TWI707870B - 針對替格瑞洛的抗體及使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明大體上提供結合替格瑞洛(ticagrelor)及替格瑞洛代謝物的抗體及抗體之抗原結合片段。本發明亦提供包括該等抗體之組合物、編碼該等抗體之核酸分子、治療患者之方法(其包括投與該等抗體)、及製備與使用該等抗體之方法。

Description

針對替格瑞洛的抗體及使用方法 以電子方式呈送之序列表之參考

本申請案以引用的方式併入隨同此申請案呈送之以電腦可讀形式(CRF)之序列表，其為創建於2014年10月1日之標題為「Ticagrelor_SeqList_ST25.TXT」的文字檔案及係33,900個位元組大小。

替格瑞洛(Ticagrelor)(BRILINTA^TM，BRILIQUE^TM)係口服活性環戊基三唑并嘧啶，一種選擇性及可逆結合二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑。在患有急性冠心症(ACS)之患者中，核准每日兩次之90mg替格瑞洛與低劑量阿司匹林(aspirin)之組合來降低主要心血管(CV)事件。替格瑞洛經由調節抗血小板效應(P2Y₁₂)及增強腺苷應答(ENT-1)之雙重途徑起作用(Cattaneo M等人，2014.J Am Coll Cardiol.63(23)：2503-9)。儘管尚未核准適應症，正在進行及計劃之研究係評估替格瑞洛用於降低在患有陳舊性心肌梗塞、確立之外周動脈疾病、及急性中風之患者，以及患有糖尿病與經確認之冠狀動脈粥樣硬化之患者的主要CV事件。

替格瑞洛具有兩種初級代謝物，替格瑞洛活性(active)代謝物(TAM)及替格瑞洛非活性(inactive)代謝物(TIM)(Teng等人，2010 Drug Metab.and Dispos.38：1514-1521)。TAM，亦稱為AR-C124910XX，係替格瑞洛之主要循環代謝物及在P2Y₁₂拮抗劑活性方面係等效。TAM通常在經 BRILINTA/BRILIQUE之患者中以約30至40%之親本替格瑞洛濃度存在。替格瑞洛及TAM分別具有8及12小時之循環半衰期。TIM，亦稱為AR-C133913XX，抗P2Y₁₂係非活性，構成<10%親本替格瑞洛，在8小時後不可檢測出，及係經由尿液排洩之主要代謝物。

血小板抑制及患者結果(PLATO)試驗已證實不管管理策略(藥物或侵入性管理)為何，當在廣泛ACS患者群體中(UA，NSTEMI，STEMI)與氯吡格雷(clopidogrel)比較時，替格瑞洛之較高療效而不增加總主要出血(Wallentin等人，2009 NEJM 361(11)：1045-1057)。然而，與所有抗血小板試劑一樣，在使用替格瑞洛之患者中存在出血可能。若在經雙重抗血小板治療(DAPT)之患者中發生嚴重出血，則治療選擇受限。若在經DAPT之患者中發生出血事件，則血小板輸入或投與凝血因子可用於嘗試促進止血。然而，目前並不存在評估經替格瑞洛之受試者中主要出血事件之後或期間血小板輸入或使用重組因子VIIa之止血效應的臨床資料(Dalén M等人，2013 J Cardiothorac Vasc Anesth.27(5)：e55-7)。

由此，解毒劑(諸如替格瑞洛特異性中和抗體)之可用性將容許在期望抗血栓形成藥效應與控制出血間平衡之較佳臨床管理。由於替格瑞洛係唯一市售可逆結合血小板抑制劑，抗體可提供血小板抑制之逆轉而不需要輸入新鮮血小板，由此避免與血小板輸入相關聯之危險。克服與替格瑞洛及TAM相關聯之ADP誘發之血小板凝聚抑制的試劑之可用性應滿足重要未滿足之臨床需求，例如在出現主要出血或需要緊急手術之患者中。

在一態樣中，本發明係關於一種特異性結合式(Ia)之環戊基三唑并嘧啶化合物之抗體：

其中R₁係選自由C₁-C₆烷氧基及C₁-C₆烷硫基組成之群；R₂係選自由H、C₁-C₆烷基、經取代之C₁-C₆烷基、C₃-C₆環烷基、及經取代之C₃-C₆環烷基組成之群；且R₃係選自由H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、及C₁-C₆烷醇組成之群。

在一些實施例中，該抗體結合至由如式(IIa)之括號確定之化合物部分中的抗原決定基

其中R₁、R₂及R₃係如上文定義。

在其他實施例中，該抗體結合至由如式(IIIa)之括號確定之化合物部分中的抗原決定基

其中R₂及R₃係如上文定義且R'₁係選自由C₁-C₄烷基組成之群。

在其他實施例中，該抗體結合至選自由如下組成之群的化合 物：

替格瑞洛；

替格瑞洛活性代謝物(TAM)；及

替格瑞洛非活性代謝物(TIM)。

在上文態樣及實施例之其他實施例中，該抗體或其片段包括選自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、及SEQ ID NO：72組成之群的重鏈可變區(VH)序列；及選自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：77組成之群的輕鏈可變區(VL)序列。在一些實施例中，該抗體包括選自由SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：22與SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：32與SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：42與SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：52與SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：62與SEQ ID NO：67；及SEQ ID NO：72與SEQ ID NO：77組成之群的VH與VL序列之組合。在其他實施例中，該抗體包括選自由SEQ ID NO：52與SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：62與SEQ ID NO：67；及SEQ ID NO：72與SEQ ID NO：77組成之群的VH與VL之組合。

在上文態樣及實施例之其他實施例中，該抗體或其片段包括重鏈可變區及輕鏈可變區之框架區(FR)及互補決定區(CDR)1、2及3，其中重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3序列包括SEQ ID NO：3(CDR1)、SEQ ID NO：4(CDR2)、及SEQ ID NO：5(CDR3)；SEQ ID NO：13(CDR1)、SEQ ID NO：14(CDR2)、及SEQ ID NO：15(CDR3)；SEQ ID NO：23(CDR1)、SEQ ID NO：24(CDR2)、及SEQ ID NO：25(CDR3)；SEQ ID NO：33(CDR1)、SEQ ID NO：34(CDR2)、及SEQ ID NO：35(CDR3)；SEQ ID NO：43(CDR1)、SEQ ID NO：44(CDR2)、及SEQ ID NO：45(CDR3)；SEQ ID NO：53(CDR1)、SEQ ID NO：54(CDR2)、及SEQ ID NO：55(CDR3)；SEQ ID NO：63(CDR1)、SEQ ID NO：64(CDR2)、及SEQ ID NO：65(CDR3)；或SEQ ID NO：73(CDR1)、SEQ ID NO：74(CDR2)、及SEQ ID NO：75(CDR3)；及其中輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3序列包括SEQ ID NO：8(CDR1)、SEQ ID NO：9(CDR2)、及SEQ ID NO：10(CDR3)；SEQ ID NO：18(CDR1)、SEQ ID NO：19(CDR2)、及SEQ ID NO：20(CDR3)；SEQ ID NO：28(CDR1)、SEQ ID NO：29(CDR2)、及SEQ ID NO：30(CDR3)；SEQ ID NO：38(CDR1)、SEQ ID NO：39(CDR2)、及SEQ ID NO：40(CDR3)；SEQ ID NO：48(CDR1)、SEQ ID NO：49(CDR2)、及SEQ ID NO：50(CDR3)；SEQ ID NO：58(CDR1)、SEQ ID NO：59(CDR2)、及SEQ ID NO：60(CDR3)；SEQ ID NO：68(CDR1)、SEQ ID NO：69(CDR2)、及SEQ ID NO：70(CDR3)；或SEQ ID NO：78(CDR1)、SEQ ID NO：79(CDR2)、及SEQ ID NO：80(CDR3)。在其他實施例中，該抗體包括選自由SEQ ID NO：53(VH CDR1)、SEQ ID NO：54(VH CDR2)、SEQ ID NO：55(VH CDR3)、SEQ ID NO：58(VL CDR1)、SEQ ID NO：59(VL CDR2)、與SEQ ID NO：60(VL CDR3)；SEQ ID NO：63(VH CDR1)、SEQ ID NO：64(VH CDR2)、SEQ ID NO：65(VH CDR3)、SEQ ID NO：68(VL CDR1)、SEQ ID NO：69(VL CDR2)、與SEQ ID NO：70(VL CDR3)；及SEQ ID NO：73(VH CDR1)、SEQ ID NO：74(VH CDR2)、SEQ ID NO：75(VH CDR3)、SEQ ID NO：78(VL CDR1)、SEQ ID NO：79(VL CDR2)、與SEQ ID NO：80(VL CDR3)組成之群的CDR區之組合。

在上文態樣及實施例中，該抗體係選自多株抗體、單株抗體、人源化抗體、人類抗體、單鏈Fv(scFv)、單域抗體、Fab、F(ab')₂、單鏈雙雙功能抗體、抗體模擬物、及抗體可變域。在一些實施例中，該抗體包括scFv。在一些實施例中，該抗體包括Fab。

在一些實施例中，上文描述之抗體結合至替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物(TAM)。

在其他實施例中，該抗體以約200nM或更低之IC₅₀結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。在還有其他實施例中，該抗體以約100nM至約1nM之IC₅₀、或約10nM至約1nM之IC₅₀結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。

在其他實施例中，該抗體以約50nM或更低之K_D結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。在還有實施例中，該抗體以約250pM至約1pM範圍、或在約100pM至約1pM範圍內之K_D結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。

在其他實施例中，該抗體結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物及不結合選自由非諾貝特(fenofibrate)、尼伐地平(nilvadipine)、西洛他唑(cilostazol)、布拉地新(bucladesine)、瑞加德松(regadenoson)、環噻嗪、賽扶寧(cyfluthrin)、洛伐他汀(lovastatin)、利奈唑胺(linezolid)、辛伐他汀(simvastatin)、坎格瑞洛(cangrelor)、潘妥拉唑(pantoprazole)、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸2-MeS腺 苷、及三磷酸2-MeS腺苷組成之群的化合物。在實施例中，該抗體不抑制選自由非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加德松、環噻嗪、賽扶寧、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格瑞洛、潘妥拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸2-MeS腺苷及三磷酸2-MeS腺苷組成之群的化合物活性。在其他實施例中，該抗體針對選自非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加德松、環噻嗪、賽扶寧、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格瑞洛、潘妥拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸2-MeS腺苷及三磷酸2-MeS腺苷組成之群的化合物，顯示至少約1000μM之IC₅₀。

在一些實施例中，該抗體具有約4至12小時之體內半衰期。在特定實施例中，該抗體具有約12小時之體內半衰期。

在一些實施例中，該抗體中和替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物之抗血小板效應。在其他實施例中，該抗體在投藥約60分鐘內中和替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物之抗血小板效應。

在一些實施例中，該抗體具有容許延續包括替格瑞洛之療法起始的替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物之解離速率。

在其他態樣中，本發明提供一種治療有治療需要之患者之急性出血的方法，其包括投與該患者有效量之本文揭示之抗體。在該方法之一些實施例中，該患者已經歷或將要經歷外科手術及其已投與替格瑞洛。在該方法之一些實施例中，該患者需要緊急護理及/或緊急外傷管理。

本發明之其他態樣提供一種組合物，其包括與醫藥上可接受之載劑組合之任何前述態樣及實施例之抗體。

一些額外態樣提供包括編碼根據任何前述項之抗體之核苷酸序列的核酸分子。在一些實施例中，該核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71、及SEQ ID NO：76。

本發明之其他態樣提供可包括至少一本文揭示之核酸分子的組合物、載體及宿主細胞。在一些實施例中，該等組合物、載體、及宿主細胞包括編碼一或數個本文揭示之蛋白質的第一核酸分子及第二核酸分子。

熟習此項技術者在評審隨後之實施方式及例示性描述後，其他態樣將顯而易見。

出於闡明本發明之目的，在附圖中描繪本發明之特定態樣。然而，本發明並不限於在附圖中描繪態樣之精確排列及手段。

圖1描繪基於III期PLATO資料之替格瑞洛中和Fab之PK/PD建模。在替格瑞洛180mg負荷劑量及90mg每日兩次後，於時間零處添加中和Fab。在第1日患者重新開始接受替格瑞洛。預測Fab快速中和替格瑞洛及TAM，由此在99%患者中恢復血小板凝聚。在第0日與第l日間之「斜坡」代表在1%替格瑞洛更緩慢清除之患者中來自其他組織之替格瑞洛之重新分佈。

圖2-半抗原(haptan)及Fab特異性。(A)提供替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝物(TAM)、替格瑞洛非活性代謝物(TIM)及腺苷之化學結構。使用虛線強調獨特R基團、二-氟苯基-環丙基及硫代丙基取代基。(B)TICA0072之特異性曲線。(C)TICA0212(MEDI 2452)之特異性曲線。特異性曲線包括替格瑞洛、TAM、TIM、腺苷、ADP、ATP及圖4之十二種相關化合物中之三者(為了明確起見；未檢測到結合至濃度高達0.1mM之十二種化合物中之任一者)。數據係三次重複分析之平均值及SEM。

圖3闡明scFv結合至生物素化之連接子替格瑞洛(x-軸)及於50倍過量未經修飾之替格瑞洛結合至生物素化之連接子替格瑞洛(y-軸)的相關性。在過量未經修飾之替格瑞洛存在下scFv結合之抑制由0%、50%、80%及90%抑制之線顯示。

圖4顯示使用與替格瑞洛某種程度之2D、3D或靜電相似性確定的化合物。

圖5提供TICA0049及TICA0072 Fab之選擇性研究。a-c藉由列出之化合物TICA0049 Fab結合至生物素化之替格瑞洛的競爭。d-f藉由列出之化合物TICA0072 Fab結合至生物素化之替格瑞洛的競爭。數據經DMSO標準化。

圖6提供在第二代抗原決定基競爭分析中親本TICA0072及優化之變異體TICA0152、TICA0162及TICA0212 Fab的競爭曲線。

圖7顯示TICA0162及TICA0212 Fab之選擇性研究結果。a-c藉由列出之化合物TICA0162 Fab結合至生物素化替格瑞洛的競爭。d-f藉由列出之化合物TICA0212 Fab結合至生物素化之替格瑞洛的競爭。數據經DMSO標準化。

圖8顯示TICA0212/MEDI2452或TICA0072濃度依賴性替格瑞洛之逆轉之結果。(A)20μM ADP-誘發凝聚之TICA0212/MEDI2452 1μM替格瑞洛(▲)或1μM TAM(●)介導之抑制。(B)在1μM替格瑞洛存在下，TICA0212/MEDI2452顯示血漿中降低之游離替格瑞洛濃度。平均值(n=5)±平均值標準誤差。(C)P2Y₁₂信號傳導之替格瑞洛及TAM抑制之TICA0072逆轉。

圖9顯示在投藥經替格瑞洛治療之小鼠後，TICA0212(250mg/kg)介導之ADP誘發之全血體外凝聚之逆轉的結果。

圖10顯示TICA0072(A)及TICA0212/MEDI2452(B)在與替格瑞洛之複合物中之晶體結構的局部視圖。Fab顯示以帶狀表示而在獲自替 格瑞洛在7Å內之胺基酸殘基顯示為條狀。為了明確起見省略一些主鏈原子。輕鏈顯示為灰棕色及重鏈為淺藍色。二鏈之CDR3均為綠色。V_H CDR3不可在TICA0072結構中建模及以虛線描繪暫時位置。橙色箭頭表明與TICA0072相比在TICA0212/MEDI2452中觀察到之V_L CDR3位移。殘基係根據kabat編碼及使用L或H前綴以表明輕或重鏈。

圖11顯示ADP誘發之全血體外凝聚之逆轉。(A)停止替格瑞洛輸注後各個治療群組之個別數據。媒劑對照(■)、單獨替格瑞洛(●)、替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452(o)及替格瑞洛+同型物對照(△)。Bar表示平均值數據(n=4)。AU=凝聚單位。僅收集替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452組之於15分鐘之數據。(B)由TICA0212/MEDI2452誘發之百分比逆轉，平均值數據(n=4)±SEM。

圖12顯示替格瑞洛誘發之出血之逆轉。(A)全部血液損失之個別數據及(B)全部出血時間。媒劑對照(■)、單獨替格瑞洛(●)及替格瑞洛+TICA0212/MEDI2452(○)。Bar表示平均值數據(n=12)。

在繼續更詳細描述本發明之前，應瞭解本發明並不限於特殊組合物或方法步驟，由於此可變化。須注意，除非本文清楚地另作規定，否則用於本說明書及隨附申請專利範圍中之單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指示物。

除非另外定義，否則本文中使用的所有技術及科學術語具有與如熟習本發明相關技術者通常所瞭解相同的含義。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology，Juo,Pei-Show，第2版，2002年，CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999年，Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，修訂版，2000年，Oxford University Press，提供熟習此項技術者本發明中所使用許多術語之一 般辭典。

本文胺基酸可引用由IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議之其通常熟知之三字符號或單字符號。同樣，核苷酸可引用其通常可接受之單字編碼。

