TWI771253B - 戶外用的簡易式核酸萃取套組以及於戶外萃取樣本的核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種戶外用的簡易式核酸萃取套組，包含第一緩衝液、第二緩衝液、第三緩衝液、第一洗滌液、第二洗滌液、第一針筒以及第二針筒。第一緩衝液包含氯化鈉、溴化十六烷基三甲基銨以及十二烷基硫酸鈉。第二緩衝液包含複數個二氧化矽珠粒。第三緩衝液包含三羥甲基胺基甲烷-氯化氫或無菌水。第一洗滌液包含乙酸鈉以及乙醇。第二洗滌液包含三羥甲基胺基甲烷-鹼。第一針筒包含設置於其底部的第一緩衝材。第二針筒包含設置於其底部的第二緩衝材以及第一濾層。本揭露亦提供一種於戶外萃取樣本的核酸的方法。

Description

戶外用的簡易式核酸萃取套組以及於戶外萃取樣本的核酸的方法

本揭露是關於一種核酸萃取套組以及萃取樣本的核酸的方法，且特別是關於可於戶外用的簡易式核酸萃取套組以及使用此套組於戶外萃取樣本的核酸的方法。

隨著世界人口增加與極端環境快速變化等情形，農作物的生產為各國矚目的課題。為確保作物的量產以及品質，有效率地對作物病害進行早期診斷極為重要。

一般而言，判斷作物是否遭到病害感染的方式多為依據外表病徵進行判斷，然而，此判斷方式誤差較大且無法對早期潛伏於作物植株內的病害進行有效判斷。近年來，已發展出利用特定核酸引子搭配聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測作物中是否有目標致病原存在的技術，然而，檢驗的過程仍需將植株樣本帶回實驗室進行檢測，無法即時且有效地提供育苗戶與病害相關的資訊。

另一方面，利用特定核酸引子搭配聚合酶連鎖反應的檢測技術亦應用於判斷食品以及環境中是否存在致病原。相似地，檢驗的過程仍需將食品以及環境樣本帶回實驗室進行檢測，同樣無法即時且有效地提供病害相關的資訊。

因此，發展可於戶外使用的核酸萃取套組對於現地提供致病原的相關資訊為重要的課題之一。

根據本揭露一些實施例，提供一種戶外用的簡易式核酸萃取套組，包含第一緩衝液、第二緩衝液、第三緩衝液、第一洗滌液、第二洗滌液、第一針筒以及第二針筒。第一緩衝液包含氯化鈉、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)以及十二烷基硫酸鈉(SDS)，且第一緩衝液的pH值為6至8。第二緩衝液包含複數個二氧化矽珠粒，二氧化矽珠粒的粒徑分別為50 μm至100 μm。第三緩衝液包含三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)或無菌水。第一洗滌液包含乙酸鈉以及乙醇。第二洗滌液包含三羥甲基胺基甲烷-鹼(Tris-base)。第一針筒包含第一緩衝材，第一緩衝材設置於第一針筒的底部。第二針筒包含第二緩衝材以及第一濾層，第二緩衝材以及第一濾層設置於第二針筒的底部，且第二緩衝材設置於第一濾層的上方。

根據本揭露一些實施例，提供一種於戶外萃取樣本的核酸的方法，包含收集樣本以及提供核酸萃取套組。核酸萃取套組包含第一緩衝液、第二緩衝液、第三緩衝液、第一洗滌液、第二洗滌液、第一針筒以及第二針筒。第一緩衝液包含氯化鈉、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)以及十二烷基硫酸鈉(SDS)，且第一緩衝液的pH值為6至8。第二緩衝液包含複數個二氧化矽珠粒，二氧化矽珠粒的粒徑分別為50 μm至100 μm。第三緩衝液包含三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)或無菌水。第一洗滌液包含乙酸鈉以及乙醇。第二洗滌液包含三羥甲基胺基甲烷-鹼(Tris-base)。第一針筒包含第一緩衝材，第一緩衝材設置於第一針筒的底部。第二針筒包含第二緩衝材以及第一濾層，第二緩衝材以及第一濾層設置於第二針筒的底部，且第二緩衝材設置於第一濾層的上方。前述方法更包含將樣本與第一緩衝液混合；將樣本與第一緩衝液的混合液加入第一針筒中進行過濾並收集通過第一針筒的濾液；將通過第一針筒的濾液與第二緩衝液混合並加入第二針筒中進行過濾，且移除通過第二針筒的濾液；將第一洗滌液加入第二針筒中進行過濾，且移除通過第二針筒的濾液；將第二洗滌液加入第二針筒中進行過濾，且移除通過第二針筒的濾液；以及將第三緩衝液加入第二針筒中，且回收第三緩衝液。

