點的延長。螯合發酵階段以15~20℃處理，此時醋酸菌在耗氧環境下能大量生成有機酸，使產品pH值達到3左右，提供防腐作用。

結果如圖1C所示，草本植物細胞壁以纖維聚糖為主成分，在傳統發酵方法中，菌株活性大於酵素活性，容易使pH值、碳源快速降低，發酵終點提前達成，多數草本植物細胞無法完整進行分解，其成分釋放比例有限；溫度梯度發酵技術中，低溫發酵階段控制酵素活性大於菌種活性，使得碳源下降緩慢，對細胞壁的分解能更完全，結果中表明溫度梯度發酵技術纖維素含量皆高於傳統發酵技術，表明細胞壁被分解的比例高。

結果如圖1D所示，真菌細胞壁以幾丁聚糖為主成分，必須將細胞壁破壞後才能釋放出胞內多醣，在傳統發酵方法中，菌株活性大於酵素活性，容易使pH值、碳源快速降低，發酵終點提前達成，多數真菌細胞無法完整進行分解，其成分釋放比例有限；溫度梯度發酵技術中，低溫發酵階段控制酵素活性大於菌種活性，使得碳源下降緩慢，對細胞壁的分解能更完全，結果中表明溫度梯度發酵技術多醣體含量皆高於傳統發酵技術，表明釋放的胞內多醣比例能有效提高。

實施例三、實驗動物與實驗方法

本發明類NMN發酵組合物具有延緩衰老的效果。依中華民國衛生福利部公告之「健康食品之延緩衰老保健功效評估方法」進行分析，本發明類NMN發酵組合物獲得至少一項指標項目之正反應。本發明類NMN發酵組合物可防止、延緩、抑制一個體的外觀老化、功能上的衰退及行為遲緩。以下動物實驗以60公斤之成人為基準，劑量換算以人體每日每公斤體重人體建議食用量1g/天換算動物劑量，分成下述5組：

(1.)低劑量0.5倍劑組(LD,low dose)

(2.)中劑量1倍劑量組(MD,medium dose)

(3.)高劑量1.5倍劑量為HD(high dose)

(4.)健康組(WT,wild type)：未加入任何樣本

(5.)老化組(C,control)：未加入任何樣本

本發明動物實驗使用的為C57BL/6品種的小鼠，該小鼠週齡為6~12周，並依照(1)健康組、(2)老化組、(3)低劑量組、(4)中劑量組、(5)高劑量組，各組別每組分配10隻雌鼠以及10隻雄鼠。

將上述小鼠建立D-半乳糖誘發氧化壓力老化動物模型，將小鼠誘導依照(1)健康組、(2)老化組、(3)低劑量組、(4)中劑量組、(5)高劑量組，各組別每組分配10隻雌鼠以及10隻雄鼠，並且對健康組小鼠注射0.1-0.3g/kg bw的生理食鹽水；對對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組注射0.1-0.3g/kg bw的D-半乳糖液，誘導6~10周後取血檢測脂質氧化丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

本發明實驗結果圖中，a表示與WT組別相比，有統計學上顯著的差異(p<0.01)；b表示與C組別相比有統計學上顯著的差異(p<0.01)。

3.1延緩衰老相關基因表達試驗

以D-半乳糖誘導小鼠老化，再分別以3種不同的劑量(LD、MD、HD)餵食小鼠12周後，取小鼠血液樣品分離血球，並分析血球細胞中相關衰老基因的表達。其中SIRT1掌管同源染色體的重組及斷裂DNA的修復；SIRT6 掌管鹼基對錯誤序列的修復，同時能促進同源染色體的重組；SIRT7可將斷裂DNA末端進行連接，修復DNA損傷。

