TWI740323B - 高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法 - Google Patents

高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI740323B
TWI740323B TW108147675A TW108147675A TWI740323B TW I740323 B TWI740323 B TW I740323B TW 108147675 A TW108147675 A TW 108147675A TW 108147675 A TW108147675 A TW 108147675A TW I740323 B TWI740323 B TW I740323B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
stage
coating layer
bacterial
fermentation broth
total volume
Prior art date
Application number
TW108147675A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202123948A (zh
Inventor
林詠翔
何政育
王錦佳
Original Assignee
大江生醫股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大江生醫股份有限公司 filed Critical 大江生醫股份有限公司
Priority to TW108147675A priority Critical patent/TWI740323B/zh
Priority to CN201911377557.6A priority patent/CN113025514B/zh
Priority to US16/826,892 priority patent/US11066637B1/en
Publication of TW202123948A publication Critical patent/TW202123948A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI740323B publication Critical patent/TWI740323B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1664—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一種活菌菌粉微粒，其係包含一菌種、一第一包覆層、以及一第二包覆層，其中，第一包覆層係位於該菌種之細胞膜及細胞壁之間，且該菌種係分散於第二包覆層中。一種製備活菌菌粉微粒的方法，包括：(a) 對一菌種進行三階段之發酵培養，以獲得一發酵菌液；(b) 將該發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液；(c) 將該濃縮菌液與保護劑混合，以獲得一混合物；以及，(d) 將該混合物進行乾燥處理，以獲得一活菌菌粉微粒。

Description

高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法
本發明係關於一種活菌菌粉微粒，其係包含一菌種、一第一包覆層、以及一第二包覆層，其中，第一包覆層係位於該菌種之細胞膜及細胞壁之間，且該菌種係分散於第二包覆層中。本發明亦關於一種製備活菌菌粉微粒的方法，包括：(a) 對一菌種進行三階段之發酵培養，以獲得一發酵菌液；(b) 將該發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液；(c) 將該濃縮菌液與保護劑混合，以獲得一混合物；以及，(d) 將該混合物進行乾燥處理，以獲得一活菌菌粉微粒。
隨著人們對於益生菌的了解及其對人體健康作用的認識，益生菌之相關產品與日俱增。基於維持益生菌活性的需求，含活菌之產品在保存上有諸多限制，例如：需儲存於冷藏或冷凍的溫度下、需使用氣調包裝（modified atmosphere packaging）等。此外，基於運輸及保存的便利性，益生菌產品常以菌粉之形式提供。
噴霧乾燥法及冷凍乾燥法乃菌粉製備過程中之常見的冷凍方法，然而，噴霧乾燥法因必須在較高的溫度下實施，可能導致細菌因高溫而死亡；冷凍乾燥法則可能溫度下降過程中形成冰晶而造成菌體受損，導致菌粉中的活菌含量減少。因此，業界目前仍致力於發展出可以提供高活菌含量之菌粉的製備方法。
有鑑於上述技術問題，本案發明人研究發現一種提供高活菌濃度之菌液的方法、一種製備活菌菌粉微粒的方法、以及一種具高活菌含量及低水分殘留特性之菌粉微粒。
