TWI723418B - 針對程式性細胞死亡配體1 ( pd - l 1 ) 的抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及生物醫藥領域。具體而言，本發明揭露針對程式性細胞死亡配體1 (PD-L1)的抗體及其應用，特別是在治療和/或預防PD-L1相關疾病中的應用。

Description

針對程式性細胞死亡配體1　(PD-L1)的抗體及其應用
本發明涉及生物醫藥領域。具體而言，本發明公開針對程式性細胞死亡配體1 (PD-L1)的抗體及其應用，特別是在治療和/或預防PD-L1相關疾病中的應用。
程式性細胞死亡受體1 (PD-1)是CD28受體家族的成員，該家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。該家族的最初成員CD28和ICOS透過添加單株抗體後增強T細胞增殖的功能而發現。已經鑑定了PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體，PD-L1和PD-L2。已經表明它們在與PD-1結合後向下調控T細胞活化和細胞因子分泌。PD-L1 (B7-H1)和PD-L2 (B7-DC)都是可與PD-1結合但是不與其他CD28家族成員結合的B7同源物。
已經在幾種鼠和人類癌症中發現PD-L1的表現，包括人肺癌、卵巢癌、結腸癌、黑色素瘤和各種骨髓瘤。已有結果顯示，腫瘤細胞高表現的PD-L1透過增加T細胞的凋亡從而在腫瘤的免疫逃脫中起著重要的作用。研究者發現，轉染PD-L1基因的P815腫瘤細胞株在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內後具有更強的致瘤性和侵襲性。這些生物學特性均可透過阻斷PD-L1而逆轉。剔除PD-1基因的小鼠，阻斷PD-L1/PD-1途徑，則接種腫瘤細胞不能形成腫瘤。也已經提示PD-L1可能與腸粘膜炎症有關，並且PD-L1的抑制防止了與結腸炎有關的萎縮病。
現有技術中已經開發了一些針對PD-L1的抗體，例如MDX-1105 (WO2007/005874)、Tecentriq (Atezolizumab)等。但是本領域仍亟需能夠與PD-L1高親和力結合，並且能夠阻斷PD-1與PD-L1結合的抗PD-L1抗體。
發明概要
本發明的一方面提供一種針對PD-L1的抗體(PD-L1抗體)或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性識別並結合PD-L1。
在一實施方案中，所述PD-L1抗體包括PD-L1抗體B10、PD-L1抗體B11、PD-L1抗體H12或其組合，特別是PD-L1抗體B11。
在一實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠特異性識別並結合PD-L1，其中親和力為1×10-9 M或更低，優選5×10-10 M或更低，更優選1×10-10 M或更低。
在一方面，本發明提供一種針對PD-L1的抗體B10 (在本文中也稱為PD-L1抗體B10或抗體B10)或其抗原結合片段， 其中所述抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 所述重鏈可變區包含： H CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示胺基酸序列， H CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示胺基酸序列，和 H CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示胺基酸序列； 所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO:5所示胺基酸序列， L CDR2，其包含SEQ ID NO:6所示胺基酸序列，和 L CDR3，其包含SEQ ID NO:7所示胺基酸序列。
在一實施方案中，所述PD-L1抗體B10包含重鏈可變區， 其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:4具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，所述PD-L1抗體B10包含輕鏈可變區， 其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:8具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供一種針對PD-L1的抗體B11 (在本文中也稱為PD-L1抗體B11或抗體B11)或其抗原結合片段， 其中所述抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 所述重鏈可變區包含： H CDR1，其包含SEQ ID NO:9所示胺基酸序列， H CDR2，其包含SEQ ID NO:10所示胺基酸序列，和 H CDR3，其包含SEQ ID NO:11所示胺基酸序列； 所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO:13所示胺基酸序列， L CDR2，其包含SEQ ID NO:14所示胺基酸序列，和 L CDR3，其包含SEQ ID NO:15所示胺基酸序列。
在一實施方案中，所述PD-L1抗體B11包含重鏈可變區， 其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:12所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:12具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，所述PD-L1抗體B11包含輕鏈可變區， 所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:16所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:16具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，所述PD-L1抗體B11包含重鏈， 其中所述重鏈包含SEQ ID NO:28所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:28具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，所述PD-L1抗體B11包含輕鏈， 其中所述輕鏈包含SEQ ID NO:27所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在又一方面，本發明提供一種針對PD-L1的抗體H12 (在本文中也稱為PD-L1抗體H12或抗體H12)或其抗原結合片段， 其中所述抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 所述重鏈可變區包含： H CDR1，其包含SEQ ID NO:17所示胺基酸序列， H CDR2，其包含SEQ ID NO:18所示胺基酸序列，和 H CDR3，其包含SEQ ID NO:19所示胺基酸序列； 所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO:21所示胺基酸序列， L CDR2，其包含SEQ ID NO:22所示胺基酸序列，和 L CDR3，其包含SEQ ID NO:23所示胺基酸序列。
在另一實施方案中，所述PD-L1抗體H12包含重鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:20所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:20具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，所述PD-L1抗體H12包含輕鏈可變區，其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:24所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供一種藥物組成物，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體。在一實施方案中，上述抗體包括PD-L1抗體B10、PD-L1抗體B11、PD-L1抗體H12或其組合，特別是PD-L1抗體B11。
在一方面，本發明提供本發明的抗體或其抗原結合片段或者本發明的藥物組成物在製備用於治療腫瘤性疾病的藥物中的應用。
在另一方面，本發明提供一種治療個體的腫瘤性疾病的方法，其包括向有此需要的個體給藥本發明的抗體或其抗原結合片段或者本發明的藥物組成物。
在又一方面，本發明涉及的本發明的抗體或其抗原結合片段或者本發明的藥物組成物，其用於治療腫瘤性疾病。
在一實施方案中，上述抗體包括PD-L1抗體B10、PD-L1抗體B11、PD-L1抗體H12或其組合，特別是PD-L1抗體B11。
在又一實施方案中，所述腫瘤性疾病為PD-L1陽性腫瘤。在另一實施方案中，所述PD-L1陽性腫瘤為肺癌、卵巢癌、結直腸癌、黑色素瘤和骨髓瘤，特別是結直腸癌或非小細胞肺癌。
在一些實施方案中，上述方法或應用還包括給藥其它抗腫瘤治療手段，例如施用化療劑、標靶其它腫瘤特異性抗原的抗體或放療。
在另一方面，本發明還提供一種分離的核酸分子，其編碼本發明的抗體或其抗原結合片段。在另一方面，本發明還提供一種表現載體，其包含本發明的核酸分子。在另一方面，本發明還提供一種宿主細胞，其由本發明的核酸分子或本發明的表現載體轉化。
定義
