TWI768394B

TWI768394B - 黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用

Info

Publication number: TWI768394B
Application number: TW109122987A
Authority: TW
Inventors: 詹華強; 董婷霞; 夏翊騰; 鄭玉忠; 汪成; 戴坤
Original assignee: 香港科技大學
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2022-06-21
Also published as: WO2021063047A1; TW202114722A; CN110548066A

Abstract

本發明涉及一種黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用。所述黃芩地上部分包括黃芩莖、黃芩葉和黃芩花中的至少一種。其中，黃芩地上部分的提取物對於水生病原菌具有良好的抑制效果，且不易產生耐藥性，適合於在水產養殖中大規模應用。

Description

黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用

本發明涉及水產養殖技術領域，特別是涉及一種黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用。

近年來，隨著水產養殖規模的不斷擴大、養殖種類的增加以及環境的日益惡化，各類水產養殖病害呈頻發的態勢，其中水生病原菌引起的水產動物細菌性疾病，仍然是最常見、危害最大的疾病之一。

但是，一方面，目前針對抗菌藥物的研究主要針對陸地環境中常出現的致病菌，如葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌等，而對於水生病原菌的針對性研究十分少。並且現今水產養殖中的抗菌手段仍然以照搬人醫、獸醫用藥為主，缺乏針對水產微生物的精准研究和用藥，大大降低了用藥效率，提高了養殖成本。另一方面，傳統化學藥品以及抗生素的使用，容易導致病原菌的耐藥性以及多重耐藥性。而肉類位於人類食物鏈的上游，會間接造成人類對抗生素的抗藥性。並且傳統化學藥品以及抗生素在水產動物體內的殘留及由此產生的畸變也嚴重影響了水產經濟動物的價值。

因此，如何提供一種具有良好的抗水生病原菌功效、低毒且不易產生耐藥性的藥物應用於水產養殖，具有重要意義。

基於此，本發明的目的之一是提供一種黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用。該黃芩地上部分的提取物對於水生病原菌具有良好的抑制效果，且不易產生耐藥性，適合於在水產養殖中大規模應用。

具體技術方案如下：

黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用；所述黃芩地上部分包括黃芩莖、黃芩葉和黃芩花中的至少一種。

本發明的另一目的是提供一種水產養殖飼料，由包括以下重量份的原料製備而成：黃芩地上部分的提取物0.5-5份、飼料90-110份和魚油0.2-2份。

本發明的再一目的是提供上述水產養殖飼料的製備方法，包括以下步驟：（1）黃芩地上部分的提取物的製備：將黃芩地上部分用提取溶劑提取，濃縮，乾燥，得黃芩地上部分的提取物；（2）按所述重量份數稱取黃芩地上部分的提取物，溶于水後噴灑在所述飼料的表面，乾燥；（3）在步驟（2）得到的飼料表面噴灑所述魚油。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

黃芩是唇形科植物（Scutellaria baicalnsis Georgi）的根，味苦性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效，是常用中藥材。在黑龍江、遼寧、內蒙古、河北、河南、甘肅、陝西、山西、山東、四川等地均有大面積種植。但僅只有根部用來入藥，其餘莖葉均作為廢棄物丟棄，污染環境的同時還造成資源的極大浪費。

本發明的發明人經過大量的試驗研究發現，黃芩地上部分的提取物對於水生病原菌具有良好的抑制效果，且不易產生耐藥性，適合用於水產養殖中。

將黃芩地上部分的提取物與魚油、飼料按特定比例複配，製備得到的水產養殖飼料，對於水體中的微生物具有明顯的抑制作用，對於水產動物具有良好的抗炎作用，同時魚油的添加避免了黃芩味苦造成的水產動物食用困難的問題。

本發明的水產養殖飼料製備工藝簡單，實現了中藥廢棄物黃芩的地上部分作的高附值利用，大大降低了原料成本，可適用於大規模生產。

為了便於理解本發明，下面將參照實施例對本發明進行更全面的描述，以下給出了本發明的較佳實施例。但是，本發明可以以許多不同的形式來實現，並不限於本文所描述的實施例。提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬於本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發明。本文所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。

本發明的實施例提供黃芩地上部分的提取物在水產養殖中的應用；所述黃芩地上部分包括黃芩莖、黃芩葉和黃芩花中的至少一種。

在其中一些實施例中，所述黃芩地上部分的提取物包括所述黃芩地上部分的醇提取物、水提取物或乙醇水溶液提取物或其精製品。

在其中一些實施例中，黃芩地上部分的提取物在製備水產養殖飼料中的應用。

在其中一些實施例中，黃芩地上部分的提取物作為所述水產養殖飼料的添加劑。

在其中一些實施例中，所述水產養殖飼料中不包括抗生素。

在其中一些實施例中，所述黃芩地上部分的提取物的製備包括以下步驟：將黃芩地上部分用提取溶劑提取，濃縮，乾燥。

在其中一些實施例中，所述黃芩地上部分的提取物的製備包括以下步驟：取黃芩地上部分粉末，加入其12-18倍（W/V）的提取溶劑，室溫超聲20-40分鐘，離心，收集上清液，所得沉澱重複上述步驟一次，合併上清液，得到黃芩地上部分的提取液，濃縮，乾燥。