本發明之一目的，在於提供一種提供高活菌濃度之菌液的方法，包括： (a)    對一菌種依序進行以下三階段之發酵培養以獲得一發酵菌液： 一第一階段培養，歷時 t1小時， 一第二階段培養，歷時 t2小時，以及 一第三階段培養，歷時 t3小時， 其中： T1 -2≦t1≦T1 +2， T1 -2≦t2≦T1 +2， T2 -2≦t3≦T2 +2， t1、t2、及t3皆不小於0.5， T1 係該菌種之生長對數期的起始時間點， T2 係該菌種之生長穩定期的起始時間點， 且其中第二階段之發酵菌液總體積為第一階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍，第三階段之發酵菌液總體積為第二階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍；以及， (b)   對(a)所提供之發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液。
本發明之另一目的，在於提供一種製備活菌菌粉微粒的方法，包括： (a)    對一菌種依序進行以下三階段之發酵培養以獲得一發酵菌液： 一第一階段培養，歷時 t1小時， 一第二階段培養，歷時 t2小時，以及 一第三階段培養，歷時 t3小時， 其中： T1 -2≦t1≦T1 +2， T1 -2≦t2≦T1 +2， T2 -2≦t3≦T2 +2， t1、t2、及t3皆不小於0.5， T1 係該菌種之生長對數期的起始時間點， T2 係該菌種之生長穩定期的起始時間點， 且其中第二階段之發酵菌液總體積為第一階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍，第三階段之發酵菌液總體積為第二階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍； (b)   對(a)所提供之發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液； (c)    將該濃縮菌液與保護劑混合，以獲得一混合物；以及， (d)   對該混合物進行乾燥處理，以獲得一活菌菌粉微粒。
於上述提供高活菌濃度之菌液的方法、及製備活菌菌粉的方法中，較佳地，T1 -1≦t1≦T1 +1，T1 -1≦t2≦T1 +1，且T2 -2≦t3≦T2 。
本發明之又一目的，在於提供一種活菌菌粉微粒，其係透過如上述之製備方法而提供。
本發明之再一目的，在於提供一種活菌菌粉微粒，其係包含一菌種、一第一包覆層、以及一第二包覆層，其中，第一包覆層係位於該菌種之細胞膜及細胞壁之間，且該菌種係分散於第二包覆層中。較佳地，該活菌菌粉微粒係更包含一第三包覆層，其中該第三包覆層係位於第二包覆層外側。
於根據本發明所提供之活菌菌粉微粒中，第一包覆層係含有以下之至少一者：異麥芽寡糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果寡糖、鼠李糖、及棉子糖；第二包覆層係含有以下之至少一者：麥芽糊精、脫脂奶粉、菊糖、及澱粉；以及，第三包覆層係含有以下之至少一者：麥芽糊精、阿拉伯膠、巧克力、及脫脂奶粉。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者或後附申請專利範圍所界定者。
除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「低聚醣」係指具有二至十個單醣分子的醣類；所謂「多聚醣」係指具有超過十個之單醣分子的醣類；所謂「低水分殘留」係指以菌粉微粒之總重量計，其水分殘留量小於10重量%；所謂「個體」係指人類或非人的哺乳動物（例如：狗、貓）。
本文中所使用之數值範圍（例如5至100）應理解為亦包含在該範圍中的所有有理數以及在該範圍中之任何有理數所組成的範圍，因此，本說明書中所使用之數值範圍係包含介於所列舉之最低值與最高值之間的數值的所有可能組合。另，當本文於數值前使用「約」時，係指所述數值可以所屬技術領域中具通常知識者認知為一般且合理的大小的量增加或減少，舉例言之，當本文於數值前使用「約」時，實質上代表與所述數值相差在10%以內者，較佳在5%以內者。
本文中雖涉及使用「第一包覆層」、「第二包覆層」及「第三包覆層」等用語，但此用語僅用於區隔之目的，所描述之包覆層並不受這些用語限制。
已知細菌的生長週期依其生長速率變化可分為遲滯期（Lag phase）、對數期（Logarithmic phase）、穩定期（Stationary phase）及衰退期（Decline/Death phase）。本案發明人研究發現，透過在細菌發酵期間對其生長週期進行控制，可顯著縮短細菌擴大發酵的耗時，從而在短時間內提供高活菌濃度之菌液；本案發明人另發現，將本發明所提供之高活菌濃度的菌液與保護劑混合且進一步濃縮乾燥，可獲得一具高活菌含量及低水分殘留量特性之菌粉微粒。因此，本發明係關於菌粉微粒及其製備方法，包括一種提供高活菌濃度之菌液的方法、一種製備活菌菌粉微粒的方法、以及一種活菌菌粉微粒。