為讓本揭露之特徵、或優點能更明顯易懂，下文特舉出數個實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。

以下針對本揭露實施例之戶外用的簡易式核酸萃取套組以及於戶外萃取樣本的核酸的方法作詳細說明。應了解的是，以下之敘述提供許多不同的實施例或例子，用以實施本揭露一些實施例之不同樣態。以下所述特定的元件及排列方式僅為簡單清楚描述本揭露一些實施例。當然，這些僅用以舉例而非本揭露之限定。

本揭露實施例可配合圖式一併理解，本揭露之圖式亦被視為揭露說明之一部分。應理解的是，本揭露之圖式並未按照比例繪製，事實上，可能任意的放大或縮小元件的尺寸以便清楚表現出本揭露的特徵。

於本文中，「約」、「大約」、「實質上」之用語通常表示在一給定值或範圍的5%內，或3%之內，或2%之內，或1%之內，或0.5%之內。於本中給定的數量為大約的數量，亦即在沒有特定說明「約」、「大約」、「實質上」的情況下，仍可隱含「約」、「大約」、「實質上」之含義。再者，描述數值範圍的用語「介於第一數值至第二數值之間」以及「第一數值至第二數值」表示所述範圍包含第一數值、第二數值以及它們之間的其它數值。

此外，應理解的是，雖然在此可使用用語「第一」、「第二」、「第三」等來敘述各種元件、組件、或部份，這些元件、組件或部份不應被這些用語限定。這些用語僅是用來區別不同的元件、組件、或部份。因此，以下討論的第一元件、組件、或部份可在不偏離本揭露之教示的情況下被稱為第二元件、組件、或部份。

除非另外定義，於本文中使用的全部用語(包含技術及科學用語)具有與本揭露所屬技術領域的技術人員通常理解的相同涵義。能理解的是，這些用語例如在通常使用的字典中定義用語，應被解讀成具有與相關技術及本揭露的背景或上下文一致的意思，而不應以一理想化或過度正式的方式解讀。為了使本揭露的內容更容易理解，提供以下術語及用詞的定義。

根據本揭露一些實施例，提供一種可於戶外使用的簡易式核酸萃取套組，其操作步驟中不需使用離心機或其它動力裝置，可於現地萃取樣本的核酸並且進行檢測，進而可即時且有效地篩檢樣本中是否含有目標核酸片段(例如，致病原的特定核酸片段)。再者，相較於一般市售的核酸萃取套組，本揭露實施例提供的簡易式核酸萃取套組可減少實驗的操作時間以及產生的廢液量。

請參照第1圖以及第2圖，第1圖顯示根據本揭露一些實施例中，戶外用的簡易式核酸萃取套組10的示意圖。戶外用的簡易式核酸萃取套組10可包含第一緩衝液PL、第二緩衝液SB、第三緩衝液EL、第一洗滌液W1、第二洗滌液W2、第一針筒SG1以及第二針筒SG2。

第一緩衝液PL可用於裂解樣本中的細胞，使樣本中的核酸釋出。根據一些實施例，第一緩衝液PL可包含氯化鈉(sodium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)以及十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)。根據一些實施例，第一緩衝液PL的pH值可約為6至8，例如，pH值可約為6.5、7或7.5等，但本揭露並不限於此。根據一些實施例，第一緩衝液PL中的氯化鈉、溴化十六烷基三甲基銨以及十二烷基硫酸鈉的濃度各自可為約0.5%至約5%，或為約1%至約4.5%、約1.5%至約4%、約2%、約2.5%、約3%、約3.5%等，但本揭露並不限於此。

根據一些實施例，第二緩衝液SB可包含複數個二氧化矽珠粒(silica bead)，二氧化矽珠粒的粒徑可為約50 μm至約100 μm，或為約60 μm至約90 μm，例如，65 μm、70 μm、75 μm、80 μm或85 μm等，但本揭露並不限於此。第二緩衝液SB中的二氧化矽珠粒可用於吸附樣本中的核酸。根據一些實施例，二氧化矽珠粒的表面係經矽烷化合物修飾，使得二氧化矽珠粒的表面為帶正電的，可用於吸附該樣本中帶負電的核酸。詳細而言，二氧化矽珠粒的表面經矽烷化合物修飾後形成矽烷結構，其包含由矽原子連結形成的主鏈以及以共價鍵連結於主鏈上的氫原子的結構。根據一些實施例，第二緩衝液SB的溶液成分可包含無菌水，二氧化矽珠粒可分散於無菌水中。

