CN115023439A

CN115023439A - 抗cd73抗体

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Publication number: CN115023439A
Application number: CN202080076881.9A
Authority: CN
Inventors: M·M·格兰达尔; T·吉廷; J·兰托; J·S·雅各布森; R·W·汉森; C·弗洛赫里奇
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Laboratoires Servier SAS
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-09-06
Also published as: TW202122423A; CO2022002622A2; IL291068A; PE20220708A1; MX2022002682A; JP2022547081A; CA3153213A1; US20210070876A1; US11634500B2; WO2021044005A1; US20230227573A1; BR112022003956A2; KR20220057558A; AU2020342778A1; EP4025605A1

Abstract

本发明涉及抗CD73抗体和使用它们治疗与CD73活性相关的疾病和病症例如癌症的方法。

Description

抗CD73抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月6日提交的美国临时专利申请62/896,908的优先权，其公开内容通过引用的方式整体并入本文作为参考。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文作为参考。序列表的电子副本创建于2020年9月1日，名为 022675_WO055_SL.txt，大小为30,355字节。

发明背景

影响肿瘤发生的每个步骤的复杂微环境(肿瘤微环境或TME)包围着肿瘤细胞。在TME中，免疫调节因子如腺苷的浓度增加有助于肿瘤细胞克服宿主的抗肿瘤免疫反应。

腺苷与在各种免疫细胞如CD4+和CD8+T细胞以及自然杀伤(NK)细胞上表达的四种不同受体(AR)结合。这些嘌呤能G蛋白偶联受体A1R、A2AR、A2BR 和A3R各自都表达出独特的特性以及细胞和组织分布。腺苷与AR的结合抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤反应，并且也促进免疫抑制细胞如调节性T细胞(Treg)和髓样衍生的抑制细胞(myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)的发育和活化，从而促进癌症进展。除了腺苷受体的免疫调节作用外，它们的信号传导也可能直接影响癌细胞的存活和增殖。

TME中腺苷的积聚是由细胞表面酶CD73和CD39介导的，它们在将细胞外ATP转化为腺苷的途径中起作用。CD73也称为5'-NT，是一种由两个65kD 亚基通过α-螺旋接头连接成同型二聚体组成的细胞外酶。许多癌细胞过量表达 CD73，特别是在肿瘤低氧条件下，CD73介导5'-AMP水解为腺苷。研究显示，CD73的高表达导致多种癌症的预后较差，所述多种癌症如三阴性乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和黑素瘤。抑制CD73可能是一种有效的癌症治疗方法。

发明概述

本公开涉及靶向CD73的新型重组抗体，以及包含一种或多种这些抗体的药物组合物，以及所述抗体和药物组合物用于治疗癌症的用途。与目前可用的此类癌症的治疗(包括抗体治疗)相比，预期本文所述的抗体和组合物可单独或与另一种癌症治疗剂组合提供优异的临床应答。

在一些方面，本公开提供了一种抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与包含以下的抗体结合人CD73的相同表位结合，

a)包含SEQ ID NO:9和41的氨基酸序列的重链(HC)和包含SEQ ID NO:13 和42的氨基酸序列的轻链(LC)；

b)包含SEQ ID NO:10和41的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:14和 42的氨基酸序列的LC；

c)包含SEQ ID NO:11和41的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:15和 42的氨基酸序列的LC；或

d)包含SEQ ID NO:12和41的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:16和 42的氨基酸序列的LC。

在某些实施方案中，所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:17-19的氨基酸序列的重链互补决定区 (H-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；

iii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:9和41的氨基酸序列的重链(HC)；

并且所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:20-22的氨基酸序列的轻链互补决定区 (L-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

iii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:13和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

在某些实施方案中，所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:23-25的氨基酸序列的重链互补决定区 (H-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；

iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:10和41的氨基酸序列的重链(HC)；

并且所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:26-28的氨基酸序列的轻链互补决定区 (L-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:14和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

在某些实施方案中，所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:29-31的氨基酸序列的重链互补决定区 (H-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；

iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:11和41的氨基酸序列的重链(HC)；

并且所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:32-34的氨基酸序列的轻链互补决定区 (L-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:15和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

在某些实施方案中，所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:35-37的氨基酸序列的重链互补决定区 (H-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；

iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:12和41的氨基酸序列的重链(HC)；

并且所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:38-40的氨基酸序列的轻链互补决定区 (L-CDR)-1-3；

ii)包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

iii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:16和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

在一些实施方案中，本公开提供抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含以下的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列：

a)分别是SEQ ID NO:17至22；

b)分别是SEQ ID NO:23至28；

c)分别是SEQ ID NO:29至34；或

d)分别是SEQ ID NO:35至40。

在一些实施方案中，本公开提供抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含与以下的氨基酸序列至少90％同一的重链可变结构域氨基酸序列和轻链可变结构域氨基酸序列：

a)分别是SEQ ID NO:9和13；

b)分别是SEQ ID NO:10和14；

c)分别是SEQ ID NO:11和15；或

d)分别是SEQ ID NO:12和16。

在一些实施方案中，本公开提供抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含含有以下氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变结构域：

a)分别是SEQ ID NO:9和13；

b)分别是SEQ ID NO:10和14；

c)分别是SEQ ID NO:11和15；或

d)分别是SEQ ID NO:12和16。

在一些实施方案中，本公开提供包含以下的抗CD73抗体：

在一些实施方案中，本公开提供结合至人CD73上的表位的抗CD73抗体或其抗原结合部分，所述表位包含：

a)SEQ ID NO:43的氨基酸残基R73、R109和D168；

b)SEQ ID NO:43的氨基酸残基R109；或

c)SEQ ID NO:43的氨基酸残基I301、S302和H304。

a)SEQ ID NO:43的氨基酸残基27至31、61至75和161至170；

b)SEQ ID NO:43的氨基酸残基61至70和161至170；或

c)SEQ ID NO:43的氨基酸残基27至31、266至270和291至305。

在某些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分具有选自以下的至少一种特性：

a)体外抑制可溶性CD73的活性；

b)体外抑制Calu-6细胞上的CD73的活性；

c)体外抑制H292细胞上的CD73的活性；

d)特异性结合至表达在CHO-S细胞上的人和食蟹猴CD73；

e)结合至人CD73的ECD，通过SPR测量的K_D为1nM或更小；

f)结合至食蟹猴CD73的ECD，通过SPR测量的K_D为0.7nM或更小；

g)不与欧乐利尤单抗(oleclumab)、CPX006和/或11E1结合至CD73的相同表位结合；

h)以产生1:1复合物的方式结合CD73同型二聚体上的表位；

i)比欧乐利尤单抗更有效地体外抑制可溶性CD73活性；

j)体外抑制Calu-6、H292和Cynom-K1细胞上的CD73活性；

k)体外抑制Calu-6、NCI-H1775、KYSE-30和Capan-2细胞上的CD73活性；

l)体外抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的存活和/或增殖；

m)体外抑制原代CD4⁺和CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞上的CD73活性；

n)体外恢复CD4⁺T细胞的增殖；

o)体外活化CD4⁺和CD8⁺T细胞；

p)与抗PD-1抗体组合，在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中，在AMP的存在下恢复T细胞增殖；

q)与抗PD-1抗体组合，在单向MLR中，在AMP的存在下增强T细胞活化；

r)在体外不刺激B细胞活化；

s)在体外不使H292细胞中的CD73水平下降25％以上；

t)抑制从移植有A375细胞的PBMC人源化小鼠收获的肿瘤中的CD73活性；

u)在移植有MDA-MB-231细胞的NOD-scid小鼠中体内抑制肿瘤生长；

v)在移植有Calu-6细胞的PBMC人源化小鼠中体内抑制肿瘤生长；和

w)在移植有A375细胞的PBMC人源化小鼠中体内抑制肿瘤生长。

在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合部分具有至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或所有23 个所述特性。

在某些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分是IgG，例如 IgG₁。该抗体可以在F_C区中包含至少一个突变。例如，该抗体可以是IgG1并且包含在一个或多个重链氨基酸位置234和235处的突变，其中重链氨基酸位置根据

编号方案编号。在具体实施方案中，位置234和235处的一个或两个氨基酸残基从Leu突变为Ala。

在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分和可药用赋形剂。在某些实施方案中，该药物组合物可进一步包含免疫刺激剂、疫苗、化疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和CD73途径抑制剂中的一种或多种。

在一些实施方案中，本公开提供了分离的核酸分子，其包含编码本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，或编码本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列，或包含这两者。在某些实施方案中，该核酸分子可以包含SEQ ID NO:1至8中任一个的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了载体，其包含本文所述的分离的核酸分子，其中所述载体进一步包含表达控制序列。

在一些实施方案中，本公开提供了宿主细胞，其包含编码本文所述的抗 CD73抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，和编码本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了用于产生抗CD73抗体或其抗原结合部分的方法，其包括提供本文所述的宿主细胞，在适于表达该抗体或部分的条件下培养所述宿主细胞，和分离所得的抗体或部分。

在一些实施方案中，本公开提供了双特异性结合分子，其包含一种或两种不同的本文所述的抗CD73抗体的抗原结合部分。

在一些实施方案中，本公开提供了用于降低有需要的患者的CD73活性的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、药物组合物或双特异性结合分子。

在一些实施方案中，本公开提供了用于增加有需要的患者的CD4⁺T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、药物组合物或双特异性结合分子。

在一些实施方案中，本公开提供了用于刺激有需要的患者的免疫系统的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、药物组合物或双特异性结合分子。

在一些实施方案中，本公开提供用于治疗患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、药物组合物或双特异性结合分子。在某些实施方案中，该癌症起源于选自以下的组织：皮肤、肺、肠、结肠、卵巢、脑、前列腺、肾、软组织、造血系统、头和颈、肝、骨、膀胱、乳房、胃、子宫、子宫颈和胰脏。在某些实施方案中，该癌症是黑素瘤、头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胆管癌(cholangiocarcinoma)、甲状腺癌或睾丸癌。

在某些实施方案中，本文所述的治疗进一步包括向患者施用免疫刺激剂、疫苗、化疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、CD73途径抑制剂或放射疗法。

在一些方面中，本公开提供本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、药物组合物或双特异性结合分子的用途，其用于制备用于以下的药物：

a)降低患者的CD73活性；

b)增加患者的CD4⁺T细胞增殖；

c)刺激患者的免疫系统；或

d)治疗患者的癌症。

在一些方面中，本公开提供本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、药物组合物或双特异性结合分子，其用于：

a)降低患者的CD73活性；

b)增加患者的CD4⁺T细胞增殖；

c)刺激患者的免疫系统；或

d)治疗患者的癌症。

在下文的详细描述中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应理解该详细描述尽管描述了本发明的实施方案和方面，但仅以阐述的方式而非限制地给出。本领域技术人员自该详细描述将明白在本发明的范围内的各种变化和改变。

附图简述

图1是显示使用所示的抗CD73抗体处理后的可溶性CD73的活性的图。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值±SEM。

图2是显示使用所示的抗CD73抗体处理后，表达于Calu-6细胞(上图)或 H292细胞(下图)上的CD73的活性的一对图。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值±SEM。

图3是显示所示的抗CD73抗体和参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物对表达于 CHO-S细胞上的人和食蟹猴CD73的结合的一组图。模拟转染的CHO-S细胞系用作阴性对照。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG₁-LALA同种型抗体。数据表示为平均值±SEM。

图4是显示针对所示的抗CD73抗体鉴定的竞争模式和表位仓(epitope bins) 的示意图。连接的黑线指示交叉阻断活性。连接的虚线指示仅在一个方向上阻断的抗体。抗体根据竞争模式与其他抗CD73抗体进行分组。

图5描述定位在CD73二聚体(4H2G)呈开放状态的晶体结构上的抗体21127 (A小图)、21163(B小图)、21046(C小图)、11E1类似物(D小图)、欧乐利尤单抗类似物(E小图)和CPX006类似物(F小图)的结合表位。该结构显示为表面表示，且N端结构域为浅灰色和C端结构域为灰色。腺苷显示为白色棒状物(用箭头指示)。线性表位显示为深灰色，且接触残基显示为黑色。

图6A和6B是抗体21127、21163、21046和11E1、欧乐利尤单抗和CPX006 类似物与CD73以比率mAb:CD731:1(黑线)、0.5:1(深灰色线)、0.1:1(浅灰色线)、 0:1(灰色虚线)和1:0(黑色虚线)混合的一系列SEC-MALS图。不同峰的计算大小显示于表10中。

图7是显示使用所示的抗CD73抗体和参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物处理后的可溶性CD73的活性的图。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG₁-LALA同种型抗体。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值± SEM。垂直虚线指示与可溶性重组CD73等摩尔的抗体浓度。

图8是显示使用所示的抗CD73抗体和参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物处理后，表达于Calu-6细胞(上图)、H292细胞(中图)和Cynom-K1细胞(下图)上的 CD73的活性的一组图。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG₁-LALA 同种型抗体。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值±SEM。

图9是显示在使用所示的抗CD73抗体和参考抗体类似物(欧乐利尤单抗)处理3小时(上图)、6小时(中图)或24小时(下图)后，表达于H292细胞上的CD73 的活性一组图。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值±SEM。

图10是显示如通过CellTiter-Glo测定法测定，在所示的抗体的存在下，由 20种不同癌细胞系表达的CD73的活性的图。“对照Ab”是非CD73特异性Fc γR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。各数据点表示三个技术重复的平均值。

图11是显示阻断CD73活性对在300μM AMP的存在下生长的两个三阴性乳腺癌细胞系MBA-MB-231(上图)和MBA-MB-468(下图)的存活率的影响的一对图。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。将所有计数归一化为未处理的细胞，并将数据表示为三个技术重复的平均值± SEM。

图12是显示如通过CellTiter-Glo测定法测定，在所示的抗体的存在下，由来自健康人类供体的原代CD4⁺和CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞表达的CD73的活性的一组图。将活性归一化为未处理的细胞(100％)。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。将数据表示为三个技术重复的平均值±SEM。

图13是显示使用抗CD3/CD28珠、AMP、以及所示的抗CD73抗体和参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物处理的CD4⁺T细胞的增殖的图。将数据归一化为未经AMP处理的对照并表示为平均值±SEM。

图14是显示使用抗CD3/CD28珠、AMP和21127或参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物处理的CD4⁺(上图)和CD8⁺(下图)T细胞的活化的一对图。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。将数据表示为平均值±SEM。

图15是显示经抗PD-1抗体(12819)、AMP和所示的抗CD73抗体或参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物培养后，单向混合的淋巴细胞反应(MLR)中的T细胞增殖的图。“对照Ab”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。将数据归一化为未经AMP处理的对照并表示为平均值±SEM。

图16是显示经(下图)或不经(上图)AMP和所示浓度的抗PD-1和/或抗CD73 抗体培养后，单向MLR中的T细胞增殖的一对图。12819+21127组合是两种抗体的1:1混合物，且所示浓度显示该混合物的总浓度。“对照Ab”是非CD73 特异性FcγR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。将数据归一化为未经AMP处理的对照并表示为平均值±SEM。

图17A和17B描述在来自以所示的抗体(10μg/mL)和CD40配体(0.5μg/mL) 刺激过夜的健康供体的PBMC中的B细胞活化。图17A是显示CD69在B细胞 (CD20⁺)上的水平的一系列图。图17B是显示B细胞活化标志物CD25、CD69 和CD83的抗体染色的平均荧光强度(MFI)的一系列图。“IgG1-LALA对照”是非CD73特异性FcγR缺陷型IgG1-LALA同种型抗体。数据是来自一个供体的两个数据并表示为平均值±SEM。

图18是显示在使用所示的抗CD73抗体或参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物处理24小时后，表达于H292细胞中的CD73水平的图。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值±SEM。

图19是显示使用所示的抗体处理后，CD73在人类异种移植黑素瘤模型 A375中的活性的一对图。上图：移植有A375的PBMC人源化小鼠每周三次接受不同剂量的21127，历时两周。最后一剂后一天收获肿瘤并分析CD73活性。下图：皮下移植有A375的NOD-scid小鼠每周三次经所示的抗体或组合处理，历时一周。最后一次处理后第3、7、10、17和29天收获肿瘤并分析CD73活性。将数据归一化为未处理的对照并表示为平均值±SEM。

图20是显示皮下移植有人类三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的 NOD-scid小鼠中的肿瘤生长的图。该小鼠每周两次经10mg/kg抗体21127或参考抗体(欧乐利尤单抗)类似物处理。灰色区域表示处理期间。将数据表示为平均值±SEM。