所謂「生長對數期」係指在微生物生長週期中，微生物數量急速成長的期間，而「生長穩定期」係指微生物數量維持恆定、不再上升的期間。於本發明中，係透過微生物生長曲線圖來判斷生長對數期的起始時間點（於本文中稱為「T1 」）及生長穩定期的起始時間點（於本文中稱為「T2 」），其中，當一時間點之切線斜率大於或等於前一小時之切線斜率的三倍時，即判定該時間點為T1 ；而當一時間點之切線斜率為零時，即判定該時間點為T2 。
1. 提供高活菌濃度之菌液的方法
本發明係提供一種提供高活菌濃度之菌液的方法，包括： (a)      對一菌種依序進行以下三階段之發酵培養以獲得一發酵菌液： 一第一階段培養，歷時 t1小時， 一第二階段培養，歷時 t2小時，以及 一第三階段培養，歷時 t3小時， 其中： T1 -2≦t1≦T1 +2， T1 -2≦t2≦T1 +2， T2 -2≦t3≦T2 +2， t1、t2、及t3皆不小於0.5， T1 係該菌種之生長對數期的起始時間點， T2 係該菌種之生長穩定期的起始時間點， 且其中第二階段之發酵菌液總體積為第一階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍，第三階段之發酵菌液總體積為第二階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍；以及， (b)     對(a)所提供之發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液。
本發明之提供高活菌濃度之菌液的方法可適用於任何合宜之菌種，例如嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles ）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum ）、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum ）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans ）、乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei ）、瑞士乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus ）、加氏乳酸桿菌（Lactobacillus gasseri ）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis ）、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii ）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici ）、發酵乳酸桿菌（Lactobacillus fermentum ）、鼠李醣乳酸桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ）、副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides ）、唾液乳酸桿菌（Lactobacillus salivarius ）、戴白氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii ）、及短毛乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ），但不以此為限。於本發明之一具體實施態樣中，係透過上述方法提供一高濃度之胚芽乳酸桿菌活菌的菌液。
於步驟(a)中，t1係介於所欲培養之菌種之生長對數期的起始時間點前後2小時的範圍內（即，T1-2≦t1≦T1+2），t2係介於生長對數期之起始時間點前後二小時的範圍內（即，T1-2≦t2≦T1+2），t3則係介於生長穩定期之起始時間點前後二小時的範圍內（即，T2-2≦t3≦T2+2），且t1、t2、及t3皆不小於0.5；較佳地，t1係介於所欲培養之菌種之生長對數期的起始時間點前後1小時的範圍內（即，T1 -1≦t1≦T1 +1），t2係介於生長對數期之起始時間點前後1小時的範圍內（即，T1 -1≦t2≦T1 +1），t3則係介於生長穩定期之起始時間點前2小時至該起始時間點的範圍內（即，T2 -2≦t3≦T2 ），且t1、t2、及t3皆不小於0.5。於本發明之一具體實施態樣中，係透過上述方法提供一高濃度之胚芽乳酸桿菌活菌的菌液，其中，經計算胚芽乳酸桿菌之生長曲線的切線斜率之後，判斷T1 為2、且T2 為8，故0.5≦t1≦4，0.5≦t2≦4，且6≦t3≦10。較佳地，於根據本發明之提供高濃度之胚芽乳酸桿菌活菌的菌液的方法中，第一階段培養係歷時2至3小時，第二階段培養係歷時2至4小時，第三階段培養係歷時6至8小時。