除非另作說明，否則抗體之可變域、互補決定區(CDR)及框架區(FR)中胺基酸之編號，遵循Kabat定義，如由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)所陳述。使用此編號系統，實際直鏈胺基酸序列可含有對應縮短、或插入可變域之FR或CDR的更少或額外胺基酸。例如，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後之單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b、及82c，等等)。給定抗體之殘基之Kabat編號可由在具有「標準」Kabat編號序列之抗體序列同源區對準決定。框架殘基之最大對準往往需要在編號系統中插入「間隔」殘基以用於Fv域。此外，由於種間或等位基因差異，在任何給定Kabat位點編號之特定個別殘基之識別可從抗體鏈至抗體鏈變化。

如本文使用，術語「抗體」及「抗體等」，亦稱為免疫球蛋白，包含單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、由至少兩個不同抗原決定基結合片段形成之多特異性抗體(例如，多特異性抗體，例如PCT公開案WO2009018386、PCT申請案第PCT/US2012/045229號，其全文以引用的方式併入本文中)、biMab、人類抗體、人源化抗體、駱駝化抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、單域抗體、域抗體、Fab片段、F(ab')₂片段、顯示期望生物活性之抗體片段(例如，抗原結合部分)、二硫鍵鍵結之Fvs(dsFv)、及抗獨特型(anti-Id)抗體(包括例如對本發明抗體之anti-Id抗體)、內抗體、及任何上述之抗原決定基結合片段。在本文提供之特定實施例中，抗體係關於抗體之活性結合片 段，即，含有至少一個抗原結合位點之分子，諸如，例如scFv及Fab。抗體亦包括與抗體或其部分融合之肽，諸如與Fc域融合之蛋白質。免疫球蛋白分子可具有任何同型物(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、子同型物(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或同種異型(例如，Gm，例如，G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b、或c)、Am、Em、及Km(1、2或3))。抗體可衍生自任何哺乳動物(包括但不限於人類、猴、豬、馬、兔、狗、貓、小鼠、等等)、或其他動物諸如鳥(例如雞)。

如本文使用，C₁-C₆烷基指具有一至六個碳原子之直鏈及分支鏈烷基，及包括甲基、乙基、丙基、正丁基、異丁基、戊基、異戊基、新戊基、及己基。

如本文使用，C₁-C₆烷氧基指如上文表明在基團中具有一個氧之烷基。在一些實施例中，該氧原子位於將取代基附接至核心結構(即，環結構)之位置。

如本文使用，C₁-C₆烷硫基指如上文表明在基團中具有一個硫之烷基。在一些實施例中，該硫原子位於將該取代基附接至核心結構(即，環結構)之位置。

如本文使用，C₁-C₆烷醇指如上文表明在該取代基結構末端具有羥基之烷基。

如本文使用，C₃-C₆環烷基指環丙基、環丁基、環戊基、及環己基。

如本文使用，「經取代」之C₃-C₆環烷基及C₁-C₆烷基指上文討論之在至少一碳原子上由亦經1至3個鹵素原子取代之芳基取代的烷基及環烷基。

如本文使用，「替格瑞洛」指可逆P2Y₁₂抑制劑((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基]胺基}-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三 唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羥基乙氧基)環戊烷-1,2-二醇)及具有以下化學結構：

如本文使用，「替格瑞洛活性代謝物」或「TAM」指替格瑞洛之主要活性代謝物，亦稱為AR-C124910XX，一種可逆P2Y₁₂抑制劑及具有以下化學結構：

如本文使用，「替格瑞洛非活性代謝物」或「TIM」指替格瑞洛之非活性代謝物，亦稱為AR-C133913XX，及具有以下化學結構：

抗體

一般意義上，本發明提供結合式(Ia)之環戊基三唑并嘧啶化合物的新穎抗體：

其中R₁係選自由C₁-C₆烷氧基及C₁-C₆烷硫基組成之群；R₂係選自由H、C₁-C₆烷基、經取代之C₁-C₆烷基、C₃-C₆環烷基、及經取代之C₃-C₆環烷基組成之群；且R₃係選自由H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、及C₁-C₆烷醇組成之群。

在特定實施例中，該抗體特異性結合選自由如下組成之群的化合物：

替格瑞洛；

替格瑞洛活性代謝物(TAM)；及

替格瑞洛非活性代謝物(TIM)。

在特定態樣中，本發明提供一種具有任何一或數個如下特徵的結合至替格瑞洛及TAM之抗體，該等特徵包括高結合特異性、高結合親和性、快速起效、及快速抵消(例如，容許視情況延續或共投與包括替格瑞洛之治療)。

在一些實施例中，該抗體結合至替格瑞洛及中和替格瑞洛及TAM之抗血小板凝聚活性，由此恢復在替格瑞洛與TAM存在下ADP誘發之血小板凝聚。

在一些實施例中，在受試者中該抗體半衰期係約等於替格瑞洛及TAM之半衰期。在一些實施例中，該抗體之半衰期係約4至24小時(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時)。在一些實施例中，該抗體半衰期係約4至12小時(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、或12小時)。

在一些實施例中，該抗體提供活性快速起效。例如，在實施例中，該抗體起效時間或中和替格瑞洛及TAM介導之血小板抑制的時間係約15至120分鐘、或約15至60分鐘。在一些實施例中，起效時間小於60分鐘。

在一些實施例中，該抗體具有提供快速活性抵消之PK/PD曲線，使得例如經投與該抗體之受試者可重新開始指定替格瑞洛治療。在一些實施例中，接受本文揭示抗體(例如，藉由i.v.注入)之受試者可在投與該抗體後二十四小時內接受或重新開始替格瑞洛治療。

如在本文某些實施例中討論及例示，該抗體結合替格瑞洛或其代謝物及不結合至其他結構相關化合物，或可作為共治療與替格瑞洛一起投與之化合物。例如，適宜地，該抗體不抑制性選自由非諾貝特、尼伐地平、西洛他唑、布拉地新、瑞加德松、環噻嗪、賽扶寧、洛伐他汀、利奈唑胺、辛伐他汀、坎格瑞洛、潘妥拉唑、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸2-MeS腺苷、及三磷酸2-MeS腺苷組成之群的化合物之活性。

本文描述之抗體可包括僅含有抗體分子之選定部分之抗原結合片段(諸如Fab、F(ab')₂、Fab'、scFv、di-scFv、sdAb片段)及可用作診斷或治療劑。此外，可改變可變域中特異性殘基以改良抗體及抗體片段之結合特異性及/或穩定性。不直接涉及抗原結合之其他殘基可經替代以「人源化」非人類抗體之區域及降低抗體之免疫原性。

在某些態樣中，該抗體係Fab片段，例如，包括可變輕鏈(VL)、 恆定輕鏈(CL)、可變重鏈(VH)、及恆定重鏈部分(CH1)的抗體Fab片段或重組產生之抗原結合片段。視情況，該Fab之輕及重鏈可經由一或數個二硫鍵，諸如，例如，經由適宜抗體鉸鏈區互連。如本文描述，Fab結合至環戊基三唑并嘧啶類口服活性劑化合物之抗原決定基。在一些實施例中，Fab結合至替格瑞洛或其代謝物。

在某些態樣中，Fab可衍生自或基於抗體序列，諸如習知鼠類、人源化或人類抗體。在某些態樣中，Fab可衍生自或基於一或數個scFv，諸如從庫篩選及衍生之scFv。在此等實施例中，衍生自或基於習知抗體或scFv之序列之Fab保留習知抗體之一或數個功能活性(例如，保留至少80%或更多(80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%)功能活性)。例如，在某些態樣中，Fab保留抗原(例如，替格瑞洛)親和性、抑制活性、及/或抗體或scFv之選擇性中之一或多者。

儘管Fab片段可包括結合至環戊基三唑并嘧啶之抗原決定基之序列，在某些實施例中，Fab結合至替格瑞洛。在一些態樣中，Fab結合至替格瑞洛活性代謝物。在某些態樣中，Fab可結合至替格瑞洛及替格瑞洛活性代謝物二者。

在一些實施例中，Fab可包括獲自結合至替格瑞洛或其活性代謝物之不同抗體的CDR區之組合。

在某些態樣中，Fab包括輕鏈部分(VL)，其包括在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：77中任一者列出之胺基酸序列。在其他實施例中，Fab包括輕鏈部分，其包括在SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：77中任一者列出之胺基酸序列。在某些態樣中，Fab包括重鏈部分(VH)，其包括在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、及SEQ ID NO：72中任一者 列出之胺基酸。在其他實施例中，Fab包括重鏈部分，其包括在SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、及SEQ ID NO：72中任一者列出之胺基酸序列。在某些態樣中，Fab由編碼輕鏈部分(VL)之核苷酸序列及編碼重鏈部分(VH)之核苷酸序列，例如，包括在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、或SEQ ID NO：71中列出之核酸序列的核苷酸序列；及包括在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：16、或SEQ ID NO：76中列出之核酸序列的核苷酸序列編碼。

在某些態樣中，該抗體可係scFv。應瞭解，scFv涵蓋包括經由撓性多肽連接子連接至可變輕鏈域(VL)之可變重鏈域(VH)的多肽鏈。在一些態樣中，在VH與VL間之多肽連接子包括蛋白酶裂解位點。scFv之VH及VL域可衍生自相同或不同抗體。在一些態樣中，該scFv之VH或VL可包括一或數個結合至所關注靶之CDR，同時VH或VL域之剩餘部分係衍生自不同抗體或係合成。在一些態樣中，scFv包括抗體(例如，具有結合至替格瑞洛或其代謝物之結合活性的抗體)之至少一CDR。在一些態樣中，scFv包括給定抗體之至少兩個CDR。在一些態樣中，scFv包括給定抗體之至少三個CDR。在一些態樣中，scFv包括給定抗體之至少四個CDR。在一些態樣中，scFv包括給定抗體之至少五個CDR。在一些態樣中，scFv包括給定抗體之至少六個CDR。

可單獨或組合使用若干方法以改良scFv分子之穩定性。可單獨或與一或數個其他方法組合使用之一方法係改造連接scFv域之連接子之長度及/或組成以穩定scFv部分。

可單獨或與一或數個本文描述之其他方法組合使用之另一潛在方法係藉由將至少兩個胺基酸取代基引入(亦稱為修飾或突變)該scFv之VH及/或VL域以促進二硫鍵形成(例如，參見Brinkmann等人， 1993，PNAS，90：7538-42；Zhu等人，1997，Prot.Sci.6：781-8；Reiter等人，1994，Biochem.33：5451-9；Reiter等人，1996，Nature 14：1239-45；Luo等人，1995，J.Biochem.118：825-31；Young等人，1995，FEBS Let.377：135-9；Glockshuber等人，1990，Biochem.29：1362-7)。

在某些態樣中，將一突變引入scFv之各個VH及VL域以促進scFv表現時在VH與VL域間鏈間二硫鍵形成。在另一態樣中，將該兩個突變引入該鏈之相同域。在某些態樣中，將該兩個突變引入不同鏈中。在某些態樣中，引入多對兩個突變以促進多個二硫鍵形成。在某些態樣中，引入半胱胺酸以促進二硫鍵形成。可突變為半胱胺酸之例示性胺基酸包括VH2之胺基酸43、44、45、46、47、103、104、105、及106與VL2之胺基酸42、43、44、45、46、98、99、100、及101。先前編號係基於Kabat編號，其確定僅與scFv之VH2及VL2有關(及與在全長抗體序列中胺基酸之位置無關)之位置。可突變為半胱胺酸殘基之胺基酸部分之例示性組合包括：VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44、及VH103-VL45。在一些態樣中，VH之胺基酸44及VL之胺基酸100突變為半胱胺酸。

可單獨或與一或數個本文描述之其他方法組合使用之又一潛在方法係選擇scFv域之順序。在某些態樣中，出於穩定性目的優化VH域相對於VL域之定向。在某些態樣中，scFv係在VH-連接子-VL定向。在某些態樣中，scFv係在VL-連接子-VH定向。

可單獨或與一或數個本文描述之方法組合使用之額外方法係藉由突變scFv之一或數個表面殘基引入一或數個穩定突變。在一些態樣中，一、二、三、四、五、六、或超過六個殘基在scFv之VH及/或VL 域之一或二者中突變。在某些態樣中，改變僅在scFv之VH域中發生。在某些態樣中，改變僅在scFv之VL域中發生。在某些態樣中，改變在scFv之VH及VL域中均發生。可在各個域發生相同數量之改變或可在各個域中發生不同數量之改變。在某些態樣中，一或數個改變係獲自存在於未經修飾之親本scFv中之殘基的保守胺基酸取代。在其他態樣中，一或數個改變係獲自存在於未經修飾之親本scFv中之殘基的非保守胺基酸取代。當產生數個取代時，在該scFv之VH或VL域之一或二者中，各個取代獨立地為保守或非保守取代。在某些態樣中，全部取代係保守取代。在某些態樣中，全部取代係非保守。在某些態樣中，取代之至少一者係保守。在某些態樣中，取代之至少一者係非保守。

可單獨或與一或數個本文描述之額外方法組合使用之又一方法係藉由突變一或數個存在於scFv之VH及/或VL域中之殘基引入一或數個取代以匹配在已知、經篩選、及/或識別抗體之VH及/或VL域共有序列之該特定位置的最常見殘基。在某些態樣中，於scFv之VH域及/或VL域之一或二者中之一、二、三、四、五、六、或超過六個位置引入取代。可在各個域中發生相同數量之改變或在各個域中發生不同數量之改變。在某些態樣中，在序列中一或數個匹配給定共有序列之改變係獲自存在於未經修飾之VH及/或VL序列中之殘基的保守胺基酸取代。在其他態樣中，一或數個改變代表獲自存在於未經修飾之VH及/或VL序列中之殘基的非保守胺基酸取代。當產生多個取代時，在scFv之VH或VL域之一或二者中，各個取代獨立地為保守及非保守取代。在某些態樣中，全部該取代係保守取代。在某些態樣中，全部取代係非保守取代。在某些態樣中，取代之至少一者係保守。在某些態樣中，取代之至少一者係非保守。

應注意，任何描述為用於修飾或穩定scFv部分之修飾可用於修飾 Fab部分。例如，可修飾Fab之可變域以改良穩定性、抗原結合及等等。此外，可修飾Fab或scFv部分以降低免疫原性。

在某些態樣中，該抗體可係包括可變輕鏈部分(VL)之scFv，該可變輕鏈部分包括在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：77中之任一者列出之胺基酸序列。在其他實施例中，該scFv包括輕鏈部分，其包括在SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：77中之任一者列出之胺基酸序列。在某些態樣中，scFv包括重鏈部分(VH)，其包括在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、及SEQ ID NO：72中之任一者列出之胺基酸。在其他實施例中，scFv包括重鏈部分，其包括在SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、及SEQ ID NO：72中之任一者列出之胺基酸序列。

本文揭示之抗體可進一步包括一或數個連接子多肽。該連接子可使重鏈域及輕鏈域(scFv)互連或將抗體或其抗原結合片段連接至另一試劑，諸如標識，Fc域或等等。連接子長度及序列可變化及一般在此項技術中為吾人熟知。

可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和性來增加包括Fc區之抗體的血清半衰期。本文使用之術語「抗體半衰期」意指為抗體分子在其投藥後之平均存活時間之量度的抗體之藥物動力學性質。抗體半衰期可表示為從患者體內(或其他哺乳動物)或其特異性隔室(例如，在血清中測量，即循環半衰期，或在其他組織中)中消除50%已知量免疫球蛋白所需之時間。半衰期可從一免疫球蛋白或一類免疫球蛋白至另一者變化。一般而言，增加抗體半衰期導致在所投與之抗體循環中之平均滯留時間(MRT)之增加。

增加半衰期可容許降低給予患者之試劑量以及降低投藥頻率。 為增加抗體之血清半衰期，吾人可將補救受體結合抗原決定基併入該抗體(特定言之抗體片段)，例如，如在美國專利第5,739,277號中所描述。如本文使用，術語「補救受體結合抗原決定基」指負責增加IgG分子之體內血清半衰期之IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)之Fc區的抗原決定基。或者，具有增加半衰期之本發明抗體可藉由修飾涉及Fc與FcRn受體間交互作用所確定之胺基酸殘基產生(例如，參見美國專利第6,821,505號及第7,083,784號；及WO 09/058492)。此外，可藉由在此項技術中廣泛採用之技術共軛至PEG或白蛋白增加本發明抗體之半衰期。

在本發明範疇內之抗體可藉由任何本文確定之結構及/或功能特徵進行確定。例如，可使用任何本文闡明或在此項技術中熟知之其他技術篩選抗體之特定結合特徵(例如，K_off、K_D、IC₅₀、對替格瑞洛及替格瑞洛代謝物之特異性/選擇性)。

標識、共軛物及部分

本發明之抗體可共軛至出於診斷及其他分析目的之標識，其中可檢測出該抗體及/或其靶。標識包括(但不限於)發色團、熒光團、熒光蛋白質、發磷光染料、串聯染料、粒子、半抗原(hapten)、酶及放射性同位素。