第三緩衝液EL可用於溶出且回收吸附於二氧化矽珠粒表面上之樣本中的核酸。根據一些實施例，第三緩衝液EL可包含三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)。根據一些實施例，第三緩衝液EL可包含無菌水。根據一些實施例，第三緩衝液EL的pH值可約為7至8，例如，pH值可約為7.2或7.5。根據一些實施例，第三緩衝液EL中的Tris-HCl的濃度可為約0.5%至約5%，或為約1%至約3%。

再者，第一洗滌液W1可用於清洗樣本，去除樣本中的雜質，例如，鹽類或蛋白質等。根據一些實施例，第一洗滌液W1可包含乙酸鈉(sodium acetate)以及乙醇(ethanol)。根據一些實施例，第一洗滌液W1中的乙酸鈉的濃度可為約0.5%至約5%，或為1%至3%。根據一些實施例，第一洗滌液W1中的乙醇的濃度可為約10%至約30%，例如，約20%或約25%。

相似地，第二洗滌液W2可用於清洗樣本，去除樣本中的雜質，例如，鹽類或蛋白質等。根據一些實施例，第二洗滌液W2可包含三羥甲基胺基甲烷-鹼(Tris-base)。根據一些實施例，第二洗滌液W2中的Tris-base的濃度為約0.5%至約5%，或為約1%至約3%。

此外，第一針筒SG1可作為過濾針筒，將與第一緩衝液PL混合的樣本進行固態液態分離，將樣本的固態部分留於第一針筒SG內，使樣本的液態部分通過第一針筒SG。第一針筒SG1可包含緩衝材102-1，緩衝材102-1設置於第一針筒SG1的底部，例如位於活塞110-1的下方。

根據一些實施例，緩衝材102-1可包含具有緩衝外力或支撐功能的材料，例如，棉花、海綿或其它具有類似功能的材料，但不限於此。根據一些實施例，緩衝材102-1在未經外力壓縮前的厚度可為約2 mm至約5 mm，例如，約3 mm或約4 mm。

根據一些實施例，第一針筒SG1可僅設置有緩衝材102-1。然而，根據一些實施例，第一針筒SG1可進一步包含濾層104-1，濾層104-1設置於第一針筒SG1的底部，且濾層104-1設置於緩衝材102-1的下方以及活塞110-1的下方。濾層104-1可包含具有過濾功能的材料，例如，濾層104-1可包含具有篩選特定尺寸功能的材料。具體而言，根據一些實施例，濾層104-1的材料可包含纖維素，濾層104-1可包含定性濾紙或色層分析濾紙，但不限於此。根據一些實施例，設置於第一針筒SG1中的濾層104-1的孔徑可為約150目(mesh)至約250目(相當於約100 μm至60 μm)，例如，160目、170目、180目、190目、200目、210目、220目、230目或240目。再者，根據一些實施例，濾層104-1的厚度可為約0.15 mm至約0.3 mm，例如，約0.18 mm、0.2 mm、0.22 mm、 0.25 mm或0.28 mm。

第二針筒SG2亦可作為過濾針筒，對第二緩衝液SB進行固態液態分離，將吸附有核酸的二氧化矽珠粒留於第二針筒SG2內，使其它液態部分通過第二針筒SG2。第二針筒SG2可包含緩衝材102-2以及濾層104-2，緩衝材102-2以及濾層104-2設置於第二針筒SG2的底部，緩衝材102-2設置於濾層104-2的上方，且緩衝材102-2以及濾層104-2設置於活塞110-2的下方。

根據一些實施例，緩衝材102-2可包含具有緩衝外力或支撐功能的材料，例如，棉花、海綿或其它具有類似功能的材料，但不限於此。緩衝材102-2可避免設置於其下的濾層104-2位移或變形。根據一些實施例，緩衝材102-2在未經外力壓縮前的厚度可為約2 mm至約5 mm，例如，約3 mm或約4 mm。

再者，濾層104-2可包含具有過濾功能的材料，例如，濾層104-2可包含具有篩選特定尺寸功能的材料。具體而言，根據一些實施例，濾層104-2的材料可包含纖維素，濾層104-2可包含定性濾紙或色層分析濾紙，但不限於此。此外，根據一些實施例，濾層104-2可為經表面處理的濾紙，例如，濾層104-2可經塗佈處理以強化其表面的疏水能力。根據一些實施例，濾層104-2的表面可包含聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene，PTFE)塗層。根據一些實施例，設置於第二針筒SG2中的濾層104-2的孔徑可為約200目(mesh)至約300目(相當於約75 μm至50 μm)，例如，210目、220目、230目、240目、250目、260目、270目、280目或290目。再者，根據一些實施例，濾層104-2的厚度可為約0.15 mm至約0.3 mm，例如，約0.18 mm、0.2 mm、0.22 mm、0.25 m或0.28 mm。根據一些實施例，濾層104-2的孔徑小於或等於濾層104-1的孔徑。