於根據本發明之提供高活菌濃度之菌液的方法中，較佳地，第二階段之發酵菌液總體積為第一階段之發酵菌液總體積的10倍至25倍，第三階段之發酵菌液總體積為第二階段之發酵菌液總體積的10倍至30倍。
於步驟(a)中，可依所欲培養之菌種而調整培養溫度及發酵培養基。舉例言之，嗜熱鏈球菌、凝結芽孢桿菌、及戴白氏乳酸桿菌可於42°C±5之溫度下進行發酵培養；啤酒酵母菌、及腸膜明串珠菌可於30°C±5之溫度下進行發酵培養；嗜熱鏈球菌、長雙歧桿菌、胚芽乳酸桿菌、乾酪乳桿菌、瑞士乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌、乳雙歧桿菌、約氏乳桿菌、乳酸片球菌、發酵乳酸桿菌、鼠李醣乳酸桿菌、副乾酪乳桿菌、唾液乳酸桿菌、及短毛乳酸桿菌則可於37°C±5之溫度下進行發酵培養。至於發酵培養基，以胚芽乳酸桿菌為例，可使用純水作為發酵培養基的基底，於每公升純水中加入20至40公克之酵母浸粉、10至30公克之酵母蛋白腖、1至3公克之磷酸氫二鉀、0.5至1.5公克之硫酸鎂、0.5至1.5公克之聚山梨醇酐脂肪酸酯八十、10至30公克之葡萄糖、及10至30公克之10N氫氧化鈉而提供。
於步驟(b)中，可採用任何合宜之離心設備對步驟(a)所提供之發酵菌液進行離心濃縮，並無特別限制，只要能有效減少發酵菌液之總體積且有效保留菌液中的活菌含量即可。較佳地，係使發酵菌液之總體積達到至少10倍濃縮（即，濃縮菌液之總體積不大於發酵菌液之總體積的十分之一）。舉例言之，係將500公升之發酵菌液離心濃縮至總體積約為30至50公升之濃縮菌液。
2. 製備活菌菌粉微粒的方法
本發明亦提供一種製備活菌菌粉微粒的方法，其係包含對上述1.之方法提供的濃縮菌液進行以下處理： (c)      將該濃縮菌液與保護劑混合，以獲得一混合物；以及 (d)     對該混合物進行乾燥處理，以獲得一活菌菌粉微粒。
步驟(c)之目的在於，透過添加保護劑以避免濃縮菌液中的活菌含量因為活菌在後續步驟(d)之乾燥處理中死亡而減少。因此，步驟(c)所使用之保護劑並無特殊限制，只要可以有效保護濃縮菌液中的活菌不因乾燥處理而死亡即可。適用於步驟(c)之保護劑的例子包括異麥芽寡糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果寡糖、鼠李糖、棉子糖、麥芽糊精、脫脂奶粉、菊糖、澱粉、阿拉伯膠、巧克力、脫脂奶粉，但不以此為限。
較佳地，步驟(c)中所使用的保護劑係包含至少一種對於菌體具有半穿透性（semi-permeable；即，可穿透細菌細胞壁，但不穿透細菌細胞膜）的低聚醣（例如異麥芽寡糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果寡糖、鼠李糖、及棉子糖）、以及至少一種多聚醣（例如麥芽糊精、菊糖、及澱粉）或蛋白質（例如脫脂奶粉）。更佳地，步驟(c)中所使用的保護劑更包含至少一種防潮劑（例如麥芽糊精、阿拉伯膠、巧克力、及脫脂奶粉）。舉例言之，步驟(c)中所使用的保護劑係包含乳糖、菊糖、及麥芽糊精，或者，該保護劑係包含乳糖、麥芽糊精及脫脂奶粉。
於步驟(d)中，可採用任何合宜之乾燥方法對步驟(c)提供之混合物進行乾燥處理，例如：噴霧乾燥及冷凍乾燥，但不以此為限。於本發明之一具體實施態樣中，係於步驟(d)使用冷凍乾燥以對步驟(c)所提供之混合物進行乾燥處理，以獲得一活菌菌粉微粒。
3. 活菌菌粉微粒
本發明亦關於一種活菌菌粉微粒，其可透過本發明方法而提供。如本文之圖1及圖2所示，本發明之活菌菌粉微粒2係包含一菌種1、一第一包覆層12、以及一第二包覆層14，其中，第一包覆層12係位於菌種1之細胞膜11及細胞壁13之間，且菌種1係分散於第二包覆層14中。此外，如本文之圖2及圖3所示，本發明之活菌菌粉微粒更可以包含一第三包覆層21，其中第三包覆層21係位於第二包覆層14外側。
較佳地，第一包覆層係含有以下之至少一者：異麥芽寡糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果寡糖、鼠李糖、及棉子糖。於本發明之一具體實施態樣中，第一包覆層係含有乳糖。
較佳地，第二包覆層係含有以下之至少一者：麥芽糊精、脫脂奶粉、菊糖、及澱粉。於本發明之一具體實施態樣中，第二包覆層係含有麥芽糊精。
較佳地，第三包覆層係含有以下之至少一者：麥芽糊精、阿拉伯膠、巧克力、及脫脂奶粉。更佳地，第三包覆層係含有麥芽糊精或脫脂奶粉或其組合。於本發明之一具體實施態樣中，第三包覆層係含有脫脂奶粉。
根據本發明所提供之活菌菌粉微粒的保存條件並無特別限制，可依運輸、保存、或使用上之需求進行調整。舉例言之，可將本發明之活菌菌粉微粒置於一密封包裝中，儲存於室溫（25°C）、冷藏（4°C）或冷凍（-20°C）環境下。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