在某些態樣中，抗體共軛至熒光團。附接至抗體之熒光團之選擇將決定共軛抗體之吸收及熒光發射性質。可用於抗體及抗體結合配位體之熒光團標識的物理性質包括(但不限於)光譜特性(吸收、發射及斯托克斯(stokes)位移)、熒光強度、衰退期、偏光及光脫色速率、或其組合。全部此等物理性質可用於區分一熒光團與另一者，及由此容許多重分析。熒光標識之其他期望性質可包括細胞滲透性及低毒性，例如若抗體標識係在細胞或模型生物(例如，活體動物)中進行。

在某些態樣中，酶係標識及共軛至抗體。由於可達成導致分析 敏感性增強之可檢測信號放大，酶係期望標識。酶本身不產生可檢測應答，但當其與適當底物接觸時用於破壞底物使得經轉化之底物產生熒光、比色或發光信號。由於在標識試劑上一種酶可導致多個底物轉化為可檢測信號，酶放大該可檢測信號。選擇酶底物以產生較佳可測量產物，例如比色分析、熒光或化學發光。此等底物係廣泛用於此項技術中及為熟習此項技術者所熟知及包括例如氧化還原酶諸如辣根過氧物酶及底物諸如3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)；磷酸酶諸如酸性磷酸酶、鹼及底物諸如磷酸5-溴-6-氯-3-吲哚基酯(BCIP)；糖苷酶，諸如β-半乳糖苷酶、β-葡萄醣酸酸酶或β-葡萄糖苷酶及底物諸如5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)；額外酶包括水解酶諸如膽鹼酯酶及肽酶、氧化酶諸如葡萄糖氧化酶及細胞色素氧化酶、及熟知其之適宜底物之還原酶。

產生化學發光之酶及其適當底物係適宜用於一些分析。此等包括(但不限於)熒光素酶及水母素之天然及重組形式。用於磷酸酶、糖苷酶及氧化酶之產生化學發光之底物諸如含有穩定二氧雜環丁烷、魯米諾、異魯米諾及吖錠酯之彼等係額外有用。

在另一態樣中，半抗原諸如生物素亦用作標識。生物素係有用，由於其可作用於酶系統以進一步放大可檢測信號，及其可用作用於出於分離目的親和性層析法之標籤。出於檢測目的，使用具有生物素親和性之酶共軛物，諸如抗生物素蛋白-HRP。隨後添加過氧化酶底物以產生可檢測信號。

半抗原亦包括激素、天然及合成藥物、污染物、過敏原、效應分子、生長因子、趨化細胞素、細胞因子、淋巴細胞活素、胺基酸、肽、化學中間產物、核苷酸及等等。

在某些態樣中，熒光蛋白可作為標識共軛至抗體。熒光蛋白之實例包括綠熒光蛋白(GFP)及藻色素蛋白及其衍生物。該熒光蛋白(特 定言之藻色素蛋白)係特別適用於產生串聯染料標識之標識試劑。出於獲得較大斯托克斯位移之目的，此等串聯染料包括熒光蛋白及熒光團，其中發射光譜係從熒光蛋白吸收光譜之波長進一步位移。

在某些實施例中，該標識係放射性同位素。適宜放射性物質之實例包括(但不限於)碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氣(³H)、銦(¹¹¹In、¹¹²In、¹¹³mIn、¹¹⁵mIn)、鎝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、鉈(²⁰¹Ti)、鎵(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、鈀(¹⁰³Pd)、鉬(⁹⁹Mo)、氙(¹³⁵Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³SM、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh及⁹⁷Ru。

在一些態樣中，藥物可共軛至該抗體。例如，包括scFv之抗體可共軛至用於治療心血管疾病及/或急性冠心症之藥物。

在某些特徵中，藥物及其他分子可經由位點特異性共軛靶向抗體。例如，該抗體可包括產生用於共軛反應之游離硫醇基的半胱胺酸改造域(包括改造為結合單元及/或Fc域之半胱胺酸)。在某些態樣中，該抗體經改造以併入特異性共軛位點。

編碼抗體之核酸分子

本發明提供編碼抗體或其抗原結合片段之核酸分子。本發明之一態樣提供編碼本文特別描述之任何抗體的核酸分子。核酸分子可編碼該抗體之重鏈及/或輕鏈可變區。

在一些態樣中，該抗體係Fab或scFv，其中編碼Fab或scFv之核酸部分包括編碼VL域之核苷酸序列及編碼VH之核苷酸序列，及其中編碼VL域之核苷酸序列係視情況經由編碼撓性多肽連接子之核苷酸序列連接至編碼VH域之核苷酸序列。

另一態樣提供一種經如本文描述之任一核酸分子轉形的宿主細胞。在本發明另一態樣中，提供一種包括含如本文描述之核酸分子之載體的宿主細胞。在一態樣中，該宿主細胞可包括數個載體。

本發明設計編碼任何本發明抗體，以及該抗體之輕或重鏈之核酸分子。例如，本發明設計包括編碼一或數個SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：77之核苷酸序列的核酸分子。本發明進一步設計編碼進一步包括額外區(例如，Fc或經修飾之Fc)之任何本發明之抗體的核酸分子。在一些實施例中，該等核酸分子可選自一或數個SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71、或SEQ ID NO：76。在其他實施例中，本發明提供一種載體，其包括選自一或數個SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、EQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71、或SEQ ID NO：76之核酸分子。

製備抗體、Fab及scFv之方法

本發明提供製備本文描述之抗體及其片段之方法。在一些態樣中，可藉由任何熟習此項技術者熟知之任何技術產生識別本文揭示之替格瑞洛及替格瑞洛及/或TAM之特異性抗原決定基的抗體之抗原結合片段。例如，可使用酶諸如木瓜酶(製備Fab片段)或胃蛋白酶(製備F(ab')₂片段)，藉由免疫球蛋白分子之蛋白酶裂解由抗體製備Fab及F(ab')₂片段。此外，可使用各種在此項技術中已知之噬菌體呈現方法產生如本文描述包括seFv及Fab之抗體。

一般而言，在噬菌體呈現方法中，功能抗體域係在攜帶編碼其之多核苷酸序列的噬菌體粒子表面上呈現。特定言之，編碼VH及VL域之DNA序列從動物cDNA庫(例如，淋巴組織之人類或哺乳動物cDNA庫)擴增。編碼VH及VL域之DNA藉由PCR與scFv連接子重組在一起及選殖為噬菌粒載體。該載體在大腸桿菌中電穿孔及大腸桿菌經輔助噬菌體感染。用於此等方法之噬菌體可係包括fd及M13之絲狀噬菌體及VH及VL域可以重組方式融合至噬菌體基因III或基因VIII。表現結合至替格瑞洛及/或TAM之抗原結合域之噬菌體可由抗原選擇或確定，例如使用標記抗原或結合或捕獲至固體表面或珠粒的抗原。相似地，結合至除替格瑞洛及/或TAM外或其他之抗原/半抗原的結合域可確定為取消選擇。用於製備本發明抗體之噬菌體呈現方法之實例可包括彼等在Brinkman等人，1995,J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等人，1995,J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等人，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等人，1997，Gene 187：9-18；Burton等人，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT申請案第PCT/GB91/O1 134號；PCT公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/1 1236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號、及第WO97/13844號；及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號中所揭示者；其各者之全文以引用的方式併入本文中。

如在上文參考文獻中所描述，在噬菌體選擇後，可自噬菌體單離抗體編碼區域及用於產生全抗體，包括人類抗體、或任何其他期望抗原結合片段(scFv及Fab)，及在任何期望宿主(包括哺乳動物細胞、 昆蟲細胞、植物細胞、酵母、及細菌，例如，如下文描述)中表現。亦可使用在此項技術中熟知之方法諸如彼等在PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax等人，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等人，1995，AJRI 34：26-34；及Better等人，1988，Science 240：1041-1043(該等參考文獻其全文以引用的方式併入本文中)中所揭示之方法，採用重組製備Fab、Fab'及F(ab')₂片段之技術。

在某些態樣中，本文揭示之核酸以可操作方式連接至在表現構造中之一或數個調節核苷酸序列。編碼抗體輕及重鏈之核酸序列可在相同表現載體中以任何方向(例如，輕鏈在重鏈前端或相反)選殖或可在兩個不同載體中選殖。若表現係使用一個載體進行，該兩個編碼基因可具有其各自遺傳因子(例如，啟動子、RBS、引導段、停止、polyA等等)或其可由單一組遺傳因子選殖，但與順反子相連。調節核苷酸序列將一般適宜於用於表現之宿主細胞。針對各種宿主細胞之數個類型之適當表現載體及適宜調節序列係在此項技術中熟知。通常，該一或數個調節核苷酸序列可包括(但不限於)啟動子序列、引導段或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始及終止序列、翻譯起始及終止序列、及增強或活化序列。如在此項技術中熟知之組成型或誘導型啟動子係由本發明設計。啟動子可係天然啟動子、或組合數個啟動子因子之雜合啟動子。表現構造可存在於細胞中之附加體(諸如質體)上、或表現構造可插入染色體中。

在某些態樣中，表現載體含有可選擇標記基因以容許選擇經轉形之宿主細胞。可選擇標記基因係在此項技術中為吾人熟知及可隨使用之宿主細胞變化。在某些態樣中，本發明係關於包括編碼多肽及以可操作方式連接至至少一調節序列之核苷酸序列的表現載體。調節序列係由技術識別及經選擇以直接表現編碼之多肽。由此，術語調節序列包括啟動子、增強子、及其他表現控制因子。舉例言之，非限制性 調節序列係在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology,Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。應瞭解，表現載體之設計可取決於諸如待轉形宿主細胞之選擇及/或期望表現之蛋白質類型之因素。此外，亦應考慮載體之複製數量、控制由載體編碼之任何其他蛋白質(諸如抗生素標記物)之複製數量及表現之能力。

製備本發明抗體之方法可包括，例如，可在容許抗體表現發生之適當條件下培養經編碼抗體之一或數個表現載體(例如，編碼重及輕鏈或其可變區之單一載體、或兩個載體，一者編碼重鏈及一者編碼輕鏈或其可變區)轉染的宿主細胞。可從細胞與含有該抗體之培養基的混合物中分泌及單離該抗體。或者，該抗體可保留在細胞質或膜部分中及細胞收穫、裂解及蛋白質單離。細胞培養物包括宿主細胞、培養基及其他副產物。適宜用於細胞培養之培養基係在此項技術中為吾人所熟知。該抗體可使用在純化蛋白質、抗體、及其抗原結合抗體片段之技術中已知之技術(包括離子交換層析法、凝膠過濾層析法、超微過濾、電泳、及免疫親和性純化)從細胞培養基、宿主細胞、或二者中單離。在某些態樣中，抗體係製備為包括重及輕鏈可變區之抗體之抗原結合片段(其可增加溶解性及促進純化)。

可藉由將選殖基因、或其部分連接至適宜用於在原核細胞、真核細胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)、或二者中表現之載體來製備重組核酸。用於製備重組多肽之表現媒劑包括質體及其他載體。例如，適宜載體包括以下類型之質體：用於在原核細胞(諸如大腸桿菌)中表現之pBR322-衍生之質體、pEMBL-衍生之質體、pEX-衍生之質體、pBTac-衍生之質體及pUC-衍生之質體。在某些態樣中，哺乳動物表現載體含有促進載體在細菌中增殖之原核序列，及一或數個在真核細胞中表現之真核轉錄單元。該pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、 pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及pHyg衍生之載體係適宜用於轉染真核細胞之哺乳動物表現載體之實例。一些此等載體經獲自細菌質體(諸如pBR322)之序列修飾以促進在原核及真核細胞中複製及耐藥性選擇。或者，病毒諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)、或艾司坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒((pHEBo、pREP-衍生及p205)之衍生物可用於在真核細胞中短暫表現蛋白質。製備質體及轉形宿主生物採用之各種方法係在此項技術中為吾人所熟知。關於原核及真核細胞之其他適宜表現系統，以及一般重組程序，參見Molecular Cloning A Laboratory Manual，第二版，由Sambrook,Fritsch與Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)第16及17章。在一些實例中，期望藉由使用桿狀病毒表現系統來表現重組多肽。此等桿狀病毒表現系統之實例包括pVL-衍生之載體(諸如pVL1392、pVL1393及pVL941)、pAcUW-衍生之載體(諸如pAcUW1)、及pBlueBac-衍生之載體(諸如含有ß-gal之pBlueBac III)。

用於製備融合基因之技術係為吾人所熟知。基本上，編碼不同多肽/抗體序列之各種核酸片段之接合係依照習知技術進行，採用用於連接、限制酶消解之平末端或交錯末端終點以提供適當終點，按需要填充黏性末端，鹼性磷酸酶處理以避免不期望接合及酶連接。在另一態樣中，可藉由包括自動DNA合成儀之習知技術合成融合基因。或者，可使用在兩連續核酸片段間產生互補懸垂體(其可隨後經退火以產生嵌合基因序列)之錨定引物進行基因片段之PCR擴增(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons：1992)。

在一些態樣中，表現任何本文描述之核酸的表現載體可用於在宿主細胞中表現抗體。例如，抗體可在細菌細胞諸如大腸桿菌、昆蟲 細胞(例如，使用桿狀病毒表現系統)、酵母、或哺乳動物細胞中表現。其他適宜宿主細胞係為熟習此項技術者所熟知。

一旦表現載體藉由習知技術轉移至宿主細胞，該經轉染之細胞隨後藉由習知技術培養以產生抗體。由此，本發明包括含有編碼抗體或其片段之多核苷酸的宿主細胞，以可操作方式連接至異源啟動子。在某些態樣中，重鏈及輕鏈及/或重及輕鏈可變區可在宿主細胞中共同表現(自相同或不同載體)以表現全部抗體。在某些態樣中，抗體之重及輕鏈可自單一啟動子表現。在某些態樣中，抗體之重及輕鏈可自多個啟動子表現。在某些態樣中，該抗體之重及輕鏈可在單一載體上編碼。在某些態樣中，抗體之重及輕鏈可在多個載體上編碼。

可用作表現重組抗體之宿主的哺乳動物細胞系係在此項技術中為吾人所熟知及包括獲自美國菌種保存中心(ATCC)之眾多永生細胞系，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉(HeLa)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎臟細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類上皮腎臟293細胞、及數個其他細胞系。不同宿主細胞具有後轉譯處理及修飾蛋白質及基因產物之特徵及特異性機制。可選擇適當細胞系或宿主系統以確保正確修飾及處理表現之抗體或其部分。為此，可使用具有適當處理基因產物之初級轉錄、糖苷化、及磷酸化之細胞機制的真核宿主細胞。此等哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0(不內源性地產生任何功能免疫球蛋白鏈之鼠類骨髓癌細胞系)、SP20、CRL7O3O及HsS78Bst細胞。在一態樣中，藉由使人類淋巴細胞永生開發之人類細胞系可用於重組製備單株抗體。在一態樣中，人類細胞系PER.C6.(Crucell，Netherlands)可用於重組製備單株抗體。

可用作表現重組抗體之宿主的額外細胞系包括(但不限於)昆蟲細 胞(例如，Sf21/Sf9，Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4)或酵母細胞(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、畢赤酵母屬(Pichia)、US 7326681；等等)、植物細胞(US20080066200)；及雞細胞(WO2008142124)。

在某些態樣中，本發明抗體係在細胞系中穩定表現。穩定表現可用於長期、高產率製備重組蛋白質、抗體及其抗原結合片段。例如，可產生穩定表現該抗體分子之細胞系。宿主細胞可經包括表現控制因子(例如，啟動子、增強子、轉錄終止區、多腺苷酸化位點等等)及可選擇標記基因之適當工程改造之載體轉形。在引人外源DNA後，可容許細胞在強化型培養基中生長1至2天，及隨後切換到選擇性培養基。在重組質體中之可選擇標記賦予選擇抗性及容許將質體穩定整合至其染色體的細胞生長及形成變異區，其繼而可經選殖及擴展為細胞系。以高產率製備穩定細胞系之方法係在此項技術中為吾人熟知，且試劑一般係市售的。

在某些態樣中，本發明抗體在細胞系中短暫表現。短暫轉染係其中引入細胞之核酸不整合至該細胞之基因組或染色體DNA的過程。其實際上作為細胞中染色體外元件(諸如附加體)維持。附加體之核酸之轉錄過程不受影響及產生由該附加體之核酸編碼之蛋白質。

經穩定或短暫轉染之細胞系係在此項技術中為吾人熟知之細胞培養基及條件下維持，從而產生單株抗體之表現及製備。在某些態樣中，哺乳動物細胞培養基係基於市售培養基調配物，包括，例如，DMEM或漢姆氏F12(Ham's F12)。在其他態樣中，改良該細胞培養基以提供在細胞生長及生物蛋白質表現方面之增長。如本文使用，術語「細胞培養基」、「培養基」、及「培養基調配物」指在多細胞生物或組織外部人工體外環境中維持、生長、增殖、擴展細胞之營養液。細胞培養基可針對特異性細胞培養用途優化，包括例如，經調配以促進細胞生長之細胞生長培養基、或經調配以促進重組蛋白質產生之細胞 生產培養基。本文可交換使用術語營養劑、成分、及組分以指構成細胞培養基之部分。