图21是显示使用抗CD73抗体21127或载剂(vehicle)处理对移植有Calu-6 或A375肿瘤细胞的PBMC人源化小鼠中的肿瘤生长的影响的一对图。灰色区域表示处理期间。将数据表示为平均值±SEM。*P＜0.05。

发明详述

本发明提供了可用于抑制患者(例如癌症患者)中CD73活性的新型抗人 CD73抗体。除非另有说明，如本文所用，“CD73”指人CD73。人CD73多肽序列在UniProt登录号P21589(5NTD_HUMAN)(SEQ ID NO:43)下可获得，如下所示：

如本文使用，术语“抗体”(Ab)或“免疫球蛋白”(Ig)是指包含由二硫键相互连接的两条重(H)链(约50至70kDa)和两条轻(L)链(约25kDa)的四聚体。各重链包含重链可变结构域(VH)和重链恒定区(CH)。各轻链包含轻链可变结构域(VL) 和轻链恒定区(CL)。该VH和VL结构域可进一步细分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，穿插更保守的区域，称为“构架区”(FR)。各VH和VL包含三个CDR(H-CDR在本文中指来自重链的CDR；和L-CDR在本文中指来自轻链的CDR)和四个FR，自氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。氨基酸编号和FR和CDR区在重链或轻链中的分配可根据

定义(EU编号；Lefranc等人，Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003))；或Kabat的定义，Sequences ofProteins of immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD(1987和1991))；Chothia&Lesk,J.Mol.Biol. 196:901-917(1987)；Chothia等人，Nature342:878-883(1989)；MacCallum等人， J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；或Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol. 309(3):657-70(2001)。

术语“重组抗体”是指自包含编码抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系表达的抗体，其中所述核苷酸序列是不与该细胞天然相关联的。

术语“经分离的蛋白质”、“经分离的多肽”或“经分离的抗体”是指这样的蛋白质、多肽或抗体：由于其衍生的起源或来源(1)不与以其天然状态伴随其的天然相关联的组分天然相关联，(2)不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达和/或(4)不存在自然中。因此，于不同于来自其天然起源的细胞的细胞系统中化学合成或合成的多肽将“分离”自其天然相关联的组分。蛋白质也可以通过使用本领域熟知的蛋白质纯化技术分离而呈现基本上不含天然相关联的组分。

术语“亲和力”是指抗原与抗体之间的吸引力的量度。抗体针对抗原的内在吸引力通常表示为特定抗体-抗原相互作用的结合亲和力平衡常数(K_D)。当K_D≤1mM，优选地≤100nM时，认为抗体特异性结合至抗原。K_D结合亲和力常数可以例如通过表面等离子体共振(BIAcore^TM)或生物膜层干涉术，例如使用来自IBIS Technologies的IBIS MX96 SPR系统或来自ForteBio的Octet^TM系统测量。

如本文使用的术语“表位”是指特异性结合至抗体或相关分子(例如双特异性结合分子)的抗原的一部分(决定子)。表位决定子一般由分子(例如氨基酸或糖或糖侧链)的化学活性表面基团组成，且一般具有特定三维结构特性，和特定电荷特性。表位可为“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质(例如，抗原)与相互作用的分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿该蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构象表位中，相互作用点的发生跨越蛋白质上一级氨基酸序列中彼此分离的氨基酸残基。一旦确定了抗原上的目的表位后，可以使用本领域熟知的技术产生该表位的抗体。例如，线性表位的抗体可以例如通过使用具有线性表位的氨基酸残基的肽免疫动物产生。构象表位的抗体可以例如通过使用含有该构象表位的相关氨基酸残基的微小结构域(mini-domain)免疫动物产生。特定表位的抗体也可以例如通过使用目的靶分子(例如，CD73)或其相关部分免疫动物产生，然后针对与该表位的结合筛选。

可以通过使用本领域已知的方法确定抗体是否与本发明的抗CD73抗体结合至相同表位或竞争结合，该方法包括但不限于竞争测定法、表位分仓(epitope binning)和丙氨酸扫描。在一些实施方案中，容许本发明的抗CD73抗体在饱和条件下结合至CD73，和然后测量测试抗体结合至CD73的能力。若测试抗体可与参考抗CD73抗体同时结合至CD73，则相较于该参考抗CD73抗体，该测试抗体结合至不同表位。然而，若测试抗体无法同时结合至CD73，则该测试抗体结合至相同表位、重叠的表位或接近本发明的抗CD73抗体结合的表位的表位。此实验可以使用例如ELISA、RIA、BIACORE^TM、SPR、生物膜层干涉术或流式细胞术进行。为了测试一个抗CD73抗体是否与另一抗CD73抗体交叉竞争，可以在两个方向上使用上文所述的竞争方法，即，确定已知抗体是否阻断测试抗体且反之亦然。这类交叉竞争实验可以例如使用IBIS MX96 SPR仪器或 Octet^TM系统进行。

术语“人抗体”是指其中可变结构域和恒定区序列衍生自人类序列的抗体。该术语包含具有自人类基因衍生但已经修饰的，例如以降低免疫原性、增加亲和力和/或增加稳定性的序列的抗体。此外，该术语包含在非人类细胞中重组产生的抗体，其可以赋予人类细胞非典型的糖基化。该术语亦包含在具有人抗体基因的转基因非人类生物体(例如，

大鼠)中产生的抗体。

如本文使用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保留特异性结合至抗原(例如，人CD73或其部分)的能力的抗体的一个或多个部分或片段。已显示全长抗体的某些片段可以实施该抗体的抗原结合功能。术语“抗原结合部分”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1 结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段：包含由二硫键在铰链区连接的两个 Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段；和(vi) 能特异性结合至抗原的分离互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法由合成的接头连接，该合成的接头使得它们可制备成其中该VL和VH结构域配对以形成单价分子 (称为单链Fv(scFv)的单一蛋白链。包含VH和/或VL的抗原结合分子也于本发明内。在VH的情况下，该分子也可以包含CH1、铰链、CH2或CH3区中的一者或多者。这类单链抗体也意欲包含于术语抗体的“抗原结合部分”中。也包含单链抗体的其他形式(例如双体抗体(diabodies))。双体抗体是其中VH和VL 结构域表达于单一多肽链上，但使用接头连接的二价双特异性抗体，该接头太短以至于不容许在该相同链上的两个结构域之间配对，由此迫使结构域与另一链的互补结构域配对和产生两个抗原结合位点。

抗体部分(例如Fab和F(ab’)₂片段)可以使用常规技术(例如全抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)自全抗体制备。此外，抗体、抗体部分和免疫黏附分子可以使用标准重组DNA技术(例如，如本文所述的技术)获得。

抗CD73抗体的类别(同种型)和亚类可以通过本领域已知的任何方法确定。一般而言，抗体的类别和亚类可以使用对抗体的特定类别和亚类具特异性的抗体确定。这类抗体是商业可获得的。该类别和亚类可以通过ELISA或Western 印迹法和其他技术确定。备选地，该类别和亚类可以如下确定：通过测序该抗体的重链和/或轻链的恒定区的所有或一部分，将它们的氨基酸序列与免疫球蛋白的各种类别和亚类的已知氨基酸序列比较，并确定该抗体的类别和亚类。

除非本文另有指示，否则本发明中提及的所有抗体氨基酸残基编号是在

编号方案(EU编号)下的编号。

抗CD73抗体

本公开提供针对CD73的抗体和其抗原结合部分。在一个具体实施方案中，本文公开的抗体是自能产生由重排的人抗体基因编码的抗体的转基因动物(例如，大鼠)产生的人抗体。在某些实施方案中，该人抗体可含有某些突变，例如，以改变引物衍生的突变使其突变回种系序列(参见，例如，表1中的“Symplex 校正的”变体序列)。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体在Fc区中具有“LALA”突变 (L234A/L235A)。这些突变减弱该抗体对人类FcγR(Fcγ受体)的结合。这类抗体是有利的，因为它们具有低水平的次级效应子功能且不消耗效应子T细胞或不靶向其他非恶性细胞。

在一些实施方案中，抗CD73抗体或抗原结合部分与包含以下的抗体竞争或交叉竞争结合至人CD73，或结合至人CD73的相同表位：

a)具有SEQ ID NO:9和41的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:13和 42的氨基酸序列的LC；

b)具有SEQ ID NO:10和41的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:14和 42的氨基酸序列的LC；

c)具有SEQ ID NO:11和41的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:15和 42的氨基酸序列的LC；或

d)具有SEQ ID NO:12和41的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:16和 42的氨基酸序列的LC。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有SEQ ID NO:19、 25、31或37的重链CDR3(H-CDR3)氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有分别包含SEQ ID NO:17-19、23-25、29-31或35-37的氨基酸序列的重链CDR1-3(H-CDR1-3)。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有与任一SEQ ID NO: 9至12中的氨基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有包含任一SEQ ID NO:9至12的氨基酸序列的VH。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体具有与任一SEQ ID NO:9至12的氨基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或 99％同一的重链恒定区氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体包含任一SEQ ID NO:9至12的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:41的重链恒定区氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有SEQ ID NO:22、 28、34或40的轻链CDR3(L-CDR3)氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有分别包含SEQ ID NO:20-22、26-28、32-34、或38-40的氨基酸序列的轻链CDR1-3(L-CDR1-3)。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有与任一SEQ ID NO: 13至16的氨基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一的轻链可变结构域(VL)氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有包含任一SEQ ID NO:13至16的氨基酸序列的VL。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体具有与任一SEQ ID NO:13至16的氨基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一的VL氨基酸序列；和与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一的轻链恒定区氨基酸序列。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体包含任一SEQ ID NO:13至16的VL 氨基酸序列和SEQ ID NO:42的轻链恒定区氨基酸序列。

在某些实施方案中，该抗CD73抗体包含任一上文所述的重链和任一上文所述的轻链。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分包含以下的 H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列：

a)分别是SEQ ID NO:17至22；

b)分别是SEQ ID NO:23至28；

c)分别是SEQ ID NO:29至34；或

d)分别是SEQ ID NO:35至40。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分包含与以下的氨基酸序列80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的VH和VL：

a)分别是SEQ ID NO:9和13；

b)分别是SEQ ID NO:10和14；

c)分别是SEQ ID NO:11和15；或

d)分别是SEQ ID NO:12和16。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分包含含有以下氨基酸序列的VH和VL：

a)分别是SEQ ID NO:9和13；

b)分别是SEQ ID NO:10和14；

c)分别是SEQ ID NO:11和15；或

d)分别是SEQ ID NO:12和16。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体包含：

本发明也提供与抗体21028、21046、21127或21163竞争或交叉竞争结合、或结合至相同表位的抗CD73抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分包含抗体21028、21046、21127或21163的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分包含氨基酸序列分别与抗体21028、21046、21127或21163的VH和VL至少90％同一的VH和 VL。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分包含分别为抗体21028、21046、21127或21163的VH和VL的VH和VL。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体是抗体21028、21046、21127 或21163，或与所述抗体具有相同氨基酸序列的抗体。

通过本文所述的方法获得的抗CD73抗体的类别可以另一类别或亚类改变或转换。在本发明的一些实施方案中，编码VL或VH的核酸分子系使用本领域熟知的方法分离，使得其不包括分别编码CL或CH的核酸序列。然后将编码 VL或VH的核酸分子有效连接至编码来自不同类别的免疫球蛋白分子的分别 CL或CH的核酸序列。如上文所述，这可以使用包含CL或CH序列的载体或核酸分子实现。例如，最初为IgM的抗CD73抗体可类别转换为IgG。此外，该类别转换可用于将一种IgG亚类转化为另一种，例如，自IgG₁转化为IgG₂。可将κ轻链恒定区改变例如为λ轻链恒定区，或反之亦然。用于产生具有所需Ig 同种型的本发明的抗体的示例性方法包括以下步骤：分离编码抗CD73抗体的重链的核酸分子和编码抗CD73抗体的轻链的核酸分子，获得该重链的可变结构域，将重链的可变结构域的编码序列与所需同种型的重链的恒定区的编码序列连接，在细胞中表达由连接序列编码的轻链和重链，和收集具有所需同种型的抗CD73抗体。

本发明的抗CD73抗体可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，但通常为IgG 同种型，例如，IgG亚类IgG₁、IgG₂a或IgG₂b、IgG₃或IgG₄的抗体。在一些实施方案中，所述抗体为同种型亚类IgG₁的抗体。在一些实施方案中，所述抗体为同种型亚类IgG₂的抗体。

在一些实施方案中，抗CD73抗体在Fc区中可以包含至少一个突变。已知许多不同的Fc突变，其中这些突变改变该抗体的效应子功能。例如，在许多情况下，希望减少或消除效应子功能，例如，其中配体/受体相互作用是不希望的或在抗体-药物缀合物的情况下。

在一些实施方案中，抗CD73抗体在Fc区中包含减少效应子功能的至少一个突变，例如，于位置228、233、234和235中的一者或多者的突变，其中氨基酸位置根据

编号方案编号。

在一些实施方案中，例如，在抗体为IgG₁亚类的抗体的情况下，于位置234 和235的氨基酸残基中的一者或两者可经突变，例如自Leu突变至Ala (L234A/L235A)。这些突变减少IgG₁抗体的Fc区的效应子功能。氨基酸位置根据

编号方案编号。

在一些实施方案中，例如，在抗体为IgG₄亚类的抗体的情况下，它可以包含突变S228P，其中氨基酸位置根据

编号方案编号。已知此突变减少不希望的的Fab臂交换。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分结合至CD73 的表位，其包括SEQ ID NO:43的以下残基中的至少一者(例如，至少一者、至少二者、至少三者、至少四者或至少五者)：R73、R109、D168、I301、S302和 H304。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合部分结合至CD73的表位，其包含残基R73、R109和D168(例如抗体21127)或由残基R73、R109和D168(例如抗体21127)组成。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合部分结合至CD73 的表位，其包含残基R109(例如抗体21163)或由残基R109(例如抗体21163)组成。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合部分结合至CD73的表位，其包含残基I301、S302和H304(例如抗体21046)或由残基I301、S302和H304(例如抗体21046)组成。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分结合至CD73 的表位，其包含SEQ ID NO:43的残基27至31、61至70、61至75、161至170、 266至270和/或291至305。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合部分结合至CD73的表位，其包含残基27至31、61至75和161至170(例如抗体21127) 或由残基27至31、61至75和161至170(例如抗体21127)组成。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合部分结合至CD73的表位，其包含残基61至70和161至170(例如抗体21163)或由残基61至70和161至170(例如抗体21163)组成。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合部分结合至CD73的表位，其包含残基27至31、266至270和291至305(例如抗体21046)或由残基27至31、266 至270和291至305(例如抗体21046)组成。

在一些实施方案中，所述抗体或部分结合至包含SEQ ID NO:43的残基27 至31(或其片段，例如1、2、3或4个残基片段)的表位(例如抗体21127和21046)。在一些实施方案中，所述抗体或部分结合至包含SEQ ID NO:43的残基61至75 (或其片段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个残基片段，例如，残基61至70)的表位(例如抗体21127和21163)。在一些实施方案中，所述抗体或部分结合至包含SEQ ID NO:43的残基161至170(或其片段，例如 1、2、3、4、5、6、7、8或9个残基片段)的表位(例如抗体21127和21163)。在一些实施方案中，所述抗体或部分结合至包含SEQ ID NO:43的残基266至 270(或其片段，例如1、2、3或4个残基片段)的表位(例如抗体21046)。在一些实施方案中，所述抗体或部分结合至包含SEQID NO:43的残基291至305(或其片段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个残基片段) 的表位(例如抗体21046)。

也考虑了具有上文残基或表9中所示残基的任何组合的表位。

在一些实施方案中，包含本文所述的CD73表位的氨基酸序列可用作免疫原 (例如，向动物施用或作为抗原用于筛选抗体库)以产生或鉴定结合至所述表位的抗CD73抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中(例如，在10μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制可溶性CD73的活性至少40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％(例如，至少40％)。在一些实施方案中，在1、2、3、4、5、7、10、 15、20、30、40、50或100μg/mL的浓度下，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制可溶性CD73的活性至少90％。

在一些实施方案中(例如，在10μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制Calu-6细胞上的CD73的活性至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％或100％(例如，至少75％)。