此外，根據一些實施例，前述戶外用的簡易式核酸萃取套組10係搭配研缽以及研磨棒使用，研缽以及研磨棒可用於將待檢測之樣本破碎。詳細而言，在將前述第一緩衝液PL與待檢測之樣本(例如，植物)混合之後，使用研缽以及研磨棒將樣本研磨破碎，第一緩衝液PL可裂解樣本中的細胞，使樣本中的核酸釋出。然而，根據另一些實施例，待檢測之樣本(例如，微生物)可不用經過研磨破碎處理，直接與第一緩衝液PL混合。

再者，根據一些實施例，前述戶外用的簡易式核酸萃取套組10係搭配手持式加熱裝置使用，手持式加熱裝置可用於加熱緩衝液，例如加熱第一緩衝液PL或第三緩衝液EL。詳細而言，手持式加熱裝置可用於加熱待檢測之樣本與第一緩衝液PL的混合液以及預熱第三緩衝液EL。關於戶外用的簡易式核酸萃取套組10的詳細使用步驟將於下文進行說明。

第2圖顯示根據本揭露一些實施例中，於戶外萃取樣本的核酸的方法20的步驟流程圖。應理解的是，可於戶外萃取樣本的核酸的方法20進行前、進行中及/或進行後加入額外的步驟，或是取代或刪除一些步驟。

首先，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S1：提供樣本，以及提供如前述之戶外用的簡易式核酸萃取套組10。根據一些實施例，樣本可包含含致病原(pathogen)或非致病原的生物樣本、或含致病原或非致病原的食物樣本、飲料樣本或環境樣本，但本揭露不以此為限。本揭露實施例提供的核酸萃取套組可應用於任意需要進行核酸萃取處理的樣本種類。根據一些實施例，提供的核酸萃取套組可用於檢測生物樣本、食物樣本、飲料樣本或環境樣本(例如，水體樣本)中是否含有特定種類的致病原或是微生物。

根據一些實施例，含致病原或非致病原的生物樣本包含受到至少一致病菌感染的環境樣本。根據一些實施例，前述由致病菌所引發的疾病可包含赤鰭病(red fin disease)、紅嘴病(red mouth disease)、腸炎、出血性敗血病、立鱗病(scale protrusion disease)、紅腿病(red-leg disease)或前述之組合，但不限於此。

根據一些實施例，含致病原或非致病原的生物樣本包含受到至少一致病菌感染的植物樣本。根據一些實施例，植物樣本可包含水果類植株、穀類植株、蔬菜類植株、雜糧類植株或花卉植株，但不限於此。根據一些實施例，水果類植株可包含草莓、楊桃、葡萄、芒果、木瓜、蓮霧或柑橘，但不限於此。根據一些實施例，穀類植株可包含稻米或藜麥，但不限於此。根據一些實施例，蔬菜類植株可包含洋蔥或大蒜，但不限於此。根據一些實施例，雜糧類植株可包含茶葉，但不限於此。根據一些實施例，花卉植株可包含蘭花或百合，但不限於此。

此外，根據一些實施例，前述由致病菌所引發的疾病可包含炭疽病(anthracnose)、青黴病(blue mold)、蒂腐病(stem end rot)、白粉病(powdery mildew)、赤葉枯病(brown blight)、白絹病(southern blight)或前述之組合，但不限於此。具體而言，根據一些實施例，受到致病菌感染的植物樣本可為草莓植株，且致病菌所引發的疾病可為草莓炭疽病。

接著，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S2：將樣本與第一緩衝液PL混合。承前述，第一緩衝液PL可用於將樣本中的細胞裂解，使核酸釋出。再者，根據一些實施例，在樣本與第一緩衝液PL混合的步驟S2之後，可進一步包含使用研缽以及研磨棒使樣本破碎的步驟。例如，當樣本為植物樣本時，可使用研缽以及研磨棒將樣本研磨破碎，破壞植物的細胞壁結構，提升核酸萃取的效率。

再者，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S3：將樣本與第一緩衝液PL的混合液加入第一針筒SG1中進行過濾並收集通過第一針筒SG1的濾液。詳細而言，將樣本與第一緩衝液PL的混合液加入第一針筒SG1後，將第一針筒SG1的活塞推至底部，使樣本與第一緩衝液PL的混合液進行固態液態分離，固態部分留於第一針筒SG1內，收集排出第一針筒SG1的液態部分，即收集含有樣本的核酸的濾液。根據一些實施例，以100 mg的樣本為例，加入的第一緩衝液PL的量可為約200 μl至約1000 μl，或為約300 μl至約800 μl，例如約400 μl、500 μl或600 μl。