一旦已產生分子，其可藉由任何在純化免疫球蛋白分子或其片段之技術中已知之方法，例如，藉由層析法(例如，離子交換、親和性(特定言之藉由對特異性抗原蛋白質A或蛋白質G之親和性)、及尺寸排阻管柱層析法)、離心、差別溶解度、或藉由任何其他用於純化蛋白質、抗體、及/或抗體片段之標準技術純化。此外，本發明之分子或其片段可融合至本文描述或其他在此項技術中熟知促進純化之異源多肽序列(本文稱為「標籤」諸如組胺酸標籤)。

當使用重組技術時，分子可在細胞內、胞外質空間製備，或直接分泌至培養基。若在細胞內製備該分子，作為第一步驟，例如，藉由離心或超濾移除顆粒碎片(宿主細胞或裂解片段)。Carter等人，Bio/Technology，10：163-167(1992)描述一種單離分泌至大腸桿菌胞外質空間之抗體的程序。在分子分泌至培養基之情況下，一般首先使用市售蛋白質濃度過濾器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮此等表現系統之上清液。蛋白酶抑制劑諸如PMSF可包含於任何前述步驟以抑制蛋白水解及抗生素可包含在內以防止額外污染物生長。

可單獨或與其他純化步驟組合使用(例如)之氫氧磷灰鹽層析法、疏水相互作用層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、透析、及/或親和性層析來純化由細胞製備之組合物。作為親和性配位體之蛋白質A之適合性取決於分子中任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型物(若存在)，及將為熟習此項技術者所瞭解。附接親和性配位體之基質最通常係瓊脂糖，但其他基質可用。機械穩定基質諸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可達到與瓊脂糖相比容許更快流動速度及更短處理時間。其他蛋白質純化技術諸如在離子交換柱上分餾、乙醇沉澱、反 相HPLC、二氧化矽層析、肝素層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)SEPHAROSE層析、層析聚焦、SDS-PAGE、及硫酸銨沉澱亦係可用，端視待回收之分子而定。

在任何預備純化步驟後，包括所關注分子及污染物之混合物可接受使用洗脫緩衝液於介於約2.5至4.5之pH之低pH疏水交互層析，及於低鹽濃度(例如，約0至0.25M鹽)下進行。

可使用(例如)上文及/或在實例中列出技術之任一或組合製備及純化抗體。與如何純化抗體無關，為確認本發明抗體之功能結合，可(在純化前及/或後)進行結合分析。例如，可使用雙重ELISA分析。在一些態樣中，將第一抗原(例如，替格瑞洛或其競爭物)塗覆在孔上，及結合至此抗原固定製備其之抗體以用於檢測。

醫藥調配物

在某些態樣中，本發明提供醫藥組合物。此等醫藥組合物可係包括編碼抗體之核酸分子的組合物。此等醫藥組合物亦可係包括抗體、或抗體之組合、及醫藥上可接受之賦形劑之組合物。在某些態樣中，本發明之醫藥組合物係用作藥劑。

在某些態樣中，抗體或抗體之組合(或編碼抗體或抗體之組合之核酸分子)可與醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑調配為醫藥組合物。在某些態樣中，此等醫藥組合物係適宜經由任何一或數個投藥途徑使用在此項技術中熟知之方法投與給人類或非人動物。如熟習此項技術者瞭解，投藥途徑及/或方式可視所需結果變化。術語「醫藥上可接受之載劑」指一或數個不干擾活性成分生物活性之有效性的非毒性物質。此等製劑可通常含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容載劑、及視情況可選之其他治療劑。此等醫藥上可接受之製劑亦可含有適宜投與人類之相容固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質。可用於本文描述之調配物的其他預期載劑、賦形劑、及/或添加劑包括(例如)調味 劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質、蛋白質賦形劑諸如血清白蛋白、凝膠、酪蛋白、鹽形成抗衡離子諸如鈉及等等。適宜用於本文描述之調配物之此等及額外熟知之醫藥載劑、賦形劑及/或添加劑係在此項技術中熟知，例如，如在「Remington：The Science & Practice of Pharmacy」，第21版，Lippincott Williams & Wilkins，(2005)、及「Physician’s Desk Reference」，第60版，Medical Economics，Montvale,N.J.(2005)中列出。可選擇適宜用於期望或需要之投藥模式、溶解性及/或穩定性的醫藥上可接受之載劑。

本文描述之調配物包括以產生w/v適用於期望劑量之濃度的活性劑(例如，抗體或抗體片段諸如Fab或scFv)。在某些態樣中，該活性劑係以約1mg/ml至約200mg/ml、約1mg/ml至約100mg/ml、約1mg/ml至約50mg/ml、或約1mg/ml至約25mg/ml之濃度存在於調配物中。在某些態樣中，該活性劑係以約25mg/ml之濃度存在。在某些態樣中，在調配物中該活性劑濃度可從約0.1至約100重量%變化。在某些態樣中，該活性劑濃度係在0.003至1.0莫耳之範圍內。

在一態樣中，本發明調配物係實質上不具有內毒素及/或相關熱原性物質之無熱原調配物。內毒素包括侷限於微生物內部及僅當該微生物破碎或死亡時釋放之毒素。熱原性物質亦包括源自細菌或其他微生物外膜之引起發熱、熱穩定物質(糖蛋白)。若此等物質兩者投與人類均可引起發熱、低血壓及休克。由於潛在有害效應，甚至少量內毒素必須從靜脈內投與之醫藥藥品溶液中移除。美國食品與藥品管理局(「FDA」)已設置在靜脈內藥物應用一小時期間5內毒素單位(EU)/劑量/千克體重之上限(The United States Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum 26(1)：223(2000))。在某些特定態樣中，在組合物中內毒素及熱原含量係小於10EU/mg、或小於5EU/mg、或小於1EU/mg、或小於0.1EU/mg、或小於0.01EU/mg、或小於0.001 EU/mg。

當用於體內投藥時，本發明調配物應滅菌。本發明調配物可藉由各種滅菌方法滅菌，包括無菌過濾、輻射等等。在一態樣中，該調配物經預滅菌之0.22微米過濾器過濾滅菌。可根據習知醫藥實踐(如在「Remington：The Science & Practice of Pharmacy」，第21版，Lippincott Williams & Wilkins，(2005)中所描述)調配用於注射之無菌組合物。

本發明治療組合物可針對特定投藥途徑(諸如口服、經鼻、肺、局部(包括經頰及舌下)、直腸、陰道及/或非經腸投藥)進行調配。如文中所用，短語「非經腸投藥」及「經非經腸方式投與」指除經腸及局部投藥外之投藥模式，通常藉由注射，且包括(但不限於)經靜脈內、經肌內、經動脈內、經鞘內、經莢膜內、經眼窩內、經心臟內、經真皮內、經腹膜內、經氣管、經皮下、經表皮下、經關節內、莢膜下、蛛網膜下、經脊柱內、經硬膜外及經胸骨內注射及輸注。適宜局部或經皮投藥之本發明調配物包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、乳液、凝膠、溶液、貼片及吸入劑。該抗體可在滅菌條件下與醫藥上可接受之載劑、及任何可需要之防腐劑、緩衝劑、或推進劑混合(美國專利第7,378,110號；第7,258,873號；第7,135,180號；美國公開案第2004-0042972號；及第2004-0042971號)。

該調配物可方便地以單位劑型存在及藉由藥學技術中任何已知的方法製備。在本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量水平可變化以獲得有效達成針對特定患者、組合物及投藥模式之期望治療反應，而對患者不具有毒性的活性成分量(例如，「治療有效量」)。經選擇劑量水平將取決於多種藥物動力學因素，其包括採用之特定組合物之活性、投藥途徑、投藥時間、採用之特定化合物之排洩速度、治療持續期、其他藥物、與採用之特定組合物組合使用之化合物及/或 材料、待治療患者之年齡、性別、體重、狀態、一般健康及先前藥物史及在藥物技術中熟知之類似因素。適宜劑量可從約0.0001至約100mg/kg體重或更高變化，例如約0.1、1、10、或50mg/kg體重，約1至約10mg/kg體重係適宜。

應注意，本發明相似地設計，亦可製備適用於診斷及研究使用之調配物。可基於特定應用及預期用途選擇在此等調配物中之活性劑濃度，以及存在或缺乏賦形劑及/或熱原。

用途

本文揭示之抗體適用於包括組合治療之治療方法，其用於中和血小板活化、凝聚及脫粒抑制劑、血小板解聚促進劑、及抗血栓形成劑之活性。由此，發現本文描述之抗體可用於數個有關投與替格瑞洛之應用(包括伴隨方法)及係適宜用於中和替格瑞洛及/或替格瑞洛之一或數個代謝物之效應。在此等方法中，該抗體可視情況可逆地降低、中和、消除、或以其他方式抑制替格瑞洛之活性及治療或預防與替格瑞洛投藥相關聯及/或產生自包括替格瑞洛之治療的任何數量之效應、疾病及/或症狀。

該抗體可投與待治療或需要治療或預防替格瑞洛(BRILINTA)可治療及/或指明之適應症的患者，該等適應症包括(例如)不穩定心絞痛、動脈粥樣硬化之原發性動脈血栓形成併發症，諸如血栓形成或栓塞性中風、短暫性腦缺血發作、周邊血管疾病、具有或不具有血栓形成之心肌梗塞、由於動脈粥樣硬化疾病之干預諸如血管成形術(包括冠狀動脈成形術(PTCA)、動脈內膜切除術、支架放置、冠狀動脈及其他血管移植手術)所致的動脈併發症、外科手術或機械損傷(諸如在事故或手術創傷之後的組織補救、包括皮膚及肌瓣之整形手術)的血栓形成併發症、在瀰漫性血栓形成/血小板消耗組分之病狀諸如廣泛性血管內凝固、血栓形成性血小板減少症性紫癜、溶血症候群、敗血 病之血栓形成併發症、成人呼吸窘迫症候群、抗磷脂症候群、肝素引發之血小板減少症及預驚厥/驚厥、或靜脈血栓形成諸如下胺深靜脈血栓、靜脈閉塞疾病、血液病狀諸如骨髓增生性疾病，包括血小板增多症、鐮狀細胞疾病；或預防機械引發之體內血小板活化，諸如心肺旁路及體外膜氧合(預防微小血栓栓塞症)、機械引發之體外血小板活化，諸如用於保存血液產品，例如，血小板濃縮物、或分流閉塞(諸如在腎透析及血漿除去法)，血管損傷/炎症諸如脈管炎、動脈炎、血管球性腎炎、炎性腸病及器官移植排斥反應，症狀(諸如偏頭痛)繼發之血栓。

在一些實施例中，本文揭示之抗體可投與給將要接受或已接受包括替格瑞洛之治療，及需要治療或將要需要治療與以下相關聯之出血或潛在出血之患者：冠狀動脈繞道移植手術(CABG)、胸心手術、縱膈再探、術後中風、機械換氣法、在加護病房中長期停留、非心臟外科手術(例如，神經或眼科手術、腎柱外科手術、顱內手術、眼眶手術、矯形外科手術、腎切除術、部分結腸切除術等等)。因此，本文提供之方法可涵蓋與替格瑞洛共同治療(同時)、或在投與替格瑞洛後一段時間(例如，數分鐘、數小時、或數天)內之抗體投與。例如，在一些實施例中，該方法可包括在投與替格瑞洛10至120分鐘內將該抗體投與給已經投與替格瑞洛之患者。在一些實施例中，該方法可包括在投與替格瑞洛1至48小時內將該抗體投與給已經投與替格瑞洛之患者。在一些實施例中，在不容許替格瑞洛及/或其代謝物從受試者新陳代謝及消除之一定時間內將該抗體投與給已經投與替格瑞洛之受試者。

在一些實施例中，本發明提供一種抑制替格瑞洛或其活性代謝物對患者之(P2Y₁₂)受體之效應之方法。

在一些實施例中，本發明提供一種抑制替格瑞洛或其活性代謝 物結合至患者之P2Y₁₂受體之方法。

在一些實施例中，本發明提供一種在已經投與替格瑞洛之患者中活化ADP誘發之血小板凝聚之方法。

本發明之抗體(諸如在實例中例示之彼等)亦可用於診斷目的。例如，可在受試者之組織或細胞中檢測一或數個靶試劑(替格瑞洛或其代謝物)以測定或篩選受試者中替格瑞洛之循環量。診斷套組可包括一或數個抗體、及用於指示抗體與替格瑞洛或其代謝物(若任一者存在)反應之檢測系統。

由此，本發明設計抗體之數個用途，包括治療、診斷及研究用途。診斷及研究用途可係體內或體外。

套組

本發明之另一態樣係一種套組。在一態樣中，套組包括上文描述之核酸、抗體、表現載體、或宿主細胞的組合物或醫藥組合物中之任一者，及引導適當使用或投藥之說明書或標識。視情況，套組亦包括一或數個容器及/或注射器或其他裝置以促進遞送或使用。本發明設計用於進行研究分析、診斷分析及/或用於投與治療有效量之組分之全部或任何子集係封裝於套組中。相似地，該套組可包括用於藉由(例如)在適宜條件下培養表現編碼本發明抗體之核酸的宿主細胞製備抗體之說明。舉額外實例言之，用於治療性投與本發明抗體之套組可包括含有該抗體之醫藥調配物的溶液、或該抗體之凍乾製劑、及將該組合物按投與給有需要之患者及/或用於復水該凍乾產品之說明。在某些實施例中，該套組進一步包括在適宜投與給受試者之調配物中的替格瑞洛(例如，BRILINTA^TM、BRILIQUE^TM)。在此等實施例中，該套組進一步包括用於投與抗體及替格瑞洛調配物二者給有經抗體、經替格瑞洛、或經抗體及替格瑞洛二者治療需要之患者的說明。

本發明亦涵蓋最終包裝及標識之醫藥產品。此製品包括在適當 容器或容納物諸如玻璃瓶或其他氣密密封容器中之適當單位劑型。就適宜於非經腸投與該活性成分(例如，上文描述之抗體及/或替格瑞洛調配物)之劑型而言，係滅菌及適宜作為無顆粒溶液投藥。在某些態樣中，該調配物適宜用於可注射投藥途徑。在一些實施例中，該投藥係皮下。在一些實施例中，該投藥係靜脈內投藥。由此，設計包括注射或輸注至人類或動物的投藥途徑。

在一特殊態樣中，本發明調配物係在單一劑量瓶中調配為無菌液體。例示性容器包括(但不限於)小瓶、瓶、預填充注射器、IV袋、氣泡包裝(包括一或數個九劑)。視情況與此(等)容器相關聯的係以由管理藥品或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構規定之形式的注意事項，其注意事項反映由製造、使用或銷售用於人類診斷及/或投藥之機構批准。

如同任何醫藥產品，設計包裝材料及容器以在存儲及運輸期間保護該產品之穩定性。此外，本發明產品包括使用說明或建議醫生、技術者人員或患者如何適當預防或治療討論之疾病或病症的其他資訊材料。換言之，製品包括表明或建議包括(但不限於)實際劑量、監測程序等等之投藥方案，及其他監測資訊的說明書構件。

用於診斷分析之套組可包括含有本發明抗體的溶液或抗體之凍乾製劑，其中該抗體特異性結合至替格瑞洛及/或其代謝物，以及用於檢測此抗體之試劑。該抗體可根據在此項技術中熟知及本文描述之方法，包括(但不限於)標識，諸如小分子熒光標籤、蛋白質諸如生物素、GFP或其他熒光蛋白質、或抗原決定基序列諸如his或myc進行標識。相似地，用於檢測抗體之一級抗體可包括於該套組內。一級抗體可指向在抗體上之序列或標識抗體所用之標識、標籤、或抗原決定基。一級抗體可繼而經標識以用於檢測或若需要進一步放大信號，則可藉由二級抗體(其可亦包括於該套組內)檢測一級抗體。

亦設計用於研究用途之套組。此等套組可(例如)類似於預期用於診斷或治療用途之套組但進一步包括指明將該套組及其用途僅限於研究目的之標識。

實例

縮寫清單

實例1：半抗原之製備及特性分析

此實例描述合成、優化、單離、及特性分析若干用於產生如本文描述之例示性抗體之半抗原的方法。該等半抗原包括替格瑞洛、替 格瑞洛代謝物(TAM及TIM)、生物素化之替格瑞洛、及生物素化之腺苷(參見，例如，呈未生物素化之形式的化學半抗原結構之圖2)。如在國際專利公開案WO 2000/034283(Guile等人，2000)中所描述合成替格瑞洛及如在國際專利公開案WO 1999/005143(Guile等人，1999)中所描述合成TAM，各者其全文以引用的方式併入本文。

使用Biotage矽膠40S、40M、12i或Merck矽膠60(0.063至0.200mm)進行直相層析。使用標準玻璃或塑料管柱或在Biotage Horizon系統上進行急驟層析。使用溶劑作為內標物給出以ppm計之化學位移。僅當在NMR中檢測時記錄在雜原子上之質子諸如NH及OH質子及可由此忽視。