如圖所示，連續使用12周後，使用不同濃度的組別皆能有效提升SIRT1、SIRT6、SIRT7表達量，相較於老化組，DNA修復能力具有顯著的改善效果。

3.2血液生化實驗

以D-半乳糖誘導小鼠老化，依照3種低、中、高劑量管餵12周後，取小鼠血液樣品，分析抗氧化物指標SOD及GSH含量，因老化被視為是氧化物過多造成細胞的氧化而導致，因此其抗氧化指標越高，延緩老化的能力越強。

結果如圖所示，連續使用12周後，使用不同濃度的組別皆能有效提升抗氧化物質濃度，相較於老化組，抗氧化能力具有顯著的改善效果。

3.3組織、器官老化之生物活性指標測定

以D-半乳糖誘導小鼠老化，依照3種低、中、高劑量管餵12周後，取小鼠器官組織作為樣品，分別針對大腦組織、肝臟組織及心臟組織，分析其組織內氧化物的濃度，8-oxo-dG為人體中經常存在的氧化物，當氧化物濃度越高，組織器官內的細胞老化速度越快。

大腦為老化表現最主要的器官，氧化物質會導致組織內產生8-oxo-dG產物，產物濃度越高表示老化現象越嚴重，而若是能在不同器官中降低氧化物的濃度，例如大腦，能降低阿茲海默症或帕金森氏症的罹患機率；在心臟能降低心血管疾病的風險；在肝臟能減少肝臟代謝負擔，穩定肝指數。

結果如圖所示，老化產物與年輕小鼠組別無差異，表示能延緩腦部老化，而肝臟與心臟也是容易老化的器官，在這兩個器官中，也同樣能具有延緩老化產物生成的作用。

3.4存活期試驗

以D-半乳糖誘導小鼠老化，依照3種不同劑量管餵直至小鼠自然死亡，並統計死亡數據，分析平均壽命及最大存活天數，以統計學分析顯著性差異，評估本發明是否具有延長壽命的作用。

本存活期試驗中，直接進行小鼠的長期觀察，評估對生物體的延長壽命是否有直接的功效，藉由對小鼠施加三種不同劑量(HD、MD、LD)測試，每日餵食直至自然死亡，並統計數據結果。

結果如圖所示，死亡率達50%時，未使用本發明的組別存活118天，而使用本發明且達建議劑量則延長壽命達200%，結果顯示本發明具有良好的延長壽命效果；未使用本發明的組別最長存活127天，使用本發明且達建議劑量組別最長則存活263天，延長207%的壽命。

根據動物試驗，本發明有助於延緩衰好之功效。與降低DNA氧化產物8-oxo-dG的含量，有效減緩腦部脂質過氧化的現象、降低腦部氧化損傷的程度，進而改善腦部氧化壓力上昇、腦部老化等現象。

經上述實驗結果證實，在延緩老化相關基因表達、提高抗氧化物指標SOD及GSH含量、降低組織器官氧化物濃度等老化相關指標上，本發明之發酵組合物具有能有效的延緩老化的效果。

上述實驗數據為在特定條件之下所獲得的初步實驗結果，其僅用以易於瞭解或參考本發明之技術內容而已，其尚需進行其他相關實驗。該實驗數據及其結果並非用以限制本發明之權利範圍。

前述較佳實施例僅舉例說明本發明及其技術特徵，該實施例之技術仍可適當進行各種實質等效修飾及/或替換方式予以實施；因此，本發明之權利範圍須視後附申請專利範圍所界定之範圍為準。

Claims

一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，包含：

(1)蔬果萃取步驟：將複數個蔬果分別以物理方式壓榨該些蔬果至果實或子實體呈碎塊狀，同時保留汁液與果渣或子實體，以取得複數個第一萃取物；

(2)負壓破壁工法：添加0.15~1.5%一有機黑糖，以提高該些第一萃取物等滲透壓，並同時以負壓萃取方式在35cmHg~45cmHg近真空環境中，持續萃取3~15天，使蔬果細胞壁破裂，釋放出細胞內營養成分及胞內多醣，以取得複數個第二萃取物；