4. 實施例
4.1 實驗方法及材料
4.1.1 活菌含量檢測方法
取50公克之菌粉（或50毫升之菌液）為樣品，加入450毫升之稀釋液中並均勻混合，以獲得10倍稀釋樣品（可視需要進行10倍序列稀釋，以使稀釋樣品之濃度降低）。將1毫升之稀釋樣品塗佈於瓊脂培養基，然後置於37°C下進行厭氧培養，歷時72小時。觀察培養基，選取菌落數介於25至250個之間的區域進行菌落數計數，以回推該菌粉（或菌液）樣品中的活菌含量（單位：CFU／公克、或CFU／毫升）。
4.1.2 發酵培養條件 1.         氣流：每分鐘3公升。 2.         轉速：100 rpm。 3.         溶氧量：不小於40%。
4.1.3 發酵培養基
以純水為基底，於每公升純水中加入30公克之酵母浸粉、20公克之酵母蛋白腖、2公克之磷酸氫二鉀、1公克之硫酸鎂、1公克之聚山梨醇酐脂肪酸酯八十、20公克之葡萄糖、及20公克之10N氫氧化鈉，均勻混合後，進行滅菌，以提供一發酵培養基；pH 5.5±0.1。
4.1.4 凍乾保護劑
以6：1：33（乳糖：麥芽糊精：脫脂奶粉）之重量比將乳糖、麥芽糊精、及脫脂奶粉均勻混合，以提供一凍乾保護劑。
4.2 製備實施例
4.2.1 菌種之準備
取胚芽乳酸桿菌之冷凍保存管，解凍後，以1%（V/V）之植菌量接種至150毫升（mL）之MRS培養液（購自Thermo Fischer Scientific；產品名稱：BD Difco Lactobacilli MRS Broth）中，於37°C下培養約16小時，以提供一含菌量到達約1×109 至1×1010 CFU／毫升之菌液。
4.2.2 生長曲線之繪製
將4.2.1提供之胚芽乳酸桿菌TCI378接種至MRS培養基，於37°C下培養，且於培養期間每間隔1小時以4.1.1之檢測方法檢測培養基中之活菌含量，以繪製胚芽乳酸桿菌TCI378之生長曲線。結果示於圖4。
使用EXCEL之SLOPE公式計算圖4之生長曲線中各時間點的切線斜率，以評估胚芽乳酸桿菌TCI378之生長對數期的起始時間點（即，T1 ）以及生長穩定期的起始時間點（即，T2 ）。由下表1可知，胚芽乳酸桿菌TCI378於培養2小時之切線斜率已大於培養1小時之切線斜率的三倍，因此，胚芽乳酸桿菌TCI378之T1 為2。此外，由圖4可知，培養約8小時之切線斜率為零，因此，胚芽乳酸桿菌TCI378之T2 為8。表 1
時間（小時） 菌數（ CFU/mL ） 切線斜率
0 2.5×107 –
1 5×107 2.6×107
2 1×108 8.7×107
3.3 6×108 3.7×108
4 1×109 9.1×108
4.3 實施例 1
4.3.1 高活菌濃度之菌液的製備 1.         以5%（V/V）之植菌量將4.2.1提供之菌種接種4.1.3提供之發酵培養基中，使總體積到達約3公升，進行發酵培養2.5小時，以提供一含菌量約5×108 至5×109 CFU／毫升之第一菌液； 2.         以6%（V/V）之植菌量將第一菌液接種至4.1.3提供之發酵培養基中，使總體積到達約50公升，進行發酵培養3小時，以提供一含菌量約5×108 至5×109 CFU／毫升之第二菌液；以及 3.         以10%（V/V）之植菌量將第二菌液接種至4.1.3提供之發酵培養基中，使總體積到達約500公升，進行發酵培養7小時，以提供一含菌量約5×109 至5×1010 CFU／毫升之高活菌濃度的菌液。
4.3.2 活菌菌粉微粒之製備
以連續式固液分離機對4.3.1提供之高活菌濃度之菌液（總體積：500公升）進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液（總體積：40公升）。其後，將該濃縮菌液、純水及凍乾保護劑以2：1：1（濃縮菌液：純水：凍乾保護劑）之重量比均勻混合，以獲得一混合物，並使用掃描式電子顯微鏡對該混合物進行拍攝（放大倍率：3000倍），結果示於圖5。如圖5所示，前述混合物係形成微粒結構。
另一方面，對上述濃縮菌液、純水與凍乾保護劑之混合物進行二階段之真空冷凍乾燥，其中，第一階段係於10至30°C下進行約15小時；第二階段係於30至40°C下進行約3小時，以獲得一活菌菌粉微粒。前述菌粉微粒之結構係如圖1至圖3所示。
4.4 實施例 2
4.4.1 菌粉活菌含量檢測
使用40目之篩網對4.3.2所提供之活菌菌粉微粒進行一過篩處理，使單顆活菌菌粉微粒的重量為0.0000111181573828125公克（40目之篩網孔徑體積為0.000022597880859375立方公分；活菌菌粉微粒之密度為0.492公克／立方公分），並推算單顆活菌菌粉微粒之活菌含量為1.11×108 CFU。
此外，亦使用4.1.1之方法檢測4.3.2所提供之菌粉微粒中的活菌含量。結果顯示，4.3.2所提供之菌粉微粒中之活菌含量高達為1.3×1012 CFU／公克。此說明，根據本發明所提供之活菌菌粉微粒中的活菌含量極高。