實例1.1：生物素化之替格瑞洛

N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基)-5-(丙硫基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,3-二羥基環戊基)氧基)乙基-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑1-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己醯胺(1.1)

(i)製備甲磺酸2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基-5-(丙硫基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)氧基)乙酯(1.a)

於0℃下，將甲磺醯氯(0.086mL，1.10mmol)逐滴添加至2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)氧基)乙醇(參見Springthorpe,B.等人Bioorg.Med.Chem.Lett.,，2007，17，6013-6018)(0.563g，1.0mmol)與TEA(0.209mL，1.50mmol)在DCM(5mL)中之溶液。歷時3h將該混合物從0℃攪拌至約5℃。使用DCM(30mL)稀釋該反應混合物及使用水(5mL)洗滌。藉由經過相分離器乾燥該混合物。蒸發溶劑及自甲苯共蒸發獲得呈黃色稠油之標題化合物(1.a)(714mg，111%)，其用作粗製物而不經進一步純化。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 1.02(dd,3H),1.3-1.47(m,5H),1.55(s,3H),1.72(d,2H),2.20(d,1H),2.6-2.71(m,2H),2.97(s,3H),3-3.19(m,3H),3.57-3.68(m,1H),3.69-3.79(m,1H),4.02(td,1H),4.13-4.24(m,2H),4.78(dd,1H),5.13(td,1H),5.57(s,1H),6.50(s,1H),7.03(s,1H),7.07-7.16(m,2H)。

¹⁹F NMR(376MHz,CDCl₃)δ -141.37(J=21.3),-138.10(J=21.3)。

(ii)製備3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-疊氮基乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.b)

將甲磺酸2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)氧基)乙酯(1.a)(0.641g，1mmol)及疊氮化鈉(0.070mL，2.00mmol)在DMF(7mL)中之混合物在氮氣氛圍下加熱至60℃持續15.5h。形成白色沉澱。添加水(20mL)及使用TBME(100+40mL)萃取該產物兩次。經Na₂SO₄乾燥有機相。過濾有機相及於減壓下移除該溶劑。藉由急驟層析法在2 x 8cm二氧化矽管柱上使用庚烷/EtOAc 1/1作為溶離劑純化該殘留物(TLC，其使用庚烷/EtOAc 1/1(Rf產物=0.5))。收集相關溶離份及蒸發該溶劑獲得呈透明稠油之標題化合物(1,b)(514mg，87%)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 1.00(s,3H),1.33-1.42(m,5H),1.59(s,3H),1.73(d,2H),2.17(s,1H),2.68(t,2H),2.96-3.17(m,3H),3.19-3.33(m,2H),3.52-3.63(m,1H),3.72(ddd,1H),4.03(td,1H),4.79(dd,1H),5.13(td,1H),5.54(dd,1H),6.43(s,1H),6.96-7.23(m,3H)。

(iii)製備中間產物3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-胺基乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.c)

將在EtOH(99.5%)(2mL)中之3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-疊氮基乙氧基)-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.b)(62.0mg，0.11mmol)添加至Pd/C(5% Pd，50重量% Pd/C，22.46mg，5.28μmol)及於大氣壓力下氫化該混合物2h。經由HYFLO®過濾該反應混合物及進一步使用EtOH(99.5%)沖洗塞柱。在減壓下移除該溶劑，將該殘留物再次溶於DCM(2 x 2mL)及在減壓下移除該溶劑。藉由急驟層析在2 x 2cm二氧化矽管柱上使用DCM/NH₃(飽和)在MeOH中之95/5作為溶離劑純化該殘留物。收集相關溶離份獲得標題化合物(1.c)(41mg，69%)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 0.98(m,3H),1.28-1.46(m,7H),1.54(s,3H),1.62-1.81(m,2H),2.15(s,1H),2.48-2.81(m,4H),3.07(tt,3H),3.34-3.47(m,1H),3.53(ddd,1H),3.99(td,1H),4.79(dd,1H),5.12(td,1H),5.52(dd,1H),7.02(s,1H),7.09(dt,2H),7.23(s,1H)。

¹⁹F NMR(376MHz,CDCl₃)δ -141.43(J=21.3),-138.13(J=21.3)。

(iv)製備中間產物(1S,2S,3S,5R)-3-(2-胺基乙氧基)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)環戊烷-1,2-二醇(1.d)

將預冷卻之冰/水浴溫的TFA(8mL，103.84mmol)與水(0.88mL，48.85mmol)之混合物添加至預冷卻之具有3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-胺基乙氧基-2,2-二甲基四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-N-((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(1.c)(340mg，0.61mmol)之燒瓶中。於0至5℃下攪拌該反應混合物1h。在減壓下移除該溶劑及將殘留物溶於DCM(100mL)及使用NaHCO₃(飽和10mL)洗滌。將鹽水(5mL)添加至水相及使用EtOAc(30mL)萃取此。經Na₂SO₄乾燥合併之有機相。過濾，接著蒸發該溶劑獲得米白色固體粗產物。藉由製備型HPLC在XBridge C18管柱(10μm 250 x 50 IDmm)上使用35至75%梯度之ACN在H₂O/ACN/NH₃ 95/5/0.2中之緩衝液以100mL/min之流速純化該化合物20分鐘。藉由UV於298nm檢測該等化合物。在減壓下將峰溶離份蒸發至乾燥。殘留物溶於DCM及經相分離器過濾。在減壓下移除溶劑，獲得標題化合物(1.d)(213mg，67.5%)。LC-MS m/z 522.3(M+H)⁺。

(v)製備化合物N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基-5-(丙硫基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2,3-二羥基環戊基)氧基)乙基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己醯胺。(1.1)

將6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(21.77mg， 0.04mmol)添加至(1S,2S,3S,5R)-3-(2-胺基乙氧基)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)環丙基)胺基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)環戊烷-1,2-二醇(20mg，0.04mmol)在無水DMF(1.0mL)中之溶液及將該混合物置於氮氣氛圍及於室溫下攪拌6h。於40℃在減壓下移除該溶劑。藉由製備型HPLC在Kromasil C18管柱(10μm 250 x 20ID mm)上使用20至60%梯度之ACN在H₂O/ACN/FA 95/5/0.2中之緩衝液以19mL/min之流速純化該化合物20分鐘。藉由UV於298nm檢測該化合物。收集、濃縮、及冷凍乾燥峰溶離份以獲得標題化合物(1.1)(21.4mg，57.3%)。

¹H NMR(600MHz，DMSO)：存在兩種旋轉異構體(比例5：1)，獲自主要旋轉異構體之信號於δ 0.81(t,3H),1.15-1.64(m,20H),2.03(ddd,7H),2.12(ddd,1H),2.57(d,1H),2.59-2.67(m,1H),2.77-2.89(m,2H),2.93(dd,1H),2.96-3.01(m,4H),3.05-3.12(m,1H),3.15(td,1H),3.18-3.25(m,2H),3.39-3.46(m,1H),3.48(tt,1H),3.7-3.76(m,1H),3.92(s,1H),4.08-4.14(m,1H),4.30(dd,1H),4.54(dd,1H),4.95(q,1H),5.06(s,1H),5.13(d,1H),6.35(s,1H),6.42(s,1H),7.07(d,1H),7.31(ddt,2H),7.71(dt,2H),7.82(t,1H),9.36(d,1H)。選擇獲自較少旋轉異構體之信號於δ 0.98(CH ₃ ),8.95(ArNH)。

[C₄₅H₆₅F₂N₁₁O₇S₂]⁺之HRMS計算值：974.4556；實測值：974.4585(M+H)⁺

實例1.2：生物素化之腺苷

N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己醯胺(1.2)

(i)製備N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基-2,2-二甲基四氫呋喃[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己醯胺(1.e)

於室溫下，將DMF(2mL)添加至6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(55.6mg，0.10mmol)及9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(胺基甲基-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基-9H-嘌呤-6-胺(30mg，0.10mmol)(參見Austin,D.J.及Liu,F.，Tetrahedr.Lett.，2001，3153-3154)及將該反應混合物置於氮氣氛圍下及攪拌1h又45min以獲得(1.e)。隨後於減壓下移除該溶劑。用作粗產物而不經進一步純化。LC-MS m/z 759(M+H)⁺，757(M-H)^-。

(ii)製備最終化合物N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己醯胺(1.2)

將TFA(1.8ml，23.36mmol)與水(0.2mL，11.10mmol)之混合物添加至粗製N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺基)己醯胺基)己醯胺(1.e)(76mg，0.1mmol)及於0℃攪拌該反應混合物1小時25分鐘。在減壓下移除該溶劑及殘留物溶於DMSO。藉由製備型HPLC在XBridge C18管柱(10μm 250 x 19 IDmm)上使用5至45%梯度之CAN在H₂O/ACN/NH₃ 95/5/0.2中之緩衝液以19mL/min之流速純化該化合物20分鐘。藉由UV於259nm檢測該化合物。濃縮及冷凍乾燥峰溶離份以獲得呈白色酥鬆固體之標題化合物(1.2)(50mg，69.6%)。

¹H NMR(600MHz,DMSO,40℃)δ 1.17-1.26(m,4H),1.27-1.4(m,6H),1.43-1.54(m,7H),1.62(ddt,1H),1.99-2.06(m,4H),2.12(t,2H),2.58(d,1H),2.82(dt,1H),2.96-3.05(m,4H),3.05-3.14(m,1H),3.36(dt,1H),3.44(dt,1H),3.96(dd,1H),4.04(dd,1H),4.11-4.15(m,1H),4.29-4.33(m,1H),4.67(dd,1H),5.16(d,1H),5.38(d,1H),5.84(d,1H),6.29(s,1H),6.33(d,1H),7.25(s,2H),7.64(dt,2H),8.11(t,1H),8.16(s,1H),8.31(s,1H)。針對[C₃₂H₅₀N₁₀O₇S]⁺之HRMS計算值：719.3657；實測值：719.3667(M+H)⁺

實例2：單離及鑑定抗替格瑞洛/TAM抗體

此實例闡明可用於製備針對替格瑞洛及其代謝物、結構相似於ATP及含有類腺苷核心之化合物之抗體的策略及技術(Springthorpe等人，2007 Bioorg Med Chem Lett.17：6013-6018)。替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝物(TAM)及替格瑞洛非活性代謝物(TIM)之化學結構在圖2中 顯示。如上文討論，本文揭示及產生之抗體可結合并中和替格瑞洛及TAM及可結合至TIM，但不結合或顯著抑制其他結構相關化合物諸如腺苷。當對TIM之結合活性係本文揭示抗體之可選特徵時，由於TIM通常代表替格瑞洛代謝物之小或不重要部分，所以預期顯示對TIM結合活性之抗體不會影響所需該抗體/解毒劑之劑量。

靶向常用抗原決定基(即替格瑞洛及TAM之獨特R基團(二氟苯基-環丙基及硫丙基取代基))以賦予針對彼等化合物之抗體結合特異性及選擇性。所關注抗原決定基在圖2中由虛線圈出。在實例1中描述之半抗原用於將抗體抗原決定基引導朝向二氟苯基-環丙基及硫丙基取代基。如在實例1中描述，用於生物素化之半抗原(生物素化之替格瑞洛及生物素化之腺苷)之連接子位於二元醇基上。此策略容許製備對未修飾之二-氟苯基-環丙基及硫丙基、生物素化之替格瑞洛/TAM具有結合特異性之抗體，及亦能夠用於篩選及取消選擇結合腺苷之抗體庫。

使用已知技術，人類scFv噬菌體呈現庫可用於產生scFv抗體，及特異性scFv在一系列重複選擇生物素化替格瑞洛而取消選擇生物素化腺苷之循環中從庫中單離，基本上如在Lloyd等人，2009 PEDS 22：159-168(以引用的方式併入本文中)中所描述。選擇從循環2及循環3選擇輸出之數個個別純系，scFv在細菌周質中表現及在三個平行生物化學分析中篩選特異性。該分析篩選i)結合至生物素化之替格瑞洛(分析1)，ii)結合至生物素化之腺苷(分析2)及iii)在50倍過量未經修飾替格瑞洛存在下結合至生物素化之替格瑞洛(分析3)以確認對替格瑞洛而非生物素化連接子之特異性。

使用相同一般技術及策略進行分析1、2及3。簡言之，結合至生物素化之替格瑞洛或生物素化之腺苷之粗製周質scFv樣品之HTS係使用HTRF^®分析技術進行。HTRF^®(均相時差式熒光)係基於TR-FRET(時差式熒光共振能量轉移)原理。簡言之，TR-FRET採用從供體熒光團 (在此情況下銪穴狀化合物)至受體熒光團(在此情況下XL⁶⁶⁵)之能量轉移。條件係供體及受體熒光團係在足夠接近(約<10nm)，銪穴狀化合物供體之激發(337nm)導致能量轉移至XL⁶⁶⁵受體，其繼而發射於665nm下之熒光信號。此技術可用於藉由將供體及受體熒光團(直接或間接)附接至在特定交互作用下之各結合搭檔來敏感地測量生物分子交互作用。scFv結合至生物素化替格瑞洛之HTS形式(分析1)係在下文表示及依賴在生物素化替格瑞洛及his標記之周質scFv兩者中化學標籤之存在： 銪穴狀化合物鏈黴抗生物素蛋白：生物素化之替格瑞洛：scFv-His：抗-His-XL⁶⁶⁵

在包括DPBS pH 7.4(Gibco 14190-086)、KF(VWR 103444T)(0.4M)及Tween 20(Sigma P9416)(0.05%)之緩衝液中以10μl之分析體積使用黑色淺孔384孔分析板(Corning/Costar 3676)進行該分析。藉由添加5μl生物素化之替格瑞洛(60nM以獲得30nM最終濃度)、2μl之周質scFv樣品(20%最終濃度)及3μl含有銪穴狀化合物標記之鏈黴抗生物素蛋白(CisBio 610SAKLB)(4.2nM以獲得1.26nM最終濃度)及XL⁶⁶⁵標記之抗-His抗體(CisBio 61HISXLB)(40nM以獲得12nM之最終濃度)之溶液建立該分析。建立除添加2μl分析緩衝液代替周質scFv處外含有全部上文分析組分之陰性結合對照孔。該分析板於室溫下培養4小時，然後使用其中樣品於337nm激發及時差熒光發射於620nm及665nm測量之標準HTRF讀取方案在Envision板讀取器上讀取。

原始665nm及620nm計數首先轉化為665nm/620nm比值及隨後結果表示為△F(%)值。根據以下等式計算△F：△F(%)={((樣品665/620比)-(陰性665/620比))/(陰性665/620比例)}x100

(採用獲自陰性結合對照孔之陰性比例)。在此分析中提供大於100%之△F值的scFv定義為命中物(hit)。

如上文描述之相同方案用於進行粗製周質scFv樣品對結合至生物素化腺苷之HTS(最終分析濃度30nM)。分析2之形式可如下列出描繪：銪穴狀化合物鏈黴抗生物素蛋白：生物素化之腺苷：scFv-His：抗-His-XL⁶⁶⁵

分析3採用如上文描述之相同方案以進行鑑定在過量游離未經修飾替格瑞洛存在下顯示對生物素化替格瑞洛減低結合之粗製周質scFv樣品的HTS。此方案由分析1改良，在於在50倍莫耳過量之游離未經修飾替格瑞洛(1500nM)存在下進行分析3。

命中物定義為結合至生物素化之替格瑞洛(在分析1中△F>100%)，而不結合至生物素化之腺苷(在分析2中△F<25%)及在過量游離未經修飾之替格瑞洛存在下>50%減低之結合至生物素化之替格瑞洛。分析1及3數據之相關性之一實例在圖3中顯示。在過量游離未經修飾之替格瑞洛存在下，數個scFv顯示受限抑制，表明其與替格瑞洛及連接子之某些組分具有結合相互作用。在過量游離之未經修飾替格瑞洛存在下，鑑定抑制(>50%)對生物素化替格瑞洛之結合的scFv之子集。基於在分析3與分析1中觀察到之結合抑制%(50至80%、80至90%、>90%)分類scFv，其中提供>90%抑制之scFv(包括TICA0072)優先用於進一步特性分析。將序列獨特scFv命中物轉化為Fab及使用標準技術在CHO細胞中表現。

Fab表現及純化

獨立之HC及LC表現質體用於暫時轉染，基於由Persic等人1997描述之表現載體。修飾該載體以含有EBV複製起點(OriP)。該Fab(HC)載體僅含有恆定區1(CH1)及鉸鏈區，CH2及CH3被移除。根 據製造商建議將HC及LC DNA添加至150mM NaCl及25-kDa直鏈PEI(Polysciences Europe，Germany 23966)。隨後將DNA-PEI複合物添加至適合懸浮培養之由CHOK1細胞系(ECACC編號：85051005)衍生之中國倉鼠卵巢野生型(CHO wt)細胞(Daramola O等人2014)。7天後，藉由離心收穫該細胞及過濾上清液。該含有Fab蛋白質之細胞培養上清液直接裝載至於5ml/min之流速下使用Äkta純化儀(GE Healthcare)之填充有5ml CaptureSelect IgG-CH1(Life Technologies,Carlsbad，USA)之層析管柱。根據樹脂製造商之說明，平衡該管柱及使用pH 7.2之經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)洗滌及使用20mM檸檬酸鈉、150mM氯化鈉，pH 3.5(CaptureSelect IgG-CH1)洗脫。在分析前將洗脫之Fab調整至pH 5.5及過濾(0.22μm Steriflip，Millipore EMD，Bethdesa,USA)。藉由於280nm之吸光度使用DU520 UV/vis光譜儀(Beckman Coulter，Brea，USA)測定蛋白質濃度。使用TSK凝膠G3000SWxl管柱(Tosoh Bioscience，Tokyo，Japan)及於1.0ml/min下運行之1100 HPLC系統(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)測定樣品純度。