在一些实施方案中(例如，在10μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制H292细胞上的CD73的活性至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％或100％(例如，至少80％)。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分特异性结合至表达在CHO-S细胞上的人CD73、食蟹猴CD73或两者。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分以1、0.9、0.8、 0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、 0.02或0.01nM或更小(例如，1nM或更小)的K_D结合至人CD73的胞外结构域 (ECD)，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分以1、0.9、0.8、 0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、 0.02或0.01nM或更小(例如，0.7nM或更小)的K_D结合至食蟹猴CD73的胞外结构域(ECD)，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分不与欧乐利尤单抗、CPX006、11E1或其任何组合结合至CD73的相同表位。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分以产生1:1复合物的方式结合CD73同型二聚体上的表位。在某些实施方案中，所述抗体/CD73 结合仅产生1:1复合物。在某些实施方案中，所述抗体/CD73结合主要产生1:1 复合物。在具体实施方案中，抗体或抗原结合部分对CD73的结合产生独立于 CD73浓度的1:1复合物。

在一些实施方案中，例如，在1、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、 90或100μg/mL或更小的浓度下(例如在10μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制可溶性CD73活性。在某些实施方案中(例如，在10μg/mL的浓度下)，抗CD73抗体或抗原结合部分比欧乐利尤单抗更有效抑制该CD73活性。在具体实施方案中(例如，抗体或抗原结合部分在上文列举的浓度之一时)，抑制CD73活性至少10、20、30、40、50、60、70、80、90 或100％。例如，在3μg/mL的浓度下，该抗体或抗原结合部分可100％抑制CD73 活性。

在一些实施方案中，例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75或100μg/mL或更小的浓度下(例如在3μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制Calu-6、H292、Cynom-K1 细胞或其任何组合上的CD73活性。在某些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分比欧乐利尤单抗更有效抑制该CD73活性。在某些实施方案中，在额外地培养3、6或24小时后，该抗CD73抗体或抗原结合部分仍比欧乐利尤单抗更有效。在具体实施方案中(例如，抗体或抗原结合部分在上文列举的浓度之一时)，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％抑制CD73活性。

在一些实施方案中(例如，在25μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制表11中所示的任何细胞系或细胞系的组合上的CD73活性。在某些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分抑制Calu-6、NCI-H1775 细胞、KYSE-30细胞、Capan-2细胞或其任何组合上的CD73活性。在某些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分比欧乐利尤单抗更有效抑制该CD73活性。

在一些实施方案中，例如，在0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20或 25μg/mL或更小的浓度下(例如在0.01μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗 CD73抗体或抗原结合部分体外抑制MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞或两者的存活和/或增殖。在某些实施方案中(例如，在0.5μg/mL或更大的浓度下)，该抗CD73抗体或抗原结合部分比欧乐利尤单抗更有效抑制该存活/增殖。在具体实施方案中(例如，抗体或抗原结合部分在上文列举的浓度之一时)，活细胞的数量减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

在一些实施方案中，例如，在0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20或 25μg/mL或更小的浓度下(例如在0.1μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗 CD73抗体或抗原结合部分抑制原代CD4⁺细胞、CD8⁺T细胞、CD19⁺B细胞或其任何组合上的CD73活性。在具体实施方案中(例如，抗体或抗原结合部分在上文列举的浓度之一时)，CD73活性被抑制例如至少10、20、30、40、50、60、 70、80、90或100％。

在一些实施方案中，例如，在0.05、0.1、0.5或1μg/mL或更小的浓度下(例如在0.01μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分恢复CD4⁺T细胞的增殖。在一些实施方案中，例如，在0.1、0.5、1、10、15、20、 25、30、40、50或100μg/mL或更小的浓度下(例如在25μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分将CD4⁺T细胞的增殖恢复至 100％。在一些实施方案中(例如，在0.1μg/mL或更大的浓度下)，该抗CD73抗体或抗原结合部分比欧乐利尤单抗更有效恢复CD4⁺T细胞的增殖。在某些实施方案中(例如，抗体或抗原结合部分在上文列举的浓度之一时)，T细胞增殖恢复至至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

在一些实施方案中，例如，在0.001、0.005、0.01、0.05、1、5、10、15或 25μg/mL或更小的浓度下(例如在1μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗 CD73抗体或抗原结合部分活化CD4⁺和CD8⁺T细胞。在一些实施方案中(例如，在0.1μg/mL或更大的浓度下)，该抗CD73抗体或抗原结合部分比欧乐利尤单抗更有效活化CD4⁺和CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，例如，在0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10μg/mL或更小的浓度下(例如在0.01μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分与抗PD-1抗体的组合在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中在AMP 的存在下恢复T细胞增殖。在某些实施方案中(例如，在1μg/mL或更小的浓度下)，该抗CD73抗体或抗原结合部分与抗PD-1抗体的组合完全恢复T细胞增殖。在某些实施方案中(例如，在0.1μg/mL或更大的浓度下)，该抗CD73抗体或抗原结合部分与抗PD-1抗体的组合比欧乐利尤单抗更有效恢复T细胞增殖。在具体实施方案中(例如，抗体或抗原结合部分在上文列举的浓度之一时，与抗 PD-1抗体组合)，T细胞增殖恢复至至少10、20、30、40、50、60、70、80、90 或100％。

在一些实施方案中，例如，在0.5、1、5、10、15或25μg/mL或更小的浓度下(例如在1μg/mL或更小的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分在单向MLR中在AMP的存在下增强T细胞活化。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分与抗PD-1抗体(例如12819)的组合在单向MLR中在 AMP的存在下增强T细胞活化。

在一些实施方案中(例如，在10μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分在体外不刺激B细胞活化。在一些实施方案中(例如，在10 μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分体外刺激B细胞活化。B细胞活化可以通过观测标志物(例如，CD25、CD69和/或CD83)确定。

在一些实施方案中(例如，在25μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分在体外不降低H292细胞中的CD73水平。在一些实施方案中 (例如，在25μg/mL的浓度下)，相较于未处理的对照，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分于体外降低H292细胞中的CD73水平例如至不超过40％、 50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中(例如，在25μg/mL的浓度下)，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分体外仅适度降低H292细胞中的 CD73水平。例如，在某些实施方案中，CD73水平降低不超过例如5％、10％、 15％、20％、25％、30％或35％(例如，25％)。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制从移植有 A375细胞的PBMC人源化小鼠收获的肿瘤中的CD73活性(例如，其中该小鼠以5mg/kg、20mg/kg或50mg/kg施用该抗体或抗原结合部分，每周三次，历时一或两周)。在某些实施方案中，在处理结束后，CD73活性的抑制维持至少20、 24、28、32、36、40、44、50、75、100、125、150、175或200天(例如，至少 28天)。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分在移植有 MDA-MB-231细胞的NOD-scid小鼠中体内抑制肿瘤生长(例如，其中该小鼠以 10mg/kg施用该抗体或抗原结合部分，每周两次，历时总计16次处理)。在某些实施方案中，在处理结束后，该肿瘤生长抑制是以肿瘤体积的有限增加(例如，小于10、20、30、40或50mm³)维持至少10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100、120、140、160、180或200天(例如，至少60天)。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分抑制移植有 Calu-6或A375细胞的PBMC人源化小鼠中的肿瘤生长(例如，其中该小鼠以10 mg/kg施用该抗体或抗原结合部分，每周三次，历时总计六次处理)。

本发明也考虑了具有上文性质的任何组合的抗CD73抗体或抗原结合部分。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分具有以下性质中的至少一者(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22或所有23个性质)：

a)体外抑制可溶性CD73的活性；

b)体外抑制Calu-6细胞上的CD73的活性；

c)体外抑制H292细胞上的CD73的活性；

d)特异性结合至表达在CHO-S细胞上的人和食蟹猴CD73；

e)以1nM或更小的K_D结合至人CD73的ECD，如通过SPR测量的；

f)以0.7nM或更小的K_D结合至食蟹猴CD73的ECD，如通过SPR测量的；

g)不与欧乐利尤单抗、CPX006和/或11E1结合至CD73的相同表位结合；

h)以产生1:1复合物的方式结合CD73同型二聚体上的表位；

i)于体外比欧乐利尤单抗更有效抑制可溶性CD73活性；

j)体外抑制Calu-6、H292和Cynom-K1细胞上的CD73活性；

k)体外抑制Calu-6、NCI-H1775、KYSE-30和Capan-2细胞上的CD73活性；

l)体外抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的存活和/或增殖；

m)体外抑制原代CD4⁺和CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞上的CD73活性；

n)体外恢复CD4⁺T细胞的增殖；

o)体外活化CD4⁺和CD8⁺T细胞；

r)在体外不刺激B细胞活化；

s)在体外不使H292细胞中的CD73水平下降25％以上；

u)在移植有MDA-MB-231细胞的NOD-scid小鼠中体内抑制肿瘤生长；

w)在移植有A375细胞的PBMC人源化小鼠中体内抑制肿瘤生长。

在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有性质a)至w)中的所有性质。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有至少性质 a)至k)、n)和s)。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有至少性质a)至g)、i)至k)和n)。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有至少性质a)至d)、i)至k)、n)和s)。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分可体内抑制肿瘤生长和/或引起肿瘤生长消退、可减缓或逆转癌症患者中的转移和/或可延长癌症患者的存活。也考虑了上文性质的任何组合。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分比目前在临床试验中的抗CD73抗体更有效增加T细胞增殖和/或降低CD73活性。例如，在某些实施方案中，该抗CD73抗体或抗原结合部分具有以下性质中的至少一者：

-在0.1μg/mL的浓度下，比具有包含以下HC和LC氨基酸序列的抗体更多增加以100μM AMP培养的经活化CD4⁺T细胞的增殖：

-美国专利公开2016/0129108的分别是SEQ ID NO:17和19；

-美国专利公开2018/0009899的分别是SEQ ID NO:14和13；或

-美国专利公开2018/0030144的分别是SEQ ID NO:3和4；

和/或

-在10μg/mL或更高的浓度下，培养24小时后，比具有包含以下HC和 LC氨基酸序列的抗体更多降低H292细胞中的CD73活性：

-美国专利公开2016/0129108的分别是SEQ ID NO:17和19；

-美国专利公开2018/0009899的分别是SEQ ID NO:14和13；或

-美国专利公开2018/0030144的分别是SEQ ID NO:3和4。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分可为通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫黏附分子的一部分。这类免疫黏附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区以制备四聚体scFv分子(Kipriyanov等人，Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101(1995)) 和使用半胱氨酸残基、标志肽和C端聚组氨酸标签以制备二价和生物素化scFv 分子(Kipriyanov等人，Mol.Immunol.31:1047-1058(1994))。其他实例包括其中将来自抗体的一个或多个CDR共价或非共价并入分子内以使其成为特异性结合至目的抗原的免疫黏附素。在这类实施方案中，该CDR可作为较大多肽链的一部分并入、可共价连接至另一多肽链或可非共价并入。

在一些实施方案中，可制备融合抗体或免疫黏附素，其包含本发明的抗 CD73抗体的所有或一部分连接至另一多肽。在某些实施方案中，将该抗CD73 抗体的仅可变结构域连接至该多肽。在某些实施方案中，将抗CD73抗体的VH 结构域连接至第一多肽，而将抗CD73抗体的VL结构域连接至第二多肽，该第二多肽是以使得该VH和VL结构域可彼此相互作用以形成抗原结合位点的方式与该第一多肽结合。在一些实施方案中，该VH结构域通过接头与该VL结构域分开，从而该VH和VL结构域可彼此相互作用(例如，单链抗体)。然后将VH- 接头-VL抗体连接至目的多肽。另外，可产生其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接的融合抗体。如果计划在单一多肽链上产生二价或多价抗体或计划产生双特异性抗体时，这是有用的。

为产生单链抗体(scFv)，将编码VH和VL的DNA片段有效连接至编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO:44))的另一片段，使得该 VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，其具有由该柔性接头连接该VL和VH 结构域。参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Huston等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和McCafferty等人，Nature 348:552-554 (1990)。若仅使用单一VH和VL，则该单链抗体可为单价；若使用两个VH和 VL，则为二价；或若使用超过两个VH和VL，则为多价。例如，可产生特异性结合至人CD73和另一分子的双特异性或多价抗体。

在其他实施方案中，可以使用编码抗CD73抗体的核酸分子制备其他经修饰的抗体。例如，“κ体(kappa bodies)”(Ill等人，Protein Eng.10:949-57(1997))、“微体(minibodies)”(Martin等人，EMBO J.13:5303-9(1994))、“双体抗体 (diabodies)”(Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))或“Janusin”(Traunecker等人，EMBO J.10:3655-3659(1991)和Traunecker等人，Int.J.Cancer(增刊)7:51-52(1992))可以使用标准分子生物技术遵循本说明书的教导制备。

本发明的抗CD73抗体或抗原结合部分可经衍生化或连接至另一分子(例如，另一肽或蛋白质)。一般而言，该抗体或其部分是经衍生化的，使得CD73 结合不受该衍生化或标记的不利影响。因此，本发明的抗体和抗体部分意欲包括本文所述的人抗CD73抗体的完整和经修饰的形式。例如，本发明的抗体或抗体部分(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他)可功能上连接至一个或多个其他分子实体，例如另一抗体(例如，双特异性抗体或双体抗体)、检测剂、药物和/或蛋白质或肽，它们可介导该抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)的结合。

通过交联两个或更多个抗体(相同类型或不同类型的抗体，例如，以产生双特异性抗体)产生经衍生抗体的一种类型。合适的交联剂包括那些异双功能的、具有由适当的间隔基团分开的两个明显不同的反应性基团(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的反应性基团(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这类接头可以例如自Pierce Chemical公司，Rockford,IL获得。

抗CD73抗体或抗原结合部分也可用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或糖基衍生。这些基团可适用于改善该抗体的生物特性，例如，以增加血清半寿期。

根据本发明的抗体或抗原结合部分也可经标记。如本文使用，术语“标记”或“经标记”是指将另一分子并入该抗体内。在一些实施方案中，该标记是可检测标志物，例如，掺入放射性标记的氨基酸或结合至生物素基部分的多肽，其可以通过标记的亲和素检测(例如，可以通过光学或比色方法检测的含有荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)。在一些实施方案中，该标记或标志物可为治疗剂，例如，药物缀合物或毒素。本领域已知和可以使用标记多肽和糖蛋白的各种方法。用于多肽的标记的实例包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素荧光粉)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标志物、生物素基团、由次级报导分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)、磁性剂(例如钆螯合物)、毒素(例如百日咳毒素)、紫杉醇(taxol)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱 (vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D (actinomycin D)、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)和类似物或同源物。在一些实施方案中，标记物由各种长度的间隔臂连接以减少潜在空间位阻。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合部分可结合至细胞毒性剂以形成免疫缀合物。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合部分可缀合至放射性同位素。

在某些实施方案中，本发明的抗体可以中性形式(包括两性离子形式)存在或作为带正电或带负电物质存在。在一些实施方案中，该抗体可与反荷离子复合以形成可药用盐。

术语“可药用盐”是指包含一个或多个抗体和一个或多个反荷离子的复合物，其中该反荷离子衍生自可药用无机和有机酸和碱。

抗CD73抗体组合物

本发明也提供组合疗法(例如，组合物)，其包含一种、两种、三种、四种或更多种本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，该组合疗法(例如，组合物)包含两种抗CD73抗体或抗原结合部分。该组合疗法可采取例如使用所述抗体或抗原结合部分或包含所述抗体或抗原结合部分的药物组合物的治疗方法的形式。