4.4.2 菌粉水分殘留檢測
使用水活性檢測儀（購自ROTRONIC公司；型號：HP23-AW-A-SET-40）對4.3.2所提供之菌粉微粒進行水分殘留量檢測。結果顯示，以4.3.2所提供菌粉微粒之總重量計，其水分殘留量係小於1重量%。此說明，根據本發明所提供之活菌菌粉微粒具有低水分殘留之特性。
上述實驗結果表示，透過本發明之方法可在短時間內提供一高活菌濃度之菌液，且可由該活菌菌液進一步提供一具有高活菌含量且低水分殘留特性之活菌菌粉微粒。
1:菌種 11:細胞膜 12:第一包覆層 13:細胞壁 14:第二包覆層 2:菌粉微粒 21:第三包覆層
圖1係本發明活菌菌粉微粒中第一包覆層與菌種之細胞膜及細胞壁之相對位置的示意圖。
圖2係本發明活菌菌粉微粒之一實施態樣的示意圖。
圖3係本發明活菌菌粉微粒之另一實施態樣的示意圖。
圖4係胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum ）之生長曲線圖。
圖5係由本發明方法獲得之濃縮菌液與凍乾保護劑之混合物的掃描式電子顯微鏡照片（放大倍率：3000倍）。
2:菌粉微粒
21:第三包覆層

Claims (10)

  1. 一種提供高活菌濃度之菌液的方法，包括：(a)對一菌種依序進行以下三階段之發酵培養以獲得一發酵菌液：一第一階段培養，歷時t1小時，一第二階段培養，歷時t2小時，以及一第三階段培養，歷時t3小時，其中：T1-2≦t1≦T1+2，T1-2≦t2≦T1+2，T2-2≦t3≦T2+2，t1、t2、及t3皆不小於0.5，T1係該菌種之生長對數期的起始時間點，T2係該菌種之生長穩定期的起始時間點，且其中第二階段之發酵菌液總體積為第一階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍，第三階段之發酵菌液總體積為第二階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍；以及(b)對(a)所提供之發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液。
  2. 一種製備活菌菌粉微粒的方法，包括：(a)對一菌種依序進行以下三階段之發酵培養以獲得一發酵菌液：一第一階段培養，歷時t1小時，一第二階段培養，歷時t2小時，以及 一第三階段培養，歷時t3小時，其中：T1-2≦t1≦T1+2，T1-2≦t2≦T1+2，T2-2≦t3≦T2+2，t1、t2、及t3皆不小於0.5，T1係該菌種之生長對數期的起始時間點，T2係該菌種之生長穩定期的起始時間點，且其中第二階段之發酵菌液總體積為第一階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍，第三階段之發酵菌液總體積為第二階段之發酵菌液總體積的10倍至35倍；(b)對(a)所提供之發酵菌液進行離心濃縮，以獲得一濃縮菌液；(c)將該濃縮菌液、純水與保護劑以2：1：1(濃縮菌液：純水：保護劑)之重量比混合，以獲得一混合物；以及(d)對該混合物進行乾燥處理，以獲得一活菌菌粉微粒。
  3. 如請求項1或2之方法，其中T1-1≦t1≦T1+1。
  4. 如請求項1或2之方法，其中T1-1≦t2≦T1+1。
  5. 如請求項1或2之方法，其中T2-2≦t3≦T2。
  6. 一種活菌菌粉微粒，其係透過如請求項2至5中任一項之方法而提供。
  7. 一種活菌菌粉微粒，其係包含一菌種、一第一包覆層、以及一第二包覆層，其中，第一包覆層係位於該菌種之細胞膜及細胞壁之間，且該菌種係分散於第二包覆層中，且其中第二包覆層係含有以下之至少一者：麥芽糊精、及脫脂奶粉。
  8. 如請求項7之活菌菌粉微粒，其係更包含一第三包覆層，其中該第三包覆層係位於第二包覆層外側。
  9. 如請求項7或8之活菌菌粉微粒，其中第一包覆層係含有以下之至少一者：異麥芽寡糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果寡糖、鼠李糖、及棉子糖。
  10. 如請求項8之活菌菌粉微粒，其中第三包覆層係含有以下之至少一者：麥芽糊精、阿拉伯膠、巧克力、及脫脂奶粉。
TW108147675A 2019-12-25 2019-12-25 高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法 TWI740323B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108147675A TWI740323B (zh) 2019-12-25 2019-12-25 高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法