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的蛋白質和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養、微生物學、免疫學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
如本文所用，“至少一個(種)”或“一個(種)或多個(種)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8個(種)或更多個(種)。
如本文所用，“抗體”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，無論天然的或者部分或全部合成(例如重組)產生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可變區的保留全長免疫球蛋白的結合特異性能力的任何片段。因此，抗體包括具有與免疫球蛋白抗原結合結構域(抗體結合位址)同源或基本上同源的結合結構域的任何蛋白。抗體涵蓋抗體片段。如本文所用，因此術語抗體包括合成抗體、重組產生的抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人抗體、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、胞內抗體以及抗體片段，例如但不限於Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2 片段、Fv片段、二硫鍵連接的Fv (dsFv)、Fd片段、Fd’片段、單鏈Fv (scFv)、單鏈Fab (scFab)、雙抗體、抗獨特型(抗Id)抗體、或者上述任何抗體的抗原結合片段。本文所提供的抗體包括任何免疫球蛋白類型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類(例如，IgG2a和IgG2b)的成員。在優選的實施方案中，本發明的抗體是人抗體。
如本文所用，抗體的“抗體片段”或“抗原結合片段”指全長抗體的任何部分，其少於全長，但是至少包含結合抗原的所述抗體的部分可變區(例如一個或多個CDR和/或一個或多個抗體結合位址)，並且因此保留結合特異性以及所述全長抗體的至少部分特異性結合能力。因此，抗原結合片段指包含與衍生抗體片段的抗體結合相同抗原的抗原結合部分的抗體片段。抗體片段包括透過酵素催化處理全長抗體所產生的抗體衍生物，以及合成產生的衍生物，例如重組產生的衍生物。抗體包括抗體片段。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2 、單鏈Fv (scFv)、Fv、dsFv、雙抗體、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修飾的片段(參見，例如Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov)。所述片段可以包括連接在一起的多條鏈，例如透過二硫鍵和/或透過肽連接子。抗體片段一般包含至少或約50個胺基酸，並且典型至少或約200個胺基酸。抗原結合片段包括任何抗體片段，其在被插入抗體框架(例如透過置換相應區域)時獲得免疫特異性地結合抗原的抗體。
如本文所用，“常規抗體”指包含兩條重鏈(其可以標示為H和H’)和兩條輕鏈(其可以標示為L和L’)和兩個抗原結合位址的抗體，其中每條重鏈可以是全長免疫球蛋白重鏈或保留抗原結合能力的其任何功能區(例如重鏈包括但不限於VH 鏈、VH -CH 1鏈和VH -CH 1-CH 2-CH 3鏈)，並且每條輕鏈可以是全長輕鏈或任何功能區(例如輕鏈包括但不限於VL 鏈和VL -CL 鏈)。每條重鏈(H和H’)與一條輕鏈(分別為L和L’)配對。
如本文所用，全長抗體是具有兩條全長重鏈(例如VH -CH 1-CH 2-CH 3或VH -CH 1-CH 2-CH 3-CH 4)和兩條全長輕鏈(VL -CL )和樞紐區的抗體，例如透過抗體分泌B細胞天然產生的抗體以及合成產生的具有相同結構域的抗體。
如本文所用，dsFv指具有穩定VH -VL 對的工程化分子間二硫鍵的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全長免疫球蛋白所獲得的抗體片段，或者例如透過重組方法合成產生的具有相同結構的片段。Fab片段包含輕鏈(包含VL 和CL )和另一條鏈，所述另一條鏈包含重鏈的可變結構域(VH )和重鏈的一個恆定區結構域(CH 1)。
如本文所用，F(ab’)2 片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所導致的抗體片段，或者例如透過重組方法合成產生的具有相同結構的片段。F(ab’)2 片段基本上包含兩個Fab片段，其中每個重鏈部分包含額外的幾個胺基酸，包括形成連接兩個片段的二硫鍵的半胱胺酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2 片段的一半(一條重鏈和一條輕鏈)的片段。
如本文所用，scFv片段指包含透過多肽連接子以任何順序共價連接的可變輕鏈(VL )和可變重鏈(VH )的抗體片段。連接子長度使得兩個可變結構域基本不干擾地橋接。示例性連接子是分散有一些Glu或Lys殘基以增加溶解性的(Gly-Ser)n 殘基。
如本文所用，可變結構域或可變區是抗體重鏈或輕鏈的特定Ig結構域，其包含在不同抗體之間變化的胺基酸序列。每條輕鏈和每條重鏈分別具有一個可變區結構域VL 和VH 。可變結構域提供抗原特異性，並且因此負責抗原識別。每個可變區包含CDR和框架區(FR)，CDR是抗原結合位址結構域的部分。
如本文所用，“抗原結合結構域”和“抗原結合位址”同義地用來指識別並與同源(cognate)抗原物理相互作用的抗體內的結構域。天然的常規全長抗體分子具有兩個常規抗原結合位址，每個包含重鏈可變區部分和輕鏈可變區部分。常規抗原結合位址包含連接可變區結構域內反向平行的β鏈的環。抗原結合位址可以包含可變區結構域的其他部分。每個常規抗原結合位址包含3個來自重鏈的高度變異區和3個來自輕鏈的高度變異區。高度變異區也稱為互補決定區(CDR)。
如本文所用，“高度變異區”、“HV”、“互補決定區”和“CDR”和“抗體CDR”可以交換地使用，並且指一起形成抗體的抗原結合位址的每個可變區內的多個部分中的一個。每個可變區結構域包含3個CDR，命名為CDR1、CDR2和CDR3。例如，輕鏈可變區結構域包含3個CDR，命名為L CDR1 (或VL CDR1)、L CDR2 (或VL CDR2)和L CDR3 (或VL CDR3)；重鏈可變區結構域包含3個CDR，命名為H CDR1 (或VH CDR1)、H CDR2 (或VH CDR2)和H CDR3 (或VH CDR3)。可變區中的3個CDR沿線性胺基酸序列是不連續的，但是在折疊的多肽中接近。CDR位於連接可變結構域的β折疊的平行鏈的環內。如本文所述，本領域技術人員知道並且可以基於Kabat或Chothia編號鑑定CDR (參見例如Kabat, E.A.et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 和Chothia, C.et al. (1987)J. Mol. Biol . 196:901-917)。
如本文所用，框架區(FR)是位於β折疊內的抗體可變區結構域內的結構域；在胺基酸序列方面而言，FR區比高度變異區相對更保守。
如本文所用，“恆定區”結構域是抗體重鏈或輕鏈中的結構域，其包含比可變區結構域的胺基酸序列相對更保守的胺基酸序列。在常規全長抗體分子中，每條輕鏈具有單個輕鏈恆定區(CL )結構域，而每條重鏈包含一個或多個重鏈恆定區(CH )結構域，包括CH 1、CH 2、CH 3和CH 4。全長IgA、IgD和IgG同種型包含CH 1、CH 2、CH 3和樞紐區，而IgE和IgM包含CH 1、CH 2、CH 3和CH 4。CH 1和CL 結構域延伸抗體分子的Fab臂，因此有助於與抗原相互作用以及轉動抗體臂。抗體恆定區可以作用於效應子功能，例如但不限於清除該抗體特異性結合的抗原、病原體和毒素，例如透過與各種細胞、生物分子和組織相互作用。
如本文所用，VH 結構域的功能區是保留完整VH 結構域的至少部分結合特異性(例如透過保留完整VH 結構域的一個或多個CDR)的完整VH 結構域的至少一部分，從而所述VH 結構域的功能區單獨地或者與另一抗體結構域(例如VL 結構域)或其區域組合地結合抗原。示例性VH 結構域的功能區是包含VH 結構域的CDR1、CDR2和/或CDR3的區域。
如本文所用，VL 結構域的功能區是保留完整VL 結構域的至少部分結合特異性(例如透過保留完整VL 結構域的一個或多個CDR)的完整VL 結構域的至少一部分，從而所述VL 結構域的功能區單獨地或者與另一抗體結構域(例如VH 結構域)或其區域組合地結合抗原。示例性VL 結構域的功能區是包含VL 結構域的CDR1、CDR2和/或CDR3的區域。
“親和力”或“結合親和力” KD常透過測量平衡締合常數(ka)和平衡解離常數(kd)並計算kd除以ka的商數來確定(KD = kd/ka)。如本文所用，關於抗體或其抗原結合片段的“特異性結合”或“免疫特異性地結合”在本文中可以交換地使用，並且指抗體或抗原結合片段透過抗體和抗原的抗體結合位址之間的非共價相互作用與同源抗原形成一個或多個非共價鍵的能力。所述抗原可以是分離的抗原或存在於例如腫瘤細胞中。
在本發明的一實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段可以以2×10-9 M或更低，1×10-9 M或更低，9×10-10 M或更低，8×10-10 M或更低，7×10-10 M或更低，6×10-10 M或更低，5×10-10 M或更低，4×10-10 M或更低，3×10-10 M或更低，2×10-10 M或更低，1×10-10 M或更低的親和力結合標靶抗原(例如PD-L1，如人PD-L1)。
親和力可以利用常規技術容易地測定，例如透過平衡透析；透過使用BIAcore 2000儀器，利用製造商所列的一般方法；透過利用放射性標記的標靶抗原進行放射免疫測定；或者透過技術人員已知的其他方法。