在其中一些實施例中，所述黃芩地上部分的醇提取物、水提取物或乙醇水溶液提取物的精製品的製備包括以下步驟：將黃芩地上部分用提取溶劑提取，將所得提取液濃縮，調節pH至2-3，用大孔樹脂分離，收集體積分數為80%-90%的乙醇水溶液洗脫部分，濃縮。

在其中一些實施例中，所述提取溶劑包括水、乙醇或乙醇水溶液。優選地，所述乙醇水溶液中乙醇的體積分數為70%-80%。

在其中一些實施例中，所述提取的方式為超聲提取或熱提取；

本發明的實施例還提供一種水產養殖飼料，由包括以下重量份的原料製備而成：

黃芩地上部分的提取物0.5-5份、飼料90-110份和魚油0.2-2份。在其中一些實施例中，所述水產養殖飼料由包括以下重量份的原料製備而成：黃芩地上部分的提取物1.5-2.5份、飼料95-105份、魚油0.2-1份。

在其中一些實施例中，所述原料中的飼料包括以下重量份數的組分：蛋白質30-40份、脂類6-7份、纖維素3-6份和碳水化合物29-37份。

在其中一些實施例中，所述原料中的飼料包括以下重量份數的組分：蛋白質30-40份、脂類6-7份、纖維素3-6份、碳水化合物29-37份和水分8-9份。

上述水產養殖飼料的製備方法，包括以下步驟：（1）黃芩地上部分的提取物的製備：將黃芩地上部分用提取溶劑提取，濃縮，乾燥，得黃芩地上部分的提取物；（2）按所述重量份數稱取黃芩地上部分的提取物，溶于水後噴灑在所述飼料的表面，乾燥；（3）在步驟（2）得到的飼料表面噴灑所述魚油。

在其中一些實施例中，上述水產養殖飼料的製備方法，包括以下步驟：（1）黃芩地上部分的提取物的製備：將黃芩地上部分用提取溶劑提取，將所得提取液濃縮，調節pH至2-3，用大孔樹脂分離，收集體積分數為80%-90%的乙醇水溶液洗脫部分，濃縮，得黃芩地上部分的提取物；（2）按所述重量份數稱取黃芩地上部分的提取物，溶于水後噴灑在所述飼料的表面，乾燥；（3）在步驟（2）得到的飼料表面噴灑所述魚油。

其中，所述黃芩地上部分指的是除黃芩根之外的莖、葉、花等。

在其中一些實施例中，步驟（1）所述提取溶劑包括水、乙醇或乙醇水溶液。

在其中一些實施例中，步驟（1）所述提取的方式為超聲提取或熱提取。優選地，所述超聲的時間為20-40分鐘。

在其中一些實施例中，步驟（2）所述的黃芩地上部分的提取物的水溶液的品質體積濃度為50-150mg/ml。優選地，所述的黃芩地上部分的提取物的水溶液的品質體積濃度為90-110 mg/ml。

在其中一些實施例中，步驟（2）所述乾燥的溫度為35℃-60℃。

以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細的說明。

原料：黃芩地上部分（包括黃芩莖、葉或花）、魚油、飼料（蛋白質30-40份、脂類6-7份、纖維素3-6份、碳水化合物29-37份和水分8-9份）。

以下實施例涉及的微生物（嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、解藻弧菌、哈威氏弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌）均購買自廣東省微生物菌種保藏中心。

[實施例1 水產養殖飼料的製備方法]

包括以下步驟：

（1）黃芩地上部分的水提物的製備：取黃芩地上部分粉末，加入15倍體積的水，室溫超聲30分鐘，4000rpm離心10分鐘後，收集上清液，沉澱重複上述步驟一次，合併上清液，得到黃芩地上部分提取液。將黃芩地上部分提取液減壓濃縮，冷凍乾燥得到黃芩地上部分水提物粉末

（2）將黃芩地上部分水提物粉末加水溶解，配成終濃度為100 mg/mL；將配方水產飼料（顆粒直徑0.2 cm）放入飼料攪拌機；按飼料幹重的2%比例（粉末品質）噴灑黃芩地上部分的水提物的水溶液，以40轉/分鐘的轉速攪拌，使黃芩地上部分的水提物的水溶液均勻包裹在飼料表面；