CN201911377557.6A CN113025514B (zh) 2019-12-25 2019-12-27 具有高浓度活菌的微粒结构及其制备方法
US16/826,892 US11066637B1 (en) 2019-12-25 2020-03-23 Particulate structure with a high concentration of live bacteria and method of preparing the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW108147675A TWI740323B (zh) 2019-12-25 2019-12-25 高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202123948A TW202123948A (zh) 2021-07-01
TWI740323B true TWI740323B (zh) 2021-09-21

Family

ID=76458894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108147675A TWI740323B (zh) 2019-12-25 2019-12-25 高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11066637B1 (zh)
CN (1) CN113025514B (zh)
TW (1) TWI740323B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010054439A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Unistraw Patent Holdings Limited Probiotic compositions, methods and apparatus for their administration
CN102220272A (zh) * 2011-06-01 2011-10-19 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法
CN102978143A (zh) * 2012-12-21 2013-03-20 哈尔滨工业大学 乳杆菌冻干产品及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939295A (en) * 1996-03-29 1999-08-17 Archer Daniels Midland Company Production of tryptophan by microorganisms
CN104263675A (zh) * 2014-08-29 2015-01-07 湖北省生物农药工程研究中心 一种多粘芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺
CN106434463B (zh) * 2016-10-12 2019-08-27 汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司 一种鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010054439A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Unistraw Patent Holdings Limited Probiotic compositions, methods and apparatus for their administration
CN102220272A (zh) * 2011-06-01 2011-10-19 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法
CN102978143A (zh) * 2012-12-21 2013-03-20 哈尔滨工业大学 乳杆菌冻干产品及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hubálek Z., "Protectants used in the cryopreservation of microorganisms", Cryobiology, Vol. 46, 2003, page 205–229. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11066637B1 (en) 2021-07-20
TW202123948A (zh) 2021-07-01
US20210198617A1 (en) 2021-07-01