“分離的蛋白”、“分離的多肽”或“分離的抗體”指所述蛋白、多肽或抗體(1)不與在其天然狀態下伴隨其天然相關成分關聯，(2)不含來自相同物種的其它蛋白，(3)由來自不同物種的細胞表現，或(4)不在天然中存在。因此，經化學合成的多肽或在不同於多肽的天然來源細胞的細胞系統中合成的多肽將會與其天然相關成分“分離”。還可透過分離以使蛋白實質上不含天然相關成分，即使用本領域眾所周知的蛋白純化技術。
在肽或蛋白中，合適的保守胺基酸取代是本領域技術人員已知的，並且一般可以進行而不改變所得分子的生物活性。通常，本領域技術人員認識到多肽的非必需區中的單個胺基酸取代基本上不改變生物活性(參見，例如Watsonet al. ,Molecular Biology of the Gene , 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224)。
如本文所用，術語“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少兩個連接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚體或聚合物，包括通常透過磷酸二酯鍵連接在一起的去氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分離的核酸分子是從存在於核酸分子的天然來源中的其他核酸分子分離的核酸分子。諸如cDNA分子的“分離的”核酸分子可以在透過重組技術製備時基本上不含其他細胞物質或培養基，或者在化學合成時基本上不含化學前驅物或其他化學成分。本文所提供的示例性分離的核酸分子包括編碼所提供的抗體或抗原結合片段的分離的核酸分子。
序列“相同性”具有本領域公認的含義，並且可以利用公開的技術計算兩個核酸或多肽分子或區域之間序列相同性的百分比。可以沿著多核苷酸或多肽的全長或者沿著該分子的區域測量序列相同性。(參見，例如：Computational Molecular Biology , Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing: Informatics and Genome Projects , Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data , Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology , von Heinje, G., Academic Press, 1987; andSequence Analysis Primer , Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)。雖然存在許多測量兩個多核苷酸或多肽之間的相同性的方法，但是術語“相同性”是技術人員公知的(Carrillo, H. & Lipman, D.,SIAM J Applied Math 48 :1073 (1988))。
如本文所用，“表現”指透過多核苷酸的轉錄和轉譯產生多肽的過程。多肽的表現位準可以利用本領域已知的任何方法來評估，包括例如測定從宿主細胞產生的多肽的量的方法。這類方法可以包括但不限於透過ELISA定量細胞溶胞產物中的多肽，凝膠電泳之後考馬斯藍染色，Lowry蛋白測定以及Bradford蛋白測定。
如本文所用，“宿主細胞”是用於接受、保持、複製和擴增載體的細胞。宿主細胞還可以用來表現載體所編碼的多肽。當宿主細胞分裂時，載體中所含的核酸複製，從而擴增核酸。宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。合適的宿主細胞包括但不限於CHO細胞、各種COS細胞、HeLa細胞、HEK細胞例如HEK 293細胞。
如本文所用，“載體”是可複製的核酸，當載體轉化入適當的宿主細胞時，可以從該載體表現一種或多種異源蛋白。關於載體包括那些通常透過限制酶切消化和連接可以將編碼多肽或其片段的核酸引入其中的載體。關於載體還包括那些包含編碼多肽的核酸的載體。載體用來將編碼多肽的核酸引入宿主細胞，用於擴增核酸或者用於表現/展示核酸所編碼的多肽。載體通常保持游離，但是可以設計為使基因或其部分整合入基因組的染色體。還考慮人工染色體的載體，例如酵母人工載體和哺乳動物人工染色體。這類媒介物的選擇和用途是本領域技術人員公知的。
如本文所用，載體還包括“病毒載體”或“病毒的載體”。病毒的載體是工程化的病毒，其可操作地連接至外源基因以將外源基因轉移(作為媒介物或穿梭)入細胞。
如本文所用，“表現載體”包括能夠表現DNA的載體，所述DNA與諸如啟動子區的能夠影響這類DNA片段表現的調控序列可操作地連接。這類額外的片段可以包括啟動子和終止子序列，並且任選地可以包括一個或多個複製起點、一個或多個選擇標記、增強子、多腺苷酸化訊號等。表現載體一般來源於質體或病毒DNA，或者可以包含這兩者的元件。因此，表現載體指重組DNA或RNA建構物，例如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體，當引入適當的宿主細胞時，導致選殖DNA的表現。適當的表現載體是本領域技術人員公知的，並且包括在真核細胞和/或原核細胞中可複製的表現載體以及保持游離的表現載體或者整合入宿主細胞基因組的表現載體。
如本文所用，“治療”患有疾病或疾病狀況的個體表示所述個體的症狀部分或全部緩解，或者在治療後保持不變。因此，治療包括預防、治療和/或治癒。預防指防止潛在疾病和/或防止症狀惡化或疾病發展。治療還包括所提供的任何抗體或其抗原結合片段以及本文所提供的組成物的任何藥學用途。
如本文所用，“療效”表示由個體的治療所導致的效果，其改變、通常改良或改善疾病或疾病狀況的症狀，或者治癒疾病或疾病狀況。
如本文所用，“治療有效量”或“治療有效劑量”指施用於對象之後至少足以產生療效的物質、化合物、材料或包含化合物的組成物的量。因此，其為防止、治癒、改善、阻滯或部分阻滯疾病或病症的症狀所必需的量。同樣，如本文所用，“預防有效量”或“預防有效劑量”指在施用於對象時會具有預期的預防效果的物質、化合物、材料或包含化合物的組成物的量，例如，防止或延遲疾病或症狀的發生或復發，減少疾病或症狀發生或復發的可能性。完全預防有效劑量不必透過施用一個劑量發生，並且可以僅在施用一系列劑量之後發生。因此，預防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，術語“個體”是指哺乳動物，例如人。
本文所用的抗體編號(如B10、B11、H12)僅為區分或標識抗體或產品所用，並不意圖表示這樣的標識是本發明抗體或產品的特徵。本領域技術人員應當理解，例如出於區分或標識的目的，其他抗體或產品同樣也有可能使用這樣的標識，但並非是指相同或等同的抗體或產品。類似地，實施例中所用的類似編號或標識也僅僅是用於示例方便，本發明的抗體或產品由所附申請專利範圍中所描述的特徵限定。
本發明的抗體
本發明提供一種針對PD-L1的抗體(PD-L1抗體)或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性識別並結合PD-L1。
在一實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠特異性識別並結合PD-L1，其中親和力(KD)為1×10-9 M或更低，優選5×10-10 M或更低，更優選1×10-10 M或更低。
在另一實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段具有下述特徵中的至少一個： 1)阻斷PD-L1與PD-1的相互作用；2)阻斷PD-L1與CD80的相互作用；3)活化T細胞；4)抑制腫瘤生長。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合PD-L1 (如人PD-L1)並阻斷其與PD-1的相互作用。
在另一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合PD-L1 (如人PD-L1)並阻斷其與CD80的相互作用。
在一些實施方案中，所針對的腫瘤包括但不限於下文關於腫瘤性疾病所描述的那些。在另一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠抑制腫瘤生長至少約10%，優選至少約20%，更優選至少約30%，更優選至少約40%，更優選至少約50%，更優選至少約60%，更優選至少約70%，更優選至少約80%。
在一實施方案中，所述PD-L1抗體包括PD-L1抗體B10、PD-L1抗體B11、PD-L1抗體H12或其組合，特別是PD-L1抗體B11。
抗體 B10
在一方面，本發明提供一種針對PD-L1的抗體B10或其抗原結合片段， 其中所述抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 所述重鏈可變區包含： H CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示胺基酸序列， H CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示胺基酸序列，和 H CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示胺基酸序列； 所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO:5所示胺基酸序列， L CDR2，其包含SEQ ID NO:6所示胺基酸序列，和 L CDR3，其包含SEQ ID NO:7所示胺基酸序列。