(3)低溫發酵階段：以一酵母菌，以比例0.5~1.5%(10⁷CFU/ml)植入該些第二萃取物中，發酵溫度控制在2~12℃，持續發酵3~15天，在此階段菌種處於低活性、讓酵素作用大於菌種作用，減緩糖類的消耗，在發酵過程中防腐，提高纖維聚糖的分解作用，促進細胞壁分解，以取得複數個第一發酵物；

(4)深層發酵階段：以一乳酸菌，以比例0.5~1.5%(10⁷CFU/ml)；0.15~0.25%一異麥芽寡糖植入該些第一發酵物中，發酵溫度控制在20~35℃，持續發酵5~25天，在此階段乳酸菌消耗糖類生成乳酸，降低pH值達到防腐作用，且提高酸度降低黏稠度，以取得複數個第二發酵物；

(5)螯合發酵階段：以一醋酸菌，以比例0.5~1.5%(10⁷CFU/ml)；2.5~5.5%一D-山梨醇植入該些第二發酵物中，發酵溫度控制在10~25℃，持續發酵5~20天，在此階段耗氧環境消耗葡萄糖產生醋酸，消耗乙醇且提高酸度降低黏稠度，以取得複數個第三發酵物；以及

(6)乾燥造粒步驟：將通過(1)-(5)步驟發酵完成之該些第三發酵物，進行過濾以取得複數個發酵液並保留該些發酵液，再將該些發酵液以等比例混合後，以噴霧乾燥造粒，取得該發酵組合物。
如請求項1所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該蔬果萃取步驟進一步包含將該些蔬果與水混合的步驟。
如請求項1所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該蔬果包含松露、菇蕈類子實體、酪梨、番茄或毛豆。
如請求項3所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該蔬果萃取步驟之蔬果為松露或菇蕈類子實體時，在以物理方式壓榨前，進一步包含以65~100℃熱水淨泡25~35分鐘軟化之步驟。
如請求項2所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該些蔬果與水混合的比例分別為松露或菇蕈類子實體比水1：40；酪梨比水1：25；番茄比水1：1；毛豆比水1：30。
如請求項1所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該些第二萃取物糖度介於21~28°Brix；該些第一發酵物糖度介於15~34°Brix；該些第二發酵物糖度介於15~38°Brix；該些第三發酵物糖度介於10~50°Brix。
如請求項1所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該些第二萃取物pH值介於5.5~7；該些第一發酵物pH值介於5~6.5；該些第二發酵物pH值介於4.5~5.5；該些第三發酵物pH值介於3~3.5。
如請求項1所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該乳酸菌係選自由植物乳桿菌(L.plantarum)、保加利亞乳桿菌(L.delbrueckii)、乳酸乳球菌(L.lactis)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和比菲德氏菌(B.bifidum)所組成之群組。
如請求項1所述之一種具有NMN延緩老化功效的發酵組合物之製備方法，其中該酵母菌或該醋酸菌係選自由白麴菌(S.fibuligera)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、膜畢赤酵母(P.faciens)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、弱氧化促酸菌(A.hansenii)、木質醋酸菌(A.xylinum)和弱氧化醋酸桿菌(A.suboxydans)所組成之群組。
一種如請求項1所請製法製得之具有NMN延緩老化功效的發酵組合物，包含一蔬果原料，該蔬果原料包含松露、菇蕈類子實體、酪梨、番茄或毛豆，透過一製備方法取得一發酵組合物。
一種如請求項10所述之具有NMN延緩老化功效的發酵組合物用於製備延緩老化之一藥物的用途，其延緩老化係指延緩老化相關基因表達、提高抗氧化物指標SOD及GSH含量、降低組織器官氧化物濃度，其中該老化相關基因為SIRT1、SIRT6及SIRT7基因。
如請求項11所述之具有NMN延緩老化功效的發酵組合物用於製備延緩老化之藥物的用途，其中該藥物可以用於延緩心臟、腦部及肝臟的老化。