實例3：抗替格瑞洛/TAM之Fab

詢問含有市售藥物之結構資料庫(「DrugsDB」，Oprea T.I等人，2011 Mol.Inform.30(2-3)，100-111，以引用的方式併入本文中)以確定具有替格瑞洛之某些結構相似性之分子。一旦確定，此等結構相似分子用於測試除腺苷及其磷酸化形式(例如，ADP及ATP)外Fab之結合特異性。詢問該資料庫具有與替格瑞洛2D指紋相似性、3D形狀、及靜電相似性之分子，基於替格瑞洛X-射線及NMR結構。從此電腦分析中，選擇包括六種潛在協同藥物之一組12種化合物。此等化合物之結構在圖4中顯示。

於競爭結合分析形式中研究特異性，其中測試各個測試化合物 競爭性抑制生物素化替格瑞洛與相關Fab之交互作用之能力或其他方面。HTRF^®競爭分析形式如下文列出使用，其中目的係藉由一組測試化合物測量結合至各個His-Fab之生物素化替格瑞洛之競爭：銪穴狀化合物抗His抗體：測試His-Fab：生物素化之替格瑞洛：XL⁶⁶⁵標識之鏈黴抗生物素蛋白。

此基本分析形式用於評估獲自先導分離及先導優化期結束時之先導Fab的選擇性曲線及出於此等研究之目的使用His-Fab表現載體產生Fab。

在黑色淺孔384孔分析板(Corning/Costar 3676)中以20μl分析體積在包括DPBS pH 7.4(Gibco 14190-086)、KF(VWR 103444T)(0.4M)及BSA(PAA K05-013)(0.1%)的緩衝液中進行該分析。涉及添加5μl生物素化之替格瑞洛、5μl各個測試選擇性化合物之滴定、5μl相關His-Fab及5μl含有銪穴狀化合物標識之抗-His抗體(CisBio 61HISKLB)(5.33nM以獲得1.33nM之最終濃度)及XL⁶⁶⁵標識之鏈黴抗生物素蛋白(CisBio 611SAXLB)(40nM以獲得10nM之最終濃度)的組合溶液建立該分析。建立除添加5μl分析緩衝液代替添加測試選擇性化合物外含有全部上文分析組分的總結合對照孔。建立除添加5μl分析緩衝液代替添加His-Fab外含有全部包括於總結合對照孔之分析組分的陰性結合對照孔。取決於特定實驗，測試化合物系列滴度係1/2或1/3及在化合物特異性基礎上優化最高最終分析化合物濃度。在獨立實驗中，於Fab特異性基礎上優化生物素化之替格瑞洛及His-Fab之濃度。對於在先導分離期結束時研究之四個Fab(TICA0010、TICA0049、TICA0053及TICA0072)而言，使用之最終分析試劑濃度在下文表1中列出：

對於在先導優化期結束時研究之兩個Fab(TICA0162及TICA0212)而言，在兩種情況下使用之最終分析試劑濃度係5nM生物素化之替格瑞洛及1nM His Fab。若干用於此等實驗中之測試選擇性化合物溶於100%DMSO及在分析信號中媒劑有關之降低可開始出現於大於約1%DMSO之濃度。為能夠隨後標準化數據以校正任何此媒劑有關之效應，單獨DMSO之平行滴定係包含於多數實驗中，其中最終分析DMSO濃度反映彼等測試化合物連續稀釋之濃度。在建立程序末期，在Envision板讀取器上使用標準讀數方案讀取前，於室溫培養該分析3小時。

對於隨後數據分析而言，首先將原始665nm及620nM計數轉化為665nm/620nm比值，其隨後用於根據分析1中陳述之等式計算△F%值。用於計算△F%之陰性比值係由陰性結合對照孔衍生。△F值%隨後用於根據下文等式計算特異性結合值%：特異性結合(%)={(樣品△F-陰性結合△F)/(總結合△F-陰性結合△F)}x100

對於標準計算特異性結合%而言，總結合△F係獲自含有分析之全部上文提及之組分但不具有任何競爭性測試化合物的總結合對照孔。

在其中應用DMSO標準化之彼等實驗中，基本上根據上文等式計算DMSO標準化之特異性結合%，除非此情況下總結合△F係獲自含有全部在總結合對照孔中之組分以及DMSO濃度等於其在相關樣品孔中之濃度的孔。

獲自此類型初始實驗之結果在表2中匯總。在研究之四個初始Fab之三者(TICA0010、TICA0049及TICA0053)中，化合物坎格瑞洛顯示競爭性抑制Fab結合至生物素化之替格瑞洛。在TICA0049情況下，潘妥拉唑及利奈唑胺均顯示部分競爭性抑制。如在表2中顯示，TICA0072 Fab不顯示抑制十二種化合物中之十一者，而潘妥拉唑顯示弱部分抑制。

在此第一系列實驗中測試之全部四個Fab中觀察到抑制未經修飾之替格瑞洛及TAM，IC₅₀值落於0.1μM至0.5μM範圍。亦檢測四個Fab之二者(TICA0049及TICA0072)對TIM之競爭性抑制，然而，IC₅₀值>50μM，表明與未經修飾之替格瑞洛及TAM相比大幅度降低之對TIM親和性。基於在表2中結果，確定TICA0072具有最有利選擇性曲線。基於在剩餘三個Fab中此Fab顯示最少結合至坎格瑞洛之標準確定TICA0049為潛在備用。

NI係無抑制。

在第二系列實驗中產生TICA0049及TICA0072 Fab之進一步選擇性數據，其中連同替格瑞洛、TAM及TIM及若干腺苷相關化合物重新測試在圖4中列出之一組十二個化合物之四者。此處，對在表2中較早研究之細化，設計實驗以使得百分數特異性結合值標準化以校正任何由於DMSO之非特異性媒劑有關效應。描繪獲自此第二系列實驗之數據的實例係在圖5中顯示，連同在表3中製表之IC₅₀值。

如同較早實驗，TICA0072顯示是最有利選擇性曲線，而在測試之四個化合物中僅潘妥拉唑顯示微弱部分抑制(>1500μM)。在TICA0049情況下，坎格瑞洛及潘妥拉唑觀察到顯著抑制而利奈唑胺及布拉地新觀察到微弱抑制。應注意，針對某些分析化合物在第一與第二系列實驗間絕對IC₅₀值之細微差異基本上不改變總體結論。此等差異可能源自下列事實組合：將DMSO標準化整併至第二系列實驗的事實，並與在若干情況下吾人嘗試測量非常弱抑制之事實。

對於TICA0049及TICA0072兩者而言，針對替格瑞洛及TAM測得之IC₅₀值在0.3μM至0.5μM之範圍，而針對TIM之IC₅₀值在大於2對數值，分別高於74.8μM及119.5μM。對於TICA0049及TICA0072 Fab二者而言，在腺苷、ADP、ATP及後二化合物之甲基硫代衍生物中觀察到輕微抑制，然而此僅於測試之最高化合物濃度下檢測到且不視為顯著。

由此得出結論，TICA0072係唯一視為對替格瑞洛及TAM具有特異性之Fab。

實例4：抗替格瑞洛/TAM Fab之親和性測量

使用生物層干涉計在Octet Red384上測定上文產生之抗替格瑞洛Fab之親和性。對於親和性測量而言，抗替格瑞洛Fab抗體在分析緩衝液(PBS，Tween20 0.05%，BSA 0.02%)中稀釋至2x最終分析濃度之濃度，例如200nM。在Greiner聚丙烯96孔板中製備10點2倍連續稀釋之替格瑞洛。隨後將等體積(例如，70μL加70μL)經稀釋之抗體及游離替格瑞洛轉移至第二Greiner聚丙烯板。藉由吸量管混合該樣品，使用板蓋覆蓋及容許於室溫平衡3至5天。在平衡後，將60μL抗體/替格瑞洛滴定以一式兩份轉移至384孔黑色傾斜底聚丙烯板。在分析緩衝液中將生物素化之替格瑞洛稀釋至250nM及添加至384孔分析板之前2欄之交替孔，剩餘孔僅含有分析緩衝液。將鏈黴抗生物素蛋白生物感 測器在分析緩衝液中預先浸漬至少10分鐘。樣品板及生物感測器隨後放置在OctetRed384之載物台上。

全部分析於室溫下進行。在分析緩衝液中基線平衡60sec後，將生物素化之替格瑞洛裝載在鏈黴抗生物素蛋白生物感測器上300sec，接著在分析緩衝液600sec以建立新基線。該抗體/替格瑞洛混合物隨後容許與生物素化之替格瑞洛感測器表面締合30至600sec，取決於使用之抗體濃度而定。使用OctetRed數據分析軟體分析所得締合期數據。針對各個樣品，將信號對齊至基線及減去參考感測器信號(無抗體對照)，隨後使用KinExA n型曲線分析軟體導出用於分析之數據。使用Constant Partner分析，測定抗替格瑞洛Fab抗體之平衡KD。數據顯示Fab TICA0072及TICA0049分別具有7.4nM及11.6nM之替格瑞洛親和性(表4)。

實例5：優化抗替格瑞洛/TAM抗體TICA0072

使用基於親和性之噬菌體選擇優化抗體TICA0072。使用如描述之標準分子生物技術(Clackson及Lowman 2004 Practical Approach Series 266)藉由可變重(VH)互補決定區(CDR)1、2或3或可變輕(VL)鏈CDR1、2或3之寡核苷酸導向突變創建由先導scFv序列衍生之大型scFv庫。該庫經歷基於親和性噬菌體呈現選擇以選擇具有對替格瑞洛及TAM較高親和性之變異體。簡言之，在具有減低生物素化之替格瑞洛濃度(典型實例應係20nM至20pM，經四個選擇循環後)的溶液中培養scFv噬菌體粒子，基本上如先前描述(Thompson等人，1996 J Mol Biol.256(1)：77-88)。製備獲自CDR靶向選擇輸出之代表性數個個別 scFv的粗製含有scFv之周質提取物及在HTRF^®抗原決定基競爭性分析形式中篩選，該分析形式設計為篩選相對於TICA0072之親和性之改良。

簡言之，為篩選具有改良親和性之scFv及Fab變異體，HTRF^®抗原決定基競爭性分析係藉由測試scFv變異體基於在親本TICA0072 IgG與生物素化之替格瑞洛間之交互作用的競爭性實施。此分析用作初級單點HTS以篩選粗製周質抽提物scFv樣品以及作為多點二級譜化(profiling)分析以測量純化之scFv及Fab變異對親本TICA0072之IC₅₀值之改良。雖然抗原決定基競爭性分析(諸如本文描述之一者)並非一般用於測定絕對親和性值，但是此等分析可用作基於親和性之HTS的基礎。此外，純化之scFv/Fab變異體(相對於親本scFv/Fab)之IC₅₀倍數改良可提供良好親和性總倍數增益之指示及可代表在先導優化活動中親和性分級scFv/Fab變異體之有效途徑。本文描述之TICA0072親本IgG基抗原決定基競爭性分析之形式在下文列出： 銪標識之鏈黴抗生物素蛋白：生物素化之替格瑞洛；TICA0072 IgG：XL⁶⁶⁵標識之抗人類Fc抗體

在包括DPBS pH 7.4(Gibco 14190-086)、KF(VWR 103444T)(0.4M)及Twcen 20(Sigma P9416)(0.05%)之緩衝液中於黑色淺孔384孔分析板(Corning/Costar 3676)中進行此分析。對於粗製周質scFv變異體之單點測試而言，使用10μl分析體積，然而當在多點二級IC₅₀譜化分析中測試純化scFv及Fab時，使用20μl分析體積。

對於單點HTS，藉由添加3μl TICA0072 IgG(53.3nM以獲得16nM最終濃度)、2μl粗製周質提取物scFv樣品、2.5μl生物素化之替格瑞洛(8nM以獲得2nM最終濃度)及2.5μl含有銪標識之鏈黴抗生物素蛋白(CisBio 610SAKLB)(3nM，用於0.75nM之最終分析濃度)及XL⁶⁶⁵標識之抗人類Fc抗體(CisBio 61HFCXLB)(30nM以獲得7.5nM之最終 分析濃度)的組合溶液建立該分析。親本TICA0072粗製周質scFv用作基準點及HTS經組態以識別提供相對於親本改良抑制之變異體。總結合對照孔含有除添加2μl分析緩衝液代替scFv樣品外全部分析組分。陰性結合對照孔含有除添加3μl分析緩衝液代替TICA0072 IgG外全部總結合對照孔組分。

對於純化scFv/Fab變異體之多點IC₅₀測試而言，藉由添加5μl TICA0072 IgG(53.3nM以獲得16nM最終濃度)、5μl 1/3滴定之純化測試scFv或Fab變異體、5μl生物素化之替格瑞洛(8nM以獲得2nM最終濃度(scFv譜化)、4nM以獲得1nM最終分析濃度(Fab譜化))及5μl含有銪標識之鏈黴抗生物素蛋白(CisBio 610SAKLB)(3nM，用於0.75nM最終分析濃度)及XL⁶⁶⁵標識之抗人類Fc抗體(CisBio 61HFCXLB)(30nM以獲得7.5nM之最終分析濃度)之組合溶液建立該分析。在全部實驗中純化之親本TICA0072(scFv或Fab)係用作基準使得使用優化之變異體(scFv或Fab)測得之IC₅₀之改良可表示為相對親本TICA0072之倍數改良。總結合對照孔含有除添加5μl分析緩衝液代替純化scFv或Fab樣品處外全部分析組分。陰性結合對照孔含有除添加5μl分析緩衝液代替TICA0072 IgG外總結合對照孔之全部組分。

在分析之單點HTS及多點IC5₀譜化版本中，於室溫培養板3小時，然後使用其中於337nm激發樣品及於620nm及665nm測量時差熒光發射之標準HTRF讀取方案在Envision板讀取器上讀取。

原始665nm及620nm計數用於根據早前分別在分析1及4中描述之等式計算△F(%)及特異性結合%。對於多點二級譜化實驗而言，藉由Graphpad Prism軟件使用S形劑量反應(可變斜率)曲線擬合(4參數邏輯方程)測定IC₅₀值。

在篩選中識別之Hit，即當與親本TICA0072 scFv相比時顯示顯著改良之抑制效應之scFv變異體，經歷DNA測序，及隨後將獲自可變重 CDR1、CDR2或CDR3及可變輕庫CDR1、CDR2或CDR3輸出之獨特變異體製備為純化scFv及在相同分析中重新測試以測定濃度反應IC₅₀曲線。隨後將顯示最多改良之IC₅₀值之scFv變異體製備為Fab及在下文描述之第二代抗原決定基競爭性分析中測試。

用於篩選/分級最高親和性Fab之第二代抗原決定基競爭性分析

為在先導優化活動末期非常高親和性純化Fab間有效區分，實施另一HTRF^®抗原決定基競爭性分析，然而在此情況下該分析係基於結合至生物素化之替格瑞洛的中間產物親和性優化之TICA0072世系IgG(TICA0159)而不是親本TICA0072 IgG之競爭性抑制。此分析僅用於多點IC₅₀譜化形式(而不是HTS形式)及基本上與以在分析5(上文)中針對在親本TICA0072 IgG基抗原決定基競爭性分析中純化Fab變異體之多點IC₅₀譜化給出之方法相同地進行。唯一差異係在分析建立適當點使用TICS0159 IgG代替TICS0072 IgG但是相同16nM最終分析濃度。在全部其他態樣中，此分析精確地如上文在針對純化Fab之多點二級譜化版本中描述進行。

與TICA0072基抗原決定基競爭性分析所能達到相比，使用部分優化之抗體TICA0159替代TICA0072之第二代分析能夠更有效區分及分級最高親和性Fab。

最多改良之VH識別為CDR3變異體TICA0162。最多改良之VL識別為CDR3變異體TICA0152。為產生進一步親和性改良，使用標準分子生物技術將源自經改良抗體之不同CDR組合為新Fab。自此重組操作，TICA0162與TICS0152之組合產生具有進一步改良之抗原決定基競爭曲線的新Fab TICA0212。在第二代抗原決定基競爭性分析中描繪之TICA0072、TICA0152、TICA0162及TICA0212 Fab競爭曲線係在圖6中顯示，測得之IC₅₀值在表5中。TICA0212顯示IC₅₀之相對於親本TICA0072 Fab之約2對數改良。