在另一實施方案中，PD-L1抗體B10包含重鏈可變區(VH)， 其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:4具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，PD-L1抗體B10包含輕鏈可變區(VL)， 其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:8具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在又一實施方案中，PD-L1抗體B10包含重鏈恆定區(CH)， 其中所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO:26所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在又一實施方案中，PD-L1抗體B10包含輕鏈恆定區(CL)， 其中所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:25所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
抗體 B11
在另一方面，本發明提供一種針對PD-L1的抗體B11或其抗原結合片段， 其中所述抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 所述重鏈可變區包含： H CDR1，其包含SEQ ID NO:9所示胺基酸序列， H CDR2，其包含SEQ ID NO:10所示胺基酸序列，和 H CDR3，其包含SEQ ID NO:11所示胺基酸序列； 所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO:13所示胺基酸序列， L CDR2，其包含SEQ ID NO:14所示胺基酸序列，和 L CDR3，其包含SEQ ID NO:15所示胺基酸序列。
在一實施方案中，PD-L1抗體B11包含重鏈可變區(VH)， 其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:12所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:12具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在一實施方案中，PD-L1抗體B11包含輕鏈可變區(VL)， 所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:16所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:16具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在優選的實施方案中，PD-L1抗體B11包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)， 其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:12所示胺基酸序列， 所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:16所示胺基酸序列。
在又一實施方案中，PD-L1抗體B11包含重鏈恆定區(CH)， 其中所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO:26所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在又一實施方案中，PD-L1抗體B11包含輕鏈恆定區(CL)， 其中所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:25所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一具體實施方案中，PD-L1抗體B11包含重鏈， 其中所述重鏈包含SEQ ID NO:28所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:28具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一具體實施方案中，PD-L1抗體B11包含輕鏈， 所述輕鏈包含SEQ ID NO:27所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在特別優選的實施方案中，PD-L1抗體B11包含重鏈和輕鏈， 其中所述重鏈包含SEQ ID NO:28所示胺基酸序列， 所述輕鏈包含SEQ ID NO:27所示胺基酸序列。
抗體 H12
在又一方面，本發明提供一種針對PD-L1的抗體H12或其抗原結合片段， 其中所述抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 所述重鏈可變區包含： H CDR1，其包含SEQ ID NO:17所示胺基酸序列， H CDR2，其包含SEQ ID NO:18所示胺基酸序列，和 H CDR3，其包含SEQ ID NO:19所示胺基酸序列； 所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO:21所示胺基酸序列， L CDR2，其包含SEQ ID NO:22所示胺基酸序列，和 L CDR3，其包含SEQ ID NO:23所示胺基酸序列。
在另一實施方案中，PD-L1抗體H12包含重鏈可變區， 其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:20所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:20具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在另一實施方案中，PD-L1抗體H12包含輕鏈可變區， 其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:24所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在又一實施方案中，PD-L1抗體B11包含重鏈恆定區(CH)， 其中所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO:26所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
在又一實施方案中，PD-L1抗體B11包含輕鏈恆定區(CL)， 其中所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:25所示胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的胺基酸序列。
腫瘤性疾病
本發明的抗體對PD-L1的阻斷可以增強患者中對癌細胞的免疫反應。PD-L1富含於多種人類癌症中。PD-1與PD-L1的相互作用導致浸潤腫瘤的淋巴細胞減少，T細胞受體媒介的增殖減少，以及癌細胞的免疫逃脫。抑制PD-L1與PD-1的相互作用可以逆轉免疫抑制。
本發明的抗體或其抗原結合片段可以用於治療腫瘤性疾病。可以使用本發明的抗體或其抗原結合片段進行預防和/或治療的優選的腫瘤性疾病(或癌症)包括一般對免疫治療有反應的癌症。可治療的癌症的非限制性的實例包括但不限於肺癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、子宮頸癌、子宮體瘤和骨肉瘤。其他癌症的實例包括但不限於骨癌、胰腺癌、皮膚癌、前列腺癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、肛門癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管新生、脊髓腫瘤、腦幹神經膠質瘤、腦下垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮狀癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌症，包括石棉誘發的癌症，以及所述癌症的組合。本發明的抗體也可用於治療轉移性癌，特別是表現PD-L1的轉移性癌。在又一實施方案中，所述腫瘤性疾病(或癌症)為肺癌、卵巢癌、結直腸癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、子宮頸癌、子宮體癌或骨肉瘤，特別是結直腸癌或非小細胞肺癌。在一實施方案中，所述腫瘤性疾病為PD-L1陽性腫瘤。
在一優選實施方案中，抗體包括PD-L1抗體B10、PD-L1抗體B11、PD-L1抗體H12或其組合，特別是PD-L1抗體B11。
核酸、載體和抗體產生方法
在另一方面，本發明提供分離的核酸分子，其編碼前述本發明的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列可以針對用於表現的宿主細胞進行密碼子最佳化。本發明還提供一種表現載體，其包含至少一種前述本發明的核酸分子。
本發明的一方面還提供一種宿主細胞，其由至少一種前述本發明的核酸分子或表現載體轉化。
本發明的又一方面還涉及一種生產針對PD-L1的抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括：(i)在適合核酸分子或表現載體表現的情況下培養本發明的宿主細胞，和(ii)分離並純化由所述核酸分子或表現載體表現的抗體或其抗原結合片段。
藥物組成物
本發明還提供一種藥物組成物，其包含本發明的抗體以及藥學上可接受的載體。在一實施方案中，上述抗體包括PD-L1抗體B10、PD-L1抗體B11、PD-L1抗體H12或其組合，特別是PD-L1抗體B11。
本文使用的“藥學上可接受的載體”包括生理學相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優選地，該載體適合於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(如透過注射或輸液)。根據施用途徑，可將活性化合物即抗體分子、免疫綴合物包裹於一種材料中，以保護該化合物免受可使該化合物去活化的酸和其他天然條件的作用。