在一些实施方案中，本公开提供包含第一抗CD73抗体或其抗原结合部分和第二抗CD73抗体或其抗原结合部分的组合物，其中：该第一和第二抗体：

-分别是抗体21028和21046；

-分别是抗体21028和21127；

-分别是抗体21028和21163；

-分别是抗体21046和21127；

-分别是抗体21046和21163；或

-分别是抗体21127和21163。

在一些实施方案中，该组合物包含与该第一和第二抗体结合至相同表位或该第一和第二抗体竞争结合的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，该组合物包含含有该第一抗体的H-CDR1-3和 L-CDR1-3氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分，和含有该第二抗体的 H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，该组合物包含含有与该第一抗体的分别VH和VL氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和VL的抗体或其抗原结合部分，和含有与该第二抗体的分别VH和VL氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和VL的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，该组合物包含含有该第一抗体的VH和VL氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分，和含有该第二抗体的VH和VL氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，该组合物包含含有该第一抗体的HC和LC氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分，和含有该第二抗体的HC和LC氨基酸序列的抗体或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，该组合物可以包含选自以下一个、二个或更多个抗体或其抗原结合部分：

a)包含分别含有SEQ ID NO:17-19、23-25、29-31或35-57的氨基酸序列的H-CDR1-3的抗体；

b)VH的序列与SEQ ID NO:9、10、11或12的氨基酸序列至少90％同一的抗体；

c)VH包含SEQ ID NO:9、10、11或12的氨基酸序列的抗体；

d)HC包含SEQ ID NO:9和41、10和41、11和41、或12和41的氨基酸序列的抗体；

e)包含分别含有SEQ ID NO:20-22、26-28、32-34、或38-40的氨基酸序列的L-CDR1-3的抗体；

f)VL的序列与SEQ ID NO:13、14、15或16的氨基酸序列至少90％同一的抗体；

g)VL包含SEQ ID NO:13、14、15或16的氨基酸序列的抗体；

h)LC包含SEQ ID NO:13和42、14和42、15和42、或16和42的氨基酸序列的抗体；

i)H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID NO:17至22、23至28、29至 34或35至40的氨基酸序列的抗体；

j)包含含有氨基酸序列分别与SEQ ID NO:9和13、10和14、11和15、或 12和16的氨基酸序列至少90％同一的VH和VL的抗体；

k)包含分别含有SEQ ID NO:9和13、10和14、11和15、或12和16的氨基酸序列的VH和VL的抗体；和

l)包含分别含有SEQ ID NO:9和41，和13和42；10和41，和14和42； 11和41，和15和42；或12和41，和16和42的氨基酸序列的HC和LC的抗体。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体组合物可以体内抑制肿瘤生长和/或引起肿瘤生长消退、可以减缓或逆转癌症患者中的转移和/或可以延长癌症患者的存活。也考虑了上文性质的任何组合。

本发明也提供用于产生本文所述的抗CD73抗体组合物的方法，其包括提供第一抗CD73抗体或抗原结合部分和第二抗CD73抗体或抗原结合部分，和混合该两种抗体或部分。

双特异性结合分子

本发明也提供具有本文所述的抗CD73抗体的结合特异性的双特异性结合分子(例如，包含抗原结合部分，例如六个CDR或VH和VL)。在一些实施方案中，该双特异性结合分子额外具有另一不同的抗CD73抗体(例如，本文所述的另一抗CD73抗体)或靶向不同蛋白质(例如癌症抗原或活性介导例如癌症的疾病病症的另一细胞表面分子)的抗体的结合特异性。本领域已知这类双特异性结合分子，且本文别处给出了不同类型的双特异性结合分子的实例。在某些实施方案中，该双特异性结合分子可以结合至CD73和PD-1、CD73和PD-L1、或CD73 和CTLA-4。

核酸分子和载体

本发明也提供编码本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分的核酸分子和序列。在一些实施方案中，不同核酸分子编码该抗CD73抗体或抗原结合部分的重链和轻链氨基酸序列。在其他实施方案中，相同核酸分子编码该抗CD73 抗体或抗原结合部分的重链和轻链氨基酸序列。

除非本文另有规定，否则对核苷酸序列的提及包含其互补物。因此，应理解对具有特定序列的核酸的提及包含其互补链，具有其互补序列。如本文提及的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或这两者之一的核苷酸类型的经修饰形式。该术语包括单链和双链形式。

在一些实施方案中，本公开提供包含编码本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，或编码本文所述的抗CD73 抗体或其抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列或两者的核酸分子。

本发明也提供与本文所述的一个或多个核苷酸序列，例如，与选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的核苷酸序列，或与编码选自由SEQ ID NO:9至16组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、 98％或99％同一的核苷酸序列。在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性百分数”是指两个序列在针对最大对应进行比对时相同的残基。序列同一性比较的长度可以为超过一段至少约九个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，通常至少约28个核苷酸，更通常至少约32个核苷酸，和优选地至少约36、48或更多个核苷酸。本领域已知可用于测量核苷酸序列同一性的许多不同算法。例如，多核苷酸序列可以使用FASTA、Gap或Bestfit比较，其为威斯康星州软件包版本10.0，遗传学计算器组(GCG)，麦迪逊，威斯康星州的程序。包括例如程序FASTA2和FASTA3的FASTA提供查询与搜索序列间的最佳重叠的区域的比对和序列同一性百分数(参见，例如，Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000)； Pearson,Methods Enzymol.266:227-258(1996)；和Pearson,J.Mol.Biol. 276:71-84(1998)；以引用的方式并入本文作为参考)。除非本文另有规定，否则使用针对特定程序或算法的默认参数。例如，核酸序列间的序列同一性百分数可以使用FASTA和其默认参数(字长为6和评分矩阵的NOPAM因子)或使用如 GCG版本6.1中提供的Gap和其默认参数测定，其以引用的方式并入本文作为参考。

在一些实施方案中，本公开提供包含选自由SEQ ID NO:1至8组成的组的核苷酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，该核酸分子包含SEQ ID NO:1和 5、SEQ ID NO:2和6、SEQ ID NO:3和7或SEQ ID NO:4和8的核苷酸序列。

在任一上文的实施方案中，该核酸分子可经分离。在本文中称为“经分离”或“经纯化”的核酸分子是(1)已自其起源的基因组DNA或细胞RNA的核酸分离；和/或(2)天然中不存在的核酸。

在一些实施方案中，本公开提供适用于表达如本文所述的抗体或其抗原结合部分的链中的一者或两者的载体。如本文使用，术语“载体”意指能够转运另一核酸的核酸分子，该核酸分子已与该另一核酸连接。在一些实施方案中，该载体是质粒，即，其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA。在一些实施方案中，该载体是病毒载体，其中额外DNA区段可连接至病毒基因组内。在一些实施方案中，载体能够在并入其的宿主细胞内自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在其他实施方案中，该载体(例如，非游离型哺乳动物载体)一经引入宿主细胞内即可整合至该宿主细胞的基因组内，并由此随着该宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。

本公开提供包含编码如本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分的重链、轻链或重链和轻链两者的核酸分子的载体。在某些实施方案中，本发明的载体包含本文所述的核酸分子。本发明进一步提供包含编码融合蛋白、经修饰的抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。该载体可进一步包含表达控制序列。

如本文使用的术语“表达控制序列”意指影响其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质 mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和根据需要，增强蛋白质分泌的序列。这类控制序列的性质取决于宿主生物体而不同；在原核生物中，这类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般而言，这类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意在至少包括存在对于表达和加工而言必需的所有组分，和也可包括存在是有利的额外组分，例如，前导序列和融合伴侣序列。

编码如本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分的重链和/或轻链的核酸分子可以自产生此抗体或部分的任何来源分离。在一些实施方案中，该核酸分子系自表达自经人CD73抗原免疫的动物分离的抗CD73抗体的B细胞或自此B 细胞产生的永生化细胞分离。本领域熟知分离编码抗体的核酸的方法。可分离和使用mRNA以产生cDNA用于抗体基因的聚合酶链反应(PCR)或cDNA克隆中。在某些实施方案中，可以合成而非分离如本文所述的核酸分子。

在一些实施方案中，如本文所述的核酸分子包含编码来自如本文所述的抗 CD73抗体或抗原结合部分的VH结构域的核苷酸序列，其读框内连接至编码来自任何来源的重链恒定区的核苷酸序列。类似地，如本文所述的核酸分子可以包含编码来自如本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的VL结构域的核苷酸序列，其读框内连接至编码来自任何来源的轻链恒定区的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，编码VH和/或VL的核酸分子可“转化”为全长抗体基因。在某些实施方案中，编码VH或VL结构域的核酸分子通过插入于已分别编码重链恒定(CH)区或轻链恒定(CL)区的表达载体内，使得该VH区段有效连接至该载体内的CH区段和/或该VL区段有效连接至该载体内的CL区段，转化为全长抗体基因。在一些实施方案中，编码VH和/或VL结构域的核酸分子通过使用标准分子生物技术将编码VH和/或VL结构域的核酸分子连接 (link)(例如连接(ligate))至编码CH和/或CL区的核酸分子，转化为全长抗体基因。然后，编码全长重链和/或轻链的核酸分子可自其中已引入所述核酸分子的细胞表达，以及分离抗CD73抗体。

核酸分子可用于重组表达大量抗CD73抗体。如本文描述，该核酸分子也可用于产生嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫黏附素、双体抗体、突变抗体和抗体衍生物。

在一些实施方案中，将本发明的核酸分子用作特定抗体序列的探针或PCR 引物。例如，该核酸可作为探针用于诊断方法中或作为PCR引物用于扩增可尤其用于分离编码抗CD73抗体的可变结构域的额外核酸分子的DNA区域。在一些实施方案中，该核酸分子是寡核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸来自目的抗体的重链和轻链的高度可变结构域。在一些实施方案中，该寡核苷酸编码如本文所述的本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分的CDR中的一者或多者的所有或一部分。

在一些实施方案中，核酸分子和载体可用于制备经突变的抗CD73抗体。该抗体可在重链和/或轻链的可变结构域中突变例如以改变该抗体的结合性质。例如，突变可在CDR的一者或多者中作出以增加或降低该抗CD73抗体的K_D、增加或降低k_off或改变该抗体的结合特异性。在一些实施方案中，一个或多个突变是在已知相较于本发明的单克隆抗体中的种系而变化的氨基酸残基处做出。突变可在可变结构域的CDR或构架区中或在恒定区中作出。在某些实施方案中，突变是在可变结构域中作出。在具体实施方案中，一个或多个突变是在已知相较于本发明的抗体或其抗原结合部分的可变结构域的CDR或构架区中的种系而变化的氨基酸残基处做出。

在一些实施方案中，构架区经突变使得所得构架区具有相应种系基因的氨基酸序列。突变可在构架区或恒定区中作出，例如，以增加该抗CD73抗体的半寿期。参见，例如，PCT公开WO 00/09560。构架区或恒定区中的突变也可经作出以改变该抗体的免疫原性和/或为共价或非共价结合至另一分子提供位点。根据本发明，抗体可以在可变结构域的CDR或构架区的任何一者或多者中或在恒定区中具有突变。

在一些实施方案中，通过将如上文所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体内使得将基因有效连接至必需表达控制序列(例如转录和翻译控制序列)表达本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒(例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)、黏粒、YAC、EBV衍生的附加体等。该抗体编码序列可连接至载体内，使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体编码序列的转录和翻译的预期功能。该表达载体和表达控制序列可经选择以可与使用的表达宿主细胞兼容。抗体轻链编码序列和抗体重链编码序列可插入相同或不同载体内，和可以有效连接至相同或不同表达控制序列(例如，启动子)。在一些实施方案中，两种编码序列均插入相同表达载体内和可以有效连接至相同表达控制序列(例如，共同启动子)，有效连接至分开的相同表达控制序列(例如，启动子)，或有效连接至不同表达控制序列(例如，启动子)。该抗体编码序列可以通过标准方法插入表达载体内(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或若不存在限制性位点，则为平端连接)。

如上文所述，便利的载体系编码功能完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列且适当的限制性位点经改造使得任何VH或VL序列可容易地插入和表达的载体。这类载体中的编码HC和LC的基因可以含有内含子序列，其将通过稳定相关mRNA导致增强的整体抗体蛋白产率。该内含子序列两侧为剪接供体和剪接受体位点，其决定RNA剪接将发生的位置。当使用多个内含子时，内含子序列的位置可在抗体链的可变区或恒定区中或在可变区和恒定区两者中。聚腺苷酸化和转录终止可发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体也可编码促进抗体链自宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体内使得将该信号肽读框内连接至免疫球蛋白链的氨基端。该信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因外，本发明的重组表达载体可携带调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员应知晓表达载体的设计(包括调节序列的选择)可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒组件，例如自以下衍生的启动子和/或增强子：逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒和强哺乳动物启动子(例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子)。对于病毒调节组件和其序列的进一步描述，参见，例如，美国专利5,168,062,4,510,245 和4,968,615。本领域已知用于在植物中表达抗体的方法，包括启动子和载体的描述和植物的转化。参见，例如，美国专利6,517,529。本领域也熟知在细菌细胞或真菌细胞(例如，酵母细胞)中表达多肽的方法。

除抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可以携带额外序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因利于其中已引入载体的宿主细胞的选择(参见，例如，美国专利 4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因可对已引入载体的宿主细胞赋予对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。例如，选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。

宿主细胞和产生抗体和抗体组合物的方法

本发明也提供用于产生本文所述的抗体组合物和抗体和其抗原结合部分的方法。在一些实施方案中，本发明涉及用于产生如本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的方法，其包括提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，和编码本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列；在适于表达该抗体或抗原结合部分的条件下培养所述宿主细胞；和分离所得的抗体或抗原结合部分。在这类重组宿主细胞中由此表达产生的抗体或抗原结合部分在本文中称为“重组”抗体或抗原结合部分。本发明也提供这类宿主细胞的后代细胞，和由其产生的抗体或抗原结合部分。

如本文使用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指其中已引入重组表达载体的细胞。根据定义，重组宿主细胞不天然存在。本公开提供可以包含例如如本文所述的载体的宿主细胞。本发明也提供包含例如编码本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、编码本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列或这两者的宿主细胞。应理解“重组宿主细胞”和“宿主细胞”意指不仅特定的主题细胞，也指此细胞的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可在后代中出现，因此此后代可事实上与亲代细胞不相同，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。

编码抗CD73抗体和其抗原结合部分的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可用于转染合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞内的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法为本领域熟知并包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、 Polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸囊封于脂质体中和将 DNA直接显微注射至细胞核内。另外，核酸分子可由病毒载体引入哺乳动物细胞内。本领域熟知转化细胞的方法。参见，例如，美国专利4,399,216、4,912,040、 4,740,461和4,959,455。本领域熟知转化植物细胞的方法，包括例如农杆菌介导的转化、生物射弹转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。本领域也熟知转化细菌和酵母细胞的方法。

作为用于表达的宿主的可获得哺乳动物细胞系为本领域熟知和包括可自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293Freestyle细胞 (Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。特别优选的细胞系是通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系(例如Sf9或Sf21细胞)。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，该抗体通过将宿主细胞培养足以容许在该宿主细胞中表达该抗体的时间期间，或更优选地，将该抗体分泌至该宿主细胞生长的培养基内而产生。抗体可以使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收。植物宿主细胞包括例如烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、土豆等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌属(Streptomyce)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

此外，本发明的抗体或其抗原结合部分自产生细胞系的表达可以使用许多已知技术增强。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在某些条件下增强表达的常用方法。EP专利0 216 846、0 256 055、0 323 997和0 338 841 整体或部分讨论了该GS系统。

由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体很可能将具有彼此不同的糖基化模式。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的一部分，与所述抗体的糖基化状态无关，和更一般而言，与翻译后修饰的存在或缺乏无关。

药物组合物

本发明的另一方面是药物组合物，其包含本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、双特异性结合分子或抗体组合物作为活性成分(或作为唯一活性成分)。该药物组合物可额外地包含可药用赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物旨在用于改善、预防和/或治疗癌症(例如，本文所述的癌症)。在某些实施方案中，癌症在例如皮肤、肺、肠、结肠、卵巢、脑、前列腺、肾、软组织、造血系统、头和颈、肝、骨、膀胱、乳房、胃、子宫、子宫颈和胰脏的组织中。在某些实施方案中，癌症是黑素瘤、头颈癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、膀胱癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胰脏癌(例如，胰导管腺癌)、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胆管癌、甲状腺癌或睾丸癌。

本发明的药物组合物将包含一种或多种本发明的抗CD73抗体、抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子，例如，一种或两种抗CD73抗体、抗原结合部分或双特异性结合分子。在一些实施方案中，该组合物包含本发明的单一抗CD73抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该组合物包含两种不同本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，药物组合物可以包含至少一种本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分，例如，一种抗CD73抗体或部分，和靶向一个或多个相关细胞表面受体(例如，一个或多个癌症相关受体)的一种或多种额外抗体。

一般而言，本发明的抗体、抗原结合部分和双特异性结合分子适合作为与一种或多种可药用赋形剂(例如，如下文描述的赋形剂)组合的制剂施用。

本文使用术语“赋形剂”以描述除本发明的化合物外的任何成分。赋形剂的选择将较大程度上取决于例如以下因素：特定的施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响和剂型的性质。如本文使用，“可药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，和生理上可相容的类似物。可药用赋形剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，和其组合。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠于该组合物中。可药用物质的额外实例是润湿剂或少量辅助物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强该抗体的货架期或有效性。