實例6：優化之抗替格瑞洛/TAM Fab之親和性測量

使用KinExA3200測定在實例5中產生之抗替格瑞洛/TAM Fab之親和性。對於KinExA親和性測量而言，首先藉由使其與1mg鏈黴抗生物素蛋白在50mM NaHCO₃中反應整夜製備珠粒(600mg吖內酯珠粒)。在使用2種變化之Tris緩衝液(1M Tris pH 8.7，10mg/mL BSA)阻斷之後，該鏈黴抗生物素蛋白塗覆之珠粒以8mL總體積再懸浮。使用PBS徹底清洗珠粒(1.33mL，等於100mg初始乾燥吖內酯珠粒)，隨後容許在1mL PBS中結合至約2.5μg生物素-替格瑞洛10分鐘並且偶爾攪拌。使用PBS清洗所得生物素-替格瑞洛塗覆之珠粒，隨後再懸浮於含有0.1%BSA及0.02%NaH₃之50mL PBS中及於室溫儲存直至轉移至KinExA珠粒小瓶。

基本上如先前描述之方法進行抗體/替格瑞洛樣品製備。在分析緩衝液(PBS，Tween20 0.05%，BSA 0.02%，0.02% NaN₃)中將抗替格瑞洛Fab抗體稀釋至2倍於最終分析濃度之濃度(例如200nM)。在Falcon 50mL聚丙烯管中製備10點2倍連續稀釋之替格瑞洛。隨後將等體積(例如5mL加5Ml)稀釋之抗體及游離替格瑞洛轉移至第二Falcon聚丙烯管中。藉由吸量管混合樣品及容許於室溫平衡3至5天。平衡後，將該樣品管轉移至KinExA 3200以用於分析。

全部分析於室溫進行。取樣抗體/替格瑞洛混合物及容許與生物素-替格瑞洛珠粒混合同時清洗掉未結合之游離替格瑞洛。隨後使用 DyLight649標識之小鼠抗人類重及輕鏈抗體檢測結合之抗體。樣品體積(300至1300pL)及注射時間(90至120s)隨濃度變化，及每樣品變化2至3珠粒。使用KinExA n型曲線分析軟體分析數據。使用Constant Partner分析測定抗替格瑞洛Fab抗體之平衡KD。

如先前實例，在20倍過量濃度之未經修飾替格瑞洛或TAM存在下容許Fab於室溫平衡。將生物素化之替格瑞洛裝載在鏈黴抗生物素蛋白塗覆之珠粒表面。平衡後，容許剩餘游離抗體結合至生物素化之替格瑞洛。隨後使用DyLight649標識之小鼠抗人類重及輕鏈檢測抗體檢測結合之抗體。使用至少三個不同混合濃度之抗體製備游離替格瑞洛或TAM之滴定以產生在表觀KD中具有至少10倍偏移之獨立滴定曲線。使用KinExA Pro n型曲線分析軟體分析數據以測定游離替格瑞洛或TAM之平衡KD。Fab TICA0212具有約20pM之未經修飾替格瑞洛及TAM之親和性(表6)。根據平衡數據，TICA0212證實結合至替格瑞洛及TAM之相當高親和性(~20pM)。

加粗自親本TICA0072之序列殘基之變化，及kabat號碼係針對在TICA0072中特定殘基進行確定。

實例7：抗替格瑞洛/TAM Fab TICA0162及TICA0212之特異性

如在實例3中測試Fab TICA0162及TICA0212之特異性及經DMSO 標準化。TICA0162及TICA0212之全部可用選擇性數據之匯總表係包含於表7。此外，描繪獲自其中連同替格瑞洛、TAM、TIM及之數個腺苷族化合物測試的在圖4中列出之十二個化合物之五者之實驗的數據之實例係在圖7中顯示。

NI係無抑制。

如由數據闡明，TICA0212(NEDI2452)具有實質上對替格瑞洛及TAM相當結合特異性，及較弱結合至TIM。此外，MEDI2452/TICA0212不顯示明顯結合至任何其他結構相關藥物或腺苷相關化合物。

實例8：蛋白質結晶學

將具有C末端his-標籤之TICA0072在PBS中濃縮至9mg/ml。藉由添加溶於DMSO之1mM替格瑞洛達成複合物形成。在使用沉滴式蒸汽擴散方法進行結晶試驗前，於室溫培養該複合物2小時。使用3種商業篩進行廣泛篩選及獲得若干命中物。由Morpheus^®(Molecular Dimensions，UK)命中物網格優化獲得最佳繞射晶體。藉由混合等體積TICA0072-替格瑞洛複合物與12.8% PEG 3350、12.8% PEG 1000、12.8% MPD、1.7% 1,6-己二醇、1.7% 1-丁醇、1.7% 1,2-丙二醇、1.7% 2-丙醇、1.7% 1,4丁二醇、1.7% 1,3-丙二醇、25mM咪唑、25mM二甲胂酸鈉、25mM MES及25mM Bis-Tris pH 6.5之貯槽溶液於20℃生長該用於結構測定之晶體。在液氮中急驟冰凍該晶體而不添加任何低溫保護劑。

以約15mg/ml之濃度含在PBS中之TICA0212/MEDI2452與替格瑞洛混合至1mM之濃度及在進行廣泛篩選前於室溫培養2小時。未獲得自發命中物。藉由在30μl孔溶液中粉碎數個晶體製備獲自TICA0072-替格瑞洛晶體之晶種及用於MMS(微晶種基質篩選)至廣泛商業篩。獲得若干命中物，但用於結構測定之晶體於20℃在20%甘油、20% PEG 4000、10% 2-丙醇、0.1M NaCl及0.5M NaAcetate pH 4.6條件下生長。使用0.2μl蛋白質、0.18μl孔溶液及0.02μl晶種原液製備該滴劑。在液氮中急驟冰凍該晶體而不添加任何低溫保護劑。

於歐洲同步輻射設備(Grenoble，France)之射束線ID23-1收集數 據。使用AutoProc工作流程[Vonrhein,C.等人，Acta Cryst.2011；D67：293-302]處理、按比例調整及進一步降低該數據，參見表8統計。對於TICA0072而言，藉由分子替代使用高解析度Fab結構(PDB標識碼laqk，[Faber C.等人，Immunotechnology.1998；3：253-70])作為起始模型完成初始相。對於TICA0212/MEDI2452而言，TICA0072結構用作起始模型。使用Coot[Bricogne G.等人，(2011).BUSTER版本2.11.4.Cambridge,United Kingdom：Global Phasing Ltd]進行模型重建及使用自動粉粹機[Emsley,P.等人，Acta Crystallogr.,Sect.D：Biol.Crystallogr.2004，D60，2126-2132]進行細化。最終模型統計參見表8。

以1.7Å解析度測定在與替格瑞洛之複合物中TICA0072之結構(圖10)。CDR形成高度凹曲面及替格瑞洛深插入VH與VL域間界面。通常在小型半抗原中觀察到此結合類型。除VL CDR2外全部CDR直接構成替格瑞洛結合及大部分VH CDR3異常。替格瑞洛之二氟苯基位於經包括游標殘基VH Trp47、VL Phe98及VH CDR3殘基Leu100L之疏水性殘基填充之凹穴中。與替格瑞洛交互之主要殘基係VL Trp91，其涉及pi-堆疊對抗類腺苷核心及氫鍵接至於環戊基部分之核糖羥基之一。額外對類腺苷核心之交互作用由VH CDR1 His35及VH CDR3 Tyr99提供。硫丙基取代基堆疊對抗VH CDR2環之主鏈。在環戊基部分之羥基乙基取代基伸至溶劑及不產生任何與Fab之交互作用。

在親和性改良之Fab TICA0212/MEDI2452結構中，替格瑞洛結合係相似於具有全部上文提及交互保留但具有一些重要差異之TICA0072之替格瑞洛結合(圖10B)。VL CDR3突變Asp92Leu及Ser94Asp之組合破壞在VL CDR3環中之氫鍵以產生更「鬆弛」結構。新構型與關於附著環丙基-二氟苯基取代基15°傾斜之嘧啶環相關。嘧啶環之新位置使其與Fab72相比在TICA0212/MEDI2452中約0.2Å更接近VH CDE3Tyr99。此外，VL Ile93Tyr引入產生與VH CDR3環路之交互作用的氫鍵供體，由此限定進一步結合位點。

TICA0212/MEDI2452之晶體結構顯示替格瑞洛限制於V_H與V_L界 面間之深裂隙。由於晶體結構表明羥基乙基不涉及任何與TICA0212/MEDI2452之交互作用，證實經由三醯胺連接子至羥基乙基之使用生物素標識替格瑞洛之設計策略。此進一步由Fab亦以相同親和性結合缺乏羥基乙基之TAM的事實支持。TICA0212/MEDI2452顯示弱結合至缺乏環丙基-二氟苯基之TIM。在TICA0212/MEDI2452-替格瑞洛複合物中，該環丙基-二氟苯基埋於疏水凹穴底部及必須在對準具有V_L CDR3殘基Trp L91之替格瑞洛類腺苷核心時發揮關鍵結構作用。由於替格瑞洛化學起始點係ATP及其保留類腺苷核心，解毒劑特異性之關鍵屬性係證實不結合腺苷。此先導單離策略包含高產量及詳細特異性分析及藉由競爭性或直接結合分析檢測不結合腺苷。根據結構分析，可期望腺苷之嘌呤環及核糖基模擬替格瑞洛之類腺苷核心之交互作用。然而，缺乏結合可由不存在兩個顯著降低相對形狀互補性及結合交互之疏水性的疏水性R基(環丙基-二氟苯基及硫丙基)解釋。

親本TICA0072及TICA0212/MEDI2452之結構分析顯示在親和性成熟期間引入一些改變之重要性。在V_L CDR3中之突變顯示出具有特別重大影響，從而產生在TICA0212/MEDI2452中不同環路構型及額外氫鍵以限定結合凹穴。相比之下，在V_H CDR3中突變之影響係結構較不明顯。此等獲自結構之觀察係部分由含有僅在V_L CDR3(TICA0152)或V_H CDR3(TICA0162)中修飾之修飾抗體的數據確認，其與TICA0072相比分別導致200倍及50倍改良。然而，儘管V_L CDR3改變顯示具有較高影響，二組突變添加顯著改良。應注意晶體結構係複合物之靜止圖片及不能捕捉涉及結合之任何蛋白質及配位體動態。

實例9：在替格瑞洛或TAM存在下體外TICA0212/MEDI2452濃度依賴性恢復之血小板凝聚

在富含人類血小板之血漿(PRP)中使用光透射集合度測定法測定 TICA0212/MEDI2452逆轉替格瑞洛或TAM介導之抑制ADP誘發之血小板凝聚的程度及能力。

對於體外人類PRP分析而言，從空腹健康志願者藉由頭靜脈靜脈穿刺收集血液。在將等分試樣收集至含有0.109M檸檬酸鈉之試管前丟棄最初之2mL血液，1+9(檸檬酸鹽+血液)，至10.9mM之最終濃度。於240 x g離心抗凝血之人類血液15min。小心移除PRP及轉移至乾淨小瓶中。藉由於2000 x g離心PRP 15min製備貧血小板血漿(PPP)。藉由血小板凝聚測繪器(PAP-8E，Bio/Data Corporation，PA，USA)在PRP中評估光透射集合度(LTA)。零%凝聚定義為PRP之光透射及100%凝聚定義為PPP之光透射。

在與不同濃度TICA0212或同型物對照Fab共培養30分鐘前，使用1μM替格瑞洛或TAM預培養PRP 1小時。藉由添加20μM ADP引發血小板凝聚及持續記錄6min。分析於6min之最終凝聚(FA)程度數據。

計算提供半最大值逆轉之TICA0212/MEDI2452濃度(IC₅₀)。TICA0212/MEDI2452產生1μM替格瑞洛及1μM TAM介導之20μM ADP-誘發之血小板凝聚抑制之濃度依賴性逆轉，計算之平均(n=5)IC₅₀值分別為0.64及0.78μM(圖8)。當於1：1條件(1μM TICA0212/MEDI2452：1μM替格瑞洛或TAM)評估時，逆轉之平均程度分別係78%及62%。同型物對照Fab不引發明顯替格瑞洛及TAM ADP誘發之血小板凝聚的逆轉。例如，在30min培養後，同型對照Fab分別產生-3%及2%替格瑞洛及TAM逆轉。

由此，數據顯示TICA0212/MEDI2452可以濃度依賴方式體外逆轉替格瑞洛及TAM介導之ADP誘發血小板凝聚之抑制。當在1：1實驗設置評估時(可預測當TICA0212/MEDI2452以1：1化學計量比結合至替格瑞洛或TAM時)，達成最大及幾乎完全之逆轉效應。

實例10：在替格瑞洛或TAM存在下TICA0212/MEDI2452有效及 快速恢復體外血小板凝聚

在富含人類血小板血漿(PRP)中使用如在實例8中之光透射集合度測定法測定TICA0212/MEDI2452逆轉替格瑞洛或TAM之起效時間。在添加1μM TICA0212/MEDI2452及共培養5、10、15、30及60分鐘，或添加同型物對照Fab共培養30分鐘前，使用1μM替格瑞洛或TAM預培養PRP1小時。藉由添加20μM ADP引發血小板凝聚及持續記錄6min。分析於6min之最終凝聚(FA)程度數據。

TICA0212/MEDI2452產生無關共培養時間之相似對替格瑞洛介導之抑制之逆轉程度，在5、10、15、30及60分鐘後平均(n=3)逆轉程度分別係85%、69%、74%、80%、及81%。相似地，在5、10、15、30及60分鐘後由TICA0212/MEDI2452引發之平均(n=3)TAM逆轉程度分別係53%、56%、58%、69%、74%。TICA0212/MEDI2452快速及有效逆轉替格瑞洛及介導之ADP誘發之血小板凝聚之抑制。在與同型物對照Fab共培養30min後不存在逆轉(平均(n=3)-2%)。根據此數據，當以1：1實驗設置評估時TICA0212/MEDI2452顯示快速及有效逆轉替格瑞洛及TAM介導之ADP誘發凝聚之抑制。

實例11：在投藥給經替格瑞洛治療之小鼠後TICA0212/MEDI2452有效及快速恢復體內血小板凝聚

在靜脈內(i.v.)投與小鼠替格瑞洛後，體外測定在全血(阻抗集合度測定法)中TICA0212/MEDI2452介導之逆轉替格瑞洛介導之ADP誘發的血小板凝聚之抑制的起效速度及程度。經5分鐘靜脈內呈1200μg/kg大劑量投與小鼠替格瑞洛，接著15分鐘持續輸注30μg/kg/min。在終止替格瑞洛輸注後，當測量之替格瑞洛血漿暴露為平均1.4μM時，給予小鼠250mg/kg TICA0212/MEDI2452之靜脈大劑量。在5、30、及60min TICA0212/MEDI2452投藥後，殺死小鼠及收集血樣。在此研究中測量ADP誘發之凝聚反應6min及數據表示為在隨時間記 錄之凝聚單位(AU)曲線下方的平均面積(AU*min)。

在進行阻抗集合度測定法分析時，殺死小鼠及將血樣收集至7μM水蛭素。在多板微測試單元中將血液(175μL)添加至預加熱之NaCl₂(37℃，175μL)及在添加12μL ADP至6.5μM最終濃度前混合3min。該可棄式多板微測試單元含有攪拌棒及具有兩對分離之浸入血樣中的電極。

當添加促效劑(ADP)及藉由拌攪引發剪切時，血小板開始附著及凝聚在電極上。這導致電極上阻抗增加，其藉由多板阻抗集合度計(DynaByte，Munchen，Germany)隨時間持續記錄。

由於在替格瑞洛輸注及PBS大劑量後5、30及60min時，平均(n=4)凝聚反應分別從432降低至2、從474至6及從494至14AU*min(圖9)，所以替格瑞洛處理誘發幾乎完全之ADP誘發之凝聚抑制。由於在替格瑞洛輸注及TICA0212大劑量後5、30、及60分鐘時，平均(n=4)凝聚反應分別從2增加至147、從6至448及從14至412AU*min(圖9)，所以TICA0212/MEDI2452介導之體內替格瑞洛介導之抑制之逆轉。由於平均(n=4)凝聚反應仍從6至4AU*min未改變，在投與同型物對照後30分鐘不存在逆轉。

此數據顯示，當靜脈內大劑量給予投與至1.4μM替格瑞洛血漿濃度(其提供完全ADP誘發凝聚之抑制)之小鼠時，TICA0212/MEDI2452可快速及有效恢復ADP誘發之血小板凝聚。

實例12：經替格瑞洛治療小鼠之小鼠出血

由於TICA0212/MEDI2452期望適應症之一係作為用於需要緊急手術之替格瑞洛患者的解毒劑，在設計為應在手術開始前達成完全逆轉之模擬臨床設置之小鼠出血實驗中評估TICA0212/MEDI2452。