（3）45℃低溫烘乾飼料，按飼料幹重的0.5%比例噴灑加入魚油，40轉/分鐘攪拌，使魚油均勻包裹在飼料表面上，即得水產養殖飼料。

[實施例2]

（1）黃芩地上部分的醇提物的製備：以黃芩地上部分粉末加入15倍體積的75%濃度的乙醇，室溫超聲30分鐘，4000rpm離心10分鐘後，收集上清液，所得沉澱重複上述步驟一次，合併上清液，得到黃芩地上部分提取液。將黃芩地上部分提取液減壓濃縮，冷凍乾燥得到黃芩地上部分醇提物粉末。

（2）將黃芩地上部分醇提物粉末加水溶解，配成終濃度為100 mg/mL；將配方水產飼料（顆粒直徑0.2 cm）放入飼料攪拌機；按飼料幹重的5%比例（粉末品質）噴灑黃芩地上部分的提取物的水溶液，以40轉/分鐘的轉速攪拌，使黃芩地上部分的提取物水溶液均勻包裹在飼料表面；

（3）45℃低溫烘乾飼料，按飼料幹重的1%比例噴灑加入魚油，40轉/分鐘攪拌，使魚油均勻包裹在飼料表面上，即得水產養殖飼料。

[實施例3]

（1）黃芩地上部分的水提取物的精製品的製備：以黃芩地上部分粉末加入15倍體積的水，室溫浸泡30分鐘後，加熱提取2小時，收取上清液並加熱濃縮，調pH至2-3，上大孔樹脂柱，收85%乙醇洗脫部分，減壓濃縮即得。

（2）將黃芩地上部分的水提取物的精製品粉末加水溶解，配成終濃度為100 mg/mL；將配方水產飼料（顆粒直徑0.2 cm）放入飼料攪拌機；按飼料幹重的1%比例（粉末品質）噴灑黃芩地上部分的提取物水溶液，以40轉/分鐘的轉速攪拌，使黃芩地上部分的提取物水溶液均勻包裹在飼料表面；

（3）35℃低溫烘乾飼料，按飼料幹重的0.2%比例噴灑加入魚油，40轉/分鐘攪拌，使魚油均勻包裹在飼料表面上，即得水產養殖飼料。

[實施例4 體外抗菌活性檢測]

1、將實施例1和2製備得到的黃芩地上部分提取物，溶解配成終濃度為100 mg/mL的溶液，進一步配置成濃度為10 mg/mL、1mg/mL溶液分別與嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、解藻弧菌和哈威氏弧菌四種有害細菌的菌液共培養12小時；

2、培養結束後離心去除舊培養基，將菌體用新培養基稀釋後測量生長曲線；

3、採用SGT法評估黃芩地上部分的提取物的抗菌活性。起始生長曲線法（SGT）是篩選抗菌活性藥物的高通量新篩選方法。細菌在與藥物共培養一段時間後，離心去除藥物，剩餘細菌稀釋到新的培養基中進行生長，通過讀取OD595評估細菌生長狀態，一段時間後進入對數生長期，起始數量較多的細菌較快進入對數生長期，較少的細菌較慢進入對數生長期。通過計算不同組進入對數生長期的時間點，進而計算與藥物共培養後細菌的數量，從而判斷藥物的抗菌活性。

如附圖2所示，黃芩地上部分的不同提取液對四種水生有害細菌均有抑制作用。由此可知，黃芩地上部分的提取物對於水生病原菌具有良好的生長抑制作用。

[實施例5 體外抗菌活性檢測]

將實施例1和2製備得到的黃芩地上部分水提物和醇提物，溶解配成終濃度為100 mg/mL的溶液，進一步配置成10 mg/mL、1mg/mL的溶液分別與四種水生病原菌（嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、解藻弧菌和哈威氏弧菌）和四種常見非水生病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌）的菌液共培養12小時；卡那黴素用DMSO配置成濃度為5mg/mL的溶液，作為對照。

結果如表1所示

表1

	抑菌圈直徑（mm）
黃芩地上部分水提物	黃芩地上部分醇提物	卡那黴素
10mg/mL	1mg/mL	10mg/mL	1mg/mL	5mg/mL
金黃色葡萄球菌	23	9	25	10.5	16.5
大腸桿菌	17	9.5	18	8.5	12.5
肺炎克雷伯氏菌	13	8	14	8	11.5
銅綠假單胞菌	10	0	10.5	0	15
嗜水氣單胞菌	19	8	18	10.5	6
遲緩愛德華氏菌	17	10	16.5	10	8
解藻弧菌	13.5	8	14	9	7
哈威氏弧菌	15.5	10.5	15	8	7

由表1的結果可知，黃芩地上部分提取物在高濃度（10mg/mL）對四種水生病原菌（嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、解藻弧菌和哈威氏弧菌）和四種常見非水生病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌）的抑菌功效明顯。