本发明的药物组合物和其制备方法对本领域技术人员容易明了。这类组合物和其制备方法可参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack 出版公司，1995)。药物组合物优选地在GMP(良好的制备实务)条件下制备。

本发明的药物组合物可作为单一单位剂量或作为复数个单一单位剂量制备、包装或批量(in bulk)出售。如本文使用，“单位剂量”是离散量的包含预定量活性成分的药物组合物。该活性成分的量一般等于将向受试者施用的活性成分的剂量或此剂量的便利部分(例如，例如，此剂量的一半或三分之一)。

适用于肠胃外施用的药物组合物的制剂通常包含活性成分与可药用载剂(例如无菌水或无菌等渗盐水)的组合。这类制剂可以适用于推注施用(bolus administration)或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以单位剂型 (例如以安瓿或以含有防腐剂的多剂量容器)制备、包装或出售。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性载剂中的乳液、糊剂等。这类制剂可进一步包含一种或多种额外成分，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一些实施方案中，活性成分是以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供，用于以合适的载剂(例如，无菌无热原水)重构，然后肠胃外施用该重构组合物。肠胃外制剂也包括可含有赋形剂(例如盐、糖和缓冲剂) 的水溶液(优选地pH为3至9)，但就一些应用而言，其可更适合调配成无菌非水溶液或调配成干燥形式以组合合适的载剂(例如无菌、无热原水)使用。示例性肠胃外施用形式包括于无菌水溶液(例如，丙二醇或右旋糖水溶液)中的溶液或悬浮液。根据需要，这类剂型可经适当地缓冲。其他有用的可肠胃外施用的制剂包括那些包含活性成分呈微晶形式或为脂质体制备物。用于肠胃外施用的制剂可经调配以立即和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟地、持续地、脉冲地、受控制地、靶向地和程序性地释放。

在一些实施方案中，无菌可注射溶液可以通过将所需量的抗CD73抗体、其抗原结合部分、双特异性结合分子或抗体组合物并入根据需要具有上文列举的成分中的一种成分或组合成分的适当溶剂中，接着过滤灭菌制备。一般而言，分散剂是通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自那些上文列举的所需其他成分的无菌载剂中制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末加来自其预先无菌过滤的溶液的任何额外目的成分。溶液的适当流动性可以例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂维持。可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中包括延迟吸收的物质(例如，单硬脂酸盐或明胶)，和/或通过使用修饰释放包衣(例如，缓释包衣)实现。

本发明的抗体也可鼻内或通过吸入施用，通常呈来自干燥粉末吸入器的干燥粉末的形式(单独、作为混合物或作为混合组分颗粒例如与合适的可药用赋形剂混合)；呈来自加压容器、泵、喷雾、雾化器(优选使用电动流体力学以产生细雾的雾化器)或喷雾器的气溶胶喷雾，使用或不使用合适的推进剂；或呈滴鼻剂。

本发明的抗体和抗体部分也可经调配用于经口途径施用。经口施用可涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道内和/或经颊、经舌或舌下施用，通过该施用，该化合物直接自口腔进入血流内。适用于经口施用的制剂包括固体、半固体和液体系统例如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒的软质或硬质胶囊、液体或粉末；锭剂(包括液体填充的锭剂)；咀嚼物；凝胶；快速分散的剂型；薄膜；卵状小体；喷雾剂；和经颊/黏膜黏附贴剂。液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。这类制剂可作为填料用于软质或硬质胶囊(例如，由明胶或羟丙基甲基纤维素制得) 和通常包含载剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油，和一种或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂也可以通过例如自小袋重构固体制备。

本发明的抗体和组合物的治疗用途

在一些实施方案中，使用本发明的抗CD73抗体和其抗原结合部分、抗CD73 组合物和双特异性结合分子以降低有需要的哺乳动物(例如，人类)中的CD73活性。例如，医师可以通过单独或与其他治疗剂(依序或同时)组合施用本发明的抗 CD73抗体促进患者中的抗肿瘤活性。该抗CD73抗体降低CD73的活性，从而抑制压制该患者的抗肿瘤反应的途径。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分、组合物或双特异性结合分子用于治疗CD73阳性癌症。癌症可在一个或多个组织例如皮肤、肺、肠、结肠、卵巢、脑、前列腺、肾、软组织、造血系统、头和颈、肝、骨、膀胱、乳房、胃、子宫、子宫颈和胰脏中。

在一些实施方案中，由本发明的抗CD73抗体、抗原结合部分、双特异性结合分子和/或抗体组合物治疗的癌症可包括例如黑素瘤(例如，晚期或转移性黑素瘤)、皮肤基底细胞癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、胶质肉瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、肾上腺皮质癌、头颈鳞状细胞癌、口腔癌、唾液腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、食道癌、胃食管连接癌、胃癌、胃肠道癌、原发性腹膜癌、肝癌、肝细胞癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、输卵管癌、膀胱癌、上尿路癌、尿路上皮癌、肾细胞癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、组织细胞瘤、胰脏癌、子宫内膜癌、阑尾癌、晚期默克尔(Merkel)细胞癌、多发性骨髓瘤、肉瘤、绒毛膜癌、红白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、HTLV相关T细胞白血病/淋巴瘤、间皮瘤和实体瘤。该癌症可以例如处于早期、中期、晚期、局部晚期或转移阶段，和对其他治疗剂(例如，其他抗CD73治疗剂)可复发或难治或可能不存在可用的标准疗法。

在一些实施方案中，由本发明的抗CD73抗体、抗原结合部分、组合物和/ 或双特异性结合分子治疗的癌症可包括例如黑素瘤、头颈癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、膀胱癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胰脏癌(例如，胰导管腺癌)、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胆管癌、甲状腺癌和睾丸癌。

“治疗”是指缓解或消除生物疾患和/或其伴随症状中的至少一者的方法。如本文使用，为“缓解”疾病、疾患或病症意指降低该疾病、疾患或病症的症状的严重性和/或发生频率。此外，本文对“治疗”的提及包括对治愈、姑息和预防治疗的提及。

“治疗有效量”是指施用的治疗剂的量将在一定程度上减轻治疗中的疾患的症状中的一者或多者。治疗有效量的抗癌治疗剂可以例如导致延迟的肿瘤生长、肿瘤收缩、增加的存活、癌细胞的消除、减缓或减少的疾病进展、转移的逆转或专业医护人员所希望的其他临床终点。

本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可单独或与一种或多种其他药物或抗体(或作为其任何组合)组合施用。因此，如下文详细描述，本文所述的药物组合物、方法和用途也包含与其他活性剂的组合(共施用)的实施方案。

如本文使用，涉及本发明的抗CD73抗体和其抗原结合部分、抗体组合物和双特异性结合分子与一种或多种其他治疗剂“共施用”、“经共施用”和“组合”的术语欲意指和确实是指且包括下列：

a)当将这类组分调配成向有需要的患者基本上同时释放所述组分的单一剂型时，向该患者同时施用本发明的抗体/抗原结合部分/抗体组合物/双特异性结合分子和治疗剂的此组合，

b)当将这类组分彼此分别调配成有需要的患者基本上同时服用，由此所述组分基本上同时向该患者释放的分开的剂型时，向该患者基本上同时施用本发明的抗体/抗原结合部分/抗体组合物/双特异性结合分子和治疗剂的此组合，

c)当将这类组分彼此分别调配成有需要的患者在连续时间下服用且各施用之间存在显著时间间隔，由此所述组分是在基本上不同的时间向该患者释放的分开的剂型时，向该患者依序施用本发明的抗体/抗原结合部分/抗体组合物/双特异性结合分子和治疗剂的此组合；和

d)当将这类组分一起调配成以受控方式释放该组分，由此它们是在相同和/ 或不同时间向有需要的患者同时、连续和/或重叠释放，其中各部分可以通过相同或不同途径施用的单一剂型时，向该患者依序施用本发明的抗体/抗原结合部分/抗体组合物/双特异性结合分子和治疗剂的此组合。

本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可经施用而无额外的治疗性治疗，即，作为独立疗法(单一疗法)。备选地，使用本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子的治疗可包括至少一种额外的治疗性治疗(组合疗法)，例如，免疫刺激剂、抗癌剂(例如，化疗剂、抗肿瘤药、抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂)或疫苗(例如，肿瘤疫苗)。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可与另一药剂/药物共施用或调配以治疗癌症。该额外的治疗性治疗可以包含例如免疫刺激剂、疫苗、化疗剂、抗肿瘤药、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或放射疗法。在一些实施方案中，该额外的治疗性治疗可以包含不同抗癌抗体。

包含本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子和至少一种其他药物(例如，化疗剂、抗肿瘤或抗血管生成剂)的医药品可作为组合治疗用于在癌症疗法中同时、分别或连续施用。该另一药剂可为适用于治疗所治疗的特定癌症的任何药剂，例如，选自以下药剂：烷化剂，例如，铂衍生物，例如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和/或奥沙利铂(oxaliplatin)；植物生物碱，例如，紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)和/或伊立替康 (irinotecan)；抗肿瘤抗生素，例如，阿霉素(亚德里亚霉素(adriamycin))、道诺霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌、更生霉素 (dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素、藤黄霉素(luteomycin)和/或丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康(topotecan)；抗代谢物，例如，氟尿嘧啶(fluorouracil)和/或其他氟嘧啶；FOLFOX；奥西替尼(osimertinib)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；蒽环霉素(anthracycline)；达卡巴嗪(dacarbazine)；吉西他滨(gemcitabine)；或其任何组合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子重建对另一药剂的反应性。

本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子也可与其他抗癌疗法例如疫苗、细胞因子、酶抑制剂、免疫刺激化合物和T细胞疗法组合使用。在疫苗的情况下，它可为例如含有与治疗中的癌症相关的一种或多种抗原的蛋白质、肽或DNA疫苗或包含树突细胞连同抗原一起的疫苗。合适的细胞因子包括例如IL-2、IFN-γ和GM-CSF。具有抗癌活性的一类酶抑制剂的实例是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，例如，1-甲基-D-色氨酸 (1-D-MT)。过继性T细胞疗法是指涉及扩增或工程化改造患者自身T细胞以识别和攻击其肿瘤的各种免疫疗法技术。

也考虑了本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可结合酪氨酸激酶抑制剂用于辅助疗法中。这些为合成的、主要为喹唑啉衍生的低分子量分子，其例如通过竞争胞内Mg-ATP结合位点，与受体的胞内酪氨酸激酶域相互作用和抑制配体诱导的受体磷酸化。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可与介导免疫系统活化的药剂/药物组合使用，其包括但不限于调节A2AR、 A1AR、A2BR、A3AR、ADA、ALP、BTLA、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、CD27、 CD28、CD39、CD40、CD47、CD55、CD122、CD137、CD160、CGEN-15049、 CHK1、CHK2、CTLA-3、CEACAM(例如，CEACAM-1和/或CEACAM-5)、 GAL9、GITR、HVEM、LAG-3、LY108、LAIR1、ICOS、IDO、KIR、NKG2A、 PAP、PD-1/PD-L1/PD-L2、OX40、TIGIT、TIM-3、TGFR-β、TNFR2、VISTA、 LILRB2、CMTM6和/或2B4的表达或活性的药剂。在一些实施方案中，该药剂调节CD39、NKG2A、LAG-3、TIM-3或TNFR2的表达。在某些实施方案中，该药剂是小分子抑制剂。在某些实施方案中，该药剂是结合至上文分子之一的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，该药剂是抗PD-L1抗体(例如，杜鲁伐单抗(durvalumab)或阿妥珠单抗(atezolizumab))、抗PD-1抗体或抗CTLA-4 抗体。也考虑了本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可与细胞因子(例如，IL-1、IL-2、IL-12、IL-15或IL-21)、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂等组合使用。

在某些实施方案中，本发明的抗体和抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可与腺苷能途径的另一抑制剂组合施用，另一抑制剂可靶向例如 CD73、CD39或CD38或选自A1R、A2AR、A2BR和/或A3R的腺苷受体。这类抑制剂包括但不限于AR1抑制剂(例如，DPCPX、SCH58261和FSPTP)、A2AR 抑制剂(例如，PBF-509、CPI-444、AZD4635、ZM241385、AB928、伊曲茶碱 (istradefylline)、SYN-115、ANR94、PSB1115、PSB603和NIR178)、A2B抑制剂(例如，miR-128b、ATL801、氨茶碱(aminophylline)、MRS1754、IPDX和 PBF-1129)和A3R抑制剂(例如，MRS1191、MRS1220、MRS1523和CF-102)。这类抑制剂的其他实例包括其他抗CD73抗体和抗CD39和抗CD38抗体。在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或抗体组合物可与A001421、APCP、欧乐利尤单抗、CPX-006/CPI-006、CPX-016、 NZV-930、BMS-986179、IPH53、PT199、杜鲁伐单抗、阿妥珠单抗、达拉他单抗或伊沙妥昔单抗组合施用。

本发明也考虑了使用本文所述的抗CD73抗体或抗原结合部分的序列(例如，六个CDR或VH和VL序列)以制备嵌合抗原受体，其可用于CAR-T技术中。

应理解本发明的抗体和其抗原结合部分、抗体组合物和双特异性结合分子可用于如本文所述的治疗方法中，可用于如本文所述的治疗中、和/或可用于制备用于如本文所述的治疗的药物。本发明也提供包含本文所述的抗体和其抗原结合部分、抗体组合物和双特异性结合分子的药盒和制品。

剂量和施用途径

本发明的抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可以施用有效量以治疗所治疗的病症，即，以达成所需结果所必需的剂量和时间期间施用。治疗有效量可根据例如以下的因素变化：所治疗的特定病症、患者的年龄、性别和体重，和该抗体是否作为独立治疗施用或与一种或多种额外抗癌治疗组合施用。

可以调整剂量方案，以提供最佳的所需反应。例如，可施用单次推注、可随时间施用数个分开剂量、或可根据治疗情况的紧急程度指示依比例减少或增加剂量。将肠胃外组合物调配成剂量单位形式以便于剂量的施用和均匀性是尤其有利的。如本文使用，剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗的患者/受试者的物理离散单元；各单元含有经计算以产生与所需医药载剂相关联的所需治疗效应的预定量的活性化合物。针对本发明的剂量单位形式的说明书一般由以下规定和直接取决于以下：(a)治疗剂的独特特性和待实现的特定治疗或预防效应，和(b)化合此活性化合物以治疗个体的敏感性的领域中固有的局限性。

因此，本领域技术人员知晓基于本文提供的公开内容，根据治疗领域中熟知的方法调整剂量和给药方案。即，可容易地确立最大可耐受剂量，且也可确定向患者提供可检测治疗益处的有效量，可确定用于施用各药物以向该患者提供可检测治疗益处的时间要求。因此，尽管本文例示某些剂量和施用方案，但这类实例不以任何方式限制可向患者提供以实践本发明的剂量和施用方案。

应注意剂量值可随待缓解的病症的类型和严重性变化，且可包括单剂量或多剂量。应进一步了解就任何特定受试者而言，具体剂量方案应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断经时调整，本文列举的剂量范围仅是示例性的且无意限制具体化组合物的范围或实务。此外，使用本发明的组合物的剂量方案可基于各种因素，包括疾病的类型、患者的年龄、重量、性别、医学病症、该病症的严重性、施用途径和采用的特定抗体。因此，该剂量方案可广泛变化，但可以使用标准方法例行性确定。例如，剂量可基于药物动力学或药效学参数加以调整，药物动力学或药效学参数可包括临床效应例如毒性效应和/或实验室数值。因此，本发明包含如由本领域技术人员确定的患者内剂量递增。适当的剂量和方案的确定是相关领域中熟知的且在提供本文公开的教导后，将为本领域技术人员了解。

用于肿瘤疗法的有效量可由其稳定患者的疾病进展和/或改善症状、和优选地逆转疾病进展(例如通过减小肿瘤尺寸)的能力测量。本发明的抗体、抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子抑制癌症的能力可由体外测定法(例如，如实例中描述的体外测定法)，以及在预测人类肿瘤中的功效的合适动物模型来评估。将选择合适的剂量方案以在各特定情况下提供优化治疗反应，例如，作为单次推注或作为连续输注施用，且可根据各情况的紧急程度所指示来调整剂量。