本發明的藥物組成物也可含有藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的例子包括：(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
這些組成物還可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。
可以透過滅菌程序或透過包含諸如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等各種抗細菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。在很多情況下，組成物中優選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。透過在組成物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實現注射型藥物延長的吸收。
藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用於臨時製備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用於藥學活性物質的介質和試劑的使用是本領域公知的。常規介質或試劑，除了任何與活性化合物不相容的範圍外，都可能在本發明的藥物組成物中。還可以向組成物中摻入補充的活性化合物。
治療性組成物一般必須是無菌的並且在製備和貯存條件下穩定的。可以將組成物配製成溶液、微乳狀液、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，透過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下透過保持所需的顆粒大小，以及透過使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。
透過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，並且根據需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可製備無菌注射液。通常，透過將活性化合物摻入到含有基本分散介質和上面所列其他所需成分的無菌載體中製備分散劑。對於用於製備無菌注射液的無菌粉末劑，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，由其預先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。
可以與載體材料組合製備單一劑量形式的活性成分的量根據所治療的對象和特定給藥方式而不同。可以與載體材料組合製備單一劑量形式的活性成分的量一般是產生治療效果的組成物的量。通常，以100%計，這個量的範圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優選大約0.1%至大約70%，最優選大約1%至大約30%的活性成分，與藥學上可接受的載體相組合。
可以調節劑量方案以提供最佳的期望的反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單一注射，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組成物配製成容易給藥並且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用於所治療的對象的物理不連續單位；每個單位含有預定量的活性化合物，經計算該預定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產生所需的治療效果。對本發明劑量單位形式的具體說明限定於且直接依賴於(a)活性化合物的獨特特性和要達到的特定治療效果，和(b)本領域中固有的對於配製這種用於治療個體敏感性的活性化合物的限制。
對於抗體分子的給藥而言，劑量範圍為約0.0001至100 mg/kg，更通常為0.01至20 mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重，10 mg/kg體重或20 mg/kg體重，或在1-20 mg/kg範圍內。示例性的治療方案需要每週給藥一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次、每3-6個月一次、或起始給藥間隔略短後期給藥間隔加長。在一實施方案中，所用的劑量可以是每三周給藥1200 mg。給藥方式可以是靜脈滴注。
或者，針對腫瘤的抗體分子也可以作為持續釋放製劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據抗體分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現出最長的半衰期，之後是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據處理是預防性的還是治療性的而不同。在預防性應用中，在長時間內以較不頻繁的間隔給予相對較低的劑量。有些患者在餘生中持續接受處理。在治療性應用中，有時需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進展減輕或停止，優選直到患者表現為疾病症狀部分或完全改善。之後，可以以預防性方案給患者給藥。
藥物組成物中活性成分的實際劑量位準可能改變，以獲得可有效實現對特定患者、組成物和給藥方式的所需治療反應，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量位準取決於多種藥物代謝動力學因素，包括應用的本發明特定組成物的活性，給藥途徑，給藥時間，應用的特定化合物的排泄速率，治療的持續時間，與應用的特定組成物聯合應用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、整體健康情況和病史，以及醫學領域中公知的類似因素。
“有效量”的本發明的抗體或其抗原結合片段優選地導致疾病症狀的嚴重性降低，疾病無症狀期的頻率和持續時間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對於腫瘤的治療，相對於未接受治療的對象，“有效量”的本發明的抗體或其抗原結合片段優選地將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約10%，優選至少約20%，更優選至少約30%，更優選至少約40%，更優選至少約50%，更優選至少約60%，更優選至少約70%，更優選至少約80%。抑制腫瘤生長的能力可以在預測對人類腫瘤的療效的動物模型系統中評估。或者，也可以透過檢查抑制細胞生長的能力來評估，這種抑制可以透過本領域技術人員公知的試驗在體外測定。有效量的本發明的抗體或其抗原結合片段能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解對象的症狀如預防和/或治療轉移或復發。本領域技術人員可以根據如下因素確定這種量，如對象的大小、對象症狀的嚴重性和選擇的特定組成物或給藥途徑。
本發明的抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組成物可以利用本領域公知的一種或多種方法透過一種或多種給藥途徑給藥。本領域技術人員應當理解，給藥途徑和/或方式根據期望的結果而不同。本發明的抗體優選給藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊髓或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸液。本文使用的術語“腸胃外給藥”是指除腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊髓內、硬膜外和胸骨內注射和輸液。
或者，本發明的抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組成物也可以透過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內、經口、陰道、直腸、舌下或局部。
活性化合物可以與保護化合物不被快速釋放的載體一起製備，例如控釋製劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。製備這樣的製劑的很多方法受專利保護或者通常為本領域技術人員所公知。
藥物組成物中本發明的抗體或其抗原結合片段還可以與諸如細胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白等治療性部分綴合。
細胞毒素包括對細胞有害(例如殺傷細胞)的任何試劑。實例包括但不限於：紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依妥普賽、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝黴素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素和它們的類似物或同系物。
可用於綴合的治療劑還包括，例如：抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑黴素、絲裂黴素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴黴素類(例如，柔紅黴素(以前稱為道諾黴素)和阿黴素)，抗生素(例如，放線菌素D (以前稱為放線菌素)、博來黴素、光輝黴素和阿莫西林/克拉維酸(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼和長春鹼)。