CN113025514B (zh) 2023-04-18
CN113025514A (zh) 2021-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240263127A1 (en) Cryoprotective compositions and uses thereof
US11717544B2 (en) Pairing probiotics and prebiotics, methods for growth and use, separately and in combination
CN113652359B (zh) 一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂
CN105105146B (zh) 一种益生菌的活性保持方法及其在固态脂质食品中的应用
KR20190002502A (ko) 약용식물의 미생물 발효
CN112553128B (zh) 益生菌冻干粉及其制备方法和应用
Bosnea et al. Functionality of freeze-dried L. casei cells immobilized on wheat grains
CN104651232B (zh) 一种肠膜明串珠菌冻干制剂及其制备方法和应用
KR102290654B1 (ko) 동결보호용 조성물 및 이를 포함하는 유산균제
WO2017186146A1 (zh) 药食用真菌的果蔬培养及益生菌发酵
US20190053527A1 (en) Method for preparing a probiotic powder using a two-in-one whey-containing nutrient medium
EP4012017A1 (en) Method for preparing pure plant-based microbial culture
TWI740323B (zh) 高穩定性的菌粉微粒結構及其製備方法
Tian et al. Effect of freeze-dried protectants on the survival rate and fermentation performance of fermented milk's directed vat set starters
JPWO2006112364A1 (ja) 乳酸菌培養により得られる血圧低下剤
KR20150012445A (ko) 마늘 파쇄물 및 유산균이 포집되어 있는 알지네이트 비드를 포함하는, 생존율이 증진된 식품 발효용 미생물 첨가제 조성물 및 이의 제조방법
KR20150125918A (ko) 동결보호제로서 찹쌀풀을 이용하는 생존율이 증진된 식품 발효용 미생물 첨가제 조성물 및 이의 제조방법
KR20180091603A (ko) 바이오폴리머를 이용한 프로바이오틱스 분말조성물 및 이의 제조방법
KR20190019097A (ko) 바이오폴리머를 이용한 프로바이오틱스 분말조성물 및 이의 제조방법
Kowalska et al. Characterization of Fermented Milks After the Passaging Process of Starter Cultures
Zheng et al. The Effect of Eight Thermal Protectants on the Survival Rate and the Viable Counts of After Heat Treatment in Fermented Goat Milk
Nguyen et al. The Effect of a Glutathione (GSH)-Containing Cryo-Protectant on the Viability of Probiotic Cells Using a Freeze-Drying Process. Fermentation 2023, 9, 187
Tan et al. A comparative analysis of preservation of functional food cultures by freeze-drying, liquid-drying and freezing methods
Mali et al. Microbiological analysis of synbiotic cottage cheese using Lactobacillus acidophilus (LA-5) and Lactobacillus casei (NCDC-298) with pectin
KR20230146838A (ko) 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법