本发明的抗体或其抗原结合部分、抗体组合物或双特异性结合分子可以通过本领域接受的用于施用肽、蛋白质或抗体的任何方法来施用，且通常适用于肠胃外施用。如本文使用，“肠胃外施用”包括特征在于对受试者的组织进行物理破坏并通过该组织中的破口进行施用的任何施用途径，因此一般导致直接施用至血流、肌肉或内部器官内。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射施用、通过手术切口施用、通过组织穿透性非手术伤口施用等。特别地，考虑了肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、脑池内、静脉内、动脉内、鞘内、尿道内、颅内、肿瘤内和滑膜内注射或输注。特定实施方案包括静脉内和皮下途径。

诊断用途和组合物

本发明的抗体和抗原结合部分也用于诊断方法(例如，体外、离体)中。例如，该抗体和抗原结合部分可用于检测和/或测量来自患者的样本(例如，组织样本或体液样本，例如炎性渗出液、血液、血清、肠液、唾液或尿液)中的CD73水平。合适的检测和测量方法包括免疫学方法例如流式细胞术、酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、化学发光测定法、放射免疫测定法和免疫组织学。本发明进一步涵盖包含本文所述的抗体和抗原结合部分的试剂盒(例如，诊断试剂盒)。

制品和药盒

本发明也提供制品，例如药盒，其包含含有本文所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分、组合物或双特异性结合分子，任选地额外的生物活性分子(例如，另一治疗剂)的药物组合物的一个或多个容器(例如，单一使用容器或多次使用容器)，和使用说明。抗体或抗原结合部分、组合物或双特异性结合分子，和任选的额外生物活性分子可分别包装在合适的包装例如由非反应性玻璃或塑料制成的小瓶或安瓿中。在某些实施方案中，该小瓶或安瓿容纳抗体或抗原结合部分、组合物或双特异性结合分子和任选地生物活性分子的浓缩储备液(例如2x、5x、 10x或更大)。在某些实施方案中，制品例如药盒包括用于施用抗体或抗原结合部分、组合物或双特异性结合分子和/或生物活性分子的医疗装置(例如，注射器和针头)；和/或适当的稀释剂(例如，无菌水和生理盐水)。本发明也包括用于制备所述制品的方法。

除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有一般技术者通常了解的含义。尽管类似或等同于那些本文描述的方法和材料也可用于本发明的实务或测试中，但下文描述了示例性方法和材料。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

一般而言，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、药用和医药化学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法和技术是那些本领域熟知的和常用的。如本领域通常实施的或如本文描述的那样，根据制备商的说明书进行酶反应和纯化技术。

此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数和复数术语应包括单数。在整个说明书和实施方案中，词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或例如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式应理解为暗示包括所述及的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

本文提及的所有出版物和其他参考文献以全文引用的方式并入本文作为参考。尽管本文引用一些文献，但此引用不构成承认这类文献中的任何一者形成本领域的一般常识的一部分。

为了更好地理解本发明，阐述下列实施例。这些实施例仅用于阐述的目的且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：自大鼠B细胞克隆抗CD73抗体

材料和方法

自

大鼠衍生的抗体库分离抗人CD73抗体(Osborn等人，J Immunol.190(4):1481-90(2013))，

大鼠为一种来自Ligand Pharmaceuticals Inc.的转基因大鼠品系，其产生具有完全人独特型的抗体。自单细胞分选的分泌抗体的B细胞(ASC)克隆大鼠衍生的抗体基因通过Symplex^TM抗体发现技术进行 (Meijer等人，J Mol Biol 358(3):764-72(2006))。

将以IgG₁-LALA形式编码完全人免疫球蛋白的抗体库构建体(参见下文)转染至HEK293细胞内。使用流式细胞术以高通量形式筛选细胞上清液中与表达于CHO细胞表面上的CD73的结合。通过DNA测序分析CD73反应性克隆并提取编码抗体的DNA序列。表达选择的抗体克隆并如下文所述地进行功能测试。

将通过在编码抗体的cDNA片段的Symplex^TM克隆中使用简并引物引入的重链和轻链的氨基末端的错义突变校正回种系序列。表1显示称为21028、21046、 21127和21163的种系抗体的重链和轻链可变结构域核苷酸序列。校正方法涉及种系的氨基末端序列校正和密码子使用优化。通过blast同源搜索重链和轻链可变区识别与人类种系序列匹配的靶标。

抗体21028、21046、21127和21163的可变结构域、恒定区和互补决定区(CDR) 的蛋白序列分别显示于表2、表3和表4中。

结果

表1显示编码抗体21028、21046、21127和21163的可变结构域的核苷酸序列。

表1：抗体21028、21046、21127和21163的可变结构域核苷酸序列：

表2显示抗体21028、21046、21127和21163的推导的氨基酸序列。CDR 是粗体/带下划线。

表2：21028、21046、21127和21163的可变结构域氨基酸序列：

表3显示重链和轻链恒定区氨基酸序列(分别为CH和CL)。“IgG₁LALA”是指重链中存在“LALA”突变(L234A/L235A，根据Kabat编号方案编号)，已知其减少IgG₁抗体Fc区的效应子功能(Hezareh等人，J Virol.75(24):12161-68 (2001)；Hessell等人，Nature 449(7158):101-04(2007))。

表3：抗体21028、21046、21127和21163的恒定区氨基酸序列：

表4显示抗体21028、21046、21127和21163的重链和轻链CDR氨基酸序列，其中所述CDR根据IMGT系统定义。

表4：抗体21028、21046、21127和21163的CDR氨基酸序列

SID:SEQ ID NO:

表5显示抗体21028、21046、21127和21163的SEQ ID NO信息。除非本文另有规定，否则所述序列为氨基酸序列。

表5：抗体21028、21046、21127和21163的SEQ ID NO

nt：核苷酸

aa：氨基酸

实施例2：在可溶性CD73活性测定法中筛选抗CD73抗体

评估一组抗CD73抗体抑制可溶性重组CD73的酶活性的能力。在37℃将抗CD73抗体以10μg/mL的浓度与重组CD73(SinoBiological Incorporated)、AMP 和ATP培养30分钟。通过使用

2.0(Promega公司)测量ATP检测的AMP抑制研究CD73活性，如Sachsenmeier等人，Journal of Biomolecular Screening 17(7):993-998(2012)中描述。

使用抗CD73抗体处理后的CD73酶活性的抑制参见图1。显然，使用不同抗CD73抗体处理后的CD73活性变化很大，显示一些抗体在此测定法中无功能性，而其他抗体则强烈抑制CD73活性。

实施例3：在基于细胞的CD73活性测定法中筛选抗CD73抗体

评估一组抗CD73抗体对表达在癌细胞系上的CD73活性的抑制能力。将抗 CD73抗体以10μg/mL浓度与表达CD73的细胞系在37℃培养30分钟，接着添加CD73底物AMP，并在37℃再培养3小时。探讨CD73活性时，添加ATP 至上清液，使用

2.0(Promega公司)测量ATP检测的AMP抑制性，如Sachsenmeier等人(同上)中描述。

使用抗CD73抗体处理后，表达在两种不同癌细胞系上的CD73的活性示于图2中。显然，使用不同抗CD73抗体处理后的CD73活性变化很大；一些抗体在此测定法中无功能性，而其他抗体强烈抑制CD73活性。特别地，相同的十种抗体在两种细胞系中均显示最大活性。

实施例4：克隆抗CD73参考抗体类似物

材料和方法

从本文列举的专利或专利申请案获得表6中编码抗体类似物的重链和轻链可变结构域的氨基酸序列。用人类密码子使用，将蛋白质序列反向翻译为DNA 序列。经基因合成相应的DNA序列并将其克隆至含有人类重链或轻链恒定区的表达载体内，导致全长抗体链的表达。选择的用于表达的人抗体同种型与根据需要引入Fc区内的额外突变一起列举在抗体形式栏中。使用标准蛋白质表达系统，用所得表达质粒转染CHO细胞。使用标准蛋白质A纯化柱层析术纯化相应的抗体上清液。

表6：基因合成的抗体类似物和相应抗体形式的列表

实施例5：抗CD73抗体与用人类或食蟹猴CD73蛋白转染的CHO-S细胞的直接结合

评估抗CD73抗体21028、21046、21127和21163对表达于CHO-S细胞上的人类或食蟹猴CD73蛋白的结合，并与欧乐利尤单抗类似物的结合进行比较。

在4℃将抗CD73抗体与瞬时表达人类或食蟹猴CD73的仓鼠CHO-S细胞系培养30分钟。将该细胞洗涤两次和接着与缀合有AF647的二级抗人类IgG (H+L)抗体再培养20分钟。洗涤步骤后，使用高通量流式细胞术iQue Screener PLUS(Sartorius)测量各孔中AF647信号的几何平均值来检测抗体结合。一式三份分析每种浓度和各抗体产生12点滴定曲线。

抗体对表达于细胞上的人类或食蟹猴CD73的结合曲线显示于图3中。经分析的抗体以不同的效价和功效结合至细胞展示的人和食蟹猴CD73蛋白。特别地，mAb 21127以测试抗体的最高效价结合至人和食蟹猴CD73。

实施例6：抗体和Fab片段与人和食蟹猴CD73胞外结构域(ECD)的亲和力的测量

此实施例显示了如通过表面等离子体共振(SPR)测量，抗CD73Fab片段和抗体对重组人和食蟹猴CD73胞外结构域(ECD)的结合。

材料和方法

通过表面等离子体共振(SPR)，使用连续流动微量点样仪(CFM,WasatchMicrofluidics,Salt Lake City,US)与IBIS MX96 SPR仪器(IBIS Technologies,TheNetherlands)的组合进行抗CD73mAb和Fab片段的动力学结合分析。合成编码人和食蟹猴CD73的胞外结构域的CD73 cDNA并将其各克隆至含有CMV启动子和用于His标签的CD73 ECD的C端6x组氨酸序列(SEQ ID NO：45)或人类 IgG1 Fc序列(AA P101-K330)的载体内，导致IgG1 Fc C端融合至经克隆的CD73 ECD。使用ExpiCHO^TM表达系统瞬时表达带His标签的构建体和Fc融合构建体并分别通过标准Ni-NTA层析术或标准MabSelect^TMSuRe^TM程序纯化。通过以 GingisKHAN酶消化全长IgG1抗体，使用由Genovis(Sweden)提供的试剂盒产生抗CD73Fab片段。通过使用CFM捕获带Fc标签的抗原于G-a-hu-IgG Fc

上15分钟测量Fab片段的亲和力。点样后，将

放置于IBIS MX96生物传感器中并用SensEyeFixIt试剂盒固定固定化抗原。通过注射浓度自0.8nM增加至300nM的单体Fab片段进行动力学分析。在Fab片段注射的各周期后，用10mM甘氨酸pH 3，10％甘油再生表面。进行15分钟Fab结合和进行15分钟抗原解离。通过使用连续流动微量点样仪(CFM,WasatchMicrofluidics,Salt Lake City,US)，捕获mAb于G-a-hu-IgG Fc

(Ssens BV,The Netherlands)上15分钟测量全长单克隆抗体(mAb)的亲和力。点样后，将 SensEye停驻于IBIS MX96中并用SensEye FixIt试剂盒(Ssens BV,The Netherlands)固定经点样的mAb。通过注射自0.16nM增加至10nM浓度的带His 标签的抗原来施加呈2倍稀释度的动力学滴定系列进行动力学分析。在下一周期的食蟹猴抗原注射前用100mM H₃PO₄，pH 3再生表面。进行15分钟MAb 结合和进行45分钟抗原解离。将记录的结合反应拟合至简单朗缪尔(Langmuir) 1:1结合模型，使用Scrubber 2.0软件计算结合速率(k_on或k_a)、解离速率(k_off或 k_d)和亲和力(K_D)常数。将结合动力学参数测量为六个独立测量点的平均值。

结果

抗CD73Fab片段和全长抗体的结合亲和力和动力学参数分别显示于表7和表8中。全长抗体以亚纳摩尔范围内的高亲和力结合人CD73。所有抗体均以与堪比参考抗体(11E1、欧乐利尤单抗和CPX006的类似物)的结合动力学识别人和食蟹猴CD73。所有抗体的特征在于非常缓慢的解离速率常数，有助于测量的高亲和力。Fab片段的单价结合亲和力比相应全长抗体的单价结合亲和力弱20至 245倍。解离速率(kd)受抗体形式变化的强烈影响，其中Fab片段显示比完整抗体快得多的自CD73解离。

完整抗体和Fab片段的结合动力学的差异表明抗体结合CD73同型二聚体，且针对全长抗体测量的高亲和力是由于亲合力效应。已知CD73作为非共价同型二聚体存在(Knapp等人，Structure 20(12):2161-2173(2012))，和先前已发现11E1 和欧乐利尤单抗类似物的结合取决于对如本文所述的全长抗体与Fab片段之间的结合动力学具有类似差异的CD73同型二聚体的二价结合(Perrot,Cell Reports 27(8):2411-2425(2019))。

抗CD73抗体和Fab片段的SPR分析显示抗CD73抗体取决于对二聚CD73 的二价结合，并且当结合至CD73同型二聚体时，本文例示的全长抗体的结合亲和力堪比参考mAb的结合亲和力。

表7：如通过SPR测量，抗CD73Fab片段对人类(Hs)和食蟹猴(Cy)CD73 ECD 的结合动力学

表8：如通过SPR测量，抗CD73抗体对人类(Hs)和食蟹猴(Cy)CD73 ECD 的结合动力学

实施例7：抗CD73抗体的表位分仓(binning)

此实施例描述基于成对竞争模式将抗CD73抗体分组为表位仓。属于不同表位仓的抗体识别CD73的ECD上的不同表位。

材料和方法

成对抗体竞争的研究是通过SPR使用IBIS-MX96仪器(IBIS,Netherlands)进行。将抗CD73抗体在PBS中稀释至3μg/mL并通过使用连续流动微量点样仪捕获15分钟点样至G-a-hu-IgG Fc

上，接着由赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)封闭残余的结合位点并用SensEye FixIt试剂盒(IBIS,Netherlands)化学交联。准备传感器后，使用经典的夹心测定法进行抗体竞争分析。将CD73-His ECD 抗原稀释于PBS、0.05％Tween 20和200nM赫赛汀运行缓冲剂中，然后以10nM 浓度注射和用抗CD73抗体的缀合阵列捕获。接着，进行在运行缓冲剂中分别稀释至100nM的各CD73抗体的个别注射以建立抗体竞争模式。通过表位分仓2.0 (Wasatch,USA)分析数据。

结果

16种抗CD73抗体的竞争模式显示于图4中。测试的抗CD73抗体分组为四种重叠的主要表位仓：1、2、3和4。仓1包括欧乐利尤单抗和11E1类似物，其彼此交叉阻断。欧乐利尤单抗和11E1抗体已显示在N端结构域的顶部和CD73 的催化位点对面处结合重叠的表位(Geoghegan等人，MABS 8(3):454-467(2016) 和Perrot等人，Cell Reports 27:2411-2425(2019))。仓1中的所有抗体交叉阻断分组于仓2中的抗体。仓2包括抗体21385、21127和21163，其显示可比的竞争模式，表明所述抗体结合类似表位。仓2中的抗体交叉阻断除仓4中的抗体外的所有测试抗体。仓4抗体可分为两个亚仓：与仓3中的一种或多种抗体竞争的仓4a和4b。抗体21046(仓4a)和CPX006类似物(仓4b)与仓3中的不同抗体竞争，显示这两种抗体具有密切相关但不相同的结合表位。

总之，抗体21127和21163(仓2)结合CD73的独特表位，所述表位与11E1 和欧乐利尤单抗类似物的表位(仓1)有一些重叠。抗体21127和21163的表位不同于CPX006类似物的表位(仓4)。抗体21046(仓4a)结合与CPX006类似物表位(仓4b)类似的表位，但不同于抗体21127和21163的表位(仓2)和11E1和欧乐利尤单抗类似物的表位(仓1)。

实施例8：通过CD73诱变的抗CD73抗体的表位定位

此实施例阐述如何通过测量对94种不同CD73突变体的结合亲和力和动力学，将抗体21127、21163和21046的结合表位分为线性表位和各接触残基。

材料和方法

自UniProt(登录编号分别为P21589和P21588)下载人和大鼠(褐家鼠(Rattusnorvegicus))CD73的蛋白序列。自NCBI(分别为XP_005552488.1和 XP_004940453.1)下载食蟹猴(Macaca fascicularis)和鸡(原鸡(Gallus gallus))CD73 的全长蛋白序列。公开可获得的CD73结构PDB 4H2F(开放)、4H2G(开放)和 4H2I(关闭)用于定位表面暴露的氨基酸残基。将人类与大鼠CD73之间不同的表面暴露的残基位置突变为丙氨酸。为了定位线性抗体表位，产生CD73嵌合蛋白，其中人CD73 ECD序列中的10个氨基酸按重叠5个氨基酸的区段依序交换为鸡序列。