能與本發明的抗體綴合的治療性細胞毒素的其他優選例子包括倍癌黴素、環孢黴素、美坦生、阿里他汀、和它們的衍生物。
可以利用本領域使用的連接子技術將細胞毒素與本發明的抗體綴合。已經用於將細胞毒素與抗體綴合的連接子類型的實例包括但不限於腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接子。可以選擇，例如，在溶酶體區室內易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接子，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優先表現的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。
本發明的抗體也可以與放射性同位素綴合，產生細胞毒性放射性藥物，也被稱作放射性抗體綴合物。能夠與診斷或治療性使用的抗體綴合的放射性同位素的例子包括但不限於碘131、銦111、釔90和鎦177。製備放射性抗體綴合物的方法在本領域是公知的。
本發明的抗體也可以與具有需要的生物活性的蛋白綴合，可用於修飾特定的生物學反應。這樣的生物活性蛋白包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物學反應調節物，如淋巴因子、介白素-1 (“IL-1”)、介白素-2 (“IL-2”)、介白素-6 (“IL-6”)、介白素-10 (“IL-10”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫因子如IFN等。
聯合治療
本發明的抗體或藥物組成物可以與化療劑或標靶其他腫瘤抗原的抗體聯合施用。本發明的抗體和所述化療劑或標靶其他腫瘤抗原的抗體可以全部在一次施用或分開施用。當分開施用時(採用互相不同的施用方案的情況下)，它們可以連續施用而不中斷或以預定的間隔施用。本發明的抗體或本發明的藥物組成物還可以與放療聯合，例如包括向患者施用電離輻射，其早於、在其過程中和/或晚於本發明的抗體或藥物組成物的施用過程。
試劑盒
本發明的範圍內還包括試劑盒，該試劑盒包括本發明的抗體或其抗原結合片段，以及使用說明。試劑盒一般包括表明試劑盒內容物的預期用途和/或使用方法的標籤。術語標籤包括在試劑盒上或與試劑盒一起提供的或以其他方式隨試劑盒提供的任何書面的或記錄的材料。
有益效果
本發明的抗體對標靶抗原具有非常強的親和力，活化T細胞，能夠表現出優異的(體內)抗腫瘤活性，優異的穩定性、更低的副作用，並且效果優於現有技術。實施例
透過參考在此給出的一些具體實施例可獲得對本發明的進一步的理解，這些實施例僅用於說明本發明，其無意於對本發明的範圍做出任何限制。顯然，可以對本發明作出多種改動和變化而不脫離本發明的實質，因此，這些改動和變化同樣在本申請要求保護的範圍內。本文中所用的比例包括百分比，如果沒有特別指出，都按重量計。
實施例部分中所用的試劑和儀器都是可商購的。Tecentriq可以獲得自羅氏公司。實施例 1 抗體篩選
收集106名成年健康人(男女各半)周邊血液，利用淋巴細胞分離液分離PBMC (周邊血液單核細胞)細胞，共收集2×109 個細胞。Trizol法萃取總RNA，將其反轉錄為cDNA。參考《重組抗體》(科學出版社，2005年)中的方法，常規PCR方法擴增不同抗體亞型的可變區基因，常規分子生物學技術將抗體可變區基因選殖入同樣酶切處理的pDF載體中，電穿孔轉化大腸桿菌XL1-Blue (Agilent Technology)。經SB培養液擴大培養後，加1×1013 pfu輔助病毒VCSM13 (BioVector NTCC Inc.)感染，獲得初級噬菌體抗體庫，按比例(感染複數MOI > 200)混合初級抗體庫和BS1365菌，建構大容量抗體庫。
用5%脫脂奶粉封阻重組PD-L1 (R&D公司產品)塗覆的免疫試管(Maxisorp免疫試管，Thermo Nunc)後，加入上述噬菌體抗體庫，37℃下培育2h；棄去未結合的噬菌體，TBS-T洗液洗滌5遍，充分洗去非特異吸附噬菌體；加入1 mL洗脫緩衝液(0.1 mol/L甘胺酸-HCl，pH 2.2)洗脫噬菌體並以40 μL 2 mol/L Tris溶液中和；加入對數期XL1-Blue菌(Agilent Technology)、SB培養基(SB培養液：胰蛋白腖30g，酵母萃取物20 g，MOPS 10 g，溶於950 mL去離子水中，氫氧化鈉調pH值至7.0，定容至1L，高壓滅菌)及輔助噬菌體VCSM13進行擴增富集；重複該過程3-4輪，將洗脫下來的噬菌體感染新鮮製備的對數期XL1-Blue菌塗培養盤，在37℃下過夜培養後，獲得單株(具體方法和試劑可以參考：《Phage Display》，Humana Press)。
將重組PD-L1與96井培養盤在4℃下恆溫培育16小時，然後用BSA溶液阻斷非特異性結合。從篩選後有明顯富集的噬菌體庫中挑選大約1000個(12個96井培養盤)單個噬菌體選殖在補充了羧苄青黴素及氨苄西林的2YT液體培養基500 μL中培養24小時，與重組PD-L1溶液恆溫培育2小時，將混合液加入用上述重組PD-L1偶聯的96井培養盤並恆溫培育15分鐘。PBST清洗後與HRP偶聯的抗噬菌體抗體(anti-M13 HRP)恆溫培育，最終加基質顯色以測定結合在96井培養盤的噬菌體量。因溶液中的PD-L1與親和力較高的噬菌體結合緊密，競爭性抑制了噬菌體與96井培養盤上偶聯的PD-L1結合，所以在ELISA中呈現較低OD讀數。利用此實驗初步選出12個親和力相對較高並有特異序列的候選抗體進行進一步檢測篩選。
將重組PD-L1與96井培養盤在4℃下恆溫培育16小時，然後用BSA溶液阻斷非特異性結合。從前述競爭ELISA中篩選出的噬菌體株與不同濃度的重組PD-L1溶液(0.03 nM-90 nM)恆溫培育2小時，將混合液加入上述重組PD-L1偶聯的96井培養盤恆溫培育15分鐘。PBST清洗後與HRP偶聯的抗噬菌體抗體(anti-M13 HRP)恆溫培育，最終加基質顯色以測定結合在96井培養盤的噬菌體量。然後根據ELISA中OD讀數用GraphPad Prism做結合曲線。結果參見圖1 (其中WT為陽性對照，為與Tecentriq序列相同的抗體)。
對親和力最高的3株候選抗體(HZPDL1- B10、HZPDL1- B11、HZPDL1- H12 (下文和附圖中為了方便，使用其各自的簡寫B10、B11、H12進行表示)進行序列分析。
序列如下：
B10選殖株的HCDR1序列為SEQ ID NO:1、HCDR2序列為SEQ ID NO:2、HCDR3序列為SEQ ID NO:3，VH的序列為SEQ ID NO:4；LCDR1序列為SEQ ID NO:5、LCDR2序列為SEQ ID NO:6、L CDR3序列為SEQ ID NO:7，VL的序列為SEQ ID NO:8。
B11選殖株的HCDR1序列為SEQ ID NO:9、HCDR2序列為SEQ ID NO:10、HCDR3序列為SEQ ID NO:11，VH的序列為SEQ ID NO:12；LCDR1序列為SEQ ID NO:13、L CDR2序列為SEQ ID NO:14、L CDR3序列為SEQ ID NO:15，VL的序列為SEQ ID NO:16。
H12選殖株的HCDR1序列為SEQ ID NO:17、HCDR2序列為SEQ ID NO:18、HCDR3序列為SEQ ID NO:19，VH的序列為SEQ ID NO:20；LCDR1序列為SEQ ID NO:21、L CDR2序列為SEQ ID NO:22、L CDR3序列為SEQ ID NO:23，VL的序列為SEQ ID NO:24。實施例 2 抗體表現
將獲得的B10、B11、H12選殖株可變區基因與人IgG恆定區基因(輕鏈恆定區序列為SEQ ID NO:25；重鏈恆定區序列為SEQ ID NO:26)融合後選殖入表現載體pCDNA3.4 (Thermo Fisher)。將獲得的真核表現載體，再瞬間轉染到Expi-CHO細胞(Thermo Fisher)中。經過8天左右的無血清細胞培養，收集培養上清液經過ELISA試驗(利用羊抗人IgG以及辣根過氧化酵素標記的羊抗人IgG進行雙夾心ELISA法檢測上清液中抗體的含量)，檢測培養上清液中抗體表現量，含有候選抗體的培養上清液用蛋白質A介質進行純化，獲得目標抗體。實施例 3 抗體特異性識別活性分析
在本實施例中，用ELISA測定候選抗體與人源、猴源、鼠源PD-L1的結合。
將人源、猴源、鼠源PD-L1 (R&D公司)用PBS稀釋到5 μg/ml並塗覆96井培養盤。在4℃下培育過夜後，次日棄去塗覆液，並用PBST洗滌。然後每井加入200 μl BSA封阻液，在室溫下培育1 h。用PBST洗滌三遍，將候選抗體和陽性對照抗體(WT，陽性對照，為與Tecentriq序列相同的抗體)用PBS稀釋，最高濃度為1 nM，進行2倍梯度稀釋，做11個濃度梯度。然後每井加入100 μl抗體，在室溫下培育2 h。用PBST洗滌三遍，然後加入抗人Fc-HRP抗體(義翹神州)，在室溫下培育1 h。最後每井用PBST洗滌四次，加入TMB顯色液(北京天根生化科技有限公司)，室溫顯色。終止顯色後用分光光度計600 nm測定OD值。ELISA結果如圖2所示(A、B、C分別為人源、猴源、鼠源，其中EC50 單位為pM)，候選抗體B10、B11和H12可以很好的結合人源、猴源和鼠源PD-L1蛋白。實施例 4 抗體親和力分析