經由持續輸注替格瑞洛(300μg/kg/min)或媒劑20分鐘預處理小鼠。在停止輸注後，t=0，經45秒給予TICA0212/MEDI2452(600 mg/kg)或媒劑(組胺酸蔗糖緩衝液)之大劑量及於t=30分鐘藉由切斷5mm尾尖誘發出血。使用水(2mL/min)淋洗尾尖及在小容器中收集血液與水之混合物，其中攪拌混合該液體以增強溶血作用及建立均相溶液。當從腹部大動脈收集末端血樣時記錄於525nm之光透射30分鐘用於血小板凝聚。光透射率可轉化為吸光度及用於計算作為在吸收曲線下面積(AUC，吸光度*s)之血液損失及藉由繪製隨時間之吸光度計算總出血時間(BT，s)。全部低於95%之透射率定義為出血。亦於替格瑞洛輸注(t=0)末期及於尾部切斷(t=30分鐘)時收集血小板凝聚及全部與游離血漿暴露樣品。

由瑞典哥德堡大學(University of Göteborg，Sweden)的動物研究倫理委員會批准研究。使用異氟醚氣體(Forene®，Abbot Scandinavia AB，Sweden)麻醉小鼠。將導管插入左側頸靜脈以用於投與媒劑或藥物。體溫藉由外熱維持於38℃。

為將TICA0212/MEDI2452對血小板凝聚之效應轉化為潛在出血效應，進行預防小鼠尾部出血研究。將替格瑞洛分別融合至7.6及0.3μM之平均總體格瑞洛及TAM血漿濃度以提供顯著藥物依賴性出血窗。在停止替格瑞洛輸注後立即經30秒投與600mg/kg TICA0212/MEDI2452之單一大劑量。在30分鐘後，ADP誘發之凝聚全部正常化及替格瑞洛之平均游離血漿濃度從4.7nM降低至低於0.03nM(量化下限)。藉由尾部切斷引發出血及監測30分鐘。在經媒劑處理之小鼠中，於尾部切斷時平均總替格瑞洛及TAM血漿濃度係2.4及0.6μM。經30分鐘總血液損失及出血時間係分別由替格瑞洛顯著(p<0.05)加強約3.8倍及1.6倍。TICA0212/MEDI2452顯著(p<0.05)逆轉血液損失及相對於單獨替格瑞洛之出血時間及恢復至不顯著區別於未經替格瑞洛處理之小鼠的程度(圖12)。在此預防設置下，TICA0212/MEDI2452使替格瑞洛依賴性出血正常化。從體外模型轉移 至此體內模型之30分鐘起效時間證實TICA0212/MEDI2452可使血液損失及出血時間恢復至未經替格瑞洛處理之小鼠的血液損失及出血時間。

實例13：替格瑞洛及TAM之總血漿濃度

在具有EDTA抗凝血劑之試管中收集血樣及在10000 x g下於室溫離心5min於以製備血漿。藉由蛋白質沉澱及使用串聯式質譜法之液相層析(LC-MS/MS)測定替格瑞洛及TAM之血漿濃度，如在具有如下偏差之已公開方法[Sillén H.等人，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2010；878：2299-306]中描述。血漿(50μL)係使用180μl內標物(D7-ZD6140)在乙腈中進行蛋白質沉澱。該液相層析系統及質譜儀係獲自Waters之Acquity Ultra Performance LC耦合Xevo TQ-S質譜儀。在Aquity UPLC® BEH C18管柱上(2.1 x 50mm，粒度1.7μm)達成層析分離。採用陰性電噴霧電離。溶離劑A係含有10mmol/L乙酸銨之水，pH 5及溶離劑B係含有10mmol/L乙酸銨之乙腈。注射體積係1至5μL及該分析梯度起始於4%B，在1.5min內增加至95%，維持直至2.3min，然後在2.4min內返回初始條件，接著再次平衡0.3min。在此分析中不使用品質對照樣品。定量下限(LLOQ)係0.005μmol/L及校正範圍係0,005至15.0uM。

藉由添加1%甲酸(FA：樣品，1：5)，接著蛋白質沉澱及如上文描述之LC-MS/MS測定在TICA0212/MEDI2452存在下替格瑞洛及TAM之總血漿濃度。將甲酸添加至樣品以促進替格瑞洛及TICA0212/MEDI2452之解離。

實例14：替格瑞洛游離血漿濃度

基於先前公開之方法[Sillén H.等人，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2011 Aug 1；879(23)：2315-22]優化該方法。將容許具有低於6至8kDa質量之分子通過的透析膜(Spectrum Laboratories，Inc)在ELGA水中浸泡10至15min及放置在半透析板間(室內製備)。在透析板一側添加130μL血漿及將130μL磷酸鹽緩衝液(pH7.0)添加至相對側。在兩側之孔使用蓋子封住及將鋁板放置在該板各側頂部以避免滲漏。該板隨後垂直放置在於100rpm/min在37℃之迴轉式振盪器上持續24h。藉由將50μL滯留物從血漿側及75μL透析物從緩衝液側轉移至蛋白質LoBind PCR清潔96深孔板來終止透析，該深孔板含有150μL在乙腈中之各自75μL內標物(D7-ZD6140)。混合該板1min及隨後，1500 x g於4℃離心20min。在離心後，轉移50μL獲自沉澱滯留物之上清液及使用50μL ELGA H₂O稀釋，然後LC-MS/MS(Acquity Ultra Performance LC耦合Xevo TQ-S質譜儀，Waters)分析。在該分析中不使用品質對照樣品。滯留物校準範圍係0.4至1000nmol/L及透析物校準範圍係0.003至50nmol/L。在透析物中替格瑞洛之LLOQ中係0.03nmol/L。

下文表9提供上文實例中描述之例示性抗體之概述及用於說明本文揭示技術之某些實施例。

參考文獻及以引用之方式併入

1. Van Giezen JJ、Nilsson L、Berntsson P等人，Ticagrelor binds to human P2Y(12) independently from ADP but antagonizes ADP-induced receptor signalling and platelet aggregation. J Thromb Haemost. 2009;7(9):1556-1565。

2. Wallentin L、Becker RC、Budaj A等人，Ticagrelor versus clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med. 2009;361:1045-1057。

3. Amsterdam EA、Wenger NK、Brindis RG等人，2014 ACC/AHA guideline for the management of patients with non-ST-elevation acute coronary syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. Circulation. 2014;000:000-000。

4. Storey RF、Angiolillo DJ、Patil SB等人，Inhibitory effects of ticagrelor compared with clopidogrel on platelet function in patients with acute coronary syndromes: the PLATO (PLATelet inhibition and patient Outcomes) PLATELET substudy. J Am Coll Cardiol. 2010;56(18):1456-1462。

5. Taylor G、Osinski D、Thevenin A等人，Is platelet transfusion efficient to restore platelet reactivity in patients who are responders to aspirin and/or clopidogrel before emergency surgery？ J Trauma Acute Care Surg. 2013;74:1367-1369。

6. Prüller F、Drexler C、Archan S、Macher S、Raggam RB、Mahla E. Low platelet reactivity is recovered by transfusion of stored platelets: a healthy volunteer in vivo study. J Thromb Haemost. 2011;9(8):1670-1673。

7. Hansson EC、Shams Hakimi C、Åström-Olsson K等人，Effects of ex vivo platelet supplementation on platelet aggregability in blood samples from patients treated with acetylsalicylic acid, clopidogrel, or ticagrelor. Br J Anaesth. 2014;112(3):570-575。

8. Thiele T、Sümnig A、Hron G，Platelet transfusion for reversal of dual antiplatelet therapy in patients requiring urgent surgery: a pilot study. J Thromb Haemost. 2012;10:968-971。

9. Pehrsson S、Hansson K、Nylander S，Ticagrelor-induced bleeding in mice can be reversed by FVIIa (NovoSeven^®) and FII. J Am Coll Cardiol. 2013;61(10S):E212。

10. Dolgin E. Antidotes edge closer to reversing effects of new blood thinners. Nat Med. 2013;19(3):251。

11. Crowther MA、Ageno W、Garcia D等人，Oral vitamin K versus placebo to correct excessive anticoagulation in patients receiving warfarin: a randomized trial. Ann Intern Med. 2009;150:293-300。

12. Schiele F、Van Ryn J、Canada K等人，A specific antidote for dabigatran: functional and structural characterization. Blood. 2013;121:3554-3562。

13. Lu G、DeGuzman FR、Hollenbach SJ等人，A specific antidote for reversal of anticoagulation by direct and indirect inhibitors of coagulation factor Xa. Nat Med. 2013;19:446-451。

14. Storey RF、Husted S、Harrington RA等人，Inhibition of platelet aggregation by AZD6140, a reversible oral P2Y12 receptor antagonist, compared with clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol. 2007;50:1852-1856。

15. Husted SE、Storey RF、Bliden K等人，Pharmacokinetics and pharmacodynamics of ticagrelor in patients with stable coronary artery disease: results from the ONSET-OFFSET and RESPOND studies. Clin Pharmacokinet. 2012;51(6):397-409。

16. Teng R、Oliver S、Hayes MA、Butler K. Absorption, distribution, metabolism, and excretion of ticagrelor in healthy subjects. Drug Metab Dispos. 2010;38(9):1514-1521。

17. Daramola O、Stevenson J、Dean G等人，A high-yielding CHO transient system: coexpression of genes encoding EBNA-1 and GS enhances transient protein expression. Biotechnol Prog. 2014;30(1):132-141。

18. Oprea TI、Nielsen SK、Ursu O等人，Associating Drugs,Targets and Clinical Outcomes into an Integrated Network Affords a New Platform for Computer-Aided Drug Repurposing. Mol Inform. 2011;30:100-111。

19. Springthorpe B、Bailey A、Barton P等人，From ATP to AZD6140: the discovery of an orally active reversible P2Y12 receptor antagonist for the prevention of thrombosis. Bioorg Med Chem Lett. 2007;17:6013-6018。

20. Fanning SW1、Horn JR. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Sci. 2011;20:1196-1207。

21. Zhang K、Zhang J、Gao ZG等人，Structure of the human P2Y12 receptor in complex with an antithrombotic drug. Nature. 2014;509:115-118。

22. Cattaneo M、Schulz R、Nylander S. Adenosine-mediated effects of ticagrelor: evidence and potential clinical relevance. J Am Coll Cardiol. 2014;63:2503-2509。

23. Sillén H、Cook M、Davis P. Determination of unbound ticagrelor and its active metabolite (AR-C124910XX) in human plasma by equilibrium dialysis and LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011;879(23):2315-2322。

本文提及之所有公開案及專利申請案其全文係以引用的方式併入文中，其程度就如同個別公開案或專利申請案特定地且個別地以引用的方式併入般。

當討論本發明之特殊態樣時，上文說明書係闡述性及並非限制性。對熟習此項技術者而言，在審查此說明書及下文申請專利範圍後，本發明之眾多變化將變得明顯。本發明之全部範疇應參考申請專利範圍以及其等效物之全部範疇、及說明書，以及此等變化而確定。

<110> 英商梅迪繆思有限公司(MEDIMMUNE LIMITED)

<120> 針對替格瑞洛的抗體及使用方法

<140> 104132245

<141> 2015-09-30

<150> US 62/114,931

<151> 2015-02-11

<150> US 62/058,458

<151> 2014-10-01

<160> 80

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 363

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<212> PRT

<213> 現代人

<400> 55

<210> 56

<211> 330

<212> DNA

<213> 現代人

<400> 56

<210> 57

<211> 110

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 57

<210> 58

<211> 13

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 58

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 59

<210> 60

<211> 11

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 60

<210> 61

<211> 387

<212> DNA

<213> 現代人

<400> 61

<210> 62

<211> 129

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 62

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 63

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 64

<210> 65

<211> 20

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 65

<210> 66

<211> 330

<212> DNA

<213> 現代人

<400> 66

<210> 67

<211> 110

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 68

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 70

<210> 71

<211> 387

<212> DNA

<213> 現代人

<400> 71

<210> 72

<211> 129

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 72

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 73

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 74

<210> 75

<211> 20

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 75

<210> 76

<211> 330

<212> DNA

<213> 現代人

<400> 76

<210> 77

<211> 110

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 77

<210> 78

<211> 13

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 78

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 79

<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 80

Claims (34)

1. 一種抗體或其結合片段，其包含選自由SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：22與SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：32與SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：42與SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：52與SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：62與SEQ ID NO：67；及SEQ ID NO：72與SEQ ID NO：77組成之群的VH與VL序列之組合。
2. 如請求項1之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段包含選自由SEQ ID NO：52與SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：62與SEQ ID NO：67；及SEQ ID NO：72與SEQ ID NO：77組成之群的VH與VL之組合。
3. 一種抗體或其結合片段，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區之框架區(FR)及互補決定區(CDR)1、2及3，其中該抗體包含選自由下列組成之群的CDR區之組合：SEQ ID NO：53(VH CDR1)、SEQ ID NO：54(VH CDR2)、SEQ ID NO：55(VH CDR3)、SEQ ID NO：58(VL CDR1)、SEQ ID NO：59(VL CDR2)、及SEQ ID NO：60(VL CDR3)；SEQ ID NO：63(VH CDR1)、SEQ ID NO：64(VH CDR2)、SEQ ID NO：65(VH CDR3)、SEQ ID NO：68(VL CDR1)、SEQ ID NO：69(VL CDR2)、及SEQ ID NO：70(VL CDR3)；及SEQ ID NO：73(VH CDR1)、SEQ ID NO：74(VH CDR2)、SEQ ID NO：75(VH CDR3)、SEQ ID NO：78(VL CDR1)、SEQ ID NO：79(VL CDR2)、及SEQ ID NO：80(VL CDR3)。
4. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其 結合片段係選自單株抗體、人源化抗體、人類抗體、Fab及F(ab')₂。
5. 如請求項4之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段包含scFv。
6. 如請求項4之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段包含Fab。
7. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段以100nM或更低之IC₅₀結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。
8. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段以100nM至1nM範圍內之IC₅₀結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。
9. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段以100nM至1nM範圍內之IC₅₀結合替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物。
10. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段以50nM或更低之K_D結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。
11. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段以250pM至1pM範圍內之K_D結合替格瑞洛或其代謝物或衍生物。
12. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段以100pM至1pM範圍內之K_D結合替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物。
13. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段顯示對於選自由非諾貝特(fenofibrate)、尼伐地平 (nilvadipine)、西洛他唑(cilostazol)、布拉地新(bucladesine)、瑞加德松(regadenoson)、環噻嗪、賽扶寧(cyfluthrin)、洛伐他汀(lovastatin)、利奈唑胺(linezolid)、辛伐他汀(simvastatin)、坎格瑞洛(cangrelor)、潘妥拉唑(pantoprazole)、腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸2-MeS腺苷及三磷酸2-MeS腺苷組成之群的化合物不超過50μM之IC₅₀。
14. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段具有12小時之體內半衰期。
15. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段中和替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物之抗血小板效應。
16. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段在投藥30分鐘內中和替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物之抗血小板效應。
17. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段恢復在替格瑞洛或替格瑞洛活性代謝物存在下ADP誘發之血小板凝聚。
18. 一種如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段的用途，其係用於製備治療已投與替格瑞洛之患者急性出血的藥物。
19. 一種如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段的用途，其係用於製備治療法已經歷或將要經歷外科手術及已投與替格瑞洛之患者嚴重出血的藥物。
20. 一種如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段的用途，其係用於製備預防已投與替格瑞洛之患者出血的藥物。
21. 一種如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段的用途，其係用於製備抑制替格瑞洛、或其活性代謝物在患者之P2Y₁₂受體上 之效應的藥物。
22. 一種如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段的用途，其係用於製備抑制替格瑞洛、或其活性代謝物結合至患者之P2Y₁₂受體的藥物。
23. 一種如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段的用途，其係用於製備活化已投與替格瑞洛之患者的ADP誘發之血小板凝聚的藥物。
24. 如請求項20至23中任一項之用途，其中該患者已排定外科手術。
25. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至17中任一項之抗體或其結合片段之序列，以產生結合替格瑞洛或其代謝物的抗體或其結合片段。
26. 一種包含核酸分子之載體，其包含如請求項25之核酸分子，以產生結合替格瑞洛或其代謝物的抗體或其結合片段。
27. 一種包含如請求項26之載體的宿主細胞，其中該宿主細胞產生結合替格瑞洛或其代謝物的抗體或其結合片段。
28. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段不結合至包含在替格瑞洛之環戊基環上之羥基乙基的抗原決定基。
29. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段結合至包含替格瑞洛之環丙基-二氟苯基的抗原決定基。
30. 如請求項1至3中任一項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段結合至包含替格瑞洛之環丙基-二氟苯基的抗原決定基，但不結合至包含在替格瑞洛之環戊基環上之羥基乙基的抗原決定基。
31. 一種Fab，其包含以下互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：73(VH CDR1)、SEQ ID NO：74(VH CDR2)、SEQ ID NO：75(VH CDR3)、SEQ ID NO：78(VL CDR1)、SEQ ID NO：79(VL CDR2)及SEQ ID NO：80(VL CDR3)。
32. 如請求項31之Fab，其中該抗體或其結合片段結合替格瑞洛或其代謝物。
33. 如請求項31之Fab，其包含SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：77之胺基酸序列。
34. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至17及28至30中任一項之抗體或其結合片段或如請求項31至33中任一項之Fab。

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