合成编码人CD73胞外结构域的cDNA并将其克隆至含有CMV启动子和人类Ig Fc序列(残基P101至K330)的载体内，导致Ig Fc C端融合至经克隆的CD73 ECD。野生型(wt)和经突变的人CD73Fc融合构建体是通过标准基因合成技术产生的，且蛋白质是使用ExpiCHO^TM表达系统在2mL培养物中瞬时表达。

收获人CD73Fc融合构建体后，通过表面等离子体共振(SPR)测试上清液中对抗CD73 Fab的结合。使用连续流动微量点样仪(CFM,Wasatch Microfluidics, Salt LakeCity,US)将含有CD73融合蛋白的培养上清液固定在G-a-hu-lgG Fc

(Ssens BV,The Netherlands)上15分钟。点样后，将

放置于IBIS MX96生物传感器中并使用FixIT试剂盒(Ssens BV,The Netherlands)将捕获的蛋白质固定在表面上。通过施加动力学滴定系列进行动力学分析，其中本发明的抗体的单体Fab片段以自0.8nM增加至500nM的浓度注射。在Fab片段注射的各周期之后，用10mM甘氨酸pH 3，10％甘油再生表面。进行15分钟Fab 结合和进行15分钟抗原解离。将记录的结合反应拟合至简单朗缪尔1:1结合模型，使用Scrubber 2软件以计算结合速率(k_on或k_a)、解离速率(k_off或k_d)和亲和力(K_D)常数。

结果

使用嵌合受体构建体定位由抗体21127、21163和21046和11E1、欧乐利尤单抗和CPX006类似物识别的CD73的表位，其中人CD73序列的10个氨基酸区段经鸡序列置换；或通过丙氨酸扫描，其中在人类与大鼠CD73之间不同的表面曝露氨基酸经突变为丙氨酸。通过SPR测量抗体对野生型CD73和突变体的结合亲和力，且相较于wt降低或偏离1:1结合模型至少5倍亲和力的截止值系用于发现显著损失对抗CD73抗体的结合的构建体(表9)。

表9：抗体21127、21163和21046和11E1、欧乐利尤单抗和CPX006类似物的结合特异性的总结

鉴定的线性表位和接触残基以其开放状态定位在CD73同型二聚体的晶体结构上(图5)。发现由抗体21127、21163和21046和11E1、欧乐利尤单抗和 CPX006类似物识别的表位均在CD73的N端结构域上(图5)。发现抗体21127 和21163和11E1和欧乐利尤单抗类似物的表位位于与CD73同型二聚体的二聚化界面垂直的表面上和相对于催化中心位于相对侧(图5，A小图、B小图、D 小图和E小图)。发现四种抗体的表位的不同的处在于结合不同的接触残基和线性表位。结合至CD73顶部的表面的抗体可以通过将酶锁定在开放、非活性构象，防止转变为封闭的活性状态来阻断酶活性(Perrot等人，Cell Reports 27:2411-2425(2019))。

发现抗体21046和CPX006类似物的表位在N端结构域的前面，正好在 CD73的催化中心上方(图5，C小图和F小图)。这两种抗体就识别的线性表位和接触残基而言是不同的。

总而言之，在单一氨基酸分辨率下的表位定位显示了示例的抗CD73抗体各具有不同的结合表位。抗体21127和21163结合至CD73N端结构域的顶部上的类似表位；这些表位不同于11E1、欧乐利尤单抗和CPX006类似物的表位。抗体21046和CPX006类似物结合CD73N端结构域前面的重叠但仍不同的表位。

实施例9：溶液中形成的抗体/CD73复合物的化学计量

此实施例描述通过SEC-MALS测量的在溶液中形成的抗体/CD73 ECD复合物的大小。

材料和方法

以不同的比率并分别分析抗CD73抗体和带His标签的CD73，以分析在 CD73同型二聚体与抗CD73抗体之间形成的复合物的大小。通过将900pmol CD73-His与900、450、90或0pmol稀释于PBS,pH 7.4中的抗体混合制备样本。在室温将样本温育30min，接着使用UHPLCUltiMate 3000(Thermo Scientific) 和SEC X-Bridge管柱(Waters)以1.2mL/min的流动速率分离。样本运行缓冲剂为0.01M柠檬酸盐、250mM L-精氨酸HCl，pH 6.0。HPLC分离后，使用 MiniDAWN TREOS MALS检测器(Wyatt)和Optilab T-rEX折射率检测器(Wyatt) 分析所有样本。使用GraphPad Prism产生数据图。

结果

抗体对CD73同型二聚体的二价结合可将酶锁定在非活性构象(Geoghegan 等人，MABS 8(3):454-467(2016)和Perrot等人，Cell Reports 27:2411-2425 (2019))。阻断机制可为通过CD73同型二聚体的交联或通过在非活性状态下结合单一CD73二聚体。为表征溶液中形成的抗体/CD73复合物的化学计量，通过 SEC-MALS测定蛋白质复合物的大小。1:1抗体/CD73同型二聚体复合物的大小在270至280kDa的范围内，如自抗体和CD73同型二聚体的各分子量(分别约 150和125kDa)计算。图6A和6B和表10显示针对在各种分子比率下结合至CD73同型二聚体的抗体21127、21163和21046和11E1、欧乐利尤单抗和CPX006 类似物形成的复合物的SEC-MALS图和大小。CD73和各抗体的分别运行显示与蛋白质的预期大小匹配的单分散峰和确认不存在聚积物(图6A和6B，虚线)。结合至CD73的抗体21127的SEC-MALS图显示一个主峰(峰2)，平均大小为 276kDa，对应于预测的1:1 21127:CD73同型二聚体复合物的大小，和一个较小峰(峰1)，对应于过量的21127或CD73二聚体。抗体21163和11E1和CPX006 类似物主要形成1:1复合物，但倾向于在最高抗体:CD73比率(1:1)下形成更高阶复合物。对CPX006和11E1类似物而言，多分散的更高阶复合物是最明显的。抗体21046和欧乐利尤单抗类似物形成大复合物，指示这些抗体主要交联分别的CD73二聚体，其也已针对欧乐利尤单抗(MEDI9447)显示(Geoghegan等人， MABS 8(3):454-467(2016))。

表10：如通过SEC-MALS测量，当在各种比率下混合CD73和抗CD73抗体时形成的复合物的分子质量(MW，kDa)

如自右至左计数，表10中的峰对应于图6A和6B中的层析图上可见的峰1 至4。峰1对应于未结合/过量的CD73同型二聚体(～125kDa)或未结合/过量的抗体(～150kDa)。峰2至4对应于各种大小和化学计量的mAb:CD73复合物，其中～275kDa的复合物大小表示1:1的化学计量。

如表10和图6A和6B显示，抗体21127以独立于CD73浓度产生1:1复合物的方式结合CD73同型二聚体上的表位。抗体21163和11E1和CPX006类似物主要与该CD73二聚体结合成1:1复合物，但也显示在各种程度下形成更高阶复合物的趋势。抗体21046和欧乐利尤单抗类似物与CD73同型二聚体仅结合成低聚物复合物，指示多个CD73二聚体的交联。

实施例10：抗CD73抗体在可溶性CD73活性测定法中的功能性

在可溶性CD73活性测定法中更详细地评估抗CD73抗体21028、21046、 21127和21163抑制可溶性重组CD73的酶活性的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。在37℃将抗CD73抗体与重组CD73、AMP和ATP温育2小时。通过使用

2.0(Promega公司)测量ATP检测的AMP抑制来研究 CD73活性，如Sachsenmeier等人(同上)中描述。

使用指示浓度的抗CD73抗体或欧乐利尤单抗类似物处理后的CD73酶活性的抑制显示于图7中。显然，抗CD73抗体的抑制功能是浓度依赖性的，且尽管效价和功效不同，但所有抗CD73抗体均抑制CD73活性。此外，该欧乐利尤单抗类似物在较高抗体浓度下不太有效抑制CD73酶活性。MedImmune已针对欧乐利尤单抗(原名MEDI9447)公开了类似结果(Geoghegan等人，MABS 8(3):454-467(2016))。相较于中间浓度，抗体21028和21046在较高浓度下也略小地抑制CD73酶活性。相反，在高于约3μg/mL的所有浓度下，抗体21127 和21163显示对CD73酶活性的最大抑制。

实施例11：抗CD73抗体在基于细胞的CD73活性测定法中的功能性

更详细地评估抗CD73抗体21028、21046、21127和21163抑制表达于细胞上的CD73的活性的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。在37℃将抗CD73 抗体与表达CD73的人类细胞系(Calu-6和H292)或表达CD73的食蟹猴细胞系 (Cynom-K1)温育30分钟，接着添加CD73底物AMP并在37℃再温育3小时。通过将ATP添加至上清液并使用

2.0(Promega公司)测量ATP检测的AMP抑制来研究CD73活性，如Sachsenmeier等人(同上)中描述。

使用不同抗CD73抗体处理后的CD73活性的抑制显示于图8中。显然，抗 CD73抗体的抑制功能是浓度依赖性的，且尽管效价和功效不同，但所有抗体均抑制人和食蟹猴CD73活性。抗体21127和21163在两种人类细胞系Calu-6和 H292中均显示最高功效，但在所有三种细胞系中，所有四种测试抗体均明显优于欧乐利尤单抗类似物。

实施例12：抗CD73抗体在长期基于细胞的CD73活性测定法中的功能性

在长期基于细胞的测定法中更详细地评估抗CD73抗体21028、21046、21127 和21163抑制表达于细胞系上的CD73的活性的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。在37℃将抗CD73抗体与表达CD73的人类细胞系H292温育30分钟，接着添加CD73底物AMP并在37℃再温育3、6或24小时。通过将ATP 添加至上清液并使用

使用不同抗CD73抗体处理后的CD73活性的抑制显示于图9中。显然，抗 CD73抗体的抑制功能是浓度依赖性的，且尽管效价和功效不同，但所有抗体均抑制CD73活性。特别地，将细胞与抗体温育长达24小时进一步区分抗体21127 和21163与欧乐利尤单抗类似物(和测试的其他两种抗CD73抗体)。

实施例13：抗CD73抗体对癌细胞系的功效

评估抗CD73抗体21127、21046、21163抑制表达于代表宽范围的CD73 表达和活性水平的一大组癌细胞系上的CD73的活性的能力。如表11中所述，该细胞组跨越多个起源组织的数种癌症适应症。

材料和方法

在37℃将抗CD73抗体以25μg/mL的浓度与表达CD73的细胞系温育30 分钟，接着添加CD73底物AMP并在37℃再温育3小时。通过将ATP添加至上清液并使用

2.0(Promega公司)测量ATP检测的AMP抑制来评估细胞CD73活性，如Sachsenmeier等人(同上)中描述。通过发光检测CD73活性。

结果

抗CD73抗体对表达于20种不同癌细胞系上的CD73活性的影响显示在图 10中。显然，使用不同抗CD73抗体处理后的CD73活性不同。在例如Calu-6、 NCI-H1775、KYSE-30和Capan-2细胞系中可见，一些抗体(21046和欧乐利尤单抗类似物)在较低细胞CD73活性水平显示一定的抑制CD73的能力，但在最高活性水平却无法抑制该酶，而其他抗体(21127和21163)即使在最高活性水平也强烈抑制CD73活性。

表11：细胞系和起源组织的列表

实施例14：抗CD73抗体活性在基于细胞的存活率测定法中的体外测试

此实施例描述了：在存活率测定法中，使用在300μM AMP的存在下生长的两种癌细胞系，抗体21127的体外功能表征。

材料和方法

体外评估抗体直接抑制三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468的存活率(存活和/或增殖)的能力。将细胞以1000个细胞/孔接种于384孔板中的补充有2％FBS和1％P/S的RPMI 1640Glutamax(MDA-MB-231) 或DMEM(MDA-MB-468)培养基中，并在37℃在加湿培养器中在300μM AMP (单磷酸腺苷，Sigma-Aldrich)的存在下与自25μg/mL滴定的抗体温育四天。按照制备商的说明书，使用WST-1细胞增殖试剂(Roche)定量细胞存活率。

结果

显然，21127和欧乐利尤单抗类似物关于功能读数是不同的(图11)。抗体 21127对两种细胞系均显示明显的影响，相较于未处理的细胞，MBA-MB-231 减少至约60％活细胞，和MBA-MB-468减少至0％活细胞(即，相对于培养基背景无可测量活细胞)。欧乐利尤单抗类似物对MBA-MB-231细胞系的存活率未显示显著的影响，而MBA-MB-468在一定程度上受影响，活细胞数相较于未处理的细胞减少至约70至80％。

在源自其他组织的癌细胞系中可预期类似效应。

实施例15：由抗CD73抗体抑制表达于来自健康人类供体的原代CD4⁺和 CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞上的CD73

评估抗CD73抗体抑制表达于来自健康人类供体的原代CD4⁺和CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞上的CD73的活性的能力。

材料和方法

根据制备商的使用说明书(Miltenyi Biotec)，使用具有相关特异性的磁性(MACS)珠自血沉棕黄层的PBMC(外周血单个核细胞)分离原代CD4⁺和CD8⁺T 细胞和CD19⁺B细胞系。在37℃将50至0.003μg/mL浓度的抗CD73抗体的四倍稀释滴定液与经分离的原代细胞温育30分钟，接着添加CD73底物AMP，并在37℃再温育20小时(CD19⁺B细胞)或40小时(CD4⁺和CD8⁺T细胞)。通过将 ATP添加至上清液并使用

2.0(Promega公司)测量ATP检测的AMP 抑制来评估CD73活性，如Sachsenmeier等人(同上)中描述。

结果

使用抗CD73抗体处理后，表达于原代CD4⁺和CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞上的CD73的活性显示于图12中。显然，使用抗体21127和欧乐利尤单抗类似物处理后的CD73活性差异很大。较高浓度的抗体21127在所有原代细胞类型中均显示CD73活性的几乎完全抑制，而欧乐利尤单抗类似物显示CD19⁺B细胞和 CD8⁺T细胞中的CD73活性的非常有限抑制以及CD4⁺T细胞中的仅部分抑制。欧乐利尤单抗类似物抑制CD73活性的能力与CD73表达的水平相关，因为来自健康供体的外周血CD4⁺T细胞平均具有有限的CD73表达，而CD19⁺B细胞平均表达高水平的CD73和CD8⁺T细胞平均表达中等水平的CD73(Allard等人，Immunol Rev 276(1):121-144(2017))。

实施例16：抗CD73抗体在T细胞增殖测定法中的功能性

在体外测定法中评估抗CD73抗体21028、21046、21127和21163抑制表达于CD4⁺T细胞上的CD73的活性的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。自健康供体分离CD4⁺T细胞并用抗CD3/CD28珠(Thermo Fisher Scientific)、AMP 和抗CD73抗体活化48小时，接着添加3H-胸苷(PerkinElmer公司)，再历时24 小时。将T细胞增殖测量为3H-胸苷掺入并归一化为未经AMP处理的对照。

使用不同的抗CD73抗体处理后的T细胞增殖显示于图13中。显然，抗 CD73抗体对T细胞增殖的刺激功能是浓度依赖性的，尽管效价和功效不同，但所有抗体均刺激T细胞增殖。除欧乐利尤单抗类似物外，所有抗体均完全恢复T 细胞增殖，且抗体21127对此具有最高效价。

实施例17：抗CD73抗体在T细胞活化测定法中的功能性

在体外测定法中评估抗CD73抗体抑制表达于CD4⁺和CD8⁺T细胞上的 CD73的活性的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。

自健康供体分离CD4⁺和CD8⁺T细胞并用抗CD3/CD28珠(Thermo FisherScientific)、AMP和抗CD73抗体活化72小时，接着收获上清液。使用ELISA (Thermo FisherScientific)将T细胞活化测量为上清液中的IFN-γ水平。