在本實施例中，用BIAcore測定抗體親和力。本實驗中使用人源抗體捕獲試劑盒(GE，BR100839)透過胺基偶聯抗人源IgG抗體至S系列CM5感測晶片(GE，BR100530)之後再結合配體和分析物。用HBS-EP+Buffer稀釋捕獲重組抗體PD-L1人源抗體，選殖B10、B11、H12作為配體。將重組帶His標籤的PD-L1用HBS-EP+Buffer稀釋至8 μg/ml、4 μg/ml、1.6 μg/ml、0.64 μg/ml、0.256 μg/ml和0.102 μg/ml，作為分析物。在Biacore Wizard模式下，以多循環方式，進行親和力分析實驗。每個樣品的測試包括3個Start up、1個零濃度對照、6個梯度濃度樣品和1個重複濃度樣品，每個循環結束之後用10 mM Glycine HCl PH2.1再生液使晶片再生。分析物的每個濃度循環設置捕獲時間180 s，配體溶液流速10 μl/min；配體與分析物結合時間180 s，分析物溶液流速30 μl/min；解離時間2400 s。將原始資料導入分析軟體，扣除零濃度對照，並且扣除參考通道以消除容積效應，用Kinetics分析方法中的1:1 binding模式擬合圖形，根據結合曲線由分析軟體迴歸計算出抗原抗體的親和力資料。實驗結果表明候選抗體B10、B11、H12均可高親和力識別標靶抗原(表1)。 表1
Figure 108119664-A0304-0001
 實施例 5 T 細胞活化
在本實施例中，利用混合淋巴細胞反應實驗(MLR)測試候選PD-L1抗體的T細胞活化能力。用人周邊血液淋巴細胞分離液(Ficoll)，從肝素化的健康新鮮人血液中分離出PBMC，然後使用人單核細胞分離試劑盒II (Miltenyi)從PBMC中分離出單核細胞。將單核細胞以每井2.5×104 個的密度鋪入96井培養盤，並加入25 ng/ml GM-CSF (義翹神州)和50 ng/ml的IL-4 (義翹神州)在37℃下培養並每隔3天更換新鮮培養基。經過7天培養，單核細胞分化成為樹突狀細胞。在樹突狀細胞分化成熟的第7天，用CD4+T細胞分離試劑盒(Miltenyi)，從來自另一健康人的PBMC中分離出CD4+T細胞。然後將2×105 /井的CD4+T細胞與樹突狀細胞在含有不同濃度抗體的RPMI培養基(Invitrogen)中共同培養。5天後，使用IFNγ ELISA試劑盒(R&D)和IL-2 ELISA試劑盒(eBioscience)檢測培養上清液中被活化的T細胞分泌的IFNγ和IL-2的含量。
結果如圖3所示(陽性抗體為與Tecentriq序列相同的抗體，對照抗體為同型IgG對照，人IgG1)。抗體B10、B11、H12均可活化T細胞，提高IFNγ和IL-2表現位準。實施例 6 抗體阻斷 PD-1 與 PD-L1 相互作用
將B11選殖株可變區基因與人IgG恆定區基因(輕鏈恆定區序列為SEQ ID NO:25；重鏈恆定區序列為SEQ ID NO:26)融合表現獲得全抗體分子，其輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:27；重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:28，分析其生物學活性。
分析抗體阻斷PD-1與PD-L1相互作用的活性。將hPD-L1-Fc蛋白(R&D)稀釋於塗覆緩衝液中，塗覆濃度為1 μg/mL，然後以100 μl/井的量加入到塗覆盤井中，4℃塗覆過夜；洗滌液(PBST)重複洗盤3遍，用2%牛血清白蛋白以100 μL/井加入相應的井中，37℃封阻2 h。B11最高濃度為10 μg/mL，將其以2.5倍稀釋，共設立10個濃度，用稀釋液(1% BSA)稀釋Biotin標記的PD-1 (hPD-1-Fc-Biotin)(R&D)至0.25 μg/mL，將該溶液分別與梯度稀釋的B11以1:1混合。將該混合液加入封阻後的ELISA反應井中，每井180 μL，每個樣品濃度設3個平行複井，蓋好封盤膜，在37℃下水平放置2 h。用洗滌液重複洗盤3遍，加入HRP標記的鏈親和素(上海碧雲天生物)，在37℃下水平放置1 h。洗滌液重複洗盤3遍，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴；每井加入100 μL TMB (北京天根生化)，室溫避光放置45 min；每井加入100 μL 1M H2 SO4 終止液終止基質反應，分光光度計450 nm處讀取OD值。
結果顯示B11抗體能夠阻斷hPD-L1與hPD-1結合，並呈劑量依賴性；如圖4所示。實施例 7 抗體阻斷 CD80 與 PD-L1 相互作用
將hPD-L1-Fc蛋白稀釋於塗覆緩衝液中，塗覆濃度為1 μg/mL，然後以100 μl/井的量加入到塗覆盤井中，在4℃下塗覆過夜；洗滌液(PBST)重複洗盤3遍，用2%牛血清白蛋白以100 μL/井加入相應的井中，在37℃下封阻2 h。B11最高濃度為10 μg/mL，以2.5倍稀釋，共設立10個濃度，用稀釋液(1%BSA)稀釋Biotin標記的CD80 (CD80-Biotin)(R&D)至0.25 μg/mL，以該溶液分別與梯度稀釋的B11抗體以1:1混合；將該混合液加入封阻後的ELISA反應井中，每井180 μL，每個樣品濃度設3個平行複井，蓋好封盤膜，在37℃下水平放置2 h。洗滌液重複洗盤3遍，加入HRP標記的鏈親和素(上海碧雲天生物)，在37℃下水平放置1 h。洗滌液重複洗盤3遍，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴；每井加入100 μL TMB，室溫避光放置45 min；每井加入100 μL 1M H2 SO4 終止液終止基質反應，分光光度計450 nm處讀取OD值。分析抗體阻斷CD80與PD-L1相互作用的活性。結果如圖5所示。B11抗體能夠阻斷CD80 (CD80-Biotin)與PD-L1的相互作用，並呈劑量依賴性。實施例 8 抗體的細胞生物學活性
取對數生長期的CHO/PD-L1細胞(Promega公司)用實驗培養基(2% FBS)調整細胞密度為5.0×105 個/mL，以80 μL/井接種於白色不透明96井細胞培養盤，放入二氧化碳培養箱培養16～18 h。
實驗組：用RPMI 1640培養基(含2%胎牛血清，均獲得自Gibco)將B11稀釋至6.4 μg/mL，以2.5倍梯度稀釋，共獲得9個濃度點，每個樣品濃度設3個平行複井，以40 μL/井加入已接種CHO/PD-L1細胞的培養盤。空白對照組：將40 μL/井的實驗培養基加入已接種CHO/PD-L1細胞的培養盤。將Jurkat/PD-1 (Promega公司)細胞密度調整到1.0×106 ～1.25×106 個/mL，並以40 μL/井加入實驗組和空白對照組中，將培養盤置於培養箱中培養5.5～6.5 h。每井加入80 μL的螢光素酶基質溶液(Promega)，在室溫下避光反應5～30 min。透過分光光度計以化學發光模式讀取相對光單位(relative light units，RLU)，應用系統內建分析軟體進行資料分析，以抗體濃度的對數為橫坐標，對應的訊號誘導倍數(計算公式為：實驗井RLU/空白對照RLU)為縱坐標，擬合四參數方程曲線。
結果顯示，B11抗體有細胞生物學活性，且呈劑量依賴性。結果如圖6所示。實施例 9 抗體的體內抑制結直腸癌的活性
在本實施例中，利用MC38-hPD-L1結腸癌細胞移植人源化B-hPD-1小鼠皮下建立的荷瘤模型評估B11抗體的體內抑制腫瘤活性。
將MC38-hPD-L1結腸癌細胞(中美冠科)以5×105 個/0.1 mL接種於雌性B-hPD-1人源化小鼠(中美冠科)右側前脅肋部皮下，待腫瘤生長到約160 mm3 時按腫瘤體積隨機分組(每組10隻，共5組)，分別為：溶劑對照、Tecentriq (10 mg/kg, Q2D×8)、B11 (10 mg/kg, Q2D×8)、B11 (3 mg/kg, Q2D×8)、B11 (1 mg/kg, Q2D×8)。給藥途徑為腹腔注射，分組給藥第22天後結束實驗。每週測量腫瘤體積及體重2次，記錄小鼠體重和腫瘤體積。
結果顯示，實驗過程中，動物健康狀態良好，小鼠對各治療抗體耐受性良好。抑瘤結果如圖7及表2所示。在實驗終點(即分組給藥第21天)時，溶劑對照組平均腫瘤體積為1917±264mm3 。B11組在10 mg/kg、3 mg/kg、1 mg/kg劑量位準下的平均腫瘤體積分別為232±76mm3 、235±71mm3 和999±306mm3 ，抑瘤率分別為96.0%、95.9%和52.3%，瘤重抑制率為92.4%、91.9%和60.2%。陽性對照藥Tecentriq (羅氏公司)在10 mg/kg劑量位準下的平均腫瘤體積為323±146mm3 ，抑瘤率為90.8%，瘤重抑制率為91.1%。Tecentriq和B11與溶劑對照組相比，腫瘤體積均有顯著性差異(P>0.05)，表明B11有明顯的腫瘤抑制作用。
抗PD-L1抗體B11在3 mg/kg劑量下，活性與10 mg/kg對照藥Tecentriq藥效相當，表明抗PD-L1抗體B11具有優於Tecentriq的抑制腫瘤活性。 表2. 受試品對MC38-hPD-L1結腸癌移植B-hPD-1人源化小鼠腫瘤重量的抑瘤作用
Figure 108119664-A0304-0002
 註：a：平均值±標準誤差；b：給藥組瘤重與溶劑對照組瘤重在分組給藥22天後統計學比較，t-test分析。實施例 10 抗體體內抑制非小細胞肺癌的活性
在本實施例中，利用人源HCC827非小細胞肺癌異種移植NCG小鼠(中美冠科生物技術有限公司)建立荷瘤模型，評估B11抗體體內抑制腫瘤活性。
收取對數生長期的HCC827細胞(中美冠科生物技術有限公司)，以5×106 /小鼠的劑量於第0天(Day 0)在右側背部皮下接種NCG小鼠，接種腫瘤細胞後5天(Day 5)，選擇腫瘤體積適中的小鼠均勻分成5組，每組12隻小鼠；腹腔移植PBMC (1×108 /mL)，每組12隻小鼠中有6隻小鼠接種來自捐贈者#86的PBMC、另外6隻小鼠接種來自捐贈者#119的PBMC，細胞重新懸浮在PBS中(0.1 ml接種體積)。試驗組為B11 15 mg/kg，B11 5 mg/kg和B11 1.5 mg/kg組、陽性對照Tecentriq 15 mg/kg組及陰性對照(Human IgG1) 15 mg/kg組。腹腔注射給藥，分別於接種腫瘤細胞後第5、8、12、15、19、22天給藥，共給藥六次。根據相對腫瘤抑制率(TGIRTV)進行療效評估，根據動物體重變化和死亡情況進行安全性評估。
結果顯示，各治療組在腫瘤接種23天內均未發生藥物治療相關的毒性反應，荷瘤小鼠對受試抗體在測試劑量下耐受良好。