[實施例6 體外抗炎活性檢測]

1、將實施例3製備得到的黃芩地上部分的水提物精製品用二甲基亞碸（DMSO）溶解配成終濃度為1 mg/mL的溶液，用細胞培養液進一步稀釋成濃度為分別0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL的溶液，分別與巨噬細胞共同培養；

2、以脂多糖刺激巨噬細胞的炎症反應，同時以沒有加入任何的對照的測試結果作為實驗陰性對照，以抗炎藥物地塞米松的測試結果作為實驗陽性對照；

3、通過螢光素酶法及即時定量PCR法測量炎症轉錄因數NF-κB及炎症細胞因數IL-1β的表達量。

如附圖3所示，黃芩地上部分的提取物對巨噬細胞中炎症轉錄因數NF-κB以及炎症細胞因數IL-1β的表達有明顯抑制作用，具有良好的體外抗炎活性，且隨著濃度的提升其抗炎效果也有所增加，適合廣泛用於水產飼料添加劑。

[實施例7 體內抗菌、抗炎實驗]

1、將實施例1製備的水產養殖飼料投喂給試驗用泥猛魚（投喂量為：每條魚每日投喂大約2.5克飼料，早晚各一次），同時加入四種混合細菌到養殖水箱中。以沒有加入任何提取物的飼料測試結果作為實驗陰性對照。以添加恩諾沙星等抗生素的飼料（添加量為：恩諾沙星在養殖水體中最終濃度：0.05 mg/mL）測試結果作為實驗陽性對照。以不添加細菌的測試結果作為實驗空白對照。

2、通過梯度稀釋法測量養殖過程中水體中細菌的數量變化；

3、比較加入細菌培養48小時後魚內各個組織內先炎症因數的表達量。

如附圖4和附圖5所示，本發明添加了黃芩地上部分的提取物的水產養殖飼料可以減少泥猛魚各組織內炎症因數的表達，降低養殖水體中細菌的數量。

以上所述實施例的各技術特徵可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特徵所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特徵的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的範圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為准。

無

圖1為實施例1中黃芩地上部分的水產養殖飼料製備工藝。圖2為實施例4中黃芩地上部分的提取物對水生細菌的生長抑制作用。圖3是實施例6中黃芩地上部分的提取物的體外抗炎結果。圖4是實施例7中添加黃芩地上部分的提取物的水產飼料的體內抗菌抗炎結果（*代表與空白組比較有顯著差異，P＜0.05；**代表與空白組比較有極顯著差異，P＜0.01）。圖5是實施例7中添加黃芩地上部分的提取物的水產飼料的體內抗菌結果。

Claims

一種黃芩地上部分的提取物在海水養殖中的應用，所述黃芩地上部分包括黃芩莖、黃芩葉和黃芩花中的至少一種，其中所述黃芩地上部分的提取物包括所述黃芩地上部分的乙醇提取物、水提取物或乙醇水溶液提取物或其精製品。
如請求項1所述的應用，其中所述乙醇水溶液中乙醇的體積分數為70%-80%。
如請求項1所述的應用，其中所述黃芩地上部分的提取物在製備海水養殖飼料中的應用。
如請求項3所述的應用，其中所述黃芩地上部分的提取物作為所述海水養殖飼料的添加劑。
一種海水養殖飼料，包括以下重量份的原料製備而成：如請求項1至請求項4中任一項所述的應用中所述的黃芩地上部分的提取物0.5-5份、飼料90-110份和魚油0.2-2份。
如請求項5所述的海水養殖飼料，包括以下重量份的原料製備而成：所述黃芩地上部分的提取物1.5-2.5份、所述飼料95-105份和所述魚油0.2-1份。
如請求項5所述的海水養殖飼料，其中所述飼料包括以下重量份數的組分：蛋白質30-40份、脂類6-7份、纖維素3-6份和碳水化合物 29-37份。
一種如請求項5至請求項7中任一項所述的海水養殖飼料的製備方法，包括以下步驟：(1)所述黃芩地上部分的提取物的製備：將所述黃芩地上部分用提取溶劑提取，濃縮，乾燥，得所述黃芩地上部分的提取物；(2)按所述重量份數稱取所述黃芩地上部分的提取物，溶于水後噴灑在所述飼料的表面，乾燥；(3)在步驟(2)得到的飼料表面噴灑所述魚油，其中所述提取溶劑包括水、乙醇或乙醇水溶液。
如請求項8所述的製備方法，其中步驟(2)所述黃芩地上部分的提取物的水溶液的品質體積濃度為50-150mg/ml。
如請求項8或請求項9所述的製備方法，其中步驟(2)所述乾燥的溫度為35℃-60℃。