在使用不同抗CD73抗体处理后的T细胞活化显示于图14中。显然，抗体 21127对T细胞活化的刺激功能是浓度依赖性的，且21127导致比相较于欧乐利尤单抗类似物更高的IFN-γ水平。

实施例18：抗CD73抗体在单向MLR测定法中的功能性

在体外测定法中评估抗CD73抗体抑制CD73在单向混合淋巴细胞反应 (MLR)中的活性的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。

将自两个不同的健康供体分离的树突细胞(DC)和CD4⁺T细胞共培养以诱导同种异体抗原特异性反应，导致细胞因子产生和T细胞活化和/或增殖。DC是通过以20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL白介素4 (IL-4)培养7天而自CD14⁺单核细胞分化，并将DC与来自健康供体材料的外周血单个核细胞(PBMC)的CD4⁺T细胞以1:10比率混合。单向MLR是以25μg/mL 抗PD-1抗体(12819；参见PCT专利公开WO 2017/055547)、50μMAMP和所示浓度的抗CD73抗体培养48小时，接着添加3H-胸苷(PerkinElmer公司)，再历时24小时。将增殖测量为3H-胸苷掺入并归一化为未经AMP处理的对照。

使用不同抗CD73抗体处理后的T细胞增殖显示于图15中。显然，抗CD73 抗体对增殖的刺激功能是浓度依赖性的，且抗体21127和欧乐利尤单抗类似物两者均刺激T细胞增殖。然而，仅抗体21127完全恢复增殖。

实施例19：抗CD73抗体和抗PD-1抗体在单向MLR测定法中的组合

此实施例检查抗PD-1抗体(12819)和抗CD73抗体(21127)的组合在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中增强T细胞活化的能力。

将自两个不同健康供体分离的树突细胞(DC)和CD4⁺T细胞共培养以诱导同种异体抗原特异性反应，导致细胞因子产生和T细胞活化和/或增殖。通过以20 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL白介素4(IL-4)培养 7天而自CD14⁺单核细胞分化DC，将DC与来自健康供体材料的外周血单个核细胞(PBMC)的CD4⁺T细胞以1:10比率混合。单向MLR是在有或无50μM AMP 的情况下并与抗CD73抗体21127和/或抗PD-1抗体(12819；参见PCT专利公开WO 2017/055547)温育72小时，接着收获上清液。抗CD73抗体21127和抗 PD-1抗体12819的组合以两种抗体1:1比率添加。通过使用ELISA(Thermo Fisher Scientific)定量上清液中的IFN-γ水平来测量T细胞活化，并归一化为未经AMP处理的对照。

使用抗体12819和/或21127处理后的单向MLR中通过IFN-γ水平测量的T 细胞活化显示于图16中。显然，抗PD-1抗体12819在无AMP且在有和无与抗体21127同时温育的情况下均强烈活化单向MLR(上图)。当将AMP添加至单向MLR时，抗PD-1抗体对单向MLR的活化明显较少(下图)。然而，将该抗PD-1 抗体和抗CD73抗体21127组合至少部分恢复强T细胞活化，突出该抗PD-1抗体/抗CD73抗体组合的益处。

实施例20：抗CD73抗体在B细胞活化测定法中的功能性

在体外B细胞活化测定法中评估抗体21046和21127刺激B细胞活化的能力。来自健康供体的PBMC用21046、21127或欧乐利尤单抗类似物(10μg/mL) 和CD40配体(0.5μg/mL)刺激过夜。流式细胞术分析是对B细胞(CD20⁺)门控来实施并将B细胞活化评估为B细胞活化标志物CD25、CD69和CD83的上调。

如图17A和17B中显示，抗体21046刺激B细胞活化标志物CD25、CD69 和CD83的强烈上调，而抗体21127和欧乐利尤单抗类似物对B细胞活化具有有限的影响。

实施例21：抗CD73抗体诱导的H292细胞中CD73水平的降低

评估抗CD73抗体21127、21028、21046和21163调节细胞系中CD73水平的能力，并与欧乐利尤单抗类似物进行比较。在37℃将抗CD73抗体以25μg/mL 与人类细胞系H292温育24小时，接着细胞裂解和使用Simple Western技术 (ProteinSimple)评估CD73水平。

图18显示使用抗体21127、21028、21046或21163或欧乐利尤单抗类似物处理后的CD73水平。使用抗CD73抗体21046或欧乐利尤单抗类似物的温育导致一些CD73下调，而其他抗CD73抗体具有(若有)对CD73水平的适度影响。

实施例22：抗CD73抗体在人类肿瘤异种移植模型中的功能性

此实施例证实抗CD73抗体21127抑制表达于自人类肿瘤异种移植物分离的细胞上的CD73的酶活性的能力。

材料和方法

将人类黑素瘤细胞系A375皮下接种至6至8周龄雌性NOG或NOD-scid 小鼠的腹侧内。在一个实施例(图19，上图)中，在肿瘤细胞接种后一天腹膜内注射人类PBMC。通过卡尺在两个维度上每周三次测量肿瘤，当根据以下公式计算肿瘤体积(以mm³计)：(宽度)²x长度x0.5。通过腹膜内注射载剂缓冲液或(1) 抗体21127、(2)欧乐利尤单抗类似物或(3)抗体21127与抗小鼠CD73抗体TY/23 (BioXcell)的组合每周三次处理小鼠。不同于欧乐利尤单抗类似物，抗体21127 对小鼠CD73不为交叉反应性的。因此，为比较CD73活性在肿瘤块中的抑制，该肿瘤块也含有表达CD73的鼠细胞(内皮细胞和基质细胞)，将抗体21127与抗小鼠CD73抗体TY/23组合。将抗体以5mg/kg、20mg/kg或50mg/kg给药。在停止治疗后的不同时间点，收获肿瘤和使用肿瘤解离试剂盒和gentleMACS Octo 解离器(Miltenyi)解离。将所得细胞悬浮液与CD73底物AMP在37℃温育3小时。通过将ATP添加至上清液并通过

结果

在重复给药两周后，抗体21127显示CD73活性在自移植有A375人类黑素瘤细胞系的PBMC人源化小鼠收获的肿瘤中的剂量依赖性抑制(图19，上图)。也发现对CD73酶活性的影响在停止治疗后仍持续延长的时间期间。

如图19中显示(下图)，欧乐利尤单抗类似物在处理后抑制CD73活性16天和酶活性在处理后第28天完全恢复。相反地，抗体21127单独或与TY/23组合显示在停止治疗后持续抑制CD73活性28天。

实施例23：抗CD73抗体在无免疫细胞的人类异种移植肿瘤模型中的体内功效

此实施例证实抗CD73抗体在人类三阴性乳腺癌异种移植模型中抑制肿瘤生长的能力。

将人类MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞皮下接种至6至8周龄雌性 NOD-scid小鼠的腹侧内。通过卡尺在两个维度上每周三次测量肿瘤，并根据以下公式计算肿瘤体积(以mm³计)：(宽度)²x长度x 0.5。通过腹膜内注射载剂缓冲液、抗体21127或欧乐利尤单抗类似物，每周两次处理小鼠，总计16次处理，接着是观察期间。抗体以10mg/kg给药。应用具Bonferroni的多重比较测试的双向ANOVA比较处理组之间在各时间点下的肿瘤体积。使用GraphPad Prism 5.0版(GraphPad软件，Inc.)进行统计分析。

在处理期间，抗体21127和欧乐利尤单抗类似物显示明显的肿瘤抑制作用 (图20)。在停止治疗后，观察到经欧乐利尤单抗类似物处理的肿瘤的再生长。相反地，在处理期间，经抗体21127处理的小鼠有效地控制肿瘤生长，且处理后 60天肿瘤大小有限增加。

实施例24：抗CD73抗体在用人类PBMC重构的小鼠中的人类异种移植肿瘤模型中的体内功效

此实施例证实抗CD73抗体21127在移植有人类肺癌细胞或人类黑素瘤细胞的PBMC人源化小鼠中的体内功效。

在腹膜内注射人类PBMC前一天，将来自人类肺癌细胞系Calu-6或人类 A375黑素瘤细胞系的细胞皮下植入NOG小鼠内。在PBMC注射当天启动处理，通过以10mg/kg(n＝10/组)腹膜内注射载剂缓冲液或抗CD73抗体21127，每周三次处理小鼠，总计六次处理。通过卡尺在两个维度上每周三次测量肿瘤，并根据以下公式计算肿瘤体积(以mm³计)：(宽度)²x长度x 0.5。应用具Bonferroni 的多重比较测试的双向ANOVA比较处理组之间在各时间点下的肿瘤体积。使用GraphPad Prism 5.0版(GraphPad软件，Inc.)进行统计分析。

如图21中显示，在用人类PBMC重构的小鼠中，在两种人类肿瘤异种移植模型(Calu-6和A375)中，使用抗体21127的处理导致显著的肿瘤生长延迟(相比于载剂对照，P＜0.05)。图21中的各图表示一个人类PBMC供体。

Claims

1.一种抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与包含以下的抗体结合至人CD73的相同表位：

a)包含SEQ ID NO:9和41的氨基酸序列的重链(HC)和包含SEQ ID NO:13和42的氨基酸序列的轻链(LC)；

b)包含SEQ ID NO:10和41的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:14和42的氨基酸序列的LC；

c)包含SEQ ID NO:11和41的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:15和42的氨基酸序列的LC；或

d)包含SEQ ID NO:12和41的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:16和42的氨基酸序列的LC。

2.根据权利要求1所述的抗CD73抗体或抗原结合部分，其中：

a)所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:17-19的氨基酸序列的重链互补决定区(H-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:9和41的氨基酸序列的重链(HC)；和

b)所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:20-22的氨基酸序列的轻链互补决定区(L-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:13和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

3.根据权利要求1所述的抗CD73抗体或抗原结合部分，其中：

a)所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:23-25的氨基酸序列的重链互补决定区(H-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:10和41的氨基酸序列的重链(HC)；和

b)所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:26-28的氨基酸序列的轻链互补决定区(L-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:14和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

4.根据权利要求1所述的抗CD73抗体或抗原结合部分，其中：

a)所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:29-31的氨基酸序列的重链互补决定区(H-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:11和41的氨基酸序列的重链(HC)；和

b)所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:32-34的氨基酸序列的轻链互补决定区(L-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:15和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

5.根据权利要求1所述的抗CD73抗体或抗原结合部分，其中：

a)所述抗体的重链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:35-37的氨基酸序列的重链互补决定区(H-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH；或

iv)包含SEQ ID NO:12和41的氨基酸序列的重链(HC)；和

b)所述抗体的轻链包含：

i)分别包含SEQ ID NO:38-40的氨基酸序列的轻链互补决定区(L-CDR)-1-3；

iii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；或

iv)包含SEQ ID NO:16和42的氨基酸序列的轻链(LC)。

6.一种抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含以下的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列：

a)分别是SEQ ID NO:17至22；

b)分别是SEQ ID NO:23至28；

c)分别是SEQ ID NO:29至34；或

d)分别是SEQ ID NO:35至40。

7.一种抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含与以下的氨基酸序列至少90％同一的重链可变结构域氨基酸序列和轻链可变结构域氨基酸序列：

a)分别是SEQ ID NO:9和13；

b)分别是SEQ ID NO:10和14；

c)分别是SEQ ID NO:11和15；或

d)分别是SEQ ID NO:12和16。

8.一种抗CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含含有以下氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变结构域：

a)分别是SEQ ID NO:9和13；

b)分别是SEQ ID NO:10和14；

c)分别是SEQ ID NO:11和15；或

d)分别是SEQ ID NO:12和16。

9.一种抗CD73抗体，其包含：

10.一种结合人CD73上的表位的抗CD73抗体或其抗原结合部分，所述表位包含：

a)SEQ ID NO:43的氨基酸残基R73、R109和D168；

b)SEQ ID NO:43的氨基酸残基R109；或

c)SEQ ID NO:43的氨基酸残基I301、S302和H304。

11.一种结合人CD73上的表位的抗CD73抗体或其抗原结合部分，所述表位包含：

a)SEQ ID NO:43的氨基酸残基27至31、61至75和161至170；

b)SEQ ID NO:43的氨基酸残基61至70和161至170；或

c)SEQ ID NO:43的基酸残基27至31、266至270和291至305。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗CD73抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分具有选自以下的至少一种特性：

a)于体外抑制可溶性CD73的活性；

b)于体外抑制Calu-6细胞上的CD73的活性；

c)于体外抑制H292细胞上的CD73的活性；

d)特异性结合至表达在CHO-S细胞上的人和食蟹猴CD73；

e)以1nM或更小的K_D结合至人CD73的ECD，如通过SPR所测量的；

f)以0.7nM或更小的K_D结合至食蟹猴CD73的ECD，如通过SPR所测量的；

h)以产生1:1复合物的方式结合CD73同型二聚体上的表位；

i)于体外比欧乐利尤单抗更有效抑制可溶性CD73活性；

j)于体外抑制Calu-6、H292和Cynom-K1细胞上的CD73活性；

k)于体外抑制Calu-6、NCI-H1775、KYSE-30和Capan-2细胞上的CD73活性；

l)于体外抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖；

m)于体外抑制原代CD4⁺和CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞上的CD73活性；

n)于体外恢复CD4⁺T细胞的增殖；

o)于体外活化CD4⁺和CD8⁺T细胞；

r)在体外不刺激B细胞活化；

s)在体外不使H292细胞中的CD73水平下降25％以上；

u)在移植有MDA-MB-231细胞的NOD-scid小鼠中体内抑制肿瘤生长；

w)在移植有A375细胞的PBMC人源化小鼠中体内抑制肿瘤生长。

13.根据权利要求12所述的抗CD73抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或所有23个所述特性。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗CD73抗体，其中所述抗体是IgG。

15.根据权利要求14所述的抗CD73抗体，其中所述抗体是IgG₁。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗CD73抗体，其中所述抗体在F_C区中包含至少一个突变。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗CD73抗体，其中所述抗体是IgG₁且在重链氨基酸位置234和235中的一者或多者包含突变，其是根据

编号方案编号。

18.根据权利要求17所述的抗CD73抗体，其中在位置234和235的氨基酸残基中的一者或两者是自Leu突变至Ala。

19.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合部分和可药用赋形剂。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其进一步包含免疫刺激剂、疫苗、化疗剂、抗肿瘤药、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂或CD73途径抑制剂。

21.一种经分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，或编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列，或这两者。

22.根据权利要求21所述的经分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含任一SEQ IDNO:1至8的核苷酸序列。

23.一种载体，其包含权利要求21或22所述的经分离的核酸分子，其中所述载体进一步包含表达控制序列。

24.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，和编码权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列。

25.一种产生抗CD73抗体或其抗原结合部分的方法，其包括提供权利要求24所述的宿主细胞，在适合表达所述抗体或部分的条件下培养所述宿主细胞，和分离所得的抗体或部分。

26.一种双特异性结合分子，其包含一种或两种不同的根据权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体的抗原结合部分。

27.用于在有需要的患者中降低CD73活性的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、权利要求19或20所述的药物组合物或权利要求26所述的双特异性结合分子。

28.用于在有需要的患者中增加CD4⁺T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、权利要求19或20所述的药物组合物或权利要求26所述的双特异性结合分子。

29.用于在有需要的患者中刺激免疫系统的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、权利要求19或20所述的药物组合物或权利要求26所述的双特异性结合分子。

30.治疗患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、权利要求19或20所述的药物组合物或权利要求26所述的双特异性结合分子。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症起源于选自以下的组织：皮肤、肺、肠、结肠、卵巢、脑、前列腺、肾、软组织、造血系统、头和颈、肝、骨、膀胱、乳房、胃、子宫、子宫颈和胰脏。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胆管癌、甲状腺癌或睾丸癌。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用免疫刺激剂、疫苗、化疗剂、抗肿瘤药、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、CD73途径抑制剂或放射疗法。

34.根据权利要求1至18中任一项所述的抗CD73抗体或抗原结合部分、根据权利要求19或20所述的药物组合物或根据权利要求26所述的双特异性结合分子的用途，用于制备用于以下的药物：

a)降低患者的CD73活性；

b)增加患者的CD4⁺T细胞增殖；

c)刺激患者的免疫系统；或

d)治疗患者的癌症。

35.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或抗原结合部分、根据权利要求19或20所述的药物组合物或根据权利要求26所述的双特异性结合分子，用于：

a)降低患者的CD73活性；

b)增加患者的CD4⁺T细胞增殖；

c)刺激患者的免疫系统；或

d)治疗患者的癌症。