抑瘤結果如圖8所示，B11 (15 mg/kg)治療組在接種腫瘤細胞後第12、15天時表現顯著的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGIRTV (%)分別為31%、34%，相對於對照組在統計學上有顯著性差異(p值分別為0.018、0.016)。
B11 (5 mg/kg)治療組在移植了PBMC的治療組中接種腫瘤細胞後第12、15、20天時表現顯著的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGIRTV (%)分別為44%、43%、28%，相對於對照組在統計學上有顯著性差異(p值分別為0.001、0.006、0.046)。
B11 (1.5 mg/kg)治療組在接種腫瘤細胞後第12、15、18、20、22天時表現顯著的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGIRTV(%)分別為35%、30%、39%、38%、49%，相對於對照組在統計學上有顯著性差異(p值分別為0.013、0.031、0.005、0.003、0.002)。
陽性藥Tecentriq (15mg/kg)在接種腫瘤細胞後第12天時表現較小的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGIRTV (%)為23%，相對於對照組在統計學上無顯著性差異(p值0.084)。
以上結果表明，抗體B11具有優異的抗腫瘤活性，且活性優於Tecentriq。序列表 B10
Figure AA1
 B11
Figure AA2
 H12
Figure AA3
Figure AA4
Figure AA5
本領域技術人員會清楚，可以進行本發明的許多修改和變化而不背離其精神和範圍。本文所述的具體實施方案僅透過實例的方式提供，並不意味著以任何方式限制。本發明的真正範圍和精神透過所附申請專利範圍示出，說明書和實施例僅是示例性的。
圖1：候選抗體的結合曲線。
圖2：抗體B10、B11和H12的ELISA結果。
圖3：抗體B10、B11、H12活化T細胞，提高IFNγ和IL-2表現位準的結果。
圖4：抗體B11阻斷hPD-L1與hPD-1結合的結果。
圖5：抗體B11阻斷CD80與PD-L1相互作用的結果。
圖6：抗體B11的細胞生物學活性的結果。
圖7：抗體B11抑制腫瘤生長的結果。
圖8：抗體B11抑制腫瘤活性的結果。

Claims (24)

  1. 一種針對PD-L1的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段特異性識別並結合PD-L1，其中所述抗體選自：抗體B10，其中所述B10抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含：H CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列，H CDR2，其包含SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，和H CDR3，其包含SEQ ID NO：3所示胺基酸序列；所述輕鏈可變區包含：L CDR1，其包含SEQ ID NO：5所示胺基酸序列，L CDR2，其包含SEQ ID NO：6所示胺基酸序列，和L CDR3，其包含SEQ ID NO：7所示胺基酸序列；抗體B11，其中所述B11抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含：H CDR1，其包含SEQ ID NO：9所示胺基酸序列，H CDR2，其包含SEQ ID NO：10所示胺基酸序列，和H CDR3，其包含SEQ ID NO：11所示胺基酸序列；所述輕鏈可變區包含： L CDR1，其包含SEQ ID NO：13所示胺基酸序列，L CDR2，其包含SEQ ID NO：14所示胺基酸序列，和L CDR3，其包含SEQ ID NO：15所示胺基酸序列；抗體H12，其中所述H12抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含：H CDR1，其包含SEQ ID NO：17所示胺基酸序列，H CDR2，其包含SEQ ID NO：18所示胺基酸序列，和H CDR3，其包含SEQ ID NO：19所示胺基酸序列；所述輕鏈可變區包含：L CDR1，其包含SEQ ID NO：21所示胺基酸序列，L CDR2，其包含SEQ ID NO：22所示胺基酸序列，和L CDR3，其包含SEQ ID NO：23所示胺基酸序列。
  2. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述B10抗體包含重鏈可變區(VH)，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：4所示胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2的抗體或其抗原結合片段，其中所述B10抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：8所示胺基酸序列。
  4. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述B11抗體包含重鏈可變區(VH)，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：12所示胺基酸序列。
  5. 如請求項1或4的抗體或其抗原結合片段，其中所述B11抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16所示胺基酸序列。
  6. 如請求項1或4所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述B11抗體包含重鏈，其中所述重鏈包含SEQ ID NO：28所示胺基酸序列。
  7. 如請求項1或4所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述B11抗體包含輕鏈，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO：27所示胺基酸序列。
  8. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述H12抗體包含重鏈可變區(VH)，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：20所示胺基酸序列。
  9. 如請求項1或8的抗體或其抗原結合片段，其中所述H12抗體包含輕鏈可變區(VL)，其中所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：24所示胺基酸序列。
  10. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述B10、B11或H12抗體包含重鏈恆定區(CH)，其中所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO：26所示胺基酸序列。
  11. 如請求項1或10的抗體或其抗原結合片段，其中所述B10、B11或H12抗體包含輕鏈恆定區(CL)，所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：25所示胺基酸序列。
  12. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段能夠特異性識別並結合PD-L1，其中親和力(KD)為1×10-9M。
  13. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段能夠特異性識別並結合PD-L1，其中親和力(KD)為5×10-10M。
  14. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段能夠特異性識別並結合PD-L1，其中親和力(KD)為1×10-10M。
  15. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段還具有以下特徵中的至少一個：1)阻斷PD-L1與PD-1的相互作用；2)阻斷PD-L1與CD80的相互作用；3)活化T細胞；4)抑制腫瘤生長。
  16. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是人抗體。
  17. 一種藥物組成物，其包含請求項1-16中任一項的抗體或其抗原結合片段或其組合以及藥學上可接受的載體。
  18. 一種如請求項1-16中任一項的抗體或其抗原結合片段或者請求項17的藥物組成物在製備用於治療腫瘤性疾病的藥物中的應用。
  19. 如請求項18的應用，其中所述腫瘤性疾病為PD-L1陽性腫瘤。
  20. 如請求項19的應用，其中所述PD-L1陽性腫瘤為肺癌、卵巢癌、結直腸癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、子宮頸癌、子宮體癌或骨肉瘤。
  21. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1-16中任一項的抗體或其抗原結合片段。
  22. 一種表現載體，其包含如請求項21的核酸分子。
  23. 一種宿主細胞，其由請求項21的核酸分子或請求項22的表現載體轉化。
  24. 一種生產針對PD-L1的抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括：(i)在適合核酸分子或表現載體表現的情況下培養請求項23的宿主細胞，和(ii)分離並純化由所述核酸分子或表現載體表現的抗體或其抗原結合片段。
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