接著，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S4：將前述步驟S3中通過第一針筒SG1的濾液與第二緩衝液SB混合並加入第二針筒SG2中進行過濾，且移除通過第二針筒SG2的濾液。詳細而言，將前述步驟S3得到的濾液與第二緩衝液SB混合並加入第二針筒SG2後，將第二針筒SG2的活塞推接近底部，使含有樣本的核酸的濾液與第二緩衝液SB的混合液進行固態液態分離，樣本的核酸會吸附於第二緩衝液SB中的二氧化矽珠粒上進而留於第二針筒SG2內，而其它混合液則排出第二針筒SG2。根據一些實施例，以100 mg的樣本為例，加入的第二緩衝液SB的量可為約100 μl至約800 μl，或為約150 μl至約550 μl，例如約200 μl、350 μl或450 μl。

根據一些實施例，在將通過第一針筒SG1的濾液與第二緩衝液SB混合的步驟S3之前，可進一步包含將通過第一針筒SG1的濾液(即樣本與第一緩衝液PL的混合液)以約60℃至約75℃的溫度範圍加熱約5至15分鐘，以加強細胞裂解的活性，提升核酸萃取的效率。根據一些實施例，可將通過第一針筒SG1的濾液以約70℃加熱約10分鐘。並且，根據一些實施例，在加熱通過第一針筒SG1的濾液的步驟之後，可進一步包含將前述濾液靜置使其恢復至室溫的步驟，例如，可將濾液靜置約3至10分鐘，使其恢復室溫。根據一些實施例，可使用手持式加熱裝置，可包括但不限於保溫罐，加熱通過第一針筒SG1的濾液。

再者，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S5：將第一洗滌液W1加入第二針筒SG2中進行過濾，且移除通過第二針筒SG2的濾液。詳細而言，將第一洗滌液W1加入第二針筒SG2，清洗第二針筒SG2中吸附於二氧化矽珠粒上的樣本的核酸，且在清洗後將第一洗滌液W1排出第二針筒SG2棄置。根據一些實施例，以100 mg的樣本為例，加入的第一洗滌液W1的量可為約100 μl至約800 μl，或為約200μl至約600 μl，例如約300 μl、400 μl或500 μl。

接著，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S6：將第二洗滌液W2加入第二針筒SG2中進行過濾，且移除通過該第二針筒SG2的濾液。詳細而言，在以第一洗滌液W1清洗第二針筒SG2之後，接著將第二洗滌液W2加入第二針筒SG2，清洗第二針筒SG2中吸附於二氧化矽珠粒上的樣本的核酸，且在清洗後將第二洗滌液W2排出第二針筒SG2棄置。根據一些實施例，以100 mg的樣本為例，加入的第二洗滌液W2的量可為約200 μl至約1000 μl，或為約400 μl至約800 μl，例如約500 μl、600 μl或700 μl。根據一些實施例，可重複洗滌動作強化洗淨效果。

接著，於戶外萃取樣本的核酸的方法20可包含步驟S7：將第三緩衝液EL加入第二針筒SG2中，且回收第三緩衝液EL，第三緩衝液EL可溶出且回收吸附於二氧化矽珠粒表面上的樣本的核酸，於此完成核酸萃取的步驟。根據一些實施例，在第三緩衝液EL加入第二針筒SG2中之後，可靜置約0.5分鐘至約10分鐘再回收第三緩衝液EL。根據一些實施例，在將第三緩衝液EL加入第二針筒SG2之前，可先將第三緩衝液EL預熱至約60℃至75℃的溫度範圍，以增加核酸的回收效率。根據一些實施例，以100 mg的樣本為例，加入的第三緩衝液EL的量可為約50 μl至約200 μl，例如，約100 μl或150 μl。

根據一些實施例，在完成前述核酸萃取的步驟之後，可使用手持式核酸分析儀搭配特定核酸引子進行聚合酶連鎖反應(PCR)檢測樣本中是否含有目標核酸片段。例如，可檢測植株樣本中是否存在特定致病原的核酸片段。因此，可現地完成萃取樣本的核酸並且進行檢測的作業，可即時且有效地提供與病害相關的資訊。進一步而言，於作物方面的應用，可協助大型育苗農戶進行母株篩檢，搭配栽培管理，可有效降低作物病害的發生率，且減少農藥的使用量。

並且，值得注意的是，相較於需搭配離心機使用的一般市售核酸萃取套組，本揭露實施例提供的核酸萃取套組於操作步驟中不需使用離心機或其它動力裝置，因此可於戶外進行操作。此外，相較於一般市售的核酸萃取套組，本揭露實施例提供的簡易式核酸萃取套組亦可減少實驗的操作時間以及產生的廢液量。

為了讓本揭露之上述及其它目的、特徵、及優點能更明顯易懂，下文特舉數實施例、比較例以及測試例，作詳細說明如下，然其並非用以限定本揭露之內容。

實施例1-使用戶外用的簡易式核酸萃取套組萃取草莓植株的核酸

首先，取100 mg的草莓植株(樣品編號1~5，取自田間試驗農戶種植之同一植株上的不同葉片，如第3圖所示；樣品編號6~8，取自種苗場之同一植株上的不同葉片，未繪示，可參照第3圖所示的取樣方式)並放入研缽中，加入500 μl的第一緩衝液PL (3%氯化鈉、2%CTAB、1%SDS-pH=8)至研缽中，進行研磨使植株粉碎分解。接著，將研缽中之植株與第一緩衝液PL的混合液移至第一針筒SG1中進行過濾，並且將濾液收集於1.5 ml的離心管中，接著將離心管於70℃加熱10分鐘，之後將離心管放置3~5分鐘使其恢復至室溫。

將350 μl經混合均勻的第二緩衝液SB (3%二氧化矽珠粒、無菌水)加入前述離心管得到混合液，之後將混合液加入第二針筒SG2中進行過濾，並且去除濾液。接著，將400 μl的第一洗滌液W1 (3%乙酸鈉、20%乙醇)加入第二針筒SG2中進行清洗過濾，並且去除濾液。之後，將600 μl的第二洗滌液W2(2%Tris-base)加入第二針筒SG2中進行清洗過濾，並且去除濾液。最後，將經70℃預熱之200 μl的第三緩衝液EL (1% Tris-HCl)加入第二針筒SG2，靜置3分鐘後將濾液收集於1.5 ml的離心管中，即得到純化的核酸產物。

測試例1-核酸產物的確認及分析

取用10 μl之前述實施例1萃取得到的核酸產物(樣品編號1~8)，進行PCR反應，檢測核酸產物中是否存在肌動蛋白(actin)。PCR反應使用的引子對具有序列辨識號：1及2所示的核酸序列，且PCR反應的溫度條件設定如下：94℃反應5分鐘→[94℃反應30秒→54℃反應30秒→72℃反應60秒]重複35個循環→72℃反應7分鐘。

藉由膠體電泳分析PCR產物，結果如第4圖所示，標號M為標記物(Omics 100 bp DNA ladder，盟基生物科技股份有限公司)，標號1~8分別為樣品編號1~8的PCR產物，標號9~10為自標準菌盤取得菌落的PCR產物，以炭疽病與萎凋病的標準菌盤作為對照組，標號H ₂O作為控制組。如第4圖所示，樣品編號1~8的PCR擴增產物的長度為239 bp，與肌動蛋白的長度相符。由此可知，本揭露實施例提供的戶外用的簡易式核酸萃取套組可順利從樣本中萃取出DNA。再者，雖然前述實施例使用肌動蛋白作為檢測目標，但於不同的使用情境中，可使用其它蛋白質或致病原的核酸序列作為檢測目標。

比較例1-使用市售的核酸萃取套組萃取草莓植株的核酸

依照廠商提供的說明書指示，使用Plant Genomic DNA Extraction Miniprep System (VIOGENE)分離及純化草莓植株(樣品編號1~4，取自田間試驗農戶種植之同一植株上的不同葉片，未繪示，可參照第3圖所示的取樣方式)的核酸。詳細而言，於研缽倒入適量之液態氮後將植株樣本研磨成粉狀，加入400 μl的PX1緩衝液與RNase A緩衝液混合均勻，於65℃之水浴槽中反應10分鐘，再加入130 μl的PX2緩衝液翻轉混合後，置於冰上5分鐘。接著，將上清液吸至Shearing Tube內，以13,200 rpm離心2分鐘，將收集於管內的液體移至1.5 ml的微量離心管內，並且加入0.5倍體積的PX3緩衝液與1倍體積的98%酒精，翻轉數次混合均勻後，倒入Mini Column內以10,000 rpm離心1分鐘，移除濾液。之後，加入650 μl的98%酒精洗滌與離心，並且重複前述步驟一次。接著加入700 μl的WS buffer，以13,200 rpm離心30秒，並且重複前述步驟一次。最後加入50μl之65℃無菌水，靜置兩分鐘後，以13,200 rpm離心2分鐘，即得到純化的核酸產物(基因體DNA)。

測試例2-核酸產物的確認及分析

取用10 μl之前述比較例1萃取得到的核酸產物(樣品編號1~4)，進行PCR反應，檢測核酸產物中是否存在肌動蛋白(actin)。PCR反應使用的引子對具有序列辨識號：1及2所示的核酸序列，且PCR反應的溫度條件設定如下：94℃反應5分鐘→[94℃反應30秒→54℃反應30秒→72℃反應60秒]重複35個循環→72℃反應7分鐘。

藉由膠體電泳分析PCR產物，結果如第5圖所示，標號M為標記物(Omics 100 bp DNA ladder，盟基生物科技股份有限公司，標號1~4分別為樣品編號1~4的PCR產物，標號H ₂O作為控制組。如第5圖所示，樣品編號1~4的PCR擴增產物的長度為239bp，與肌動蛋白的長度相符。

實施例2-使用戶外用的簡易式核酸萃取套組對水體樣本進行分析

於場域A(養殖餌料的水體，台南)的不同位置採集水體50 ml(樣品編號1~3)，以及於場域B(養殖虱目魚的水體，台南)的不同位置採集水體50 ml(樣品編號4~6)。將水體樣品以12,000g離心3分鐘後，以100 μl的無菌水回溶。接著，使用戶外用的簡易式核酸萃取套組對水體樣本進行核酸萃取，萃取步驟與實施例1所述者大致上相同，但不需進行樣品的研磨，只需將水體樣本混和均勻，接著即可加入第一緩衝液PL。

測試例3-核酸產物的確認及分析

針對水體樣品的核酸產物，測試其中是否含有親水性產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)產生的細胞毒腸毒素(cytotonic enterotoxin)，親水性產氣單胞菌為水體中的常在細菌之一，會造成人畜共通的傳染病，人類遭受感染時可能會產生腸炎、上吐下瀉等症狀，而水產動物遭受感染時可能會引起赤鰭病(red fin disease)、紅嘴病(red mouth disease)、腸炎、出血性敗血病、立鱗病(scale protrusion disease)、紅腿病(red-leg disease)等。

取用10 μl之前述實施例2萃取得到的核酸產物(樣品編號1~6)，進行PCR反應，檢測核酸產物中是否存在細胞毒腸毒素(cytotonic enterotoxin)。PCR反應使用的引子對具有序列辨識號：3及4所示的核酸序列，且PCR反應的溫度條件設定如下：95℃反應5分鐘→[95℃反應60秒→55℃反應60秒→72℃反應60秒]重複30個循環→72℃反應5分鐘。

藉由膠體電泳分析PCR產物，結果如第6圖所示，標號M為標記物(100bp Plus DNA Ladder，Thermo Scientif:GeneRuler)，標號1~6分別為樣品編號1~6的PCR產物。如第6圖所示，樣品編號1~6的PCR擴增產物的長度為328 bp，與親水性產氣單胞菌的細胞毒腸毒素長度相符。由此可知，本揭露實施例提供的戶外用的簡易式核酸萃取套組可順利從水體樣本中萃取出DNA，且藉由搭配特定核酸引子進行PCR作用，可檢測出樣本中是否存在特定微生物或致病原。

由前述內容可知，本揭露實施例提供的戶外用的簡易式核酸萃取套組可順利萃取出樣本的DNA，且透過巢式PCR擴增出的標的核酸片段結果也顯示，此方式可精準感測目標致病原之存在(檢測準確度達100%)，為快篩工作以及後續之疫病防治提供良好的檢測工具。

雖然本揭露的實施例及其優點已揭露如上，但應該瞭解的是，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本揭露之精神和範圍內，當可作更動、替代與潤飾。再者，每一申請專利範圍構成個別的實施例，且本揭露之保護範圍也包括各個申請專利範圍及實施例的組合。本揭露之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

10:戶外用的簡易式核酸萃取套組 20:於戶外萃取樣本的核酸的方法 102-1、102-2:緩衝材 104-1、104-2:濾層 110-1、110-2:活塞 PL:第一緩衝液 SB:第二緩衝液 EL:第三緩衝液 W1:第一洗滌液 W2:第二洗滌液 SG1:第一針筒 SG2:第二針筒 S1~S7:步驟

第1圖顯示根據本揭露一些實施例中，戶外用的簡易式核酸萃取套組的示意圖； 第2圖顯示根據本揭露一些實施例中，於戶外萃取樣本的核酸的方法的步驟流程圖； 第3圖顯示根據本揭露一些實施例中，對植株進行取樣的示意圖； 第4圖顯示根據本揭露一些實施例中，使用戶外用的簡易式核酸萃取套組得到的核酸產物之膠體電泳分析圖； 第5圖顯示根據本揭露一些實施例中，使用市售的核酸萃取套組得到的核酸產物之膠體電泳分析圖； 第6圖顯示根據本揭露一些實施例中，使用戶外用的簡易式核酸萃取套組得到的核酸產物之膠體電泳分析圖。

20:於戶外萃取樣本的核酸的方法

S1~S7:步驟

Claims (12)

1. 一種戶外用的簡易式核酸萃取套組，包括： 一第一緩衝液，包括氯化鈉、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)以及十二烷基硫酸鈉(SDS)，且該第一緩衝液的pH值為6至8； 一第二緩衝液，包括複數個二氧化矽珠粒，其中該複數個二氧化矽珠粒的粒徑分別為50 μm至100 μm； 一第三緩衝液，包括三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)或無菌水； 一第一洗滌液，包括乙酸鈉以及乙醇； 一第二洗滌液，包括三羥甲基胺基甲烷-鹼(Tris-base)； 一第一針筒，包括一第一緩衝材，該第一緩衝材設置於該第一針筒的底部；以及 一第二針筒，包括一第二緩衝材以及一第一濾層，該第二緩衝材以及該第一濾層設置於該第二針筒的底部，且該第二緩衝材設置於該第一濾層的上方。
2. 如請求項1所述之戶外用的簡易式核酸萃取套組，其中該第一針筒更包括一第二濾層，該第二濾層設置於該第一針筒的底部且位於該第一緩衝材的下方。
3. 如請求項1所述之戶外用的簡易式核酸萃取套組，其中該第一緩衝材設置於該第一針筒的活塞的下方，且該第二緩衝材以及該第一濾層設置於該第二針筒的活塞的下方。
4. 如請求項2所述之戶外用的簡易式核酸萃取套組，其中該第一濾層的孔徑小於或等於該第二濾層的孔徑，其中該第一濾層的孔徑為200目(mesh)至300目，而該第二濾層的孔徑為150目至250目。
5. 如請求項1所述之戶外用的簡易式核酸萃取套組，其中該複數個二氧化矽珠粒的表面係經矽烷化合物修飾，且該複數個二氧化矽珠粒的表面係帶正電。
6. 如請求項1所述之戶外用的簡易式核酸萃取套組，其係搭配一研缽以及一研磨棒使用，該研缽以及該研磨棒用於將一待檢測之樣本破碎。
7. 如請求項1所述之戶外用的簡易式核酸萃取套組，其係搭配一手持式加熱裝置使用，該手持式加熱裝置用於加熱該第一緩衝液或該第三緩衝液。
8. 一種於戶外萃取樣本的核酸的方法，包括： 收集一樣本； 提供一核酸萃取套組，包括： 一第一緩衝液，包括氯化鈉、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)以及十二烷基硫酸鈉(SDS)，且該第一緩衝液的pH值為6至8； 一第二緩衝液，包括複數個二氧化矽珠粒，其中該複數個二氧化矽珠粒的粒徑分別為50 μm至100 μm； 一第三緩衝液，包括三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)或無菌水； 一第一洗滌液，包括乙酸鈉以及乙醇； 一第二洗滌液，包括三羥甲基胺基甲烷-鹼(Tris-base)； 一第一針筒，包括一第一緩衝材，該第一緩衝材設置於該第一針筒的底部；以及 一第二針筒，包括一第一濾層以及一第二緩衝材，該第一濾層以及該第二緩衝材設置於該第二針筒的底部，且該第二緩衝材設置於該第一濾層的上方； 將該樣本與該第一緩衝液混合； 將該樣本與該第一緩衝液的混合液加入該第一針筒中進行過濾並收集通過該第一針筒的濾液； 將通過該第一針筒的濾液與該第二緩衝液混合並加入該第二針筒中進行過濾，且移除通過該第二針筒的濾液； 將該第一洗滌液加入該第二針筒中進行過濾，且移除通過該第二針筒的濾液； 將該第二洗滌液加入第二針筒中進行過濾，且移除通過該第二針筒的濾液；以及 將該第三緩衝液加入該第二針筒中，且回收該第三緩衝液。
9. 如請求項8所述之於戶外萃取樣本的核酸的方法，其中在將通過該第一針筒的濾液與該第二緩衝液混合的步驟之前，更包括將通過該第一針筒的濾液以60℃至75℃的溫度範圍加熱5至15分鐘，其中在加熱通過該第一針筒的濾液的步驟之後，更包括將該濾液靜置使其恢復至室溫。
10. 如請求項8所述之於戶外萃取樣本的核酸的方法，其中將該第三緩衝液加入該第二針筒中之後，靜置0.5分鐘至10分鐘再回收該第三緩衝液。
11. 如請求項8所述之於戶外萃取樣本的核酸的方法，其中該樣本包括一含致病原或非致病原的生物樣本、或一含致病原或非致病原的食物樣本、飲料樣本或環境樣本。
12. 如請求項11所述之於戶外萃取樣本的核酸的方法，其中該含致病原或非致病原的生物樣本包括受到至少一致病菌感染的一植物樣本。

Images